CN101198351A - 用铜氧还蛋白治疗ephrin信号传导相关性病变的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干扰哺乳动物细胞中Ephrin信号传导系统的铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物的组合物和使用方法。具体地，本发明涉及使用铜氧还蛋白例如天青蛋白、Rusticyanin和质体蓝素及其变体、衍生物和结构等价物治疗哺乳动物体内的癌症的组合物和方法。

Description

用铜氧还蛋白治疗EPHRIN信号传导相关性病变的组合物和方法

相关申请

根据U.S.C第119节和120节，本申请要求2006年2月3日提交的美国临时专利申请60/764,749、2005年5月20日提交的美国临时专利申请60/682,812和2005年10月6日提交的美国专利申请11/244,105的优先权，11/244,105要求2004年10月7日提交的美国临时专利申请60/616,782和2005年5月13日提交的美国临时专利申请60/680,500的优先权，并且是2003年11月11日提交的美国专利申请10/720,603的部分继续申请，10/720,603要求2003年8月15日提交的美国临时专利申请60/414,550的优先权，并且是2002年1月15日提交的美国专利申请10/047,710的部分继续申请，10/047,710要求2001年2月15日提交的美国临时专利申请60/269,133的优先权。在此通过引用将这些在先申请的全部内容并入本申请。

政府权益声明

本申请的主题受到了国立卫生研究所(NIH)(Bethesda，Maryland，U.S.A.)的研究基金的资助(基金号为AI 16790-21、ES 04050-16、AI45541、CA09432和N01-CM97567)。政府在此发明中有着某些权利。

技术领域

本发明涉及铜氧还蛋白(Cupredoxins)及其在调节涉及Ephrin和Ephrin受体的细胞功能方面的用途。本发明也涉及治疗Ephrin相关性病变的方法。更具体地，本发明涉及基本上纯化的铜氧还蛋白在减慢癌细胞和病理性病变(特别是那些与Ephrin/Ephrin受体信号传导相关的病变)的生长和转移的方法以及其他与Ephrin/Ephrin受体信号传导相关的治疗方法中的用途。本发明也涉及保留了干扰细胞中Ephrin信号传导系统的能力的铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物。

背景技术

Ephrin受体(Eph受体)是一个大的受体酪氨酸激酶家族，其通过结合被称作Ephrin的配体家族来调节发育和成体组织中的多个过程。用Ephrin配体可以将Eph受体分成A型或B型。目前已知有9种A型成员，即EphA1-8和EphA10，和4种B型成员，EphB1-4和EphB6。A型受体一般优选地结合A型配体，而B型受体优选地结合B型配体。Eph受体和其他受体酪氨酸激酶一样，具有单个跨膜横跨结构域、和由具有免疫球蛋白样基序的配体结合结构域、富半胱氨酸区和两个III型纤维结合蛋白重复组成的糖基化的细胞外区(Surawska et al，Cytokine & GrowthFactor Reviews 15：419-433(2004))。根据其序列保守性可以将Ephrin配体分成A和B型。EphrinA配体是糖基磷脂酰肌醇锚定的，通常被Eph-A型受体所结合，而EphrinB含有跨膜结构域和短的细胞浆区，其通常被Eph-B受体所结合。

当Eph受体与Ephrin配体形成二聚体，引起受体成为磷酸化时，信号传导过程从此开始。通过更高级的成簇形成了Ephrin-Eph受体复合物的聚集物。受体活性被认为是依赖于多聚体化的程度，但是并非限于四聚体形式，因为在更低或更高级的形式中也观察到了受体磷酸化。根据多聚体化的状态，不同的Eph受体复合物可以诱导生物学作用。除了通过Eph受体进入到受体表达细胞的“前向”信号传导外，也有着通过Ephrin进入到Ephrin表达细胞的“反向”信号传导。例如，B-Ephrin的细胞浆尾部可以变成磷酸化，导致了信号传导效应物的募集以及Ephrin信号传导细胞中的信号传导级联。

现在已知Ephrin在多种细胞-细胞相互作用中发挥作用，包括轴突路径选择(axon pathfinding)、神经元细胞迁移、和血管内皮细胞和专门上皮的相互作用  (Flanagan & Vanderhaeghen，Annu.Rev.Neurosci.21：309-345(1998)；Frisen et al，EMBO J.18：5159-5165(1999))。Eph受体也参与了多个病理过程，包括肿瘤进展、病理形式的血管生成、组织损伤后的慢性疼痛、脊髓损伤后的神经再生的抑制、和人类先天性畸形(Koolpe et al，J Biol Chem.280：17301-17311(2005))。也报道了Eph受体在平衡干细胞自我更新和细胞结局确定及分化中起到了作用。

Eph受体和Ephrin过度表达可以造成肿瘤生成，并且与多种人类癌症类型中的血管生成和转移相关，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌、以及黑色素瘤和白血病(Surawska et al.，Cytokine & Growth Factor Reviews15：419-433(2004))。Eph受体的过度表达被认为并未影响细胞的增殖，而是改变细胞的侵袭行为。根据一个理论，在具有高水平EphA2的恶性细胞中，受体是错位的(mislocalized)，其不能结合它们的Ephrin配体，因此不会被磷酸化，造成了细胞外基质粘附的增加以及更高的转移可能(Ruoslahti，Adv.Cancer Res.76：1-20(1999))。血管生成是从预先存在的脉管结构中形成新的血管和毛细血管，这是肿瘤存活和生长的基本过程。有证据表明在肿瘤的血管侵袭期间存在着Eph受体/Ephrin的上调(Surawska et al，(2004))。具体地，A型Ephrin与肿瘤血管生成相关，EphA2-Fc和EphA3-Fc融合蛋白降低了肿瘤血管密度、肿瘤体积和细胞增殖，也增加了凋亡(Brantley et al，Oncogene 21：7011-7026(2002))。

EphB2受体-EphrinB2复合物的晶体结构表明EphrinB2折叠拓扑学的胞外结构域(ectodomain)是8链桶(barrel)，其是常见的希腊花边β桶折叠的变体，与铜结合蛋白的铜氧还蛋白家族具有相当多的同源性，不过EphrinB2不结合铜。Ephrin和铜氧还蛋白折叠蛋白之间的主要差别是Ephrin G-H_L和C-D_L袢(loop)的罕见长度，它们分别是二聚体的和四聚体的配体受体界面的一部分。晶体结构还表明G-H_L袢参与了受体结合(Himanen et al，Nature 414：933-938(2001))。小鼠EphrinB2的细胞外区也具有与植物Nodulin和Phytocyanin相似的拓扑学(Toth et al，Developmental Cell，1：83-92(2001))。

关于受微生物病原体感染的人类和动物体内的癌症消退的报道可以追溯到100多年前，源自Coley的第一个报道(Clin.Orthop.Relat.Res.262：3-12(1891))。一些随后的报道已经显示，微生物病原体在缺氧状态下在肿瘤部位进行复制，并且在感染期间也刺激了宿主的免疫系统，造成了癌症进展的抑制(Alexandrof et al，Lancet 353：1689-1694(1999)；Paglia& Guzman，Cancer Immunol.Immunother.46：88-92(1998)；Pawelek et al，Cancer Res.57：4537-4544(1997))。细菌病原体例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和许多其他的细菌都生成了多种容许细菌逃脱宿主防御并引起疾病的致病因素(Tang et al，Infect.Immun.64：37-43(1996)；Clark and Bavoil，Methods in Enzymology，vol.235，BacterialPathogenesis，Academic Press，Inc.San Diego Calif.(1994)；Salyers andWhitt，Bacterial Pathogenesis：A Molecular Approach，ASM Press，Washington D.C.(1994))。一些致病因素诱导了吞噬细胞例如巨噬细胞的凋亡，以摧毁宿主的防御(Monack et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10385-10390(1997)；Zychlinsky and Sansonetti，J.Clin.Investig.100：493-495(1997))。

铜绿假单胞菌生成的两种氧化还原蛋白，即铜氧还蛋白天青蛋白(Azurin)和细胞色素C₅₅₁(Cyt C₅₅₁)，两者都能进入J774细胞，并且与正常细胞相比较，其对人类癌症细胞显示出了显著的细胞毒活性(Zaborinaet al，Microbiology 146：2521-2530(2000))。天青蛋白也能进入人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7细胞(Yamada et al，PNAS 99：14098-14103(2002)；Punj et al，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada et al，Cell.Biol.7：14181431(2005))。另外，铜绿假单胞菌的天青蛋白优选地进入J774小鼠网状细胞肉瘤细胞，与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物并稳定p53蛋白，增加了p53的细胞内浓度，并诱导凋亡(Yamada et ah，Infection andImmunity，70：7054-7062(2002))。与非癌症细胞相比较，天青蛋白也引起了人成骨肉瘤细胞凋亡的显著增加(Ye et al，Ai Zheng 24：298-304(2003))。

铜绿假单胞菌的细胞色素C₅₅₁(Cyt C₅₅₁)增加了J774细胞中的肿瘤抑制蛋白p16^Ink4a的水平，并抑制了J774细胞的细胞周期进程(Hiraoka etal，PNAS 101：6427-6432(2004))。但是，当结肠癌细胞例如HCT 116细胞或无p53的肺癌H1299细胞与野生型天青蛋白或野生型细胞色素C₅₅₁一起生长3天时，它们抑制HCT 116细胞生长的浓度(天青蛋白的IC50＝17μg/ml；CytC IC50＝12μg/ml)比抑制H1299细胞(＞20μg/ml)更低。

癌症是可能无限生长的恶性肿瘤。它主要是人体中所见的各种类型细胞的病理性复制(缺少正常的调节控制)。疾病的初始治疗常常是手术、放疗或这些治疗的组合物，但是局部的复发和转移性病变也很常见。一些癌症可以进行化学治疗，但是这些治疗很少获得长期缓解。因此，它们常常是非治愈性的。在称作发生多药耐药的情况中，肿瘤及其转移灶常常变得对化疗耐药。在多种情况中，肿瘤对一些类型的化疗药物天生耐药。另外，这些治疗威胁着非癌症细胞，这对人体是一种应激，并产生了许多副作用。因此需要改良药物来阻止癌症细胞的播散。

发明内容

本发明涉及使用铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物来干扰哺乳动物的Ephrin信号传导系统的的组合物和方法。具体地，本发明涉及使用铜氧还蛋白例如天青蛋白和质体蓝素(Plastocyanin)及其变体、衍生物和结构等价物治疗哺乳动物的癌症的组合物和方法。

本发明的一个方面涉及分离的肽，其是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，其能抑制哺乳动物细胞或组织中癌症的生长。这个肽可以是天青蛋白、质体蓝素、假天青蛋白(Pseudoazurin)、质体蓝素、Rusticyanin或Auracyanin，特别是天青蛋白、质体蓝素和Rusticyanin。在一些实施方式中，铜氧还蛋白来自铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)、Phormidium laminosum、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidan)、支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、甲基单胞菌属(Methylomonas sp.)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、黄瓜(Cucumis sativus)、Chloroflexus aurantiacus、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、或孔石莼(Ulva pertusa)，特别是来自铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌、Phormidium laminosum或孔石莼。所述分离的肽可以是SEQ ID NO：1-17和22-23的部分。另外，SEQ ID NO：1-17和22-23可以与所述肽具有至少约90％的氨基酸序列相同性。

在一些实施方式中，分离的肽可以是铜氧还蛋白的截短形式。在具体的实施方式中，肽具有超过约10个残基，但不超过约100个残基。肽可以包括或者是由铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113、铜绿假单胞菌天青蛋白残基88-113、孔石莼质体蓝素残基70-84、孔石莼残基57-98或SEQID NO：22-30组成。在一些实施方式中，所述分离的肽包括与选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113、铜绿假单胞菌天青蛋白残基88-113、孔石莼质体蓝素残基70-84、孔石莼残基57-98或SEQ ID NO：22-30组成的组目标铜氧还蛋白区域等同的对象铜氧还蛋白的残基。

本发明的另一个方面是包括存在于药物组合物中的至少一个铜氧还蛋白或能抑制哺乳动物细胞或组织中癌症生长的铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的组合物。在一些实施方式中，药物组合物可以被配制成静脉内施用。铜氧还蛋白是来自铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌、Phormidium laminosum、粪产碱菌、氧化木糖无色杆菌、支气管败血性博德特菌、甲基单胞菌属、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌、黄瓜、Chloroflexus aurantiacus、副溶血弧菌、或孔石莼，特别是来自铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌、Phormidiumlaminosum或孔石莼。在一些实施方式中，铜氧还蛋白可以是SEQ IDNO：1-17和22-23。

本发明的另一个方面是治疗患有与Ephrin信号传导系统相关的病理性病变或患有癌症的哺乳动物患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的药物组合物中的组合物，其包括至少一种铜氧还蛋白、或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。在一些实施方式中，患者患有间质性膀胱炎(IC)、与炎性肠病(IBD)相关的病变、HIV感染、心血管病、中枢神经系统疾病、周围血管病、病毒性疾病、中枢神经系统退行性变(Christopher Reeve病)或Alzheimer病。在其他实施方式中，患者患有癌症，例如乳腺癌、肝癌、胃肠道癌、神经母细胞瘤、神经系统癌症、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、绒癌、畸胎瘤、甲状腺癌、所有肉瘤包括源自软组织和骨骼的肉瘤、肾癌、表皮样癌或非小细胞肺癌。在一些实施方式中，患者是人。

本发明的另一个实施方式是包括至少两种分离的多肽的组合物，所述分离的多肽是铜氧还蛋白或能抑制哺乳动物细胞或组织中癌症生长的铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。在一些实施方式中，组合物是药物组合物的形式。

本发明的另一个实施方式是试剂盒，其包括瓶装的药物组合物中的包括至少一种铜氧还蛋白、或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。试剂盒可以被设计成静脉内施用。

本发明的另一个方面是方法，其包括用铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物接触哺乳动物癌细胞；测定癌症细胞的生长。癌症细胞可以是乳腺癌、肝癌、胃肠道癌、神经母细胞瘤、神经系统癌症、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、绒癌、畸胎瘤、甲状腺癌、所有肉瘤包括源自软组织和骨骼的肉瘤、肾癌、表皮样癌或非小细胞肺癌。在一些实施方式中，癌细胞是体内的癌细胞。

本发明的另一个方面是编码能够抑制哺乳动物细胞或组织中癌症生长的铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的表达载体。

本发明的另一个方面是分离的肽，其是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，以及其能结合Ephrin受体，例如EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6。在一些实施方式中，肽也可以结合Ephrin，例如EphrinA1、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4。在其他实施方式中，分离的肽结合Ephrin及其受体，特别是Ephrin2B和Eph2B。在一个相关部分，分离的肽是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，其可以结合Ephrin例如EphrinA1、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4。

本发明的另一个方面是方法，包括给哺乳动物患者施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以指导患者体内的血管生长。本发明的另一个方面是方法，包括给哺乳动物患者施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以减少患者体内的血管生长。

本发明的另一个方面是方法，包括给哺乳动物患者施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以指导患者体内的神经元生长。本发明的另一个方面是方法，包括给哺乳动物患者施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以促进患者体内的骨生长。

本发明的另一个方面是方法，包括给哺乳动物患者施用治疗有效量的含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以取代需要使用Ephrin的治疗方法中的Ephrin。

本发明的另一个方面是方法，包括给哺乳动物细胞施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以抑制细胞相关的Ephrin受体的活性。

本发明的另一个方面是方法，包括施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，以增加细胞相关的Ephrin受体的活性。本发明的另一个方面是方法，包括给具有表达Ephrin受体的组织的人类患者施用含有至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，所述本发明的肽包括Ephrin的衍生物或者与药物融合的变体、衍生物或结构等价物。在一些实施方式中，表达Ephrin受体的组织是癌。

本发明的另一个方面是检测具有Ephrin受体的组织的方法，其步骤包括给人类患者施用包含与检测探针融合的至少一种铜氧还蛋白或本发明的肽的药物组合物，并检测探针在患者体内的分布。

通过下面的附图和具体实施方式的说明，本发明的这些和其他方面、优点和特点将是显而易见的。

序列说明

SEQ ID NO：1：铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2：Phormidium laminosum质体蓝素的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3：氧化亚铁硫杆菌Rusticyanin的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4：Achromobacter cycloclastes假天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5：粪产碱菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6：氧化木糖无色杆菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7：支气管败血性博德特菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8：甲基单胞菌属天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9：脑膜炎奈瑟菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10：淋病奈瑟菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11：荧光假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12：绿针假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13：苛养木杆菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14：黄瓜的漆树花青甙(Stellacyanin)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15：Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin A的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16：Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin B的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17：黄瓜的黄瓜碱性蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18：铜绿假单胞菌天青蛋白的残基96-113的18个残基的天青蛋白肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19：铜绿假单胞菌天青蛋白的残基88-113的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20：孔石莼质体蓝素的残基70-84的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21：副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22：孔石莼质体蓝素的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23：人EphrinB2胞外结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24：人EphrinB2的G-H袢区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25：与EphrinB2 G-H袢区结构类似的铜绿假单胞菌天青蛋白区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26：与EphrinB2 G-H袢区结构类似的氧化亚铁硫杆菌(氧化亚铁酸硫杆状菌(Acidithiobacillus ferrooxidans))Rusticyanin区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27：与EphrinB2 G-H袢区结构类似的Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin B区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28：与EphrinB2 G-H袢区结构类似的孔石莼质体蓝素区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29：与EphrinB2 G-H袢区结构类似的黄瓜的黄瓜碱性蛋白区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30：与EphrinB2 G-H袢区结构类似的黄瓜漆树花青甙区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31：人EphrinB2残基69-138的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32：孔石莼质体蓝素残基57-98的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33：人EphrinB2残基68-138的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34：铜绿假单胞菌天青蛋白残基76-128的氨基酸序列。

附图说明

图1：图1描述了天青蛋白和EphrinB2的结构比对。用图框显示出了EphrinB-2的G-H袢(介导与EphB受体的高亲和力相互作用的区域)。1JZG_A是铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。1KGY_E是人EphrinB2胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2：图2描述了铜氧还蛋白和EphrinB2的结构比对。图框代表EphrinB2的涉及Eph受体结合的G-H袢(15个氨基酸)。用黑体和下划线表示保守残基。大写字母是重叠位置。虚线是没有对齐的地方。EphrinB2 G-H袢区是SEQ ID NO：24。与EphrinB2 G-H袢区结构类似的铜绿假单胞菌天青蛋白区是SEQ ID NO：25。与EphrinB2 G-H袢区结构类似的氧化亚铁硫杆菌(氧化亚铁酸硫杆状菌)Rusticyanin区是SEQ IDNO：26。与EphrinB2 G-H袢区结构类似的Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin区是SEQ ID NO：27。与EphrinB2 G-H袢区结构类似的Phormidium laminosum的质体蓝素区是SEQ ID NO：28。与EphrinB2 G-H袢区结构类似的黄瓜的黄瓜碱性蛋白区是SEQ ID NO：29。与EphrinB2G-H袢区结构类似的黄瓜漆树花青甙区是SEQ ID NO：30。

图3：图3描述了人EphrinB2胞外结构域(1kgy_E)、孔石莼的质体蓝素(1iuz)、铜绿假单胞菌的天青蛋白(1jzg_A)和氧化亚铁硫杆菌(氧化亚铁酸硫杆状菌)的Rusticyanin(1rcy)的结构之间的比较。在图3A中，用TOPS动画显示出每个蛋白的拓扑学。TOP动画将结构表示为二级结构元件(SSE)的序列：β链(用三角表示)和螺旋(α和310)(用圆圈表示)，它们如何按从氨基末端到羧基末端的序列相连接，以及它们的相对空间位置和定向。可以从连接线中推导出元件的方向。用朝上的三角表示“向上”的链，以及用朝下的三角表示“向下”的链。图3B，用MolMol程序画出的图像(Koradi et ah，J.MoI.Graphics 14：51-55(1996))。

图4：图4描述了用于结合铜氧还蛋白和所结合的Eph-Fc的表面等离子共振Sensorgrams。显示了天青蛋白(图4A)、质体蓝素(图4B)、Rusticyanin(图4C)和EphA-Fc和EphB-Fc蛋白的选择性结合。

图5：图5描述了源自全长天青蛋白(SEQ ID NO：1)的各种截短形式的天青蛋白构建体的图解说明。图解了二级结构元件，用箭头表示β片以及用矩形表示螺旋(α和310)。编码128个氨基酸天青蛋白的基因的各种片段与gst基因(编码谷胱甘肽S-转移酶)的3’末端骨架融合，并将其克隆于大肠杆菌中，如上所述的进行高表达并纯化出融合蛋白(Yamadaet al.，Cell Micro.7：1418-1431(2005))。

图6：图6描述了在表面等离子共振研究中所测定出的天青蛋白和选择性构建的GST-Azu融合蛋白与EphB2-Fc的相对结合亲和力。在图6A中，进行初筛选试验，以便确定出天青蛋白或GST-Azu的相对结合强度，其中在将铜氧还蛋白(100nM)注射到EphB2-Fc修饰的CM5传感器芯片上之后记录下SPR踪迹。值得注意的是，天青蛋白、GST-Azu 88-113、和GST-Azu 36-128与EphB2-Fc的结合比天然配体(EphrinB2-Fc)更强。图6B显示了，在滴定逐渐增加的铜氧还蛋白的浓度(0.05-100nM)之后，天青蛋白、GST-Azu 88-113、EphrinB2-Fc、和GST-Azu 36-89与固定化的EphB2-Fc的相互作用的结合亲和力曲线。从单个Sensorgrams中推导出平衡共振信号(Req)，以构建出曲线。在将数据拟合于利用公式Req＝Rmax/(1+Kd/C)的Langmuir(1∶1)结合模型之后，计算出结合解离常数(Kd)(表6)，连接滴定曲线上的数据点显示出曲线。定量数据组与那些从最初结合筛选中获得的数据相一致。

图7：图7描述了在结合滴定和竞争检测法中确定出的天青蛋白和GST-Azu与EphrinB2-Fc和EphB2-Fc的结合相互作用。在图7A中，显示了天青蛋白和GST-Azu与EphrinB2-Fc的相互作用的SPR结合曲线，如先前所述的那样从中测定出结合亲和力(Kd)。在图7B中，用固定于CM5传感器芯片上的EphB2-Fc进行的SPR结合竞争研究。

图8：图8描述了经VAST算法计算出的包括孔石莼的质体蓝素的C末端(1IUZ)和铜绿假单胞菌的天青蛋白(1JZG_A)(分别为图8A和图8B)与人EphrinB2胞外结构域(1KGY_E)的结构比对。用黑体大写字母表示重叠的二级结构元件。虚线和小写字母表示此处没有对齐。图解了二级结构元件，用箭头表示β片以及用空心矩形表示310螺旋。用星号表示相同的氨基酸。在EphrinB2序列中用暗灰色和浅灰色突出显示的氨基酸分别表示参与EphrinB2和EphB2受体之间的相互作用和配体二聚体化的残基(Hirnanen et al，Nature 414：933-938(2001)；Toth et al，Dev.Cell.1：83-92(2001))。用图框标出并在每个比对的下面显示了对应于EphrinB2的G-H袢区的质体蓝素和天青蛋白肽(分别称作Plc 70-84(SEQ IDNO：20)和Azu 96-113(SEQ ID NO：18))，其是介导Ephrin与Eph受体的高亲和力结合的主要区域。在EphrinB2的氨基酸序列的上方，用粗箭头标记出G和H袢区。分别可以在SEQ ID NO：31和33中找到1KGY_E残基69-138和68-138。在SEQ ID NO：32中找到了1IUZ残基57-98。在SEQ ID NO：34中找到了1JZG_A残基76-128。

图9：图9描述了铜氧还蛋白肽对癌细胞活力的作用。在图9A中，描述了天青蛋白(Azu 96-113)和质体蓝素(Plc 70-84)合成肽对星形细胞瘤CCF-STTG1和成胶质细胞瘤LN-229癌细胞株的细胞活力的作用。在图9B中，描述了不同浓度的质体蓝素(Plc 70-84)合成肽对黑色素瘤UISO-Mel-2细胞活力的作用。如实施例10所述的，用MTT测定法测定出细胞活力。用不同浓度的合成肽在37℃下处理癌细胞(96孔板，每孔2×10⁴个细胞)24个小时。数据表示为与未处理的对照细胞(活力为100％)相比较的细胞活力百分比。在图9C中，描述了Azu 96-113合成肽对成胶质细胞瘤LN-229细胞的细胞毒活性。用MTT测定法测定出细胞毒作用。用不同浓度的Azu 96-113(10、25、50、75、100μM)在37℃下处理癌细胞(96孔板，每孔2×10⁴个细胞)24个小时。数据表示为与未处理的对照细胞(细胞毒性为0％)相比较的细胞死亡百分比。

图10：描述了GST-Azu 36-128和GST-Azu 88-113对MCF-7细胞的细胞活力的作用。向含有每孔8×10³个细胞的96孔板中加入渐增浓度(1.25、6.25和12.5μM)的GST-Azu肽，在37℃下孵育48个小时，随后用MTT测定法分析。与GST-Azu 36-128和GST-Azu 88-113平行进行相同浓度的GST和GST-Azu 36-89及未处理细胞的试验，将其作为对照。

发明详述

定义

除非被特殊地描述为“单个细胞”，否则术语“细胞”在此包括单数或复数术语。

术语“多肽”、“肽”、和“蛋白”在此可以互换使用，其指的是氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸残基的氨基酸聚合物。该术语也适用于天然存在氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、和“蛋白”也包含修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、羧化和ADP核糖基化。可以理解，多肽并非都是完全线性的。例如，由于泛素化的结果，多肽可以是分支的，并且它们可以是环形的(有或没有分支)，一般都是翻译后事件的结果，包括天然加工事件和不会天然发生的人工处理带来的事件。通过非翻译的天然过程以及通过完全合成方法都可以合成环形的、分支的和分支环形的多肽。此外，本发明预期了本发明的含甲硫氨酸和少甲硫氨酸的氨基末端变体的用途。

术语“病理性病变”在此包括不同于正常的解剖的和生理的偏差，其构成了对活体动物或其中一部分的正常状态的损害，中断或修饰了躯体功能的性能，并且是一种对各种因素(例如营养不良、工业危害或气候)、对特殊感染原(例如蠕虫、寄生原虫、细菌或病毒)、对生物体的先天缺陷(例如遗传学异常)或这些因素的组合的应答。

术语“病变”在此包括不同于正常的解剖的和生理的偏差，其构成了对活体动物或其中一部分的正常状态的损害，中断或修饰了躯体功能的性能。

术语“抑制细胞生长”在此表示减慢或停止细胞分裂和/或细胞扩增。该术语也包括抑制细胞发育或增加细胞死亡。

术语“患有”在此包括目前表现出病理性病变的症状、具有甚至没有可观察到的症状的病理性病变、处于病理性病变的恢复期以及已经从病理性病变中康复。

术语“治疗”在此包括阻止、减慢、终止或逆转与所治疗的病变相关的病变或症状的进展或严重度。因此，在当的情况下，术语“治疗”包括医疗性的、治疗性的、和/或预防性的施用。

“治疗有效量”是能有效地阻止或减慢所治疗对象的特殊病变的现有症状的进展或部分或完全消除所述症状的剂量。确定治疗有效量是在本领域人员的能力范围之内。

术语“p53肿瘤抑制基因的表达缺陷”在此指的是其中p53肿瘤抑制基因为灭活的、突变的、缺失的或低产的细胞。例如，因为p53基因内的遗传学异常或者由于表观遗传学原因例如肿瘤抑制基因上游CG岛中C残基的高甲基化或者由于与病毒和细胞的癌基因的相互作用，可能发生这种缺陷。

当用于修饰术语“铜氧还蛋白”时，术语“基本上纯化的”在此指的是铜氧还蛋白，例如从生长培养基或细胞成分中分离出的铜氧还蛋白，其形式为基本上没有或者没有掺杂其他蛋白和/或活性抑制化合物。术语“基本上纯化的”指的是，以干重计，分离的部分的量的分数至少约为75％，或至少“75％基本上纯化的”。更具体的，术语“基本上纯化的”指的是量至少约为活性化合物干重的85％或至少“85％基本上纯化的”化合物。最具体的，术语“基本上纯化的”指的是量至少约为活性化合物干重的95％或至少“95％基本上纯化的”化合物。所述基本上纯化的铜氧还蛋白可以联合一种或多种其他基本上纯化的化合物或分离的铜氧还蛋白使用。

短语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯化的”指的是，一种物质基本上或实质上不含那些在天然状态中通常伴随着所述物质的组分。因此，本发明的分离的肽优选地不含在肽的原位环境中与肽正常相关的物质。“分离的”区指的是不含该区域所来源的多肽的整个序列的区域。“分离的”核酸、蛋白或其相应片段已经基本上从其体内环境中移出，使得其可以被本领域人员加工处理，例如但不限于核苷酸测序、限制性消化、定向诱变、和核酸片段被亚克隆到表达载体内、以及获得基本上纯化质量的蛋白或蛋白片段。

当涉及到肽时，术语“变体”在此指的是氨基酸序列变体，其与野生型多肽相比较可以具有取代的、缺失的或插入的氨基酸。变体可以是野生型肽的截短形式。因此，通过加工编码多肽的基因可以制备出变体肽。通过变更多肽的基本组成或特征，但是不变更至少一些其基本活性，可以制备出变体。例如，天青蛋白的“变体”可以是突变的天青蛋白，其保留了抑制哺乳动物癌细胞生长的能力。在一些情况中，用非天然氨基酸例如ε-(3，5-dinitrobenzoyl)-Lys残基合成变体肽(Ghadiri & Fernholz，J.Am.Chem.Soc，112：9633-9635(1990))。在一些实施方式中，与野生型肽相比较，变体可以具有不超过20、19、18、17或16个取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些实施方式中，与野生型肽相比较，变体可以具有不超过15、14、13、12或11个取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些实施方式中，与野生型肽相比较，变体可以具有不超过10、9、8、或7个取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些实施方式中，与野生型肽相比较，变体可以具有不超过6个取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些实施方式中，与野生型肽相比较，变体可以具有不超过5或4个取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些实施方式中，与野生型肽相比较，变体可以具有不超过3、2、或1个取代的、缺失的或插入的氨基酸。

术语“氨基酸”在此表示包括任一天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即包括经1、2、3或更多个碳原子(通常是1个(α)碳原子)直接连接的至少一个羧基和至少一个氨基的任何部分。

当涉及到肽时，术语“衍生物”在此指的是源自对象肽(subject peptide)的肽。衍生作用包括化学修饰肽，使得肽仍然保留一些其基本活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以是保留其抑制哺乳动物癌细胞生长的能力的化学修饰的天青蛋白。感兴趣的化学修饰包括但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化或糖基化。另外，衍生肽可以是多肽或其片段与化合物的融合，所述化合物是例如但不限于另一种肽、药物分子或其他治疗性或药物试剂或可检测探针。

术语“氨基酸序列相同性百分比(％)”被定义为当两个序列被比对时，多肽中与候选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定出氨基酸相同性％，比对序列，如果必要，则引入缺口，以便获得最大的序列相同性％，保守取代不被认为是序列相同性的一部分。确定相同性百分比的氨基酸序列比对方法是本领域人员公知的。使用常常可公用的计算机软件例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件比对肽序列。在一个具体的实施方式中，使用Blastp(来自国立生物技术信息中心，Bethesda MD)，其施用长复杂性滤器(long complexityfilter)的缺省参数，预期(expect)10、字长(word size)3、存在(existence)11和延伸1。

当比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(其或者可以表达为给定氨基酸序列A具有或包括与或相对于给定氨基酸序列B的特定的氨基酸序列相同性％)可以被计算为：

氨基酸序列相同性％＝X/Y*100

其中

X是通过对A和B的序列比对程序或算法的比对被积分为相同的匹配的氨基酸残基的数目；而

Y是B中氨基酸残基的总数。

如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的序列不相等，那么A与B的氨基酸序列相同性％将不等于B与A的氨基酸序列相同性％。当比较较长的序列与较短的序列时，较短的序列将是“B”序列。例如，当比较截短形式的肽与相应的野生型多肽时，截短形式的肽将是“B”序列。

概述

本发明的一些方面提供了使用具有与Ephrin相似结构的铜氧还蛋白来干扰各种哺乳动物细胞和组织中的Ephrin信号传导系统以及也抑制哺乳动物癌细胞生长的组合物和方法。具体地，本发明提供了使用铜氧还蛋白及其变体、衍生物、和结构等价物来干扰Ephrin信号传导系统以及也抑制体外和体内哺乳动物癌细胞的生长的组合物和方法。

本发明人先前发现致病性微生物分泌一些ATP非依赖性细胞毒因子，例如氧化还原蛋白如铜绿假单胞菌的天青蛋白，且这些因子通过凋亡引起了J774细胞死亡，在癌细胞中尤为如此。也已知天青蛋白具有一从氨基酸残基50到77的结构域，其促进了蛋白有限进入到癌细胞内，诱导细胞毒性。

令人惊讶的是，本发明人现在已经发现天青蛋白和其他铜氧还蛋白中所见的C末端结构域显示出了与Ephrin相似的结构。见实施例2、5和9。现在也已知天青蛋白和质体蓝素以及这些肽的特殊区域是与EphrinG-H袢结构同源的，按1∶1比例竞争性地结合Ephrin受体。见实施例6-8。具体地，铜绿假单胞菌天青蛋白与Ephrin受体EphB2和EphA6结合。见实施例6。Phormidium laminosum质体蓝素显示出结合Ephrin受体EphA1、A3和B2的特异性以及更低程度的结合Ephrin受体EphA2和A6的特异性。见实施例6。最后，Rusticyanin表现出与Ephrin受体EphA8和B1的弱结合力。见实施例6。现在也已知含有与Ephrin G-H袢区结构同源的天青蛋白区氨基酸残基88-113与Ephrin受体EphB2结合。见实施例7。最后，现在已知天青蛋白和天青蛋白的88-113区结合EphrinB2和Ephrin受体EphB2，以及能够与EphrinB2竞争性结合其受体EphB2。见实施例8。

本发明人也已经发现具有与Ephrin G-H袢区结构相似区域的铜氧还蛋白在体外抑制了哺乳动物癌细胞的生长。总而言之，Phormidiumlaminosum的质体蓝素、氧化亚铁硫杆菌的Rusticyanin和铜绿假单胞菌天青蛋白在台盼蓝测定法中都抑制了Mel-2人黑色素瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞的体外生长。见实施例4。另外，现在已知天青蛋白的88-113残基区能够抑制MCF-7乳腺癌细胞的细胞生长。见实施例10。最后，现在已知对应于与EphrinB2 G-H袢区的结构相似的区域的18聚体天青蛋白肽和15聚体孔石莼质体蓝素肽能够在体外抑制MCF-7人乳腺癌细胞、CCF-STTG1脑瘤星状细胞瘤细胞和LN-229成胶质细胞瘤的生长。见实施例3和9。

令人惊讶的是，与EphrinB2的G-H袢结构相似的铜氧还蛋白也能在体内影响Ephrin相关发育。现在从秀丽隐杆线虫(C.elegans)的Ephrin相关发育的体内研究中得知，铜氧还蛋白Rusticyanin干扰了尾部肌肉形成，而铜氧还蛋白天青蛋白阻止了胚胎发育，两者都是Ephrin相关发育。见实施例1。

现在已经明白，除了天青蛋白外，铜氧还蛋白Rusticyanin和质体蓝素也与EphrinB2的G和H区共享结构同源性。见实施例2和5。此外，已知天青蛋白和Phytocyanin漆树花青甙和黄瓜碱性蛋白与Ephrin共享显著的结构同源性。因为铜氧还蛋白蛋白家族中的普遍的结构保守性，预计许多其他的铜氧还蛋白和铜氧还蛋白样蛋白也会显示出与Ephrin的显著的结构同源性。见实施例2。因此，提出了利用本发明的组合物和方法，铜氧还蛋白家族蛋白一般都可以用于治疗Ephrin信号传导相关性病变和癌症。相关的特殊铜氧还蛋白包括但不限于天青蛋白、Rusticyanin、质体蓝素、漆树花青甙、Auracyanin、假天青蛋白和黄瓜碱性蛋白。示例蛋白序列在此为质体蓝素(SEQ ID NO：2和22)、Rusticyanin(SEQ ID NO：3)、假天青蛋白(SEQ ID NO：4)、漆树花青甙(SEQ ID NO：14)、Auracyanin(SEQ ID NO：15和16)、和黄瓜碱性蛋白(SEQ ID NO：17)。术语“铜氧还蛋白”在此指的是铜氧还蛋白蛋白家族的任一成员，包括铜氧还蛋白样蛋白例如奈瑟菌的Laz。

天青蛋白是特别特异的，这些铜氧还蛋白的示例蛋白序列是但不限于从铜绿假单胞菌(SEQ ID NO：1)、粪产碱菌(SEQ ID NO：5)、氧化木糖无色杆菌的denitrificans I(SEQ ID NO：6)、支气管败血性博德特菌(SEQID NO：7)、甲基单胞菌属J(SEQ ID NO：8)、脑膜炎奈瑟菌(SEQ ID NO：9)、淋病奈瑟菌(SEQ ID NO：10)、荧光假单胞菌(SEQ ID NO：11)、绿针假单胞菌(SEQ ID NO：12)、苛养木杆菌9a5c(SEQ ID NO：13)和副溶血弧菌(SEQ ID NO：21)分离到的那些蛋白序列。在最具体的实施方式中，天青蛋白来自铜绿假单胞菌。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白是质体蓝素(SEQ ID NO：2和22)、Rusticyanin(SEQ ID NO：3)、假天青蛋白(SEQID NO：4)、漆树花青甙(SEQ ID NO：14)、Auracyanin(SEQ ID NO：15和16)、以及黄瓜碱性蛋白(SEQ ID NO：17)。

在一些实施方式中，铜氧还蛋白具有希腊花边β桶结构。希腊花边β桶结构是公知的蛋白折叠。见例如，Zhang & Kim(Proteins 40：409-419(2000))。因为该模式在希腊陶瓷中常见，所以被称作希腊花边拓扑学。其具有3个经发夹结构连接的上和下β链，紧接着的是更长的与第4个β链的连接，其位于第1个β链的邻近位置。在一个具体实施方式中，铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物包括至少一个希腊花边β桶结构。在另一个实施方式中，铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物包括一个至少4个β链的希腊花边结构。在另一个更具体的实施方式中，铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物包括至少8个β链的希腊花边结构。在另一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物包括一个以上的希腊花边β桶结构。

本发明的组合物

本发明提供了作为铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的肽。在一些实施方式中，肽是基本上纯化的。在其他实施方式中，肽位于包括或基本上由肽组成的组合物中。在其他实施方式中，肽是分离的。在一些实施方式中，肽比全长铜氧还蛋白短，其保留了铜氧还蛋白的一些功能特征。在一些实施方式中，肽保留了干扰哺乳动物细胞和组织中Ephrin信号传导和/或抑制哺乳动物癌细胞生长的能力。在另一个具体的实施方式中，肽不会引起哺乳动物的免疫应答，更具体的是人的免疫应答。

本发明也提供了包括至少一个、至少2个或至少三个铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物的组合物。本发明也提供了包括存在于药物组合物中的至少一个、至少2个或至少三个铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物及结构等价物的组合物。

因为铜氧还蛋白之间的高度结构同源性，预期家族中其他铜氧还蛋白也能够干扰Ephrin信号传导，并特异地抑制哺乳动物细胞和组织中癌症的生长。在一些实施方式中，铜氧还蛋白是但不限于天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、假天青蛋白、Rusticyanin或Auracyanin。在一些特别具体的实施方式中，天青蛋白源自铜绿假单胞菌、粪产碱菌、氧化木糖无色杆菌的denitriflcans I、支气管败血性博德特菌、甲基单胞菌属、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌9a5或副溶血弧菌。在非常具体的实施方式中，天青蛋白来自铜绿假单胞菌。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白是质体蓝素，更具体的是来自Phormidium laminosum或孔石莼的质体蓝素。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白是Rusticyanin，更具体的是源自氧化亚铁硫杆菌的Rusticyanin。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白包括氨基酸序列SEQID NO：1-17、21-22。

本发明提供了铜氧还蛋白的氨基酸序列变体，其与野生型多肽相比具有取代的、缺失的或插入的氨基酸。本发明的变体可以是野生型多肽的截短形式。多肽的“截短形式”在此是去除多肽序列的至少一个末端的至少一个氨基酸残基所形成的肽。在一些实施方式中，截短形式的肽是总共至少去除了多肽序列的一端或两端的至少1个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基或约100个氨基酸残基所形成的肽。在一些实施方式中，组合物包括由小于全长野生型多肽的铜氧还蛋白区域组成的肽。在一些实施方式中，组合物包括由截短形式的肽的超过约10个残基、超过约15个残基或超过约20个残基组成的肽。在一些实施方式中，组合物包括由截短形式的肽的不超过约100个残基、不超过约50个残基、不超过约40个残基或不超过约30个残基组成的肽。在一些实施方式中，变体是与铜氧还蛋白以及具体地是与SEQ ID NO：1-17、21-22具有至少约90％氨基酸序列相同性、至少约95％氨基酸序列相同性或至少约99％氨基酸序列相同性的肽。

在具体的实施方式中，铜氧还蛋白的变体包括铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113(SEQ ID NO：18)、88-113(SEQ ID NO：19)或SEQ IDNO：25。在其他的实施方式中，铜氧还蛋白的变体是由铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113(SEQ ID NO：18)、88-113(SEQ ID NO：19)或SEQ IDNO：25组成的。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白的变体包括孔石莼残基70-84(SEQ ID NO：20)、孔石莼残基57-98(SEQ ID NO：32)、或孔石莼序列SEQ ID NO：28。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白的变体是由孔石莼残基70-84(SEQ ID NO：20)、孔石莼残基57-98(SEQ IDNO：32)、或孔石莼序列SEQ ID NO：28组成的。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白的变体包括氧化亚铁硫杆菌Rusticyanin序列SEQ ID NO：26、Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin(SEQ ID NO：27)、黄瓜序列SEQ IDNO：29和30。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白的变体是由氧化亚铁硫杆菌Rusticyanin序列SEQ ID NO：26、Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin(SEQ ID NO：27)、黄瓜序列SEQ ID NO：29和30组成的。在其他具体的实施方式中，变体是由来自其他铜氧还蛋白的上述截短形式序列的等同残基组成的。也提出了，可以设计出具有与上面所提及的任一变体相似活性的其他铜氧还蛋白变体。为此，用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)、位于目标铜氧还蛋白序列上的截短形式变体的相关残基、和对象铜氧还蛋白序列上可见的等同残基以及因此设计出的等同截短形式变体来比对对象铜氧还蛋白氨基酸序列和目标铜氧还蛋白序列例如那些含有上面的截短形式变体的序列。

变体也包含有非天然存在的合成氨基酸制成的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以被整合到变体肽内，以便延伸或优化组合物在血流中的半衰期。这些变体包括但不限于D，L-肽(非对映体)(Futaki et al，J.Biol.Chem.276(8)：5836-40(2001)；Papo et al，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller et al，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987))、含有罕见氨基酸的肽(Lee et al.，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))、和含烯烃的非天然氨基酸继以碳氢化合物锁环(stapling)(Schafmeister et al，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski et ah，Science 305：1466-1470(2004))、以及包括ε-(3，5-dinitrobenzoyl)-Lys残基的肽。

在其他实施方式中，本发明的肽是铜氧还蛋白的衍生物。铜氧还蛋白的衍生物是所述肽的化学修饰形式，使得肽仍然保留一些其基本活性。例如天青蛋白的“衍生物”可以是化学修饰的天青蛋白，其保留了其干扰Ephrin信号传导以及特异地抑制哺乳动物细胞和组织中癌症生长的能力。感兴趣的化学修饰包括但不限于，肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化和糖基化。另外，衍生肽可以是铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与化合物的融合体，所述化合物是例如但不限于另一个肽、药物分子或其他治疗性或药物用试剂或可检测探针。感兴趣的衍生物包括通过其可以延长或优化本发明的肽和组合物在血流中的半衰期的化学修饰，例如通过一些本领域人员公知的方法，包括但不限于环化肽(Circularized peptide)(Monk et al，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest et al，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))、N-和C-末端修饰(Labrie et al，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))、和含烯烃的非天然氨基酸继以碳氢化合物锁环(Schafmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski et al.，Science 305：1466-1470(2004))。

预期本发明的肽可以是铜氧还蛋白的变体、衍生物和/或结构等价物。例如，肽可以是已经被PEG化的天青蛋白的截短形式，因此使得其同时既是变体又是衍生物。在一个实施方式中，用含有带烯烃的系链(tether)的α，α双取代的非天然氨基酸来合成本发明的肽，以及随后通过钌催化的烯烃易位作用形成全碳氢化合物“锁环”(Scharmeister et al，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walensky et al，Science 305：1466-1470(2004))。另外，作为天青蛋白的结构等价物的肽可以与其他肽融合，因此制备出同时是结构等价物和衍生物的肽。这些实施例只是为了说明本发明，而不是限制本发明。铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可以结合或可以不结合铜。

在另一个实施方式中，肽是铜氧还蛋白的结构等价物。确定出铜氧还蛋白和其他肽之间的显著的结构同源性的研究实例包括Toth et al.(Developmental Cell 1：82-92(2001))。具体地，通过使用VAST算法确定出铜氧还蛋白和结构等价物之间的显著的结构同源性(Gibrat et al，CurrOpin Struct Biol 6：377-385(1996)；Madej et al，Proteins 23：356-3690(1995))。在具体的实施方式中，来自铜氧还蛋白与结构等价物的结构比较的VAST p值小于约10^-3、小于约10^-5、小于约10^-7。在其他实施方式中，通过使用DALI算法确定出铜氧还蛋白和结构等价物之间的显著的结构同源性(Holm & Sander，J.MoI.Biol.233：123-138(1993))。在具体的实施方式中，配对结构比较的DALI Z积分是至少约3.5、至少约7.0、或至少约10.0。在实施例2和9中可找到这些确定方法的实例。

在一些实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物具有铜绿假单胞菌天青蛋白、孔石莼质体蓝素、Phormidium laminosum质体蓝素或氧化亚铁硫杆菌Rusticyanin的一些功能特征。在一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物抑制干扰了Ephrin信号传导系统，和/或抑制了哺乳动物细胞和组织中癌症的生长。对哺乳动物癌细胞或组织生长的抑制可能与铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物对Ephrin信号传导系统的任何干扰有关或无关。确定铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物是否干扰Ephrin信号传导的方法是本领域公知的，包括确定铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物是否与Ephrin信号传导途径的组分结合，例如但不限于Ephrin和/或Ephrin受体。Ephrin信号传导系统广义上包含Ephrin和相关的Ephrin受体、和向后及向前传送信号所需的任何分子(或“组分”)。狭义上说，Ephrin信号传动系统只包括Ephrin和负责信号传导的相关Ephrin受体。当在Ephrin信号传导系统的上下文中使用时，术语“干扰”可以造成相关的Ephrin信号传导(“向前”和“向后”方向中的一种或两种)的增加或减少。测定对Ephrin信号传导系统的干扰的方法是本领域公知的。确定对Ephrin信号传导的干扰的一种方法是肽与Ephrin或Ephrin受体或Ephrin信号传导系统的其他组分的结合或竞争，如实施例6-8所示。可以使用体内系统例如秀丽隐杆线虫，其中已知铜氧还蛋白能干扰Ephrin信号传导，并变更了尾部肌肉形成和胚胎孵育，如实施例1所示。其他方法包括但不限于Himanen等(Nat.Neurosci.7：501-509(2004))和Koolpe等(J.Biol.Chem.280：17301-17311(2005))中的Eph受体磷酸化检测法。

因为现在已知铜氧还蛋白及铜氧还蛋白的变体可以干扰Ephrin信号传导并抑制哺乳动物细胞和组织中癌症的生长，因此现在可以设计出保留这种功能的铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。通过例如利用本领域已知的多种方法中的一种方法生成铜氧还蛋白的各种变体、衍生物和结构等价物的“文库”，然后测试每种物质的抗癌活性就可以制备出这种变体、衍生物和结构等价物，例如采用实施例3、9和10中的示例方法。预期所形成的具有抗癌活性的铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物可以被用于本发明的方法，以替代铜氧还蛋白或与其共同使用。

在其他的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以与Ephrin具有显著的结构同源性。在一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体和衍生物具有Ephrin的G-H袢区周围的显著的结构同源性。确定出铜氧还蛋白和Ephrin之间的显著的结构同源性的研究实例包括Toth et al.(Developmental Cell 1：82-92(2001))和本申请的实施例2。具体地，通过使用VAST算法确定出铜氧还蛋白和Ephrin之间的显著的结构同源性(Gibrat et al，Curr Opin Struct Biol 6：377-385(1996)；Madej et al，Proteins 23：356-3690(1995))。在具体的实施方式中，来自铜氧还蛋白与Ephrin的结构比较的VAST p值小于约10^-3、小于约10^-5、小于约10^-7。在其他实施方式中，通过使用DALI算法确定出铜氧还蛋白和Ephrin之间的显著的结构同源性(Holm & Sander，J.MoI.Biol.233：123-138(1993))。在具体的实施方式中，配对结构比较的DALI Z积分是至少约3.5、至少约7.0、或至少约10.0。

在另一个实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与Ephrin和/或Eph受体结合。现在已知一些铜氧还蛋白具有与EphrinB2胞外结构域结构相似的C末端区。见实施例2、5和9。在一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与Ephrin结合。在一个特别具体的实施方式中，Ephrin是但不限于EphrinA1、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4。在一个特别优选的实施方式中，Ephrin是但不限于EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4。在另一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与Eph受体结合。在特别具体的实施方式中，Eph受体是但不限于EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6。在一些实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物既与Ephrin又与Ephrin受体结合。在一些实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与Ephrin及其受体(特别是EphrinB2及EphB2)结合。用于确定蛋白与其他蛋白结合的方法是本领域公知的。确定与Eph受体结合的方法实例包括实施例6-8以及Koolpe等(J.Biol.Chem.280：17301-17311(2005))和Himanen等(Nat.Neurosci.7：501-509(2004))。

在一些具体的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物诱导了哺乳动物癌细胞(更具体的是J774细胞)的凋亡。通过利用MITOSENSOR^TMAPOLERT^TM线粒体膜传感器试剂盒  (ClontechLaboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)的Mitosensor ApoAlert共聚焦显微镜，通过用Zou等(J.Biol.Chem.274：11549-11556(1999))所述的方法测定caspase-8、caspase-9和caspase-3活性、以及通过利用例如APOLERT^TM DNA片段化试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)检测凋亡诱导的核DNA片段化可以观察到铜氧还蛋白或其他多肽诱导凋亡的能力。

在另一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物诱导哺乳动物癌细胞(更具体的是J774细胞)的细胞生长停滞。通过例如用Yamada等(PNAS 101：4770-4775(2004))所述的方法测定对细胞周期进程的抑制程度可以确定出细胞生长停滞。在另一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物抑制了哺乳动物癌细胞(更具体的是J774细胞)的细胞周期进程。

铜氧还蛋白类

这些小的蓝铜蛋白(铜氧还蛋白)是参与细菌电子传递链的电子传递蛋白(10-20kDa)或者是未知功能的蛋白。铜离子独自被蛋白基质所结合。铜周围的两个组氨酸和一个半胱氨酸配体的特殊变形的三角平面排列给出了金属位点的非常奇特的电子性能和强烈的蓝色。已经中到高分辨率地结晶学表征出了大量的铜氧还蛋白。

铜氧还蛋白一般都具有低的序列同源性，但是具有高的结构同源性(Gough & Clothia，Structure 12：917-925(2004)；De Rienzo et al.，ProteinScience 9：1439-1454(2000))。例如，天青蛋白的氨基酸序列与AuracyaninB的氨基酸序列有着31％的相同性，与质体蓝素的氨基酸序列有着20.3％的相同性，以及与假天青蛋白的氨基酸序列有着17.3％的相同性。见表1。但是，这些蛋白的结构相似性是更加显著的。天青蛋白和Auracyanin B的结构比较的VAST p值是10^-7.4，天青蛋白和Rusticyanin是10^-5，天青蛋白和质体蓝素是10^-5.6，以及天青蛋白和假天青蛋白是1^-4.1。

所有的铜氧还蛋白都具有8链的希腊花边β桶或β三明治折叠以及具有高度保守的位点结构(De Rienzo et al，Protein Science 9：1439-1454(2000))。在天青蛋白类、Amicyanin类、篮细菌质体蓝素类、黄瓜碱性蛋白的铜位点周围存在着由于存在多个长链脂肪族残基例如甲硫氨酸和亮氨酸所形成的明显的疏水性补片(hydrophobic patch)，假天青蛋白和真核质体蓝素类也有较小程度的疏水性补片。在漆树花青甙和Rusticyanin铜位点出也能找到较小程度的疏水性补片，但具有不同的性能。

表1：利用VAST算法对铜绿假单胞菌天青蛋白(1JZG)和其他蛋白的序列和结构比对。

PDB	比对长度1	氨基酸相同性％	P值2	积分3	RMSD4	描述
							1AOZA21QHQ_A1V54B11GY2A3MSPA1IUZ1KGYE1PMY	82113799274749075	18.33120.316.38.120.35.617.3	10e-710e-7.410e-6.010e-5.010e-6.710e-5.610e-4.610e-4.1	12.212.111.211.110.910.310.19.8	1.91.92.11.82.52.33.42.3	抗坏血酸氧化酶Auracyanin B细胞色素c氧化酶Rusticyanin活动主要精子蛋白5质体蓝素Ephrinb2假天青蛋白

¹比对长度：两个结构之间重叠的等价的C-α原子对数目，即多少残基已经被用于计算3D重叠。

²P-VAL：VASTp值是比较显著性的测量值，表示可能性。例如，如果p值是0.001，那么通过纯偶然机会看到这种质量的配对的几率是1000∶1。对于多个比较的效果，利用假定即在MMDB数据库中有500个独立的和无关类型的结构域来调整VASTp值。所示的p值因此对应于每个结构域对的配对比较的p值除以500。

³积分：VAST结构相似性积分。该数字与重叠的二级结构元件的数目以及这种重叠的质量相关。更高的VAST积分有着更高的相似性。

⁴RMSD：根均方根重叠残基(埃)。在两个结构的优化重叠之后，用等价C-α原子之间的方差距离的平方根计算出该数值。注意RMSD数值刻度与结构比对的程度有关，当用RMSD作为总体结构相似性的描述指标时，必须要考虑到这个尺寸。

⁵秀丽隐杆线虫：证实是卵母细胞成熟中的Ephrin拮抗剂的主要精子蛋白(Kuwabara，2003″The multifaceted C.elegans major sperm protein：an Ephrin signalling antagonist in oocyte maturation″Genes andDevelopment，17：155-161)。

天青蛋白

天青蛋白是128个氨基酸残基的含铜蛋白，其属于参与特定细菌的电子传递的铜氧还蛋白家族。天青蛋白包括那些来自铜绿假单胞菌(PA)(SEQ ID NO：1)、氧化木糖无色杆菌、和A.Denitrificans(Murphy et ah，J.MoI.Biol.315：859-871(2002))的天青蛋白。天青蛋白之间的氨基酸序列相同性变化在60-90％之间，这些蛋白显示出了强的结构同源性。所有的天青蛋白都具有特征性的β-三明治和希腊花边基序，以及单个铜原子始终都位于蛋白的相同区域。另外，天青蛋白具有围绕在铜位点周围的基本中性的疏水性补片。

质体蓝素类

质体蓝素是蓝细菌(cyanobacteria)、藻类和植物的可溶性蛋白，其每个分子含有1分子铜，其氧化形式为蓝色。它们存在于叶绿体中，其中它们作用为电子载体。自从1978年确定出白杨质体蓝素类的结构之后，用结晶学或NMR方法已经确定出了藻类(Scenedesmus、Enteromorpha、Chlamydomonas)和植物(菜豆)质体蓝素类的结构，以及白杨的结构已经被精细到1.33分辨率。SEQ ID NO：2显示了Phormidium laminosum(一种嗜热蓝细菌)的氨基酸序列。SEQ ID NO：22显示了孔石莼的质体蓝素类的氨基酸序列。

尽管藻类和脉管植物之间的序列趋异性(例如衣滴虫目和白杨植物之间的序列相同性为62％)，但是三维结构是保守的(例如，衣滴虫目和白杨植物之间的Cα位点的偏差为0.76)。结构特征包括8链反向平行β桶的一个末端上的变形的四面体铜结合位点、明显负性补片和平坦的疏水性表面。优化了铜位点的电子转移功能，负性和疏水性补片被认为参与了生理反应伴侣的识别。化学修饰、交联和定点诱变试验已经验证了负性和疏水性补片在与细胞色素f的结合相互反应中的重要性，并确认了涉及质体蓝素类的两个功能显著的电子转移途径的模型。一个推定的电子转移途径是相对短的(近4)并涉及疏水性补片上的溶剂暴露的铜配体His-87，而另一个途径则更长(近12-15)，并涉及负性补片中的近保守残基Tyr-83(Redinbo et al，J.Bioenerg.Biomembr.26：49-66(1994))。

Rusticyanin类

Rusticyanin是从硫杆菌(现在称作酸硫杆状菌(Acidithiobacillus))中获得的含蓝铜的单链多肽。用多波长异常衍射已经确定出了来自氧化亚铁硫杆菌的极为稳定的和高度氧化的铜氧还蛋白Rusticyanin的氧化形式的X射线晶体结构，并将其精细到了1.9分辨率。Rusticyanin是由核心β三明治折叠(由6链和7链的β片组成)组成的。与其他铜氧还蛋白相似，铜离子与一簇按变形四面体排列的四个保守残基(His85、Cys138、His143、Met148)配位(Walter et al，J.MoI.Biol.263：730-51(1996))。

假天青蛋白类

假天青蛋白是含蓝铜的单链多肽家族。来自Achromobactercycloclastes的假天青蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。对假天青蛋白的X射线结构分析发现其具有与天青蛋白相似的结构，尽管这些蛋白之间只有低的序列同源性。假天青蛋白和天青蛋白的总体结构之间存在着两个主要差异。一个是假天青蛋白相对于天青蛋白的包括两个α螺旋的羧基末端延伸。在肽中间区域，天青蛋白含有延伸环，而假天青蛋白有所缩短，其形成了含有短α螺旋的瓣(flap)。铜原子位点的唯一的主要差别是MET侧链的构型以及Met-S铜键长度，其在天青蛋白中要比假天青蛋白明显更短。

Phytocyanin类

被鉴定为Phytocyanin的蛋白包括但不限于黄瓜碱性蛋白、漆树蓝蛋白、Mavicyanin、Umecyanin、黄瓜皮铜氧还蛋白(cucumber peelingcupredoxin)、豌豆荚内的推定的蓝铜蛋白、和来自拟南芥的蓝铜蛋白。在除了黄瓜碱性蛋白和豌豆荚蛋白外的所有这些蛋白中，正常情况下位于蓝铜蛋白位点的中轴(axial)甲硫氨酸配体被谷氨酸取代。

Auracyanin

已经从嗜热的绿色光合作用细菌Chloroflexus aurantiacus中分离出被称作Auracyanin A、Auracyanin B-1、和Auracyanin B-2的三个小的蓝铜蛋白。两个B形式是糖蛋白，其彼此具有几乎相同的性能，但是不同于A形式。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现表观单体分子量为14(A)、18(B-2)、和22(B-1)kDa。

已经确定出Auracyanin A的氨基酸序列，并显示出Auracyanin A是139残基的多肽(Van Dreissche et al；.Protein Science 8：947-957(1999))。按预期的空间安置His58、Cys123、His128、和Met132，只要它们是已知小铜蛋白质体蓝素类和天青蛋白中的进化保守的金属配体，二级结构预测也表明Auracyanin具有普遍的与铜绿假单胞菌的天青蛋白和白杨叶的质体蓝素类相似的β桶结构。但是，Auracyanin表现出两种小铜蛋白序列组的序列特征。与天青蛋白的共有序列的总体相似性和与质体蓝素的共有序列的总体相似性大致相同，约为30.5％。Auracyanin的N末端序列区1-18特别富含甘氨酸和羟基氨基酸。见来自Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin A链的示例氨基酸序列SEQ ID NO：15(NCBI蛋白数据库编号No.AAM12874)。

Auracyanin B分子具有标准的铜氧还蛋白折叠。已经研究了来自Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin B的晶体结构(Bond et al，J.MoI.Biol.306：47-67(2001)；在此通过引用将其全部内容并入本申请)。除了附加的N末端链外，分子与细菌铜氧还蛋白天青蛋白的结构非常相似。与其他铜氧还蛋白一样，一个Cu配体位于多肽的链4上，而其他3个配体位于链7和8之间的大环上。参照后面3个配体的氨基酸空间位置讨论了Cu位点几何位置。通过表现出与一些其他膜相关的电子传递蛋白中已知的系链显著的序列相同性的N末端尾部可能将结晶学表征的Auracyanin B的Cu结合区系到细胞膜的胞浆侧。McManus等(J BiolChem.267：6531-6540(1992))给出了B形式的氨基酸序列。见来自Chloroflexus aurantiacus的Auracyanin的B链的示例氨基酸序列SEQ IDNO：16(NCBI蛋白数据库编号No.1QHQA)。

漆树花青甙

漆树花青甙是Phytocyanin(植物铜氧还蛋白的遍在家族)的一个亚型。SEQ ID NO：14给出了漆树花青甙的一个示例序列。也已知了Umecyanin(一种来自辣根的漆树花青甙)(Koch et al，J.Am.Chem.Soc.127：158-166(2005))和黄瓜漆树花青甙(Hart el al，Protein Science5：2175-2183(1996))的晶体结构。蛋白具有与其他Phytocyanin相似的所有折叠。Ephrin B2蛋白胞外结构域四级结构与漆树花青甙具有显著的相似性(Toth et al，Developmental Cell 1：83-92(2001))。在国立生物技术信息中心蛋白数据库中可以找到编号为No.1JER的漆树花青甙的示例氨基酸序列SEQ ID NO：14。

黄瓜碱性蛋白

SEQ ID NO：17给出了黄瓜碱性蛋白的示例氨基酸序列。黄瓜碱性蛋白(CBP)是一种1型蓝铜蛋白，其晶体结构已经被精细到了1.8分辨率。分子类似于其他具有希腊花边β桶结构的蓝铜蛋白，不同之处是桶的一侧是开放的，且被更好地称作“β三明治”或“β-taco”(Guss et al.，J.MoI.Biol.262：686-705(1996))。EphrinB2蛋白胞外结构域四级结构与黄瓜碱性蛋白具有高度的相似性(50α碳的rms偏差为1.5)(Toth et al，Developmental Cell 1：83-92(2001))。

Cu原子具有正常的蓝铜NNSS’配位，键长为Cu-N(His39)＝1.93、Cu-S(Cys79)＝2.16、Cu-N(His84)＝1.95、Cu-S(Met89)＝2.61。二硫键(Cys52)-S-S-(Cys85)在稳定分子结构方面似乎起到了重要作用。多肽折叠是蓝铜蛋白亚族(Phytocyanin)以及非金属蛋白豚草过敏原Ra3(其与CBP具有高度的序列相同性)所特有的。现在被鉴定为Phytocyanin的蛋白是CBP、漆树花青甙、Mavicyanin、Umecyanin、黄瓜皮铜氧还蛋白、豌豆荚内的推定的蓝铜蛋白、和来自拟南芥的蓝铜蛋白。在除了CBP和豌豆荚蛋白外的所有蛋白中，正常位于蓝铜蛋白位点的中轴甲硫氨酸配体被谷氨酸取代。在NCBI蛋白数据库编号No.2CBP中可以发现黄瓜碱性蛋白的示例序列SEQ ID NO：17。

本发明的方法

本发明的另一个方面涉及一种或多种铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物在治疗患有病理性病变的哺乳动物患者的方法中的用途。更具体的，病变与Ephrin信号传导系统有关。另外，哺乳动物可能患有癌症。

现在已知铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物一般能干扰细胞或组织中Ephrin信号传导系统的活性。另外，现在已知铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物能抑制细胞和组织中的癌症生长。在具体的实施方式中，细胞和组织是哺乳动物的细胞和组织。在更具体的实施方式中，细胞是人类细胞。在一些实施方式中，细胞是非人细胞。在一个实施方式中，给细胞施用铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物以便抑制细胞表面上的Ephrin受体的活性。在另一个实施方式中，施用铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物，以便增加细胞表面上的Ephrin受体的活性。在其他具体的实施方式中，铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物抑制和/或增加了前向和/或后向的Ephrin信号传导。此外，在抑制前向信号的同时增加后向信号是可能的。

哺乳动物所患的病理性病变具体的是与Ephrin信号传导活性相关的病变。现在知道，铜氧还蛋白包括与Ephrin特定的结构同源性，其也可以象Ephrin一样在体内作用于Ephrin信号传导系统。提出了铜氧还蛋白可以用于治疗与Ephrin信号传导系统相关的病理性病变。在具体的实施方式中，病理性病变伴有比正常浓度更高或更低浓度的Ephrin信号传导系统的组分。在其他具体的实施方式中，病理性病变是由于Ephrin信号传导系统的组分的过度表达或表达低下所造成的。在其他具体的实施方式中，病理性病变是由于Ephrin信号传导系统的组分的过度循环或循环缺陷所造成的。在其他具体的实施方式中，病理性病变引起了Ephrin信号传导途径的组分的过度表达或表达低下。在另一个具体的实施方式中，病理性病变引起了Ephrin信号传导途径的组分的过度循环或循环缺陷。Ephrin信号传导途径的“组分”包括传递Ephrin与Ephrin受体结合所生成的信号或造成Ephrin与Ephrin受体结合所生成的信号被传递的任何分子。在更具体的实施方式中，组分是Ephrin或Ephrin受体。

另外，病理性病变可以伴有Ephrin信号传导系统的组分的异常分布(细胞内、细胞间或组织特异性分布)。在一个具体的实施方式中，可以在细胞表面上或细胞中发现更高浓度的Ephrin受体。在一个更具体的实施方式中，上调或下调了组织中的Ephrin受体。在另一个更具体的实施方式中，上调或下调了组织中的Ephrin。

在本发明的另一个方面，给患有癌症的患者施用铜氧还蛋白或其变体、衍生物和结构等价物。在一些实施方式中，患者是哺乳动物，特别是人。在其他实施方式中，患者不是人。虽然未限制这个治疗方法的作用机制，多个癌症与Ephrin信号传导途径的组分的浓度增加或降低有关。肿瘤中多个Ephrin和Eph受体都已经显示出其受到了上调或下调，特别是肿瘤进展的更晚期。例如，乳腺癌、肝癌和前列腺癌、和成胶质细胞瘤、食道鳞癌、卵巢癌和黑色素瘤中的EphA2受到了上调。在一个具体的实施方式中，癌症与上调的EphA2受体相关。但是，已知在多种肿瘤中，Ephrin信号传导系统的不同组分得受到了上调或下调，具体的是Ephrin和Eph受体。各种肿瘤中Ephrin和Ephrin受体的异常表达是本领域公知的，并如Surawska等(Cytokine & Growth Factor Reviews15：419-433(2004))所述。在其他实施方式中，癌症与异常量的Ephrin信号传导系统的组分或活性无关。在具体的实施方式中，癌症是但不限于乳腺癌、肝癌、胃肠癌症、神经母细胞瘤、神经系统癌症、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、绒癌、畸胎癌、甲状腺癌、所有肉瘤包括源自软组织和骨骼的肉瘤、肾癌、上皮样癌和非小细胞肺癌。在一个具体的实施方式中，癌症是p53肿瘤抑制基因表达缺陷的。

在其他实施方式中，癌症具有与肿瘤生长阶段相关的各种属性。肿瘤发生的早期步骤是血管化，其中募集动脉给肿瘤提供补养。虽然未将操作机制限制为任一方式，但已知Ephrin信号传导系统与血管生成有关。在一个实施方式中，癌症是一种与血管生成相关的癌症。肿瘤发生的另一个阶段是转移，其中肿瘤形成转移灶，其被定义为与原发肿瘤不连续的肿瘤植入物。虽然未将操作机制限制为任一方式，认为转移也与Ephrin信号传导系统相关。在一个实施方式中，癌症是转移前的癌症。在另一个实施方式中，癌症是转移癌。测定化合物对血管生成的作用的方法是本领域公知的。用于测定血管生成的特异方法包括但不限于在下面文章中所见的检测法，在此通过引用将其内容并入本申请：Daniel et al，KidneyInt.Suppl.57：S73-S81(1996)；Myers et al，J.Cell Biol.148：343-351(2000)；Pandey et al，Science 268：567-569(1995)；Brantley et al，Oncogene21：7011-7026(2002)。

除了肿瘤外，还有多种与Ephrin信号传导系统有关的病理性病变。例如，病理性血管生成形式(Adams & Klein，Trends Cardiov.Medicine10：183-188(2000)；Brantley-Sieders & Chen，Angiogenesis 7：17-28(2004)；Noren et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA 101：5583-558(2004))、组织损伤后的慢性疼痛(Battaglia et al，Nat Neurosci.6：339-340(2003))、脊髓损伤后神经再生的抑制(Goldscmit et al，J.Neurosci.6：339-340(2003))、和人先天性畸形(Twigg et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：8652-8657(2004)；Wieland et al.，Am.J.Hum.Genet.74：1209-1215(2004))，以及本发明的具体实施方式用铜氧还蛋白、或其变体、衍生物和结构等价物治疗这些病理性病变。在具体实施方式中，病理性病变是间质性膀胱炎(IC)、炎性肠病(IBD)相关性病变、HIV感染、心血管病、中枢神经系统疾病、周围血管病、病毒性疾病、中枢神经系统退行性变(Christopher Reeve病)和Alzheimer病。与治疗患间质性膀胱炎和炎性肠病患者相关的方法学见例如美国专利申请20050049176(2005年3月3日出版，在此通过引用将其内容并入本申请)。对于与抑制或刺激血管生成相关的方法学见例如美国专利申请No.20040136983(2004年7月15日出版，在此通过引用将其并入本申请)。对于与治疗骨生成相关的方法学，见例如美国专利申请No.20040265808(2004年7月15日出版，在此通过引用将其内容并入本申请)。

通过本领域人员公知的多种途径和多种方案给患者施用铜氧还蛋白或其变体、衍生物和结构等价物。在具体的实施方式中，静脉内、肌肉内、皮下或通过肿瘤内注射来施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体或衍生物。在具体的实施方式中，静脉内施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物。在特别具体的实施方式中，给患癌症或从癌症中康复的患者施用铜氧还蛋白或其变体或衍生物和化疗。

除了病理性病变外，铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物还可以用于与患者所患的其他病变相关的治疗性方法。这些病变可以是损伤了神经或血管系统的意外事故、其他治疗如手术的康复、和衰老相关的病变等所造成的。在一个实施方式中，患者需要血管的生长或再生，则施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物以指导血管的生长。在另一个实施方式中，患者需要减少血管生长，则施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物以抑制血管的生长。在另一个实施方式中，给需要神经元生成或再生的患者施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物，以知道神经元的生长。在另一个实施方式中，给患者施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物以促进骨生成。

本发明的另一个方面是在体内检测表现出特异的Ephrin受体的细胞。现在已知铜氧还蛋白含有与Ephrin和其他Ephrin高度结构同源的区域，且铜氧还蛋白在体外可以与Ephrin受体特异性结合。因此，铜氧还蛋白将能定位到表达Ephrin受体的细胞表面。因此，在一些实施方式中，铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可以用于定位未表达Eph受体细胞或组织中的这些表达Eph受体的细胞和组织。另外，表现出对特殊类型的Eph受体的结合优先性的铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可以用于定位特异地表达这类Eph受体的细胞或组织。在一个实施方式中，铜氧还蛋白或其变体或衍生物与可检测探针相连接，并被施用给人类患者，测定出可检测探针在患者体内的位置，以便确定出表达Eph受体的细胞或组织的位置。在特别具体的实施方式中，细胞是癌细胞。可检测探针可以是多种本领域目前已知的探针之一。特异相关的探针包括但不限于荧光探针、同位素探针和碘、钆和金。

在本发明的另一个实施方式中，铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物与药物相连接，并被施用给人类患者，以便将药物转运给表达Eph受体的细胞或组织。在另一个具体的实施方式中，组织是肿瘤。在特别具体的实施方式中，细胞是癌细胞。药物可以是任何类型的化合物，其对表达Eph受体的细胞有着影响。药物可以是有机的或无机的化合物，包括但不限于肽、DNA分子、RNA分子、药物组合物和这些化合物的任一衍生物。在具体的实施方式中，药物是毒素例如假单胞菌外毒素A结构域III或化合物例如紫杉醇或其他杀死癌细胞的药物。

通过施用在人类患者的所需细胞或组织中表达的含有与启动子区可操纵地连接的编码铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的编码区的DNA可以向细胞或人类患者施用铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。在一个具体的实施方式中，给患者施用编码铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的DNA，以便治疗能被铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物所治疗的病变。将其施用给细胞和人类患者的合适载体和方法是本领域公知的。在人类对象中表达外源蛋白的方法学在本领域是公知的，并且可以适用于在患者体内表达铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。在下面的美国专利中可以找到示例方案：2002年1月15日提交的美国专利No.6,339,068、2005年3月15日提交的美国专利No.6,867,000、2004年11月23日提交的美国专利No.6,821,957、2004年11月23日提交的美国专利No.6,821,955、2003年5月13日提交的美国专利No.6,562,376；在此通过引用将其内容并入本申请。在更具体的实施方式中，将编码铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的DNA注射到患有癌症的患者的肿瘤内。在更具体的实施方式中，将编码铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的DNA注射到患有癌症的患者的肿瘤内。

在一些实施方式中，通过静脉注射、肌肉内注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮贴剂、栓剂、或口服以及特异地通过静脉注射可以给患者施用药物组合物。可以在施用另一种已知能治疗Ephrin信号传导相关的病理性病变或癌症的药物的同时或在1分钟到1周或更长时间内给患者施用药物组合物。可以与另一种抗癌药物同时施用药物组合物。包括铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的药物组合物

用任一常用方法例如通过常用的混合、溶解、颗粒化、制锭、乳化、包囊化、包埋或低压冻干方法可以生产包括至少一种铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的药物组合物。基本上纯化的铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可以容易地与本领域公知的可药用载体组合在一起。这些载体使得制品可以被配制成片剂、药丸、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等。合适的辅料也可以包括例如填充剂和纤维素制品。其他的敷料可以包括例如芳香剂、加色剂、防粘剂(detackifiers)、增稠剂和其他可用的添加剂、佐剂或结合剂。在Ansel et al，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams & Wilkins，Baltimore MD(1999))中可以找到关于药物剂量形式的通用方法。

用多种方式包括通过注射(例如皮内、皮下、肌肉内、腹腔内等)、通过吸入、通过局部施用、通过栓剂、通过使用透皮贴剂或通过口服可以施用本发明所用的包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物。在Ansel et al(同上)中可以找到关于药物转运系统的一般信息。在一些实施方式中，包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物可以被配制并直接用作用于皮下和静脉内注射等的注射液。在与保护剂例如聚丙二醇或相似的涂层剂混合之后，也可以口服摄入包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物。

当通过注射施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以被配制于水溶液，特异地被配制于生理学相容的缓冲液例如Hanks溶液、林格液或生理盐水缓冲液。溶液可以包含制剂药物例如悬浮的、稳定的和/或分散的药物。或者，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物在使用前可以是被合适载体例如无菌的无致热源水所构建的粉末形式。在一些实施方式中，药物组合物不包括佐剂或任何其他被加入用于增强所述肽所刺激的免疫应答的物质。在一些实施方式中，药物组合物包括抑制针对所述肽的免疫应答的物质。

当通过静脉内液体进行施用时，用于施用铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的静脉内液体可以是由晶体或胶体组成的。在此所用的晶体是无机盐或其他水溶性分子的水溶液。在此所用的胶体包含更大的不可溶分子例如凝胶。静脉内液体可以是无菌的。

可以被用于静脉内施用的晶体液包括但不限于生理盐水(0.9％氯化钠溶液)、林格乳酸液或林格液、和5％葡萄糖水溶液(有时也称作D5W)，如表2所示。

表2：常用晶体液的组成

溶液	别名	[Na<+>]	[Cl]	[葡萄糖]
					D5W2/3 & 1/31/2生理盐水生理盐水林格乳酸液*	5％葡萄糖3.3％葡萄糖/0.3％盐水0.45％NaCl0.9％NaCl林格液	05177154130	05177154109	252168000

^*林格乳酸液也含有28mmol/L乳酸、4mmol/L K⁺和3mmol/L Ca²⁺。

当通过吸入施用时，利用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他合适的气体可以从加压的包装或喷雾器中释放出气雾剂形式的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物。对于加压气雾剂而言，通过提供释放计量的量可以确定出剂量单位。可以配制出用于吸入器或吹入器的含有蛋白和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物的凝胶的胶囊和药筒。

当通过局部施用来施用时，可以将铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、凝胶剂、悬浮液等，如本领域公知的那样。在一些实施方式中，施用是经透皮贴剂的方式。当施用是通过栓剂(例如直肠内或阴道内)进行时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物也可以被配制于含有常用栓剂基质的组合物。

当施用是口服施用时，通过混合铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物和本领域公知的可药用载体可以容易地配制出铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物。可以采用固体载体例如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等；合适的载体使得铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以被配制成用于所治疗的对象口服摄入的片剂、药丸、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬浮液等。对于口服的固体制剂例如粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂例如糖、纤维素制品、颗粒化试剂和结合剂。

本领域公知的其他常用载体也包含对价载体例如细菌荚膜多糖、葡聚糖或遗传学加工的载体。另外，包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的持续释放制剂容许在延长的时间段内释放出铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，使得在没有持续释放制剂时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物在没有引起或增强治疗性作用之前可以被对象系统清除和/或被例如蛋白酶和简单水解所降解。

用本领域熟知的一些方法可以延长或优化本发明的组合物的血流半衰期，所述方法包括但不限于环化肽(Monk et al，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest et al.，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))、D，L-肽(非对映体)(Futaki et al，J.Biol.Chem.Feb 23；276(8)：5836-40(2001)；Papo et al，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller et al，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987))、含罕见氨基酸的肽(Lee et al，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))、N和C末端的修饰(Labrie et al，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))、和碳氢化合物锁环(Schafineister et al，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski et al，Science 305：1466-1470(2004))。特别相关的方法是经D-取代或L-氨基酸取代的d-异构化作用(取代)和肽稳定性修饰。

在各种实施方式中，药物组合物包含载体和辅料(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、制菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油、盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液、近似生理状态所需的其他可药用辅助物质例如缓冲剂、毒性调节剂、湿化剂等。要认识到，虽然可以采用本领域人员已知的任一合适的载体来施用本发明的组合物，但是载体的类型将根据施用模式而有所不同。利用公知的技术也可以将化合物包裹在脂质体内。生物可降解的微球也可以被采用作本发明的药物组合物的载体。例如在美国专利No.4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252中描述了合适的生物可降解的微球。

药物组合物可以被常用的公知的灭菌技术灭菌或者被灭菌过滤。所形成的水溶液可以被包装使用或者被低压冻干，低压冻干的制品在施用之前可以与无菌溶液组合。

铜氧还蛋白的施用

可以施用被配制成药物组合物的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，以及可以用任何合适的途径来进行施用，例如通过口服、颊粘膜、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、鼻、局部、经皮，即经皮或肠外(包括静脉内、肌肉内、皮下和冠状动脉内)施用。可以施用能有效实现其预定目标的任何量的药物制剂。更具体的，施用治疗有效量的组合物。在具体的实施方式中，治疗有效量一般是从约0.01到20mg/天/kg体重。

包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物可以单独地或联合其他活性药物用于治疗哺乳动物细胞和组织中的Ephrin信号传导相关的病变或癌症。合适的剂量当然将根据例如所采用的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物、宿主、施用模式和所治疗的病变的性质和严重度的不同而有所不同。但是，一般来说，每日从约0.01到20mg/kg体重的剂量将在人体中获得满意的结果。人体中所给出的每日剂量范围是施用从约0.7mg到约1400mg铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物，例如是每日剂量、每周剂量、每月剂量和/或连续剂量。每日剂量可以是从每日1次到12次的分离剂量。或者，可以隔日、每3天、每4天、每5天、每6天、每周以及类似地天数间隔增加到31天或更长来施用剂量。或者，剂量可以是使用贴片、静脉内施用等的连续剂量。

在一些实施方式中，向患者引入铜氧还蛋白和/或其变体、衍生物或结构等价物的方法是共施用已知能治疗Ephrin信号传导相关的特异的病理性病变或癌症或其他病变或方法的其他药物。这些方法是本领域公知的。在一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白和/或其变体、衍生物或结构等价物是含有治疗Ephrin相关的病理性病变或癌症的其他药物的鸡尾酒或共剂量的一部分。相关的药物包括用于治疗炎性肠病、HIV感染、病毒性疾病、心血管病、周围血管病、中枢神经系统疾病、中枢神经系统退行性变和Alzheimer病的那些药物。

用于治疗炎性肠病的药物包括但不限于氨基水杨酸盐如柳氮磺吡啶(Azulfidine)、奥沙拉嗪(Dipentum)、美沙拉嗪(Asacol、Pentasa)、和巴柳氮(Colazal)；糖皮质激素例如泼尼松、Medrol、甲基泼尼松龙、氢化可的松、布地奈德(Entocort EC)；免疫调节剂例如硫唑嘌呤(依木兰)、6-巯基嘌呤(6-MP，Purinethol)和环孢菌素A(Sandimmune、Neoral)；抗生素例如甲硝唑(Flagyl)和环丙沙星(Cipro)；生物治疗例如英夫利昔单抗(Remicade)；以及其他治疗例如他克莫司(FK506)和麦考霉酚酸酯。

用于治疗HIV感染的药物包括但不限于逆转录酶抑制剂：AZT(齐多夫定[Retrovir])、ddC(扎西他滨[Hivid]、双脱氧肌苷)、d4T(司他夫定[Zerit])、和3TC(拉米夫定[Epivir])；非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIS)：地拉夫定(Rescriptor)和奈韦拉平(Viramune)；蛋白酶抑制剂：利托那韦(Norvir)、洛匹那韦和利托那韦组合物(Kaletra)、沙奎那韦(Invirase)、硫酸印地那韦(Crixivan)、安泼那韦(Agenerase)和那非那韦(Viracept)。用于治疗病毒性疾病的药物包括但不限于阿昔洛韦、水痘带状疱疹免疫球蛋白(VZIG)、PEG干扰素、利巴韦林、阿昔洛韦(Zovirax)、伐昔洛韦(Valtrex)、泛昔洛韦(Famvir)、金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、奥赛米韦和α-干扰素。

用于治疗心血管病的药物包括但不限于抗凝剂、抗血小板药、溶栓剂、肾上腺能神经阻断剂、肾上腺能神经激动剂、α/β-肾上腺能神经阻断剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和钙离子通道阻断剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和利尿剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙离子通道阻断剂、利尿剂(包括碳酸酐酶抑制剂、袢利尿剂、保钾利尿剂、噻嗪类和相关利尿剂)、血管扩张剂和血管升压药等。

用于治疗周围血管病的药物包括但不限于乙酮可可碱(pentoxifylline)(Trental)、口服甲基黄嘌呤衍生物、和西洛他唑(Pletal)；III型磷酸二酯酶抑制剂；抗血小板/抗血栓治疗如阿司匹林；抗凝剂如肝素和华法林(Coumadin)；降胆固醇药物如烟酸、他汀类、贝特类、lopid片剂(吉非贝齐；Parke-Davis)、tricor片剂(非诺贝特；Abbott)、胆酸多价螯合剂、colestid片剂(微粒化的盐酸降胆宁；Pharmacia and Upjohn)、welchol片剂(盐酸考来维纶；Sankyo)；钙离子通道阻断剂；微生物和食品添加物如叶酸、B-6、B-12、L-精氨酸和ω-3脂肪酸；和HMG-COA还原酶抑制剂如advicor片剂(Niacin/Lovastatin；Kos)；altocor延长释放片剂(洛伐他汀；Andryx labs)；lescol胶囊(氟伐他汀钠；Novartis & Reliant)；lipitor片剂(阿托伐他汀；Parke-Davis andPfizer)；mevacor片剂(洛伐他汀；Merck)；pravachol片剂(普伐他汀钠；Bristol-Myers Squibb)、pravigardPAC片剂(缓冲阿司匹林和普伐他汀钠；；Bristol-Myers Squibb)；zocor片剂(辛伐他汀；Merck)；烟酸类药物如advicor片剂(烟酸/洛伐他汀；Kos(也列为HMG-COA还原酶抑制剂))；niaspan(niacin；Kos)；和其他药物如zetia片剂(ezetimibe；Merck/Schering Plough)。

用于治疗中枢神经系统疾病的药物包括但不限于精神治疗药物例如各种苯二氮卓类制品和组合物、抗焦虑药、抗抑郁药(包括单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄入抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药)、抗躁狂剂、抗惊恐剂、抗紧张剂、精神兴奋剂、和强制性障碍疾病治疗药物；偏头痛制品如β肾上腺能神经阻断剂、甲异辛烯胺和5-羟色胺受体抑制剂、以及其他的偏头痛制品包括depakote片剂中的活性成分(Divalproexsodium；Abbott)、和excedrin偏头痛片剂中的活性成分(对乙酰氨基酚；BMS产品)；镇静剂和安眠药；抗惊厥剂；和pimozide。用于治疗帕金森病的药物包括但不限于抗胆碱能药物、儿茶酚-邻-甲基转移酶抑制剂、多巴胺药物和单胺氧化酶(MAO)抑制剂。

用于治疗CNS退行性变疾病的药物包括以下药物：用于治疗多发性硬化的药物包括但不限于avonex中的活性成分(干扰素-β1a；BiogenNeurology)；用于皮下注射的Betaseron(干扰素-β1b的修饰形式；Berlex)；用于注射的Copaxone(醋酸格拉默；Teva Neuroscience)；depo-medrol注射用悬浮液(醋酸甲基泼尼松龙；Pharmacia & Upjohn)；Novantrone注射用浓缩剂(按盐酸米托蒽醌提供的米托蒽醌；Serono)；Orapred口服液(泼尼松龙磷酸钠口服液；Ascent)；和Rebif注射液(干扰素-β1a；Pfizer & Serono)。用于治疗亨廷顿病的药物包括但不限于镇定剂如氯硝西泮(Klonopin)；抗精神病药如氟哌唑醇(Haldol)和氯氮平(Clozaril)；氟西汀(Prozac、Sarafem)、舍曲林(Zoloft)、去甲替林(Aventyl、Pamelor)、和锂剂(Eskalith、Lithobid)。

用于治疗Alzheimer病的药物包括但不限于aricept片剂(盐酸多奈培齐；Eisai或Pfizer)；exelon胶囊(利斯的明(rivastigmine)(重酒石酸盐形式)；Novartis)；exelon口服溶液(酒石酸利斯的明；Novartis)；reminyl口服液(氢溴酸加兰他敏(galantamine hydrobromide)；Janssen)或reminyl片剂(氢溴酸加兰他敏；Janssen)。

在一些实施方式中，向患者引入铜氧还蛋白和/或其变体、衍生物或结构等价物的方法是共施用已知能治疗癌症的其他药物。这些方法是本领域公知的。在一个具体的实施方式中，铜氧还蛋白和/或其变体、衍生物或结构等价物是含有治疗癌症的其他药物的鸡尾酒或共剂量的一部分。相关的药物包括例如那些在此所列的药物，特别是5-氟尿嘧啶、干扰素α、甲氨喋呤、他莫昔芬和长春新碱。上面的实例指示作为举例说明的目的，许多其他的化合物是本领域人员所已知的。

适用于治疗癌症的其他药物包括但不限于烷化剂如氮芥、烷磺酸盐、亚硝脲、乙撑亚胺、和三氮烯；抗代谢药如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、和嘧啶类似物；抗生素类如蒽环类、博莱霉素、丝裂霉素、更生霉素和光辉霉素；酶如L-天冬酰胺酶；法尼基蛋白转移酶抑制剂；5-α还原酶抑制剂、3型17β-羟类固醇脱氢酶抑制剂；激素类药物如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黄体酮、和促黄体生成激素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽；微管阻断剂如海鞘素(ecteinascidin)或其类似和衍生物；微管稳定剂如紫杉烷类例如紫杉醇(Taxol)、多西他奇(Taxotere)及其类似物、和Epothilone类如Epothilone A-F及其类似物；植物衍生产品如长春花碱、鬼臼乙叉甙、紫杉烷类；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂；和其他药物如羟基脲、甲基苄肼、邻对滴滴滴、六甲密胺、铂配位络合物如顺铂和卡铂；和用作抗癌和细胞毒药物的其他药物如生物效应修饰剂、生长因子；免疫调节剂和单克隆抗体。也可以结合放疗和手术来使用本发明的化合物。

这些类型的抗癌和细胞毒药物的代表性实例包括但不限于盐酸氮芥、环磷酰胺、瘤可宁、马法兰、异环磷酰胺、马利兰、卡莫司汀、环己亚硝脲、甲基环己亚硝脲、链脲霉素、塞替派、氮烯咪胺、甲氨喋呤、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氟达拉滨、Pentastatin、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、硫酸博莱霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、safracins、saframycins、quinocarcins、discodermolides、长春新碱、长春碱、酒石酸长春瑞滨、足叶乙甙、磷酸足叶乙甙、鬼臼噻吩甙、紫杉醇、他莫昔芬、雌氮芥、雌氮芥磷酸钠、氟他米特、乙基酰胺、亮丙瑞林、蝶啶、二炔基、左旋咪唑、aflacon、干扰素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙莫司亭、利妥昔单抗、BCG、维甲酸、盐酸依立替康、倍他米松(betamethosone)、盐酸吉西他滨、六甲密胺和拓泊替康以及它们的任一类似物或衍生物。

这些类型的优选成员包括但不限于紫杉醇、顺铂、卡铂、阿霉素、去甲氧柔红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、甲氨喋呤、甲基叶酸、丝裂霉素C、海鞘素743或Pofiromycin、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物例如足叶乙甙、磷酸足叶乙甙或鬼臼噻吩甙、马法兰、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛和长春罗新。

用于与本发明的组合物共施用的抗癌药和其他细胞毒药物的实例包括以下药物：德国专利No.4138042.8、WO 97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253和WO 00/00485所述的Epothilone衍生物；WO 99/24416(也见于美国专利No.6,040,321)所述的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；和WO 97/30992和WO 98/54966所述的异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂；以及药物例如那些在美国专利No.6,011,029中属性和具体描述的药物(可以与任何NHR调节剂(包括但不限于本发明的那些调节剂)如AR调节、ER调节剂、LHRH调节剂，或者与手术技术特别是治疗癌症的手术一起采用美国专利的化合物)。

由主治医师根据患者的病变来决定正确的制剂、施用途径和剂量。可以个体化地调整剂量的量和间隔，以提供足以保持治疗作用的活性铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的血浆水平。一般都用与经预定施用途径和标准药物实践所选出的药物载体的混合物来施用所需的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物。

在一个方面，转运DNA形式的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，使得在原位生成多肽。在一个实施方式中，DNA是“裸”DNA，如Ulmer等(Science 259：1745-1749(1993))所述以及如Cohen(Science259：1691-1692(1993))所综述的那样。通过将DNA涂层到载体例如生物可降解珠上可以增加对裸DNA的摄取，然后裸DNA被有效地转运到细胞内。在这些方法中，可以用本领域人员已知的多种转运系统中的任一系统来呈递DNA，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。用于将DNA整合到表达系统中的技术是本领域人员所公知的。见例如WO90/11092、WO93/24640、WO93/17706、和美国专利No.5,736,524。

用于将遗传物质从生物体穿梭到生物体的载体可以分成两大类：克隆载体是可复制的质粒或噬菌体，其具有在合适的宿主细胞内复制所必需的以及其中被插入外源DNA的区域；外源DNA是可复制和繁殖的，只要其是载体的一个组件。表达载体(例如质粒、酵母菌、或动物病毒基因组)被用于将外源遗传物质引入到宿主细胞或组织内，以便转录和翻译外源DNA例如铜氧还蛋白的DNA。在表达载体中，所引入的DNA与元件例如启动子可操纵地连接，启动子给宿主细胞传递信号，以便高水平地转录所插入的DNA。一些启动子是特别有用的，例如诱导型启动子，其控制应答于特异的因素的基因转录。铜氧还蛋白和其变体、衍生物或结构等价物的多核苷酸与诱导型启动子的可操纵地连接可以控制铜氧还蛋白和/或细胞色素c和其变体、衍生物或结构等价物应答于特异的因素的表达。常用的诱导型启动子的实例是那些应答于α干扰素、热休克、重金属离子、和类固醇如糖皮质激素(Kaufman，Methods Enzymol.185：487-511(1990))和四环素的启动子。其他所需的诱导型启动子包括那些非细胞内源的启动子，其中向细胞内引入构建体，当外源性提供诱导剂时，这些细胞中的诱导型启动子是有应答的。有用的表达载体一般常常是质粒。但是，也关注其他形式的表达载体例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

由所用的生物体或细胞以及所需的载体性质决定载体选择。载体一般包括信号序列、复制起点、标记物基因、多连接物位点、增强子元件、启动子和转录终止序列。

包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的试剂盒

在一个方面，本发明提供了含有包装或容器中的一个或多个下面的物质的试剂盒：(1)包括至少一种铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的生物学活性组合物；(2)包括共施用药物的生物学活性组合物；(3)可药用辅料；(4)施用工具例如注射器；(5)施用说明书。在相同包装或容器中的两种或多种组分(1)-(5)的实施方式也被预期。可以从那些先前提及的药物中选出共施用药物。

当提供试剂盒时，组合物的不同组分可以被包装在分离的容器内，在使用前即刻将其混合。这种分开包装组分可以容许长时间储存，且不丢失活性组分的功能。

可以用任一类型的容器提供试剂盒所含的试剂，使得可以保存不同组分的寿命，且不被容器的材料所吸收或变更。例如，密封的玻璃安瓿可以包含低压冻干的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，或者已经在中性的、无反应的气体如氮气下包装的缓冲液。安瓿可以由任何合适的材料组成，例如玻璃、有机聚合物例如聚碳酸盐、聚苯乙烯等、陶瓷、金属或任一通常被用于保存相似试剂的材料。合适容器的其他实例包括普通瓶，其可以由与安瓿相似的物质制成，和外壳，其可以包括夹箔的内层例如铝箔或合金箔。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等。容器可以具有无菌的进孔，例如具有可以被皮下注射针头穿透的塞子的瓶子。其他容器可以具有由容易取出的膜分隔开的两个室，在取出膜之后容许组分混合在一起。可取出的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。

试剂盒也可以提供说明材料。说明书可以被打印在纸或其他底物上，或者可以提供可电子阅读的介质如软盘、CD-ROM、DVD-RPM、zip盘、录像带、录音磁带、闪盘等。详细的说明书可以不与试剂盒物理地相连；取而代之的是，用户可以被引导到试剂盒的产商或经销商指定的网站或者通过电子邮件来提供。

铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的修饰

铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以被化学修饰或遗传学变更，以生成如上面所解释的变体和衍生物。用标准技术可以合成这些变体和衍生物。

除了铜氧还蛋白的天然存在的等位基因变体外，通过向铜氧还蛋白编码序列中引入突变可以造成改变，这能使得所编码的铜氧还蛋白的氨基酸序列发生变更，但不会显著地变更铜氧还蛋白干扰Ephrin信号传导或抑制癌症生长的能力。“非必需”氨基酸残基是铜氧还蛋白的野生型序列中可以被变更且不变更生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是这种生物学活性所必需的氨基酸残基。例如，预计在铜氧还蛋白中为保守氨基酸的氨基酸残基是特别不适合于变更的，因此是“必需”氨基酸。

可以制备出不会改变多肽活性的保守取代的氨基酸是本领域公知的。表3“优选的取代”显示了有用的保守取代。其中相同类型的另一个氨基酸对一种类型的氨基酸的保守取代是在本发明的范围之内，只要取代实质上不会变更化合物的生物学活性。

表3：优选的取代

原残基	示例性取代	优选的取代
			Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)GIn(Q)GIu(E)GIy(G)His(H)	VaI，Leu，IleLys，GIn，AsnGIn，His，Lys，ArgGIuSerAsnAspPro，AlaAsn，GIn，Lys，Arg	VaILysGinGiuSerAsnAspAlaArg

Ile(I)Leu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)VaI(V)

Leu，VaI，Met，Ala，Phe，正亮氨酸正亮氨酸，Ile，VaI，Met，Ala，PheArg，GIn，AsnLeu，Phe，IleLeu，VaI，Ile，Ala，TyrAlaThrSerTyr，PheTrp，Phe，Thr，SerIle，Leu，Met，Phe，Ala，正亮氨酸

LeuIleArgLeuLeuAlaThrSerTyrPheLeu

影响(1)多肽骨架的结构例如β片或α螺旋构象；(2)电荷；(3)疏水性；或(4)靶位点侧链的体积的非保守取代都能修饰细胞毒因子的功能。根据表4所示的常见侧链性能可以将残基分组。非保守取代使得用这些类型之一中的成员交换另一种类型的成员。取代可以被引入到保守取代位点或者更特异地被引入到非保守位点。

表4：氨基酸类型

类型	氨基酸
		疏水性中性亲水性酸性碱性破坏链构象芳香性	正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，IleCys，Ser，ThrAsp，GluAsn，Gln，His，Lys，ArgGly，ProTrp，Tyr，Phe

利用本领域已知的方法例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、和PCR诱变可以制备出变体多肽。可以在所克隆的DNA上实施定点诱变(Carter，Biochem J.237：1-7(1986)；Zoller and Smith，MethodsEnzymol.154：329-350(1987))、限制性选择诱变(Wells et al，Gene34：315-323(1985))或其他已知的技术，以生成铜氧还蛋白变体DNA。

也可以用已知的铜氧还蛋白突变生成用于本发明的方法中的变体铜氧还蛋白。例如，已知铜绿假单胞菌天青蛋白的C112D和M44KM64E突变体具有不同于天然天青蛋白的细胞毒活性和生长停滞活性，这种变更了的活性可以用于本发明的治疗方法。本发明的一个实施方式利用铜氧还蛋白及其保留了干扰哺乳动物细胞中Ephrin信号传导或抑制癌症生长的能力的变体和衍生物。在另一个实施方式中，本发明的方法利用了铜氧还蛋白变体如M44KM64E突变体，其具有引起细胞生长停滞的能力。

通过参照下面的特殊实施例可以获得对本发明的更充分的理解。描述实施例只是为了举例说明的目的，并不打算限制本发明的范围。给出提示或者出于方便目的的情况下对本发明作出的形式变化和等同替换也属于本发明的范围。尽管在此采用了具体的术语，但这些术语只是描述意义的，并不是限制的目的。在不脱离本发明的精神和范围前提下，可以进行如在此之前所述的本发明的修饰和变异，因此本发明的范围为所附权利要求书所示的范围。

实施例

实施例1：秀丽隐杆线虫发育的体内研究

已知秀丽隐杆线虫中一些Ephrin参与了尾部的肌肉形成和胚胎发育。我们的初步试验显示Rusticyanin干扰了尾部肌肉形成(引起尾部麻痹)，而天青蛋白阻止了幼虫出生(胚胎发育)。在这些试验中，在大肠杆菌中高表达天青蛋白和Rusticyanin基因。维持没有天青蛋白或Rusticyanin基因的对照大肠杆菌。当用对照大肠杆菌喂养秀丽隐杆线虫最多3天时，它们是健康的并能生产幼虫。当用表达Rusticyanin的大肠杆菌喂养秀丽隐杆线虫时，约30％只能移动它们的头部或其身体的上半部分，但不能移动它们的尾部或其身体的下半部分，说明尾部麻痹。

实施例2：天青蛋白结构邻近物分析

通过用载体比对搜索工具(VAST)算法(Gibrat et al，Curr OpinStruct Biol 6：377-385(1996)；Madej et al，Proteins 23：356-3690(1995))直接比较分子塑模数据库中的3维蛋白结构进行蛋白结构邻近物分析。分子塑模数据库含有来自结晶学和MR结构测定的试验数据，并由国立生物技术信息中心(Bethesda，MD，USA)维护。通过国立生物技术信息中心可以获得进行VAST蛋白结构邻近物分析的程序。

天青蛋白显示出与MMDB(分析塑模数据库)编号1 KGY E(EphB2-EphrinB2复合物的晶体结构)的显著的(Vast P值：10^e-4.6；比对长度：90个氨基酸；相同性％：6)(图1)结构重叠。天青蛋白与参考晶体结构的重叠比对涉及链E(138个氨基酸)(被称作Ephrin的蛋白(Ephrin-B2))。该计算分析与Himanen等(Nature，vol 414：933-938(2001))发表的结构数据相一致。

进一步的VAST分析表明铜氧还蛋白Rusticyanin、Auracyanin、质体蓝素、黄瓜碱性蛋白和漆树花青甙也显示出与EphrinB2在G-H袢区的显著的结构同源性(图2)。

实施例3：源自天青蛋白和质体蓝素的合成肽的功效

已经分析了源自天青蛋白和质体蓝素的与人EphrinB-2 G-H袢结构相似的合成肽的功效。已经用标准技术合成了具有以下序列的18-mer天青蛋白肽：

TFDVSKLKEGEQYMFFCT SEQ ID NO：18

将MCF-7乳腺癌细胞在含有5和50μg/ml 18-mer天青蛋白肽的16孔板中孵育0、24、48和72个小时，在此之后，用库尔特计数器计算出MCF-7细胞的数目。与没有合成肽处理的细胞相比较，发现50μg/ml肽在48到72个小时内抑制了50％MCF-7细胞的生长。与未处理的对照相比较，5μg/ml 18-mer合成肽的细胞生长抑制的程度约为25％。该试验表明只依据其与B-2 Ephrin的结构相似性所设计出的合成肽的确抑制了B-2Ephrin所加速的癌细胞进展。

实施例4：体外测定铜氧还蛋白对Mel-2和MCF-7细胞的生长的作用

用16孔板测定出经铜氧还蛋白处理过的细胞的生长。Mel-2或MCF-7细胞(每孔5×10⁵个细胞)被容许粘附到多孔板(在此为16孔板)24个小时。在粘附之后，吸除生长培养基。然后向含有新鲜生长培养基的孔内加入PBS(磷酸缓冲液)或浓度为0.1到10μM的各种铜氧还蛋白/细胞色素PBS，癌细胞继续生长24、48和72个小时。在孵育期之后，将台盼蓝加入到培养物中，并计算出死的漂浮细胞的数目。计算活的和死的漂浮细胞，以便确定出各种铜氧还蛋白剂量的IC50。IC50是抑制50％细胞培养物生长的蛋白浓度。

当每孔500,000个细胞生长24个小时时，有足够多的细胞进行重复计数。在无铜氧还蛋白的对照细胞培养中，当细胞生长时，它们没有足够的空间粘附到板的底部，就开始死亡并成为漂浮细胞。在质体蓝素处理过的或Rusticyanin处理过的细胞培养物中，细胞也生长超过板的表面积，并开始死亡和漂浮，但是其数目小于对照。但是，在天青蛋白处理过的细胞培养物中，Mel-2和MCF-7细胞株生长被抑制到造成了非常少的漂浮细胞。

实施例5：EphrinB2胞外结构域和铜氧还蛋白之间的结构相似性

用分别通过美国国立卫生研究所和欧洲生物信息研究所获得的VAST和DALI算法(Holm and Sander，J.MoI.Biol.233：123-138(1993)；Gibrat et al.，Curr.Opm.Biol.6″377-385(1996))测定出EphrinB2胞外结构域和铜氧还蛋白之间的结构相似性。利用VAST算法计算出基于结构的配对序列比对。用TOPS(蛋白结构的拓扑学)动画进行2维的蛋白结构算法(Torrance et al，Bioinformatics 21：2537-2538(2005))。通过使用程序Mol Mol来进行结构评估(Koradi et al，J.Mol.Graphics 14：51-55(1996))。

两个程序都发现了一些同源物，包括单体铜氧还蛋白蛋白的一个小亚组、质体蓝素、天青蛋白和Rusticyanin。具体地，EphrinB2胞外结构域与这三种铜氧还蛋白(其被选作铜氧还蛋白家族的代表性蛋白)之间的结构比较所提供的VAST和DALI比对具有显著的相当相似的积分，范围分别是从11.0到9.7(超出可能的最大值15.7)和6.7到6.4。DALI Z积分＜2.0是结构不相似的(表5)。在EphrinB2和质体蓝素之间存在着最明显的结构保守性，重叠的根均方差(r.m.s.d.)为1.8(在67个结构等价的Cα原子上计算出的数值)(表5)。相比而言，天青蛋白、质体蓝素和Rusticyanin表现出了与EphrinB2胞外结构域更弱的一级序列相同性(小于10％)。

表5：人EphrinB2胞外结构域与单结构域铜氧还蛋白家族的三种成员(质体蓝素、天青蛋白和Rusticyanin)的结构相似性。

PDB	名称	VAST积分a	DALIZ积分b	与1KGY_E的RMSDc	比对长度	相同性％
							1IUZ	质体蓝素	11.0	6.4	1.8	67	9.0
1JZG	天青蛋白	10.1	6.7	3.4	90	5.6
							1RCY	Rusticyanin	9.7	6.1	3.1	87	8.0

a-VAST积分：VAST结构相似性积分。该数字与重叠的二级结构元件的数目以及这种重叠的质量相关。更高的VAST积分有着更高的相似性。

b-DALIZ积分：利用Ephrin胞外结构域结构和DALI数据库中的其他结构的配对比较计算出Z积分。Z积分越高，3D结构之间的相似性为随机的可能性就越小(Z＜2.0的配对是结构不相似的)。

c-RMSD：结构对的比对部分之间的骨架残基的根均方差()。

图3显示了所研究的EphrinB2胞外结构域和所有三种铜氧还蛋白的TOPS动画(A)和MolMol图像(B)。拓扑学描述表明蛋白采用了形成希腊花边折叠核心的两个β片的三明治结构，并且显示出了在β链数目和空间定位方面的显著的结构相似性；1KGY_E(EphrinB2)、1IUZ(质体蓝素)和1JZGA(天青蛋白)(图3)。相反的，α螺旋的数目和排列是更不保守的。在JZG A中，与在此所示的其他蛋白相比较，其螺旋结构是独特的。对于具有不同大小的蛋白可以预计到，连接二级结构元件的环显示出在其长度及构象方面的差异。IRCY(Rusticyanin)具有最低的结构同源性，主要差异在于共享的二级结构元件(SSE)的长度和非共享SSE的存在。

实施例6：通过表面等离子共振分析Eph-Fc受体-铜氧还蛋白相互作用

通过表面等离子共振(SPR)分析确定出Eph受体和铜氧还蛋白的特异性相互作用。如先前所述的那样(Yamada et al，Cell Microbiol.7：1418-1431(2005)；Hiraoka et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA 101：6427-6432(2004))，在含5％CO2的湿润培养箱中、37℃下将人星状细胞瘤CCF-STTG1、成胶质细胞瘤LN229和MCF-7(乳腺癌)细胞培养在含2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes、10％(体积/体积)热灭活FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI培养基1640中。将人黑色素瘤细胞UISO-Mel-2(Yamada et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：14098-14103(2002))培养在加有10％FBS的MEM和Hank培养基中。大肠杆菌JM109和BL21(DE3)用作过量生产天青蛋白、Rusticyanin和质体蓝素的宿主菌株。如先前所述的纯化出天青蛋白和Rusticyanin(Yamada et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：14098-14103(2002)；Yamada et al.，Cell Cycle3：1182-1187(2004))。早先已经报道了GST-天青蛋白融合衍生物的构建和纯化(Yamada et al，Cell Microbiol.7：1418-1431(2005))。基本上如早先所述的那样进行对来自Phormidium laminosum的质体蓝素的纯化和表达(Schlarb et al，Gene 234：275-283(1999))，除了用大肠杆菌菌株BL21(DE3)Cd+(RIL)取代BL21(DE3)。利用4700M^-1cm^-1的吸光系数以分光光度法在598nm确定出充分氧化蛋白的浓度。

Eph胞外结构域Fc融合蛋白和Ephrin的低压冻干粉末都购自R & DSystems，Minneapolis，MN。所有用于表面等离子共振和生长试验的化学物都购自Biacore AB International或Sigma，它们都是高分析级的。用基于表面等离子共振(SPR)技术的Biacore X生物传感器系统(Biacore AB)测定出铜氧还蛋白或GST肽与Eph-Fc或EphrinB2-Fc之间的直接蛋白-蛋白相互作用。

在最初的筛选试验中，用胺偶联方法实现了天青蛋白、Rusticyanin、或质体蓝素被固定于CM5传感器芯片上的单个通道。连续注射N-羟基琥珀酰亚胺N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(N-hydroxysuccinimide/N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(0.05M/0.2M，35μL)、铜氧还蛋白蛋白(255μM，50μL)、1M氨基乙醇(50μL，pH 8.8)和100mM NaOH(10μL)使得蛋白与CM5传感器芯片共价连接，使得共振信号增加300RU。通过将100nM Eph-Fc蛋白HBS-EP电泳缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4；0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v表面活性剂P20)连续注射到传感器表面(流速为5和30μL/min，共2.3min)(70μL注射液)以及间断注射100mM NaOH(10μL脉冲)以再生铜氧还蛋白-CM5表面来实施结合试验。在裸Au CM5传感器表面(阴性通道)上进行所有结合试验，以校正非特异性结合。

通过连续注射100nM Eph-Fc受体(流速为30μL/min，共2.3min)可以在铜氧还蛋白修饰传感器表面上实施结合筛选。曲线代表Eph-Fc和天青蛋白、质体蓝素、及Rusticyanin的相互作用的结合相的开始。相对结合亲和力是饱和共振(Req)的函数，Rusticyanin与EphB1-Fc或EphA8-Fc的结合亲和力为79 RU，天青蛋白与EphB2-Fc的结合亲和力为1248 RU。铜氧还蛋白与特异性EphA和EphB受体蛋白的交叉选择性结合是非常显著的，在铜氧还蛋白和EphB之间出现了最好的相互作用。

固定化的铜氧还蛋白与Eph-Fc的结合的SPR Sensorgrams说明了这两个亚组蛋白之间的选择性识别(图4A-C)。在这些测定中，Eph-Fc的浓度被保持恒定于100nM，使得用Req表示的结合程度的差异能够反映出Eph-Fc受体蛋白和铜氧还蛋白之间的亲和力差异。天青蛋白显示了与EphB2-Fc和A6的最高的亲和力，其也与A4和A7紧密结合(图4A)。另一方面，质体蓝素显示出对EphA1-Fc、A3和B2的选择性，对A2和A6的选择性较小(图4B)。最后，Rusticyanin识别EphA8-Fc、和B1，但是其结合都是弱的(图4C)。天青蛋白和EphB2-Fc及EphA6-Fc的结合相互作用是最高的，其Req值分别是1248和1200RU。

实施例7：分析天青蛋白和GST-Azu肽与EphB2-Fc的结合亲和力-SPR结合测量值

利用固定化的EphB2-Fc和天青蛋白或GST-Azu肽实施天青蛋白和GST-azu肽与EphB2-Fc的结合亲和力(SPR结合测量值)，以评价全长天青蛋白或其可变区与EphB2-Fc受体的相对集合亲和力。给EphB2-Fc或EphrinB2-Fc修饰的CM5芯片注射渐增浓度(0.05-100nM)的天青蛋白或GST-Azu肽，注射之间给予100mM NaOH脉冲注射。将数据放入Langmuir(1∶1)结合模型Req＝Rmax/(1+Kd/C)，以推导出平衡结合常数(Kd)。

图5显示了用于阐述天青蛋白结合EphB2-Fc的结构决定子的试验策略，其描述了如先前所述的天青蛋白和GST-Azu构建体的一级/二级结构参数的图谱(Yamada et al.，Cell Microbiol.7：1418-1431(2005))。具体地，GST-Azu 88-113与EphrinB2(天然配体)的GH袢区相一致，因此其与EphB2-Fc的结合效率是特别相关的。最初对天青蛋白和各种GST-Azu构建体(所有浓度均为100nM)与EphB2-Fc的结合测定发现了它们的相对亲和力：即天青蛋白＞GST-Azu 88-113＞GST-Azu 36-128＞EphrinB2-Fc＞GST-Azu 36-89＞＞GST(图6A)。天青蛋白和GST-标签的天青蛋白显示出相当的亲和力(数据没有显示)。为了定量结合亲和力，测定出了作为其浓度(0-100nM)函数的天青蛋白或GST-Azu的饱和反应值(Req)(图6B)。将结合数据放入Langmuir(1∶1)结合公式以测定出平衡解离常数(Kd)。值得注意的是，天青蛋白(Kd＝6nM)和GST-Azu 88-113(Kd＝12nM)与EphB2-Fc的亲和力分别比其天然EphrinB2-Fc配体(Kd＝30nM)的亲和力的5倍和2.5倍。GST-Azu 36-128(表6)也显示比EphrinB2-Fc(Kd＝30nM)稍高的亲和力。相反的，GST-Azu 36-89和GST表现出基本上可忽略的结合(表6)。这些数据说明天青蛋白的Azu 88-113区对与EphB2-Fc的高亲和力的相互作用的重要性。Azu 88-113区是由与EphrinB2中的GH袢结构同源的GH袢区组成的。

表6：天青蛋白和GST-Azu构建体与EphB2-Fc的相对结合亲和力。

分析物	Req(RU)	分子量	Kd(nM)
				野生型天青蛋白	427	13,929	6±0.75
EphrinB2-Fc	159	130,200	30±5.1
				GST	14	26,000	＞160
GST-Azu3 6-128	244	36,076	23±1.5
				GST-Azu 36-89	57	31,924	61±9.0
GST-Azu 88-113	314	28,943	12±1.5

用SPR结合滴定试验测定出天青蛋白和GST-Azu构建体与EphB2-Fc的相对结合亲和力，在此总结了所推测的数据组，并与天然的EphrinB2-Fc配体和GST的结合力进行比较。在向传感器表面注射100nM分析物之后，生成了最初筛选试验的数据，列出了共振单位的饱和信号(Req)。获得了图6b所述的结合曲线的每个滴定点上的饱和结合，用按分析物标绘的这些数值计算出平衡解离常数(Kd)。天青蛋白和GST-Au的Kd数值范围是从6到61nM，而EphB2-Fc与天然配体具有这个范围内的中间的结合亲和力。

实施例8：分析天青蛋白/GST-Azu和EphrinB2-Fc与EphB2-Fc的竞争结合研究

为了更好的了解高亲和力的天青蛋白-EphB2-Fc结合的生理学作用，我们进行了进一步的结合测定。与结合常数研究相似的进行竞争结合滴定，除了在EphB2-Fc CM5传感器表面上注射EphrinB2-Fc(246nM)+竞争物(天青蛋白或GST-Azu(0-1020nM))。

将不同浓度的Azruin(0-1020nM)+EphrinB2-Fc(246nM)样品加入到传感器表面上，并标绘出作为共振比例的数据(占总应答％[Req(天青蛋白+EphrinB2-Fc)/(Req/(EphrinB2-Fc))])。用EphrinB2-Fc将GST-Azu88-113和GST-Azu 36-89滴定到固定化的EphB2-Fc，并用相似的方式进行分析。竞争数据表明Azruin和GST-Azu 88-113与固定化的EphB2-Fc之间的结合化学计量为1∶1。

我们首先测定了天青蛋白和GST-Azu构建体与EphB2-Fc配体EphrinB2-Fc的结合。图7A显示天青蛋白的确高亲和力地结合EphrinB2-Fc(Kd＝8.5+0.8nM)，反映出这两种蛋白之间的结构相似性(表5)。GST-Azu 88-113对EphrinB2-Fc的相对高亲和力(Kd＝39+6.5nM)说明88和113之间的区域也对结合EphrinB2-Fc起到了重要作用。相反的，GST和GST-Azu 36-89没有显示出与EphrinB2-Fc的相互作用。总而言之，这些数据表明天青蛋白可以经GH袢(88-113)区高亲和力地结合EphB2-Fc和EphrinB2-Fc。

为了进一步测试这个区域，在EphrinB2-Fc与不同浓度的天青蛋白和GST-Azu构建体孵育之后，我们进行了对EphrinB2-Fc与固定到CM5传感器芯片上的EphB2-Fc的结合的SPR分析。图7B显示了0-1020nM天青蛋白、GST-Azu 88-113、和GST-Azu 36-89分别对EphrinB2-Fc(246nM)与EphB2-Fc的结合的抑制作用。抑制作用用占总应答％表示(＝[Req(天青蛋白+EphrinB2-Fc)/Req(EphrinB2-Fc单用)]*100)。抑制作用谱表明当用天青蛋白或GST-Azu 88-113预孵育EphrinB2-Fc时，减少了总蛋白与固定化的EphB2-Fc的结合，以及天青蛋白是比GST-Azu 88-113更强的抑制剂。Azruin或GST-Azu 88-113与EphrinB2-Fc的预孵育将总蛋白与表面的结合最多减少了60％。另一方面，GST-Azu36-89不影响总蛋白结合(图7B)，这和其与EphrinB2-Fc或EphB2-Fc的弱结合力相一致。这表明天青蛋白(或GST-Azu 88-113)和EphrinB2-Fc形成了化学计量的复合物，因为当EphrinB2-Fc和天青蛋白(或GST-Azu 88-113)的比例为1∶1时获得了最大的抑制作用。天青蛋白或GST-Azu 88-113的抑制作用停留于40到50％的事实表明推定的天青蛋白-EphrinB2-Fc复合物与EphB2-Fc受体有着一些亲和力。总之，这些结合数据表明天青蛋白对EphrinB2-Fc和EphB2-Fc都有着高亲和力，以及表明天青蛋白可以通过配体隔离和受体占据的双重机制干扰EphrinB2-Fc-EphB2-Fc结合。

实施例9：对Azu96-113和Plc70-84合成肽以及GST-Azu融合衍生物对各种癌细胞株的细胞毒活性的分析

在对azruin和质体蓝素与人EphrinB2胞外结构域进行基于结构的序列比对之后，我们设计出了对应于EphrinB2的G-H袢区的肽(称作Azu96-113(SEQ ID NO：18)和Plc 70-84(SEQ ID NO：20))，所述G-H袢区是介导Ephrin与Eph受体的高亲和力结合的主要区域(Himanen et al，Nature 414：933-938(2001)；Toth et al，Dev.Cell.1：83-92(2001))。在图8中，可以看到EphrinB2胞外结构域、天青蛋白和质体蓝素的C末端片段的结构重叠。用对天青蛋白和质体蓝素与人EphrinB2胞外结构域的基于结构的序列比对设计出基于介导EphrinB2与EphB2受体的高亲和力结合的区域(EphrinB2-Fc胞外结构域的G链-袢-H链)的天青蛋白的肽(称作Azu 96-113(96-TFDVSKLKEGEQYMFFCT-113))和质体蓝素的肽(称作Plc 70-84(70-VRKLSTPGVYGVYCE-84))(图8)。从GenScript公司(Piscataway，NJ)购得纯度为99％的肽。用反相高压液相色谱纯化肽，并用质谱法确认其身份。将肽溶解于磷酸缓冲液(PBS)(1x)，并分装储存在-20℃直到使用。

为了判断天青蛋白的这些区域是否也作用为癌症进展中的Eph信号传导的拮抗剂，我们在多个已知高表达EphB受体/Ephrin配体的癌细胞株中进行了定量MTT检测。在37℃孵育24h期间，75μM天青蛋白和质体蓝素G-H袢肽都显示出诱导了脑瘤星状细胞瘤CCF-STTG1和成胶质细胞瘤LN-229的细胞死亡(图9A)。质体蓝素肽Plc70-84多少显示了比天青蛋白肽Azu 96-113更高的细胞毒活性。为了确定出这种细胞毒性是否是剂量依赖性的以及是否对其他癌细胞株也是有效的，我们评价了一些浓度的这些肽对黑色素瘤(图9B)或成交质细胞瘤细胞(图9C)的作用。在两种情况中，渐增的肽浓度造成了渐增的细胞毒性(图9B和9C)。

实施例10：对GST-Azu融合肽诱导乳腺癌MCF-7细胞细胞死亡的能力的分析

我们已经测试了GST-Azu融合肽诱导乳腺癌MCF-7细胞细胞死亡的能力。为了测定天青蛋白和质体蓝素合成肽的细胞毒性，进行了四甲基偶氮唑蓝(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)(MTT))(Sigma)检测(Mosmann，J.Immunol.Methods 65：55-63(1983))。将每孔近2×10⁴个细胞种植到96孔培养板内的100μL RPMI1640培养基中。在过夜培养后，去除上清液，向粘附细胞加入含有各种指定浓度的天青蛋白或质体蓝素合成肽的新培养基。在24或48h处理之后，向培养基加入10μL 5mg/ml MTT溶液，并在37℃下孵育1h。通过加入40mM HCl异丙醇溶液来终止MTT反应。如先前所述的那样(Mosmann，1983)，分光光度地测定出所形成的MTT甲(formazan)。比较未处理的对照细胞和处理过的细胞，以便确定出活力，以及因此确定出细胞毒性的测量值。

与对照(没有蛋白)相似，GST或GST-Azu 36-89融合蛋白触发了非常低的细胞毒性(图10)。但是，具有能够干扰EphrinB2/EphB2结合的天青蛋白区的GST-Azu 36-128或GST-Azu 88-113显示出剂量依赖方式的显著的细胞毒性，验证了Azu 88-113区在触发MCF-7细胞死亡中的作用。

实施例11：患有与Ephrin信号传导相关的病理性病变的患者的治疗

在患有癌症的患者中进行铜氧还蛋白化合物(研究药物)的I/II期临床研究。具体而言，铜氧还蛋白化合物是Plc 70-84(SEQ ID NO：20)。

在施用研究药物的开放标签、前瞻性研究中入选了49例患有经组织学确诊的乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤成人患者，这些患者都在经目前可获得的FDA批准的化疗药物和方案充分治疗后出现了临床和放射学的进展或复发。为了符合该研究的入选条件，所有患者在完成经批准的化疗方案疗程之后出现了可测量肿瘤病灶体积的增加。持续的转移灶和/或大小或体积的连续增加的证据在组织学上必须是明确的。通过细针穿刺(FNA)活检可以获得这种组织学证据。

在芝加哥伊利诺斯大学的研究所伦理委员会和FDA的监督下，在得到所有患者的知情同意书之后实施研究方案。患者没有合并症例如其他恶性肿瘤、既往恶性肿瘤病史、血液恶液质、胰岛素依赖性糖尿病或其他严重的心血管疾病，这些合并症可能会干扰对所提出的治疗的作用的适当评价。在开始治疗之前进行基线血液检查(全血细胞计数(CBC)和血清生化)，其包括肝功能检查(LFT)。所有入选患者在试验期间都不能同时接受任何癌症化疗。

通过每日静脉内注射研究药物的可药用制品共12周来施用研究药物，观察所有对象的任何剂量限制性毒性。有7种剂量水平，从10mg/kg/天开始，按5mg/kg/天逐渐增加到最大剂量为50mg/kg/天。在7例患有晚期可测量癌症(乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤)的患者中记录下每个剂量水平的疗效。

通过2维地测定可测量的肿瘤来评价反应(a和b)。1)靶向转移性肿瘤的完全消失被认为是完全缓解(CR)；2)缩小75％被认为是极好的部分反应(PR)；和3)良好好的反应(PR)是治疗后尺寸缩小了50％；4)尺寸缩小25％被认为是疾病稳定(SD)以及5)尺寸缩小＜25％被认为是无反应(NR)。被证实出现疾病进展的患者则停止治疗，但继续再随诊12周。

靶向转移性肿瘤的完全消失以及尺寸的任何缩小都表明天青蛋白治疗可有效地治疗癌症。表明Plc 70-84治疗是有效治疗的其他指示物是降低了新转移性肿瘤的出现率以及肿瘤相关的血管生成的减少。

Claims (50)

1.一种分离的肽，其是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，并能抑制哺乳动物癌细胞的生长。

2.权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白选自由天青蛋白、质体蓝素、假天青蛋白、质体蓝素、Rusticyanin和Auracyanin组成的组。

3.权利要求2的分离的肽，其中铜氧还蛋白选自由天青蛋白、质体蓝素和Rusticyanin组成的组。

4.权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白来自选自由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)、Phormidium laminosum、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidan)、支气管败血性博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、甲基单胞菌属(Methylomonas sp.)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、黄瓜(Cucumis sativus)、Chloroflexusaurantiacus、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、和孔石莼(Ulva pertusa)组成的组的生物体。

5.权利要求4的分离的肽，其来自选自由铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌、Phormidium laminosum和孔石莼组成的组的生物体。

6.权利要求1的分离的肽，其是选自由SEQ ID NO：1-17和22-23组成的组的肽的一部分。

7.权利要求1的分离的肽，选自由SEQ ID NO：1-17和22-23组成的组的序列与所述肽有至少约90％的氨基酸序列相同性。

8.权利要求1的分离的肽，其是铜氧还蛋白的截短形式。

9.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有超过约10个残基但不超过约100个残基。

10.权利要求9的分离的肽，其中所述肽包括选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113、铜绿假单胞菌天青蛋白残基88-113、孔石莼质体蓝素残基70-84、孔石莼残基57-98、和SEQ ID NO：22-30组成的组的铜氧还蛋白区域。

11.权利要求10的分离的肽，其中所述肽由选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113、铜绿假单胞菌天青蛋白残基88-113、孔石莼质体蓝素残基70-84、孔石莼残基57-98、和SEQ ID NO：22-30组成的组的铜氧还蛋白区域组成。

12.权利要求1的分离的肽，其中所述肽包括与选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基96-113、铜绿假单胞菌天青蛋白残基88-113、孔石莼质体蓝素残基70-84、孔石莼残基57-98、和SEQ ID NO：22-30组成的组的目标铜氧还蛋白区域等价的对象铜氧还蛋白的残基。

13.一种组合物，其包括存在于药物组合物中的至少一种铜氧还蛋白或权利要求1的肽。

14.权利要求13的组合物，其中药物组合物被配制为用于静脉内施用。

15.权利要求13的组合物，其中铜氧还蛋白来自选自由铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌、Phormidium laminosum、粪产碱菌、氧化木糖无色杆菌、支气管败血性博德特菌、甲基单胞菌属、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌、黄瓜、Chloroflexusaurantiacus、副溶血弧菌和孔石莼组成的组的生物体。

16.权利要求15的组合物，其中铜氧还蛋白来自选自由铜绿假单胞菌、氧化亚铁硫杆菌、Phormidium laminosum和孔石莼组成的组的生物体。

17.权利要求13的组合物，其中铜氧还蛋白选自由SEQ ID NO：1-17和22-23组成的组。

18.一种治疗患有Ephrin信号传导系统相关性病理性病变或患有癌症的哺乳动物患者的方法，包括给所述患者施用治疗有效量的权利要求13的组合物。

19.权利要求18的方法，其中所述患者患有选自由间质性膀胱炎(IC)、炎性肠病(IBD)相关性病变、HIV感染、心血管病、中枢神经系统疾病、周围血管病、病毒性疾病、中枢神经系统退行性变(ChristopherReeve病)、和Alzheimer病组成的组的病理性病变。

20.权利要求19的方法，其中所述患者患有选自由乳腺癌、肝癌、胃肠癌、神经母细胞瘤、神经系统癌症、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、绒癌、畸胎癌、甲状腺癌、所有肉瘤包括源自软组织和骨骼的肉瘤、肾癌、表皮样癌和非小细胞肺癌组成的组的癌症。

21.权利要求18的方法，其中所述患者是人。

22.权利要求18的方法，其中通过选自由静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、吸入、局部施用、经皮贴片、栓剂和口服组成的组的方式施用所述组合物。

23.权利要求22的方法，其中施用方式是通过静脉内注射。

24.权利要求18的方法，其中在施用另一种已知能治疗所述病理性病变或癌症的药物的0分钟到1周内施用所述组合物。

25.权利要求24的方法，其中与另一种抗癌药物大约同时施用所述组合物。

26.一种组合物，其包括至少两种选自由铜氧还蛋白和权利要求1的分离的肽组成的组的分离的多肽。

27.权利要求26的组合物，其存在于药物组合物中。

28.一种试剂盒，其包括存在于瓶内的权利要求13的组合物。

29.权利要求28的试剂盒，其中所述试剂盒被设计为用于静脉内施用。

30.一种方法，包括用权利要求13的组合物接触哺乳动物癌细胞，并测定癌细胞的生长。

31.权利要求30的方法，其中癌细胞选自由乳腺癌、肝癌、胃肠癌、神经母细胞瘤、神经系统癌症、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、绒癌、畸胎癌、甲状腺癌、所有肉瘤包括源自软组织和骨骼的肉瘤、肾癌、表皮样癌和非小细胞肺癌组成的组。

32.权利要求30的方法，其中癌细胞是体内的癌细胞。

33.一种表达载体，其编码权利要求1的肽。

34.一种分离的肽，其是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，并与Ephrin受体结合。

35.权利要求34的分离的肽，其中Ephrin受体选自由EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6组成的组。

36.权利要求35的分离的肽，其也结合Ephrin。

37.权利要求36的分离的肽，其中Ephrin选自由EphrinA1、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4组成的组。

38.权利要求36的分离的肽，其结合Ephrin及其受体。

39.权利要求38的分离的肽，其结合Ephrin2B和Eph2B。

40.一种分离的肽，其是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，并与选自由EphrinA1、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4组成的组的Ephrin结合。

41.一种方法，包括给哺乳动物患者施用权利要求13的组合物以指导所述患者体内的血管生长。

42.一种方法，包括给哺乳动物患者施用权利要求13的组合物以减少所述患者体内的血管生长。

43.一种方法，包括给哺乳动物患者施用权利要求13的组合物以指导所述患者体内的神经元生长。

44.一种方法，包括给哺乳动物患者施用权利要求13的组合物以促进所述患者体内的骨生成。

45.一种方法，包括给哺乳动物患者施用有效量权利要求13的组合物以替代需要使用Ephrin的治疗方法中的Ephrin。

46.一种方法，包括用权利要求13的组合物接触哺乳动物细胞以抑制与所述细胞有关的Ephrin受体的活性。

47.一种方法，包括用权利要求13的组合物接触哺乳动物细胞以增加与所述细胞有关的Ephrin受体的活性。

48.一种方法，包括给具有表达Ephrin受体的组织的人类患者施用权利要求13的组合物，所述组合物包括铜氧还蛋白衍生物、或与药物融合的变体、衍生物或结构等价物。

49.权利要求48的方法，其中组织是癌组织。

50.检测哺乳动物患者体内具有Ephrin受体的组织的方法，包括步骤：

(a)给所述患者施用权利要求13的组合物，所述组合物包括铜氧还蛋白衍生物、或与可检测探针融合的变体、衍生物或结构等价物；和

(b)检测探针在患者体内的分布。

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