CN101668536A - 用铜氧还蛋白预防癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了将货物化合物递送入癌细胞的方法和材料。货物化合物的输送是通过使用衍生自铜氧还蛋白的蛋白转导结构域实现的。所述货物化合物可以是核酸，特别是DNA、RNA或反义分子。本发明还揭示了治疗癌症与诊断癌症的方法。

Description

用铜氧还蛋白预防癌症的组合物和方法
相关申请
根据35U.S.C第119和120节，本申请要求2006年7月19日提交的美国专利申请号11/488,693、2006年9月14日提交的美国专利申请号60/844,358的优先权，60/844,358要求2005年10月6日提交的美国专利申请号11/244,105的优先权，11/244,105要求2004年10月7日提交的美国临时专利申请号60/616,782和2005年5月13日提交的美国临时专利申请号60/680,500的优先权，并且是2003年11月11日提交的美国专利申请号10/720,603的部分继续申请，10/720,603要求2003年8月15日提交的美国临时专利申请号60/414,550的优先权，并且是2002年1月15日提交的美国专利申请号10/047,710的部分继续申请，10/047,710要求2001年2月15日提交的美国临时专利申请号60/269,133的优先权。
政府权益声明
这些优先权申请的全文被引入本文作为参考。本申请的主题得到来自美国马里兰州Bethesda的国立卫生研究院的研究基金的支持(基金号AI16790-21、ES 04050-16、AI 45441、CA09432和N01-CM97S67)。政府在本申请中具有某些权益。
发明领域
本发明涉及包含铜氧还蛋白(cupredoxin)的变体、衍生物和结构等价物的组合物，其抑制哺乳动物细胞、组织和动物中癌前病变的发作。本申请还涉及铜氧还蛋白、其变体、衍生物和结构等价物作为化学预防剂在哺乳动物中抑制癌前损伤乃至癌症的发作中的应用。
背景
癌症的化学预防是使用天然、合成或生物的化学试剂来逆转、抑制或预防侵袭性癌症的致癌进展。最近在高风险群体中进行的癌症预防临床试验表明，化学预防性治疗对于高风险患者来说是一种现实的治疗方式。化学预防性治疗是基于多病灶区域性致癌和多级致癌的内容。在区域性致癌中，整个组织区域的致癌物暴露导致组织中上皮细胞普遍损伤和突变细胞的克隆样增生。整个区域中的这些遗传突变增加了所述区域中一种或多种癌前或癌病变发展的可能。这些基因和表型改变的分级累积多级致癌作用中，多级致癌中的一个或多个步骤受阻可能阻止或预防癌症的发展。通常参见Tsao等，CA Cancer J Clin 54：150-180(2004)。
天青蛋白(azurin)和其他铜氧还蛋白对癌细胞具有特异的毒性。天青蛋白诱导J774肺癌细胞的凋亡，Yamada等，PNAS 99(22)：14098-14103(2002)。进入J774肺癌细胞后，天青蛋白位于胞质和核片段中，与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物，从而稳定并提高其胞内水平。天青蛋白介导凋亡作用的诱导并不限于J774细胞。天青蛋白还可进入诸如人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7细胞的癌细胞中，Yamada等，Infect Immun.70：7054-7062(2002)；Punj等，Oncogene.23：2367-2378(2004)。在两种情况下，天青蛋白使得胞内p53水平升高，导致Bax形成增加，并诱导所述细胞的凋亡。更有趣的是，向异种移植Mel-2或MCF-7人肿瘤的裸鼠腹膜内注射天青蛋白后，导致所述癌症统计学意义上的显著退行。
小鼠乳腺器官培养(MMOC)试验可用于评价潜在的化学预防剂对激素诱导的乳腺结构分化和DMBA诱导的腺内肿瘤发生前增生肺泡节样病变的抑制效果。来自年轻的未交配动物的乳腺在胰岛素(I)+催乳素(P)+醛固酮(A)存在下孵育6天后可分化成完全成熟的乳腺。这些乳腺在形态学上类似于来自妊娠小鼠的乳腺。醛固酮可以用雌激素(E)+孕酮(Pg)代替，向培养物中加入氢化可的松(H)刺激了乳腺的功能性分化：Mehta和Banerjee，Acta Endocrinol.80：501(1975)；Mehta和Moon.Breast Cancer-：Treatment and Prognosis 300，300(Basil A Stoll ed..Blackweil Press 1986)。这样，在该培养系统中观察到的激素诱导的结构和功能分化模拟了动物不同生理学阶段中对激素的反应。
在MMOC中，小鼠在癌症形成前具有显著的肿瘤前阶段。C3H小鼠中的这种肿瘤前病变由鼠乳腺肿瘤病毒诱导，或在BALB/c小鼠中由DMBA诱导。在生长期的第3和第4天之间将腺体暴露在2μg/ml DMBA下，随后使所述腺体在仅含胰岛素的培养基中复原2-3周即导致乳房肺泡病变(MAL)的形成。Hawthorne等，Pharmaceutical Biology 40：70-74(2002)；Mehta等，Methods in Cell Science 19：19-24(1997)。此外，由含有DMBA诱导的乳房病变的乳腺制备的上皮细胞移植到同源宿主中导致了乳腺癌的发生。Telang等，PNAS 76：5886-5890(1979)。这些肿瘤在病理学上类似于在给予DMBA的同株小鼠体内观察到的那些。
MMOC中DMBA诱导的乳房病变形成可通过多种化学预防试剂诸如维生素A酸类抑制。这些试剂包括衍生自天然产物的化学预防剂，例如brassinin、resveretrol、硫醇类、抗氧化剂、鸟氨酸脱羧酶抑制剂诸如OFMO和鱼藤素、前列腺素合成抑制剂、钙调节剂等等，Jang等，Science275：218-220(1997)；Mehta，Eur.J.Cancer 36：1275-1282(2000)；Metha等，J.Natl.Cancer Inst.89：212-219(1997)。这些研究清楚的表明该器官培养系统提供了测定针对乳房致癌作用化合物效果的独特模型。可以预期，其结果与体内施用所述化合物获得的抑制紧密相关。
MMOC也可经诱导形成乳房导管病变(MDL)。若用雌激素和孕酮代替醛固酮，并在培养基中加入氢化可的松，即可诱导MDL。卵巢甾类存在下的肺泡结构很小，但在组织病理学切片中可观察到导管内损伤。Mehta等，JNatl.Cancer Inst.93：1103-1106(2001)。选择性作用于卵巢激素依赖的ER+乳腺癌的雌激素拮抗剂诸如他莫昔芬抑制MDL而非MAL形成。这样，该经过改良的培养物模型除了常规的MAL诱导外现可用于评价化学治疗剂对MAL和MOL的效果。
所需要的是能抑制癌前病变进展的化学预防剂，所述化学预防剂应当能预防癌前病变的起始发展，诱导所形成的癌前病变的细胞死亡和/或预防癌前病变发展成恶性病变。这种化学预防剂在治疗尤其是高风险癌症患者(由于高风险因素的存在、癌前病变的存在或先前患有癌症或癌前病变)中是特别有用的。
蛋白进入哺乳动物细胞的过程通常由所述蛋白的一个小片段所指导，其通常称为“蛋白转导结构域”或PTD。该片段可用作信号连接于外来蛋白上，以利于所述蛋白转运至哺乳动物细胞中。例如，两亲肽被用于帮助DNA-解离金属卟啉类的吸收，可作为潜在的人成纤维细胞HS68或鼠淋巴细胞白血病L1210细胞中的抗肿瘤药物(Chaloin，L等.Bioconjugate Chem.12：691-700，(2001))。肽类，称为细胞渗透性肽类，例如penetratin、transportan、Tat(氨基酸47-57或48-60)和模型两亲肽MAP已被用作转运药理学重要物质例如反义寡核苷酸类、蛋白类和多肽类的递送载体(Hallbrink，M.等，Biochim.Biophys.Acta 1515：101-109(2001)；Lindgren.M.，等，TrendsPharmacol.Sci.21：99-103(2000))。
在37℃或4℃下，这些肽类，尤其是触角蛋白(Antennapedia)的DNA结合同源结构域、果蝇转录因子或21残基肽载体Pep-1被多种培养物中的细胞内化，例如人HS68或鼠NIH-3T3成纤维细胞。温度变化效应的缺失暗示了一种不同于经典胞吞作用(Morris.M.C.等，Nature Biotechnol.19：1173-1176(2001)，其需要手性受体蛋白质)的穿透机制。哺乳动物细胞中最广泛用于转运药物活性化合物的肽类是人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)反式作用蛋白Tat的11个氨基酸的精氨酸富集蛋白转导结构域(PTD)(Seimarze，S.R，等，Science 285：1569-1572(1999)，Schwarze，S.R.等，TrendsCell Biol.10：290-295(2000))。腹膜内注射120kDa β-半乳糖苷酶-Tat融合蛋白使得所述融合蛋白跨细胞转导进入事实上所有的小鼠组织中，包括通过血脑屏障。已显示HIV-1Tat的该短肽结构域介导大分子或颗粒的细胞内化，包括磁性纳米颗粒、噬菌体载体、脂质体和质粒DNA。与上述讨论的其他细胞穿透肽类不同，通过全长Tat或其11个氨基酸转导区域的货物蛋白内化在4℃下受到严重影响(Liu.Y.等，Nat.Med.6：1380-1387(2000)。Suzuki，T.等，J.Biol.Chem.277：2437-2443(2002))，需要与受体例如细胞膜硫酸类肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素链相互作用。
目前大部分已鉴定的PTD衍生自病毒和哺乳动物来源。其他来源的PTD对于设计多种试验序列以及动物和人治疗和预防措施也是需要的。一种可选择的PTD来源是细菌细胞。尽管已知细菌蛋白例如霍乱毒素能进入哺乳动物细胞质(Sofer，A.和Futerman，A.H.J.Biol.Chem.270：12117-12122(1995))，这些蛋白的细胞毒性限制了细菌蛋白或衍生自它们的PTD在哺乳动物细胞中转运药理学重要的载体中的应用。
实施方案概述
本发明涉及包含肽类的组合物，所述肽类可以是铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物，其在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌前病变的发展。特别的，这些组合物可包含来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的天青蛋白，天青蛋白50-77残基区域(p28)SEQ ID NO：2，以及天青蛋白50-67残基区域(p18)SEQ ID NO：25。本发明还涉及包含铜氧还蛋白类和/或铜氧还蛋白类变体、衍生物或结构等价物的组合物，其保留了在哺乳动物细胞、组织或动物中抑制癌前病变发展的能力。这些组合物可以是互相分离的肽类或药物组合物。本发明的组合物可用于预防哺乳动物患者中癌症发展的方法中。
本发明的一方面是分离肽，其可以是铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物；可在哺乳动物组织中抑制癌前病变的发展。所述铜氧还蛋白可以是天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、Laz、橙绿屈挠素、漆树蓝蛋白和黄瓜碱性蛋白，尤其是天青蛋白。铜氧还蛋白可来自生物体例如铜绿假单胞菌、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidan)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、甲基单胞菌(Methylomonas sp.)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhea)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyiicus)，特别是铜绿假单胞菌。在某些实施方案中，所述肽可以是SEQ ID NO：1、3-19的一部分，或与SEQ ID NO：1、3-19具有至少80％的氨基酸序列相同性。
在某些实施方案中，分离肽可以是铜氧还蛋白的截短体。所述分离肽可以是大于约10个残基，但不超过大约100个残基。所述分离肽可包括或由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77SEQ ID NO：2、铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-67SEQ ID NO：25、铜绿假单胞菌天青蛋白残基36-88SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：20-24组成。
本发明的另一方面是一种药物组合物，其包含药学上可接受载体内的至少一种或两种铜氧还蛋白或本发明的分离的肽。所述药物组合物可制成静脉内施用的形式。在某些实施方案中，所述药物组合物中的铜氧还蛋白可来自生物体例如铜绿假单胞菌、Ulva pertussis、粪产碱菌、木糖氧化无色杆菌、支气管炎博德特菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌和副溶血性弧菌，特别是来自铜绿假单胞菌。所述铜氧还蛋白可以是SEQ ID NO：1、3-19。
本发明的另一方面是治疗哺乳动物患者的方法，其通过给患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。所述患者可以是人，可以比一般人群具有更高的癌症风险。在某些实施方案中，所述癌症可以是黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌或宫颈癌。在某些实施方案中，所述患者可具有至少一种高风险特征、癌前病变或已被治愈癌症或癌前病变。
所述药物组合物通过静脉注射、肌内注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射或口服进行施用，特别是通过静脉注射施用。所述药物组合物可与至少一种其他化学预防药物共同施用，特别是在几乎同时与另一种化学预防药物共同施用。
本发明的另一方面是包含于小瓶中的本发明药物组合物的试剂盒。所述试剂盒可设计用于静脉施用。
本发明的另一方面是研究癌症发展的方法，包括使哺乳动物细胞与本发明的铜氧还蛋白或肽接触，测定恶化前和恶性细胞的生长。在某些实施方案中，所述细胞可以是人和/或哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞被诱导以产生癌前病变。
本发明的另一方面是编码本发明肽的表达载体。
本发明的另一方面是包含货物化合物和氨基酸序列的复合物，其中所述氨基酸序列具有与铜氧还蛋白或其片段至少约90％序列相同性，该氨基酸序列或其片段与所述货物化合物连接，并且所述氨基酸序列利于货物化合物进入哺乳动物癌细胞。在某些实施方案中，该复合物的氨基酸序列具有与少于全长野生型铜氧还蛋白或H.8外膜蛋白至少约90％的氨基酸序列相同性。在其他实施方案中，所述货物化合物是蛋白、脂蛋白、多糖、核酸、染料、微粒、纳米颗粒、毒素和药物。在特别的实施方案中，所述货物物是蛋白或多肽，其与氨基酸序列连接形成融合蛋白。在其他特别的实施方案中，所述货物化合物是毒素，更特别的为铜绿假单胞菌外毒素A。在其他实施方案中，所述货物物是可检测的物质，更特别是可通过荧光、显微、X射线CT、MRI或超声检测的物质。最后，本发明还包括位于药学上适当载体中的所述复合物。
本发明的另一方面涉及将货物化合物递送至细胞内的方法。在一个实施方案中，该方法包括使一个或多个细胞与上述复合物接触。在其他实施方案中，所述细胞来自患有癌症的患者，并且被回输至患者体内。在其他实施方案中，所述细胞是癌细胞，更特别是骨肉瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、软组织肉瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞或前列腺癌细胞。在其他实施方案中，所述复合物以治疗有效量给患者施用。在其他实施方案中，所述复合物通过静脉、局部、皮下、肌内施用或向肿瘤内施用。在其他实施方案中，所述复合物与其他癌症治疗共同施用。在其他实施方案中，使用DNA和/或RNA作为本发明复合物的货物化合物时，RNAi方法、药物抗性、造血基因转移、同源重组、核酶技术、反义技术、肿瘤免疫治疗和肿瘤抑制、翻译研究、癌症治疗、基因递送系统(病毒和非病毒的)、抗基因治疗(反义，siRNA和核酶)、凋亡、机制和治疗、疫苗开发、免疫学和免疫治疗以及DNA合成和修复均作为其背景技术。在一个特别的实施方案中，所述货物化合物是反义分子。
本发明的另一方面是癌症的诊断方法。在某些实施方案中，所述货物化合物的复合物是可检测的物质，施用于患有癌症的患者后检测货物化合物的位置。在特别的实施方案中，所述货物化合物是X射线造影剂，通过X射线CT检测；所述货物化合物是磁共振造影剂，通过MRI检测；所述货物化合物是超声造影剂，通过超声检测。在其他实施方案中，所述细胞与具有可检测物质的复合物接触，检测货物的位置。
本发明的另一方面是含有任何上述复合物的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括可药用的佐剂或赋形剂。在其他实施方案中，所述试剂盒还包括用于施用所述试剂的载体。
本发明的这些和其他方面、优点和特征根据下列附图和特定实施例的详细描述将是显而易见的。
序列简述
SEQ ID NO：1.来自铜绿假单胞菌的天青蛋白氨基酸序列(Ala Glu CysSer Val Asp Be Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala He TlirVal Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn LeuPro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met GlnGly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys ProAsp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu He Gly Ser Gly Glu Lys Asp SerVal Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe CysThr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。
SEQ ID NO：2.p28的氨基酸序列，铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77(Leu Ser Thr Ala AIa Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Aia Ser GlyLeu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO：3.来自层理席藻(Phormidium laminosum)的质体蓝素氨基酸序列(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln PheGlu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn AsnLys Leu Pro Pro His Asn He Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser LysGlu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser TyrGlu He Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala ProHis Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys He Thr Val Glu Gly)。
SEQ ID NO：4.来自氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的铁硫菌蓝蛋白氨基酸序列(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu ProGln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr ValThr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly Phe ProPhe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu He Pro Ala GlyAla Thr Val Asp Val Thr Phe He Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser PheAsp lie Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val He Asp Pro He ValAIa Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr AspPhe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr 1yr Tyr Val Cys Gln He Pro Gly HisAla Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys He Val Val Lys)。
SEQ ID NO：5.来自裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白氨基酸序列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp GlyAla Met Val Phe Glu Pro AIa Ser Leu Lys Val AIa Pro Gly Asp Thr Val ThrPhe He Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met He Pro AspGly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr AlaPro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val GlyVal Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Gb Ala Val Lys Gly Ala LysAsn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn)。
SEQ ID NO：6.来自粪产碱菌的天青蛋白氨基酸序列(Ala Cys Asp ValSer Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser Hc Val Val Asp LysThr Cys Lys Glu Phe Thr He Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys AlaAla Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala ThrAsp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu ArgVal He Ala His Thr Ser Val lie Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe AspVal Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro GlyHis Trp Ser He Met Lys Gly Thr He Glu Leu Gly Ser)。
SEQ ID NO：7.来自木糖氧化无色杆菌亚种反硝化亚种I的天青蛋白氨基酸序列(Ala Gln Cys Glu Ala Thr He Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln TyrAsn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His LeuLys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu ThrLys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn AIa Gly Leu AIaGln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val He Ala His Thr Lys Val He GlyGly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu AlaTyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr LeuLys Leu Ser Asn)。
SEQ ID NO：8.来自支气管炎博德特菌的天青蛋白氨基酸序列(Ala GluCys Ser Val Asp He Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala HeGlu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly LysLeu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr AIa Asp MetGln Ala Val Glu Lys Asp Gly He Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu LysAla Gly Asp Thr Arg Val Leu AIa His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu SerAsp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala AIa Gly Asp AspTyr Thr PhePhe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu ValAsp)。
SEQ ID NO：9.来自甲基单胞菌J的天青蛋白氨基酸序列(Ala Ser CysGlu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser He Ser ValPro AIa Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met ProLys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly AspVal Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro GlyAsp Lys Arg Val He Ala Phe Thr Pro He He Gly Gh Gly Glu Lys Thr Ser ValLys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser lyrPro Gly His Phe Set Met Met Arg Gly Ilir Leu Lys Leu Glu Glu)。
SEQ ID NO：10.来自脑膜炎奈瑟球菌Z2491的天青蛋白氨基酸序列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala ProAla Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro AlaAla Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn ThrLys Asp He Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr He Thr Leu Lys His ThrGly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn He Vallie Gly Lys Thr Glu AspMet Asp Gly He Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val LysPro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu He Gly Gly Gly Glu Glu SerSer Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala CysThr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。
SEQ ID NO：11.来自荧光假单胞菌的天青蛋白氨基酸序列(Ala GluCys Lys Thr Thr He Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala He GluHe Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu ProLys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val He Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro HeAla Thr Asp Gly Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly AspThr Arg Val He Ala His Thr Lys Val He Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu ThrHe Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe ProGly His He Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys)。
SEQ ID NO：12.来自绿针假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列(Ala GluCys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu HeThr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser LeuPro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met AlaGly He Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly lie Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro GlyAsp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys He He Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser ValThr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys SerPhe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys)。
SEQ ID NO：13.来自苛养木杆菌9a5c的天青蛋白的氨基酸序列(LysThr Cys Ala Val Thr He Ser AIa Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr IleLys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys LysSer Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met GlnAla Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu AIa Asp Asn Tyr Val Pro LysAla Asp Pro Arg Val He Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr SerHe Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys SerPhe Pro Gly His Trp AIa Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly)。
SEQ ID NO：14，来自黄瓜的漆树蓝蛋白的氨基酸序列(Met Gln Ser ThrVal His He Val Gly Asp 4sn Thr GSy Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe TyrSer Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe AsnPhe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe AspAla Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val HeGlu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr HisCys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser lie Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val SerMet Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met ProPro Pro Ser Pro Ser)。
SEQ ID NO：15.来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素A的氨基酸序列(MetLys He Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met Ala Met ValLeu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser GlySer Gly Pro Val Thr He Glu He Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp LysThr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gln Thr Val Thr He Arg Phe Lys Asn Asn SerAla Val Gln Gln His Asn Trp He Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala AlaAsn He Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro AlaAsp Lys Ser Asn He He Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val GluVal Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Val Pro GlyHis Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn)。
SEQ ID NO：16.来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素B的氨基酸序列(AlaAla Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr ValGlu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln Thr Ser Leu Ser Leu ProAla Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val GlnHis Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn ThrAla Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro AsnAla Leu Ala Trp Thr AIa Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr PheArg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr He Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr LeuAla Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro)。
SEQ ID NO：17.来自黄瓜的黄瓜碱性蛋白的氨基酸序列(Ala Val TyrVal Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu Ser Trp Pro Lys Gly LysArg Phe Arg Ala Gly Asp He Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His AsnVal Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly AlaLys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr PheHe Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys He Ala Val Asn AIaLeu)。
SEQ ID NO：18.来自脑膜炎奈瑟球菌F62的Laz氨基酸序列(Cys SerGln Glu Pro Ma Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala SerGlu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp AIa Ala Glu Ala Pro Ala Ala GlyAsn Cys Ala Ala Thr Val Glu Scr Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys AspIle Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Gln Phe Thr He Thr Leu Lys His Thr Gly ThrGln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp MetAsp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys ProAsp Asp Ala Arg Val Val AlaHis Thr Lys Leu He Gly Gly Gly Glu Glu Ser SerLeu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu AJa Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys ThrPhe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。
SEQ ID NO：19.来自副溶血性弧菌的天青蛋白的氨基酸序列(Met SerLeu Arg He Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala GlnAla Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser He Asp Ala Asn Asp Met Met Gln Phe SerThr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu AsnHis Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met Gly His Asn Val Val He Ala Asp ThrAla Asn He Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn SerTyr Val Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly GlyGly Glu Ser Thr Ser He Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr A3a Gly Gly Asp TyrSer Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala He Met Gln Gly Lys Phe Glu PheLys)。
SEQ ID NO：20.来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素B的57-89位氨基酸的氨基酸序列(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala AlaVal Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp)。
SEQ ID NO：21.丁香假单胞菌天青蛋白的51-77位氨基酸的氨基酸序列(Ser Lys Lys AIa Asp Ala Ser Ala He Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly HeAsp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO：22.脑膜炎奈瑟球菌Laz的89-115位氨基酸的氨基酸序列(Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly He Phe Lys Asp Gly Val Gly AIa AIaAsp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO：23.副溶血性弧菌天青蛋白的52-78位氨基酸的氨基酸序列(Ala Asp Thr Ala Asn He Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly AlaAsp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO：24.支气管炎博德特菌天青蛋白的51-77位氨基酸的氨基酸序列(Thr Lys Thr AIa Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly He Ala AlaGly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp)。
SEQ ID NO：25.铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-67P18的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gk Gly Val Val Thr Asp Gh Met Ala Ser Gly)。
SEQ ID NQ：26.铜绿假单胞菌天青蛋白36-88位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr AlaAla Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys AspTyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys Leu Ile Gly)。
SEQ ID NO：27.铜绿假单胞菌天青蛋白36-77位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr AlaAla Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys AspTyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO：28.铜绿假单胞菌天青蛋白36-89位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr AlaAla Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys AspTyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser)。
SEQ ID NO：29.铜绿假单胞菌天青蛋白36-128位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr AlaAla Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys AspTyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu He Gly Ser GlyGlu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln TyrMet Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu ThrLeu Lys)。
SEQ ID NO：30.铜绿假单胞菌天青蛋白53-70位氨基酸的氨基酸序列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu AspLys)。
SEQ ID NO：31.铜绿假单胞菌天青蛋白53-64位氨基酸的氨基酸序列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met)。
SEQ ID NO：32.氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD。
SEQ ID NO：33.氨基酸序列DGXXXXDXXYXKXXD。
附图简述
图1.图1描述了用于评价p28和天青蛋白效果的所有腺体的图像。图1A显示了DMBA处理的腺体中肺泡病变的代表性图像，其与用DMBA与化学预防剂处理的腺体进行对比。图1B-1F显示了p28对肺泡病变发展效果的代表性图谱。
图2.图2描述了p28针对DMBA诱导的哺乳动物肺泡病变效果的图像。
图3.图3描述了导管病变代表性切片和p28的效果。
图4.图4描述了p28针对DMBA诱导的导管病变效果的图像。
图5.显示wt-天青蛋白以及wt天青蛋白50-77蛋白转导结构域中α螺旋位置的图像。标出了在天青蛋白50-77区域内3个氨基酸被脯氨酸的替换。
图6(A)、(B)和(C)。(A)图显示了GST-GFP-azu 50-77融合蛋白的结构。gfp基因在gst基因的3’端引入(形成GST-GFP)，azu 50-77片段随后在框架内连接到gfp基因的3’端，产生GST-GFP-azu 50-77融合蛋白。GST-GFP-azu 50-77从细胞裂解液中作为单独的蛋白得以纯化。纯化的蛋白经SDS-PAGE用考马氏亮蓝染色检测(6(B))，同样通过抗天青蛋白抗体用蛋白印迹检测(6(C))。
图7(A)、(B)和(C)。显示GST-绿色荧光蛋白(GFP)和GST-GFP-天青蛋白融合蛋白内化的动态研究的图像。绿色荧光在J774细胞中测定，其用不同浓度的GST-GFP(10(a))或GST-GFP-azu 50-77(10(b))在37℃下处理1hr。采用流式细胞仪分析了10000个细胞。(c)时间依赖的GST-GFP-azu 50-77内化。J774细胞在37℃下与200μg/ml GST-GFP-azu 50-77孵育预定的时间，用流式细胞仪分析。
图8(A)、(B)和(C)。(A)图显示了外毒素区域III(氨基酸405-613)，以及部分区域lb(氨基酸381-404)，其融合至GST(GST-PEDIII)，如早先描述的GST-GFP融合物那样。Azu 50-77片段随后使用PCR连接至GST-PEDIII的羧基端(GST-PEDIII-azu 50-77)。(B)所述融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose4B柱进行凝胶过滤柱色谱纯化，SDS-PAGE鉴定大小。(C)图显示了GST-PEDIII-azu 50-77融合蛋白在UISO-Mel-2癌细胞和正常成纤维细胞(FBT)中的作用，通过PEDIII介导的细胞毒性测定。预定的不同浓度的GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77与UISO-Mel-2和FBT细胞孵育24h，随后通过MTT方法测定细胞存活性。
图9.GST-PEDIII-铁硫菌蓝蛋白融合蛋白针对UISO-Mel-2癌细胞和FBT细胞的由PEDIII-介导的细胞毒性图像。预定的不同浓度的GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77与UISO-Mel-2和FBT细胞孵育24h，随后通过MTT方法测定细胞存活性。
发明详述
定义
如本文中所使用的，如果没有特别描述为“单个细胞”，术语“细胞“包括该术语的单数或复数形式。
如本文中所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换的用于指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语同样应用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸酯化作用、谷氨酸残基的γ羧化作用、羟基化作用和ADP核糖基化作用。应当理解，多肽并不总是全部是直链的。例如，作为泛素化的结果，多肽可以是支链的，一般作为翻译后事件(包括天然加工作用与非天然发生的人为操作引起的事件)的结果，多肽可以是环形的(具有或没有支链)。环状、支链和支链环状的多肽可通过非翻译天然方法合成，也可通过完全人工合成方法合成。
如本文中所使用的，术语“药理学活性”表示药物或其他化学物质对生物系统的作用，化学物质的效果可以是有利的(治疗性的)或有害的(毒性的)。纯的化学物质或混合物可以是天然来源的(植物、动物或矿物)，或可以是合成的化合物。
如本文中所使用的，术语“癌前”表示癌变前的，或不受控制的异常细胞分裂前。
如本文中所使用的，术语“病变”表示异常组织区域。
如本文中所使用的，术语“病理状况”包括解剖和生理偏离正常，其构成活体动物或其一部分正常状态的损害，妨碍或改变身体机能的表现，是对各种因素(如营养不良、工业危害或气候)、对特定传染物(如虫、寄生原生动物、细菌或病毒)、对生物体内在缺陷(如遗传异常)、或对这些因素组合的反应。
如本文中所使用的，术语“疾病”包括解剖和生理偏离正常，其造成活体动物或其一部分正常状态的损害，妨碍或改变身体机能的能力。
如本文中所使用的，术语“患有”包括：目前显示病理状况的症状，尽管没有可观察到的症状但具有病理状况，在从无病理状况中恢复或已从病理状况中恢复。
如本文中所使用的，术语“化学预防”是指药物、维生素或其他试剂的使用，试图减少癌症的风险或延迟癌症发作或复发。
如本文中所使用的，术语“治疗”包括预防、降低、停止或逆转与正在治疗疾病相关的疾病或症状的进展或严重程度。因此，术语“治疗”包括视情况的药物、治疗和/或预防施用。治疗也可包括防止或减轻疾病例如癌症的发作。
如本文中所使用的，术语“抑制细胞生长”表示减缓、停止细胞分裂和/或细胞膨胀。该术语同样包括抑制细胞发育和增加细胞死亡。
“治疗有效量”是指有效防止、减缓、停止或逆转正在治疗对象的特定疾病的发展、或部分或总体减轻特定疾病的现有症状的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员能力范围之内。
如本文中所使用的，术语“基本上纯的”，当用于修饰本发明的蛋白或其他细胞产物时，指的是例如从培养基或细胞内容物分离的蛋白形式为基本没有或基本上未掺杂其他蛋白质和/或其他化合物。术语“基本上纯的”指的是一种因子的量是分离部分干重的至少约75％，或至少“75％基本上纯的”。更具体而言，术语“基本上纯的”是指一种化合物是分离部分干重的至少约85％，或至少“85％基本上纯的”。最具体而言，术语“基本上纯的”是指一种化合物是分离部分干重的至少约95％，或至少“95％基本上纯的”。术语“基本上纯的”也可用于修饰本发明的人工合成蛋白质或化合物，其中，例如合成的蛋白质从合成反应的试剂和副产物分离。
如本文中所使用的，术语“药物级”，当指本发明的肽或化合物时，是基本上或主要从组分分离的肽或化合物，该组分通常伴随在天然状态发现的该物质，包括合成试剂和副产物，以及基本上或主要从可能损坏其药用的成分分离。例如，“药物级”肽可与任何致癌物分离。在某些情况下，“药物级”可以通过意欲施用的方法修饰，例如“静脉药物级”，从而指定肽或化合物基本上或主要从任何可能使组合物不适于给患者静脉施用的物质分离。例如，“静脉药物级”肽可以从去垢剂(例如SDS)和抗菌剂(例如叠氮化物)分离。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”指的是物质基本上没有或主要没有通常伴随以其天然状态发现的物质的组分。因此，根据本发明的分离的肽优选不含有通常与它们原环境有关的物质。“分离的”多肽区域指的是所述区域不包括所述区域来源的多肽整个序列。“分离”的核酸、蛋白或各自片段基本上从其体内环境移出，因此可以由技术人员操作，例如但不限于核苷酸测序、限制酶切消化、定点诱变、亚克隆到用于核酸片段表达载体中以及获得基本上纯的量的蛋白质或蛋白质片段。
这里相对于肽使用的术语“变体”，指的是与野生型的多肽相比，具有替换、缺失或插入的氨基酸的氨基酸序列变体。变体可以是野生型肽的截短体。因此，变体肽可以通过操作编码所述多肽的基因而制得。“缺失”是从所述多肽内部除去一个或多个氨基酸，而“截短体”指从所述多肽的一端或两端除去一个或多个氨基酸。这样，变体可以通过改变多肽的基本组成或特征但不改变至少其某些药理学活性而制得。例如天青蛋白的“变体”可以是突变的天青蛋白，其保持天青蛋白抑制哺乳动物癌细胞生长的能力。在某些情况下，变体肽是用非天然氨基酸(例如ε-(3，5-二硝基苯甲酰)-Lys残基)合成的。Ghadiri & Fernholz，J.Am.Chem.Soc.，112：9633-9635(1990)。在某些实施方案中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过20个。在某些实施方案中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过15个。在某些实施方案中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过10个。在某些实施方案中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过6个。在某些实施方案中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过5个。在某些实施方案中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过3个。
如本文中使用的，术语“氨基酸”指的是含有任何天然存在或非天然存在或人工合成的氨基酸残基的氨基酸部分，也就是任何包含至少一个羧基和直接连接一个、二个、三个或更多碳原子、一般为一个(α)碳原子的至少一个氨基的部分。
在这里相对于肽使用术语“衍生物”指的是衍生自目标肽的肽。衍生包括化学修饰肽，使得肽仍保留其某些基本功能。例如，天青蛋白的“衍生物”可以，例如是化学修饰的天青蛋白，仍保留其抑制哺乳动物细胞血管发生的能力。感兴趣的化学修饰包括但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸酯化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽或其片段与化合物的融合物，所述化合物例如但不限于另一肽、药物分子或其它治疗剂或药剂或可检测探针。
术语“氨基酸序列相同性百分比(％)”被定义为当比对两个序列时在多肽中与候选序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸相同性％，比对序列，如果有必要，引入缺口来实现最大的序列相同性％；保守性替换不被认为是序列相同性的部分。确定相同性百分比的氨基酸序列比对方法是本领域技术人员公知的。通常，公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件被用于比对肽序列。在特定的实施方案中，使用长复杂性过滤器、预期10、字大小3、存在性11和延伸1的缺省参数来使用Blastp(可从国家生物技术信息中心，Bethesda MD获得)。
当进行氨基酸序列比对时，给定的氨基酸序列A同、与或相对给定的氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(其换句话说可表达为给定氨基酸序列A具有或包含同、与或相对给定氨基酸序列B的一定％氨基酸序列相同性)可计算为
％氨基酸序列相同性＝X/Y*100，
其中
X是氨基酸残基数，其通过A和B的序列比对程序比对或序列比对算法比对评分为相同匹配；
Y是B中氨基酸残基的总数。
如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A对B的％氨基酸序列相同性不等于B对A的％氨基酸序列相同性。当用长序列与短序列相比时，短序列为“B”序列。例如当截短肽与相应的野生型多肽相比时，截短肽为“B”序列。
概述
本发明提供了包含铜氧还蛋白、铜氧还蛋白变体、衍生物以及结构等价物的组合物，以及预防哺乳动物癌症发展的方法。本发明还提供了铜氧还蛋白变体、衍生物以及结构等价物，其保留了预防哺乳动物癌症发展或癌症复发的能力。更特别的，本发明提供了包含铜绿假单胞菌天青蛋白、天青蛋白变体、衍生物和结构等价物的组合物，以及其治疗患者、尤其是比普通群体发展成癌症风险更高的患者的用途，最后，本发明提供了研究哺乳动物细胞、组织和动物癌症发展的方法，其在诱导癌前病变之前或之后，使细胞与铜氧还蛋白、或其变体、衍生物或结构等价物接触，并观察癌前和/或癌细胞的发展。
先前，已知铜绿假单胞菌加工的氧化还原蛋白铜氧还蛋白天青蛋白，选择性地进入J774肺癌细胞而非进入正常细胞，并且诱导凋亡。Zaborina等人，Microbiology 146：2521-2530(2000)。天青蛋白同样能选择性地进入并杀死人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7细胞。Yamada等，PNAS99：14098-14103(2002)；Punj等，Oncogene 23：2367-2378(2004)。来自铜绿假单胞菌的天青蛋白优先进入J774鼠网状细胞肉瘤细胞，与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物并将其稳定。提高p53的胞内浓度，并诱导细胞凋亡。Yamada等，Infection and Immunity 70：7054-7062(2002)。对于天青蛋白分子的各种结构域进行详细研究表明50-77位氨基酸(p28)(SEQ ID NO：2)显示对内化和随后的细胞凋亡活动重要的蛋白转导结构域(PTD)。Yamada等，CellMicrobial.7：1418-1431(2005)。
现在已知天青蛋白以及衍生自天青蛋白的肽类，例如p28和p18，具有化学预防性质。现在已知天青蛋白p28预防小鼠乳腺器官培养物中癌前肿瘤前病变的形成。在小鼠乳腺器官培养物模型中，发现50μg/ml的天青蛋白能抑制67％的肺泡病变形成。类似的，25μg/ml的p28被发现能抑制67％的肺泡病变形成，参见实施例1。此外，发现50μg/ml的天青蛋白能抑制79％的导管病变，而25μg/ml的p28能抑制71％的导管病变，参见实施例1。共焦显微镜检查和FAC显示天青蛋白和p28进入正常小鼠乳上皮细胞(MM3MG)和乳腺癌细胞(4T1)。P28还以温度、时间和浓度依赖的方式进入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并以剂量依赖的方式抑制铺于
Figure A20088000962100261
上的HUVEC形成毛细管。共焦显微镜检查和FAC还显示p18选择性地进入人黑色素瘤(Mel-2，7，29)、乳腺(MCF-7)、卵巢(SK-OV3)、胰腺(CAPAN-2)、胶质母细胞瘤(LN-229)、星形细胞瘤(CCF-STTG1)、前列腺(LN-CAP)和肾脏(ACHN-CRL1611)细胞系。此外，在具有异种移植黑色素瘤的无胸腺小鼠中用红外染料(λem 800nm)标记的p18成像清楚的显示，其在原初皮下肿瘤和远端器官转移灶中选择性地吸收，而不在正常器官和组织中积聚。因此现在已知天青蛋白和天青蛋白的变体可用于在哺乳动物患者中抑制癌前肿瘤前病变的形成，进而抑制癌症尤其是乳腺癌的发展。
包括放疗和化疗的标准癌症治疗方法包括损伤癌细胞的DNA。对正常DNA损伤的细胞应答包括DNA修复的激活、细胞周期停滞和致死性(Hall，Radiobiology for the Radiologist，Harper和Row，1988)。例如，DNA双链断裂的诱导导致了致死性的染色体畸变，其包括缺失、双中心粒、成环和后期桥(Hall，Radiobiology for the Radiologist，Harper和Row，1994)。
由于本发明的肽类被肿瘤和各种癌细胞选择性地吸收，现在已知这些肽类(包括在一个实施方案中为p18)可用作非病毒载体以将物质引入肿瘤和癌细胞中。例如，本发明的肽类可用于将DNA或RNA片段导入癌细胞中，进而对肿瘤或癌细胞提供治疗性DNA或RNA片段处理。
以下描述了非限制性的示范性技术和/或可通过本发明的肽类导入的特定DNA或RNA片段，并且，在一个实施方案中，p18促进连接分子进入哺乳动物癌细胞。例如，本发明可与基因治疗、RNAi方法、造血基因转移、同源重组、核酶技术、反义技术、肿瘤免疫治疗和肿瘤抑制基因、翻译研究、抗基因治疗(反义、siRNA和核酶)、细胞凋亡、免疫学和免疫治疗、DNA合成和修复一起使用。
基因治疗包括将外源基因，例如肿瘤抑制基因或细胞凋亡诱导物在适于所述基因表达的条件下转移至癌细胞内。一旦表达，所述基因产物通过减缓肿瘤细胞生长、抑制其转移能力或完全杀死肿瘤细胞产生对肿瘤细胞的有益效果。历史上，癌症基因治疗的临床效果受到以下因素限制：1)对肿瘤内的治疗性基因表达缺乏控制，以及2)载体到肿瘤的选择性靶向。本发明的化合物解决了肿瘤细胞的选择性靶向问题。此外，应用了某些策略以控制基因的表达。一种策略是转录靶向作用，其中调控治疗性基因的启动子被肿瘤选择性的转录因子激活。实例包括MUC-1启动子在乳腺癌中的应用和CEA启动子在结肠癌中的应用(Kurihara等，″Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1antigen，″J.Clin.Invest.106(6)：763-771，2000；Konishi等，″Transcriptionallytargeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producingadenocarcinoma，″J.Med.ScL，48(3)：79-89，1999)。
反义引物技术依赖于核酸分子向细胞的导入，其通常与所选择基因表达的mRNA互补。反义引物分子通常抑制mRNA分子的翻译，防止了所述基因编码的多肽的表达。反义引物技术的修饰可预防所选择基因的转录，其通过使所述基因的DNA与反义引物分子结合形成三链体进行。根据本发明可使用的一种特别的反义药物是G3139(同样称为oblimersen；由Genta.Inc.，Lexington，MA制备)。另一种可使用的特定的反义引物分子是G4460(也称为c-myb反义引物；由Genta，Berkeley Heights，NJ制备)。
本发明的肽类也可连接基于RNA干扰(RNAi)的分子。RNAi通常由双链RNA(″dsRNA″)、短发夹RNA(″shRNA″)或其他具有类似性质的核酸分子介导。这些核酸分子通过细胞酶类(包括Dicer和Drosha)被加工或切割成更小的片段。所述核酸分子的更小片段随后被介导mRNA降解的蛋白质复合物(RISC复合物)吸收。所述RISC复合物将降解与其吸收的核酸分子具有互补碱基对的mRNA。通过这种方式，mRNA被特异的破坏，从而防止了蛋白质的编码。
核酶技术依赖于核酸分子向细胞的导入，其表达与靶RNA分子结合并催化其选择性切割的RNA分子。所述靶RNA分子通常为mRNA分子，但其可以是，例如逆转录病毒RNA分子。
通过同源重组的靶基因的缺失也是本发明可用的一种策略，其需要两个基因失活事件(每个等位基因一个)。
与本发明化合物有关的特定治疗也可针对癌症特异性的转录复合物(CSTC)进行，其能控制对癌症发展重要的蛋白质的表达。例如，美国专利申请号2008/0027002，其直接针对CSTC的肿瘤治疗引入本文作为参考。
由于铜氧还蛋白之间的高度结构相似性，很可能除天青蛋白外的其他铜氧还蛋白也会抑制哺乳动物中的癌前病变的形成。可以在例如细菌或植物中发现所述的铜氧还蛋白。一些铜氧还蛋白已知具有与来自铜绿假单胞菌的天青蛋白类似的药代动力学性质。例如，来自氧化亚铁硫杆菌的铁硫菌蓝蛋白也可进入巨噬细胞并诱导细胞凋亡。Yaraada等，Cell Cycle 3：i182-118？(2004)；Yamada等，Cell.Micro.7：1418-1431(2005)。来自层理席藻的质体蓝素和来自裂环无色杆菌的假天青蛋白对巨噬细胞也是细胞毒性的。美国专利公开号20060040269，2006年2月23日公开。因此认为其他铜氧还蛋白也可用于本发明的组合物和方法中。此外，保留了其抑制哺乳动物癌症形成功能的铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物也可用于本发明的组合物和方法中。这些变体和衍生物可包括但不限于：铜氧还蛋白的截短物，氨基酸的保守性取代和蛋白修饰，诸如聚乙二醇化和α-螺旋的全烃化稳定。
本发明的组合物
本发明提供了作为铜氧还蛋白变体、衍生物或结构等价物的肽类，其抑制哺乳动物细胞、组织和动物中癌前病变的发展。本发明还提供了作为铜氧还蛋白变体、衍生物或结构等价物的肽类，其抑制哺乳动物细胞、组织和动物中癌症的发展。在某些实施方案中，所述肽是分离的。在某些实施方案中，所述肽是基本上纯的或药物级的。在其他实施方案中，所述肽在组合物中，所述组合物包含或基本上由所述肽组成。在另一个特定的实施方案中，所述肽是无抗原性的，并且不能在哺乳动物、更具体为人中引起免疫应答。在某些实施方案中，所述肽小于全长的铜氧还蛋白，并保留了铜氧还蛋白的某些药理学活性。具体而言，在某些实施方案中，所述肽可保留在鼠乳腺器官培养物中抑制癌前病变发展的能力。
本发明还提供包括至少一种肽的组合物，所述肽为铜氧还蛋白，或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物。特别是在药物组合物中。在特定的实施方案中，所述药物组合物被设计成特定的给药模式，例如但不限于，口服、腹膜内或静脉施用。所述组合物可以在水中水合，或可以被干燥(例如通过冻干)以用于以后的水合。所述组合物可以在除水以外的溶剂中，例如但不限于醇。
本发明还提供了包含肽类的组合物，所述肽为铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，其选择性地进入哺乳动物细胞、组织和动物内的癌细胞和/或肿瘤中。在某些实施方案中，所述肽是具有SEQ ID NO：25的p18。在某些实施方案中，所述组合物是p18与DNA或RNA的偶联物，在某些实施方案中，所述DNA或RNA是基因或基因的一部分。在某些实施方案中，所述DNA或RNA一旦在递送后具有治疗效果。
由于铜氧还蛋白之间高度的结构同源性，考虑铜氧还蛋白具有和天青蛋白与p28同样的化学预防性质。在某些实施方案中，所述铜氧还蛋白为但不限于天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、橙绿屈挠素、漆树蓝蛋白、黄瓜碱性蛋白或Laz。在特定的实施方案中，所述天青蛋白衍生自铜绿假单胞菌、粪产碱菌、木糖氧化无色杆菌反硝化亚种L(Achromobacter xylosoxidans denitrificans I)、支气管炎博德特菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌、百日咳石蒪菌和副溶血性弧菌，在一个非常特定的实施方案种，所述天青蛋白来自铜绿假单胞菌。在其他特定的实施方案中，所述铜氧还蛋白包含SEQ ID NO：1、3-19的氨基酸序列。
本发明提供了作为氨基酸序列变体的肽类，其与野生型铜氧还蛋白相比具有替换、缺失或插入的氨基酸。本发明的变体可以是野生型铜氧还蛋白的截短体。在某些实施方案中，本发明的肽包含小于全长野生型多肽的铜氧还蛋白的区域。在某些实施方案中，本发明的肽包含截短铜氧还蛋白的超过约10个残基、超过约15个残基或超过约20个残基。在某些实施方案中，本发明的肽包含截短铜氧还蛋白的不超过大约100个残基、不超过约50个残基、不超过约40个残基、不超过约30个残基或不超过约20个残基。在某些实施方案中，铜氧还蛋白具有所述肽，更具体为与本发明的SEQ ID NO：1、3-19至少约70％的氨基酸序列相同性、至少约80％的氨基酸序列相同性、至少约90％的氨基酸序列相同性、至少约95％的氨基酸序列相同性或至少99％的氨基酸序列相同性。
在特定的实施方案中，所述铜氧还蛋白的变体包含铜绿假单胞菌天青蛋白的残基50-77(p28，SEQ ID NO：2)、天青蛋白残基50-67(p18，SEQ IDNO：25)，或天青蛋白残基36-88(SEQ ID NO：26)。在其他实施方案中，所述铜氧还蛋白的变体由铜绿假单胞菌天青蛋白的残基50-77(p28，SEQ IDNO：2)、天青蛋白残基50-67(p18，SEQ ID NO：25)，或天青蛋白残基36-88(SEQ ID NO：26)组成。在其他特定的实施方案中，所述变体由天青蛋白以外的铜氧还蛋白的等价残基组成。也可考虑可以设计其他铜氧还蛋白变体，其具有和天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO：2)或天青蛋白残基36-88(SEQ IDNO：26)类似的药理学活性。为了达到此目的，采用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)将目标铜氧还蛋白氨基酸序列与铜绿假单胞菌天青蛋白序列进行比对，相关残基位于铜绿假单胞菌天青蛋白氨基酸序列上，在目标铜氧还蛋白序列上发现等价残基，从而设计等价肽。
在本发明的一个实施方案中，所述铜氧还蛋白变体包含橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素B的至少57-89位氨基酸(SEQ ID NO：20)。在另一个实施方案中，所述铜氧还蛋白变体包含铜绿假单胞菌天青蛋白的至少50-67位氨基酸(SEQ ID NO 25)。在本发明的另一个实施方案中，所述铜氧还蛋白变体包含丁香假单胞菌天青单胞的至少51-77位氨基酸(SEQ ID NO：21)。在本发明的另一个实施方案中，所述铜氧还蛋白变体包含脑膜炎奈瑟氏球菌Laz的至少89-115位氨基酸(SEQ ID NO：22)。在本发明的另一个实施方案中，所述铜氧还蛋白变体包含副溶血性弧菌天青蛋白的至少52-78位氨基酸(SEQ ID NO：23)。在本发明的另一个实施方案中，所述铜氧还蛋白变体包含支气管炎博德特菌天青蛋白的至少51-77位氨基酸(SEQ ID NO：24)。
所述变体也包括由合成的而非天然存在的氨基酸形成的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以整合到所述变体肽中，从而延长或优化所述组合物在血流中的半衰期。所述变体包括但不限于：D、L-肽类(非对映异构体)(例如Futaki等，J.Biol.Chem.27ó(8)：5836-40(2001)；Papo等，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller等，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987)；含有非天然氨基酸的肽类(例如Lee等，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))；接有烃类环钩的含烯烃的非天然氨基酸(例如Schafmeister等，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski等，Science 305：1466-1470(2004))；以及包含ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-Lys残基的肽。
在其他实施方案中，本发明的肽是铜氧还蛋白的衍生物。铜氧还蛋白的衍生物是所述肽的化学修饰，以使得所述肽仍保留其某些基本活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以是化学修饰的天青蛋白，其保留了在哺乳动物细胞、组织或动物中抑制癌前病变发展的能力。感兴趣的化学修饰包括但不限于所述肽的烃稳定、酰胺化、乙酰化、硫酸酯化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化和糖基化。此外，衍生的肽可以是铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与化学化合物的融合物，所述化合物例如但不限于另一肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或可检测的探针。感兴趣的衍生物包括例如通过本领域技术人员公知的方法进行化学修饰，通过所述修饰本发明的肽和组合物在血流中的半衰期可以被延长或优化，所述方法包括但不限于环化肽(例如Monk等，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest等，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))、N-末端和C-末端修饰(例如Labrie等，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))和接有烃类环钩的含烯烃的非天然氨基酸(例如Schafineister等，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski等，Science 305：1466-1470(2004))。
在另一个实施方案中，所述肽是铜氧还蛋白的结构等价物。确定铜氧还蛋白和其他蛋白质之间显著的结构同源性的研究实例包括Toth等(Developmental Cell 1：82-92(2001))。特别的，铜氧还蛋白和所述结构等价物之间的显著结构同源性通过使用VAST算法确定。Gibrat等，Curr OpinStruct Biol 6：377-385(1996)；Madej等，Proteins 23：356-3690(1995)。在特定的实施方案中，来自铜氧还蛋白与所述结构等价物之间结构比较的VAST p值小于大约10-3，小于大约10-5，或小于大约10-7。在其他实施方案中，可利用DALI算法测定铜氧还蛋白与所述结构等价物之间的显著结构同源性。Holm&Sander，J.MoI.Biol.233：123-138(1993)。在特定的实施方案中，配对结构比较的DALI Z分值至少为约3.5，至少为约7.0，或至少为约10.0。
预期本发明的组合物的肽可以是超过一种铜氧还蛋白的变体、衍生物和/或结构等价物。例如，所述肽可以是经过PEG化的天青蛋白的截短体，因此使其既是变体又是衍生物。在一个实施方案中，使用接有通过钌催化的烯烃置换的全烃类“环钩(staple)”的含携带烯烃的链(tether)的α，α-二取代的非天然氨基酸来合成本发明的肽。Scharmeister等，J.Am，Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walensky等，Science 305：1466-1470(2004)。此外，天青蛋白结构等价物的肽可以与其他肽融合，因此可形成既是结构等价物又是衍生物的肽。这些实例仅是示范性的，并不限制本发明。铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可以结合或不结合铜。
在某些实施方案中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物具有铜绿假单胞菌天青蛋白、特别是p28的某些药理学性质。在一个特定的实施方案中，铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物可以预防哺乳动物细胞、组织或动物、特别但不限于乳腺细胞中癌前病变的发展。本发明同样提供了铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物，其具有抑制哺乳动物癌前病变发展的能力，特别但不限于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌细胞。抑制癌细胞的发展是癌前病变的任何减少或增加率变小，与对照治疗相比具有统计学显著性。
由于现在已知铜氧还蛋白能够抑制哺乳动物细胞、组织或动物、特别是乳腺细胞中癌前病变的发展，最终抑制癌症，现在可以设计保留该化学预防活性的铜氧还蛋白的变体和衍生物。例如形成铜氧还蛋白的各种变体、衍生物和结构等价物的“库”，随后利用本领域抑制的多种方法之一，例如实施例1中的示范性方法测试每一个的化学预防活性、特别是在小鼠乳腺器官培养物中的化学预防活性，从而产生此类变体、衍生物和结构等价物。考虑代替或除天青蛋白或p28外，得到的具有化学预防活性的铜氧还蛋白变体、衍生物和结构等价物可用于本发明的方法。
在某些特定的实施方案中，铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可抑制小鼠乳腺器官培养物(MMOC)中7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的癌前病变发展至统计学上不同于未处理的对照的程度，利用实施例1中或Mehta等，(J Natl Cancer Inst 93：1103-1106(2001))和Mehta等，(Meth CellSci 19：19-24(1997))描述的MMOC模型系统，可检测肽的这种活性。其他用于确定癌症发展是否被抑制的方法也是本领域公知的，也可以使用。
在某些特定的实施方案中，铜氧还蛋白的衍生物或结构等价物在MMOC模型中抑制哺乳动物肺泡病变(MAL)的发展至统计学上不同于未处理的对照的程度。在某些特定的实施方案中，铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物在MMOC模型中抑制哺乳动物导管病变(MDL)的发展至统计学上不同于未处理的对照的程度。利用如实施例1中所描述的DMBA诱导形成癌前病变的MMOC模型系统，可以检测肽的所述活性。对MMOC模型系统中癌前病变的发展评价可通过如实施例1中提供的形态学分析或组织病理学分析确定。
在某些特定的实施方案中，所述变体、衍生物或结构等价物可选择性地进入哺乳动物细胞中的癌细胞和/或肿瘤中。在某些实施方案中，所述变体是p18的衍生物或结构等价物。在某些实施方案中，所述变体、衍生物或结构等价物可选择性地进入哺乳动物细胞、组织和动物中的癌细胞和/或肿瘤中，并且递送DNA或RNA。在某些实施方案中，所述DNA或RNA是基因或基因的一部分。在某些实施方案中，所述DNA或RNA一旦递送后具有治疗效应。
铜氧还蛋白
这些小的蓝铜蛋白(铜氧还蛋白)是电子传递蛋白(10-20kDa)，其参与细菌电子传递链或具有未知功能。铜离子单独被蛋白基质结合。两个组氨酸和一个半胱氨酸配体围绕铜的特殊的歪三角形平面排列产生金属位点很奇特的电子特性和强烈的蓝颜色。很多铜氧还蛋白均已经以中到高的分辨力在结晶上得到表征。
通常铜氧还蛋白具有低序列相同性但具有高的结构同源性。Gough &Clothia，Structure 12：917-925(2004)；De Rienzo等人，Protein Science 9：1439-1454(2000)。例如，天青蛋白的氨基酸序列与橙绿屈挠素B的氨基酸序列的相同性为31％，与铁硫菌蓝蛋白为16.3％，与质体蓝素为20.3％，与假天青蛋白为17.3％。参见表1。但是，这些蛋白质的结构相似性更明显。比较天青蛋白与橙绿屈挠素B的结构的VAST p值为100-7.4，天青蛋白与铁硫菌蓝蛋白为10-5，天青蛋白与质体蓝素为10-5.6，天青蛋白与假天青蛋白为10-4.1。
所有的铜氧还蛋白具有八-链回形拓扑结构(Greek key)β-桶或β-夹层折叠，并具有高度保守的位点结构。De Rienzo等人，Protein Science 9：1439-1454(2000)。由于很多长链脂肪族残基例如蛋氨酸和亮氨酸的存在，一显著的疏水区存在于天青蛋白、花青苷、蓝细菌质体蓝素、黄瓜碱性蛋白的铜位点周围，在假天青蛋白和真核质体蓝素的小范围内。同上。也发现疏水区在漆树花青苷和铁硫菌蓝蛋白铜位点的小范围内，但是具有不同的特征。同上。
表1.采用VAST算法将来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(1JZG)与其它蛋白质进行序列和结构比对。
Figure A20088000962100341
1比对长度：叠加在两个结构之间的相同C-α原子对的数量，即多少残基用于计算3D重叠。
2P值：VAST p值是所述对较的显著性的度量，表示为概率。例如，如果p值为0.001，那么纯随机性地看见性质相符的几率为1/1000。运用MMDB数据库中有500个独立和不相关的域的假定，调整VAST的p值是为了多重比较。因而被500除后，所述p值符合每个域对成对比较的p值。
3评分：VAST结构相似性分值。这一数字与二级结构重叠元素的数字以及重叠的质量相关。高的VAST分值意味着高的相似性。
4RMSD：以埃为单位的均方根重叠残基。在两个结构最佳重叠之后这一数字被计算出来，作为等价α碳原子之间均方距离的方根。注意RMSD值随着结构比对的范围而标定，当使用RMSD描述整个结构相似性时，必须考虑所述大小。
5线虫主要精子蛋白被证明在卵母细胞成熟中是一种ephrin拮抗物。Kuwabara，Genes和Development 17：155-161(2003)。
天青蛋白
天青蛋白是具有128个氨基酸残基的含铜蛋白质，其属于铜氧还蛋白家族，参与某些细菌的电子传递。天青蛋白包括来自铜绿假单胞菌(PA)(SEQ ID NO：1)、木糖氧化产碱菌(A.xylosoxidans)和反硝化产碱菌的那些。Murphy等人，J.Mol.Biol.315：859-871(2002)。天青蛋白之间的氨基酸序列相同性在60-90％之间变化，这些蛋白显示高的结构同源性。所有天青蛋白具有独特的具有回形拓扑结构基序的β-夹层，并且单个铜原子总是位于该蛋白质的同一区域。此外，天青蛋白在铜位点周围具有基本中性的疏水区。同上。
质体蓝素
质体蓝素是真核细菌、藻类和植物的可溶性蛋白，其在每个分子中含有一分子的铜，并且它们的氧化型为蓝色。它们出现在叶绿体中，作为电子载体发挥作用。自从在1978年测定了白杨质体蓝素的结构，藻类(栅藻，浒苔，衣藻)和植物(法国菜豆)质体蓝素的结果也用晶体学或NMR方法进行测定，并且白杨结构已经精确到1.33
Figure A20088000962100351
的分辨率。SEQ ID NO：3显示来自层理席藻，一种喜温蓝藻类细菌的质体蓝素的氨基酸序列。另一种感兴趣的质体蓝素来自Ulvapertussis。
尽管藻类和维管植物之间的质体蓝素序列趋异(例如衣藻蛋白和白杨蛋白之间的序列相同性为62％)，但三维结构是保守的(例如在衣藻蛋白和白杨蛋白之间Cα位置的0.76
Figure A20088000962100352
rms偏差)。结构特征包括位于八链反平行β-桶一个末端的扭曲四面体型铜结合位点、显著的负电区和平坦的疏水表面。铜位点对于其电子传递功能是优化的，负电和疏水区被设想参与生理反应配偶体的识别。化学修饰、交联和定位诱变试验已经证实负电和疏水区在与细胞色素f的结合相互作用中的重要性，并证实在质体蓝素中有两个功能重要的电子传递路径模型的正确。一条假定的电子传递路径是相对短的(约4
Figure A20088000962100353
)，并包括疏水区中暴露于溶剂的铜配体His-87，而另一条更长(约12-15
Figure A20088000962100354
)，包括负电区中几乎保守的残基Tyr-83。Redinbo等人，J.Bioenerg.Biomem br.26：49-66(1994)。
铁硫菌蓝蛋白
铁硫菌蓝蛋白是蓝色含铜单链多肽，其得自硫杆菌属(现在被称作酸硫杆状菌属)。利用多波长不规则衍射对来自氧化亚铁硫杆菌的极其稳定和高氧化性的铜氧还蛋白铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO：4)的氧化型进行X-射线晶体结构测定，分辨率精确到1.9铁硫菌蓝蛋白是由核心β-夹层折叠构成，所述β-夹层折叠由六链和七链b-片层构成。与其它铜氧还蛋白类似，铜离子同分布于扭曲四面体的四个保守残基(His 85，Cys 138，His 143，Met 148)组成的簇相配位。Walter，R.L等人，J.Mol.Biol.263：730-51(1996)。
假天青蛋白
假天青蛋白是蓝色含铜单链多肽家族。得自裂环无色杆菌的假天青蛋白的序列显示于SEQ ID NO：5。假天青蛋白的X射线结构分析显示它与天青蛋白具有相似的结构，尽管这些蛋白质之间具有低序列同源性。假天青蛋白和天青蛋白的整体结构之间存在两个主要区别。相对于天青蛋白，假天青蛋白具有由两个α-螺旋组成的羧基末端延伸。在中部肽区域，天青蛋白包含伸长的环，而在假天青蛋白中具有缩短的环。其形成含有短α-螺旋的瓣(flap)。在铜原子位点上唯一的主要不同是，MET侧链构象和Met-S铜键长度，其在假天青蛋白中明显短于在天青蛋白中。
植物花青苷(phytocyanin)
可鉴定为植物花青苷的蛋白质包括但不限于黄瓜碱性蛋白、漆树花青苷、mavicyanin、香辣根花青素、黄瓜剥皮铜氧还蛋白、推定的豌豆荚中的蓝色铜蛋白，以及一种来自拟南芥的蓝色铜蛋白。除了黄瓜碱性蛋白和豌豆荚蛋白以外，在其它的蛋白中通常位于轴向蓝色铜位点的甲硫氨酸配体被谷氨酰胺替换。
橙绿屈挠素
从嗜热绿色滑动光合细菌橙色绿屈挠菌分离得到三种小型蓝色铜蛋白，名为橙绿屈挠素A、橙绿屈挠素B-1和橙绿屈挠素B-2。两种B型是糖蛋白，并且性质几乎彼此相同，但与A型不同。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其表观单体分子量分别为14(A)、18(B-2)和22(B-1)KDa。
橙绿屈挠素A的氨基酸序列测定表明其为一个具有139个残基的多肽。Van Dreissche等人，Protein Science 8：947-957(1999)。如果在已知的小铜蛋白质体蓝素和天青蛋白中均为进化上保守的金属配体的话，那么在一定程度上His58、Cys123、His128和Met132都预期某种程度上被分隔。二级结构预测也指出橙绿屈挠素具有与铜绿假单胞菌天青蛋白和白杨叶质体蓝素相似的普通β桶状结构。但是，橙绿屈挠素看起来具有小铜蛋白质序列分类的序列特征。与天青蛋白共同序列的总体相似性与大体上与质体蓝素相同，即30.5％。橙绿屈挠素N端序列区域1-18富含甘氨酸和羟基氨基酸。同样，参见橙色绿屈挠菌橙绿屈挠素A链典型的氨基酸序列SEQ ID NO：15(NCBI蛋白质数据库登录号.AAM12874)。
橙绿屈挠素B分子具有标准的铜氧还蛋白折叠。人们已经研究了橙色绿屈挠菌橙绿屈挠素B的晶体结构。Bond等人，J.Mol.Biol.306：47-67(2001)。除了一个额外的N-端链以外，其分子与细菌铜氧还蛋白天青蛋白非常相似。如同在其它铜氧还蛋白中一样，其中一个铜配基位于多肽的链4上，其它三个沿着链7和链8之间的大环。参照后面三个配基之间的氨基酸间隔讨论铜位点的几何学。橙绿屈挠素B晶体学特征的铜结合域可能被一N端尾部限于细胞质膜的外周胞质侧，该N端尾部与其它几个膜相关电子传递蛋白中的链显示出显著的序列相同性。在McManus等人J.Biol.Chem.267：6531-6540(1992)有B型氨基酸序列的报道。橙色绿屈挠菌橙绿屈挠素链B典型的氨基酸序列参见SEQ ID NO：16(NCBI蛋白质数据库登录号1QHQA)。
漆树花青苷
漆树花青苷是植物花青苷的一个亚类，是植物铜氧还蛋白普遍存在的一个家族。这里漆树花青苷典型的序列包括在SEQ ID NO：14中。香辣根花青素是来自山葵根的一种漆树花青苷(Koch等，J.Am.Chem.Soc.127：158-166(2005)，其与黄瓜漆树花青苷(Hart等，Protein Science 5：2175-2183(1996))的晶体结构也是已知的。此蛋白有着与其它植物花青苷相似的总折叠。Ephrin B2蛋白外部域三级结构具有与漆树花青苷的显著相似性。Toth等，Developmental Cell 1：83-92(2001)。典型的漆树花青苷氨基酸序列可以在国立生物技术信息中心蛋白数据库登录号1JER，SEQ IDNO：14中找到。
黄瓜碱性蛋白
典型的黄瓜碱性蛋白氨基酸序列包含在本文SEQ ID NO：17中。黄瓜碱性蛋白(CBP)，一种I型蓝色铜蛋白的晶体结构分辨率的精确度已被精确到1.8该分子类似其它蓝色铜蛋白，具有一种回形拓扑β桶状结构，但桶状结构在一侧开口，最好描述为“β三明治”或“β玉米面豆卷”。Guss等人，J.Mol.Biol.262：686-705(1996)。Ephrin B2蛋白外部域三级结构与黄瓜碱性蛋白具有高度相似性(50个α碳rms偏差1.5
Figure A20088000962100382
)。Toth等，Developmental Cell1：83-92(2001)。
铜原子具有通常的蓝色铜NNSS’配位，其键长为Cu-N(His39)＝1.93A，Cu-S(Cys79)＝2.16A，Cu-N(His84)＝1.95A，Cu-S(Met89)＝2.61A。二硫化物连接，(Cys52)-S-S-(Cys85)，在稳定分子结构中扮演着重要角色。在蓝色铜蛋白的一个亚家族(植物花青苷)，以及一种非金属蛋白豚草过敏原Ra3中，多肽折叠是典型的，CBP与其具有高度的序列相同性。目前可鉴定为植物花青苷的蛋白质是CBP、漆树花青苷、mavicyanin、香辣根花青素、黄瓜剥皮铜氧还蛋白、推定的豌豆荚中的蓝色铜蛋白、以及拟南芥中一种蓝色铜蛋白。除了CBP和豌豆荚蛋白以外，在其它的蛋白中通常位于轴向蓝色铜位点的甲硫氨酸配体被谷氨酰胺替换。黄瓜碱性蛋白的典型序列可以在NCBI蛋白数据库登录号2CBP，SEQ ID NO：17中找到。
使用方法
本发明提供了在其他方面健康的患者中预防新恶性肿瘤的方法，包括给患者施用如上所述的至少一种肽，所述肽为铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物。化学预防治疗基于阻断癌发生相关的进程可预防癌症的发展这一假设。铜氧还蛋白铜绿假单胞菌天青蛋白和截短的天青蛋白p28已知能通过抑制癌前病变的最初形成或杀死或抑制已有癌前病变的生长从而抑制癌前病变的发展。因此考虑如上所述的具有抑制癌前病变发展能力的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可用于其他方面健康患者的化学预防治疗中。这些其他方面健康的患者在某些实施方案中为比普通群体具有更高癌症发病风险的患者。可以用本发明的组合物治疗预防的癌症包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。在某些实施方案中，患者可以是人。在其他实施方案中，患者不为人。
本发明还提供了研究癌症发展的方法，包括在用致癌物诱导之前或之后将哺乳动物细胞与包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物接触，并观察所述细胞的发展。在某些实施方案中，所述细胞是小鼠乳腺细胞。在其他情况下，所述细胞是可变成恶性的哺乳动物其他细胞。
比普通群体具有更高癌症发病风险的患者可以是具有高风险特征的患者、具有癌前病变的患者以及其最初癌症已治愈或其癌前病变最后得到治疗的患者。一般性参见Tsao等，CA Cancer J Clin 54：150-180(2004)。高风险特征可以是患者的行为、遗传、环境或生理因素。易使患者患有多种形式的癌症的行为因素包括但不限于抽烟、饮食、饮酒、激素替换治疗、更高的体重指数、未经产、槟榔使用、频繁漱口水的使用、暴露于人乳头瘤病毒、儿童和慢性日光照射、早期性交、多个性伙伴以及口服避孕药的使用。易使患者患有多种形式的癌症的遗传因素包括但不限于癌症的家族史、BRCA1和BRCA2的基因载体状态、乳腺瘤的病史、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遗传性非息肉性结肠直肠癌(HNPCC)、红色或金黄色头发和浅肤色表型、着色性干皮病以及种族性。易使患者患有多种形式的癌症的环境因素包括但不限于暴露于氡、多环芳香烃类、镍、铬酸盐、砒霜、石棉、氯甲基醚、苯并[a]芘、辐射以及来自橡胶或涂料的职业性暴露的芳香胺类。其他易使患者患有多种形式的癌症的多方面因素包括但不限于带气流阻塞的慢性阻塞性肺疾病、慢性膀胱感染、血吸虫病、老年和免疫受损的状态。
此外，具有癌症发病更高风险的患者可通过使用已开发的用于某些种类癌症的不同风险模型确定。例如，可通过Gail风险模型或Claus模型确定易患有乳腺癌的患者。参见Gail等，J Natl Cancer Inst 81：1879-1886(1989)；Cuzick，Breast 12：405-411(2003)；Huang等，Am J Epidemiol151：703-714(2000)。
具有癌前病变的患者癌症发病的风险比普通群体更高。本领域公知有许多方法可确定患者中癌前病变的存在。可测定患者中源于癌前病变的中间标记物或生物标记物，以确定该患者是否隐藏了癌前病变。在大多数癌症患者的肿瘤细胞和邻近组织学正常组织中发生染色体异常。染色体异常的发展伴随着从癌前病变到侵袭性癌症的表型发展。Thiberville等，CancerRes.55：5133-5139(1995)。因此，与癌症相关的染色体异常可用于中间标记物以在患者中检测癌前病变。与癌症相关的染色体异常包括但不限于肿瘤抑制基因例如3p(FHIT和其他)、9p(p16INK4、p15INK4B和p19ARF为9p21)、17p(对于p53基因为17p13，以及其他)和13q(对于视网膜母细胞瘤基因Rb为13q 14，以及其他)的等位缺失或杂合性丢失(LOH)。3p和9p的缺失与吸烟和早期肺癌有关，Mao等，J.Natl.Cancer Inst.89：857-862(1997)。影响3p、5q、8p和17p的缺失是上皮样癌中的通常变化。一般性参见Tsao等，CA Clin.Cancer J.Clin.54：153(2004)。其他与癌症相关的染色体突变包括活化癌基因的那些。其存在可用于中间标记物的癌基因包括但不限于Ras、c-myc、表皮生长因子、erb-B2和细胞周期蛋白类E、D1和B1。一般性参见同上154。
其他中间标记物可以是癌前细胞和癌细胞中基因上调的产物。在癌前细胞中可能上调的基因包括但不限于：环加氧酶类COX-1和COX-2、端粒末端转移酶。癌细胞和某些癌前细胞的其他生物标记物包括但不限于，p53、表皮生长因子受体(GFR)、增殖细胞核抗原(PCNA)、RAS、COX-2、Ki-67、DNA非整倍性(aneuploidy)、DNA聚合酶-α、ER、Her2neu、E-钙粘联蛋白、RARβ、hTERT、p16INK4a、FHIT(3p14)、Bcl-2、VEGF-R、HPV感染、LOH9p21、LOH 17p、p-AKT、hnRNPA2/B1、RAF、Myc、c-KIT、细胞周期蛋白D1、E和B1、IGF1、bcl-2、p16、LOH 3p21.3、LOH 3p25、LOH 9p21、LOH 17p13、LOH13q、LOH8p、hMSH2、APC、DCC、DPC4、JV18、BAX、PSA、GSTPl、NF-kB、API、D3S2、HPV感染、LOH 3p14、LOH 4q、LOH5ρ、膀胱肿瘤抗原(BTA)、BTK TRAK(Alidex.Inc.，Redmond WA)、泌尿道基质蛋白22、纤维蛋白降解产物、自分泌运动因子受体、BCLA-4、细胞角蛋白20、透明质酸、CYFRA 21-1、BCA、beta-人绒毛膜促性腺激素以及组织多肽抗原(TPA)。一般性参见同上155-157。
最初癌症已治愈或其癌前病变最后得到治疗的患者同样具有比普通群体更高的癌症发病风险。第二原发性肿瘤指有癌症病史的患者体内新的原发性肿瘤。第二原发性肿瘤是头颈癌死亡的主要原因。同上150。第二原发性肿瘤不同于转移瘤，前者是新生的，而后者来源于已存在的肿瘤。已治愈癌症或乳腺癌、头颈癌、肺癌和皮肤癌的癌前病变的患者形成第二原发性肿瘤的风险尤其要高。
包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物可通过本领域技术人员公知的许多途径和许多方案施用给患者。在特定的实施方案中，所述铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内、局部、口服或吸入施用。所述组合物可通过任何递送肽类至具有癌症发病风险患者体内位点的方法施用给患者。在特定的实施方案中，所述铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物通过静脉内施用。
在一个实施方案中，所述方法可包含将一单位剂量的包含铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物的组合物和一单位剂量的包含另一化学预防药物的组合物给患者共施用。它们以任意顺序在大约相同的时间施用，或在给定的时间内接着另一次施用。例如大约1分钟到大约60分钟，接着另一药物的施用，或大约1小时到大约12小时接着另一药物的施用。感兴趣的化学预防性药物包括但不限于他莫西芬、芳香酶抑制剂例如来曲唑和阿那曲唑
Figure A20088000962100411
维生素A酸类例如N-[4-羟苯基]维胺(4-HPR，芬维A胺)、非甾体抗炎药(NSAIDs)例如阿司匹林和舒林酸、塞来昔布(COX-2抑制剂)、二氟甲基鸟氨酸(DFMO)、熊去氧胆酸、3-羟基-3-甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂、EKI-785(EGFR抑制剂)、贝伐单抗(VEGF-受体的抗体)、西妥昔单抗(EGFR抗体)、维生素例如维生素A、β胡萝卜素、13-顺式维A酸、异维A酸和棕榈酸视黄酯(retinyl palmitate)、α-生育酚、干扰素、溶瘤腺病毒dl1520(ONYX-015)、吉非替尼、阿维a酯、非那雄胺、吲哚-3-原醇、白藜芦醇、绿原酸、雷洛昔芬和奥替普拉。
促进化合物选择性进入癌细胞和肿瘤中的组合物
本发明涉及递送货物化合物进入细胞的方法和材料。根据本发明，货物化合物的递送通过使用合适的转运多肽完成。在本发明的一个实施方案中，所述货物化合物与转运多肽连接。合适的转运多肽包括铜氧还蛋白，或含有“铜氧还蛋白入胞结构域”的铜氧还蛋白片段。术语“铜氧还蛋白入胞结构域”指包含铜氧还蛋白进入哺乳动物癌细胞所需要的氨基酸序列的铜氧还蛋白片段。通过本发明递送的货物化合物包括但不限于蛋白质、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸(包括RNA、DNA和反义核酸、染料、荧光和放射性标记、微粒或纳米粒子、毒素、无机和有机分子、小分子和药物(例如化学预防药物)。在某些实施方案中，所述药物和毒素杀死肿瘤细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述铜氧还蛋白是天青蛋白，例如来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO：1)。在本发明的其他实施方案中，所述铜氧还蛋白尤其是质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白或假天青蛋白。在特定的实施方案中，所述天青蛋白尤其来自铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、副溶血性弧菌或支气管炎博德特菌。
在一个实施方案中，递送货物化合物以阻止或延缓细胞中、例如癌细胞的细胞周期进程。这样的癌细胞可以是，例如尤其是骨肉瘤细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴瘤细胞、淋巴细胞、软组织肉瘤细胞或乳腺、肝、膀胱或前列腺肉瘤细胞。例如，所述货物化合物可以尤其是细胞周期调控蛋白，例如p53；细胞周期依赖激酶抑制剂，例如p16、p21或p27；自杀蛋白例如胸苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其他免疫调节蛋白例如白介素1、白介素2或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；或毒素，例如铜绿假单胞菌外毒素A。在其他实施方案中，可递送上述化合物种类之一的生物活性片段。在另一个实施方案中，递送货物化合物以产生靶组织图像。例如，所述靶组织可以是癌症，货物化合物可以是通常用于产生供X射线计算机断层摄影(CT)、磁共振成像(MRI)和超声检测影像的化合物。在这些实施方案中，所述货物化合物伽马射线或正电子发射放射同位素、磁共振成像造影剂、X射线造影剂或超声造影剂。
本发明还包括将DNA或RNA选择性导入哺乳动物癌细胞的方法。在这样的实施方案中，所述DNA或RNA是货物化合物。在某些实施方案中，该方法包括提供与DNA或RNA偶联的p18，并将所述化合物导入哺乳动物体内。在某些实施方案中，所述DNA或RNA是基因或基因片段。在某些实施方案中，所述DNA或RNA一旦导入哺乳动物细胞后具有治疗效果。
铜氧还蛋白入胞结构域(Cupredoxin Entry Domain)
本发明提供了一种蛋白转导结构域，其可将相连的货物转运入哺乳动物癌细胞而不是非癌细胞。已发现铜氧还蛋白包含蛋白转导结构域，铜氧还蛋白入胞结构域，其可促进相连的货物进入哺乳动物癌细胞。在某些实施方案中，可使用整个铜氧还蛋白以促进转运相连的货物选择性地进入癌细胞。在其他实施方案中，可使用铜氧还蛋白的一部分转运相连的货物进入癌细胞。在某些实施方案中，所述铜氧还蛋白入胞结构域由铜氧还蛋白区域组成，该区域长度小于全长野生型蛋白质。在某些实施方案中，所述铜氧还蛋白入胞结构域由铜氧还蛋白的超过约10个残基、约15个残基或者约20个残基组成。在某些实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域由铜氧还蛋白的不超过约50个残基、约40个残基或者约30个残基组成。在某些实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域与铜氧还蛋白具有至少约90％的氨基酸序列相同性、至少约95％的氨基酸序列相同性或者至少约99％的氨基酸序列相同性。
在某些实施方案中，所述铜氧还蛋白入胞结构域是天青蛋白入胞结构域。在本发明的一个实施方案中，天青单胞入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸50-77(SEQ ID NO：2)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸36-77(SEQ ID NO：27)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸36-89(SEQ ID NO：28)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸36-128(SEQ ID NO：29)。在本发明又一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸50-67(SEQ IDNO：25)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸53-70(SEQ ID NO：30)。在本发明又一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸53-64(SEQ ID NO：31)。
在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域是来自铜绿假单胞菌天青蛋白以外铜氧还蛋白的入胞结构域。在不同的实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域可以是蓝细菌层理席藻的质体蓝素(SEQ ID NO：3)、氧化亚铁硫杆菌铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO：4)；裂环无色杆菌假天青蛋白(SEQID NO：5)、丁香假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO：21)、脑膜炎奈瑟氏球菌天青蛋白(SEQ ID NO：10)、副溶血弧菌天青蛋白(SEQ ID NO：8)或橙色绿屈挠菌橙绿曲挠素(SEQ ID NO：15和16)的片段。
在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域含有至少橙色绿屈挠菌橙绿曲挠素B的氨基酸57-89(SEQ ID NO：20)。在本发明另一实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域含有至少丁香假单胞菌天青蛋白的氨基酸51-77(SEQ ID NO：21)。在本发明另一实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域含有至少脑膜炎奈瑟氏球菌Laz的氨基酸89-115(SEQ ID NO：22)。在本发明另一实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域含有至少副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸52-78(SEQ ID NO：23)。在本发明另一实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域含有至少支气管炎博德特菌天青蛋白的氨基酸51-77(SEQ IDNO：24)。
铜氧还蛋白入胞结构域的修饰
在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域被化学修饰或遗传改变以产生保留了转运货物化合物进入细胞能力的变体。例如，实施例14显示在54、61、70位导入脯氨酸残基的铜绿假单胞菌天青蛋白保留了进入UISO-Mel-2细胞的能力。
在另一实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域包含保守的氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO：32)或DGXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO：33)，其中D是天冬氨酸、G是甘氨酸、Y是酪氨酸、K是赖氨酸、X是任意氨基酸。见实施例17。
铜氧还蛋白入胞结构域的变体可通过标准技术合成。衍生物是直接形成自天然化合物或经修饰或部分取代形成的氨基酸序列。类似物是与天然化合物结构相似但不相同、在某些组分或侧链有所不同的氨基酸序列。类似物可以是合成的，也可以来自不同的进化起源。
如果衍生物或类似物含有修饰的氨基酸，则变体可以是全长的或不是全长的。铜氧还蛋白入胞结构域的变体包括但不限于包含某些区域的分子，所述区域与铜氧还蛋白入胞结构域基本上同源，在相同大小的氨基酸序列上或者通过同源性算法进行比对与一比对序列进行比较时，具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的相同性。
在另一个实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域的变体与铜绿假单胞菌的天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO：2)具有显著的结构相似性。在其他实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域的变体与铜绿假单胞菌的天青蛋白残基50-67(SEQ ID NO：25)具有显著的结构相似性。测定铜氧还蛋白和其他蛋白显著结构同源性的研究例子包括Toth等(Developmental Cell 1：82-92(2001))。具体的，铜氧还蛋白入胞结构域的变体与铜绿假单胞菌的天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO：2)之间的显著结构同源性是通过VAST算法确定的(Gibrat等，Curr Opin Struct Biol 6：3～7-385(1996)：Madej等，Proteins23：356-3690(1995))。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域变体与铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO：2)结构对比的VAST p值小于约10-3、小于约10-5或者小于约10-7。在其它实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域变体与铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO：2)之间的显著结构同源性可通过DALI算法测定(Holm&Sander，J Mol.Biol.233：123-138(1993))。在具体实施方案中，配对结构对比的DALI Z分值至少约3.5、至少约7.0或者至少约10.0。
可使用本领域中已知的方法对铜氧还蛋白入胞结构域进行修饰，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描与PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter，Biochem J.237：1-7(1986)；Zoller and Smith，Methods Enzymol.154：329-50(1987))、盒式诱变(cassette mutagenesis)、限制选择诱变(Wells等，Gene 34：315-23(1985))或其它已知技术以产生铜氧还蛋白入胞结构域变体核酸。此外，编码与铜氧还蛋白入胞结构域具有结构相似性的入胞结构域的核苷酸可通过本领域中所熟知的方法合成。另外，野生型蛋白质分子或变体铜氧还蛋白入胞结构域可通过本领域中所熟知的方法合成。
编码铜氧还蛋白入胞结构域及与货物化合物连接的铜氧还蛋白入胞结构域复合物的核酸
另一方面，本发明提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含与货物化合物相连的铜氧还蛋白入胞结构域，其中所述货物化合物为蛋白质或肽。本发明的核酸分子可通过组合本领域中已知技术进行制备。例如，可通过化学合成或克隆分别制备编码铜氧还蛋白入胞结构域和货物化合物的核酸序列。然后用连接酶将核酸序列顺序相连形成感兴趣的核酸分子。
使用铜氧还蛋白入胞结构域递送货物化合物的方法
已知许多富精氨酸肽能转位通过哺乳动物细胞膜并携带蛋白质货物化合物进入此类细胞。Suzuki.T.，等.J.Biol.Chcm.277：2437-43(2002)。例如，HIV Tat蛋白的富精氨酸的11个氨基酸短片段(氨基酸47-57)能够使货物蛋白质转运进入哺乳动物细胞。Schwarze，SR.，等.Trends Cell Biol.10：290-95(2000)。已经示出增加α-螺旋含量并优化精氨酸残基位置的合成入胞结构域增强了其作为蛋白转导结构域的潜力。Ho，A.，等Cancer Res.61：474-77(2001)。相比之下，铜氧还蛋白天青蛋白只有一个精氨酸残基。因此在本发明中有理由相信但不能确保其进入模式与Tat蛋白的不同。
本发明涵盖了促进货物化合物进入细胞的那些铜氧还蛋白片段的应用。可通过任一鉴别那些入胞所需片段的方法确定这些片段。在一种此类方法中，铜氧还蛋白片段与标记物质相连并进行测试以确定铜氧还蛋白片段是否进入细胞。这种方法可用于鉴定上述铜氧还蛋白的适当片段。
在本发明的不同实施方案中，所述货物化合物附着于铜氧还蛋白，例如铜绿假单胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO：1)；蓝细菌层理席藻的质体蓝素(SEQ ID NO：3)；氧化亚铁硫杆菌的铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO：4)；或裂环无色杆菌的假天青蛋白(SEQ ID NO：5)、丁香假单胞菌的天青蛋白片段(SEQ ID NO：21)、脑膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQ ID NO：10)、副溶血弧菌的天青蛋白(SEQ ID NO：19)、支气管炎博德特菌的天青蛋白(SEQ IDNO：8)、橙色绿屈挠菌的橙绿曲挠素A和B蛋白(SEQ ID NO：15和16)，以及其它天青蛋白和天青蛋白样蛋白。在其它实施方案中，所述货物与铜氧还蛋白入胞结构域例如p28(SEQ ID NO：2)或p18(SEQ ID NO：25)相连。
在本发明的不同实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域可在体外、离体(ex vivo)或体内将货物化合物输送进入细胞。例如，可通过将铜氧还蛋白入胞结构域与货物化合物的复合物加入细胞培养物中如巴氏涂片(pap smear)实现体外输送。或者，将复合物加入取自患者的样品如血液、组织或骨髓并将处理后的样品返回患者体内实现离体输送。还可通过将所述复合物直接施用给患者实现输送。本发明的方法可用于治疗、预防、诊断或研究目的。本发明所输送的货物化合物包括但不限于蛋白质、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸(包括反义核酸)、染料、微粒和纳米粒子、毒素、有机和无机分子、小分子及药物。
在一个实施方案中，可检测的物质，例如荧光物质，如绿色荧光蛋白；发光物质；酶，如β-半乳糖苷酶；或者是放射标记或生物素化的蛋白质被输送进入细胞，从而赋予细胞可检测的表型。与此相似，还可输送用可检测物质例如荧光物质标记的微粒或纳米粒子。适当纳米粒子的一个例子可见于2002年5月7日授权的美国专利6,383,500，其内容并入本文作参考。许多这种可检测物质为本领域技术人员所已知。
在某些实施方案中，所述货物化合物是适合X射线计算机断层摄影术(CT)、磁共振成像(MRI)、超声成像或放射性核素闪烁成像术的可检测物质。在这些实施方案中，所述货物化合物施用给患者用于诊断目的。造影剂可作为货物化合物施用以增强通过X射线CT、MRI和超声获得的图像。通过铜氧还蛋白入胞结构域施用靶向肿瘤组织的放射性核素货物化合物可用于放射性核素闪烁成像术。在某些实施方案中，铜氧还蛋白入胞结构域可含有具有货物化合物或不具有货物化合物的放射性核素。在其它实施方案中，所述货物化合物是发出伽马射线或正电子的放射性同位素、磁共振成像造影剂、X射线造影剂或超声造影剂。
适用于货物化合物的超声造影剂包括但不限于生物相容性气体微气泡、液体载体以及表面活性剂微球，在靶部分与微气泡之间可进一步包含任选的连接部分Ln。在本文中，术语液体载体是指水溶液，术语表面活性剂是指可降低溶液界面张力的任何两性物质。EP0727225A2揭示了适合于形成表面活性剂微球的表面活性剂列表，其内容并入本文参考。术语表面活性剂微球包括纳米球、脂质体、囊泡等。生物相容性气体可以是空气或碳氟化合物，例如在超声成像中产生回声差别进而形成造影的C3-C5全氟烷。所述气体包囊或含在铜氧还蛋白入胞结构域任选通过连接基团附着其上的微球中。附着可以是共价的、离子的或者通过范德华力。此类造影剂的具体例子包括脂质包囊的全氟碳，其具有多种肿瘤新生血管受体结合肽、多肽或肽模拟物。
适用作货物化合物的X射线造影剂包括但不限于一或多种原子序号20或以上的、可吸收X射线的原子或“重”原子，在铜氧还蛋白入胞结构域和X射线吸收原子之间可进一步包含任选的连接部分Ln。X线造影剂中经常使用的重原子是碘。最近揭示了包含金属螯合物的X射线造影剂(例如美国专利5,417,959)以及包含多个金属离子的多螯合物(polychelate)的X射线造影剂(例如美国专利5,679,810)。更近一些时候还揭示了用作X射线造影剂的多核簇状复合物(multinuclear cluster complex)(例如美国专利5,804,161、PCT WO91/14460及WO92/17215)。
适用作货物化合物的MRI造影剂包括但不限于一或多种顺磁性金属离子，在铜氧还蛋白入胞结构域和顺磁性金属离子之间可进一步包含任选的连接部分Ln。顺磁性金属离子以金属复合物或金属氧化微粒的形式存在。美国专利5,412,148和5,760,191描述了用于MRI造影剂中顺磁性金属离子螯合剂的例子。美国专利5,801,228、5,567,411及5,281,704描述了用于MRI造影剂的复合一个以上顺磁性金属离子的多螯合剂的例子。美国专利5,520,904描述了包含用于MRI造影剂的顺磁性金属离子的微粒组合物的例子。
在另一实施方案中，货物化合物被递送来杀伤细胞或阻碍细胞周期进展，所述细胞例如是癌细胞。这种癌细胞可以是例如骨肉瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、软组织肉瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞或前列腺癌细胞。例如，所述货物化合物可以是细胞周期调控蛋白，如p53；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，如p16、p21或p27；自杀蛋白，如胸苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其它免疫调节蛋白，如白介素1、白介素2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；或者是毒素，如铜绿假单胞菌外毒素A。在其它实施方案中，递送上述种类化合物之一的生物学活性片段。
在另一实施方案中，所述货物化合物是核酸。在某些实施方案中所述核酸编码上述种类化合物之一。在又一个实施方案中，所述货物化合物是用于治疗癌症的药物。所述药物包括，例如5-氟尿嘧啶；干扰素α；甲氨蝶呤；他莫昔芬；以及长春新碱。上述例子仅用于说明目的，许多其它此类化合物为本领域技术人员所熟知。在其他实施方案中，所述核酸用于基因治疗。
适用于治疗癌症的货物化合物包括但不限于烷化剂，如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝脲、氮丙啶及三氮烯(triazene)；抗代谢物，例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物及嘧啶类似物；抗生素，例如蒽环类、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素D及普卡霉素(plicamycin)；酶，例如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白转移酶抑制剂；5α-还原酶抑制剂；3型17β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂；激素类药物，例如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黄体酮及促黄体生成素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽(octreotide acetate)；微管破坏剂，例如ecteinascidins或者其类似物与衍生物；微管稳定剂，例如紫杉烷类(taxane)，例如紫杉醇(Taxol TM)、多西紫杉醇(Taxotere TM)及其类似物，以及埃坡霉素(epothilone)例如埃坡霉素A-F及其类似物；植物衍生制品，例如长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷类；及拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基转移酶抑制剂；及混合制剂，例如羟基脲、普鲁苄肼、米托坦(mitotan)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、铂配位复合物，例如顺铂和卡铂；以及其它用于抗癌和细胞毒性药物的制剂，例如生物反应修饰剂、生长因子；免疫调节剂和单克隆抗体。
这些种类抗癌和细胞毒性药物的代表性例子包括但不限于盐酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺(ifosfamide)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、塞替派、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、氟达拉滨、pentastatin、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素、柔红霉素、伊达比星、硫酸博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、番红(safracins)、沙加霉素(saframycins)、quinocarcins、discodermolides、长春新碱、长春花碱、酒石酸脱水长春花碱、鬼臼亚乙苷、磷酸鬼臼亚乙苷、替尼泊苷、紫杉醇、他莫昔芬、雌莫司汀、雌二醇氮芥磷酸钠、氟他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、diyneses、左旋咪唑、aflacon、干扰素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔单抗(rituximab)、BCG、维甲酸、盐酸依立替康、betamethosone、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺以及托泊替康(topoteca)及其任意类似物或衍生物。
以上这些种类的优选成员包括但不限于紫杉醇、顺铂、卡铂、多柔比星、洋红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、丝裂霉素C、ecteinascidin 743或pofiromycin、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、鬼臼脂素或者鬼臼脂素衍生物例如鬼臼亚乙苷、磷酸鬼臼亚乙苷或替尼泊苷、美法仑、长春花碱、长春新碱、白诺西丁、长春地辛及长春素。
用作货物化合物的抗癌和其它细胞毒性药物的例子包括如下：德国专利4138042.8；WO 97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253和WO 00/00485发现的埃坡霉素衍生物；WO 99/24416发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(也见美国专利6,040,321)；及WO 97/30992和WO 98/54966发现的异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂；以及美国专利6,011,029一般和具体描述的药物(此美国专利的所述化合物可与任意HR调节剂(包括但不限于本发明中所述)例如AR调节剂、ER调节剂以及LHRH调节剂或者手术去势联用，特别是在治疗癌症中)。
当上述其它治疗药物与本发明的化合物用作货物化合物时，可按照例如Physician’s Desk Reference(PDR)指出的量或本领域技术人员决定的量使用。
含有铜氧还蛋白入胞结构域的药物组合物
含有与货物化合物相连的铜氧还蛋白入胞结构域的复合物的药物组合物可通过任何常规方法制备，例如常规混合、溶解、粒化、包被糖衣、乳化、包囊化、封入(entrapping)或冻干方法。所述复合物可以容易地组合本领域中熟知的药学上可接受的载体。这种载体使制剂能够以片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬液等形式配制。适当的赋形剂还包括例如充填剂和纤维素制剂。其它赋形剂包括例如调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂以及其它可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。
这种组合物可用于例如细胞类型的检测或成像或用于与细胞死亡有关的病症的治疗或预防。所述组合物以足以预防或治疗与细胞死亡抗性有关的病症的量施用。此处使用的术语“与细胞死亡抗性有关的病症”指疾病、状态或不适，其特征由适当的、熟练的医师或临床医师判定的、与同种健康细胞相比至少表现出了细胞寿命延长的趋势。宿主生物体典型的是哺乳动物，如人或动物。
含有铜氧还蛋白入胞结构域组合物的施用
含有铜氧还蛋白入胞结构域的组合物可通过任意适当的途径例如口服、口腔、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、鼻腔、局部、经皮(即透皮)或胃肠外(包括静脉内、肌内、皮下及冠状动脉内施用)施用。组合物及其药物制剂可以有效达到其目的的任意量施用。当施用用于治疗与细胞死亡抗性有关的病症时，所述组合物应以治疗有效量施用。“治疗有效量”是指能够有效预防被治疗患者的现有症状的发展或缓解现有症状的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
适宜的剂量当然根据例如所用的含有铜氧还蛋白入胞结构域的化合物、宿主、施用方式以及被治疗或诊断的病症的性质和严重性而有所不同。但在本发明方法的一个实施方案中，在每日剂量为约0.001到约20mg/kg体重的含有铜氧还蛋白入胞结构域的化合物时获得了令人满意的人体疗效。在一个实施方案中，用于治疗人体的指明的每日剂量的范围为从约0.7mg到约1400mg的含有铜氧还蛋白入胞结构域的化合物，其可方便地施用，例如以每日剂量、每周剂量、每月剂量和/或连续给药。每日剂量每天可以是1到12次的不连续剂量。或者，所述剂量可以每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周及类似递增至每31天施用。可使用任意适当的给药形式包括片剂、敷贴、iv施用等等进行连续、间歇或单次给药。更具体地，组合物以治疗有效量施用。在具体实施方案中，治疗有效量为约0.01-20mg/kg体重。在具体实施方案中，剂量水平为约10mg/kg/日、约15mg/kg/日、约20mg/kg/日、约25mg/kg/日、约30mg/kg/日、约35mg/kg/日、约40mg/kg/日、约45mg/kg/日或者约50mg/kg/日。
在某些实施方案中，将含有铜氧还蛋白入胞结构域的化合物导入患者的方法与其它治疗癌症的已知药物共同施用。这种方法为本领域所熟知。在具体实施方案中，含有铜氧还蛋白入胞结构域的化合物为混合剂的一部分，或与含有或具有其它治疗癌症的药物共同给药。这种药物包括例如本文所列出的药物，具体为5-氟尿嘧啶、干扰素α、甲氨蝶呤、他莫昔芬及长春新碱。上述例子仅用于说明，还有许多其它此类化合物为本领域技术人员所知。
编码铜氧还蛋白入胞结构域或组合入胞结构域与货物化合物的融合蛋白的核酸分子可插入载体，用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过例如静脉内注射、局部施用(Nabel等，U.S.Patent No.5,328,470 1994.USA)或立体注射(stereotactic injection)(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA vol.91，pp 3054-57(1994))输送给患者。基因治疗载体的药物制品可包括可接受的稀释剂或可包含基因递送载体嵌入其中的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体例如逆转录病毒载体可由重组细胞完整产生时，药物制品可包括一或多种产生基因递送系统的细胞。
在一个方面，组合物以DNA被输送，因此复合物是在原位产生的。在一个实施方案中，DNA是“裸露的”，如Ulmer等，Science259：1745-49(1993)和Cohen，Science 2591691-92(1993)中所述。将DNA包被在载体上(例如可被有效转运入细胞的生物降解珠)可提高裸露DNA的摄取。在此类方法中，DNA可存在于本领域技术人员熟知的多种输送系统中的任意一种，所述系统包括核酸表达系统、细菌与病毒表达系统。将DNA整合入这些表达系统的技术为本领域技术人员所熟知。见例如WO 90/11092、WO 93/24640、WO 93/17706及美国专利5,736,524。
用于在从生物体到生物体穿梭遗传物质的载体可分为两大类：克隆载体是复制质粒或噬菌体，并具有在适当宿主细胞中繁殖所非必需的且外源DNA插入其中的区域；外源DNA像载体成分一样可复制与传代。表达载体(如质粒、酵母或动物病毒基因组)用来将外源遗传物质导入宿主细胞或组织，从而转录和翻译外源DNA，例如组合物的DNA。在表达载体中，导入的DNA被可操纵地连接于可向宿主细胞发出信号以转录插入DNA的元件例如启动子。某些启动子尤其有用，例如控制应答特殊因素的基因转录的诱导型启动子。将组合物多核苷酸可操纵地连接于诱导型启动子可控制wt-天青蛋白入胞结构域组合物多肽或者片段的表达。典型诱导型启动子的例子包括对α-干扰素、热休克、重金属离子和类固醇例如糖皮质激素(Kaufman，Methods Enzymol.185：487-511(1990))及四环素应答的启动子。其它所需的诱导型启动子包括对于构建体所导入的细胞是内源性的启动子，但在外源提供诱导剂时它们在细胞中是应答的。一般来说，有用的表达载体常为质粒。但其它形式的表达载体例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒与腺相关病毒)也可考虑。
载体的选择取决于使用的生物体或细胞，以及载体的所需命运。一般来说，载体包含信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。
包含铜氧还蛋白入胞结构域-货物化合物复合物的试剂盒
本发明另一方面提供了试剂盒，其在包装或容器内含有一种或多种下列材料：(1)包含与货物化合物相连的铜氧还蛋白入胞结构域的复合物的试剂；(2)含有药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂；(3)施用器材，例如注射器；(4)施用说明书。在某些实施方案中，在同一容器内也可含有两份或更多的成分(1)-(4)。
包含铜氧还蛋白铜氧还蛋白入胞结构域、铜氧还蛋白入胞结构域-货物化合物复合物或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物
包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物可通过任何常规方法生产，例如通过常规混合、溶解、粒化、包被糖衣、乳化、包囊化、封入(entrapping)或冻干方法。基本上纯的或药物级的铜氧还蛋白或其变体、衍生物和结构等价物可方便的与本领域公知的可药用载体组合。这种载体使制剂能够以片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬液等形式配制。适当的载体或赋形剂还包括例如充填剂和纤维素制剂。其它赋形剂包括例如调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂以及其它可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。在某些实施方案中，所述药物制剂基本上不含防腐剂。在其他实施方案中，所述药物制剂可含有至少一种防腐剂。药物剂型的一般方法参见Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(Lippencott Williams & Wilkins.Baltimore MD(1999))。
用于本发明中含有铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物可通过多种途径施用，包括注射(例如皮内、皮下、肌内、腹膜内等)，吸入，局部施用，栓剂，施用透皮贴剂或经口施用。有关药物递送系统的一般信息可以在Andel等人，出处同上中找到。在某些实施方式中，包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的组合物可以被配制并直接作为可注射剂(injectible)用于皮下注射和静脉注射。特别地，可注射剂型可以有利地用于治疗存在与不当的血管发生相关的疾病的风险、可能具有或具有与不当的血管发生相关的疾病的患者。包有铜氧还蛋白或变体、衍生物或结构等价物的组合物在与保护剂例如聚丙二醇或类似包衣剂混合后也可以口服。
当经注射施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以配制在水溶液，特别是生理相容缓冲液例如Hanks溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液中。所述溶液可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以为粉末形式，在使用前与适合的载体(vehicle)，例如无菌无热原水构造。在某些实施方案中，所述药物组合物不含有加入的用于增强所述肽促使的免疫应答的佐剂或任何其它物质。在某些实施方案中，所述药物组合物包含抑制对所述肽的免疫应答的物质。
当通过静脉流体施用时，用于施用铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的静脉流体可以由类晶体或胶体组成。这里使用的类晶体是矿物盐或其它水溶分子的水溶液。这里使用的胶体含有大的不溶分子例如明胶。静脉流体可以是无菌的。
可以用于静脉施用的类晶体流体包括但不限于生理盐水(浓度为0.9％的氯化钠溶液)，林格乳酸盐或林格溶液，以及通常称作D5W的5％右旋糖的水溶液，如表2所述。
表2.常用类晶体溶液的组成
Figure A20088000962100541
*林格乳酸盐也具有28mmol/L乳酸盐，4mmol/L K+，和3mmol/LC2+。
当通过吸入施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以利用适合的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其它适合的气体以气雾剂喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀释放计量量来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如凝胶的容器和药筒可以配制成含有所述蛋白质和适合的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
当通过局部施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、凝胶剂、悬浮液等，如本领域公知。在某些实施方式中，通过透皮肤贴剂施用。当通过栓剂施用时(例如直肠或阴道)，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物也可以配制成含有常规栓剂基质的组合物。
当通过口服施用时，通过将铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与本领域已知的药物可接受的载体结合可以很容易地配制铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物。可以利用固体载体例如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等；所述载体能使铜氧还蛋白及其变体、衍生物或结构等价物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于给待治疗的受试者口服摄入。对于口服固体剂型例如粉末、胶囊和片剂，适合的赋形剂包括填充剂例如糖、纤维素制剂、成粒剂以及粘合剂。
其他适合的载体如本领域已知的，也包括多价载体例如细菌荚膜多糖、右旋糖苷或遗传工程载体。此外，包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的缓释剂型允许在延长的时期内释放铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，而不具有缓释的剂型，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或等价物会在引起或增强治疗效果之前被从受试者系统清除、和/或例如被蛋白酶和简单的水解降解。
本发明的肽在血流中的半衰期可以通过本领域已知的几种方法延长或优化。本发明的肽变体可以包括但不限于多种变体，其可以增加其在血流中的稳定性、特定活性、寿命，和/或降低铜氧还蛋白的免疫原性，并保留所述肽在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌前病变发展的能力。所述变体包括但不限于那些减少肽的水解、减少肽的脱酰胺作用、减少氧化、降低免疫原性、增加肽的结构稳定性或增加肽的尺寸的变体。所述肽也包括环化的肽(参见Monk等人，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest等人，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))，D，L-肽(非对映异构体)，Futaki等人，J.Biol.Chem.Feb 23；276(8)：5836-40(2001)；Papo等人，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller等人，Biothem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987))；含有非天然氨基酸的肽(参见Lee等人，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))，N-末端和C-末端修饰(参见Labrie等人，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))，烃类环钩(参见Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000))；Walenski等人，Science 305：1466-1470(2004)以及PEG化作用。
在各种实施方式中，所述药物组合物包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)，水，油，盐水溶液、右旋糖和甘油水溶液，模拟生理条件需要的其它药物可接受辅助物质，例如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等。应当意识到可以采用本领域普通技术人员已知的任何适合的载体施用本发明的组合物，根据施用方式改变载体的类型。也可以使用公知的技术将化合物包在脂质体中。生物可降解的微球也可以作为载体用于本发明的药物组合物。适合的生物可降解微球例如在美国专利No.4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763和5,942,252中公开。
所述药物组合物可以通过常规、公知的灭菌技术进行灭菌，或可以无菌过滤。得到的水溶液可以包装原样使用，或冻干，在施用前冻干制剂与无菌溶液组合。
铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的施用
铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以配制作为药物组合物并通过任何适合的途径施用，例如通过口服、口腔、吸入、舌下、直肠、阴道、尿道、鼻、局部、经皮肤也就是经皮或肠胃外(包括静脉内、肌内、皮下和冠状动脉内)或玻璃体施用。其药物组合物以任意有效量施用以达到其想要的目的。更具体地，所述组合物以治疗有效量施用。在特定的实施方式中，治疗有效量一般在大约0.01-20mg/天/kg/体重。
包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物单独或与其它活性剂剂组合可用于预防癌症。适合的剂量当然会根据例如其中使用的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物，宿主，给药模式和自然界以及被治疗的疾病的本质和严重性而变化。但是，在人类中获得满意效果的每日剂量通常为0.01-20mg/kg体重。方便服用的铜氧还蛋白或其中的变体、衍生物或结构等价物的化合物的人类每日指示剂量范围大约为0.7mg到1400mg，例如每日剂量，周剂量，月剂量，和/或连续剂量。每日剂量可以不连续，从每天1次到每天12次。亦或剂量可以为每两天，每三天，每四天，每五天，每六天，每周，并且以类似天数增加直至31天或更长进行施用。或者，定量给药可以是连续施用贴剂、静脉内给药等。
主治医师考虑病人的情况以决定准确的配方、给药途径和剂量。可个别调整用药剂量和间隔，提供活性铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的血浆水平以充分保持的治疗效果。通常期望的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，与按照预期的施用途径和标准治疗实践所选择的药用载体混合施用。
一方面，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物作为DNA递送，以致在原处产生多肽。在一个实施方式中，DNA是“裸露的”，例如，正如在Ulmer等人(Science 259：1745-1749(1993)和Cohen综述(Science 259：1691-1692(1993)中所述的。裸DNA的摄取可以通过将所述DNA涂布于载体(如可生物降解珠)来增加，然后有效地运输至细胞内。用这种方法，DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的任意多种递送系统内，包括核酸表达系统，细菌和病毒表达系统。将DNA整合到这样的表达系统中所用的技术对于本领域普通技术人员是公知的。参见例如WO90/11092，WO93/24640，WO93/17706，以及美国专利5736524。
用于在生物体间穿梭传送基因物质的载体可以分为大体两种类型：克隆载体是复制型质粒或噬菌体，具有在适合的宿主细胞中增殖必需的区域，其中可以插入外源DNA；所述外源DNA被复制和增殖，如同它是载体的成分一样。表达载体(例如，质粒、酵母或动物病毒基因组)用于将外源遗传物质引入宿主细胞或组织以转录并翻译外源DNA，如铜氧还蛋白的DNA。在表达载体中，导入的DNA被可操作地连接到元件(例如启动子)，其给宿主细胞信号以高度地转录插入的DNA。某些启动子是特别有用的，例如可诱导型启动子，其响应于特殊因子来调控基因转录。将铜氧还蛋白及其多肽变体和衍生物可操作地连接到诱导型启动子可以调控相应于特殊因子的铜氧还蛋白及其变体和衍生物的表达。典型的诱导型启动子的实例包括对α-干扰素、热激、重金属离子和类固醇例如糖皮质激素(Kaufman，MethodsEnzymol.185：487-511(1990))和四环素响应的那些启动子。其他理想的诱导型启动子包括对于导入构建体的细胞不是内源的那些启动子，然而，当外源地提供诱导剂时，在那些细胞中是应答性的。一般地，有用的表达载体通常是质粒。然而，其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)是预期的。此外，本发明的肽(在一个实施方案中包括p18)可用作载体，以选择性地将治疗化合物递送至癌细胞或肿瘤内。
载体的选择取决于所用的生物体或细胞和载体预期的命运。通常，载体包括信号序列，复制起点，标记基因，多接头位点，增强子元件，启动子和转录终止序列。
含有铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的试剂盒
一方面，本发明提供了包含下面一种或多种处于包装容器中的试剂盒：(1)包含至少一种铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的药物活性组合物；(2)另一种化学预防药物；(3)给患者施用所述生物活性组合物的器材，例如注射器、喷雾器等。
当提供试剂盒时，所述组合物的不同组分可以视情况包装在分开的容器中，在使用前立刻混合。这样分开包装组分可以允许长期储存，而没有失去活性组分的功能。
试剂盒中所含的试剂可在任意种类的容器中提供，不同组分的使用期得到保持并不被容器的材料所吸收或改变。例如，密封的玻璃安瓿可以含有冻干的铜氧还蛋白及其变体、衍生物或结构等价物，或在中性、不反应气体例如氮气下包装的缓冲液。安瓿可以由适合的材料构成，例如玻璃、有机聚合物例如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷、金属或典型用于保存相似试剂的任何其它材料。其他适合的容器的实施例包括简易瓶，其由与安瓿相似的物质制成，和包壳(envelope)，其可以包括箔做内衬的内部例如铝或合金。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等。容器可以具有无菌存取口，例如有塞子的瓶子，该塞子可以用皮下注射针刺穿。其它容器可具有两室，两室被容易除去的膜隔开，去除膜后允许组分混合。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
试剂盒也可提供说明材料。说明书可以印在纸或其他载体上，和/或以电子可读介质提供，例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘、录像带、录音带、闪存装置等。详细的说明书可以不与试剂盒物理联系在一起；而是使用者可以被指引去试剂盒的制造商或分销商指定的互联网站或由电子邮件提供。
铜氧还蛋白、铜氧还蛋白入胞结构域及其变体、衍生物和结构等价物的修饰
铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可以被化学修饰或遗传改变以产生变体和衍生物，如上所述。所述变体和衍生物可以利用标准技术合成。铜氧还蛋白入胞结构域可类似的修饰。
除了天然存在的铜氧还蛋白的等位基因变体，也可通过突变在铜氧还蛋白编码序列中引入变化，突变引起被编码的铜氧还蛋白的氨基酸序列变化，而这不会显著改变铜氧还蛋白抑制癌前病变发展的能力。“非必需”氨基酸残基是可在野生型铜氧还蛋白序列中被改变，而不改变药理学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是这种药理学活性所需要的。例如铜氧还蛋白中保守的氨基酸残基预计是尤其不能改变的，因此是“必需”的。
可进行不改变所述多肽药理学活性的保守替换的氨基酸是本领域所公知的。可用的保守替换如表3中“优选替换”所示。只要所述替换实质上没有改变化合物的药理学活性，一种类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替的保守替换落在本发明的范围内。
表3.优选的替换
Figure A20088000962100591
影响(1)多肽主链的结构例如β-片层或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点的侧链体积(bulk)可以改变药理学活性。如表4所示，基于共同的侧链性质，对残基分组。非保守替换要求这些类型中的一个的成员变换成另一种类型。替换可引入至保守替换位点，或更优选非保守位点。
表4.氨基酸类型
Figure A20088000962100601
所述变体多肽可使用本领域已知的方法制得，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定位诱变(Carter，Biochem J.237：1-7(1986)；Zoller和Smith，Methods Enzymol.154：329-350(1987)、盒式诱变、限制选择诱变(Wells等人，Gene 34：315-323(1985)或其它已知的技术可在克隆DNA上操作以产生铜氧还蛋白变体DNA。
也可以利用已知的铜氧还蛋白突变产生变体铜氧还蛋白用于本发明的方法中。例如，已知天青蛋白的C112D和M44KM64E突变体具有与天然天青蛋白不同的细胞毒和生长抑制活性，如此改变的活性可用于本发明的治疗方法中。
参考下面的具体实施例可以更全面地理解本发明。所述实施例只是为了说明目的，没有意欲限制本发明的范围。当条件可暗示或提出赋形剂时，预期等价物形式和替换上的改变。虽然这里使用了特定的术语，这些术语的意图都是为了描述，并不是为了限制的目的。可以对上文所述发明进行修改和改变，而没有偏离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1.肽P-28对MMOC模型中DMBA诱导的哺乳动物损伤的效果
小鼠乳腺器官培养物(MMOC)模型允许评价潜在化学预防剂对DMBA导致的乳腺肺泡病变(MAL)或乳腺导管病变(MDL)的效果。在适当的孵育条件下，DMBA在培养基中形成基于激素环境的MAL或MDL。Hawthorne等，Pharmaceutical Biology 40：70-74(2002)；Mehta等.，J.Natl.Cancer Inst.93：1103-1106(2001)。雌激素和孕酮处理的腺体在培养物中发展导管病变，而醛固酮和氢化可的松处理的腺体形成非雌激素和孕酮依赖性的肺泡病变。不暴露于致癌物或化学预防剂的乳腺在缺乏生长促进激素的情况下经历结构性退化，而用DMBA在第3和第4天之间处理24小时防止了由缺乏激素引起的结构退化。其原因被认为在于腺体失去了正常的激素应答，改变了其发育的过程。将转化细胞移入同种小鼠中产生乳腺癌也证实了这些未退化区域的癌前肿瘤发生前性质。
从每只Balb/c小鼠中无菌切除乳腺胸廓对，分成几组。在4个不同的稀释下于培养基内评价p28的效果。使用无试验试剂的致癌物处理的腺体作为在缺乏化学预防剂情况下测量发病率百分比的手段。还包括额外的对照，作为化学预防的阳性对照。培养基中包括50μg/ml的天青蛋白。对于肺泡病变(MAL)着色的腺体评价病变的发病率(与给定治疗组的腺体总数相比的含有任何病变的腺体)。对于导管病变(MDL)适用类似的方案。然而，如以下方法部分所指出的，所述激素组合不同于肺泡和导管病变。在福尔马林中固定腺体，随后加工用于组织病理学检验。切片用曙红和hematoxelene染色，在显微镜下评价。这里比较了对照和治疗组之间导管病变的多样性。
器官培养操作.用于研究的实验动物是年轻未交配BALB/c雌性小鼠，3-4周龄，来自Charles River，Wilmington，MA。所述小鼠每天皮下注射1μg雌二醇-17β+1mg孕酮，共9天。该处理是必要条件，因为不用甾类预处理的动物不能对体外激素产生应答。整个培养过程详细描述于Jang等，Science 275：218-220(1997)；Mehta，Eu.J.Cancer 36：1275-1282(2000)；Mehta等，J.Natl.Cancer Inst.89：212-219(1997)；Mehta等，J.Natl.Cancer Inst.93：1103-1106(2001)。
简言之，颈脱位法处死动物，在丝布上切下乳腺胸廓对，在无血清Waymouth MB752/1培养基(5-腺体/5ml/盘)中孵育10天。该培养基补充有谷胺酰胺、抗生素(盘尼西林和链霉素，100单位/ml培养基)和生长促进激素、5μg胰岛素(I)、5μg催乳素(P)、1μg醛固酮(A)和1μg氢化可的松(H)每毫升培养基以用于诱导乳房肺泡病变(MAL)。为诱导导管病变(MDL)，培养基包含5μg/ml、5μg/ml P、0.001μg/ml雌二醇-17β和1μg/ml孕酮(Pg)。Mehta等，J.Natl.Cancer Inst.93：1103-1106(2001)。在第3天和第4天之间向培养基中加入致癌物DMBA(2μg/ml)。对于本研究，将DMBA以终浓度4mg/ml溶于DMSO中，向100ml培养基中加入50μg I，使得终浓度为2μg/ml。对照盘含有DMSO作为载体(vehicle)。
在第4天，通过在新鲜培养基中漂洗腺体，并将其转移至含有无DMBA的新鲜培养基的新盘中，从培养基中除去DMBA。孵育10天后，腺体在仅含I(5μg/ml)培养基中保留另14天。在整个培养期间，腺体维持在37℃、95％O2和5％CO2环境下。在生长促进时期的第一个10天内，所述培养基包含化学预防剂。在从12.5μg/ml到100μg/ml的4个浓度下评价试验肽p28。在培养基中以50μg/ml评价天青蛋白。所述肽在使用前溶于无菌水中并过滤。培养基每周更换3次(周一、周三和周五)。在暴露末期，在福尔马林中固定腺体。
结果通过卡方分析和Fisher确切检验分析。
MAL的形态学分析.对于MAL检查，将腺体在明矾洋红中染色，评价病变的存在。腺体根据存在或不存在乳房病变、每个腺体的病变严重性和试剂的毒性进行评分。在解剖显微镜下评价储存在二甲苯中的每个腺体乳房病变的存在或不存在、发病率以及严重性。乳腺根据乳房病变评分为阳性或阴性，发病率百分比确定为具有病变的腺体和该组中腺体总数的比例。由于化学预防剂处理导致的管膨胀或乳房结构分解被认为是毒性效应。对数据进行统计学分析以确定潜在化学预防剂的效果。
图1A显示了DMBA处理的腺体中肺泡病变的代表性图谱，其与用DMBA与化学预防剂一起处理的腺体进行比较。图1B-1F显示了p28对于肺泡病变发展的影响，总结于图2。肽28在25μg/ml的浓度下抑制了67％的MAL形成。增加浓度至100μg/ml没有提高所述肽的效果。该肽与天青蛋白的比较表明在MAL发育中，p28与天青蛋白一样有效。天青蛋白在50μg/ml的浓度下导致了67％的抑制。统计学分析表明p28的效果在超过12.5μg/ml浓度下与DMBA对照比较时是统计显著性的(p＜0.01，FisherExact Test，卡方分析)。
MDL的组织病理学评价.对于MDL，加工腺体以进行组织病理学评价。腺体纵向切割成5微米的切片，用曙红苏木精染色。每个腺体的纵向切片被分成几个区域，评价每个区域的导管病变。Mehta等，Natl.Cancer Inst.93：1103-1106(2001)。简而言之，整个腺体在范围内进行评价；较小的腺体与较大的腺体相比总区域数更少。这样，每个腺体具有不同数目的区域。通常通过导管的切片数目每个腺体之间也有很大不同。这导致了组间数目的不同。测定具有导管增生或异型的区域并与区域的总数比较，对每个腺体进行评价。增生或异型和严重闭塞的腺体之间不作区分。任何含有这些组织学特征的区域被认为是病变阳性的。比较治疗组与对照的严重性，计算抑制百分比。
图3显示了代表性的导管病变。DMBA诱导的导管病变分为增生、异型和完全的导管阻塞。确定了导管病变/导管切片总数的比例。再一次，12.5μg/ml浓度的p28抑制了仅15％的MDL形成。然而，在25μg/ml时，获得了与50μg/ml天青蛋白相比显著的病变抑制。P28在浓度超过12.5μg/ml时的效果是统计学显著性的(p＜0.01，Fishers Exact Test)。这些结果总结于图4。通常可区分化学预防剂在MAL和MDL之间的效果。例如他莫西芬抑制MDL而非MAL的发展。有趣的是，天青蛋白和p28不但抑制雌激素和孕酮依赖的导管病变，还抑制非依赖的肺泡病变。
本实施例表明，p28和天青蛋白均可预防乳房组织中癌前病变的发展。因此，p28和天青蛋白可用作哺乳动物患者的化学预防剂。
实施例2.通过铜氧还蛋白和衍生肽类作为潜在的载体选择性穿透癌细胞进行基因递送
我们已经证实天青蛋白，分离自铜绿假单胞菌的铜氧还蛋白家族成员在体内和体外进入癌细胞并诱导p53介导的细胞凋亡。评价了阳离子和阴离子铜氧还蛋白及其衍生肽类作为潜在的基因递送载体的穿透选择性。试验了以下铜氧还蛋白：天青蛋白(14kDa，pI5.7)、铁硫菌蓝蛋白(17kDa，pI 8.0)和质体蓝素(11kDa，pI5.4)，其结果表明天青蛋白具有最好的选择穿透性。
合成了25个氨基酸的天青蛋白(azu)片段，评价其对多种癌细胞和组织配对的正常细胞的穿透性。共焦显微镜和流式细胞仪(FACS)分析表明用Alexafluor 568(800Da)标记的18个氨基酸(1.7kDa，azu 50-67)片段(p18)选择性穿透人黑色素瘤(Mel-2，7，29)、乳腺癌(MCF-7)、卵巢癌(SK-OV3)、胰腺癌(CAPAN-2)、胶质母细胞瘤(LN-229)、星形细胞瘤(CCF-STTG1)、前列腺癌(LN-CAP)和肾癌(ACFfN-CRLl 611)细胞系，但不穿透其各自的对照。LDH释放和溶血测试显示p18在穿透过程中不破坏癌细胞膜结构或产生人红细胞溶血，表明p18在不破坏膜结构的情况下穿透人癌细胞。用细胞内化的特异性抑制剂(细胞松弛素d；抑制肌动蛋白聚合，紫杉醇；抑制微管蛋白解聚，氯丙嗪；抑制网格蛋白介导的胞吞作用，叠氮化钠；代谢抑制剂或十字孢碱；细胞周期抑制)预处理Mel-2细胞对p18的穿透性的效果可忽略不计。然而，将Mel-2细胞与制霉素(细胞膜穴样凹陷形成抑制剂)和布雷菲德菌素A(高尔基体破坏剂)孵育显著地抑制了p18的穿透，表明该胞吞过程可能部分与p18穿透有关。在具有异种移植黑色素瘤的无胸腺小鼠体内对红外染料(λem 800nm)标记的p18成像，清楚的显示在原发性皮下肿瘤和远端器官转移中的选择性吸收，而不在正常器官和组织中积聚。这样，本发明的肽(在一个实施例中包括p18)作为基因治疗的非病毒载体具有重要的作用。
实施例3-质粒构建体
使用校正DNA聚合酶，通过聚合酶链反应构建表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-截短型wt-天青蛋白(azu)衍生物融合蛋白的质粒。图5显示不同截短型wt-天青蛋白构建体的示意图。对于pGST-azu 36-128，将扩增的PCR片段导入商品化GST表达载体pGEXSX(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ 08855)的BamH1和EcoR1位点。片段扩增以pUC19-azu作为模板，5′-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGAAGA ACG TCA TGG GC-3′(SEOID NO：35)及5′-CGGAATTC GCATCA CTT CAG G GT CAG GG-3′(SEQ IDNO：36)作为引物，其中另外引入的BamHl和EcoRI位点分别用下划线标出。通过QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA92037)引入终止密码子可逐步进行azu基因的羧基末端截短。
对于pGST-azu 36-50(SEQ ID NO：37)、pGST-azu 36-77(SEQ ID NO：38)和pGST-azu 36-89(SEQ ID NO：39)，分别在Ser51、Ser78和Gly90引入终止密码子。以携带pGST-azu 36-128的质粒作为模板DNA。用于定点诱变的三组寡核苷酸显示如下。pGST-azu 36-50：5′-GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCCGCC GAC ATG CAG-3′(SEQ ID NO：40)和5′-CTG CAT GTC GGCGGC GGT TCA CAG TAC CCAGTT GTG GCC-3′(SEQ ID NO：41)。pGST-azu 36-77：5′-CCT GAA GCCCGA CGA CTG ACG TGT CATCGC CCA CAC C-3′(SEQ  ID  NO：42)和5′-GGT GTG GGC GAT GACACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3′SEQID NO：43)。pGST-azu36-89：5′-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGGTGA CC-3′(SEQ ID NO：44)和5′-GGT CAC CGA GTC CTTCTC TCACGA GCC GAT CAG CTT GG-3(SEQ  ID  NO：45)。以pGST-azu 36-77作为模板DNA，通过PCR制备质粒pGST-azu 50-77和pGST-azu67-77。
使用正向引物：5′-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACATGCAGG G-3′(SEQ ID NO：46)和5′-CGGGATCC CCG GCC TGGACA AGGATT ACC TGA AGC CCG-3(SEQ ID NO：47)获取PCR扩增片段azu 50-77和azu 67-77，其中另外引入的BamHI位点用下划线标出。这两种情况中使用的反向引物均为5′-CGGAATTC GCA TCACTT CAG GGT CAG GG-3′(SEQ ID NO：48)。
使用下列寡核苷酸将携带gst-azu 50-77的质粒用于Gly67引入终止密码子来产生pGST-azu 50-66：5′-GAC GGC ATG GCT TCC TGACTG GAC AAG GAT TAC C-3′(SEQ ID NO：49)和5′-GGT AAT CCTTGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC-3′(SEQ ID NO：50)。编码绿色荧光蛋白的绿色荧光蛋白基因(gfp)同样通过PCR扩增。所使用的正向和反向引物是5′-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3′(SEQ ID NO：51)和5′-CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3′(SEQ  IDNO：52)，在每个寡核苷酸的5′端均含有BamHl和EcoRI位点。将得到的PCR片段与pGEXSX载体连接，产生pGST-GFP。以pGST-azu 50-77作为模板，5′-CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CAT GCA GGG-3′(SEQ IDNO：53)和5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCAGTC GTC GGG CTT CAGGTA ATC C-3′(SEQ ID NO：54)作为引物，通过PCR扩增azu 50-77基因以制备携带gst-gfp-azu 50-77的质粒DNA，其中引入的Xho I和Not I位点分别用下划线标出。将纯化的azu 50-77片段导入pGST-GFP的Xho 1和Not 1独特限制性酶切位点。
实施例4-蛋白质纯化
如Yamada，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.101，pp.4770-75(2004)和共有未决美国专利申请10/720,603所述制备和纯化wt-天青蛋白和M44KM64E天青蛋白突变体，所述文献内容并入本文参考。简言之，按照Kukimoto et al，FEBS Lett，vol.394，pp 87-90(1996)所述方法通过PCR扩增wt-天青蛋白基因。以铜绿假单胞菌株PAO1的基因组DNA作为模板DNA进行PCR。
545bp的DNA扩增片段经Hindlll和Pst1消化后插入pUC19的相应位点，使天青蛋白基因位于lac启动子下游以产生表达质粒pUC19-azuA。E.col JM109用作天青蛋白基因表达的宿主菌株。重组大肠杆菌菌株在含有50μg/ml氨苄青霉素、0.1mM IPTG以及0.5mMCuSO 4的2YT培养基中37℃培养16小时，以产生天青蛋白。
制备M44KM64E天青蛋白突变体时，用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行天青蛋白基因的定点诱变。通过DNA测序验证突变。
质粒DNA，即pET9a，来自Kazuhiko Sasaki博士(Central ResearchInstitute of Electric Power Industry，Chiba，Japan)，其携带编码氧化亚铁硫杆菌铜氧还蛋白铁硫菌蓝蛋白的rus基因。
采用经修改的Sasaki，K.，等，.Biosci.Biotechnol.Biochem.，vol.67，pp.1039-47(2003)所述方法从携带rus基因的大肠杆菌BL21(DE3)中分离铁硫菌蓝蛋白。简言之，使用乙酸缓冲液(pH4.0)和CM-Sepharose(Sigma Chemicals，St.Louis，MO 63178)代替β-丙氨酸缓冲液(pH4.0)和TSK-gel CM-650柱(Tosoh Bioscience，LLC，Montgomeryville，PA 18936)。其它两种纯化的铜氧还蛋白-层理席藻质体蓝素和裂环无色杆菌假天青蛋白分别来自Beatrix G.Schlarb-Ridley博士(University of Cambridge，UK)和Christopher Dennison博士(University of Newcastle Upon Tyne，UK)。
如下纯化所有重组GST-融合衍生物：大肠杆菌BL21作为宿主菌株。以0.4mM IPTG诱导L肉汤中处于对数生长期早期的细菌后，用PBS通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析法和Sephadex 75凝胶过滤柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ 08855)从细胞提取物中纯化GST-融合蛋白。按照制造商说明分离以ALEXA
Figure A20088000962100661
(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR 97402)标记的纯化蛋白，wt天青蛋白和GST-衍生物或其它铜氧还蛋白。通过凝胶过滤柱除去未结合的游离荧光化学物。
实施例5-细胞培养
如Yamada，T.等，Infect.Immun.vol.70，pp.7054-62(2002)；Goto，M.，等，Mol.Microbiol，vol.47，pp.549-59(2003)和Yamada，T.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.99，pp.14098-103(2002)所述培养J774和UISO-Mel-2细胞(购自Frederick Cancer Research and Development Center，Frederick，Maryland，USA)，其内容并入本文参考。人正常成纤维细胞(Department of Surgical Oncology，University of Illinois(UIC)，Chicago的原种培养物)在具有含2mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM必需氨基酸并添加10％热灭活胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Eagle’s盐的MEM中培养。如Punj等，Oncogene 23：2367-78(2004)所述培养MCF-7和MOF-10F细胞。
实施例6-J774、UISO-Mel-2和成纤维细胞的共培养与共聚焦显微术
J774、UISO-Mel-2和成纤维细胞在各自盖玻片上培养。孵育过夜后，用新鲜培养基洗细胞，将这三株细胞系置于培养皿上，培养皿中含有200μg/ml缀合了ALEXA
Figure A20088000962100671
568的wt-天青蛋白。然后细胞在5％CO2中37℃孵育0.5或3.5小时。
制备显微镜样品时，细胞在盖玻片上37℃培养过夜。蛋白处理前，将细胞置于37℃或4℃2小时。将预热至37℃或预冷至4℃的新鲜培养基与红色荧光(以ALEXA
Figure A20088000962100672
568标记)铜氧还蛋白或GST-融合衍生物混合，并与细胞孵育。用PBS洗细胞，-20℃甲醇固定5分钟。用PBS洗两次后加入封片培养基，封片培养基含1.5μg/ml的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)用于染核(VECTASHILD，Vector，Burlingame，CA)，然后用共聚焦显微镜摄影。
实施例7-铜氧还蛋白进入J774细胞
如实施例6那样将wt-天青蛋白及其突变体变体M44KM64E、质体蓝素、假天青蛋白和铁硫菌蓝蛋白与J774细胞孵育，用共聚焦显微镜观察细胞。在这些实验中，铜氧还蛋白缀合了ALEXA
Figure A20088000962100673
568而发出红色荧光，将200μg/ml铜氧还蛋白与J774细胞在37℃孵育1小时，在另一实验中，6至7μM野生型天青蛋白和铁硫菌蓝蛋白与J774细胞在37℃孵育1小时。细胞核被DAPI染成蓝色。设一不加蛋白的对照。在所有实验中都观察到了铜氧还蛋白进入J774细胞的胞质溶胶。在类似实验中，橙绿曲挠素A和B优先进入MCF7癌细胞，而不是非癌对照细胞。
实施例8-wt天青蛋白和铁硫菌蓝蛋白进入不同类型的细胞
与MCF-7细胞相比，wt-天青蛋白对MCF-10F细胞表现出了较低的细胞毒性活性。Punj et at Oncogene 23：2367-2378(2004)。如实施例5所述处理并观察J774、腹膜巨噬细胞、肥大细胞、人乳腺癌MCF-7及人正常上皮细胞MCF-10F(原种培养物来自Department of Surgical Oncology，University of Illinois at Chicago(UIC)，Chicago)，并测试wt-天青蛋白是否能进入上述细胞。
在45mm孵育期间，wt-天青蛋白被J774细胞内在化。但其被腹膜巨噬细胞或肥大细胞内在化的效率很低。即使孵育6小时后，此类细胞仍仅示出有限的进入。相似地，wt-天青蛋白能够有效进入乳腺癌细胞MCF-7，但其在正常乳腺细胞MCF-10F中示出非常低的入胞比率。
缀合了Alexa
Figure A20088000962100681
的天青蛋白有效进入UISOMel-2和MCF-7癌细胞，但在正常乳腺细胞MCF 10A1中则不是。而缀合了Alexa
Figure A20088000962100682
的铁硫菌蓝蛋白不但进入UISO-Mel-2和MCF-7癌细胞的胞质溶胶也进入正常MCF 10A1细胞。与铁硫菌蓝蛋白在癌细胞中均匀分布在胞质溶胶内不同，在MCF 10A1细胞中，大多铁硫菌蓝蛋白被隔离在核周围的核周隙内。
实施例9-wt天青蛋白介导的细胞毒性和生长抑制
为了进一步评价wt-天青蛋白进入不同细胞的特异性，我们测定37℃孵育30分钟与3.5小时后，缀合了Alexa fluor的wt-天青蛋白进入J774、UISO-Mel-2和正常成纤维细胞的情况。观察到wt-天青蛋白在30mm内迅速进入J774和UISO-Mel-2细胞；相同时间内只有极少量的wt-天青蛋白进入成纤维细胞的胞质溶胶。孵育3.5小时后，在成纤维细胞中只发现了少量wt-天青蛋白。
如Yamada，T.，等，Infect.Immun.70：7054-62(2002)，Goto，M.，等，Mol.Microbiol 47：549-59(2003)和2003年11月24日提交的共有未决美国专利申请10/720,603所述，进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化四唑)(MTT)法测定wt-天青蛋白的细胞毒性，所述文献内容并入参考。图1(b)显示在24小时孵育期间，仅在J774细胞和UISO-Mel-2细胞中观察到了显著的wt-天青蛋白介导的细胞毒性。
M44KM64E天青蛋白突变体在J774细胞中表现出非常轻微的凋亡诱导活性，但在1mg/ml浓度时可显著抑制(约95％)G1期到S期的细胞周期进展。如Hiraoka，Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.101：6427-32(2004)和Yamada，T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：4770-75(2004)所述，用流式细胞术分析细胞周期进展，所述文献内容并入参考。图1(a)显示以500μg/ml或1mg/ml的M44KM64E天青蛋白突变体处理成纤维细胞时，细胞周期进展的抑制程度为约20％。
实施例10-wt天青蛋白微注射成纤维细胞和MCF-10F细胞
如Punj，V，等，Oncogene 23：2367-78(2004)所述方法，将wt-天青蛋白微注射入成纤维细胞和MCF-10F细胞。检查细胞的凋亡诱导情况，凋亡引起核DNA固缩和碎裂。在用wt-天青蛋白孵育5小时后的微注射的单细胞中可观察到显著的核DNA(以DAPI染成蓝色)固缩和碎裂，但用天青蛋白孵育30分钟则没有观察到此现象。
实施例11-37℃时wt天青蛋白融合衍生物的内化
如实施例1所述制备并纯化一系列在N端或C端截短的wt-天青蛋白的GST融合蛋白(图2(a)和2(b))。采用实施例5所述方法，用缀合了ALEXA568的wt-天青蛋白、GST和GST-azu融合衍生物检测37℃孵育1小时后J774细胞中的内在化。核用DAPI染成蓝色。
wt-天青蛋白被内在化时，GST仍保留在细胞外周，未被内在化。GST-azu 36-128和GST-azu 36-89及GST-azu 36-77也被内在化。然而进一步的截短还证明GST-azu 50-77被内在化，而GST-azu 36-50的内在化效率非常低并似乎在表面形成团。
实施例12-4℃时天青蛋白融合衍生物的内在化
4℃孵育时，检测了wt-天青蛋白和GST-azu融合衍生物在J774细胞中的内在化。4℃孵育1小时，在J774细胞中wt-天青蛋白的内在化被严重损害。用GST-azu 36-128和GST-azu 36-89也观察到了相似的损害。较短的GST-azu 36-7、GST-azu 50-77、GST-azu 50-66和GST-azu 67-77在4℃时也证明了内在化的严重损害。
实施例13-GST-GFP-azu 50-77融合蛋白在J774细胞和黑素瘤细胞UISO-MeI-2中的能量依赖性内在化
将GST与GFP融合制备GST-GFP融合衍生物。另外，将azu 50-77与GST-GFP融合蛋白(Mr 53kDa)融合(图6(a))。用SDS-PAGE检测纯化的GST、GST-GFP和GST-GFP-azu 50-77融合衍生物的迁移率(图6(b))。通过考马斯蓝染色及用抗天青蛋白抗体通过Western印迹进行检测(图6(c))。
用不同浓度的GST-GFP处理的J774细胞的流式细胞术测定显示这个蛋白结合J774细胞。用浓度增大的GST-GFP-azu 50-77融合蛋白处理的J774细胞的流式细胞术分选显示与GST-GFP单独处理相比荧光显著减弱(图7)。应注意的是GFP在哺乳动物细胞中的内在化已知会导致荧光丧失。用200μg/ml的GST-GFP-azu 50-77融合蛋白处理J774细胞时并在37℃孵育更长时间，荧光减弱也是明显的。
为确定GST-GFP和GST-GFP-azu 50-77的结合与内在化特征是否存在不同，用GST-GFP和GST-GFP-azu 50-77在37℃和4℃孵育J774和UISO-Mel-2细胞。使用共聚焦显微术定位绿色荧光。在J774细胞中，GST-GFP融合蛋白在37℃和4℃均结合表面而未被内在化。相反，GST-GFP-azu 50-77在37℃被内在化，而在4℃未被内在化。在UISO-Mel-2细胞中，GST-GFP融合蛋白在37℃和4℃均保留在表面。相反，类似于J774细胞，GST-GFP-azu 50-77融合蛋白在37℃被内在化，而在4℃未被内在化。
实施例14-wt-天青蛋白通过细胞膜穿透和胞吞机制进入哺乳动物细胞
如果wt-天青蛋白入胞仅依赖于受体介导的胞吞作用，那么其入胞可通过质子团(protonophore)羰基氰化物间-氯苯基腙(carbonyl cyanidem-chlorophrnyl hydrazone，CCCP，一种线粒体能量生成解偶联剂)或者以未标记天青蛋白或其它阻断受体的铜氧还蛋白预先孵育而阻断。以10倍以上浓度的铜氧还蛋白在4℃孵育J774和UISO-MeI-2细胞2小时，充分洗涤细胞以除去铜氧还蛋白，然后用缀合了ALEXA
Figure A20088000962100711
568的天青蛋白在37℃孵育1小时。在未经铜氧还蛋白处理的细胞中用一样多的内在化的天青蛋白。也测试了细胞松弛素D(购自Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo 63195)的作用，其是一种已知的受体介导胞吞作用的抑制剂，其破坏细胞微丝网络，也测试了布雷菲德菌素A(购自Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo 63195)的作用，其已知破坏高尔基体并抑制经典的囊泡介导的分泌。20pM浓度的CCCP如0.25至0.5pM的细胞松弛素D一样显著降低了UISO-MeI-2细胞对天青蛋白的摄取。而布雷菲德菌素A则没有明显作用。
实施例15-GST-PEDIII-azu 50-77融合衍生物进入UISO-Mel-2细胞
如Hwang，J.等，Cell 48：129-36(1987)；Reiter，Y.和Pastan，I.，Trends Biotechnol 16：513-20(1998)所述构建铜绿假单胞菌外毒素A结构域III(PEDIII)的GST融合蛋白。这个GST-PEDIII融合衍生物含有外毒素A的氨基酸381-613。PEDIII已知具有ADP-核糖基转移酶活性，能够通过抑制真核延伸因子2而抑制真核细胞中细胞蛋白质合成。
采用针对GST-GFP-azu 50-77所述的PCR法将azu 50-77序列引入到GST-PEDIII融合蛋白的羧基末端(图8(a))。通过谷胱甘肽-Sepharose 4B柱层析法将这两种融合蛋白(GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77)纯化为52和54kDa的蛋白质(图8(b))。然后UISO-Mel-2细胞和正常成纤维细胞(FBT)用不同浓度的这些蛋白在37℃孵育24小时，如实施例9所述用MTT分析检测细胞死亡程度。
GST-PEDIII表现出低细胞毒性，而GST-PEDIII-azu 50-77融合蛋白由于能有效进入UISO-Mel-2细胞而具有高细胞毒性(图8(c))。相反，融合蛋白对于成纤维细胞则表现出低水平的细胞毒性。
实施例16-wt-天青蛋白中α-螺旋去稳定对于其内在化进入UISO-Mel-2细胞无实质影响
为检测α-螺旋是否在天青蛋白入胞中发挥作用，三种螺旋去稳定的脯氨酸残基被引入wt-天青蛋白的54、61和70位(图6)，并检测全长A54PT61PK70P天青蛋白突变体进入UISO-Mel-2细胞的情况。还构建了这些位点的单突变体和双突变体并检测入胞情况。采用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)通过定点诱变天青蛋白基因来制备A54PT61PK70P天青蛋白突变体。
用200μg/ml突变体在37℃孵育UISO-Mel-2细胞1小时，然后通过共聚焦显微镜定位荧光。在所有情况中，缀合了ALEXA
Figure A20088000962100721
568的天青蛋白突变体都进入了UISO-Mel-2细胞。相似地，在检测GST-GFP-azu 50-77融合蛋白与A54PT61PK70P zau三突变体变体进入UISO-Mel-2细胞的情况时，没有观察到显著区别。
实施例17-GST-PEDIII-铁硫菌蓝蛋白融合衍生物进入UISO-Mel-2细胞
如实施例15构建铜绿假单胞菌外毒素A结构域III(PEDIII)的GST融合蛋白。采用针对GST-GFP-azu 50-77所述PCR法将全长铁硫菌蓝蛋白序列引入到GST-PEDIII融合蛋白羧基末端。通过谷胱甘肽-Sepharose 4B柱层析法纯化该融合蛋白。然后用不同浓度的融合蛋白在37℃孵育UISO-Mel-2细胞和FBT细胞24小时，如实施例7所述用MTT分析检测细胞死亡程度。
GST-PEDIII-铁硫菌蓝蛋白融合蛋白对UISO-Mel-2细胞表现出高细胞毒性(图9)。相反，融合蛋白对FBT细胞仅表现出低水平的细胞毒性。
序列表
<110>伊利诺斯大学理事会
<120>用铜氧还蛋白预防癌症的组合物和方法
<130>14PR-129880P
<140>11/488,693
<141>2006-07-19
<150>11/244,105
<151>2005-10-06
<150>60/844,358
<151>2006-09-14
<150>60/616,782
<151>2004-10-07
<150>60/680,500
<151>2005-05-13
<150>60/700,297
<151>2005-07-19
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>1
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1               5                   10                  15
Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
            20                  25                  30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
        35                  40                  45
Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
    50                  55                  60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
                85                  90                  95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
            100                 105                 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys
        115                 120                 125
<210>2
<211>28
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>2
Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp
            20                  25
<210>3
<211>105
<212>PRT
<213>Phormidium laminosum
<400>3
Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val
            20                  25                  30
Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val
        35                  40                  45
Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu
    50                  55                  60
Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe
65                  70                  75                  80
Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly
                85                  90                  95
Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly
            100                 105
<210>4
<211>155
<212>PRT
<213>Thiobacillus ferrooxidans
<400>4
Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys
1               5                   10                  15
Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr
            20                  25                  30
Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly
        35                  40                  45
Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu
    50                  55                  60
Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn
65                  70                  75                  80
Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr
                85                  90                  95
Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser
            100                 105                 110
Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp PheThr Trp His
        115                 120                 125
Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala
    130                 135                 140
Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys
145                 150                 155
<210>5
<211>124
<212>PRT
<213>Achromabacter cycloclastes
<400>5
Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met
1               5                   10                  15
Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr
            20                  25                  30
Phe Tle Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Tle Lys Gly Met
        35                  40                  45
Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr
    50                  55                  60
Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro
65                  70                  75                  80
His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln
            100                 105                 110
Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn
        115                 120
<210>6
<211>128
<212>PRT
<213>Alcaligenes faecalis
<400>6
Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr
1               5                   10                  15
Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu
            20                  25                  30
Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val
        35                  40                  45
Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys
    50                  55                  60
Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile
65                  70                  75                  80
Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe
                85                  90                  95
Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser
            100                 105                 110
Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser
        115                 120                 125
<210>7
<211>129
<212>PRT
<213>Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans I
<400>7
Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn
1               5                   10                  15
Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His
            20                  25                  30
Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp
        35                  40                  45
Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met
    50                  55                  60
Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr
                85                  90                  95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser
        115                 120                 125
Asn
<210>8
<211>129
<212>PRT
<213>Bordetella bronchiseptica
<400>8
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp
1               5                   10                  15
Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
            20                  25                  30
Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp
        35                  40                  45
Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile
    50                  55                  60
Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val
65                  70                  75                  80
Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr
                85                  90                  95
Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val
        115                 120                 125
Asp
<210>9
<211>129
<212>PRT
<213>Methylomonas sp.3.
<400>9
Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn
            20                  25                  30
Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp
        35                  40                  45
Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala
    50                  55                  60
His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys
                85                  90                  95
Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu
        115                 120                 125
Glu
<210>10
<211>166
<212>PRT
<213>Neisseria meningitidis
<400>10
Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala
1               5                   10                  15
Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp
            20                  25                  30
Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser
        35                  40                  45
Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala
    50                  55                  60
Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp
                85                  90                  95
Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys
            100                 105                 110
Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu
    130                 135                 140
Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Thr Leu Val Asp
                165
<210>11
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomomas fluorescens
<400>11
Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn
1               5                   10                  15
Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu
            20                  25                  30
Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu
        35                  40                  45
Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu
    50                  55                  60
Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys
        115                 120                 125
<210>12
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas chlororaphis
<400>12
Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn
1               5                   10                  15
Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn
            20                  25                  30
Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
        35                  40                  45
Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met
    50                  55                  60
Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
                85                  90                  95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys
        115                 120                 125
<210>13
<211>129
<212>PRT
<213>Xylella fastidiosa 9a5c
<400>13
Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp
1               5                   10                  15
Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr
            20                  25                  30
Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp
        35                  40                  45
Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu
    50                  55                  60
His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr
                85                  90                  95
Phe Pro Thr Asn Thr Leu 5er Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly
        115                 120                 125
Gly
<210>14
<211>138
<212>PRT
<213>Cucumis sativus
<400>14
Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val
1               5                   10                  15
Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe
            20                  25                  30
Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn
        35                  40                  45
Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val
    50                  55                  60
Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys
                85                  90                  95
Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr
            100                 105                 110
Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro
        115                 120                 125
Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser
    130                 135
<210>15
<211>162
<212>PRT
<213>Chloroflexus aurantiacus
<400>15
Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met
1               5                   10                  15
Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser
        35                  40                  45
Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala
    50                  55                  60
Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln
65                  70                  75                  80
His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile
                85                  90                  95
Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala
            100                 105                 110
Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu
        115                 120                 125
Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr
    130                 135                 140
Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val
145                 150                 155                 160
Val Asn
<210>16
<211>140
<212>PRT
<213>Chloroflexus aurantiacus
<400>16
Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln
            20                  25                  30
Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val
        35                  40                  45
Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly
    50                  55                  60
Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp
                85                  90                  95
Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr
        115                 120                 125
Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro
    130                 135                 140
<210>17
<211>96
<212>PRT
<213>Cucumis sativus
<400>17
Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu
1               5                   10                  15
Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe
            20                  25                  30
Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly
        35                  40                  45
Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly
    50                  55                  60
Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn
65                  70                  75                  80
Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu
                85                  90                  95
<210>18
<211>166
<212>PRT
<213>Neisseria gonorrhoeae F62
<400>18
Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly
1               5               10                      15
Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp
            20                  25                  30
Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser
        35                  40                  45
Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala
    50                  55                  60
Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys
65                  70                  75                  80
Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp
                85                  90                  95
Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys
            100                 105                 110
Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp
    130                 135                 140
Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Thr Leu Val Asp
                165
<210>19
<211>150
<212>PRT
<213>Vibrio parahaemolyticus
<400>19
Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser
1               5                   10                  15
Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn
            20                  25                  30
Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln
    50                  55                  60
Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala
65                  70                  75                  80
Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys
                85                  90                  95
Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly
            100                 105                 110
Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly
        115                 120                 125
Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln
     130                 135                 140
Gly Lys Phe Glu Phe Lys
145                 150
<210>20
<211>33
<212>PRT
<213>Chloroflexus aurantiacus
<400>20
His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro
            20                  25                  30
Asp
<210>21
<211>27
<212>PRT
<213>Pseudomonas syringae
<400>21
Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val
1               5                   10                  15
Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp
            20                  25
<210>22
<211>27
<212>PRT
<213>Neisseria meningitidis
<400>22
Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly
1               5                   10                  15
Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp
            20                  25
<210>23
<211>27
<212>PRT
<213>Vibrio parahaemolyticus
<400>23
Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala
1               5                   10                  15
Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp
            20                  25
<210>24
<211>27
<212>PRT
<213>Bordetella bronchiseptica
<400>24
Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp
            20                  25

Claims (69)

1.分离的肽，其为铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物，可抑制哺乳动物组织中癌前病变的发展。
2.权利要求1的分离的肽，其中所述铜氧还蛋白选自由天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、Laz、橙绿屈挠素、漆树蓝蛋白和黄瓜碱性蛋白组成的组。
3.权利要求2的分离的肽，其中所述铜氧还蛋白是天青蛋白。
4.权利要求1的分离的肽，其中所述铜氧还蛋白来自选自由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidan)、支气管炎博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、甲基单胞菌(Methylomonas sp.)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhea)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyiicus)组成的组的生物体。
5.权利要求4的分离的肽，其来自铜绿假单胞菌。
6.权利要求1的分离的肽，其是选自由SEQ ID NO：1、3-19组成的组的肽的一部分。
7.权利要求1的分离的肽，其与选自由SEQ ID NO：1、3-19组成的组的序列具有至少80％的氨基酸序列相同性。
8.权利要求1的分离的肽，其是所述铜氧还蛋白的截短体。
9.权利要求8的分离的肽，所述肽大于约10个残基，但不超过大约100个残基。
10.权利要求8的分离的肽，其中所述肽包括选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77、铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-67、铜绿假单胞菌天青蛋白残基36-88和SEQ ID NO：20-24组成的组的序列。
11.权利要求10的分离的肽，其中所述肽由选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77、铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-67、铜绿假单胞菌天青蛋白残基36-88和SEQ ID NO：20-24组成的组的序列组成。
12.权利要求1的分离的肽，其中所述肽包括与选自组残基50-77、残基50-67和残基36-88的铜绿假单胞菌天青蛋白区域等价的铜氧还蛋白残基。
13.药物组合物，其包含置于药物可接受载体中的至少一种权利要求1的铜氧还蛋白或肽。
14.权利要求13的药物组合物，其包含至少两种所述铜氧还蛋白或肽。
15.权利要求13的组合物，其中所述药物组合物被配制成用于静脉施用。
16.权利要求13的组合物，其中所述铜氧还蛋白来自选自铜绿假单胞菌、粪产碱菌、木糖氧化无色杆菌、支气管炎博德特菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌或副溶血性弧菌组成的组的生物体。
17.权利要求16的组合物，其中所述铜氧还蛋白来自铜绿假单胞菌。
18.权利要求13的组合物，其中所述铜氧还蛋白选自由SEQ ID NO：1、3-19组成的组。
19.治疗哺乳动物患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的权利要求13的组合物。
20.权利要求19的方法，其中所述患者是人。
21.权利要求19的方法，其中所述患者比普通群体具有更高的癌症发病风险。
22.权利要求21的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。
23.权利要求21的方法，其中所述患者具有至少一种高风险特征。
24.权利要求19的方法，其中患者具有癌前病变。
25.权利要求19的方法，其中所述患者曾被治愈过癌症或癌前病变。
26.权利要求19的方法，其中所述药物组合物通过选自静脉注射、肌内注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服组成的组的模式施用。
27.权利要求24的方法，其中施用模式是通过静脉注射。
28.权利要求21的方法，其中所述药物组合物与至少一种其他化学预防性药物共施用。
29.权利要求26的方法，其中所述药物组合物与另一种化学预防药物在几乎相同的时间施用。
30.一种试剂盒，其包含位于小瓶中的权利要求13的组合物。
31.权利要求30的试剂盒，其中该试剂盒被设计用于静脉施用。
32.一种研究癌症发展的方法，包括使哺乳动物细胞与权利要求1的铜氧还蛋白或肽接触，并测量癌前和癌细胞的发展。
33.权利要求32的方法，其中所述细胞是人类细胞。
34.权利要求32的方法，其中所述细胞是乳腺细胞。
35.权利要求32的方法，其中所述细胞被诱导以发展癌症。
36.一种表达载体，其编码权利要求1的肽。
37.分离的肽，其为铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物；其中所述分离肽与货物化合物偶联，可选择性地进入哺乳动物癌细胞。
38.权利要求37的分离的肽，其中所述铜氧还蛋白来自选自由铜绿假单胞菌、粪产碱菌、木糖氧化无色杆菌、支气管炎博德特菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌和副溶血性弧菌组成的组的生物体。
39.权利要求37的分离的肽，其中铜氧还蛋白是天青蛋白。
40.权利要求39的分离的肽，其中所述天青蛋白来自铜绿假单胞菌。
41.权利要求37的分离的肽，其包括SEQ ID NO：25。
42.权利要求37的分离的肽，其由SEQ ID NO：25组成。
43.权利要求37的分离的肽，其是铜氧还蛋白的截短体。
44.权利要求37的分离的肽，其中所述肽大于约10个残基，但不超过大约100个残基。
45.权利要求37的分离的肽，其中所述肽包括选自由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO：2)、铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-67(SEQID NO：25)、铜绿假单胞菌天青蛋白残基36-88(SEQ ID NO：26)和SEQ IDNO：20-24组成的组的序列。
46.权利要求37的组合物，其中所述货物化合物是DNA或RNA。
47.权利要求46的组合物，其中所述货物化合物是反义分子。
48.权利要求37的组合物，其中所述货物化合物阻止或杀死哺乳动物癌细胞。
49.权利要求48的组合物，其中所述货物化合物是细胞毒类药物。
50.权利要求37的组合物，其中所述货物化合物选自由蛋白质、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、纳米粒子、毒素和药物组成的组。
51.权利要求37的组合物，其中所述货物化合物选自由蛋白质和多肽组成的组，其中所述肽与货物化合物连接形成融合蛋白。
52.权利要求37的组合物，其中所述货物化合物是毒素。
53.权利要求37的组合物，其中所述货物化合物是可检测的物质。
54.药物组合物，其包含权利要求37的组合物和药学上可接受的载体。
55.一种方法，其包括将一或多个细胞与权利要求37的组合物相接触。
56.权利要求55的方法，其中所述一或多个细胞源于患有癌症的患者，其还包括将所述细胞回输至患者体内。
57.权利要求55的方法，其中所述细胞是癌细胞。
58.权利要求57的方法，其中所述细胞是选自由骨肉瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、软组织肉瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、黑素瘤细胞、脑肿瘤细胞和前列腺癌细胞组成的组中的癌细胞。
59.一种治疗癌症患者的方法，其中给所述患者施用治疗有效量的权利要求37的组合物。
60.权利要求59的方法，其中施用所述复合物的方式选自静脉内、局部、皮下、肌内和肿瘤内施用。
61.权利要求59的方法，其中所述复合物与另一癌症治疗方法联合施用。
62.一种成像患者癌症的方法，其中给所述患者施用权利要求53的组合物，并检测所述货物化合物的定位。
63.权利要求62的方法，其中所述货物化合物是X射线造影剂，并通过X射线CT检测所述货物化合物的定位。
64.权利要求62的方法，其中所述货物化合物是磁共振成像造影剂，并通过MRI检测所述货物化合物的定位。
65.权利要求62的方法，其中所述货物化合物是超声造影剂，并通过超声成像检测所述货物化合物的定位。
66.一种诊断癌症的方法，其中将权利要求53的组合物与细胞接触，并检测所述货物分子的定位。
67.试剂盒，其包括包含权利要求37的组合物的试剂。
68.权利要求67的试剂盒，其还包括包含药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂。
69.权利要求67的试剂盒，其还包括用于施用所述试剂的载体。
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