CN101600447A - 铜氧还蛋白衍生肽类的修饰物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有药理学活性的修饰的铜氧还蛋白衍生肽类，其具有改进的药代动力学性质，以及使用其治疗患有与此药理学活性有关的多种病症的哺乳动物的方法。铜氧还蛋白衍生肽类的修饰包括氨基酸序列变体和结构衍生作用，这些修饰增加了肽的血浆半衰期、增加了药理学活性的比活、降低免疫原性和减少肽的生物转化。修饰的铜氧还蛋白衍生肽类可以用于治疗哺乳动物的癌症、与不适当血管发生有关的病症、病毒和细菌感染且特别是HIV和疟疾、与ephrin信号有关的病症的方法，用于输送载物化合物(包括诊断化合物)至癌细胞的方法。
Description
相关申请的交叉参考
根据35U.S.C.§§119和120，此申请要求2006年9月11提交的美国临时申请序列号60/843,388的权益，其要求2005年10月6日提交的美国专利申请号11/244,105的优先权，其要求2004年10月7日提交的美国临时专利申请号60/616,782、2005年5月13日提交的美国临时专利申请号60/680,500及2005年7月19日提交的美国临时专利申请号60/700,297的优先权。这些申请的全部内容在此完全引入作为参考。
政府投资的声明
此申请的主题已经受到National Institutes of Health(NTH).Bethesda，Maryland，U.S.A.，(补助金号ES 04050-18)的科研补助金的支持。政府在这一发明中具有某些权益。
技术领域
本发明涉及具有药理学活性的修饰的铜氧还蛋白(cupredoxin)衍生肽类，所述肽具有改进的药代动力学性质，以及使用其治疗患有与药理学活性有关的多种病症的哺乳动物的方法。铜氧还蛋白衍生肽类的修饰包括氨基酸序列变体和结构衍生作用，所述修饰可能增加肽的血浆半衰期、增加药理学活性的比活、降低免疫原性和/或减少肽的生物转化。修饰的铜氧还蛋白衍生肽类可以用于治疗哺乳动物的癌症、与不适当血管发生有关的病症、病毒和细菌感染且特别是HIV和疟疾、与ephrin信号有关的病症的方法以及用于输送载物化合物(cargo compound)(包括诊断化合物)至癌细胞的方法。
发明背景
来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的铜氧还蛋白天青蛋白是有前途的新的治疗及诊断用分子。由铜绿假单胞菌产生的两种氧化还原蛋白质，铜氧还蛋白天青蛋白和细胞色素(Cyt c551)，均进入J774细胞，同正常细胞相比，显示了对于人癌细胞的显著的细胞毒性。Zaborina等人，Microbiology 146：2521-2530(2000)。天青蛋白还可以进入人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7细胞。Yamada等人，PNAS 99：14098-14103(2002)；Punj等人，Oncogene23：2367-2378(2004)；Yamada等人，Cell.Biol.7：14181431(2005)。此外，来自铜绿假单胞菌的天青蛋白优先进入J774鼠类网状细胞肉瘤细胞，与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物并稳定肿瘤抑制蛋白p53，增强细胞内p53的浓度并诱发细胞凋亡。Yamada等人，Infection and Immunity，70：7054-7062(2002)。同非癌性细胞比较，天青蛋白还引起人骨肉瘤细胞中细胞凋亡的显著增加。Ye等人，Ai Zheng 24：298-304(2003)。来自氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillusferrooxidans)的铁硫菌蓝蛋白(rusticyanin)也可以进入巨噬细胞并诱发细胞凋亡。Yamada等人，Cell Cycle 3：1182-1187(2004)；Yamada等人，Cell.Micro.7：1418-1431(2005)。来自层理席藻(Phormidium laminosum)的质体蓝素和来自Achromobacter cycloclastes的假天青蛋白也是针对巨噬细胞的细胞毒素。美国专利公布号20060040269，2006年2月23日公开。
天青蛋白目前还已知具有治疗意义的其他药理学活性。已知抑制人脐带血管内皮细胞(HUVEC)中血管发生。美国专利申请号11/488,693，2006年7月19日提交。也已知来自铜绿假单胞菌的天青蛋白具有抑制外周血液单个核细胞中HIV-1感染的增加以及抑制感染疟疾的哺乳动物的红细胞的寄生虫血症的能力。Chaudhari等人，Cell Cycle.5：1642-1648(2006)。也已知来自的铜绿假单胞菌的天青蛋白可干扰多种哺乳动物细胞和组织中ephrin信号系统。美国专利申请号11/436.592，2006年5月19提交的。
因此已经发现，天青蛋白，尤其是衍生自天青蛋白的两种肽，18-mer核28-mer，具有治疗和诊断用途。然而，患者体内治疗剂的功效是取决于多种因素。除了治疗药自身的活性之外，还存在治疗药的药代动力学性质，以其如何涉及给药之后的过程，即吸收、分布、代谢和排泄。药物的这些药代动力学性质描述了这些生物学过程如何影响服用药物的功效及影响的程度，这些性质包括血浆中的药物半衰期、药物的肝脏首过代谢、药物的体积分布、白蛋白结合药物的程度等。这些药代动力学性质各个可以对药物的功效具有深刻的影响。
药物吸收进入患者的血流的位点取决于给药途径。例如，口服给予的药物可能是在消化道的某一位点较另外的位点相比吸收更多，这是因为药物的化学和物理性质。在另一个方面，胃肠外给药的吸收不仅快于口服给药，而且药物的血液浓度是更加可预料的，因为药物的损失少得多，特别是在静脉给药中。生物利用度是给予的药物达到体循环的部分。
药物从血流进入细胞外流体(间质)和/或组织细胞的分布可以因药物的不同方面而改变。药物在体内的分布可以表示为“药物的体积分布”，其是药物分布于其中的流体的假定体积。药物的结构可能影响药物分布，由于疏水性药物更易于移动穿过大多数的生物膜，因此可以是分布在组织的细胞之内。药物也可能结合血液蛋白，因此可延迟其进入外周组织。例如，当在血流中时，萘普生是99％结合血浆蛋白，青霉素是60％结合，阿莫西林仅有20％结合，而米诺地尔是不结合的。Howard C.Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Formsand Delivery Systems 129(Lippincott，Williams and Wilkins 1999)。结合的药物既不暴露于身体的解毒过程，也不通过从肾小球的过滤从血流中除去。结合的药物是称为无活性部分，而未结合的部分认为是活性部分。药物的结合部分用作药物的储藏库，即，当游离药物的浓度不再足以确保蛋白质饱和时，其以未结合的活性形式释放进入血流。所以，结合在血液中的药物将留在体内更长时间，并可需要较少次给药。
患者中药物的代谢还将影响其功效。很多药物在从身体排出之前，经过生物转化。药物的生物转化可能导致形成这样的药物，所述药物是更加水溶性的、更加离子化的、较少能够结合血浆和组织中的蛋白、较少能够穿透细胞膜，以及使药物药理学活性降低的其他方面。生物转化的药物因此可以变得更低毒性和更易于排出。存在药物生物转化的四种主要途径：氧化、还原、水解和接合(conjugation)。氧化反应主要是通过肝细胞内结合内质网的氧化酶催化。还原反应主要是通过消化道和肝中的还原酶催化。水解分解主要是通过肝中的酯酶催化。葡萄糖醛酸苷结合作用，药物最常见的生物转化途径，通过药物和葡糖醛酸化合形成，产生易于从体内消除的离子型药物。Christensen等人，J.Pharm.Pharmacol.37：91-95(1985)。增加消除的其他生物转化的过程包括甲基化和酰化。
药物从体内的排泄可以通过多种途径发生。在药物从尿的消除中，肾具有支配作用。然而，药物还可以通过肝从血浆中消除。特别是对于口服的药而言，肝在确定药物的血浆半衰期起决定性作用。
需要的是铜氧还蛋白衍生肽类，其具有铜氧还蛋白的药理学活性而且在哺乳动物体内具有改进的药代动力学性质。特别地，在患者体内是稳定的并保持高度特异性的药理学活性以及具有长的的血浆半衰期的铜氧还蛋白衍生肽类将是特别有效的治疗剂和诊断剂。
发明概述
本发明的一个方面提供了分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽，即是铜氧还蛋白衍生肽的变体或衍生物。在实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽同未修饰的铜氧还蛋白衍生肽比较，具有改进的药代动力学性质。改进的药代动力学性质可能以下的一种或多种：(1)肽在患者体内更不易发生生物转化，(2)肽以更低的速率从患者中排泄，(3)肽具有增加的三级结构的稳定性，而且(4)肽具有更长的血浆半衰期。
此外，分离的肽可能具有铜氧还蛋白的至少一种药理学活性。感兴趣的特定药理学活性包括：(1)进入哺乳动物癌细胞，(2)不进入非癌性哺乳动物细胞，(3)进入癌前期哺乳动物细胞，(4)杀死哺乳动物癌细胞，(5)杀死癌前期哺乳动物细胞，(6)抑制哺乳动物癌细胞的生长，(7)抑制HIV-1感染，(8)抑制感染疟疾的红细胞的寄生虫血症，(9)干扰ephrin信号系统，和(10)抑制血管发生。
修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以衍生自来自铜绿假单胞菌、层理席藻、Ulvapertussis、氧化亚铁硫杆菌、Achromobacter cycloclastes、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringa)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、支气管败血性博德特氏菌(Bordctellabronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的铜氧还蛋白。铜氧还蛋白可以是天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白、auracyanin、漆树蓝蛋白、黄瓜碱性蛋白或天青蛋白样蛋白。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白可以是SEQ ID NO：1-12之一。分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以是截短的铜氧还蛋白。在特定的实施方案中，肽可以是SEQ IDNO：13-47之一。在其他特定实施方案中，SEQ ID NO：1-12与所述分离的肽具有至少约90％相同性。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽可能更不易发生水解。特别地，分离的肽可能具有铜氧还蛋白衍生肽的序列中的一个或多个天冬酰胺或丝氨酸残基，所述残基被另外的氨基酸残基特别是谷氨酸或苏氨酸残基取代。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽更不易发生脱酰胺作用。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甘氨酸残基被另外的氨基酸残基特别是苏氨酸或丙氨酸残基取代。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽中等同于铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基58或63的一个或多个的甘氨酸残基可以被取代。在另外的特别的实施方案中，分离的肽可能包含SEQ ID NO：30。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽更不易发生氧化。特别地，分离的肽可能具有铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甲硫氨酸或半胱氨酸残基，所述残基被另外的氨基酸残基特别是亮氨酸或缬氨酸残基取代。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽中等同于铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基56或64的一个或多个甲硫氨酸残基被取代。在另外的特定实施方案中，分离的肽可能含有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽可能更不易形成哌嗪二酮和焦谷氨酸。特别地，分离的肽可能在铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的位置1、2或3具有甘氨酸残基，所述残基被另外的氨基酸残基取代。此外，分离的肽可能在铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的位置3具有脯氨酸残基，所述残基被另外的氨基酸残基取代。进一步，分离的肽可能在铜氧还蛋白衍生肽的N-末端具有天冬酰胺残基，所述残基被另外的氨基酸取代。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽可能是较不易于发生消旋化。特别地，分离的肽可能具有铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个氨基酸残基，所述残基被所述氨基酸残基的D-异构体取代。在一特定实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的所有氨基酸残基被所述氨基酸残基的D-异构体的取代。在另外的特定实施方案中，分离的肽包含SEQ ID NO：45。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽可能更不易发生降解。特别地，铜氧还蛋白衍生肽的N-末端可能是乙酰化的。进一步，铜氧还蛋白衍生肽的C-末端可能是酰胺化的。在一特定实施方案中，分离的肽是SEQID NO：33。在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽被修饰以增加其三级结构的稳定性。特别地，分离的肽可能被修饰以增加至少一种α-螺旋的稳定性。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的至少一甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸的氨基酸残基被亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。在一特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的取代的残基可以是在等同于的铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基的内。在其他特定实施方案中，等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基57的残基上的谷氨酰胺可以用色氨酸残基取代，等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基52的残基上的苏氨酸可以被色氨酸残基取代，等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基61的残基上的苏氨酸可以用色氨酸残基取代，和/或等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基63的残基上的甘氨酸被色氨酸残基取代。在其他特定实施方案中，分离的肽包含SEQ ID NO：34-44之一。
在其他实施方案中，分离的肽可以具有铜氧还蛋白衍生肽两个或多个的赖氨酸残基，所述残基被ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸残基以i(i+4)间隔的方式取代。特别地，铜氧还蛋白衍生肽的被取代残基可以是在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
在其他实施方案中，分离的肽可能具有以i(i+4)间隔的方式取代进入铜氧还蛋白衍生肽的组氨酸-半胱氨酸或组氨酸-组氨酸残基对，以及至少Cu、Zn、Cd和Ru之一。在一特定的实施方案中，分离的肽可能具有铜氧还蛋白衍生肽的取代残基，所述取代残基在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
在另一个实施方案中，分离的肽可能具有铜氧还蛋白衍生肽中的一或多对的天然氨基酸残基，所述残基被相应于天然氨基酸的具有携带烯烃的系链的α，α-二取代非天然氨基酸取代。分离的肽可能具有铜氧还蛋白衍生肽的取代的残基，所述残基是在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
在一些实施方案中，分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽可能具有共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个PEG(聚乙二醇)分子。特别地，分离的肽可能具有共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个半胱氨酸残基的一个或多个PEG分子。在特定的实施方案中，分离的肽可能具有共价结合于一个或多个半胱氨酸残基的一个或多个PEG分子，所述半胱氨酸残基等同于铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的一个或多个残基3、6和112。在另外的实施方案中，半胱氨酸残基可能被取代进入铜氧还蛋白衍生肽，可以共价结合于PEG分子。
在另一个实施方案中，分离的肽可能具有在赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、N-末端氨基或C-末端羧酸处共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个PEG分子。在特定的实施方案中，分离的肽具有共价结合于PEG分子的一个或多个赖氨酸残基或C-末端羧酸。在另一个实施方案中，一个或多个赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基可能被取代进入铜氧还蛋白衍生肽并可以共价结合于PEG分子。在其他实施方案中，一个或多个PEG分子可以共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个氨基，或者随机地共价结合于铜氧还蛋白衍生肽。
每个铜氧还蛋白衍生肽的PEG分子的平均分子量可以是约200至约100,000道尔顿。铜氧还蛋白衍生肽可以共价结合于一个或多个分枝PEG分子，特别是当分枝PEG分子是约50kDa。铜氧还蛋白衍生肽可以共价结合于一个或多个直链PEG分子，特别是约5kDa的直链PEG分子。
本发明的另一个方面是药用组合物，其可以包含修饰的铜氧还蛋白衍生肽和药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面是治疗哺乳动物患有的病症的方法，其可以包括向哺乳动物施用治疗有效量的修饰的铜氧还蛋白衍生肽。在特定的实施方案中，哺乳动物是人。
本发明的另一个方面是分离的肽，其包含或由氨基酸序列X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(SEQ ID NO：48)组成；其中X1选自基团L和乙酰化-L；X2选自基团T和W；X3选自基团M、L和V；X4选自基团Q和W；X5选自基团G和A；X6选自基团T和W；X7选自基团G、T和W；X8选自基团M、L和V；X9选自基团D和酰胺化-D。
本发明的另一个方面是分离的肽，包含或由氨基酸序列X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(SEQ ID NO：49)组成；其中X1选自基团D和乙酰化-D；X2选自基团M、L和V；X3选自基团G、T和W；X4选自基团T和W；X5选自基团G和A；X6选自基团Q和W；X7选自基团M、L和V；X8选自基团T和W；和X9选自基团L和酰胺化-L。
本发明的另一个方面是分离的肽，其包含或由SEQ ID NO：50-3506序列组成。
序列简述
SEQ ID NO：1是来自的铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是来自层理席藻的质体蓝素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是来自的氧化亚铁硫杆菌的铁硫菌蓝蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是来自的Achromobacter cycloclastes的假天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是来自丁香假单胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是来自淋病奈瑟球菌的Laz的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是来自脑膜炎奈瑟球菌的Laz的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是来自副溶血弧菌的天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是来自支气管败血性博德特氏菌的天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是来自橙色绿屈挠菌的auracyanin A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是来自橙色绿屈挠菌的auracyanin B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是来自百日咳博德特氏菌的天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的50-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的50-67氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的36-128氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的36-89氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的36-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的36-50氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的50-66氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20是来自铜绿假单胞菌的wt-天青蛋白的67-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21是来自橙色绿屈挠菌的auracyanin B的57-89氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22是来自百日咳博德特氏菌的天青蛋白的50-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是来自脑膜炎奈瑟球菌的Laz蛋白的89-115氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ FD NO：24是来自来自铜绿假单胞菌的天青蛋白的53-70氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是来自铜绿假单胞菌的天青蛋白的53-64氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26是来自铜绿假单胞菌的天青蛋白的51-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27是来自丁香假单胞菌的天青蛋白的51-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28是来自副溶血弧菌的天青蛋白的52-78氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29是来自支气管败血性博德特氏菌的天青蛋白的51-77氨基酸片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：31是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：32是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：33是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：34是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：35是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：36是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：37是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：38是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：39是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：40是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：41是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：42是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：43是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：44是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：45是来自铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77氨基酸区域的变体的人工序列。
SEQ ID NO：46是天青蛋白的保守氨基酸序列，其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是赖氨酸且X是任何氨基酸。
SEQ ID NO：47是天青蛋白的保守氨基酸序列，其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是赖氨酸且X是任何氨基酸。
SEQ ID NO：48是铜绿假单胞菌的天青蛋白50-77修饰物的人工序列。
SEQ ID NO：49是铜绿假单胞菌的天青蛋白50-77的D-异构体修饰物的人工序列。
SEQ ID NO：50-3506是修饰的铜氧还蛋白衍生肽的人工序列。
附图简述
附图1.附图1描绘了已经注射标记的p18的小鼠的整个老鼠扫描的图象。
标记的p18(125μg)静脉内注射，无胸腺的小鼠在标明的时间周期使用
红外成像系统扫描，用于检测肿瘤和器官中标记的染料。
附图2.附图2描绘了已经注射标记的p18小鼠的整体老鼠和器官扫描的图象。125μg的
标记的p18，静脉注射后120小时(处死前立刻)。离体的器官扫描，右边显示。P18信号见于肾脏和Mel-2肿瘤。
附图3.Mel-2皮下肿瘤，在Mel-2细胞注射之后三周静脉注射125μg
标记的p18，
红外扫描是48小时进行。使用800nm信道记录的图象表示来自
的特异性p18信号，采用700nm信道记录的图象表示背景。P18信号见于肾脏和Mel-2肿瘤。
发明详述
定义
如本文所用的，术语“细胞”包括术语的单数或复数，除非专门定义为“单个细胞”。
如本文所用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是可交换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。术语应用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人造化学类似物。术语也应用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”也包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应当理解，多肽不总是完全直链的。例如，作为遍在蛋白化作用的结果，多肽可以是支链的，其可能是环状的(有或没有分枝)，这通常作为翻译后事件的结果，包括天然加工事件和非天然存在的人为操作带来的事件。环状、支链和支链环状的多肽可以是通过非翻译的自然过程和完全合成方法合成的。合成肽是不借助细胞组分制得。制备肽的合成方法也是本领域熟知的，并是商业上可以获得。进一步，本发明预期本发明蛋白的含甲硫氨酸及较少甲硫氨酸的氨基末端变体的应用。
如本文所用的，术语“病症”包括偏离正常的解剖学和生理学的偏差，构成活体动物或其一部分的正常状态的病损，中断和改变身体功能的执行。
如本文所用的，术语“抑制细胞生长”指的是减缓或中止细胞分裂和/或细胞扩增。此术语还包括抑制细胞发育或增加细胞死亡。
如本文所用的，术语“患有”包括目前显示病症的症状，具有甚至观察不到症状的病症，在从病症恢复中，以及已从病症恢复。
如本文所用的，术语“治疗”包括预防、降低、停止或逆转与待治疗的病症有关的病症或症状的进程或严重度。因此，术语“治疗”在适当情况下包括医药、治疗性和/或预防性给药。
“治疗有效量”是这样的量，有效预防、降低、停止或逆转待治疗患者的特定病症或特定病症的已有症状的发展，或者部分或完全地减轻待治疗患者的特定病症或特定病症的已有症状。本领域技术人员有能力确定治疗有效量。
如本文所用的，术语“药理学活性”指的是药物或其他化学药品对于生物学系统的作用。化学药品的作用可以是有益(治疗性的)或有害的(毒性)。纯的化学药品或混合物可以是天然来源(植物、动物或矿物)的或可以是合成的化合物。
如本文所用的，术语“癌前期(premalignant)”指的是癌变前的，或者是不受控制的异常的细胞分裂之前。
如本文所用的，术语“药代动力学性质”指的是描述活性剂或药物在生物体或宿主中分布的参数。代表性药代动力学性质包括：血浆半衰期、肝首过代谢、分布体积、与血清蛋白例如白蛋白结合的程度等等。
如本文所用的，术语“血浆半衰期”指的是给予的药物通过生物学过程例如生物代谢、排泄等从患者的血浆中消除一半的时间，
如本文所用的，术语“分布体积”指的是遍及生物的不同隔室，例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等的药物的分布和保留的程度。这个因素表达为“表观分布体积”或Vd，其是药物分布于身体的估计体积。大Vd揭示，药物更广泛地分布遍及身体，可以是与更长半衰期有关，因为药物在血浆中的部分将较少，且因此较少的药物被传送到消除点如肾和肝。
如本文所用的，术语“血清结合的程度”指的是药物被血清蛋白如白蛋白结合的倾向。
如本文所用的，术语“功效”指的是特定活性剂对于预期目的的有效性，即，给定活性剂产生其期望药理学效应的能力。
如本文所用的，术语“比活”指的是在在给定的每毫克酶的条件下的给定的时间量下由酶形成的产物的量。比活是等同于反应速度x反应体积/酶量。在转运肽的情形下，比活将是在给定的每毫克转运肽或转运肽-负荷复合物的条件下的给定的时间量下纳入细胞的转运肽或转运肽-负荷复合物的量。
如本文所用的，术语“基本上纯的”，当用于修饰蛋白或本发明的其他细胞产物时，是指例如从生长培养基或细胞内含物中分离出的蛋白，为基本上不含或不掺杂其他蛋白和/或活性抑制化合物的形式。术语“基本上纯的”指的是基于干重计算，至少约75％量的因数的分离部分，或者至少“75％基本上纯的”。更特别地，术语“基本上纯的”指的是基于干重计，至少85％活性化合物的化合物，或者至少“85％基本上纯的”。最特别地，术语“基本上纯的”指的是基于干重计，至少约95％的活性化合物的化合物，或者至少“95％基本上纯的”。术语“基本上纯的”也可以用于修饰合成制得的蛋白或化合物，其中例如合成蛋白是从合成反应的试剂和副产物中分离出的。
如本文所用的，当涉及肽或本发明的化合物时，术语“药物等级”是基本上或实质上从正常伴随在其天然状态中的物质(包括合成试剂和副产物)组分中分离的肽或化合物，并且基本上或实质上与将损害其作为药物用途的组分分离。例如，“药物等级”肽可以与任何致癌原分离。在某些情况下，“药物等级”可以是用预期给药的方法修饰，如“静脉药物等级”，以便表明其基本上或实质上与任何使得组合物不适合于静脉给药于患者的肽或化合物分离。例如，“静脉药物等级”肽可以是从去污剂如SDS和抗菌剂如叠氮化物中分离出的。
术语“分离”、“纯化”或“生物学纯”指的是这样的物质，其基本上或实质上不含如其以正常状态发现的正常伴随该物质的组分。因此，本发明的分离的肽优选不含在其原来的环境中正常伴随肽的物质。“分离的”区域是指这样的区域，其不包括衍生出该区域的多肽的整个序列。“分离的”核酸、蛋白或其各自的片段已经基本上从其体内环境中除去，以便其可以由技术人员处理，如但不限于核苷酸测序、限制消化、定向诱变和亚克隆进入表达核酸片段的载体以及获得基本上纯的蛋白或蛋白片段。
术语“野生型”如在此所用的，是指肽，意思是该肽与如天然存在肽具有相同的序列。
如在此所用的术语“变体”，关于肽，是指同野生型多肽比较其可能具有氨基酸的取代、缺失或插入的氨基酸序列变体。变体可以是野生型肽的截短(truncation)。“缺失”是从野生型蛋白中除去一个或多个氨基酸，而“截短”是从野生型蛋白的一个或多个末端除去一个或多个氨基酸。因此，变体肽可能是由处理编码多肽的基因制得。变体可以是由改变多肽的基本组成或特征制得，但不改变至少某些其基本药理学活性。例如，铜绿假单胞菌转移肽的“变体”可以是突变型的铜绿假单胞菌转移肽，保持其进入癌细胞的能力。在某些情况下，变体肽是用非天然氨基酸合成的，如ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸残基。(Ghadiri & Fernholz，J.Am.Chem.Soc，112：9633-9635(1990))。在一些实施方案中，同野生型肽或其部分相比，变体具有至多20、19、18、17或16个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，同野生型肽或其部分相比，变体具有至多15、14、13、12或11个氨基酸被取代、缺失、或插入。在一些实施方案中，同野生型肽或其部分相比，变体具有至多10、9、8或7个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，同野生型肽或其部分相比，变体具有至多6个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，同野生型肽或其部分相比，变体具有至多5或4个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，同野生型肽或其部分相比，变体具有至多3、2或1个氨基酸被取代、缺失或插入。
术语“氨基酸”，如本文所用的，意思是包含任何天然存在或非天然存在或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即包含由一、二、三或多个碳原子通常是一个(α)碳原子直接连接的至少一羧基和至少一氨基残基的任何部分。氨基酸可以是氨基酸的L-异构体或D-异构体。
如本文所用的关于肽的术语“衍生物”是指衍生自目标肽的肽。衍生包括肽的化学修饰以便肽仍然保持某些其基本的药理学活性。例如，铜绿假单胞菌转运肽的“衍生物”可以是化学修饰的铜绿假单胞菌转运肽，保持其进入癌细胞的能力。感兴趣的化学修饰包括，但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸盐化、聚乙二醇(PEG)改性、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽与化学化合物的融合体，所述化学化合物如，但不限于另外的肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或检测探针。
术语“氨基酸序列相同性百分数(％)”定义为当两个序列对比时，多肽的氨基酸残基与候选序列氨基酸残基相同性的百分数。为测定氨基酸相同性％，进行序列对比，并且如果需要的话，引入缺口以获得最大％序列相同性；保守取代不视为序列相同性的部分。测定相同性百分数的氨基酸序列对比方法对于本领域技术人员是公知的。通常使用可公开获得的计算机软件进行肤序列对比，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件。在一特定的实施方案中，使用Blastp(从National Center for Biotechnology Information得到，Bethesda MD)，使用长复杂滤波器的缺省参数，expect 10、word size 3、existence 11和extension 1。当进行氨基酸序列对比时，给定的氨基酸序列A同、与或相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列相同性(其换句话说可表达为具有或包含同、与或相对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列相同性的给定氨基酸序列A)可计算为：
％氨基酸序列相同性＝X/Y*100
其中
X是通过A和B的序列对比程序对比或序列对比算法对比而记为相同匹配的氨基酸残基数目，并且
Y是B中氨基酸残基的总数目。
如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A对B的％氨基酸序列相同性将不等于B对A的％氨基酸序列相同性。当更长的序列比较更短的序列时，较短的序列将是“B”序列。例如，当比较截短的肽与相应的野生型多肽时，截短的肽将是“B”序列。
总则
本发明涉及保持铜氧还蛋白的一个或多个药理学活性的铜氧还蛋白衍生肽，其可以具有改进的药代动力学性质，如改进的稳定性、比活、血浆中的半衰期和/或降低的免疫原性等。此外，本发明涉及衍生于修饰的铜氧还蛋白衍生肽的化合物，反过来其还保持铜氧还蛋白的一个或多个药理学活性，并且其具有改进的药代动力学性质。最终，本发明涉及使用修饰的铜氧还蛋白衍生肽类以及由其制得的化合物治疗和/或诊断哺乳动物患者患有的不同病症的方法，以及研究哺乳动物患者患有的不同病症的方法。
组合物
本发明涉及修饰的铜氧还蛋白衍生肽类的肽，其具有改进的药代动力学性质。在一些实施方案中，这些修饰的铜氧还蛋白衍生肽类保持铜氧还蛋白的至少一种药理学活性。在一些实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽类是分离的、基本上纯的或药物等级。在特定的实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽类是静脉注射的药物等级。
铜氧还蛋白且特别是来自的铜绿假单胞菌的天青蛋白，已知具有用于治疗和/或诊断哺乳动物患者以及用于对哺乳动物患者患有的病症进行研究的多种有用的药理学活性。例如，许多铜氧还蛋白蛋白如铜绿假单胞菌天青蛋白具有特异性进入并杀死多种类型的哺乳动物癌细胞能力。Yamada等人，Cell.Biol.7：1418-1431(2005)；Hiraoka等人，PNAS 101：6427-6432(2004)；Hiraoka等人Biochem.Biophys.Res.Cornm.338：1284-1290(2005)；美国专利申请号11/244,105，2005年10月6日提交；美国专利申请号10/720,603，2003年11月24日提交；美国专利申请号10/047,710，2002年1月15日提交；美国专利申请号11/485,252，2006年7月13日提交，其全部在此以全文清楚引入作为参考。来自铜绿假单胞菌的天青蛋白还已知抑制病毒或细菌感染的生长，更特别地是外周血液单个核细胞中HIV-1感染，还已知抑制疟疾-感染的哺乳动物的红细胞的寄生虫血症。Chaudhari等人，Cell Cycle.5：1642-1648(2006)；美国专利申请号11/436,591，2006年5月19日提交；美国专利申请号11/436,590，2006年5月19日提交的，其均在此以全文清楚引入作为参考。来自的铜绿假单胞菌的天青蛋白还已知干扰多种哺乳动物的细胞和组织中的的ephrin信号系统。2006年5月19日提交的美国专利申请号11/436,592，其在此以全文清楚引入作为参考。进一步，衍生自铜绿假单胞菌天青蛋白的肽已知抑制哺乳动物的细胞特别是人脐带血管内皮细胞(HUVECs)中的血管发生。2006年7月19日提交的美国专利申请号11/488,693，其在此以全文清楚引入作为参考。在一些实施方案中，本发明的修饰的铜氧还蛋白衍生肽类保持其衍生自的铜氧还蛋白的至少一种药理学活性。铜氧还蛋白的药理学活性可以是铜氧还蛋白的任何有用活性。特别感兴趣的药理学活性包括，但不限于特异性进入哺乳动物癌细胞的能力、进入非癌的哺乳动物细胞的能力、进入癌前期哺乳动物细胞的能力、杀死哺乳动物癌细胞的能力、杀死癌前期哺乳动物细胞的能力、抑制病毒或细菌感染的生长的能力、抑制外周血液单个核细胞中HPV-1感染的能力、抑制由于疟疾引起的疟疾感染的红细胞的寄生虫血症的能力以及抑制哺乳动物细胞特别是HUVECs中血管发生的能力。测量肽的药理学活性的量的方法是在以上引用的申请和出版物中提供。
铜氧还蛋白衍生肽类可以是任何铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等效物。在一些实施方案中，铜氧还蛋白肽保持铜氧还蛋白的至少一种药理学活性。在一些实施方案中，铜氧还蛋白可以是，但不限于天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白、auracyanin或天青蛋白样蛋白。
铜氧还蛋白衍生肽类可以是来自任何生物，包括但不限于铜绿假单胞菌、层理席藻、氧化亚铁硫杆菌、Achromohacter cycloclastes、Psendomonussyringae、淋病奈瑟球菌、副溶血弧菌、支气管败血性博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、橙色绿屈挠菌和淋病奈瑟球菌。在一些实施方案中，铜氧还蛋白可以是天青蛋白，特别是来自包括但不限于铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、淋病奈瑟球菌、副溶血弧菌或支气管败血性博德特氏菌的生物。
铜氧还蛋白衍生肽类可以是铜氧还蛋白的任何变体、衍生物或结构等效物。铜氧还蛋白衍生肽类也可以是现有技术已知的和/或先前申请如2005年10月6日提交的美国专利申请号11/244,105、2003年11月24日提交的美国专利申请号10/720,603、2002年1月15提交的美国专利申请号10/047,710、2006年7月13日提交的美国专利申请号11/485,252、2006年5月19日提交的美国专利申请号11/436,591、2006年5月19日提交的美国专利申请号11/436,590、2006年5月19日提交的美国专利申请号11/436,592和2006年7月19日提交的美国专利申请号11/488,693中所述的任何铜氧还蛋白肽。这些申请全部在此以全文清楚引入作为参考。在一些实施方案中，肽是分离的。在一些实施方案中，肽是基本上纯的或药物等级的。在其他实施方案中，肽是在包含或基本上由肽组成的组合物中。在另外的特定实施方案中，肽不在哺乳动物更特别是人中引起免疫应答。铜氧还蛋白衍生肽类可以是来自的的的氨基酸序列。变体，同野生型铜氧还蛋白比较，其具有氨基酸取代、缺失或插入。这些变体可以是野生型铜氧还蛋白的截短。铜氧还蛋白衍生肽类包含铜氧还蛋白的一定区域，所述区域少于全长野生型多肽。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类包含超过约10个残基，超过约15个残基或超过约20个残基的截短的铜氧还蛋白。在某些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类包含至多约100个残基、至多约50个残基、至多约40个残基、至多约30个残基或至多约20个残基的截短的铜氧还蛋白。在一些实施方案中，铜氧还蛋白对于铜氧还蛋白衍生肽且更特别是SEQ ID NO：1-12具有至少约70％氨基酸序列相同性、至少约80％氨基酸序列相同性、至少90％氨基酸序列相同性、至少约95％氨基酸序列相同性或至少约99％氨基酸序列相同性。
在特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽包含铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77、天青蛋白残基50-67或天青蛋白残基36-88。在其他实施方案中，铜氧还蛋白的变体是由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77、天青蛋白残基50-67或天青蛋白残基36-88组成。在其他特定实施方案中，变体是由非天青蛋白铜氧还蛋白的等同残基组成。为了测定另外铜氧还蛋白的等同残基，目标铜氧还蛋白氨基酸序列将对比铜绿假单胞菌天青蛋白序列，使用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)，位于铜绿假单胞菌天青蛋白氨基酸序列上有关残基以及在目标铜氧还蛋白序列上发现的等同残基，和由此设计的等同肽。
在本发明的一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽包含橙色绿屈挠菌(SEQ IDNO：21)的auracyanin B的至少氨基酸57-89。在本发明的另一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽包含丁香假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：27)的至少氨基酸51-77。在本发明的另一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽包含脑膜炎奈瑟球菌Laz(SEQ ID NO：23)的至少氨基酸89-115。在本发明的另一实施方案中铜氧还蛋白衍生肽包含副溶血弧菌天青蛋白(SEQ ID NO：28)的至少氨基酸52-78。在本发明的另一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽包含支气管败血性博德特氏菌天青蛋白(SEQ IDNO：29)的至少氨基酸51-77。
铜氧还蛋白衍生肽类还包括用非天然存在的合成氨基酸制得的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以是整合入变体肽以延长或优化血液中组合物的半衰期。这样的变体包括，但不限于D，L-肽(非对映异构体)，(参见，例如Futaki等人，J.Biol.Chem.276(8)：5836-40(2001)；Papo等人.Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller等人，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987)；含罕见氨基酸的肽(参见，例如Lee等人，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))，含烯烃的非天然的氨基酸接着烃纤维包扎(参见，例如Sehafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski等人，Science 305：1466-1470(2004))，以及含ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸残基的肽。
在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽是铜氧还蛋白的衍生物。铜氧还蛋白的衍生物是化学修饰的肽以便肽仍然保留其某些基本药理学活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以是保留其抑制哺乳动物癌细胞生长的能力的化学修饰的天青蛋白。感兴趣的化学修饰包括，但不限于肽的烃稳定、酰胺化、乙酰化、硫酸盐化、聚乙二醇(PEG)改性、磷酸化和糖基化。此外，衍生肽可以是融合铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等效物成化学化合物如，但不限于另外的肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或检测探针。感兴趣的衍生物包括化学修饰，通过化学修饰本发明的肽和组合物在血流中的半衰期可以延长或优化，如通过本领域熟知的多种方法，包括但不限于成环形的肽(参见，例如Monk等人，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest等人，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))，N-和C-末端修饰(参见，例如Labrie等人，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))，含烯烃的非天然氨基酸接着烃钉针(hydrocarbonstapling)(参见，例如Schamieister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski等人，Science 305：1466-1470(2004))。
在另一个实施方案中，肽是铜氧还蛋白的结构等效物或截短的铜氧还蛋白。测定铜氧还蛋白和其他蛋白之间的显著结构同源性的研究的实例包括Toth等人(Developmental Cell 1：82-92(2001))。特别地，铜氧还蛋白和结构等效物之间的显著结构同源性是通过使用VAST算法测定。Gibrat等人，CurrOpin Struct Biol 6：377-385(1996)；Madej等人，Proteins 23：356-3690(1995)。在特定的实施方案中，得自铜氧还蛋白与结构等效物的结构比较的VAST p值是少于约10-3，少于约10-5或少于约10-7。在其他实施方案中，铜氧还蛋白和结构等效物的显著结构同源性是通过使用DALI算法测定。Holm & Sander，J.MoL Biol.233：123-138(1993)。在特定的实施方案中，配对结构比较的DALIZ得分是至少约3.5、至少约7.0或至少约10.0。
感兴趣的某一特定铜氧还蛋白衍生肽是铜氧还蛋白的进入区与载物化合物的融合。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类可以特异性进入哺乳动物癌细胞，借此可以用于传送载物化合物进入细胞，并特异性进入癌细胞。铜氧还蛋白转运肽包含铜氧还蛋白进入区。术语“铜氧还蛋白进入区”指的是包含铜氧还蛋白进入哺乳动物癌细胞所需的氨基酸序列的铜氧还蛋白片段。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白转运肽是SEQ ID NO：13-17，或来自另外铜氧还蛋白的等同残基。本发明包括与载物化合物络合的铜氧还蛋白转运肽，其以及修饰以改进其药代动力学性质。载物化合物以及铜氧还蛋白转运肽可以是通过在此所述的方法修饰，以改进其药代动力学性质。这些复合物然后可以是用于本发明的方法中以传送载物化合物进入哺乳动物癌细胞，从而治疗患有癌症的患者。通过本发明的物质合方法传送的载物化合物包括，但不限于蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸包括反义核酸、燃料、荧光和放射性标记物、微颗粒或毫颗粒、毒素、无机和有机分子、小分子和药物。在某些实施方案中，药物和毒素杀死肿瘤细胞。使用其制得的这样的铜氧还蛋白转运肽和复合物是在2005年10月6日提交的美国专利申请号11/244.105中提供，其在此以全文清楚引入作为参考。
在一些实施方案中，在具有期望的药理学活性的铜氧还蛋白中的铜氧还蛋白衍生肽类中保守的氨基酸残基保留在具有改进的药代动力学性质的修饰的铜氧还蛋白衍生肽类中。例如，已知在铜绿假单胞菌天青蛋白的铜氧还蛋白进入区(entry domain)中，多个残基是保留在来自多个种类铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、淋病奈瑟球菌、副溶血弧菌和支气管败血性博德特氏菌的天青蛋白和天青蛋白样的蛋白中。Yamada等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005)。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽保留相应于残基62、63、69、72、74和77铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，铜氧还蛋白肽包含保守的氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO：46)或DGXXXXDXXYXKXXD(SEQID NO：47)，其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是赖氨酸和X是任何氨基酸。
修饰
本发明涉及铜氧还蛋白衍生肽类的修饰物，其是变体或衍生物，而且在特定的实施方案中，保持一种或多种药理学活性，和/或其改进肽的药代动力学性质。这些修饰包括，但不限于可能增加其稳定性、比活、血浆半衰期和/或降低铜氧还蛋白衍生肽的免疫原性，同时保持铜氧还蛋白进入哺乳动物癌细胞和/或抑制哺乳动物癌细胞的生长的能力的肽的变体和衍生物。这样的变体包括，但不限于减少肽的水解、降低肽的脱酰胺作用、减少氧化、降低肽免疫原性和/或增加肽的结构稳定性的那些。本发明预期，在此所述的两种或多种修饰可以是组合在一个修饰的铜氧还蛋白衍生肽中，以及本文所述的一种或多种修饰与改进药代动力学性质的其他修饰的组合是本领域技术人员熟知的。设计这种变体和衍生物的多种方法是本领域熟知的。
生物转化
改进肽的药代动力学性质的一个手段是创造较不易发生生物转化的铜氧还蛋白衍生肽的变体和衍生物。生物转化可以降低肽的药理学活性以及增加其从患者体内清除的速率。完成这一目标的一种途径是测定最大可能是生物转化的并用不易受该特定生物转化过程影响的氨基酸取代这些氨基酸的氨基酸和/或氨基酸序列。
水解是含天冬氨酸的肽的常见问题。天冬氨酸是易受脱水影响，以形成环状酰亚胺中间体，引起天冬氨酸将转化成可能失活的异天冬氨酸类似物，最终裂开肽链。例如，在肽序列中天冬氨酸-脯氨酸的存在下，环状酰亚胺中间体的酸催化形成可以导致分裂肽链。类似地，在肽序列中天冬氨酸-甘氨酸存在下，环状中间体可以是水解成原始的天冬氨酸变型(无害)或水解成异天冬氨酸类似物。最后，全部的天冬氨酸变型可以是完全转化成异天冬氨酸类似物。类似地，含丝氨酸的序列也可以是脱水形成可以裂开肽链的环状酰亚胺中间体。肽的分裂可能导致肽的血浆半衰期的缩短以及特定药理学活性的降低。
本发明预期，用其他氨基酸取代铜氧还蛋白衍生肽的序列中的天冬酰胺和/或丝氨酸，可能产生具有改进的药代动力学性质的肽，如更长的血浆半衰期和增加比活的药理学活性的肽。在一个预期的变体中，在铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个天冬酰胺残基上，可以用另外的氨基酸残基特别是谷氨酸残基取代。在另一预期的变体中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个丝氨酸残基可以用另外的氨基酸残基特别是苏氨酸残基取代。在铜氧还蛋白衍生肽的某些变体中，一个或多个天冬酰胺残基和一个或多个丝氨酸残基是被取代。在一些实施方案中，进行保守的取代。在其他实施方案中，进行非保守的取代。
氨基酸残基的脱酰胺是生物转化中值得注意的问题。这种碱催化反应常常在含的天冬酰胺-甘氨酸或谷氨酰胺-甘氨酸的序列中发生，遵循类似于以上的天冬氨酸-甘氨酸序列的机理。天冬酰胺-甘氨酸序列的脱酰胺形成环状酰亚胺中间体，该中间体接着水解形成天冬氨酸或天冬酰胺的异天冬氨酸类似物。此外，环状酰亚胺中间体可以产生外消旋化成天冬酰胺的D-天冬氨酸或D-异-天冬氨酸类似物，其全部可能产生灭活形式的肽。
本发明预期铜氧还蛋白肽中的脱酰胺可以通过用另外的氨基酸取代铜氧还蛋白的天冬酰胺-甘氨酸或谷氨酰胺-甘氨酸序列的甘氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺防止，可能得到具有改进的药代动力学性质如肽的更长的血浆半衰期和增加比活的药理学活性的肽。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甘氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甘氨酸残基被苏氨酸或丙氨酸残基取代。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺残基被另外的氨基酸残基取代。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺残基被丙氨酸残基取代。在其他特定实施方案中，在铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)残基58和/或63上的甘氨酸或其他铜氧还蛋白的等同的甘氨酸被丙氨酸或苏氨酸取代。在其他特定的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基59处的甲硫氨酸，或者另外的铜氧还蛋白衍生肽的等同的甲硫氨酸残基被丙氨酸残基取代。在其他特定实施方案中，在铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基63处的甘氨酸或者另外铜氧还蛋白衍生肽的等同的甘氨酸残基被苏氨酸残基取代。在一些实施方案中，进行保守取代。在其他实施方案中，进行非保守的取代。在特定的实施方案中，本发明的修饰的铜氧还蛋白衍生肽包含以下序列，其中下划线的氨基酸是取代进入野生型铜绿假单胞菌天青蛋白LSTAADMQAVVTDTMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：30)。
氨基酸的可逆和不可逆的氧化是也可能造成降低铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性和/或血浆半衰期的问题的其他生物转化过程。半胱氨酸和甲硫氨酸残基是经受可逆氧化的主要残基。半胱氨酸的氧化是在较高pH下加快，其中巯基更容易去质子化并且易于形成链内或链间的二硫键。通过用二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基膦)盐酸化物(TCEP)处理，这些二硫键可以容易在体外逆转。通过化学和光化学途径，甲硫氨酸氧化形成甲硫氨酸亚砜(Methioninesufoxide)并进一步形成甲硫氨酸砜，其两者几乎不可能逆转。
本发明预期，铜氧还蛋白衍生肽中的氧化可以是通过用其他残基取代甲硫氨酸和/或半胱氨酸残基来防止。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甲硫氨酸和/或半胱氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。在特定的实施方案中，甲硫氨酸残基被亮氨酸或缬氨酸残基取代。在其他特定实施方案中，在铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基56和64上的一个或多个甲硫氨酸，或其他铜氧还蛋白衍生肽上的等同甲硫氨酸残基被亮氨酸或缬氨酸取代。在一些实施方案中，进行保守取代。在其他实施方案中，进行非保守的取代。在特定的实施方案中，本发明的铜氧还蛋白肽包含以下序列之一，其中下划线的氨基酸是取代进入野生型铜绿假单胞菌天青蛋白序列：
LSTAADLQGVVTDGLASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：31)或
LSTAADVQGVVTDGVASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：32)。
可能影响铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性、血浆半衰期或免疫原性的另外的生物转化过程是哌嗪二酮和焦谷氨酸形成。哌嗪二酮形成通常是当甘氨酸在N-末端的第三个位置时发生，更特别地，如脯氨酸或甘氨酸是在位置1或2时。反应包括第二个氨基酸和第三个氨基酸之间的酰胺羰基上的N-末端的氮的亲核攻击，其导致哌嗪二酮形式的头两个氨基酸的分裂。在其他方面，如果谷氨酰胺是在N-末端，焦谷氨酸形成几乎是不可避免的。这是类似反应，在其中N-末端氮攻击谷氨酰胺的侧链羰基碳以形成脱氨的焦谷氨酰肽类似物。这种转化也在含N-末端的天冬酰胺的肽中存在，但是程度要低得多。
本发明预期，哌嗪二酮和焦谷氨酸形成可以在铜氧还蛋白衍生肽中减少，通过用另外的氨基酸残基取代肽的N-末端的1、2或3位的甘氨酸、取代肽的N-末端的3位的脯氨酸，或者取代肽的N-末端的天冬酰胺。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的1、2或3位的甘氨酸被另外的氨基酸残基取代。在特定的实施方案中，甘氨酸残基被苏氨酸或丙氨酸残基取代。在另一个实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的3位的脯氨酸被另外的氨基酸残基取代。在特定的实施方案中，脯氨酸被丙氨酸残基取代。在另一个实施方案中，N-末端的天冬酰胺被另外的氨基酸残基取代。在特定的实施方案中，天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代。在一些实施方案中，进行保守取代。在其他实施方案中，进行非保守的取代。
可以影响铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性、血浆半衰期和/或免疫原性的另外的生物转化过程是消旋化。这个术语宽泛地理解为是指氨基酸或肽的手性完整性的全部丧失。消旋化包括氨基酸的某一对映异构体(通常是L-形式)的碱催化转化成L-和D-对映异构体的1∶1的混合物。改进肽的稳定性的一种手段通常是通过制备逆反式(D-异构体)肽。肽结构的双重翻转常常保留侧链完整的表面拓扑学，并且已经广泛地用于稳定生物学上活性的肽。Snyder等人，PLoS Biol.2：0186-0193(2004)。D-氨基酸取代的Tat是纳入细胞和L-氨基酸肽。Futaki等人，J.Biol.Chem.276：5836-5840(2001)；Huq等人，Biochemistry38：5172-5177(1999)。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个氨基酸残基被该氨基酸残基的D-异构体取代。在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的全部氨基酸残基被这些残基的D-异构体来取代。在一实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽是铜氧还蛋白衍生肽的逆反式(D-异构体)版本。在一特定的实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽是
DDPKLYDKDLGSAMGDTVVGQMDAATSL(SEQ ID NO：45)。
保护铜氧还蛋白衍生肽免受生物转化降解的其他方法是N-乙酰化和C-酰胺化。这些衍生物可以保护肽免受降解，并可以使铜氧还蛋白衍生肽更接近模拟天然蛋白的α氨基和羧基的电荷状态。N-乙酰化和/或C-酰胺化的肽可以由商业供应商提供。在本发明的一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的N-末端可以是乙酰化。在本发明的另一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类的C-末端可以是酰胺化。在一特定实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽是
乙酰化-LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD-酰胺化(SEQ IDNO：33)。
三级结构稳定性
铜氧还蛋白衍生肽的三级结构的稳定性将影响药理学的大部分方面，包括药理学活性、血浆半衰期和/或免疫原性等。参见Kanovsky等人，CancerChemother，Pharmacol 52：202-208(2003)；Kanovsky等人，PNAS 23：12438-12443(2001)。肽螺旋常常瓦解成任意的卷，变得更易受蛋白酶攻击的影响，并不可能穿透细胞膜壁。Schafirneister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)。因此，稳定肽的整个结构的一个手段是稳定肽的α-螺旋结构。与螺旋形成有关的分子内氢键降低极性酰胺骨架的暴露，借此减少转运肽中膜穿透的障碍，因此增加相关的药理学活性并使用肽增加耐蛋白酶分裂。Id.铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)在残基53-56、58-64和68-70上具有α-螺旋。
稳定α-螺旋的一种方法是使用螺旋形成残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸取代α-螺旋中的螺旋断裂氨基酸残基如甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和天冬氨酸或螺旋中性氨基酸残基如丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸或精氨酸。值得关注的是铜氧还蛋白衍生肽的α-螺旋可以通过使用其他氨基酸取代一个或多个甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和/或天冬氨酸残基来稳定。在特定的实施方案中，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸和/或精氨酸残基被亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或甲硫氨酸残基取代。参见Lee等人，Cancer Cell Intl.11：21(2005)。在其他特定实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的α-螺旋中一个或多个丝氨酸或谷氨酰胺残基可以被取代。而在更特定的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基53-56、58-64和68-70中的丝氨酸和/或谷氨酰胺残基，或其他铜氧还蛋白衍生肽的等同残基可以被取代。在另外的特定实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQID NO：1)的氨基酸残基57上的谷氨酰胺残基，或者另外铜氧还蛋白衍生肽的等同残基可以被取代，更特别地用色氨酸取代。在另外的特定实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基52上的苏氨酸残基，或者另外铜氧还蛋白衍生肽的等同残基可以被取代，更特别地被色氨酸取代。在另外的特别实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基61上的苏氨酸残基，或者另外铜氧还蛋白衍生肽的等同残基可以被取代，更特别地被色氨酸取代。在另外的特定实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基63上的甘氨酸残基，或者另外铜氧还蛋白衍生肽的等同残基可以被取代，更特别地被色氨酸取代。在另外的特定实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基52、57、61或63上的一个或多个苏氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸残基，或者另外铜氧还蛋白衍生肽的等同残基可以被取代，更特别地被色氨酸取代。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白肽包含以下序列之一，其中下划线的氨基酸是取代进入野生型铜绿假单胞菌天青蛋白序列：
LSWAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：34)；
LSTAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：35)；
LSTAADMQGVVWDGMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：36)；
LSTAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：37)；
LSWAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID XO：38)；
LSWAADMQGVVWDGMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：39)；
LSWAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：40)；
LSTAADMWGVVWDGMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：41)；
LSTAADMWGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：42)；
LSTAADMQGVVWDWMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：43)；或
LSWAADMWGVVWDWMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO：44)。
在其他实施方案中，其他铜氧还蛋白衍生肽中的等同氨基酸被色氨酸取代。
稳定α-螺旋三级结构的另一种方法包括使用能够π-堆积的非自然的氨基酸残基。例如，在Andrews和Tabor(Tetrahedron 55：11711-11743(1999))中，ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸残基的对是以不同的间隔取代进入肽的α-螺旋区。全部结果显示，i，(i+4)间隔是最有效的稳定排列。增加水的百分比，高至90％，增加了肽的螺旋状的量。相同i，(i+4)间隔的ε-酰基-赖氨酸残基对不具有稳定效果，表明大多数的稳定作用起于π-π相互作用。在一实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽可以被修饰，以便赖氨酸残基被ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸残基取代。在一特定的实施方案中，赖氨酸残基可以被ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸以i，(i+4)间隔的方式取代。
稳定α-螺旋三级结构的另一种方法使用α-螺旋的侧链的静电相互作用。当His-Cys或His-His残基对以i，(i+4)排列的方式被取代进入肽时，加入Cu、Zn或Cd离子时，肽从约50％螺旋状变成约90％螺旋状。当钌(Ru)盐加入His-His肽，形成交换-惰性复合物，大环的顺式-[Ru-(NH3)4L2]3+复合物，其中L2是两个组氨酸的侧链，其提高螺旋的稳定性。Ghadiri和Fernholz，J.Am.Chem.Soc 112，9633-9635(1990)。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽可以包含大环的顺式-[Ru-(NH3)4L2]3+复合物，其中L2是两个组氨酸的侧链。在一些实施方案中，一个或多个组氨酸-半胱氨酸或组氨酸-组氨酸残基对可以i，(i+4)排列的方式取代进入铜氧还蛋白衍生肽的α-螺旋。在其他实施方案中，一个或多个组氨酸-半胱氨酸或组氨酸-组氨酸残基对可以i，(i+4)排列的方式取代进铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基53-56、58-64和68-70，或其他铜氧还蛋白衍生肽的等同残基。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽可以进一步包含Cu、Zn、Cd和/或Ru离子。
稳定α-螺旋三级结构的另一种方法涉及在α-螺旋的侧链之间形成二硫键。依靠肽序列中分离的残基之间形成的共价键，也可能稳定螺旋状的结构。平常使用的自然方法是使用二硫键。Pierret等人，Intl.J.Pept.Prot.Res.，46：471-479(1995)。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基对是取代进入铜氧还蛋白衍生肽的α-螺旋。在其他实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基对是在铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基53-56、58-64和68-70或其他铜氧还蛋白衍生肽的等同残基上被取代。
稳定α-螺旋三级结构的另一种方法是整体碳交联法。整体烃交联法提供用于增加螺旋状结构的稳定作用、耐蛋白酶和细胞通透性。Walensky等人，Science，305，1466-1470(2004)。具有携带烯烃的系链的α，α-二取代的非天然的氨基酸被掺入肽。钌催化的烯烃复分解(metathesis)产生全烃“钉针”来交联螺旋。Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc，122.5891-5892(2000)；Walensky等人，id.具有携带烯烃的系链的非天然氨基酸可以是根据Schafmeister等人(id.)以及Williams和Im(J.Am.Chem.Soc，113：9276-9286(1991))提供的方法合成。在特定的实施方中，铜氧还蛋白衍生肽是通过全烃钉针稳定。在特定的实施方案中，相应于具有携带烯烃的系链的天然氨基酸的α，α-二取代的非天然的氨基酸的一个或多个对是取代进入铜氧还蛋白衍生肽的α-螺旋。在其他实施方案中，相应于天然氨基酸的具有携带烯烃的系链的α，α-二取代的非天然的氨基酸的一个或多个对是取代进入铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基53-56、58-64和68-70，或其他铜氧还蛋白衍生肽的等同残基。
在一些实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以包含X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(SEQ ID NO：48)，其中X1是L或乙酰化的-L，X2是T或W，X3是M、L或V，X4是Q或W，X5是G或A，X6是T或W，X7是G、T或W，X8是M、L或V，且X9是D或酰胺化的-D。在其他实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以由
X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(SEQ ID NO：48)组成，其中X1是L或乙酰化-L，X2是T或W，X3是M、L或V，X4是Q或W，X5是G或A，X6是T或W，X7是G、T或W，X8是M、L或V，且X9是D或酰胺化-D。在其他实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以包含X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(SEQ ID NO：49)，其中X1是D或乙酰化-D，X2是M、L或V，X3是G、T或W，X4是T或W，X5是G或A，X6是Q或W，X7是M、L或V，X8是T或W，且X9是L或酰胺化-L。在其他实施方案中，修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以由X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(SEQ ID NO：49)组成，其中X1是D或乙酰化-D，X2是M、L或V，X3是G、T或W，X4是T或W，X5是G或A，X6是Q或W，X7是M、L或V，X8是T或W，且X9是L或酰胺化-L。感兴趣的特定肽是在表3中列出。
聚乙二醇化
PEG共价连接于具有治疗和诊断意义的药剂延长了药物在体内的血浆半衰期，和/或减少其免疫原性和抗原性。Harris和Chess.Nature Reviews DrugDiscovery 2：214-221(2003)。例如，PEG连接改进了多种治疗性蛋白的药代动力学性质，包括白细胞介素(Kaufman等人，J，Biol.Chem.263：15064f 1988)；Tsutsumi等人，J.Controlled Release 33：447(1995))，干扰素(Kita等人，Drug Des.Delivery 6：157(1990))，过氧化氢酶(Abuchoviski等人，J.Biol.Chem.252：3582(1977))，超氧化物岐化酶(Beauehamp等人，Anal Biochem.131：25(1983))以及腺苷脱氨酶(Chen等人，Biochem.Biophys，Acta 660：293(1981))等等。FDA批准PEG用作食品、化妆品和药物中的载体或基础，包括注射、局部、直肠和鼻制剂。PEG显示了较少的毒性，通过肾(PEGs＜30kDa)从身体内完整消除，或者在粪便中(PEGs＞20kDa)。PEG是高度溶解于水。
通过减少肾脏的超滤，治疗肽的聚乙二醇化可以用于增加肽在患者血流中的寿命，且因此降低药物从身体内清除。电荷掩蔽可以影响肾的透过。电荷掩蔽可能是蛋白可电离的官能团，即胺或羧基的paramchemical修饰的结果。特别地，生产蛋白-PEG衍生物的最常见的操作包括使蛋白氨基转化成酰胺，其结果是正电荷损失，这可能改变蛋白超滤。已经发现阴离子大分子通过肾超滤清除比中性或阳性的大分子更缓慢，期望PEG结合氨基延长血流中聚乙二醇化的肽的持久。
分子大小和球形超滤也可以影响治疗性肽的肾超滤。分离天然球蛋白的肾消除的分子量认为是约70kDa，其接近的血清白蛋白的分子量。因此，分子量超过70kDa的蛋白主要是通过非肾超滤的途径如肝摄取、蛋白水解的消化以及免疫系统的清除从身体清除。因此，通过聚乙二醇化增加治疗性肽的大小，可以减少源自患者血流的肽的肾的超滤。
此外，治疗性肽的聚乙二醇化可以降低这种肽的免疫原性，并保护肽免受蛋白水解酶、吞噬细胞和需要与治疗性肽直接接触的其他因素的作用。特别地，支链PEG的类似伞形的结构已经发现较直链PEG对于接近蛋白水解酶、抗体、吞噬细胞等给予更好的保护。Caliceti和Veronese，Drug.Deliv Rev.55：12778(2003)。
在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类被修饰以便具有共价结合于半胱氨酸分子的一个或多个PEG分子。共价结合并非必然需要是从PEG分子至铜氧还蛋白衍生肽的直接共价键，但是可以是共价结合一个或多个连接分子，其又是彼此共价结合和/或共价结合于铜氧还蛋白衍生肽。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽具有位点特异性聚乙二醇化。在特定的实施方案中，PEG分子可以共价结合于铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的半胱氨酸残基3、26和/或112。在其他实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基可以是取代进入铜氧还蛋白衍生肽并聚乙二醇化。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽聚乙二醇化的方法可以是NHS、还原性胺化、malimid或环氧等等。在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽可以是在一个或多个赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，或N-末端氨基基团或C-末端羧酸上聚乙二醇化。在更特定的实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类可以是在一个或多个赖氨酸或N-末端氨基基团上聚乙二醇化。在其他实施方案中，一个或多个赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基是取代进入铜氧还蛋白衍生肽并聚乙二醇化。在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类可以在一个或多个氨基上聚乙二醇化。在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类可以随机的非位点特异性方式聚乙二醇化。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类具有平均分子量为约200道尔顿-约100,000道尔顿、约2,000道尔顿-约20,000道尔顿或约2,000道尔顿-约5,000道尔顿的基于PEG的聚合物。在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类可以是包含一个或多个PEG分子，其是支链的，特别是约kDa的支链的PEG分子。在其他实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽类可以包含一个或多个直链PEG分子，特别是约5kDa的直链PEG分子。
铜氧还蛋白
铜氧还蛋白是这样的小型的含蓝铜的蛋白，参与例如细菌的氧化还原链、光合作用，具有电子转移性质(10-20kDa)。铜离子唯一地结合于蛋白基质。铜周围两个组氨酸和一个半胱氨酸的配体具有特殊的扭曲三角平面排列，引起在金属位点非常特殊的电学性质和强烈的蓝色。一些铜氧还蛋白已经在介质中以高分辨率进行了结晶学鉴定。铜氧还蛋白包括天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白、auracyanin和类似天青蛋白的蛋白。如本文所用的，术语“铜氧还蛋白”包括不含铜原子的蛋白以及含铜的蛋白。
天青蛋白
天青蛋白是具有128个氨基酸残基的含铜蛋白质，其属于铜氧还蛋白家族，涉及植物和一些细菌中的电子转移。天青蛋白包括来自铜绿假单胞菌(SEQ ID NO：1)(“wt-天青蛋白”)、木糖氧化产碱菌(A.ylosoxidans)和反硝化产碱菌((A.denitrificans)的那些。Murphy等人，J.Mol.Biol.，vol.315，pp 859-71(2002)。尽管天青蛋白间的序列同源性在60-90％变化，这些分子间的结构同源性是高的。所有的天青蛋白具有独特的具有Greek key基序的β-夹层，并且单个铜原子总是位于蛋白的同一区域。此外，天青蛋白在铜位点周围具有基本中性的疏水区。Id.
质体蓝素
质体蓝素是真核植物和蓝细菌中发现的铜氧还蛋白。其在每个分子中含有一个铜分子，并且它们的氧化型为蓝色。它们出现在叶绿体中，作为电子载体发挥功能。自从在1978年测定了白杨质体蓝素的结构，藻类(栅藻(Scenedesmus)，浒苔(Enteromorpha)，衣藻(Chlamydomonas))和植物(法国菜豆((French bean))质体蓝素的结构也用晶体学或NMR的方法得到测定，并且白杨质体蓝素的结构已经精确到1.33的分辨率。SEQ ID NO：2显示了来自层理席藻的质体蓝素的氨基酸序列。
尽管在藻类和维管植物之间的质体蓝素序列趋异(例如在衣藻蛋白和白杨蛋白之间序列相同性为62％)，但三维结构是保守的(例如在衣藻蛋白和白杨蛋白之间Cα位置的
rms偏差)。结构特征包括位于八股反平行β-桶一个末端的扭曲四面体型铜结合位点、显著的负电区和平坦的疏水表面。铜的位置对于其电子转移功能是优化的，负电和疏水区被设想涉及生理反应配偶体的识别。化学修饰、交联和定位诱变试验已经证实负电和疏水区在与细胞色素哟结合相互作用中的重要性，并证明在质体蓝素中有两个功能重要的电子转移路径模型的正确。一个假定的电子转移路径是相对短的(约
)，并包括疏水区中暴露于溶剂的铜配体His-87，而另一条更长(约12-
)，包括负电区中几乎保守的残基Tyr-83，Redinbo等人，J.Bioenerg.Biomembr.，vol.26(1)：49-66(1994)。
铁硫菌蓝蛋白
铁硫菌蓝蛋白是含有蓝铜的单链多肽，其得自一种硫杆菌。利用多波长不规则衍射对来自氧化亚铁硫杆菌的极其稳定和高氧化性的铜氧还蛋白铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO：3)氧化型进行X射线晶体结构测定，精确到
分辨率。铁硫菌蓝蛋白由核心β-夹层折叠构成，所述β-夹层折叠由六股和七股的β-片层组成。与其它铜氧还蛋白类似，铜离子同分布于扭曲四面体的四个保守残基(His 85，Cys 138，His 143，Met 148)组成的簇相配位。Walter等人，J.Mol.Biol.，vol.263：730-51(1996)。
Auracyanin
指定为auracyanin A、auracyanin B1和auracyanin B-2的三种小的蓝铜蛋白已经从嗜热的绿色滑动光合细菌橙色绿屈挠菌中分离。两种B类型彼此具有几乎相同的性质，但是不同于A类型。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳证明近似的单体分子量为14(A)、18(B-2)和22(B-1)kDa。
auracyanin A的氨基酸序列已经确定并显示auracyanin A是139个残基的多肽。Van Dreissche等人，Protein Science 8：947-957(1999)。His58、Cys123、His 128和Met132是以期望的方式间隔，如果它们是如已知的小型铜蛋白质体蓝素和天青蛋白的进化保守的金属配体。二级结构预测还表明auracyanin具有一般的β-桶形结构，类似于来自的铜绿假单胞菌的天青蛋白和来自白杨叶的质体蓝素的β-桶形结构。然而，auracyanin看来似乎具有两种小型桶蛋白序列种类的序列特征。具有一致的天青蛋白的序列的整体相似性是大致相同于具有一致的质体蓝素的序列的整体相似性，即30.5％。auracyanin的N-末端序列区1-18显著地富含甘氨酸和羟基氨基酸。Id.参见，来自橙色绿屈挠菌的auracyanin的A链的示例性氨基酸序列SEQ ID NO：10(NCBI Protein DataBank Accession No.AAM12874)。auracyanin B分子具有标准的铜氧还蛋白折叠。已经研究了来自橙色绿屈挠菌的auracyanin B的晶体结构。Bond等人，J.MoI.Biol.306：47-67(2001)。除了另外的N-末端链之外，分子是非常类似于细菌铜氧还蛋白天青蛋白的分子。如在其他的铜氧还蛋白中，Cu配体之一位于多肽的链4上，其他三个沿着链7和8之间的大环路分布。参考后三个配体之间的氨基酸间隔，讨论Cu位置几何。auracyanin B的结晶学表征的Cu-结合域可能是通过N-末端尾部系上细胞膜的周质侧面，显示了与已知的多个其他膜有关的电子转移蛋白中的系链的显著的序列相同性。B型的氨基酸序列是在McManus等人.(J Biol Chem.267：6531-6540(1992))中提出。参见，来自橙色绿屈挠菌的auracyanin B的A链的示例性氨基酸序列SEQ IDNO：11(NCBI Protein Data Bank Accession No.1QHQA)。
假天青蛋白
假天青蛋白是含有蓝铜的单链多肽家族。得自裂环无色杆菌((Achrorraobacter cycloclastes)的假天青蛋白的氨基酸序列显示于SEQ IDNO：4。假天青蛋白的X射线结构分析显示它与天青蛋白具有相似的结构，尽管这些蛋白质之间具有低序列同源性。在假天青蛋白和天青蛋白的整体结构之间存在两个主要的不同。相对于天青蛋白，假天青蛋白具有由两个α-螺旋组成的羧基末端延伸。在中部肽区域，天青蛋白包含延伸的环，而在假天青蛋白中变短，其形成含有短α-螺旋的瓣。在铜原子位点上唯一的主要不同是，MET侧链构象和Met-S铜键长度，其在假天青蛋白中明显短于在天青蛋白中。
修饰的铜氧还蛋白衍生肽可以是由标准技术合成。变体是由天然化合物直接地或通过修饰或部分取代形成的氨基酸序列。变化可以被引入铜氧还蛋白衍生肽，其引起铜氧还蛋白衍生肽的氨基酸序列改变，但不造成铜氧还蛋白的药理学活性的消失。“非必需的”氨基酸残基是这样的残基，其可以从铜氧还蛋白衍生肽的序列中改变而不消除其药理学活性，反之，“必需的”氨基酸残基是这样的药理学活性所需要的。可以进行“保守”取代的氨基酸是本领域已知的。有用的保守取代是表1中所示的，“优选的取代”。由此一类氨基酸用相同类的另一种氨基酸取代的保守取代落入本发明的保护范围，条件是取代不消除铜氧还蛋白衍生肽的期望的药理学活性。导致改变的铜氧还蛋白衍生物的药理学活性的这样的交换是本发明的一部分，条件是这样的药理学活性是可感知的。在一些实施方案中，铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性是少于的其衍生于的野生型铜氧还蛋白的比活的约5％、少于约10％、少于约25％和少于约50％。应当理解，铜氧还蛋白衍生肽的比活的某些丧失可以是容忍的，如果其是通过铜氧还蛋白衍生肽中其他改进的性质如更长的血浆半衰期或降低的免疫原性来弥补。
表1-优选的取代
影响(1)多肽骨架的结构，例如β-折叠或α-螺旋构象、(2)电荷、(3)疏水性，或(4)侧链体积的非保守取代可改变铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性。如表2所示，基于共同侧链的性质，对残基进行分组。非保守取代使得这些类型中的一个的成员变换成另一种类型。
一类氨基酸用不同类的另一种氨基酸取代的非保守取代落入本发明的保护范围，条件是取代不使铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性消失。致使铜氧还蛋白衍生肽的药理学活性改变的这样的变化预期是本发明的一部分，条件是这样的药理学活性是可感知的。
表2-氨基酸种类
对于铜氧还蛋白衍生肽的修饰可以使用本领域熟知的方法进行，如寡核苷酸介导的(定向)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定向诱变(Carter，Biochem J.237：1-7(1986)；Zoller和Smith，Methods Enzymol.154：329-50(1987))，盒式诱变、限制选择诱变(Wells等人，Gene 34：315-23(1985))或其他已知技术可以对克隆的DNA进行以产生编码铜氧还蛋白衍生肽的变体核酸。此外，编码作为铜氧还蛋白的结构等效物的铜氧还蛋白衍生肽的核苷酸是，可以通过本领域熟知的方法合成。进一步，修饰的铜氧还蛋白衍生肽的蛋白分子可以通过本领域熟知的方法合成。
编码铜氧还蛋白进入区的核酸和连接载物化合物的铜氧还蛋白进入区的复合物
在另一个方面，本发明提供编码本发明的修饰的铜氧还蛋白衍生肽的核酸分子。这种核酸分子可以是由本领域已知技术的组合而制得。例如，修饰的铜氧还蛋白衍生肽的核酸序列可以由化学合成或克隆个别地制得。
含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的药用组合物
含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的药用组合物可以是以任何常规方法生产，例如常规混和、溶解、制粒、制糖衣((dragee-making)、乳化、包入胶囊(encapsulating)、包封((entrapping)或冻干过程。修饰的铜氧还蛋白衍生肽易于与本领域熟知的药物学上可接受载体组合。这样的载体能够使配制品被制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、混悬剂等等。合适的赋型剂也可包括例如填充剂和纤维素制品。其它的赋型剂包括例如矫味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。
这样的组合物可用于治疗或诊断癌症、治疗不适当的血管发生、HIV和/或疟疾感染及治疗与ephrin信号发生有关的病症。组合物可以有效预防或治疗患者所患有的病症的量给药。通常，患病生物体是哺乳动物如人或动物。
含铜氧还蛋白进入区的组合物的给药
含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的组合物可以是以任何合适的途径给药，例如口服、含服、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、经鼻腔、局部、经皮即透皮或注射(包括静脉内、肌内、皮下和冠状动脉内)给药。所述组合物及其药用制剂可以是以有效达到其预期目标的任何剂量来给药。当给药用于治疗患有病症的患者时，组合物是以治疗有效量给药。“治疗有效量”是有效预防治疗患者的发展，或缓解治疗患者的存在的症状的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力之内。
在各种实施方案中，组合物包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、糖类、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油、盐溶液、水性葡萄糖和甘油溶液、为了近似于生理条件所要求的其它药学上可接受的辅助物质，例如缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等等。应理解的是，当本领域技术人员已知的任意合适载体被应用于给予本发明的组合物时，载体的类型将根据给药方式而变化。化合物也可用公知的技术以脂质体来包封。也可应用生物可降解微球作为本发明药物学组合物的载体。合适的生物可降解微球已公开于例如美国专利号4,897,268；5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252。如本文所用的“化合物”包括肽、氨基酸序列、载物化合物及本发明的复合物。本发明的组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术来灭菌或无菌过滤。所得水性溶液可以其现有形式或冻干形式被包装，冻干制剂在给药前与无菌溶液相组合。
本发明的组合物可用多种方法给药，包括注射(如真皮内、皮下、肌内、腹膜内等等)、吸入、局部给药、栓剂、使用透皮贴剂或经口给药。
当注射给药时，组合物可在水性溶液中配制，优选在生理相容性缓冲液中，例如Hanks溶液、Ringer′s溶液或生理盐缓冲液。所述溶液可包含配制剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，在使用前，所述组合物可以以粉末形式与合适的载体例如无菌无热原水组合。
当吸入给药时，组合物可以以气溶胶喷剂形式从加压包装中送递，或从带有使用合适抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他合适的气体)的喷雾器送递。在加压气溶胶的情形下，剂量单位可通过提供按计量量释放的阀门来确定。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可被配制成包含蛋白和合适粉末基质(例如乳糖或淀粉)的混合粉末。
当局部给药时，组合物可被配制成溶液、凝胶、油膏、乳剂、混悬剂等等，如本领域公知的。在一些实施方案中，利用透皮贴剂来给药。当通过栓剂(例如直肠或阴道)给药时，组合物也可配制成包含常规栓剂基质的组合物。当口服给药时，组合物可容易地与本领域公知的药学上可接受载体组合配制。可使用固体载体，例如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等等；这些载体能使趋化因子配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、混悬剂等等，以用于待治疗患者的口服摄入。对于口服固体制剂如粉剂、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂例如糖类、纤维素制品、造粒剂和粘合剂。
其它常规载体，如本领域公知的，也包括多价载体，例如细菌荚膜多糖、葡聚糖，或被基因工程化的载体。此外，包括组合物的缓释制剂允许组合物在延长的时间期间内释放，这样如果不使用缓释制剂，所述组合物将从患者的体系中被清除，和/或例如通过蛋白酶和在引出或增强治疗效果之前的简单水解被降解。
确切的制剂、给药途径和剂量通常是由主治医生考虑患者情况来决定。给药量和间隔可分别调整，以提供足以维持治疗效果的复合物的血浆水平。通常，期望的组合物是以与药用载体的混合物形式给药，所述药用载体根据预期给药途径和标准药学操作进行选择。
适当的剂量，当然是将根据例如所用的含铜氧还蛋白进入区的化合物、宿主、给药方式以及待治疗和诊断的病症的性质和严重度变化。然而，在本发明方法的一实施方案中，认为约0.001-约20mg/kg的体重的含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的化合物的每日剂量可在人中获得令人满意的治疗结果。在一个实施方案中，用于人治疗的标明的每日剂量可以是便于给药的约0.7mg-约1400mg的含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的化合物，例如每日给药、每周给药、每月给药和/或连续给药。每日给药可以是每日1-12次的分开给药。或者，给药可以是每隔一天、每隔两天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每周，直至每31天的方式类似地进行。给药可以是连续的、间断的或单个剂量，使用任何适用的剂型，包括片剂、贴片、静脉注射给药等。更特别地，组合物是以治疗有效量给药。在特定的实施方案中，治疗有效量是约0.01-20mg/kg的体重。在特定的实施方案中，剂量水平是约10mg/kg/天、约15mg/kg/天、约20mg/kg/天、约25mg/kg/天、约30mg/kg/天、约35mg/kg/天、约40mg/kg/天、约45mg/kg/天或约50mg/kg/天。
在一些实施方案中，把含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的化合物引入患者的方法是与已知治疗病症的其他药物联合给药。这样的方法是本领域熟知的。在一特定的实施方案中，含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的化合物是鸡尾酒疗法或共同给药包含或具有治疗癌症、HIV、疟疾、不适当的血管发生以及与ephrin-信号发生有关的病症的其他药物的部分。很多其他这样的化合物对于本领域技术人员来讲是已知的，并且由在此清楚引入作为参考的专利申请提供。
编码铜氧还蛋白衍生肽的核酸分子或编码组合铜氧还蛋白衍生肽和载物化合物的融合蛋白的核酸分子可以插入载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过例如静脉内注射、局部给药(Nabel等人，美国专利号5,328,470)或立体定向注射(Chen等人，Proc Natl Acad Sci USA 91：3054-3G57(1994))送递至患者。基因治疗载体的药物学制剂包括可接受稀释剂或包含基因送递载体嵌入其中的缓释基质。或者，完整的基因送递载体可从重组细胞中完整生成，如逆转录病毒载体，所述药物学制剂可包括一种或多种生产所述基因送递系统的细胞。
在一方面，组合物作为DNA送递，以便复合物可在原位生成。在一个实施方案中，DNA是“裸露的”，例如Ulmer等人，Science，vol.259，pp-1745-49(1993)的描述和Cohen，Science，vol.259，pp-1691-92(1993)的综述。通过将DNA包被于可有效地被运送进细胞的载体例如生物可降解珠上，可提高裸DNA的摄取。在这些方法中，所述DNA可存在于多种本领域普通技术人员公知的送递系统中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。将DNA引入这些表达体系中的方法对于本领域普通技术人员是公知的。参见例如W090/11092，W093/24640，WO 93/17706和美国专利号5,736,524。
用于生物间运输遗传物质的载体可分为两大类：克隆载体是在适当宿主细胞中带有繁殖非必需区域的复制质粒或噬菌体，外源DNA可插入其中；所述外源DNA可被复制和繁殖，如同它是载体的组分。表达载体(例如质粒、酵母或动物病毒基因组)用于将外源遗传物质引入宿主细胞或组织中，以使得转录并翻译所述外源DNA，例如组合物的DNA。在表达载体中，引入的DNA与元件(例如向宿主细胞发出信号对插入DNA进行转录的启动子)可操纵地连接。一些启动子特别地有用，例如应答特定因子控制基因转录的可诱导启动子。组合物多核苷酸与可诱导启动子的可操纵地连接可控制本发明修饰的铜氧还蛋白衍生肽的表达。标准的可诱导启动子的实例包括那些对α-干扰素、热休克蛋白、重金属离子和类固醇例如糖皮质激素(Kaufman，MethodsEnzymol.185：487-511(1990))和四环素作出反应的启动子。其它期望的可诱导启动子包括对引入构建体的细胞不是内源性的，但是当诱导剂被外源提供时在那些细胞中是反应性的。一般而言，有用的表达载体通常是质粒。然而，也包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
载体的选择由待使用的生物或细胞以及载体期望的命运决定。一般而言，载体包括信号序列、复制起始位点、标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
包含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的试剂盒
在另一方面，本发明提供了包含一种或多种处于包装或容器中的下列物质的试剂盒：(1)包含修饰的铜氧还蛋白衍生肽的试剂；(2)包含药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂；(3)给药载体，例如注射器；(4)给药说明书。还包括同一容器中出现具有组分(1)-(4)中的两个或多个的实施方案。
当提供试剂盒时，组合物中的不同成分可在分开的容器中包装，并在使用前立即混合。分离组分的这样包装可允许长期的贮存，而不丧失活性组分的功能。
试剂盒中的试剂可在任意种类的容器中提供，要求不同组分的使用期得到保存并不被容器的材料所吸收或改变。例如，密封的玻璃安瓿可含有冻干的多肽或多核苷酸，或在中性、不反应性气体例如氮气下包装的缓冲液。安瓿可由合适的材料构成，例如玻璃、有机聚合物如聚碳酸醋、聚苯乙烯等、陶瓷、金属或通常用于保存相似试剂的任何其它材料。其它合适容器的实例包括简易瓶，其由与安瓿相似的物质焊接而来，和封套((envelopes)，其可包含金属箔封闭的内部，例如铝和合金。其它的容器包括试管、管形瓶、烧瓶、瓶、注射器等等。容器可有无菌存取口，例如有塞子的瓶子，该塞子可用皮下注射针头刺穿。其它容器可具有两室，两室被容易去除的膜分开，去除所述膜后允许组分混合。可去除膜可为玻璃、塑料、橡胶等。试剂盒也可提供指导材料。说明书可印在纸或其它载体上，和/或以电子可读介质提供，例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘(Zip disc)、录像带、录音带、闪存盘等。详细的说明书与试剂盒可以不是以物理形式在一起的，而是使用者可以被指引去试剂盒的制造商或分销商指定的互联网站点，或由电子邮件提供。
对本发明更完整的理解可通过参考下列具体实施例来获得。描述实施例目的仅在于说明，而并不是试图限制本发明的范围。当环境提示或使得这样更便利时，形式的变化和等同取代也包含在本发明中。尽管在本文使用了特定的术语，但是这些术语是为了描述，而不是为了限制。如上文所列出的对本发明的修饰和变化可以在不偏离本发明精神或范围下进行，因此本发明的范围应当认为只是如所附权利要求书中所指明的那样。
实施例
实施例1-体内异种移植的肿瘤模型和运输实验
采用Mel-2异种移植进行的无胸腺小鼠的成像以测定随着时间P18(SEQID NO：14)在小鼠体内的分布。雌性裸鼠是在胁腹皮下注射1×106 UISO-Mel-2细胞。当肿瘤生长至0.5mm大小(三个直径测量之一)，用标记的p18开始研究。对于标记物p18，在连续搅拌下，p18是用
800CW NHS Ester红外染料(LI-COR Bioscienccs，Lincoln，Nebraska)在4℃下孵育2小时。标记的肽从未结合染料中分离，通过在Slide-A-
透析盒中用PBS透析最少48小时。
按照125μg/小鼠静脉注射100μl无菌PBS(磷酸盐缓冲的盐水)中的
标记的p18(SEQ ID NO：14)，每天扫描小鼠，使用
红外成像系统检测肿瘤和器官中标记的染料。在1-1.5mm的深度进行高分辨率的扫描，以检测皮下的肿瘤。用800nm信道(绿色)记录的图象表示特定的信号，用700nm的信道(红色)记录的图象表示背景。
在第一个实验中，扫描具有0.5mm Mel-2肿瘤的小鼠达16天以确定
的位置。附图1。在第二个实验中，给具有0.5mm Mel-2肿瘤的小鼠静脉注射125μg/小鼠的
标记的p18并120小时后处死。进行整个小鼠扫描，离体器官和肿瘤，并扫描以确定
的定位。以0.1-0.5mm的深度进行器官以及离体之后的横切面的高分辨率扫描。附图2。在第三个实施例中，给小鼠注射Mel-2细胞，允许肿瘤生长三周。然后给小鼠注射125μg/小鼠的
标记的p18，及48小时后，处死并扫描以确定
的位置。
这些实施例表明
标记的p18在注射进入小鼠5小时之后就集中于肿瘤和肾。参见附图1。肾蓄积IRDye-p18复合物，揭示p18主要是通过肾的排泄而从血流中除去。参见附图2和附图3。
实施例2-使用修饰的铜氧还蛋白衍生肽治疗患有癌症的患者
聚乙二醇化p28(SEQ ID NO：13)融合物(研究药物)的I/II期临床试验将在患有癌症的患者中完成。特别地，来自铜绿假单胞菌的p28将用聚乙二醇化修饰。
患有组织学上证实的乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤的49名成人患者，他们被证实经当前可获得的FDA-批准的化学治疗药和治疗方案适当治疗之后在临床上和影像学上仍进展或复发，将参加施用所述研究药物的开放性前瞻性研究。对于入选本研究的资格，要证明所有患者在完成批准的化疗过程之后可测量的肿瘤体积仍增加。必须在组织学上确认存在持续的转移病灶和/或大小或体积不断增加的证据。这种组织学上证据可以是通过细针抽吸(FNA)活组织检查获得。
根据Institutional Review Board of the University of Illinois，Chicago and theFDA，治疗程序将在获得全部患者的知情同意后进行。患者应不具有并发的疾病如其他恶性肿瘤、先前恶性肿瘤的病史、血液病、依赖胰岛素糖尿病或其他严重的心血管疾病，这些疾病可能干扰对所推荐的治疗方案的效应的适当评估。包括肝功能研究(LFT)的基线血液操作(Complete Blood Counts[CBC]and Serum Chemistry)将在治疗开始之前进行。全部适合的患者在试验期间不能同时接受任何癌症化疗。
研究药物将是每日静脉内注射研究药物的药学上可接受的制剂，给药12周，受试者将观察任何剂量限制毒性。将存在7个剂量水平，从10mg/kg/天开始，并以5mg/kg/天增加，增至最大剂量50mg/kg/天。
将在患有晚期的可测量的癌症(乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤)的7个患者中记录各个剂量水平的有效性。
通过测量二维上的可测量的肿瘤来评估应答(a和b)。1)靶转移肿瘤的全部消失将是认为完全应答(CR)；2)75％减少将是认为极好的部分应答(PR)；3)良好应答(PR)将是治疗后大小减少50％；4)大小减少25％将是认为稳定疾病(SD)；和5)小于25％将是认为没有应答(NR)。疾病进展的患者将中断治疗，但是将进行另外12周的随诊观察。
靶转移肿瘤的全部消失以及其大小任何减少将表明天青蛋白治疗对于癌症是有效的。聚乙二醇化p28治疗有效的其他指征是新转移肿瘤的出现率减少以及与肿瘤有关的血管发生的降低。
在不背离本发明的范围和精神下，本发明所述实施例和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员来讲是显而易见的。尽管本发明是结合特定实施方案进行详细说明的，但应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这样的特定实施方案。的确，对于本领域技术人员来讲是显而易见的实施本发明的上述模式的各种改动也落入以下实施方案的范围之内。
Claims (71)
1、一种分离的修饰的铜氧还蛋白衍生肽，其是铜氧还蛋白衍生肽的变体或衍生物，同未修饰的铜氧还蛋白衍生肽相比，所述变体或衍生物可以具有至少一种改进的药代动力学性质。
2、权利要求1的分离的肽，其中该至少一种改进的药代动力学性质选自：(1)更不易于在患者体内发生生物转化，(2)以更慢的速率从患者体内排泄，(3)其三级结构的稳定性增加，和(4)更长的血浆半衰期。
3、权利要求1的分离的肽，其具有野生型铜氧还蛋白的至少一种药理学活性。
4、权利要求1的分离的肽，其具有至少一种选自以下的药理学活性：(1)进入哺乳动物癌细胞，(2)不进入非癌性哺乳动物细胞，(3)进入癌前期哺乳动物细胞，(4)杀死哺乳动物癌细胞，(5)杀死癌前期哺乳动物细胞，(6)抑制哺乳动物癌细胞的生长，(7)抑制HIV-1感染，(8)抑制感染疟疾的红细胞的寄生虫血症，(9)干扰ephrin信号系统，和(10)抑制血管发生。
5、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白来自选自以下的生物体：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、层理席藻(Phormidium laminosum)、Ulvapertussis、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus fcrrooxidans)、Achromobactercycloclastes、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringa)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、支气管败血性博德特氏菌(Bordctella bronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)。
6、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白选自天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白、auracyanin、漆树蓝蛋白、黄瓜碱性蛋白和天青蛋白样蛋白。
7、权利要求6的分离的肽，其中铜氧还蛋白选自SEQ ID NO：1-12。
8、权利要求1的分离的肽，其是截短的铜氧还蛋白。
9、权利要求8的分离的肽，其包含选自SEQ ID NO：13-47的氨基酸序列。
10、权利要求1分离的肽，选自SEQ ID NO：1-12的至少一种序列与其具有至少90％相同性。
11、权利要求2的分离的肽，其更不易发生水解。
12、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽序列中的一个或多个天冬酰胺或丝氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。
13、权利要求12的分离的肽，其中天冬酰胺或丝氨酸残基被谷氨酸或苏氨酸残基取代。
14、权利要求2的分离的肽，其更不易发生脱酰胺。
15、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甘氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。
16、权利要求15的分离的肽，其中一个或多个甘氨酸残基被苏氨酸或丙氨酸残基取代。
17、权利要求16的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽中的一个或多个等同于铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基58或63的甘氨酸残基被取代。
18、权利要求17的分离的肽，其包含SEQ ID NO：30。
19、权利要求2的分离的肽，其更不易发生氧化。
20、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个甲硫氨酸或半胱氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。
21、权利要求20的分离的肽，其中一个或多个甘氨酸残基被亮氨酸或缬氨酸残基取代。
22、权利要求21的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个等同于铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的残基56或64的甲硫氨酸残基被取代。
23、权利要求22的分离的肽，其包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。
24、权利要求2的分离的肽，其更不易发生哌嗪二酮和焦谷氨酸形成。
25、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的位置1、2或3的甘氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。
26、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的位置3的脯氨酸残基被另外的氨基酸残基取代。
27、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的N-末端的天冬酰胺残基被另外的氨基酸残基取代。
28、权利要求2的分离的肽，其更不易发生消旋化。
29、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽一个或多个氨基酸残基被所述氨基酸残基的D-异构体取代。
30、权利要求29的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的全部的氨基酸残基被所述氨基酸残基的D-异构体取代。
31、权利要求1的分离的肽，其包含SEQ ID NO：45。
32、权利要求2的分离的肽，其更不易发生降解。
33、权利要求1分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的N-末端是乙酰化的。
34、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的C-末端是酰胺化的。
35、权利要求34的分离的铜氧还蛋白衍生肽，其是SEQ ID NO：33。
36、权利要求2的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽是修饰的以增加其三级结构的稳定性。
37、权利要求36的分离的肽，其中肽是修饰的以增加至少一种α-螺旋的稳定性。
38、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸中的至少一个氨基酸残基被选自亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基取代。
39、权利要求38分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的被取代的残基是在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
40、权利要求38的分离的肽，其中在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基57的残基上的谷氨酰胺被色氨酸残基取代。
41、权利要求38的分离的肽，其中在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基52的残基上的苏氨酸被色氨酸残基取代。
42、权利要求38的分离的肽，其中在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基61的残基上的苏氨酸被色氨酸残基取代。
43、权利要求38的分离的肽，其中在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基63的残基上的甘氨酸被色氨酸残基取代。
44、权利要求38的分离的肽，其包含选自SEQ ID NO：34-44的氨基酸序列。
45、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的两个或多个赖氨酸残基被ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-赖氨酸残基以i(i+4)间隔的方式取代。
46、权利要求45的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的被取代的残基是在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
47、权利要求39的分离的肽，其中组氨酸-半胱氨酸或组氨酸-组氨酸残基对以i(i+4)间隔的方式取代进入铜氧还蛋白衍生肽，所述肽进一步包含选自Cu、Zn、Cd和Ru的至少一种离子。
48、权利要求47的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的被取代的残基是在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
49、权利要求1的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽中的一个或多个天然氨基酸残基对被相应于天然氨基酸的具有携带烯烃的系链的α，α-二取代的非天然氨基酸取代。
50、权利要求49的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽的被取代的残基是在等同于铜绿假单胞菌天青蛋白的残基53-56、58-64和68-70的残基内。
51、权利要求1的分离的肽，其具有共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个PEG分子。
52、权利要求51的分离的肽，其中一个或多个PEG分子共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的一个或多个半胱氨酸残基。
53、权利要求52的分离的肽，其中一个或多个PEG分子共价结合于等同于选自铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基3、6和112的残基的一个或多个半胱氨酸残基。
54、权利要求51的分离的肽，其中半胱氨酸残基被取代进入铜氧还蛋白衍生肽并共价结合于PEG分子。
55、权利要求51的分离的肽，其中一个或多个PEG分子共价结合于铜氧还蛋白衍生肽的选自赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、N-末端氨基和C-末端羧酸的一个或多个位点。
56、权利要求55的分离的肽，其中一个或多个赖氨酸残基或C-末端羧酸共价结合于PEG分子。
57、权利要求55的分离的肽，其中选自赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的一个或多个残基被取代进入铜氧还蛋白衍生肽并共价结合于PEG分子。
58、权利要求51的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽一个或多个氨基共价结合于PEG分子。
59、权利要求51的分离的肽，其中一个或多个PEG分子随机共价结合于铜氧还蛋白衍生肽。
60、权利要求51的分离的肽，其中每个铜氧还蛋白衍生肽的PEG分子的平均分子量是大约200至约100,000道尔顿。
61、权利要求60的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽共价结合于一个或多个支链PEG分子。
62、权利要求61的分离的肽，其中支链的PEG分子约为50kDa。
63、权利要求60的分离的肽，其中铜氧还蛋白衍生肽共价结合于一个或多个直链PEG分子。
64、权利要求63的分离的肽，其中直链PEG分子约为5kDa。
65、药用组合物，包含权利要求1的分离的肽和药学上可接受的载体。
66、一种方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1的分离的肽。
67、权利要求66的方法，其中该哺乳动物是人。
68、一种分离的肽，其包含氨基酸序列
X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(SEQ ID NO：48)；
其中X1选自L和乙酰化-L；
其中X2选自T和W；
其中X3选自M、L和V；
其中X4选自Q和W；
其中X5选自G和A；
其中X6选自T和W；
其中X7选自G、T和W；
其中X8选自M、L和V；
其中X9选自D和酰胺化-D。
69、权利要求68的分离的肽，其由氨基酸序列
X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(SEQ ID NO：48)组成；
其中X1选自L和乙酰化-L；
其中X2选自T和W；
其中X3选自M、L和V；
其中X4选自Q和W；
其中X5选自G和A；
其中X6选自T和W；
其中X7选自G、T和W；
其中X8选自M、L和V；
其中X9选自D和酰胺化-D。
70、一种分离的肽，其包含氨基酸序列
X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(SEQ ID NO：49)；
其中X1选自D和乙酰化-D；
其中X2选自M、L和V；
其中X3选自G、T和W；
其中X4选自T和W；
其中X5选自G和A；
其中X6选自Q和W；
其中X7选自M、L和V；
其中X8选自T和W；
其中X9选自L和酰胺化-L。
71、权利要求70的分离的肽，其由氨基酸序列
X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(SEQ ID NO：49)组成；
其中X1选自D和乙酰化-D；
其中X2选自M、L和V；
其中X3选自G、T和W；
其中X4选自T和W；
其中X5选自G和A；
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其中X8选自T和W；
其中X9选自L和酰胺化-L。
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