CN102387809A - 用pa-card预防和/或治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用源自细菌的蛋白杀伤癌细胞的方法和材料。本发明具体涉及天青蛋白、Laz、Pa-CARD以及融合蛋白Azu-H.8和H.8-Azu，以及它们在杀伤白血病细胞和/或卵巢癌细胞中的用途。

Description

用PA-CARD预防和/或治疗癌症的组合物和方法

相关申请

本申请要求在美国法典第35篇第119款(35U.S.C.§§119)和美国法典第35篇第120款(35U.S.C.§§120)下的对2009年2月20日提交的美国临时申请第61/154,236号和2009年5月19日提交的美国临时申请第61/179,435号的优先权；并且是2008年12月15日提交的美国专利申请第12/314,703号的部分连续案；并且是2006年8月23日提交的美国专利申请第11/508,173号的部分连续案；并且是2005年10月6日提交的美国专利申请第11/244,105号的部分连续案；并且是2006年7月19日提交的美国专利申请第11/488,695号的部分连续案。这些申请的全部内容通过引用完全并入本文。

背景

白血病是骨髓和血液的恶性癌症。白血病的特征为异常血细胞不受控制的积聚，导致正常血细胞功能的抑制，并且在许多情况下导致死亡。据估计在2008年白血病侵袭美国大约44,270新人口。白血病是男性第五大最常见的癌症死因和女性第六大最常见的癌症死因。白血病在20岁以下儿童中引起的死亡比任何其他癌症都多(“Cancer facts and figures 2008(癌症的事实和数字2008)，”Atlanta：American Cancer Society(2008)；Xie Y等人，Cancer 97：2229-35(2003))。某些白血病类型极其难治-例如，急性前髓细胞白血病(APL)是一种罕见但通常致命的疾病，在这种疾病中只有30％的患者响应于标准化学疗法。

许多当前的治疗方式在某种程度上是有效的，但由于缺乏针对癌细胞的特异性而具有显著有害的副作用。开发靶特异性疗法的努力被伊马替尼的成功极大地激励，伊马替尼是称为

的高效药物。

特异性抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶。慢性髓细胞样白血病(CML)中的染色体易位导致Bcr-Abl酪氨酸激酶的组成性活化，进而导致促进癌症生长的细胞信号传导的活化。视黄酸是参与细胞分化的激素，它与三氧化二砷(As2O3)结合是APL的治疗选择。

然而，耐受性的形成是靶向单攻击点(如激酶)的药物伴随的主要问题，在所述单攻击点，药物的构象特异性结合可被改变。白血病患者耐受性的情况增多将临床医师引至诉诸常规的药物组合疗法实践，从而组合肿瘤特异性药物以产生药物活性的协同作用，以允许使用较小剂量的非特异性药物，并寻找其他的有效治疗。

发明概述

本发明涉及使用细胞毒性肽来杀伤癌症且尤其是白血病和/或卵巢癌的组合物和方法。本发明的一个方面是能够杀伤癌细胞的分离肽，该分离肽包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域。该分离肽可来源于细菌，且特别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在一些实施方案中，分离肽是Pa-CARD。在其他实施方案中，分离肽包括SEQ ID NO：27或由SEQ ID NO：27组成。在一些实施方案中，分离肽能够杀伤白血病、纤维肉瘤、卵巢癌和/或乳腺癌的细胞。在其他实施方案中，分离肽被化学修饰以延长或优化其在血流中的半衰期。

本发明还涉及通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来杀伤癌细胞的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽、Laz、H8-Azu和Azu-H8。在一些实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：白血病细胞、纤维肉瘤细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞。这种方法还可包括使所述细胞与能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂接触。这些细胞毒剂可以为，但不限于：顺铂、

视黄酸、5′-氮杂-2′-脱氧胞苷和三氧化二砷。在具体的实施方案中，所述方法包括使癌细胞与顺铂接触。在另一实施方案中，癌细胞在与所述一种或多种蛋白大约相同的时间同所述一种或多种细胞毒剂接触。

本发明还涉及包括向患有癌症的哺乳动物患者施用一种或多种蛋白的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽、Laz、H8-Azu和Azu-H8。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：白血病、纤维肉瘤、卵巢癌和乳腺癌。在又一实施方案中，还可以向患者施用能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。这些细胞毒剂可以包括，但不限于：顺铂、视黄酸、5′-氮杂-2′-脱氧胞苷和三氧化二砷。在又一个实施方案中，向患者施用的另外的细胞毒剂是顺铂。在另一个实施方案中，所述一种或多种细胞毒剂在与所述一种或多种蛋白大约相同的时间施用。

本发明还涉及如下一种方法：所述方法包括通过使白血病细胞与天青蛋白(azurin)和包含Laz的H.8区的肽接触来杀伤白血病细胞。在又一个实施方案中，白血病细胞与天青蛋白和包含Laz的H.8区的肽同时或大致同时接触。

本发明还涉及包括向患有白血病的哺乳动物患者施用天青蛋白和包含Laz的H.8区的肽的方法。在又一实施方案中，所述天青蛋白和所述包含Laz的H.8区的肽同时或大致同时向所述患者施用。

本发明还涉及包括通过使白血病细胞与一种或多种蛋白接触来诱导白血病细胞中的细胞分化的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：Laz、天青蛋白、H.8-Azu、Azu-H.8和能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽。

本发明还涉及包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来选择性进入癌细胞的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：Laz、天青蛋白、H.8-Azu、Azu-H.8和能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽；其中所述癌细胞选自由白血病细胞和卵巢癌细胞组成的组。

本发明还涉及包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来诱导癌细胞中的细胞周期停滞的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：Laz、天青蛋白、H.8-Azu、Azu-H.8和能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽。所述癌细胞可以选自由以下组成的组：白血病细胞、纤维肉瘤细胞、乳腺癌和卵巢癌细胞。在又一实施方案中，所述蛋白增加细胞中的Wee1蛋白水平。在另一个实施方案中，所述蛋白引起磷酸化的AKT-Ser-473的消耗(depletion)。又在另一个实施方案中，所述蛋白既提高所述细胞中的Wee1蛋白水平又引起磷酸化的AKT-Ser-473的消耗。

本发明还涉及如下一种方法：所述方法包括通过使癌细胞与能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽接触而通过胱天蛋白酶3的活化诱导癌细胞中的凋亡。在又一实施方案中，癌细胞是卵巢癌细胞。

本发明还涉及如下一种方法：所述方法包括通过使癌细胞与能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽接触而调节癌细胞中NF-kB信号传导途径基因的表达。在又一实施方案中，其中癌细胞是卵巢癌细胞。

本发明还涉及编码能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽的表达载体。在具体实施方案中，表达载体编码Pa-CARD。

本发明还涉及包含如下分离肽的药物组合物：所述分离肽能够杀伤癌细胞，包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域。在又一实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物还包括选自由以下组成的组的蛋白：天青蛋白(Azurin)、Laz、H.8-Azu和Azu-H.8。在另一个实施方案中，药物组合物还包含能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含适于静脉内注射的药学上可接受的载体。

本发明还涉及包括向患有白血病的患者施用治疗有效量的本发明公开的一种或多种药物组合物的方法。在又一实施方案中，所述药物组合物以选自由以下组成的组的方式向患者施用：静脉内、局部(topically)、皮下、肌内、口服和进入肿瘤内。

本发明的另一个方面是编码本文所公开的一种或多种分离肽的核酸分子。

本发明的另一方面是包含本文所述的一种或多种药物组合物的药盒。

序列简述

SEQ ID NO：1是编码淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)laz基因的基因组DNA编码序列，Genbank登录号Y00530(ctggcaggct tgacgcttcgatacgctctg tttcggtcag gctggtcccg aaaccggaaa aaccgccgaa aaccaatacc ctgcatttgagtaaggctgc gctggagagt ttcggttcgg cggcggcaaa gttggaaaaa cggcatcccg aattggcggaggcattggca aacttggtta gaaggcatgg cgcataaaat gtatacggga atttgtgtaa acatccgttaatattaagaa gtaaaggata atgggtctaa tactaaagaa ataggttcgg ggtaaaattg ccccttttaaagtaaacgat tgtaaacttg cagacaggct ttgatttcaa atgaaatttg tagcaaaatg ccgccccgaaacatctgttt gtgcaacgcg gcggaatctt tttcaaggtt ttgttaatgg cggttgcact ttgatttctgtaaaaccgaa tattatttta tcgattggag atttaccatg aaagcttatc tggctctgat ttctgccgccgttatcggtt tggctgcctg ctctcaagaa cctgccgcgc ctgctgccga ggcaactcct gctgctgaagcacccgcttc cgaagcgcct gccgccgaag ctgctcctgc agatgctgcc gaagcccctg ctgccggcaattgtgcggca actgtcgaat ccaacgacaa tatgcagttc aacaccaaag acatccaagt cagcaaagcatgtaaagagt ttaccatcac tctgaaacat accggtacgc aacccaaagc cagcatgggt cacaaccttgtgattgccaa agctgaagac atggacggcg tatttaaaga cggcgtaggt gctgccgata ccgactatgtcaaacctgac gatgcgcgcg ttgttgccca caccaaactg atcggcggcg gcgaagagtc ttccctgactctggatcctg ccaaattggc tgacggcgac tacaaatttg cctgcacttt cccgggtcac ggtgctttgatgaacggcaa agtgactttg gtcgattaat ccgcttaaag tctcaaaaga cggacagcct gctttgtgcaggctgtttta ttataaaatg actgcttgaa aagtgccccg ttgagaacga aaacatgaat ccgtttgaaa)。

SEQ ID NO：2是编码铜绿假单胞菌天青蛋白基因的基因组DNA编码序列(ctttttcatg cagcggatcg ctcgcgcatc acttcagggtcagggtgccc ttcatcagcgcggagtggcc cgggaaggtg cagaagaaca tgtactgctc gccttccttc agcttggaga cgtcgaaggtcaccgagtcc ttctcgcccg agccgatcag cttggtgtgg gcgatgacac ggctgtcgtc gggcttcaggtaatccttgt ccaggccgga agccatgccg tcggtgacca cgccctgcat gtcggcggcg gtgctcagtacccagttgtg gcccatgacg ttcttcggca ggttgccggg gtgggacagg ttgacggtga actgcttgcagctcttgtcg acggtgatgg cattggtgtt gaactgcatc tggtcgttac cctggatgtc caccgagcactcggcagcca gcagtggcgc actgagcagg gacagcaggg ataccgcagc gagtttacgtagcatggagc agcctcctag gcaggttggg cgatgaatcc tgaaagagca gactgcccgatcgggcaccg)。

SEQ ID NO：3是编码淋病奈瑟氏球菌laz基因的H.8区域的基因组DNA编码序列(tgctctcaag aacctgccgc gcctgctgcc gaggcaactc ctgccggtgaagcacccgct tccgaagcgc ctgccgccga agctgctcct gcagatgctg ccgaagcccc tgctgcc)。

SEQ ID NO：4是PCR扩增淋病奈瑟氏球菌的Laz编码基因(laz)的正向引物(ccggaattcc ggcagggatg ttgtaaatat ccg)。

SEQ ID NO：5是PCR扩增淋病奈瑟氏球菌的Laz编码基因(laz)的反向引物(ggggtaccgc cgtggcaggc atacagcatt tcaatcgg)。

SEQ ID NO：6是PCR扩增pUC18-laz的3.1kb片段的正向引物(ggcagcaggg gcttcggcag catctgc)。

SEQ ID NO：7是PCR扩增pUC18-laz的3.1kb片段的反向引物(ctgcaggtcg actctagagg atcccg)。

SEQ ID NO：8是PCR扩增pUC19-paz的0.4kb片段的正向引物(gccgagtgct cggtggacat ccagg)。

SEQ ID NO：9是PCR扩增pUC19-paz的0.4kb片段的反向引物(tactcgagtc acttcagggt cagggtg)。

SEQ ID NO：10是PCR扩增pUC19-paz的3.3kb片段的正向引物(cttcagggtc agggtgccct tcatc)。

SEQ ID NO：11是PCR扩增pUC19-paz的3.3kb片段的反向引物(ctgcaggtcg actctagagg atcccg)。

SEQ ID NO：12是PCR扩增pUC18-laz的0.13kb片段的正向引物(tgctctcaag aacctgccgc gcctgc)。

SEQ ID NO：13是PCR扩增pUC18-laz的0.13kb片段的反向引物(taggatcctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgc)。

SEQ ID NO：14是PCR扩增来自pGEX-5X-3的GST编码基因的正向引物(cgagctcatg tcccctatac taggttattg g)。

SEQ ID NO：15是PCR扩增来自pGEX-5X-3的GST编码基因的反向引物(cccaagcttt caggggatcc cacgaccttc gatcagatcc)。

SEQ ID NO：16是PCR扩增来自pUC18-laz的laz的信号肽和H.8编码区的正向引物(ggaattcata tgaaagctta tctggc)。

SEQ ID NO：17是PCR扩增来自pUC18-laz的laz的信号肽和H.8编码区的反向引物(ccggaattcg gcagcagggg cttcggc)。

SEQ ID NO：18是PCR扩增来自pUC18-laz的H.8编码区的正向引物(cgggatcccc tgctctcaag aacctgccgc gee)。

SEQ ID NO：19是PCR扩增来自pUC18-laz的H.8编码区的反向引物(cggaattctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgcag g)。

SEQ ID NO：20是PCR扩增来自pGEX-5X-3-H.8的GST-H.8融合区的正向引物(cgagctcatg tcccctatac taggttattg g)。

SEQ ID NO：21是PCR扩增来自pGEX-5X-3-H.8的GST-H.8融合区的反向引物(ccgctcgagt caggcagcag gggcttcggc ag)。

SEQ ID NO：22是淋病奈瑟氏球菌菌株F62 Laz蛋白的氨基酸序列，Genbank登录号Y00530(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu AlaThr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro AlaAsp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser AsnAsp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile GIn Val Ser Lys Ala Cys Lys GluPhe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr GIn Pro Lys Ala Ser Met Gly HisAsn Leu Val lIe Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly ValGly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala HisThr Lys Leu lIe Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala LysLeu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala LeuMet Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。

SEQ ID NO：23是铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu CysSer Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile ThrVal Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn LeuPro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met GlnGly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys ProAsp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu lle Gly Ser Gly Glu Lys AspSer Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe PheCys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。

SEQ ID NO：24是来自淋病奈瑟氏球菌F62 Laz蛋白的H.8区域的氨基酸序列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala GlyGlu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala AlaGlu Ala Pro Ala Ala)。

SEQ ID NO：25是五肽基序的氨基酸序列(Ala Ala Glu Ala Pro)。

SEQ ID NO：26是铜绿假单胞菌精氨酸脱亚胺酶(ADI)的氨基酸序列(Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys Leu ArgLys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg Leu Thr Pro Ser AsnCys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val Ile Trp Val Asn Gln Ala Lys Arg AspHis Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu Arg Gly Ile Asp Val Leu Glu MetHis Asn Leu Leu Thr Glu Thr Ile Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile LeuAsp Arg Lys Ile Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu ArgSer Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly GlyVal Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met TyrArg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr GlnPhe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro MetTyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala Ile Tyr Lys PheHis Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp LysAsp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asp Val Met Pro Ile Gly Asn GlyVal Val Leu Ile Gly Met Gly Glu Arg Ser Ser Arg Gln Ala Ile Gly Gln Val AlaGln Ser Leu Phe Ala Lys Gly Ala Ala Glu Arg Val Ile Val Ala Gly Leu ProLys Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp Arg AspLeu Ile Val Pro Phe Ser Leu Arg Pro Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Gly Met Asn IleArg Arg Glu Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Ala Glu Ser Leu Gly Leu LysLys Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn Ser Phe Ala Ala Glu Arg Glu GlnTrp Asp Asp Gly Asn Asn Val Val Cys Leu Glu Pro Gly Val Val Val GlyTyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Leu Arg Lys Ala Gly Val Glu ValIle Thr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly His Cys Met ThrCys Pro Ile Val Arg Asp Pro Ile Asp Tyr)。

SEQ ID NO：27是铜绿假单胞菌ADI的CARD区，残基75-225的氨基酸序列(Leu Leu Thr Glu Thr Ile Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile LeuAsp Arg Lys Ile Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu ArgSer Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly GlyVal Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met TyrArg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr GlnPhe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro MetTyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala Ile Tyr Lys PheHis Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp LysAsp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly)。

SEQ ID NO：28是PCR扩增铜绿假单胞菌ADI基因的CARD基序的正向引物的核苷酸序列(ATGCAC AATC TGCTGACCGAGACCATCCAG)。

SEQ ID NO：29是PCR扩增铜绿假单胞菌ADI基因的CARD基序的反向引物的核苷酸序列(CAGGTCGAGG AGCCGTGGTC CTTGTC)。

附图简述

图1.图1描绘了来自淋病奈瑟氏球菌的laz(A)和来自铜绿假单胞菌的paz(B)的示意图。用于在大肠杆菌中克隆和过高表达的铜绿假单胞菌天青蛋白基因由天青蛋白基因本身(paz)和决定其周质位置的信号肽(psp)序列组成(B)。将laz的H.8区域符合读框地克隆在包括奈瑟氏球菌信号序列nsp的paz基因的5′端(C)(pUC18-H.8-paz)或paz基因的3′端(D)(pUC19-paz-H.8)。用于制备这些构建体的详细程序在实施例1中给出。naz，在laz基因中存在的淋病奈瑟氏球菌的天青蛋白样序列；nsp，奈瑟氏球菌信号肽序列。在两种情况下的信号肽序列被切掉以产生成熟的Paz(周质)和Laz(表面暴露的)蛋白。(E)，Laz、Paz和融合蛋白的SDS-PAGE。H.8融合蛋白诸如Laz、H.8-Paz或Paz-H.8(均大约17kDa)的异常迁移之前已对脂化的(lapidated)包含H.8的蛋白指出(Cannon，Clin.Microbiol.Rev.2：S1-S4(1989)；Fisette，等人，J.Biol.Chem.278：46252-46260(2003))。

图2.图2描绘了显示H.8-Paz融合蛋白对各种癌细胞的细胞毒性程度的图。(A)合成的H.8肽、Paz、Laz以及在Paz(Paz-H.8)的羧基末端和Paz(H.8-Paz)的氨基末端的H.8融合物对成胶质细胞瘤LN-229细胞的细胞毒性。用三种不同浓度(10μM、20μM和40μM)的蛋白处理细胞6、12和24小时。进行MTT测定来测量活细胞的程度以说明细胞毒性(细胞死亡百分比)。为了计算细胞毒性百分比，将未处理的有活力的细胞的值视为100％，并且在Paz、Laz和H.8融合蛋白处理的样品中确定有活力的细胞的数目。然后从死细胞的数目确定细胞毒性的程度(％)。(B)H.8肽、Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性。所有的处理条件与以上(A)相似。

图3.图3描绘了各种荧光标记的天青蛋白相关蛋白进入成胶质细胞瘤LN-229细胞和乳腺癌MCF-7细胞中。(A)轭合于的H.8肽、Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz(各20μM)与LN-229细胞在盖玻片上在37℃孵育30min，之后拍摄图像。(B)如通过共聚焦显微镜所观察到的且根据对于(A)所述的，各种轭合于

的蛋白内化到MCF-7细胞中。(C)通过共聚焦显微镜观察到Laz的内化。将各种浓度(2μM、4μM、8μM和16μM)的荧光标记的Laz与LN-229细胞在37℃孵育30min。细胞核用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)标记为蓝色。(D)将轭合于的Laz(10μM)在37℃与LN-229细胞孵育多个时段(5min、10min、20min和30min)。通过共聚焦显微镜观察内化。(E)将轭合于

的Paz(10μM)与LN-229细胞在盖玻片上在37℃孵育不同的时间，之后拍摄图像。在(E)中检测到非常少的可测量的荧光。

图4.图4描绘了指示在图3A-D的共聚焦显微镜图像中发现的荧光定量的柱状图。(A)在图3A的图像中的荧光定量。通过使用

进行天青蛋白的荧光定量。误差棒代表单一样品的三种不同细胞中的荧光的标准差。(B)在图3B的图像中的荧光定量。如在图4A中那样进行定量。(C)在图3C的图像中的荧光定量。如在图4A中那样进行定量。(D)在图3D的图像中的荧光定量。如在图4A中那样进行定量。

图5.图5分别描绘了细胞中标记的融合蛋白的摄取和细胞毒性的图像和照片。用H.8-GST融合蛋白联合处理促进

标记的Paz在成胶质细胞瘤LN-229细胞中的摄取。将未标记的20μM(A)H.8、(B)GST、(C)GST-H.8、(D)H.8-GST、(E)PBS缓冲液和20μM轭合于Alexa

的Paz与LN-229细胞在37℃孵育30min。通过共聚焦显微镜观察内化。(F)合成的H.8肽、GST和GST-H.8/H.8-GST融合衍生物在有或没有Paz的情况下的细胞毒性。将大约5×10³LN-229细胞接种到96孔培养板中并在有20μM Paz(+Paz)或没有20μM Paz(-Paz)的情况下用各20μM的H.8肽、GST和GST-H.8、H.8-GST或相同体积的PBS缓冲液处理24小时。

图6.图6描绘了以轭合于

(LI-COR Biotechnology，Lincoln，Nebraska)的Paz、H.8-Paz和Laz注射的小鼠的脑的图像。(A)来自活小鼠的脑图像。在活的裸鼠中向腹膜内注射轭合于

的500μg Paz、H.8-Paz和Laz。在24小时后，处死小鼠，取出脑，并用LI-COR

红外成像系统检测和测量荧光。(B)按(A)中那样处理的裸鼠脑的中脑喙(rostral mesencephalon)区图像。平行地切割小鼠脑并拍摄图像。

图7.图8描绘了H.8-Gst融合蛋白在大肠杆菌中的定位的SDS-PAGE、蛋白质印迹和共聚焦图像。(A)用0.1mM IPTG在37℃培养具有克隆的gst、H.S-gst或gst-H.8基因的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。细胞沉淀(cellpellet)用PBS洗涤两次，并且对全细胞裂解物进行SDS-PAGE。考马斯亮蓝染色用于检测蛋白。(B).重复以上步骤，但这次全细胞裂解物和周质空间内容物被分别分离，进行SDS-PAGE(20μg蛋白)，并且通过用抗GST抗体的蛋白质印迹检测GST或GST-H.8融合蛋白来确定这些蛋白的总浓度和周质浓度。(C).用0.4mM IPTG在37℃培养具有克隆的gst、H.S-gst或gst-H.8基因的大肠杆菌菌株BL21(DE)细胞(表2)。将各1ml的这些细菌培养物离心并收集得到的细菌沉淀。在用PBS洗涤两次后，施加1ml包含抗GST抗体的1％FBS-PBS(1∶2000)。将细胞悬浮液孵育1小时，然后用PBS洗涤两次。将细菌细胞与1％FBS-PBS中的FITC轭合的抗兔IgG孵育30min。为了除去未结合的抗体，再次洗涤细胞，然后用乙醇在冰上固定。在共聚焦显微镜(×100物镜)下观察用DAPI(赋予蓝色染色)处理的大肠杆菌样品，并且还对单个细胞拍照。(D)将带有pUC19-paz(铜绿假单胞菌天青蛋白)、pUC19-laz(奈瑟氏球菌)、pUC18-H.8-paz或pUC18-paz-H.8的大肠杆菌细胞在存在0.1mM IPTG的情况下于37℃培养过夜。将0.5ml这种培养物离心，并且将得到的细菌沉淀用预冷的PBS洗涤两次。施加1ml的1％FBS-PBS中的抗天青蛋白抗体(1∶500)，并且在冰上孵育1小时。在用PBS洗涤两次后，施加FITC轭合的抗兔抗体，在冰上孵育30min，用PBS洗涤两次，并且用冷乙醇固定。通过共聚焦显微镜(×100物镜)观察细菌样品。

图8.图8描绘了显示如MTT测定所确定的细胞的细胞毒性的图。(A和B)通过对用10μM的Laz、天青蛋白(Azu)、H8-Azu和Azu-H8或作为阳性对照的5μM DAC处理的HL60(A)和K562(B)细胞在24小时、48小时和72小时后进行MTT测定，来确定细胞的细胞毒性。(C)用低浓度：3.75nM、37.5nM、75nM、2.5μM、5μM及10μM的Laz、Azu、H8-Azu、Azu-H8或作为阳性对照的5μM DAC处理的K562细胞。(D)通过对用不同浓度1μM、2.5μM、5μM和10μM的Laz、Azu、H8-Azu、Azu-H8或5μM DAC处理的HL60细胞进行MTT测定确定的细胞的细胞毒性。数据代表一式三份进行的三个独立实验的平均值(±标准误)。所有值与对照具有显著差异(p＜0.05)。

图9.图9描绘了在HL60细胞和K562细胞中由Laz和天青蛋白诱导的细胞形态学改变的荧光显微图像。如通过荧光显微术所显示的，Laz诱导了HL60细胞和K562细胞的形态学改变。(A)和(B)代表未处理的HL60细胞和K562细胞。用10μM Laz处理48小时的HL60细胞(C)或K562细胞(D)经历分化，分化是与后面的细胞凋亡相关联的过程。箭头指出分化的肉芽肿细胞。即使细胞毒性很高，在用10μM天青蛋白处理48小时的HL60细胞(E)或K562细胞(F)中看见较少的形态学改变。

图10.图10描绘了显示Laz和天青蛋白选择性进入HL60细胞和K562细胞的来自共聚焦显微镜的图像。组图1：天青蛋白和Laz在以10μM浓度孵育1小时后都没有进入外周血单核细胞(A和B)。天青蛋白在1小时孵育后进入K562细胞(D)，Laz也如此(C)。天青蛋白在1小时孵育后进入HL60细胞(F)，Laz也如此(E)。组图2：与对照K562细胞比较，Azu-H8、H8-Azu像Laz一样进入这些K562细胞。

图11.图11描绘了在不存在和存在天青蛋白、Laz和DAC的情况下细胞周期进程的图示。K562细胞用10μM Laz、天青蛋白和5μM DAC处理48小时，固定，染色并按之前所述分析DNA含量。

图12.图12描绘了免疫印迹的图像。该图提供了经由在Laz和Pa-CARD处理的K562细胞和HL-60细胞中在胞质和细胞核提取物中的蛋白的免疫印迹对AKT的磷酸化状态(AKT-P-Ser473)和Wee1蛋白水平的分析。显示了比较用10μM的Laz或10μM的Pa-CARD处理48小时后的HL60细胞和K562细胞(相比于未处理的细胞对照)的Wee1和磷-AKT丝氨酸473的水平的胞质蛋白和细胞核蛋白的蛋白质印迹分析。

图13.图13描绘了来自具有针对白血病细胞的细胞毒活性的铜绿假单胞菌ADI的CARD结构域的示意图。(A)CARD结构域存在于Pa-ADI和Ma-ADI中，但在胍基修饰的超家族酶的其他成员如DDAH和AGAT中不存在，如从基于结构的序列比对中所示。CARD结构域代表哺乳动物胱天蛋白酶-9的CARD结构域。DDAH，二甲基精氨酸二甲氨基水解酶；AGAT，精氨酸：甘氨酸脒基转移酶。β-链和α-螺旋分别显示为箭头和窄条。罗马数字I到V是五个ββαβ亚基。钳部分(α-螺旋模块)见于Pa-ADI和精氨酸支原体(M.argnini)ADI(Ma-ADI)中，它与形成胱天蛋白酶-9蛋白分子的CARD结构域的六个α-螺旋模块具有结构同源性。N，N端；C，C端。(B)来自铜绿假单胞菌的纯化的46kDa ADI和17kDa CARD蛋白的SDS-PAGE凝胶迁移。(C)Pa-ADI和Pa-CARD对纤维肉瘤细胞(HT-1080)、乳腺癌细胞(MCF-7)和白血病(HL60)细胞的细胞毒活性。将细胞与10μM Pa-ADI或Pa-CARD孵育48小时，之后通过MTT测定确定细胞活力。

图14.图14描绘了显示来自精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)和铜绿假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)的结构特征的图像。(A)突出两个结构域的铜绿假单胞菌ADI(1RXX_A)的带图(MolMol程序)。(B)在本文图13A中显示的图像拷贝。(C)显示如所述的铜绿假单胞菌ADI(Pa-ADI)的总体折叠和拓扑结构的示意图。

图15.图15描绘了显示Pa-ADI和Pa-CARD的纯化和精氨酸脱亚胺酶的酶促活性的凝胶图像和图。(A)来自铜绿假单胞菌的纯化的ADI和CARD蛋白的SDS-PAGE凝胶迁移。(B)纯化的Pa-ADI和Pa-CARD在37℃和pH 7.2的ADI活性动力学。在490nm测量了酶反应产物瓜氨酸。没有检测到Pa-CARD的精氨酸脱亚胺酶的酶促活性。

图16.图16描绘了显示Pa-CARD具有比Pa-ADI更高的抗一系列癌细胞的细胞毒性的图。(A)将纤维肉瘤细胞(HT-1080)、乳腺癌细胞(MCF-7)和卵巢癌细胞(SKOV-3)与20μM Pa-ADI或Pa-CARD孵育48小时，之后通过MTT测定来确定细胞活力。从一式三份培养物的3个实验确定每孔活力细胞的数目平均值(±标准误)。所有值与对照具有显著差异(p＜0.05)。(B)作为时间(24、48和72小时)的函数的由Pa-CARD显示的针对卵巢癌SKOV-3细胞的剂量依赖性细胞毒性。(C)对Pa-ADI进行相同的实验。按A中所述从一式三份培养物的3个实验确定每孔活力细胞的数目平均值(±标准误)。

图17.图17描绘了显示Pa-CARD、天青蛋白和顺自在卵巢癌SKOV-3细胞中的比较细胞毒性效应的图。(A)将均为20μM的Pa-ADI、Pa-CARD、天青蛋白和顺铂与SKOV-3细胞或正常卵巢HOSE6-3细胞孵育48小时，之后通过MTT测定来确定细胞活力。(B)与针对SKOV-3细胞的个体处理相比，Pa-CARD显示与顺铂的某种加性效应。

图18.图18描绘了显示Pa-CARD通过胱天蛋白酶活化在SKOV-3细胞中但未在HOSE6-3细胞中诱导凋亡的照片。TUNEL测定用于检测凋亡诱导的DNA链破裂，这种检测是通过使用原位细胞死亡检测荧光素试剂盒(in situ Cell Death Detection Fluorescein kit，Roche)测量荧光素标记的dUTP的加入而实现的。使SKOV-3细胞和HOSE6-3细胞生长在8孔LabTek腔式载玻片(Lab Tek chamber slide)中并且与10μM的Pa-CARD、Pa-ADI和天青蛋白孵育48小时。将没有处理或用BSA处理的阴性对照也进行平行培养(底部箭头)。用DAPI将细胞的细胞核染成蓝色。显示了在绿色(A)和蓝色(B)通道以及叠加图像(C)(青色)下观察到的细胞。

图19.图19描绘了显示胱天蛋白酶被Pa-CARD活化的图。通过购自Promega的Caspase-GloTM 3/7测定试剂盒来测量胱天蛋白酶活性。Pa-ADI和Pa-CARD以两种不同的浓度使用以评估剂量响应效应。将胱天蛋白酶活性的提高表示为相比于没有药物处理的对照的倍增。

实施方案的详细描述

定义

除非具体描述为“单个细胞”，否则如本文所用的术语“细胞”包括该术语的单数或复数。

如本文所用的术语“细胞毒性肽”表示对癌细胞且特别是对白血病细胞但不对正常细胞具有选择性细胞毒性的本发明的肽。

如本文所用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于如下氨基酸聚合物：其中一种或多种氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人造化学类似物。这些术语还适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”也包括修饰，所述修饰包括但不限于：糖基化、脂质附着(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应理解多肽不总是完全线性的。例如，多肽可以因为泛素化而分支，并且它们可以是环状的(有或没有分支)，一般是因为翻译后事件，包括天然加工事件和通过人的操作带来的并非天然发生的事件。环状的、分支的以及分支环状的多肽可通过非翻译天然过程且也可通过完全合成方法来合成。合成肽是没有细胞组分的帮助而制备的肽。制备肽的合成方法是本领域公知的并且是商业上可获得的。此外，本发明涵盖了本发明的蛋白的含有甲硫氨酸和甲硫氨酸较少(methionine-less)的氨基端变体的使用。

如本文所用的术语“病症”包括在解剖学和生理学上偏离正常，这种偏离构成活的动物或其部分之一的正常状态的损害，这种损害破坏或改变身体功能的表现。

如本文所用的术语“抑制细胞生长”表示细胞分裂和/或细胞扩增的减慢或停止。该术语还包括细胞发育的抑制或细胞死亡的增加。

如本文所用的术语“患有”包括目前显示病症的症状、具有甚至没有观察到的症状的病症、在从病症的恢复中以及从病症恢复。

如本文所用的术语“治疗”包括防止、降低、停止或逆转病症或与正在治疗的病症相关的症状的进展或严重度。这样，术语“治疗”适当时包括医疗性、治疗性和/或预防性给药。治疗还可以包括防止或减轻病症如恶化前病变或癌症的形成。

“治疗有效量”是有效防止、降低、停止或逆转受治疗者正在治疗的特定病症的现有症状的发展或者部分或完全地缓解受治疗者正在治疗的特定病症的现有症状的量。治疗有效量的确定完全是在本领域技术人员的能力之内。

如本文所用的术语“基本纯的”当用于修饰本发明的蛋白或其他细胞产物时是指，例如，从生长培养基或细胞内容物中分离的、处于基本上不含或不掺杂其他蛋白和/或活性抑制化合物的形式的蛋白。术语“基本纯的”是指按干重计至少约75％的分离部分或至少“75％基本纯的”的量的系数。更具体地说，术语“基本纯的”是指具有按干重计至少约85％活性化合物的化合物，或指至少“85％基本纯的”化合物。最具体地说，术语“基本纯的”是指具有按干重计至少约95％的活性化合物的化合物，或指至少“95％基本纯的”化合物。术语“基本纯的”还可以用于修饰本发明的合成制备的蛋白或化合物，其中，例如，合成蛋白与合成反应的试剂和副产物分离。

如本文所用的术语“药物级”当指本发明的肽或化合物时是基本上或实质上与通常伴随以天然态发现的材料的组分分离的肽或化合物，所述组分包括合成试剂和副产物，以及是基本上或实质上与损害其用作药物的组分分离的肽或化合物。例如，“药物级”肽可与任何致癌物分离。在一些情况下，“药物级”可由预定的施用方法修饰，如“静脉内药物级”，以限定基本上或实质上与将使得组合物不适于静脉内施用至患者的任何物质分离的肽或化合物。例如，“静脉内药物级”肽可与去污剂如SDS和抗细菌剂如叠氮化物分离。

短语“分离的”、“纯化的”或“生物纯”是指基本上或实质上不含通常伴随以天然态发现的材料的组分的材料。因此，依据本发明的分离肽优选地不包含通常与原位环境中的肽相关的材料。“分离的”区域是指如下区域：不包括该区域所来源的多肽的整个序列的区域。“分离的”核酸、蛋白或其相应片段已基本上从其体内环境中移出以便它可被技术人员操作，诸如但不限于核苷酸测序、限制酶切消化、定点诱变，和亚克隆到核酸片段的表达载体中，以及获得基本纯的数量的蛋白或蛋白片段。

如本文所用的关于肽的术语“变体”是指与野生型多肽相比有氨基酸被取代、缺失或插入的氨基酸序列变体。变体可以是野生型肽的截短物。“缺失”是一个或多个氨基酸从野生型蛋白中去除，而“截短”是一个或多个氨基酸从一个或多个野生型蛋白末端去除。因此，变体肽可通过操作编码多肽的基因来制备。变体可通过改变多肽的基本组成或特征但不改变其至少某些根本活性来制备。例如，奈瑟氏球菌肽或Pa-CARD肽的“变体”可以是保留杀伤白血病细胞的能力的突变的奈瑟氏球菌肽或Pa-CARD肽。在一些情况下，用非天然氨基酸如ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-Lys残基合成变体肽(Ghadiri & Fernholz，J.Am.Chem.Soc，112：9633-9635(1990))。在一些买施方案中，变体与野生型肽相比有不超过20、19、18、17或16个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过15、14、13、12或11个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过10、9、8或7个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过6个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过5个或4个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过3个、2个或1个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，使用在美国专利申请系列第12/389,120号中描述的技术和方法创建变体，该文献的公开内容通过引用整体并入本文。

如本文所用的术语“氨基酸”表示包括任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即，包括由一个、两个、三个或更多个碳原子(通常为一个(α)碳原子)直接连接的至少一个羧基和至少一个氨基残基的任何部分。术语“残基”与“氨基酸”同义。

如本文所用的关于肽的术语“衍生物”是指衍生自主题肽的肽。衍生包括肽的化学修饰以使得该肽仍保留其根本活性中的一些活性。例如，奈瑟氏球菌肽或Pa-CARD肽的“衍生物”可以是保留其杀伤白血病和/或卵巢癌细胞的能力的化学修饰的奈瑟氏球菌肽或Pa-CARD肽。感兴趣的化学修饰包括但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽或其片段与化合物的融合物，所述化合物诸如但不限于另一种肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或可检测探针。在一些实施方案中，使用在美国专利申请系列第12/389,120号中描述的技术和方法创建衍生物，该文献的公开内容通过引用整体并入本文。

术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为当多肽与候选序列比对时多肽中的氨基酸残基与候选序列中的氨基酸残基相同的百分比。为了确定氨基酸同一性百分比，比对序列，并且如果必要，引入空位来实现最大序列同一性百分比；保守性取代不被认为是序列同一性的一部分。确定同一性百分比的氨基酸序列比对步骤是本领域技术人员公知的。通常可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件用于比对肽序列。在具体的实施方案中，使用Blastp(可从美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)，Bethesda MD获得)，使用的缺省参数为：长复杂度滤波器(long complexity filter)、期望值(expect)10、字长(word size)3、存在(existence)11和延伸(extension)1。

当比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A对给定氨基酸序列B、与给定氨基酸序列B、或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(能够可替代地被表达为具有或包含对给定氨基酸序列B、与给定氨基酸序列B、或针对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性百分比的给定氨基酸序列A)可计算为：

氨基酸序列同一性％＝X/Y＊100

其中

X是根据A与B的序列比对程序或算法比对而评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，和

Y是B中的氨基酸残基总数。

如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，那么A对B的氨基酸序列同一性百分比不等于B对A的氨基酸序列同一性百分比。当将较长序列与较短序列比较时，较短的序列是“B”序列。例如，当将截短的肽与相应的野生型肽进行比较时，截短的肽是“B”序列。

概况

本发明提供了包含对癌细胞而不是正常细胞具有细胞毒效应的细菌肽以及这些肽的变体、衍生物和结构等同物的组合物，以及防止哺乳动物形成癌症、治疗哺乳动物癌症和杀伤哺乳动物癌细胞的方法。具体地说，本文公开的组合物和方法可用于防止、治疗和/或杀伤白血病和/或卵巢癌。

已显示，许多铜氧还蛋白(cupredoxin)、特别是铜绿假单胞菌天青蛋白及其截短物具有在体内和体外优先进入并杀伤许多类型的哺乳动物实体癌细胞的能力(Yamada等人，Cell.Biol.7：1418-1431(2005)；Hiraoka等人，PNAS 101：6427-6432(2004)；Hiraoka等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.338：1284-1290(2005))。还参见美国专利第7,491,394号、7,381,701号和7,084,105号，以及美国专利申请系列第11/488,693号、11/950,165号、11/854,654号和12/338,480号，它们的公开内容通过引用整体并入本文。天青蛋白样基因存在于许多淋球菌和脑膜炎双球菌如淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)中(Gotschlich & Seiff，FEMS Microbiol.Lett.43：253-255(1987)；Kawula，等人，Mol.Microbiol.1：179-185(1987))。天青蛋白由许多病原菌产生，并且在这些基因中存在显著的序列同源性(Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。

一种称为“H.8”的蛋白表位在病原奈瑟氏球菌属物种中是保守的，并且通过结合指定的H.8的单克隆抗体来检测。这种不同的淋球菌基因laz编码与H.8单克隆抗体交叉反应的蛋白(Hayashi & Wu，J.Bioenerg.Biomembr.22：451-471(1990))。

Laz是包含由细菌酶信号肽酶II识别的信号肽脂蛋白共有序列的淋球菌外表面蛋白，该信号肽酶II加工该信号肽脂蛋白共有序列导致脂肪酸和甘油的半胱氨酸残基的N端酰化。(Hayashi & Wu，同前；Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。Laz脂蛋白，大约17kDa，包括H.8区，该H.8区是N端包含基序Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(AAEAP(SEQ ID NO：25))的不完美的五肽重复序列的39氨基酸区域(Gotschlich & Seiff，同前；Kawula，等人，同前；Woods等人，Mol.Microbiiol.3：43-48(1989))。除此之外在Laz中的这种39氨基酸N端区域是与铜绿假单胞菌天青蛋白高度同源的127个氨基酸区域。(Cannon，Clin.Microbiol.Rev.2：S1-S4(1989))Laz参与针对氧化应激和铜毒性的防御并提高在活体外的原代人外宫颈上皮测定(ex vivo primary human ectocervical epithelial assay)中的存活率(Wu，等人，Infect.Immun.73：8444-8448(2005))。

现在已知来自淋病奈瑟氏球菌和其他奈瑟氏球菌属物种的天青蛋白样蛋白Laz蛋白能够特异性进入并杀伤脑癌细胞如成胶质细胞瘤细胞以及其他肿瘤。见实施例2和实施例7。此外，现在已知Laz蛋白的H.8区当融合至铜绿假单胞菌天青蛋白的N端或C端时能够赋予铜绿假单胞菌天青蛋白进入并杀伤成胶质细胞瘤细胞的能力。见实施例2和实施例3。

现在还已知H.8区不必与共施用的蛋白如天青蛋白物理地连接来赋予该蛋白进入成胶质细胞瘤细胞的能力。见实施例5。相比于单独的天青蛋白，H.8和融合至GST的N端的H.8均增加物理上未连接的天青蛋白进入成胶质细胞瘤细胞，然而融合至GST的C端的H.8无效。此外，H.8和融合至GST的N端的H.8当与天青蛋白共施用时均增强天青蛋白对成胶质细胞瘤细胞的细胞毒性。见实施例5。还考虑可用这种AAEAP(SEQ ID NO：25)重复单元设计杀伤白血病细胞的肽。

天青蛋白和laz已知在癌症进展途径中靶向多个步骤，如通过复合物形成和p53的稳定诱导凋亡、抑制凋亡以及抑制由受体酪氨酸激酶如EphB2/肝配蛋白B2所介导的细胞信号传导，从而使形成抗性的机会降到最小。参见，例如美国专利第7,381,701号，通过引用将其公开内容整体并入本文。天青蛋白和Laz已知在黑色素瘤或乳腺癌细胞中相比于正常细胞具有进入特异性。

出人意料地，除了对实体型癌细胞具有细胞毒性外，天青蛋白和Laz蛋白也对液体传播癌症(liquid-borne cancer)如白血病有效，如通过本文给出的实施例所显示的。这些实施例显示天青蛋白和Laz能够各自进入白血病细胞系并且在其中具有细胞毒效应。此外，如在实施例9和实施例11中所讨论且在图8-11中所显示的，Laz对白血病细胞系发挥细胞毒效应，而对正常的外周血单核细胞(PBMC)几乎没有效应，在正常的外周血单核细胞它们具有有限的进入。这些细菌蛋白在白血病细胞中具有进入特异性，但在正常的PBMC中没有(图10，组图1)。

除了天青蛋白和Laz以外，门冬酰胺酶和精氨酸脱亚胺酶(ADI)已显示具有针对实体瘤的活性，所述实体瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌等等，并且也已报道来自精氨酸支原体的ADI(Ma-ADI)抑制人白血病细胞的增殖(Yamada T等人，Proc Natl Acad Sci USA2002；99：14098-103；Punj V等人，Oncogene 23：2367-78(2004)；Ni Y等人，Cancer Lett.261：1-11(2008)；Fialho AM，Chakrabarty AM，Anticancer DrugDiscov 2：224-34(2007)；Ensor CM等人，Cancer Res 62：5443-50(2002)；Yoon CY等人，Int.J Cancer 120：897-905(2007)；Gong H等人，Leukemia14：826-9(2000))。在Ma-ADI中的催化三联体是Cys 398-His 269-Glu213。然而，除了Ma-ADI对白血病细胞的效应的一次报道外，之前几乎不知道细菌蛋白如ADI在可能的针对白血病的治疗应用中的作用。

铜绿假单胞菌也产生ADI(Pa-ADI)，该ADI在Cys406-His278-Asp166具有催化三联体，并且具有与Ma-ADI的一级序列同源性。二级结构匹配(SSM)程序的使用揭示了在Pa-ADI的N端区域中的胱天蛋白酶募集结构域(“CARD”)样结构域(蛋白质数据库，PDB ID代码1RXX)，它对带有CARD结构域的胱天蛋白酶-9的原结构域(pro-domain)(PDB ID代码3YGS)具有可辨别的结构同源性。如图14D所示，在胍基超家族的成员中，ADI是唯一带有CARD结构域的。除了以上讨论的在精氨酸支原体ADI中的CARD样结构域(PDB ID代码1LXY)之外，在细菌蛋白中没有已知的CARD样结构域。出人意料地，如本文所公开的，在Pa-ADI(Pa-CARD)中的CARD结构域具有很强的抗癌活性。简言之，CARD结构域多肽显示显著的抗癌活性同时对正常细胞几乎未展示细胞毒性。

哺乳动物的包含CARD的蛋白通常由大约95个氨基酸残基构成并且具有对死亡域(DD)和死亡效应域(DED)的序列相似性。CARD的结晶结构表明它由环绕疏水袋的大约6个紧密堆积的α-螺旋组成。类似地，Pa-CARD由形成5个堆积的α-螺旋的85个氨基酸残基组成，这些α-螺旋采取“夹式风扇(clip-on-fan)”部分的形式(图14B和图14C)。因为一些哺乳动物CARD结构域促进癌症生长，所以感兴趣的可能性是细菌CARD有助于干扰哺乳动物CARD活性，从而有助于含推定的CARD样结构域的Pa-ADI的抗癌活性。预期Pa-CARD结构域可由携带哺乳动物CARD的蛋白补充，并且Pa-CARD可在癌细胞中发挥其细胞毒效应，至少在部分上通过与已知在癌细胞中被过高表达的哺乳动物CARD蛋白的蛋白-蛋白相互作用。还预期这种相互作用可能是ADI在癌症生长的调节中的作用的原因。

Pa-CARD(SEQ ID NO：27)显示了针对白血病细胞和卵巢癌细胞的出人意料的细胞毒活性。特别地，Pa-CARD多肽具有抑制白血病细胞增殖的能力。在白血病细胞系HL60和K562中，Laz和Pa-CARD的抗癌活性是通过在G2/M期的细胞周期停滞介导的，G2/M期涉及Wee1蛋白稳定和磷酸化的AKT-Ser-473的消耗，磷酸化的AKT-Ser-473是通常在许多癌症类型中失调的丝氨酸/苏氨酸激酶的活性形式。见实施例11和实施例12以及图12。具体地说，Pa-CARD和Laz通过Wee1蛋白在K562细胞中的上调和活性AKT P-Ser473在HL60细胞中的下调来抑制白血病细胞的细胞周期(图12)。

已知Wee1和磷酸化的AKT-Ser473(AKT-P-Ser473)参与G2/M期的细胞周期停滞，已知G2/M期的细胞周期停滞进而导致细胞死亡。例如，促有丝分裂激酶CDC2(也称为CDK1)的活化是真核细胞从G2期转变为M期所需要的，在真核细胞中在Thr-14和Tyr-15残基上的CDC2的磷酸化是重要的。抑制性Tyr-15磷酸化是由Wee1蛋白激酶所介导的，并因此其增强的水平介导这种对转变为M期的抑制。已知病毒蛋白模拟Laz/Pa-CARD介导的Wee蛋白激酶水平的升高。人乳头瘤病毒1型(HPV-1)E4蛋白通过形成无活性的细胞周期蛋白B1-CDK1复合物来抑制细胞周期的G2到M的转变，所述B1-CDK1复合物的形成是通过由水平升高的Wee1催化的抑制性Tyr-15磷酸化实现的。因此，Wee1的过表达增强G2细胞周期停滞，而通过小干扰RNA(siRNA)消耗Wee1缓解E4诱导的G2阻断。类似地，病毒癌基因v-akt的人同源物AKT(蛋白激酶B)在磷脂酰基肌醇3-激酶(PI3K)途径中起作用。在AKT-1中Ser-473残基被PDK2磷酸化对于细胞周期进程是重要的，而磷酸化的Akt Ser-473(Akt-P-S473)水平的降低增强G2/M停滞，如通过HL60细胞中的Laz和Pa-CARD所证明的。

Pa-CARD经由编码GM-CSF的基因的转录刺激而具有对SKOV-3(卵巢癌)的效应。基因被刺激大约3倍的GM-CSF和IL-12已知是许多肿瘤模型中的抗肿瘤免疫性的有效诱导剂，在肿瘤位点引发粒细胞、巨噬细胞和树突细胞的浸润，从而大大地增强肿瘤抗原递呈。因此似乎Pa-CARD诱导的凋亡(图18)可显著加到在存在Pa-CARD的情况下过高生成的任何GM-CSF的抗肿瘤响应。尽管基因谱表达显示许多细胞因子基因的刺激，但细胞因子CCL2(C-C基序配体2)的基因，也称为单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，显示显著的(17倍)阻抑(表3)。CCL2通常显示通过在肿瘤中增加单核细胞募集和有害的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)而促进在乳腺癌中的恶性转化。CCL2也已知可能经由MCPIP促进血管发生和转移，MCPIP是一种新颖的转录因子，它活化钙粘蛋白基因cdh12和cdh19的转录。因此，Pa-CARD降低CCL2水平可通过干扰血管发生和肿瘤生长进程而允许肿瘤衰退。

总之，本文的实施例和公开内容显示细菌蛋白如天青蛋白、Laz和Pa-CARD能够进入白血病细胞并诱导G2/M期的细胞周期停滞，G2/M期的细胞周期停滞似乎是由CDC2-细胞周期蛋白B阻抑途径和细胞PI3K/AKT途径介导的细胞信号传导的调节所引发的。此外，ADI能够具有几种方式的抗癌活性，包括经由酶促消耗精氨酸和通过没有ADI活性的N端推定的CARD样结构域(图14-16)。Pa-cARD蛋白显示主要对癌细胞的抑制作用，但对正常细胞没有(图18)。此外，抗癌活性可通过胱天蛋白酶活性介导(图19)，并且能够诱导在卵巢癌细胞中的凋亡。

本发明的组合物

本发明提供了单独或与一种或多种其他细胞毒剂组合的细胞毒性肽和/或这些肽的变体、衍生物、截短物或结构等同物。

在一些实施方案中，细胞毒性肽是铜氧还蛋白或其截短物。在一些这样的实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白或其截短物。在其他这样的实施方案中，细胞毒性肽是Laz或其截短物。在其他实施方案中，细胞毒性肽是Laz的H.8区。在一些实施方案中，细胞毒性肽包括选自由SEQ ID NO：22-24组成的组的一种或多种氨基酸序列。

在其他实施方案中，细胞毒性肽包括CARD结构域。在一些实施方案中，细胞毒性肽是携带CARD的蛋白。在一些实施方案中，携带CARD的蛋白来源于细菌。在另一个实施方案中，细菌为铜绿假单胞菌。在一个实施方案中，细胞毒性肽是Pa-CARD。在另一个这样的实施方案中，细胞毒性肽包括SEQ ID NO：27。

在一些实施方案中，使用本领域公知的技术将细胞毒性肽与赋予其更大细胞毒效应的另一种肽融合。在一个这样的实施方案中，另一种肽是Laz的H.8区。在另一种肽中，另一种肽具有包括SEQ ID NO：24的序列。在一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白Azu-H.8。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白H.8-Azu。图1。

可以与本文所述的细胞毒性肽组合施用的一种或多种其他细胞毒剂可以是癌症治疗药物，包括但不限于：顺铂、

视黄酸、5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(“DAC”)和/或与三氧化二砷结合的视黄酸。除了

视黄酸、DAC和/或与三氧化二砷结合的视黄酸以外的癌症治疗药物包括：细胞周期控制蛋白，如p53；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如p16、p21或p27；自杀蛋白，如胸腺嘧啶核苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其他免疫调节蛋白，如白细胞介素1、白细胞介素2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；毒素，如铜绿假单胞菌外毒素A；5-氟尿嘧啶；干扰素α；甲氨蝶呤；他莫西芬；雷洛昔芬；长春新碱；烷化剂，如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、氮丙啶、和三氮烯；抗代谢药，如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、以及嘧啶类似物；抗生素，如蒽环类抗生素、博来霉素、丝裂霉素、更生霉素和普卡霉素；酶，如L-门冬酰胺酶；法尼基-蛋白转移酶抑制剂；5α-还原酶抑制剂；17β-羟基类固醇脱氢酶3型抑制剂；激素药，如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黄体酮、和促黄体生成素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽；微管破坏剂，如海鞘素(ecteinascidin)或其类似物和衍生物；微管稳定剂，如紫杉烷，例如，紫杉醇(Taxol^TM)、多西他赛(Taxotere^TM)、及其类似物，和埃坡霉素，如埃坡霉素A-F及其类似物；植物源产物，如长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂；和各种各样的剂，如羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲蜜胺、铂配位络合物，如顺铂和卡铂；和用作抗癌剂和细胞毒性剂的其他剂，如生物反应调节物、生长因子；免疫调节剂和单克隆抗体；盐酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星、噻替派、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁(pentastatin)、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素、柔红霉素、伊达比星、硫酸博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、番红霉素(safracin)、沙弗拉霉素(saframycin)、quinocarcin、discodermolide、长春新碱、长春碱、酒石酸长春瑞滨、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、氟他胺、布舍瑞林、亮丙立德、蝶啶、双炔(diynes)、左旋咪唑、aflacon、干扰素、白细胞介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔单抗、BCG、维甲酸、盐酸伊立替康、倍他米松(betamethosone)、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺、和托泊替康以及它们的任何类似物或衍生物。

其他细胞毒剂的实例还包括以下：如在德国专利第4138042.8号；WO97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253和WO 00/00485中发现的埃坡霉素衍生物；如在WO 99/24416(还参见美国专利第6,040,321号)中发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；以及如在WO 97/30992和WO98/54966中发现的异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂；以及诸如那些一般且特定地在美国专利第6,011,029号中描述的剂，其化合物能够与任何NHR调节剂如AR调节剂、ER调节剂一起，与LHRH调节剂一起利用，尤其是在癌症的治疗中。

本发明还提供了为铜氧还蛋白和/或携带CARD的蛋白的变体、衍生物、截短物或结构等同物的细胞毒性肽。在一些实施方案中，分离细胞毒性肽。在一些实施方案中，细胞毒性肽是基本纯的或药物级的。在其他实施方案中，细胞毒性肽在包含该细胞毒性肽或基本上由该细胞毒性肽组成的组合物中。在其他实施方案中，细胞毒性肽在包含该细胞毒性肽和至少一种其他细胞毒剂的组合物中。在另一个具体实施方案中，细胞毒性肽是无抗原性的并且不在哺乳动物(且更具体为人)中产生免疫应答。在一些实施方案中，细胞毒性肽比全长铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白小，并且保留了全长蛋白的某些药理活性。具体地说，在一些实施方案中，细胞毒性肽可保留杀伤癌细胞特别是白血病细胞的能力。

因为在铜氧还蛋白之间的高结构同源性，预期其他铜氧还蛋白将具有与天青蛋白和Laz相同的细胞毒特性，特别是关于白血病的。在一些实施方案中，铜氧还蛋白为，但不限于：天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白(rusticyanin)、绿丝菌蓝色铜蛋白(auracyanin)、漆树蓝蛋白、黄瓜碱性蛋白或Laz。在特别具体的实施方案中，天青蛋白或Laz来源于铜绿假单胞菌、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化物色杆菌反硝化亚种I(Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans I)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、甲基单胞菌(Methylomonas sp.)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhea)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、Ulvapertussis或副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。在具体的实施方案中，天青蛋白来自铜绿假单胞菌。

本发明提供了如下细胞毒性肽：所述细胞毒性肽为与野生型铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白相比氨基酸被取代、缺失或插入的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的氨基酸序列变体。本发明的变体可以是野生型蛋白的截短物。在一些实施方案中，本发明的细胞毒性肽包含比全长野生型多肽小的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的区域。

本发明的细胞毒性肽还可以包括用非天然存在的合成氨基酸制备的肽。例如，非天然存在的氨基酸可被整合到化学预防剂中来延长或优化该组合物在血流中的半衰期。这些化学预防剂包括但不限于：D，L-肽(非对映体)(例如Futaki等人，J.Biol.Chem.276(8)：5836-40(2001)；Papo等人，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller等人，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987)；包含罕见氨基酸的肽(例如Lee等人，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))，包含非天然氨基酸的烯烃接着碳化氢钉针(hydrocarbon stapling)(例如Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski等人，Science 305：1466-1470(2004))，和包含ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-Lys残基的肽。

在其他实施方案中，本发明的细胞毒性肽是铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的衍生物。铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的衍生物是化学修饰的肽，使得该肽仍保留其一些根本活性。例如，天青蛋白、Laz或Pa-CARD的“衍生物”可以是保留其杀伤癌细胞特别是白血病细胞和/或卵巢癌细胞的能力的化学修饰的蛋白。另一种衍生物可以是具有增加的或优化的在血流中的半衰期的衍生物。化学修饰可包括但不限于，在美国专利申请系列第12/389,120号中公开的化学修饰，该申请的公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，可使用包括但不限于以下的方法修饰细胞毒性肽：减少肽的水解、减少肽的脱酰胺作用、减少氧化、减少免疫原性和/或增加肽的结构稳定性。预期本文所述的或通过引用并入的两种或更多种修饰可合并在一种修饰的铜氧还蛋白衍生肽中，且本文所述的一种或多种修饰与改进药物代谢动力学特性的其他修饰的组合是本领域技术人员公知的。设计这些变体和衍生物的许多方法是本领域公知的。

使用方法

本发明提供了杀伤哺乳动物特别是人的癌细胞、特别是白血病细胞和/或卵巢癌细胞的方法。所述方法包括使癌细胞与对癌细胞具有细胞毒效应的分离肽或其变体、衍生物、截短物或结构等同物接触。分离肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，分离肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，分离肽是Laz。又在另一个实施方案中，分离肽是Pa-CARD。在另外的实施方案中，分离肽是包含Laz的H.8区的融合蛋白。在一个这样的实施方案中，融合蛋白是H.8-Azu。在另一个这样的实施方案中，融合蛋白是Azu-H.8。细胞毒性肽可以单独施用给癌细胞或与本文所述的另一种细胞毒剂组合或与Laz的H.8区组合施用给癌细胞。在一些实施方案中，细胞毒性肽与Laz的H.8区同时或大致同时施用。在其他实施方案中，细胞毒性肽与包含SEQ ID NO：24的序列同时或大致同时施用。

本发明还提供了通过向患者施用对癌细胞具有细胞毒效应的分离肽或其变体、衍生物、截短物或结构等同物来治疗患有癌症的哺乳动物患者或另外杀伤哺乳动物患者中的癌细胞的方法。分离肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，分离肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，分离肽是Laz。又在另一个实施方案中，分离肽是Pa-CARD。在另外的实施方案中，分离肽是包含Laz的H.8区的融合蛋白。在一个这样的实施方案中，融合蛋白是H.8-Azu。在另一个这样的实施方案中，融合蛋白是Azu-H.8。细胞毒性肽可以单独施用或与本文所述的另一种细胞毒剂组合或与Laz的H.8区组合施用。在一些实施方案中，细胞毒性肽与Laz的H.8区同时或大致同时施用。在其他实施方案中，细胞毒性肽与包含SEQ ID NO：24的序列同时或大致同时施用。

本发明还提供了通过向白血病细胞和/或卵巢癌细胞施用一种或多种细胞毒性肽来诱导白血病细胞和/或卵巢癌细胞通过细胞分化而死亡的方法。细胞毒性肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Laz。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白H.8-Azu。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白Azu-H.8。

本发明还提供了通过向白血病细胞和/或卵巢癌细胞施用一种或多种细胞毒性肽来选择性进入白血病细胞和/或卵巢癌细胞并且在其中具有细胞毒效应的方法。细胞毒性肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Laz。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Pa-CARD。在另外的实施方案中，细胞毒性肽是包含Laz的H.8区的融合蛋白。在一个这样的实施方案中，融合蛋白是H.8-Azu。在另一个这样的实施方案中，融合蛋白是Azu-H.8。

本发明还包括通过引起G2/M期的细胞周期停滞来杀伤白血病细胞和/或卵巢癌细胞的方法，所述方法包括施用一种或多种细胞毒性肽。在另外的实施方案中，细胞毒性肽稳定Wee1蛋白和/或提高细胞中的Wee1蛋白水平，包括但不限于细胞的细胞质和/或细胞核中的Wee1蛋白水平。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽消耗磷酸化的AKT-Ser-473。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽既稳定/提高Wee1蛋白水平又消耗磷酸化的AKT-Ser-473。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Laz。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Pa-CARD。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白H.8-Azu和Azu-H.8中的一种或多种。

编码细胞毒性肽的核酸和表达载体

在另一方面，本发明提供了编码本文所述的细胞毒性肽及其变体、衍生物和/或结构等同物的核酸分子。根据本发明的核酸分子可通过组合本领域已知的技术来制备。在这些核酸中使用的编码序列可以是那些在编码特定肽的天然基因组DNA中发现的编码序列，或者可以由已知密码子设计。这些编码序列也可以被设计成考虑到要表达多肽的生物的替代密码子使用和偏好密码子使用。细胞毒性肽的核酸序列可通过化学合成或克隆个别地制备。然后可用连接酶将核酸序列连接在一起，以便给出感兴趣的核酸分子。

用于使遗传材料在生物之间穿梭的载体可分为两大类：克隆载体是具有在适当的宿主细胞中繁殖所必需的且外源DNA可插入其中的区域的复制质粒或噬菌体；外源DNA如同它是载体的组分一样被复制和繁殖。表达载体(如质粒、酵母或动物病毒基因组)用来将外源遗传材料引入宿主细胞或组织中以便转录和翻译外源DNA，如细胞毒性肽像Laz、天青蛋白、Pa-CARD、H.8-Azu或Azu-H.8的DNA。在表达载体中，引入的DNA与传递信号给宿主细胞以高效转录插入的DNA的元件如启动子可操作地连接。一些启动子是格外有用的，如响应于特定因子而控制基因转录的诱导型启动子。将细胞毒性肽及其变体和衍生物与诱导型启动子可操作地连接能够响应于特定因子而控制该细胞毒性肽及其变体和衍生物的表达。经典诱导型启动子的实例包括那些对α-干扰素、热休克、重金属离子和类固醇如糖皮质激素(Kaufman，Methods Enzymol.185：487-511(1990))以及四环素有响应的启动子。其他令人期望的诱导型启动子包括那些对于引入构建体的细胞来说不是内源的但是当外源供应诱导剂时在这些细胞中有响应的启动子。一般来说，有用的表达载体通常是质粒。然而，考虑其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒)。

载体选择由正使用的生物或细胞以及期望的载体去向来决定。一般来说，载体包括信号序列、复制起点、标记基因、多聚接头位点、增强元件、启动子和转录终止序列。

包含细胞毒性肽的药物组合物

本发明还提供了包含至少一种细胞毒性肽的组合物，所述细胞毒性肽是铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白，或是铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的变体、衍生物、截短物或结构等同物，特别是在药物组合物中单独的或与至少另一种细胞毒剂组合的细胞毒性肽。在具体实施方案中，将药物组合物设计为特定的施用方式，例如，但不限于，口服、腹膜内或静脉内。这些组合物可以是在水中水合的，或可以是干燥的(如通过冷冻干燥)以用于后来的水合。这些组合物可以在除水外的溶剂中，诸如但不限于醇。

包含细胞毒性肽的本发明的药物组合物能够以任何常规方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、成粒、制糖衣(dragee-making)、乳化、装胶囊、截留或冷冻干燥工艺。细胞毒性肽可容易地与本领域公知的药学上可接受的载体合并。这些载体使得制剂能够被配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮剂等等。适合的赋形剂还可以包括，例如，填充剂和纤维素制剂。其他的赋形剂可包括，例如，调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。

在多个实施方案中，组合物包括载体和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)，水，油，盐水溶液，含水葡萄糖和甘油溶液，适当的生理条件所需的其他药学上可接受的辅助物质，如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等等。将认识到，尽管可利用本领域技术人员已知的任何适宜的载体施用本发明的组合物，但载体类型将随施用方式而改变。还可使用公知技术将化合物封装在脂质体中。也可以利用生物可降解的微球作为本发明的组合物的载体。适合的生物可降解的微球显示在，例如美国专利第4,897,268号、5,075,109号、5,928,647号、5,811，128号、5,820,883号、5,853,763号、5,814,344和5,942,252号中。如本文所述的“化合物”包括本发明的肽、氨基酸序列、载荷化合物(cargo compound)和络合物和核酸。

用于制备施用本文公开的细胞毒性肽和核酸的药物组合物的静脉注射液(intravenous fluid)可由类晶体或胶体构成。如本文所用的类晶体是矿物盐或其他水溶性分子的水溶液。如本文所用的胶体包含较大的不可溶分子，如明胶。静脉注射液可以是无菌的。

可用于静脉内施用的类晶体流体包括但不限于生理盐水(0.9％浓度的氯化钠溶液)、林格氏乳酸盐或林格氏溶液、以及有时称为D5W的5％葡萄糖的水溶液，如表1所述。

表1：常见的类晶体溶液的组成

^*林格氏乳酸盐还具有28mmol/L乳酸盐、4mmol/L K⁺和3mmol/L Ca²⁺。

本发明的组合物在血流中的半衰期可通过本领域技术人员公知的几种方法延长或优化，包括但不限于：环化肽(Monk等人，BioDrugs19(4)：261-78，(2005)；DeFreest等人，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))、D，L-肽(非对映体)(Futaki等人，J.Biol.Chem.Feb 23；276(8)：5836-40(2001)；Papo等人，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller等人，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987))；包含罕见氨基酸(Lee等人，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))，以及N端和C端修饰(Labrie等人，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))的肽。特别感兴趣的是经由D-取代或L-氨基酸取代的肽稳定性的d-异构化(取代)和修饰。

当施用是通过注射时，组合物可以被配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。溶液可包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，组合物可以是在使用前以适合的媒介物例如无菌无热原水构建的粉末形式。

当通过吸入法施用时，组合物可以以喷雾剂形式递送，所述喷雾剂来自利用适合的推进剂的加压包或喷雾器，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供递送计量用量的阀来确定。例如在吸入器或吹入器中使用的明胶的胶囊和药筒可被配制成包含蛋白与适合的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

当施用是通过局部施用时，如本领域所公知的，组合物可被配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、悬浮液等等。在一些实施方案中，施用是借助透皮贴剂。当施用是通过栓剂(例如，直肠栓剂或阴道栓剂)时，组合物也可以被配制在包含常规栓剂基质的组合物中。当施用是口服时，组合物可以容易地与本领域公知的药学上可接受的载体组合在一起配制。可利用固体载体，如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等等；这些载体使得趋化因子能够被配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮剂等等，以用于待治疗的受治疗者的口服摄入。对于口服固体制剂例如像粉末、胶囊和片剂来说，适合的赋形剂包括填充剂如糖、纤维素制剂、成粒剂和粘合剂。

其他本领域公知的常规载体也包括多价载体，如细菌荚膜多糖、葡萄糖或基因工程载体。此外，包括所述组合物的缓释制剂允许该组合物经延长的时间释放，以至于如果没有该缓释制剂，组合物将在引起或增强治疗效果之前从受治疗者的系统中清除，和/或被例如蛋白酶和单纯水解降解。

包含细胞毒性肽的药盒

在另一方面，本发明提供了在包装或容器中包含以下的一种或多种的药盒：(1)包括本文所述的一种或多种细胞毒性肽的试剂；(2)包括药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂；(3)施用媒介物，如注射器；(4)施用说明。在同一容器中发现组分(1)-(4)的两种或更多种的实施方案也被考虑。在其他实施方案中，药盒组分也可以包括一种或多种额外的细胞毒剂。在其他的实施方案中，配制试剂用于静脉内施用，和/或施用的媒介物适合于静脉内施用。

当提供药盒时，组合物的不同组分可被包装在各自的容器中并且在使用前立即混合。组分的这种分别包装可分别允许长期储存而不损失活性组分功能。

在药盒中包括的试剂可提供在任何种类的容器中，以使得不同组分的寿命被保藏并且不被容器的材料吸附或改变。例如，密封的玻璃安瓿可盛装冻干的多肽或多核苷酸，或在中性非反应的气体如氮气之下包装的缓冲液。安瓿可由任何适宜的材料组成，如玻璃，有机聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷，金属或通常用于容纳相似试剂的任何其他材料。适合的容器的其他实例包括可由类似的物质像安瓿一样制造的简单的瓶，以及可包含如铝或合金的箔内衬的包装袋(envelop)。其他容器包括试管、管形瓶、烧瓶、瓶、注射器或类似容器。容器可具有无菌入口(sterile access port)，如具有可被皮下注射针穿入的塞子的瓶。其他容器可具有两个被容易移去的膜分隔的室，该膜在移去后允许组分混合。可移去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等等。

药盒还可以配有说明材料。可以将说明印在纸上或其他基质上，和/或可以作为电子可读介质提供，如软磁盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、录音带、闪存装置等等。详细说明可以不与药盒在物理上关联；相反，可将用户引导至由药盒的制造商或分销商指定的因特网网站，或作为电子邮件提供。

通过参考以下具体实施例，可获得对本发明的更完整的理解。仅出于解释的目的描述实施例，且实施例不旨在限制本发明的范围。在情况提示有利或变得有利时，考虑形式变化和等同物的取代。尽管本文已利用特定术语，但这些术语意在描述意义而不是出于限制的目的。可在不背离本发明的精神和范围的情况下作出本文之前给出的本发明的修饰和变化，因此，仅这些限制应按照由所附实施方案所指示那样来施加。

实施例

实施例1.Laz和H.8-天青蛋白融合基因的克隆和表达

基于来自淋病奈瑟氏球菌的laz基因的已知序列(SEQ ID NO：1)克隆该基因(图1A)。使用称为paz(图1B)的铜绿假单胞菌天青蛋白基因(SEQ ID NO：2)和来自淋病奈瑟氏球菌的laz的H.8表位序列(SEQ IDNO：3)将H.8表位基因符合读框地克隆在paz的5′端中产生H.8-paz(图1C)或者符合读框地克隆在paz的3′端中产生paz-H.8(图1D)，如以下所述。

细胞系和试剂。人癌细胞、细菌菌株和质粒列在表2中。人乳腺癌MCF-7细胞和脑瘤LN-229细胞来自伊利诺斯大学芝加哥校区(UIC)手术肿瘤学系的储存培养物保藏中心(stock culture collection of theDepartment of Surgical Oncology，University of Illinois at Chicago(UIC))。将细胞培养在包含2mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM必需氨基酸和补充了10％热灭活的胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的具有伊格尔盐的MEM中。所有细胞在37℃、5％CO₂下生长。(Yamada，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，等人，Oncogene23：2367-2378(2004))。

表2.癌细胞、细菌菌株和基因构建体

^*Ap，氨苄西林；Km卡那霉素；GST，谷胱甘肽S-转移酶。

Paz和laz基因的克隆和表达。已描述了天青蛋白基因的克隆和过高表达。(Yamada，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，等人，Oncogene 23：2367-2378(2004))用淋病奈瑟氏球菌F62菌株的基因组DNA作为模板DNA通过PCR扩增了淋病奈瑟氏球菌的Laz编码基因(laz)。使用的正向引物和反向引物是5’-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3′(SEQ ID NO：4)和5′-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3′(SEQID NO：5)，其中另外引入的限制酶切位点EcoRI和KpnI位点被分别加下划线。将用EcoRI和KpnI消化的扩增的1.0kb DNA片段插入到pUC18载体的相应位点(Yanisch-Perron，等人，Gene 33：103-119(1985))，使得laz基因被安放在lac启动子的下游以产生表达质粒pUC18-laz(表2，图1)。

用pUC19-paz和pUC18-laz作模板通过PCR构建了表达融合的淋病奈瑟氏球菌Laz的H.8和铜绿假单胞菌的天青蛋白(Paz)的质粒。对于H.8-Paz融合，使用pUC18-laz作模板和以下引物扩增3.1kb片段：5′-(磷酸化的)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3′(SEQ ID NO：6)和5′-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3′(SEQ ID NO：7)，其中SalI位点被加下划线。从作为模板的pUC19-paz和以下引物获得了PCR扩增的0.4kb片段：5′-(磷酸化的)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3′(SEQ ID NO：8)和5′-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3′(SEQID NO：9)，其中XhoI位点被加下划线。克隆来自pUC18-laz的SalI消化的PCR片段和来自pUC19-paz的XhoI消化的PCR片段以产生表达质粒pUC18-H.8-paz(表2，图1)。

对于Paz-H.8融合，使用pUC18-laz作模板和以下引物扩增3.3kb片段：5′-CTTCAGGGTCAGGGTGCCCTTCATC-3′(SEQ ID NO：10)和5′-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3′(SEQ ID NO：11)，其中BamHI位点被加下划线。使用pUC18-laz作为模板和以下引物扩增了0.13kb片段：5′-(磷酸化的)TGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCCTGC-3′(SEQ IDNO：12)和5′-TAGGATCCTTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3′(SEQ IDNO：13)，其中BamHI位点被加下划线，并且对应于细菌基因终止密码子的另外引入的TTA以斜体显示。克隆两个BamHI消化的PCR片段以产生表达质粒pUC19-paz-H.8(表2)。

大肠杆菌JM109用作表达天青蛋白及其衍生基因的宿主菌株。将重组的大肠杆菌菌株于37℃培养在包含100μg/ml氨苄西林、0.1mM IPTG和0.5mM CuSO₄的2×YT培养基中持续16小时以产生天青蛋白。

融合GST蛋白的质粒构建。用pGEX-5X-3(GE Healthcare Bio-SciencesCorp.，Piscataway，NJ)作为模板DNA通过PCR扩增谷胱甘肽S-转移酶(GST)编码基因。使用的正向引物和反向引物是5’-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3′(SEQ ID NO：14)和5′-CCCAAGCTTTCAGGGGATCCCACGACCTTCGATCAGATCC-3′(SEQID NO：15)，其中另外引入的限制酶切位点SacI和HindIII被分别加下划线，并且另外引入的TCA(对应的细菌基因终止密码子)以斜体显示。将用SacI和HindIII消化的扩增的1.0kb DNA片段插入pET29a载体相应位点以产生表达质粒pET29a-gst(表2)。

对于H.8-GST融合，用pUC18-laz作模板DNA通过PCR扩增laz的信号肽和H.8编码区。使用的正向引物和反向引物是5′-GGAATTCATATGAAAGCTTATCTGGC-3′(SEQ ID NO：16)和5′-CCGGAATTCGGCAGCAGGGGCTTCGGC-3′(SEQ ID NO：17)，其中另外引入的限制酶切位点NdeI和EcoRI位点被分别加下划线。将用NdeI和EcoRI消化的扩增的0.14kb DNA片段插入pET29a-gst载体相应位点以产生表达质粒pET29a-H.8-gst(表2)。

对于GST-H.8融合，用pUC18-laz作模板DNA通过PCR扩增H.8编码区。使用的正向引物和反向引物是5’-CGGGATCCCCTGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCC-3′(SEQ ID NO：18)和5′-CGGAATTCTTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGCAGG-3′(SEQ ID NO：19)，其中另外引入的限制酶切位点BamHI和EcoRI被加下划线，并且引入的细菌基因终止密码子TTA以斜体显示。将用BamHI和EcoRI消化的扩增的0.14kb DNA片段插入pGEX-5X-3载体相应位点以产生pGEX-5X-3-H.8。然后用pGEX-5X-3-H.8作模板DNA通过PCR扩增GST-H.8融合区。使用的正向引物和反向引物是5’-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3′(SEQ ID NO：20)和5′-CCGCTCGAGTCAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAG-3′(SEQ ID NO：21)，其中另外引入的限制酶切位点SacI和XhoI位点被加下划线，并且细菌基因终止密码子TCA以斜体显示。将用SacI和XhoI消化的扩增的1.1kbDNA片段插入pET29a载体相应位点以产生表达质粒pET29a-gst-H.8(表2)。

大肠杆菌BL21(DE3)用作表达gst及其融合衍生物的宿主菌株。当带有这些质粒的大肠杆菌菌株如对天青蛋白所述的在存在IPTG的情况下生长，裂解细胞并纯化蛋白时(Yamada，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：14098-14103(2002)；Punj，等人，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))，多种天青蛋白衍生物作为单组分在SDS-PAGE上迁移(图1E)，但是包含H.8的蛋白(约17kDa)显示异常迁移，如以前所指出的那样(Cannon等人，同前；Fisette等人，同前)。

实施例2.H.8增强铜绿假单胞菌天青蛋白对成胶质细胞瘤细胞而不是对乳腺癌细胞的细胞毒性

已报道Paz优先进入癌细胞(Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))及其在体外和体内针对人黑色素瘤(Yamada，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002))和乳腺癌(Punj，等人，Oncogene 23：2367-2378(2004))的细胞毒性。还参见美国专利申请系列第12/338,480号，通过引用将其公开内容整体并入本文。然而，已知Paz或Laz对脑瘤如成胶质细胞瘤没有作用。这里研究了Paz、Laz、H.8-Paz(在Paz的N端中的H.8表位)和Paz-H.8(在Paz的C端中的H.8表位)对成胶质细胞瘤(LN-229细胞系)和乳腺癌(MCF-7细胞系)细胞的作用。

蛋白的制备。按之前所述纯化铜绿假单胞菌的天青蛋白(Paz)、淋病奈瑟氏球菌的Laz、Paz-H.8和H.8-Paz(Yamada，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，等人，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。按以前所述纯化所有的重组GST融合衍生物(Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。化学合成的39氨基酸的H.8肽是购买的。

细胞毒性测定。进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基)溴化四唑(MTT)测定来确定对癌细胞的细胞毒性。在37℃、5％CO₂下将细胞(5×10³每孔)接种到96孔培养板的100∶1培养基中。在过夜孵育后，除去上清液并将包含指定的多个浓度的蛋白的新鲜培养基添加至附着的细胞。将这些细胞孵育指定的多个时间段，然后通过添加10μl 5mg/ml MTT(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)溶液到培养物中并在37℃孵育2小时，通过MTT测定确定活细胞数目。通过添加100μl在异丙醇中的40mM HCl终止MTT反应。根据Mosmann所述的方法(J.Immunol.Methods 65：55-63(1983))以分光光度计测量形成的MTT甲臜(formazan)。

合成的H.8肽对成胶质细胞瘤LN-229细胞(图2A)或乳腺癌MCF-7(图2B)细胞具有非常小的细胞毒性。天青蛋白(Paz)在成胶质细胞瘤(图2A)中的作用是剂量依赖性的，尽管很低，但在乳腺癌(图2B)细胞中不是这样，而是随着天青蛋白浓度从10μM升到40μM，细胞毒性逐渐增加。超过6小时孵育时间细胞毒性仅少量增加。最值得注意的是Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz在成胶质细胞瘤细胞和乳腺癌细胞中细胞毒性的差异。尽管Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz在所有剂量在不同的孵育时段的MCF-7细胞中具有基本上相同的细胞毒性(图2B)，但Paz具有比Paz-H.8、H.8-Paz或Laz低得多的对成胶质细胞瘤的细胞毒性，尤其是在较短的孵育时段(6小时)。因此，H.8部分尽管本身缺乏细胞毒性，却显示增强了Paz的细胞毒性，但这种细胞毒性仅是针对成胶质细胞瘤的而不是针对乳腺癌细胞的。

实施例3.存在于Paz或Laz中的H.8表位促进成胶质细胞瘤细胞中天青蛋白的摄入

与Paz相比，Paz-H.8、H.8-Paz和Laz对成胶质细胞瘤细胞的细胞毒性增强产生如下问题：是否H.8部分某种程度上促进成胶质细胞瘤细胞中天青蛋白的摄入。

标记的红色荧光蛋白(Invitrogen-Molecular Probes Corp.，Carlsbad CA)用于确定这些蛋白内化到成胶质细胞瘤细胞和乳腺癌细胞内部。这种技术之前用于显示天青蛋白在MCF-7细胞中的内化(Punj，等人，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。

共聚焦显微镜。对于显微镜样品的制备，将细胞在37℃在5％CO₂之下过夜培养在盖玻片上。将预热的37℃新鲜培养基与红色荧光标记的

天青蛋白或GST融合衍生物混合，并与细胞一起孵育指定的时间。用PBS洗涤细胞，然后与甲醇一起在-20℃混合5分钟。在用PBS洗涤三次并添加包含用于给细胞核染色的1.5mg/ml 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固剂

Vector Laboratories，Burlingame CA)后，通过使用Carl Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜拍摄图像(Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。

天青蛋白(Paz)以比Paz-H.8、H.8-Paz和Laz低的效率内化，显示Paz进入成胶质细胞瘤LN-229细胞的障碍(图3A和图4A)。相比之下，Paz如之前所报道的那样在乳腺癌MCF-7细胞中被有效地内化，其效率等于或某种程度上大于Paz-H.8、H.8-Paz或Laz(图3B和图4B)。(Punj，等人，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，等人，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))Laz进入LN-229细胞的剂量依赖性显示在37℃在30min孵育期间大约16μM的最适浓度(图3C和图4C)，超过该浓度没有进一步增强(数据未显示)。在10μM浓度，尽管大量Laz在LN-229细胞中在大约10到20min内被内化(图3D和图4D)，但Paz的内化在这些条件下最小(图3E)，表明Paz内化在LN-229细胞中是内在无效的。Paz-H.8和H.8-Paz在LN-229细胞中的显著内化与Laz相似但与Paz相反(图3A和图4A)，这似乎表明H.8部分在Paz的N端或在C端的相对定位不影响其促进Paz部分在成胶质细胞瘤细胞中内化的能力。

实施例4.H.8部分促进Paz进入成胶质细胞瘤细胞而不是乳腺癌细胞

为了确定H.8表位是否需要成为Paz的一部分(像在Laz中一样)或者H.8表位是否能够单独起作用来促进Paz进入成胶质细胞瘤细胞中，除了单独的H.8之外，还使用了各种H.8融合蛋白。因为小肽如39氨基酸合成的H.8部分在溶液中具有很低的稳定性，所以我们构建了与Paz-H.8或H.8-Paz相似的具有H.8部分的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合物，使得H.8被加入到GST的N端(H.8-GST)或GST的C端(GST-H.8)。在实施例1之下描述了GST融合肽的构建。

将发红色荧光的

轭合的Paz分别与未标记的合成的H.8肽、GST、GST-H.8和H.8-GST融合蛋白以及作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS)一起孵育，并且在37℃孵育30min后确定20μM Paz混合物在LN-229细胞中的内化。合成的H.8肽当与Paz一起单独被引入时，与PBS(图5E)、GST(图5B)或GST-H.8(图5C)相比的确增强了Paz内化(图5A)。荧光定量显示H.8肽刺激Paz进入2.1倍。然而，H.8-GST的存在显著增强(多于3倍)了Paz的内化(图5D)。另一方面，GST-H.8只显示温和的刺激(图5C)。Paz本身只缓慢进入(图5E)成胶质细胞瘤细胞中，显示在脑瘤细胞中的进入由H.8介导。单独的H.8不进入成胶质细胞瘤细胞(图3A)，但其刺激Paz内化(图5A)的能力反映了其促进蛋白进入脑瘤细胞的能力。

实施例5.在存在H.8-GST的情况下Paz在成胶质细胞瘤细胞中的内化增强导致在这些细胞中较高的细胞毒性。

我们在不存在或存在20μM Paz的情况下将合成的H.8肽、GST、GST-H.8和H.8-GST蛋白(各20μM)与LN-229细胞孵育24小时，然后通过借助24小时后的MTT测定测量有活力的成胶质细胞瘤细胞来测量细胞毒性的程度。在不存在Paz的情况下，H.8肽、GST或GST融合蛋白都没有显示任何显著的细胞毒性(图5F，-Paz)。在存在20μM Paz的情况下，Paz本身在存在H.8肽或PBS的情况下显示较低细胞毒性(图5F，+Paz)，只在存在H.8-GST的情况下观察到细胞毒性的可观的增强(图5F，+Paz)，但是GST本身或GST-H.8确实显示细胞毒性的某种增强(图5F，+Paz)。综观来说，这些数据表明H.8部分当作为蛋白一部分而存在或在存在诸如Paz的蛋白的情况下存在时，促进Paz运输到这些细胞内部，导致增强的细胞毒性。

实施例6.H.8介导穿过BBB以允许进入脑

H.8表位允许融合物或单个蛋白在成胶质细胞瘤LN-229细胞中的内化增强(图3A、图4A和图5D)的能力产生了如下问题：H.8是否作为H.8-Paz或Laz的N端的一部分促进穿过BBB并允许将这些蛋白从外周循环运输到脑小静脉。

测定。所有蛋白在制造商建议的条件下使用

(LI-COR Biosciences，Lincoln，Nebraska)来标记。在裸鼠中向腹膜内注射轭合于

的500μg Paz、H.8-Paz和Laz。在24小时后，处死小鼠，取出脑并且用LI-COR

红外成像系统(84μm分辨率，1mm偏移)检测脑图像。然后平行地切割小鼠脑并拍摄中脑区的图像用于检测标记蛋白的存在。

天青蛋白中的荧光定量。通过使用如下测量荧光定量：通过

的Lasso Tool选择一个细胞，并从图像菜单的红色直方图取得平均值。一个样品至少测量三个不同的细胞，并计算标准偏差。

将500μg用红外染料

CW(LI-COR Bioscience)标记的Paz、H.8-Paz和Laz蛋白经腹膜内注射到活裸鼠中。在24小时后，处死小鼠，分离脑并使用LI-COR

红外成像系统拍摄图像。尽管发现少量Paz进入脑小静脉，但在这些条件下在脑内检测到多得多的Laz特别是H.8-Paz(多于4倍)(图6)，显示H.8表位允许融合蛋白进入脑的明确作用。

实施例7.H.8表位当存在于N端时允许细菌表面展示周质蛋白.

为了研究H.8表位在Laz的N端定位是否有助于其表面展示，按实施例1所述在GST(图5)和Paz(图2和图3A/B和图4A/B)的N端和C端中构建了H.8融合衍生物。

大肠杆菌中表面暴露的蛋白的定位。在37℃具有0.4mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的情况下培养带有pET29a-gst、pET29a-H.8.gst或pET29a-gst-H.8的大肠杆菌BL21(DE3)菌株和带有pUC19-paz、pUC19-paz-H.8、pUC18-H.8-paz或pUC18-laz的大肠杆菌JM109菌株。将各1ml的这些细菌培养物离心并收集得到的沉淀(pellet)。在用PBS洗涤两次后，添加1ml含对于GST衍生物的抗GST抗体(1∶2000)或对于天青蛋白衍生物的抗天青蛋白抗体(1∶500)的1％FBS-PBS。将细胞悬浮液在冰上孵育1小时，然后用PBS洗涤两次。施加对于GST衍生物的FITC轭合的抗兔IgG或对于天青蛋白衍生物的FITC轭合的抗兔抗体并且在冰上孵育30min。为了除去未结合的抗体，用PBS洗涤细胞两次，并且用乙醇在冰上固定。然后在共聚焦显微镜下观察用DAPI处理的大肠杆菌样品。

纯化H.8融合蛋白(图1E和图7A)。在图7B中显示了GST以及在N端和C端的两种H.8融合物(H.8-GST和GST-H.8)的细胞定位。当通过使用抗GST抗体的蛋白质印迹检测时，所有三种蛋白在大肠杆菌中被过高表达并且存在于大肠杆菌的全细胞裂解物中(图7B)。当周质级分从大肠杆菌中分离并检查三种蛋白的存在时，检测到大量的GST和GST-H.8蛋白(图7B，在周质级分下的泳道1和泳道3)，但在这些周质级分中只能检测到少量的H.8-GST(图7B，在周质级分下的泳道2)。

为了检验其余的H.8-GST融合蛋白是否能够运输到大肠杆菌细胞的表面，培养并收集过高表达这三种蛋白的细胞，洗涤，用抗GST抗体处理以结合任何表面暴露的GST，再次洗涤并用FITC轭合的二抗处理。如果GST是表面暴露的，那么抗GST抗体将结合它们，然后可被FITC轭合的二抗检测到。实际上，只有带H.8-GST的大肠杆菌细胞显示FITC产生的绿色荧光(图7C，H.8-GST)，表明在GST的N端中存在H.8表位促进其运输到细胞表面。H.8部分在GST的C端中的存在(GST-H.8)以及GST本身大部分地仍是周质的和胞内的而没有任何表面展示(图7C，GST和GST-H.8)。

使用如以上所述的相同技术，确定了Paz和Paz-H.8仍是胞内的(图7D，Paz和Paz-H.8)，而H.8-Paz和Laz显示表面展示，证实H.8在N端的存在(或许需要游离的半胱氨酸用于脂质化)对于运输融合蛋白通过外膜到达表面是重要的。

实施例8.制备天青蛋白、Laz和Pa-CARD肽用于白血病研究

按Yamada T等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：14098-103(2002)和Punj V等人，Oncogene 23：2367-78(2004)所述纯化野生型(wt)天青蛋白和突变的天青蛋白。使用与Hong CS等人，Cell Cycle 5：1633-41(2006)中所述相同的方案纯化Laz。简言之，使用pUC18载体在大肠杆菌中表达Laz。孵育细胞24小时，离心，并且在PBS中洗涤两次，然后裂解以分离周质级分。收集周质级分以用于Q琼脂糖凝胶交换进行蛋白纯化。将级分浓缩并且在FPLC上对纯化的蛋白进行分离。

Pa-CARD的克隆、表达和纯化。在其N82末端区域具有SUMO融合蛋白的pET-SUMO表达载体用于可溶的精氨酸脱亚胺酶和来自铜绿假单胞菌ADI的包含胱天蛋白酶募集结构域(CARD)的结构域的高水平表达。为了将ADI基因的CARD基序克隆到pET-SUMO载体(Invitrogen)中，用以下引物从铜绿假单胞菌的临床分离株的基因组DNA中扩增该基因：F，fwd：5′-ATGCACAATCTGCTGACCGAGACCATCCAG-3′(SEQ ID NO：28)和R，rev：5′-TCAGGTCGAGGAGCCGTGGTCCTTGTC-3′(SEQ IDNO：29)。将PCR产物直接连接到pET-SUMO TA克隆载体中。得到的表达载体被测序证实并将其转化到大肠杆菌90菌株BL21(DE3)中。

使过夜培养物在37℃生长在包含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。在OD₅₉₅nm约为0.5时，将具有0.5mM终浓度的IPTG添加到培养物中并且在37℃孵育5小时。通过以5000rpm离心15分钟收集细胞。通过包含50mM Tris-Cl、100mM NaCl和25％(w/v)蔗糖的pH，8.0的裂解缓冲液裂解细胞沉淀。在添加裂解缓冲液后，将20mg/ml溶菌酶添加到细胞悬浮液中并且在4℃孵育20min。添加Triton X-100[终浓度0.01％(v/v)]并孵育5min。每500ml培养物添加100μl DNA酶和RNA酶并且在37℃孵育30min。将细胞悬浮液在4℃以15,000rpm离心35min。将上清液在预平衡的1ml Ni-NTA柱上上样。在上样后，用缓冲液(50mM Tris-Cl，300mMNaCl，10％甘油，10mM咪唑)洗涤柱。用25ml步长梯度(step gradient)的50-500mM咪唑洗脱缓冲液(100mM Tris-Cl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH，8.9)洗脱SUMO-CARD。汇集纯化的SUMO-CARD级分，并与缓冲液(20mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH，8.0)交换以用于SUMO蛋白酶消化。然后将SUMO-CARD蛋白浓缩直至1.5-2ml。然后将DTT添加到1mM的终浓度。在添加SUMO蛋白酶后，将消化混合物在30℃孵育2-3小时，并通过使用镍树脂纯化称为Pa-CARD的CARD多肽。使用BSA作标准品用蛋白试剂(Pierce)测量蛋白的终浓度。从中获取CARD结构域的铜绿假单胞菌的ADI酶是使用相同方法(Pa-ADI)从SUMO-ADI融合蛋白中纯化的。

细胞培养。将所有细胞系培养在补充10％胎牛血清(FBS)2％青霉素/链霉素以及2％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(Gibco/Life TechnologiesInc.)中。使所有细胞生长在增湿的37℃、5％CO2的培养箱中。

细胞毒性测定。按Yamada T等人，Proc Natl Acad Sci USA99：14098-103(2002)和Punj V等人，Oncogene 23：2367-78(2004)所述使用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5溴化四唑)]测定来测量野生型天青蛋白和突变的天青蛋白的细胞毒性。简言之，通过完整的线粒体脱氢酶将水溶性四唑盐[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5溴化四唑)]代谢为不溶于水的甲臜。然后通过添加2-丙醇+40mM HCl孵育1小时使甲臜溶解。用不同浓度的天青蛋白、Laz或Pa-CARD以及作为阳性对照的5-氮杂-2-脱氧胞苷(DAC)处理3×10⁴细胞。基于形成的甲臜估计细胞的活力，通过以分光光度计在570nm的光密度检测形成的甲臜。

细胞周期分析。用野生型天青蛋白、Pa-CARD或Laz(5μM和10μM)处理HL60细胞和K562细胞(在24孔板中每孔接种3×10⁵细胞)48小时。用PBS洗涤细胞两次并且用70％乙醇在-20℃固定。用PBS洗涤固定的细胞两次，并且用在包含20μg/ml RNA酶A的PBS中的50μg/ml碘化丙锭在黑暗中染色30min，并通过流式细胞术(Becton Dickinson)分析。通过MODFIT LT软件确定在细胞周期不同期中的细胞百分比。

蛋白质印迹。对于免疫印迹，根据制造商的方案使用NE-PER提取试剂(Pierce)用完全的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)分离细胞质级分及细胞核级分。使用Bradford Bio-Rad测定测量细胞裂解物的蛋白质浓度。经SDS-PAGE分离细胞裂解蛋白并将其转移至PVDF膜用于免疫印迹。将膜在包含5％脱脂奶粉(Difco)的Tris缓冲盐水(0.15M NaCl，0.05MTris-HCl[pH 8.0]，0.05％吐温20)中封闭并且在4℃在轻柔搅拌下与一抗(按推荐的稀释度在TBST、5％脱脂奶粉中)孵育过夜。在用TBST洗涤三次每次5min后，用来自Zymed Laboratories(San Francisco，CA)的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或兔抗小鼠抗体(在TBST，5％脱脂奶粉中1∶3000)在室温下探测膜持续1小时。在额外的洗涤步骤后，将膜与化学发光基质在室温下孵育1min。为了在每次抗体孵育中除去结合的抗体，根据制造商的方案将膜在恢复蛋白质印迹剥离缓冲液(Restore Western blotstripping buffer，Pierce)中孵育并再次探测。抗B肌动蛋白来自Sigma。AKT、Wee1和抗-磷酸基-AKT-S 473抗体来自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和兔抗小鼠二抗来自Zymed Laboratories(San Francisco，CA)。

共聚焦显微术。将天青蛋白和Laz蛋白与荧光化学品AlexaFluor 568(Molecular Probes)轭合并与HL60、K562或正常外周血单核细胞孵育1小时。通过共聚焦显微术(LC510型，Carl Zeiss)观察到荧光化学标记的肽或蛋白进入细胞，如Yamada T等人，Cell Microbiol.7：1418-31(2005)所述。

实施例9.天青蛋白和Laz对白血病细胞的作用

检验细菌蛋白Laz和天青蛋白诱导细胞的细胞毒性从而减少两种白血病细胞系的活力的能力，所述两种白血病细胞系为一种AML细胞系HL60和一种CML细胞系K562。根据细胞系HL60和K562在用10μM Laz或天青蛋白处理24小时、48小时和72小时后以代谢方式将MTT还原为紫色甲臜产物的能力来测量细胞系HL60和K562的活力(图1A和图1B)。10μM的蛋白证明具有高度细胞毒性，减少细胞活力超过90％。Laz是具有天青蛋白组分的奈瑟氏球菌蛋白，它与铜绿假单胞菌天青蛋白具有明显序列同一性，但具有称为H8表位的额外39氨基酸肽。

为了确定这种H8表位是否调节天青蛋白的抗癌活性，将H.8表位克隆在铜绿假单胞菌天青蛋白的N端和C端，产生H8-天青蛋白(H8-Azu)和Azu-H8。Hong CS等人，Cell Cycle 5：1633-41(2006)。这两种Laz样蛋白也针对白血病细胞系进行测试。为了确定低有效剂量，用不同浓度的蛋白(终浓度在3.75nM及以上)处理K562细胞，而HL60细胞用1-10μM终浓度处理。所有的细菌蛋白展示对这两种白血病细胞系剂量依赖性细胞毒效应。甚至用纳摩尔(nM)蛋白浓度观察到显著的细胞活力降低，其中5μM的蛋白观察到活力降低峰值(图8C和图8D)。用在HL60细胞和K562细胞中发挥细胞毒效应的所有蛋白处理24小时后，这种细胞毒效应是明显的(图8A和图8B)。

还将Laz和天青蛋白的细胞毒效应与已知的白血病药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)进行比较。5-氮杂-2′-脱氧胞苷是通过再活化被DNA超甲基化沉默的肿瘤抑制基因起作用的DNA甲基化抑制剂。肿瘤抑制基因的再活化导致细胞周期停滞和凋亡。每种细菌蛋白的活力降低效应显著好于DAC的活力降低效应(图8C和图8D)。天青蛋白或Laz对癌细胞具有细胞毒性而对正常细胞没有细胞毒性。还已显示这种细胞毒性是由于该肽本身，且不是由于细胞污染物如内毒素。

在努力辨别由Laz和天青蛋白诱导的细胞死亡的可能机制时，通过荧光显微术寻找明显肉眼能看到的形态学改变。寻找帮助区分细胞坏死、凋亡和细胞分化的改变，细胞坏死、凋亡和细胞分化是最终导致细胞死亡的过程。诸如颗粒形成或细胞增大等改变预示了在急性髓细胞样白血病细胞和慢性髓细胞样白血病细胞的两种情况下可能的分化或坏死以及最终的细胞死亡。荧光显微术结果显示Laz和天青蛋白能够以10μM浓度孵育21048小时后在HL60细胞和K562细胞中诱导细胞分化(图9)。

实施例10.Laz和天青蛋白进入HL60和K562细胞

使用共聚焦显微术和AlexaFluor 568轭合的红色荧光的天青蛋白或Laz检验了天青蛋白和Laz进入HL60细胞和K562细胞的能力。这两种蛋白似乎没有进入正常的PBMC(图10A和图10B，组图1)，但是Laz和天青蛋白明显进入K562细胞(图10C和10D，组图1)和HL60细胞(图10E和10F，组图1)。天青蛋白显示较少的进入(图10D和图10F，组图1)。天青蛋白在1.0-2.5μM的细胞毒性的水平(图8C和图8D)可能与其进入HL60细胞或K562细胞的水平相关联。

检验了H8轭合的天青蛋白、Azu-H8和H8-Azu的进入，它们显示与天青蛋白类似的细胞毒性或比天青蛋白略高的细胞毒性，特别是在较低浓度如1.0-2.5μM，但与Laz相当(图8C和图8D)。Azu-H8和H8-Azu二者与天青蛋白相比显示更高的进入水平，与在K562细胞中的Laz的进入水平相当(图10，组图2)，显示H8-表位在允许天青蛋白或Laz进入白血病细胞中的作用。

实施例11.Laz通过提高Wee1蛋白水平并降低磷酸化的AKT在K562细胞中引起细胞周期停滞

使用流式细胞分析在似乎高度敏感的K562细胞中评估Laz、天青蛋白或5-氮杂-2-脱氧胞苷(DAC)对细胞周期进程的作用。观察到Laz、天青蛋白和DAC对K562细胞周期停滞的作用(图11)。Laz、天青蛋白和DAC能够将K562细胞停滞在G2/M。在G2/M期的细胞周期停滞通常导致诱导凋亡和细胞死亡，如已经对天青蛋白和Laz所观察的那样。有可能诸如Laz和天青蛋白等蛋白能够影响G2细胞周期调节剂在白血病细胞中的水平和或活性。

分析了Laz对介导G2停滞的细胞周期调节剂包括Wee1和磷酸化的AKT的作用。Wee1蛋白已知是G2/M期细胞周期停滞的调节剂。许多病毒蛋白已显示能够通过与Wee1相互作用并影响Wee1体内活性将细胞周期停滞在G2期。用10μM Laz处理K562细胞导致Wee1蛋白水平在细胞质和细胞核中增加(图12)，已知Wee1在细胞质和细胞核中发挥其作用。与K562细胞相反，HL60细胞显示显著减少的Wee1蛋白水平。抑制在丝氨酸473的AKT磷酸化且由此抑制AKT活性也与G2/M细胞周期停滞有关。Laz处理还导致HL60细胞中AKT活性的显著降低，如通过磷酸化的AKT丝氨酸473的水平降低所证明的(图12)。有趣的是，AKT-P-Ser 473水平的降低在HL60细胞中比在K562细胞中更明显，而由Laz引起的细胞核Wee1蛋白水平的改变在K562细胞中更显著。

实施例12.抗癌细菌蛋白Pa-CARD具有针对白血病细胞的活性.

已报道精氨酸支原体ADI通过引起在G1/S期的生长停滞抑制培养的人淋巴白血病细胞的增殖，导致凋亡。Gong H等人，Leukemia 14：826-9(2000)。认为ADI通过消耗精氨酸、将精氨酸转化为瓜氨酸和氨来发挥其作用。精氨酸是一种非必需氨基酸，因为哺乳动物细胞能够由瓜氨酸重新合成它。然而，某些癌症如肝细胞癌、黑色素瘤或肾细胞癌不体内表达精氨琥珀酸合成酶(对于由瓜氨酸合成精氨酸重要的酶)，使得这些癌细胞对由于ADI作用所致的精氨酸剥夺异常敏感。

精氨酸支原体ADI的一个有趣的特征是其N端部分与哺乳动物CARD蛋白可辨别的结构相似性。真核的(主要是哺乳动物的)CARD蛋白携带称为胱天蛋白酶募集结构域的结构域，它是蛋白-蛋白相互作用基序。CARD结构域在携带CARD的蛋白中的存在允许通过CARD-CARD相互作用形成复合物，导致由NF-kβ介导的细胞信号传导的活化/抑制或导致细胞死亡的过程。携带CARD的蛋白如胱天蛋白酶不仅参与凋亡的诱导而且参与促炎症细胞因子的产生。因此，胱天蛋白酶如胱天蛋白酶1参与细胞因子如IL-1B的蛋白水解加工以允许其以活化形式从细胞中释放。因为IL-1B促进血管发生并且在许多肿瘤中被过度产生，所以携带CARD的蛋白如胱天蛋白酶1被认为是作为抗癌剂的抑制剂开发的主要靶标。

来自精氨酸支原体和铜绿假单胞菌的ADI(分别称为Ma-ADI和Pa-ADI)的基因序列和晶体结构是已知的，并且显示约27％的序列同一性，在N末端中存在常见的CARD基序(图13A)。ADI是胍修饰酶(GME)超家族的一员，与其他家族成员如二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(DDAH)和精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT)相似，具有催化在胍鎓碳原子处亲核取代反应的能力。然而，GME超家族成员的结构特征的比对显示CARD基序只存在于ADI中而在其他成员中不存在(图13A)，表明CARD结构域被ADI募集并由此暗示其作为抗癌剂的潜在作用。

将具有CARD的结构特征的来自铜绿假单胞菌ADI的区域(氨基酸75-225)符合读框地与来自质粒pET-SUMO的SUMO部分一起克隆，产生SUMO-CARD融合蛋白。使用Ni-NTA柱纯化这种融合蛋白并且将CARD多肽分离为同质的17kDa蛋白(图13B)。然后使用实体瘤细胞系纤维肉瘤HT-1080、乳腺癌MCF-7和白血病细胞系HL-60确定这种蛋白的活性，这种蛋白由于起源于铜绿假单胞菌ADI N端的CARD结构域而被称为Pa-CARD以及来自铜绿假单胞菌的ADI(Pa-ADI，46kDa，图13B)。

Pa-CARD具有针对HT-1080、MCF-7和白血病HL60(图13C)以及其他癌症的显著细胞毒活性，但对于正常成纤维细胞和正常乳腺细胞如MCF-10A细胞毒活性很小(数据未显示)。因为已报道精氨酸支原体ADI通过诱导细胞周期停滞抑制人白血病细胞增殖，所以也测量Pa-CARD诱导癌细胞中的细胞周期停滞的能力。Pa-CARD显示了显著的细胞周期停滞(数据未显示)，如之前对Laz和天青蛋白所报道的那样(图11)。与Laz类似，Pa-CARD在K562细胞的细胞核级分中增强了Wee1蛋白水平，但在HL60细胞中没有显示这种活性(图12)。然而，在HL60细胞的细胞核级分中，以及在K562细胞和HL60细胞的细胞质级分中，Pa-CARD显著降低了AKT-P-S473水平(图12)，表明由Pa-CARD引起的在HL60细胞中细胞周期停滞的主要方式可能是通过AKT的473丝氨酸磷酸化的减少介导的，而在K562细胞中，这种作用主要是通过细胞核Wee1蛋白水平的增强介导的，虽然AKT的细胞质473丝氨酸磷酸化在某种程度上也受影响。在介导这种作用上Laz与Pa-CARD相似(在K562中的细胞核Wee1增强以及在HL60细胞中的细胞质AKT-S473消耗)，表明共同的作用方式。

实施例13.卵巢癌研究的材料和方法

化学品、试剂和细胞培养物：MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)和碘化丙锭购自Sigma。预染凝胶从Biorad获得。pET SUMO试剂盒和SUMO蛋白酶购自Invitrogen。人癌细胞系和正常细胞系SK-OV3、HOSE6-3、MCF-7和HT1080细胞均来自芝加哥伊利诺斯大学芝加哥校区(UIC)手术肿瘤学系的储存培养物保藏中心。将细胞培养在包含2mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM必需氨基酸和补充了10％热灭活的胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的具有伊格尔盐的MEM中。所有细胞在37℃、5％CO₂下生长。

蛋白的克隆、表达和纯化：如本文实施例8中所述进行。

MTT-细胞毒性测定：3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基)溴化四唑(MTT)测定按实施例8中所述的进行，来确定对癌细胞的细胞毒性。

胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶-7活性测定：如在Yamada，T.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2002，99，14098-14103中所述的使用胱天蛋白酶Glo3/7(Promega)在96孔板中进行测试。

借助流式细胞术的细胞周期停滞：以10⁶细胞每孔、每孔2ml体积将SKOV3细胞接种在6孔板中。收集细胞沉淀(＞1×10⁶细胞)并且将其固定在4℃1mL的70％乙醇中60min，在1mL PBS中洗涤并将其重悬在400□L包含0.5mg的RNA酶A(Sigma)的PBS中。在轻轻混合后，添加100-μL份的碘化丙锭(1g/L PBS)(Sigma)。在室温下将细胞在黑暗中孵育15min，然后保持在4℃黑暗中用于流式细胞分析。对于每个样品，使用Becton-Dickinson FACS Calibur流式细胞仪分析至少1×10⁴细胞的DNA含量。使用Multi Cycle AV软件确定细胞在sub-G1、G1、S和G2-M的分布。

TLR途径和NF-kB信号传导基因的微阵列：将SKOV3细胞(100,000细胞每孔，每孔2ml体积)接种在6孔板上。在用蛋白处理后，用裂解缓冲液收集细胞。将样品送至Superarray Biosciences用于toll样受体基因和NF-kB信号传导基因的微阵列。

TUNEL测定：这项技术通过使用末端脱氧核苷酸转移酶在DNA片段的3′端酶促加入荧光素-dUTP来鉴定包含断裂的DNA的细胞核，如在Yamada，T.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2002，99，14098-14103中所述。

实施例14.ADI具有推定的CARD样结构域

二级结构比较显示在Pa-ADI和Ma-ADI之间27％的序列同一性。使用MolMol程序和VAST算法，结构比对清晰地显示在Pa-ADI和Ma-ADI中存在推定的CARD样结构域和催化结构域(图14A和图14B)。Pa-ADI和Ma-ADI均具有如下特性：五个ββáβ亚基存在于胍修饰酶超家族的所有蛋白中，二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(DDAH)和精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT)蛋白是胍修饰酶超家族的成员(图14B)。然而，不像DDAH和AGAT，Pa-ADI和Ma-ADI具有在第一ββáβ亚基与第二ββáβ亚基之间精确地插入的独特的85个残基的5-α螺旋束结构域，给出典型的“夹式风扇”部分(图14B和图14C)。就是这个区域显示与哺乳动物的包含CARD的蛋白的结构相似性。因为CARD样结构域只存在于Pa-ADI和Ma-ADI中而不存在于其他成员中(图14B)，所以CARD结构域被ADI募集而不被该家族的其他成员募集可能给予ADI唯一的抗癌特性。

实施例15.Pa-CARD具有抗癌活性

包含CARD的哺乳动物蛋白具有不同的功能，如螺旋酶、激酶和胱天蛋白酶活性。除了经由CARD-CARD相互作用介导较大蛋白复合物的形成以外，已知CARD本身不具有任何其他的活性。假定细菌与癌细胞竞争体内相同的营养作为其存活和增殖的来源，可能细菌从哺乳动物来源获得CARD结构域，推测干扰癌症生长。为了测试这一假设，将来自Pa-ADI的具有疏水袋的推定CARD结构域(氨基酸75-225)克隆并纯化，并且检验了它作为抗癌剂以及对于任何潜在的ADI样活性的功能。将包括氨基酸75-225以及全长ADI蛋白的Pa-ADI的基因序列符合读框地与来自质粒pET-SUMO(Invitrogen)的SUMO部分一起克隆，产生SUMOCARD融合物和SUMO-ADI蛋白，如在实施例8中所述。使用Ni-NTA柱在单个步骤中纯化这些重组蛋白，接着用SUMO蛋白酶切割。这两种细菌蛋白的均质性和SDS-PAGE迁移类型显示在图15A中。如所预期的，纯化的Pa-ADI作为Mw 46kDa的单条带迁移，而Pa-CARD作为17kDa蛋白迁移。

接下来确定这两种蛋白的精氨酸脱亚胺酶活性。如所预期的，Pa-ADI显示强烈的酶活性，而Pa-CARD不具有这种活性(图15B)，因为在Pa-CARD中缺少Pa-ADI的催化三联体的关键氨基酸Cys-406和His-278。已知精氨酸支原体ADI(Ma-ADI)具有抗癌活性，尽管没有在Pa-ADI或Pa-CARD中评定这种活性的存在。检查Pa-ADI和Pa-CARD对一系列人癌细胞如纤维肉瘤HT-1080、乳腺癌MCF-7和卵巢癌SKOV-3的生长抑制活性(图16A)。Pa-ADI和Pa-CARD均显示对所有癌细胞类型的显著抑制活性。最有趣的是，Pa-CARD具有比Pa-ADI更高的针对这些癌细胞的生长抑制活性(图16A)。因为Pa-ADI和Pa-CARD显示略高的针对卵巢癌SKOV-3细胞的活性，所以将各种浓度的Pa-CARD(图16B)和Pa-ADI(图16C)的细胞毒性测定为与这些细胞孵育的时间的函数。尽管细胞毒活性在24小时孵育期间是明显的，但在48小时孵育期间活性在更高浓度(10到20μM)被显著提高。Pa-CARD再次以浓度和时间依赖性方式显示了比Pa-ADI更高的细胞活性。

实施例16.Pa-CARD对正常细胞具有非常小的抑制效应

检验了20μM浓度的Pa-ADI和Pa-CARD对卵巢癌SKOV-3细胞和正常卵巢HOSE6-3细胞的细胞毒效应。因为天青蛋白具有针对一系列癌症的抗癌活性，但不能进入正常细胞并且对这些细胞显示很小的细胞毒性，所以在这些研究中添加20μM的天青蛋白作为对照。已知的抗癌剂“顺铂”(顺二氯化二氨亚铂(II)；CDDP)用作阳性对照。这些剂对HOSE6-3正常卵巢细胞和SKOV-3卵巢癌细胞的细胞毒活性显示在图17A中。Pa-ADI和Pa-CARD均对SKOV-3具有显著的细胞毒活性，但对正常卵巢细胞具有非常小的细胞毒性。天青蛋白还显示类似的细胞死亡性质。Pa-CARD和天青蛋白均对正常HOSE6-3细胞显示比常用药顺铂更低的细胞毒性。此外，用Pa-CARD和顺铂处理的SKOV-3细胞与分别处理时相比显示略高的细胞毒效应(图17B)，显示了某些加性效应。

实施例17.Pa-CARD通过胱天蛋白酶活化而在癌细胞中诱导凋亡

为了确定由Pa-CARD诱导的细胞死亡的本质，并且由于已知其他细菌蛋白如天青蛋白和Laz通过胱天蛋白酶活化而在癌细胞中诱导凋亡，所以通过使用原位细胞死亡检测荧光试剂盒(in situ Cell Death DetectionFluorescein Kit，Roche)的TUNEL测定确定在卵巢癌SKOV-3细胞和正常卵巢HOSE6-3细胞中由Pa-CARD、Pa-ADI和天青蛋白诱导凋亡的程度。当用DNA酶I处理SKOV-3细胞或HOSE6-3细胞时，基本上所有的细胞发绿荧光(阳性对照，图18)。当用10μM的Pa-CARD、Pa-ADI和天青蛋白处理SKOV-3细胞和HOSE6-3细胞时，增强的凋亡选择性地在SKOV-3细胞中是明显的。当用Pa-CARD处理SKOV-3细胞时，与Pa-ADI和天青蛋白相比，观察到最高百分比的凋亡。因为凋亡细胞往往损害其粘附特性，所以在具有较高百分比的凋亡细胞的载玻片上看到较少的细胞(图18)。在所有条件下HOSE6-3细胞只显示少许发绿荧光的细胞(图18)，证实Pa-CARD主要在癌细胞中而不是在正常细胞中诱导凋亡性细胞死亡。用牛血清白蛋白(BSA)处理或不用蛋白处理(对照)在视野中显示非常少的绿色荧光细胞和许多蓝色(非凋亡细胞)(图18，底行)，表明癌细胞或正常细胞没有自发地经历许多凋亡，除非用Pa-CARD、Pa-ADI或天青蛋白处理。

为了确定Pa-CARD是否在卵巢癌细胞中而不是在正常卵巢细胞中通过胱天蛋白酶3的活化而诱导细胞凋亡，在不存在或存在Pa-ADI、Pa-CARD、顺铂和天青蛋白的情况下测量胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶7在SKOV-3细胞和HOSE6-3细胞中的水平。通过胱天蛋白酶-GloTM 3/7测定试剂盒(Promega)确定这种胱天蛋白酶活性。Pa-ADI和Pa-CARD以两种不同的浓度10μM和20μM使用。Pa-ADI和Pa-CARD均以剂量依赖性方式诱导胱天蛋白酶3/7的活化，但只是在卵巢癌SKOV-3细胞中。在正常卵巢细胞HOSE6-3看到非常少的活化(图19)。

实施例18.Pa-CARD抑制G2/M期的细胞周期

精氨酸支原体(Ma-ADI)之前已显示抑制肝细胞癌的生长并且在白血病细胞中诱导细胞停滞和凋亡。通过胱天蛋白酶活化来诱导凋亡通常已知由包括在肝癌、白血病和其他癌症中的G2/M期的细胞周期停滞所介导。

检验了在用或没用Pa-ADI和Pa-CARD处理的癌细胞中G1、S和G2期的水平。当SKOV-3细胞用10μM浓度的Pa-ADI处理24小时时，在G1期的细胞从86.0％降到69.1％，而那些在S期和G2期的细胞分别从7.9％上升至19.7％以及从6.1％上升至11.2％。然而，在相似条件下用Pa-CARD处理减少了G1期细胞水平从86.0％到19.1％，而S期和G2期细胞分别从7.9％升至43.5％以及从6.1％升至37.4％(数据未显示)，清楚地显示Pa-CARD显著抑制G2/M期的细胞周期。

实施例19.Pa-CARD调节NF-kB信号传导途径基因的表达

通过测量参与NF-kB信号传导途径的几种基因的表达来检验Pa-CARD在SKOV-3细胞中的作用。目标是鉴定在决定SKOV-3细胞以Pa-CARD蛋白处理后的命运中可能起关键作用的候选基因。对于这项研究，将SKOV-3细胞与各10μM的Pa-CARD和天青蛋白以及没有任何处理的对照一起孵育48小时。分离总RNA来进行定量实时PCR微阵列。通过用管家基因的表达进行的标准化来计算调节倍数(fold regulation)。只报道多于两倍对照水平的改变。

在这些基因的表达概况中一个惊人的观察是，当SKOV-3细胞用Pa-CARD相较天青蛋白处理时包括Toll样受体(TLR)的NF-kB途径的大多数基因的总体上调(表3)。这是由于在SKOV-3细胞中的Pa-CARD-哺乳动物CARD相互作用。已知携带哺乳动物CARD的蛋白调节NF-kB信号传导途径并且与Pa-CARD的任何相互作用可能如所观察到的那样改变这种基因表达概况。另一方面，天青蛋白已知通过与p53和受体酪氨酸激酶的蛋白-蛋白相互作用而不是通过NF-kB途径的调节来抑制癌细胞生长。因此，这两种细菌抗癌蛋白具有两种不同的作用方式。

在SKOV-3细胞中Pa-CARD对这些基因的最显著的上调包括在编码集落刺激因子CSF2的基因表达的55倍增加，集落刺激因子也称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在这些条件下，IL-12基因的表达也被刺激大约3倍(表3)。蛋白质印迹数据(未显示)证实在这种条件下GM-CSF的过度产生(5倍)。该水平低于55倍增加，大概因为GM-CSF是从细胞出来的分泌性蛋白。在Pa-CARD处理过程中表达被上调的其他细胞因子是IL-2、IL-8、IL-10、IL-1α和IL-1β(表3)。

表3.使用实时PCR微阵列测量Toll样受体(TLR)和NF-kB基因 的mRNA水平：将SKOV-3细胞与各10μM的CARD和天青蛋白一起孵育48小时。作为对照，留下一份SKOV-3细胞样品未作处理。在孵育后，收集细胞并提取总RNA。使用实时PCR微阵列分析(Superarray Bioscience)来分析样品。将结果对管家基因标准化。倍数值指示上调倍数并且用星号(*)标记的数字指示相对于未处理的对照样品的下调。减少的表达用负号指示。

Claims (47)

1.一种能够杀伤癌细胞的分离肽，所述分离肽包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域。

2.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽来源于细菌。

3.如权利要求2所述的分离肽，其中所述细菌是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

4.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽是Pa-CARD。

5.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽包括SEQ ID NO：27。

6.如权利要求5所述的分离肽，所述分离肽由SEQ ID NO：27组成。

7.如权利要求1所述的分离肽，其中所述癌选自由以下组成的组：白血病、卵巢癌、纤维肉瘤和乳腺癌。

8.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽被化学修饰以延长或优化其在血流中的半衰期。

9.一种方法，包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来杀伤所述癌细胞，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：权利要求1所述的分离肽、Laz、H8-Azu和Azu-H8。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：白血病细胞、纤维肉瘤细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞。

11.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂接触。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂选自由以下组成的组：顺铂、

视黄酸、5′-氮杂-2′-脱氧胞苷和三氧化二砷。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂是顺铂。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述癌细胞在与接触所述一种或多种蛋白大约相同的时间同所述一种或多种细胞毒剂接触。

15.一种方法，包括向患有癌症的哺乳动物患者施用一种或多种蛋白，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：权利要求1所述的分离肽、Laz、H8-Azu和Azu-H8。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：白血病、纤维肉瘤、卵巢癌和乳腺癌。

17.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂选自由以下组成的组：顺铂、

视黄酸、5′-氮杂-2′-脱氧胞苷和三氧化二砷。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂是顺铂。

20.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂在与所述一种或多种蛋白大约相同的时间施用。

21.一种方法，包括通过使白血病细胞与天青蛋白和包含Laz的H.8区的肽接触来杀伤所述白血病细胞。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述白血病细胞与所述天青蛋白和所述包含Laz的H.8区的肽同时或大致同时接触。

23.一种方法，包括向患白血病的哺乳动物患者施用天青蛋白和包含Laz的H.8区的肽。

24.如权利要求23所述的方法，其中同时或大致同时向所述患者施用所述天青蛋白和所述包含Laz的H.8区的肽。

25.一种方法，包括通过使白血病细胞接触一种或多种蛋白来诱导所述白血病细胞中的细胞分化，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：Laz、天青蛋白、H.8-Azu、Azu-H.8和权利要求1所述的分离肽。

26.一种方法，包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来选择性进入所述癌细胞，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：Laz、天青蛋白、H.8-Azu、Azu-H.8和权利要求1所述的分离肽；其中所述癌细胞选自由白血病细胞和卵巢癌细胞组成的组。

27.一种方法，包括通过使癌细胞接触一种或多种蛋白来诱导所述癌细胞中的细胞周期停滞，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组：Laz、天青蛋白、H.8-Azu、Azu-H.8和权利要求1所述的分离肽。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：白血病细胞、纤维肉瘤细胞、乳腺癌和卵巢癌细胞。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白提高所述细胞中的Wee1蛋白水平。

30.如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白引起磷酸化的AKT-Ser-473的消耗。

31.如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白既提高所述细胞中的Wee1蛋白水平又引起磷酸化的AKT-Ser-473的消耗。

32.一种方法，包括通过使癌细胞与权利要求1所述的肽接触而通过胱天蛋白酶3的活化在所述癌细胞中诱导凋亡。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。

34.一种方法，包括通过使癌细胞与权利要求1所述的肽接触来调节所述癌细胞中NF-kB信号传导途径基因的表达。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。

36.一种表达载体，所述表达载体编码权利要求1所述的分离肽。

37.如权利要求36所述的表达载体，所述表达载体编码权利要求4所述的分离肽。

38.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1所述的分离肽。

39.如权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

40.如权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物还包括选自由以下组成的组的蛋白：天青蛋白、Laz、H.8-Azu和Azu-H.8。

41.如权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物还包括能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。

42.如权利要求38所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适合于静脉内注射。

43.一种方法，包括向患有白血病的患者施用治疗有效量的权利要求38所述的药物组合物。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述药物组合物以选自由以下组成的组的方式向患者施用：静脉内、局部、皮下、肌内、口服和进入肿瘤内。

45.一种药盒，所述药盒包括权利要求38所述的药物组合物。

46.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述的分离肽。

47.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求4所述的分离肽。

Images