KR20090114414A - 쿠프레독신으로 암을 예방하는 조성물과 방법 - Google Patents

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아난다 차카라바티
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Abstract

본 발명에서는 적하 화합물(cargo compound)을 암 세포로 전달하기 위한 방법과 재료를 기술한다. 적하 화합물의 전달은 쿠프레독신(cupredoxin)으로부터 유래된 단백질 형질도입 도메인(transduction domain)의 이용으로 달성된다. 이러한 적하 화합물은 핵산, 구체적으로, DNA, RNA 또는 안티-센스(anti-sense)일 수 있다. 더 나아가, 본 발명에서는 암을 치료하고 진단하는 방법을 기술한다.
적하 화합물(cargo compound)

Description

쿠프레독신으로 암을 예방하는 조성물과 방법{Compositions and Methods to prevent cancer with Cupredoxins}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. §§ 119와 120 하에, 2006년 7월 19일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 11/488,693 및 2006년 9월 14일자 제출된 U.S. 가출원 60/844,358에 우선권을 주장하고, 상기 U.S. 가출원 60/844,358은 2005년 10월 6일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 11/244,105에 우선권을 주장하고, 상기 U.S. 특허 출원 No. 11/244,105는 2004년 10월 7일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/616,782 및 2005년 5월 13일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/680,500에 우선권을 주장하고 2003년 11월 11일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 10/720,603의 일부 계속 출원이며, 상기 U.S. 특허 출원 No. 10/720,603은 2003년 8월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/414,550에 우선권을 주장하고 2002년 1월 15일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 10/047,710의 일부 계속 출원이며, 상기 U.S. 특허 출원 No. 10/047,710은 2001년 2월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/269,133에 우선권을 주장한다. 이들 선행 출원의 전체 내용은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.
정부 권리의 진술
본 출원의 요부는 National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland, U.S.A.로부터 연구 기금(Grant Number AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, CA 09432와 N01-CM97567)을 지원받았다. 정부는 본 발명에 일부 권리를 주장할 수 있다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 포유동물 세포, 조직과 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체와 구조적 등가물을 함유하는 조성물에 관계한다. 본 발명은 또한, 전악성 병소와 궁극적으로, 암의 발생을 저해하기 위한 포유동물에서 화학예방제(chemopreventive agent)로서, 쿠프레독신 및/또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체와 구조적 등가물의 용도에 관계한다.
암 화학예방(chemoprevention)은 침습성 암(invasive cancer)으로의 발암 진행(carcinogenic progression)을 반전, 억제 또는 예방하기 위한 천연, 합성 또는 생물 화학 작용제(biologic chemical agent)의 이용이다. 고위험 개체군에서 암을 예방하는 최근의 임상 시험에서는 화학예방 요법(chemopreventive therapy)이 고위험 환자에 대한 현실적인 치료법임을 제안한다. 화학예방 요법은 다중병소 필드 발암(multifocal field carcinogenesis)과 다단계 발암(multistep carcinogenesis)의 개념에 기초한다. 필드 발암(field carcinogenesis)에서, 조직 필드(tissue field) 전반에 포괄적인 발암인자 노출(carcinogen exposure)은 조직 내에서 확산성 상피 손상(diffuse epithelial injury) 및 돌연변이된 세포의 클론 증식(clonal proliferation)을 유발한다. 필드 전반에서 이들 유전자 돌연변이(genetic mutation)는 필드 내에서 하나 이상의 전악성(premalignant) 또는 악성(malignant) 병소가 발생할 가능성을 증가시킨다. 다단계 발암에서는 이들 유전적 변형과 표현형적 변형이 단계별로 축적된다. 다단계 발암에서 하나 이상의 단계를 중지시키면, 암의 발생이 방해되거나 예방될 수 있다(참조: Tsao et al., CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004)).
아주린 및 다른 쿠프레독신은 암 세포에 대하여 특이적인 세포독성을 나타낸다. 아주린은 J774 폐암 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다(Yamada et al., PNAS 99(22):14098-14103 (2002)). J774 폐암 세포 내로 침입후, 아주린은 시토졸(cytosol)과 핵 분획물(nuclear fraction) 내에 집중되고 종양 억제 단백질(tumor suppressor protein) p53과 복합체를 형성하여 이를 안정화시키고 이의 세포내 수준을 강화시킨다(Id). 아주린-매개된 아폽토시스의 유도는 J774 세포에 국한되지 않는다. 아주린은 또한, 인간 흑색종 UISO-Mel-2 또는 인간 유방암 MCF-7 세포와 같은 암 세포를 침입할 수 있다(Yamada et al., Infect Immun. 70:7054-7062 (2002); Punj et al., Oncogene. 23:2367-2378 (2004)). 양쪽 사례에서, 아주린은 세포내 p53 수준의 상승을 가능하게 하여 이들 세포에서 강화된 Bax 형성과 아폽토시스 유도를 이끌어냈다. 흥미롭게도, 이종이식된 Mel-2 또는 MCF-7 인간 암을 보유하는 누드 생쥐(nude mice)에 아주린의 복강내 주입(intraperitoneal injection)은 이들 암의 통계학적으로 유의한 퇴행을 유도하였다(Id).
유선(mammary gland)의 호르몬-유도된 구조적 분화(structural differentiation) 및 유선 내에서 DMBA-유도된 전암성(preneoplastic) 증식 성(hyperplastic) 폐포성 결절(alveolar nodule)-유사 병소의 발생에 대한 잠재적 화학예방제의 저해 효과(inhibitory effect)를 평가하기 위하여 생쥐 유선 기관 배양액(mouse mammary gland organ culture, MMOC) 검사가 이용될 수 있다. 어린 처녀 동물로부터 유선은 인슐린(insulin, I) + 프로락틴(prolactin, P) + 알도스테론(aldosterone, A)의 존재에서 6일 동안 배양되면, 완전히 성장된 선으로 분화될 수 있다. 이들 선은 임신 생쥐로부터 얻은 선과 형태적으로 유사하다. 알도스테론은 에스트로겐(estrogen, E) + 프로게스테론(progesterone, Pg)으로 대체될 수 있다. 배지에 하이드로코르티손(hydrocortisone)(H)의 포함은 유선의 기능적 분화(functional differentiation)를 촉진한다(Mehta and Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501 (1975); Mehta and Moon, Breast Cancer: Treatment and Prognosis 300, 300 (Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986)). 따라서 이러한 배양 시스템(culture system)에서 관찰되는 호르몬-유도된 구조적, 기능적 분화는 동물의 다양한 생리 단계(physiological stage) 동안 관찰되는 호르몬에 대한 반응을 모방한다.
생쥐는 MMOC에서 암 형성 이전에 분명한 전암성 단계를 나타낸다. C3H 생쥐에서 이런 전암성 병소는 뮤린 유방 종양 바이러스에 의해, 또는 DMBA에 의해 BALB/c 생쥐에서 유도된다. 성장 단계(growth phase)의 3일과 4일 사이에 2 ㎍/㎖ DMBA에 선의 노출과 차후에, 인슐린만을 포함하는 배지에서 2-3주 동안 이들 선의 퇴행은 유방 폐포성 병소(mammary alveolar lesion, MAL)의 형성을 유발한다(Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002); Mehta et al., Methods in Cell Science 19:19-24 (1997)). 더 나아가, DMBA-유도된 유방 병소를 포함하는 선으로부터 만들어진, 상피 세포의 동계 숙주(syngeneic host) 내로 이식(transplantation)은 유방 선암종(mammary adenocarcinoma)의 발생을 유발하였다(Telang et al., PNAS 76:5886-5890 (1979)). 병리학적으로, 이들 종양은 동일 계통의 생쥐에 DMBA가 투여될 때 생체내에서 관찰된 것들과 유사하였다(Id).
MMOC에서 DMBA-유도된 유방 병소 형성은 레티노이드(retinoid)와 같은 다양한 분류의 화학예방제에 의해 저해될 수 있다. 이들 작용제에는 천연 산물로부터 유래된 화학예방제, 예를 들면, 브라씨닌(brassinin)과 레스베레트롤(resveretrol), 티올(thiol), 항산화제(antioxidant), 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase)의 저해물질, 예를 들면, OFMO와 데구엘린(deguelin), 프로스타글란딘 합성(prostaglandin synthesis)의 저해물질, Ca 조절물질 등이 포함된다(Jang et al., Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eur. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Metha et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997)). 이들 연구는 이러한 기관 배양 시스템(organ culture system)이 유방 발암(mammary carcinogenesis)에 대항하는 화합물의 효능을 결정하는 독특한 모형을 제공한다는 것을 분명하게 증명한다. 이들 결과는 이런 화합물의 생체내 투여에 의해 달성되는 저해와 밀접하게 상관할 것으로 예상된다.
MMOC는 또한, 유방관 병소(mammary ductal lesion, MDL)를 형성하도록 유도될 수도 있다. MDL은 알도스테론과 하이드로코르티손 대신에 에스트로겐과 프로게스테론이 배지에 포함되는 경우에 유도될 수 있다. 난소 스테로이드(ovarian steroi)의 존재에서 폐포성 구조(alveolar structure)는 매우 작지만, 조직병리학적 절편(histopathological section)에서 유관 병소(intraductal lesion)가 관찰된다(Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)). 난소 호르몬 의존성(ovarian hormone dependent) ER+ 유방암에 선택적으로 작용하는 안티에스트로겐(antiestrogen), 예를 들면, 타목시펜(tamoxifen)은 MDL 형성을 저해하지만 MAL을 저해하지 못하였다. 따라서 전통적인 MAL 유도 프로토콜 이외에 이러한 변형된 배양 모형이 MAL과 MOL 둘 모두에 대한 화학예방제의 효과를 평가하는데 이용될 수 있다.
전악성 병소의 발생을 저해하는 화학예방제가 필요하다. 이런 화학예방제는 전악성 병소의 최초 발생을 예방하고, 형성되는 전악성 병소에서 세포 사멸(cell death)을 유도하고 및/또는 전악성 병소의 악성 병소로의 발달을 예방할 수 있어야 한다. 이런 화학예방제는 특히, 고위험 특징(feature)의 존재, 전악성 병소의 존재, 또는 이전의 암 또는 전악성 병소로 인하여 암이 발병할 위험이 더욱 높은 환자를 치료하는데 매우 유용할 것이다.
포유동물 세포 내로 단백질의 침입(entry)은 종종, "단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain)" 또는 PTD로 통칭되는, 단백질의 소형 분절(small segment)에 의해 지배된다. 이러한 분절은 포유동물 세포 내로 이런 단백질의 수송을 용이하게 하기 위하여 외래 단백질(foreign protein)에 부착된 신호로서 이용될 수 있다. 가령, 인간 섬유아세포 HS68 또는 뮤린 림프성 백혈병(lymphocytic leukemia) L1210 세포에서 잠재적 항종양 약물로서 DNA-절단 메탈 로포르피린(metalloporphyrin)의 흡수(uptake)를 용이하게 하기 위하여 양쪽성 펩티드(amphipathic peptide)가 이용된다(Chaloin, L. et al. Bioconjugate Chem. 12:691-700, (2001)). 세포-침투 펩티드(cell-penetrating peptide)로 지칭되는 펩티드, 예를 들면, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포르탄(transportan), Tat(아미노산 47-57 또는 48-60)와 모형 양쪽성 펩티드 MAP는 약리학적으로 중요한 물질, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonuclotide), 단백질과 펩티드를 수송하기 위한 전달 운반체(delivery vehicle)로서 이용되고 있다(Hallbrink, M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109 (2001); Lindgren. M., et al. Trends Pharmacol. Sci. 21 :99-103 (2000)).
이런 펩티드, 구체적으로, 안테나페디아(Antennapedia)의 DNA-결합 호메오도메인(homeodomain), 초파리(Drosophila) 전사 인자(transcription factor), 또는 21개 잔기 펩티드 담체 Pep-1은 37℃ 또는 4℃에서, 배양 중인 다양한 유형의 세포, 예를 들면, 인간 HS6S 또는 뮤린 NIH-3T3 섬유아세포에 의해 내재화된다. 온도 이전(temperature shift)의 효과 없음은 고전적인 세포내이입(endocytosis)에서와 상이한 침투 기전(penetration mechanism)을 암시하는데(Morris. M. C. et al. Nature Biotechnol. 19:1173- 1176 (2001)), 이러한 기전은 키랄성 수용체 단백질(chiral receptor protein)을 필요로 한다. 포유동물 세포 내에서 약리학적 활성 화합물을 수송하는데 가장 폭넓게 이용되는 펩티드 중의 하나는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) 1형(HIV-1) 트랜스활성인자(transactivator) 단백질 Tat의 11개 아미노산 아르기닌-풍부 단백질 형질도입 도메인(PTD)이다(Schwarze, S. R. et al. Science 285:1569-1572(1999), Schwarze, S. R. et al. Trends Cell Biol.10:290-295(2000)). 120 kDa 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase)/Tat 융합 단백질(fusion protein)의 복강내 주입은 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier)의 통과를 비롯하여, 생쥐에서 거의 모든 조직으로 이러한 융합 단백질의 관세포 형질도입(transcellular transduction)을 결과한다. HIV-I Tat의 이러한 짧은 펩티드 도메인은 자성 나노입자(magnetic nanoparticle), 파지 벡터(phage vector), 리포솜(liposome)과 플라스미드 DNA를 비롯한 대형 분자 또는 입자의 세포 내재화(cell internalization)를 매개하는 것으로 밝혀졌다. 앞서 언급된 다른 세포-침투 펩티드와 달리, 전장(full length) Tat 또는 이의 11개 아미노산 형질도입 도메인에 의한 적하 화합물(cargo protein)의 내재화는 4℃에서 현저하게 손상되고(Liu. Y. et al. Nat. Med. 6: 1380-1387 (2000); Suzuki, T. et al. J. Biol. Chem. 277:2437-2443 (2002)), 세포 막 황산헤파란 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)의 황산헤파란(heparan sulfate) 사슬과 같은 수용체와의 상호작용을 필요로 한다.
현재까지 확인된 대부분의 PTD는 바이러스와 포유동물 출처로부터 유래되었다. PTD의 다른 출처는 다양한 실험 서열의 설계, 그리고 동물과 인간 요법과 예방적 절차에 바람직할 것이다. PTD의 한 가지 대안적 출처는 세균 세포이다. 세균 단백질, 예를 들면, 콜레라 독소(cholera toxin)가 포유동물 세포 시토졸에 침입하는 것으로 알려져 있긴 하지만(Sofer, A. and Futerman, A.H. J. Biol. Chem. 270: 12117-12122 (1995)), 이들 단백질의 세포독성(cytotoxicity)은 포유동물 세포에서 약리학적으로 중요한 적하를 수송하기 위한 세균 단백질, 또는 이들로부터 유래된 PTD의 용도를 제한하였다.
본 발명의 요약
본 발명은 포유동물 세포, 조직과 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체와 구조적 등가물인 펩티드를 함유하는 조성물에 관계한다. 구체적으로, 이들 조성물은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린, 아주린(P28) SEQ ID NO: 2의 50-77 잔기 영역, 그리고 아주린(p18) SEQ ID NO: 25의 50-67 잔기 영역을 함유한다. 본 발명은 또한, 포유동물 세포, 조직과 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신 및/또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물에 관계한다. 이들 조성물은 특히, 분리된 펩티드 또는 제약학적 조성물이다. 본 발명의 조성물은 포유동물 환자에서 암의 발생을 예방하는 방법에 이용될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이고, 포유동물 조직 내에서 전악성 병소의 발생을 저해할 수 있는 분리된 펩티드에 관계한다. 이러한 쿠프레독신은 아주린(azurin), 슈도아주린(pseudoazurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), Laz, 아우라시아닌(auracyanin), 스텔라시아닌(stellacyanin)과 오이 기초 단백질(cucumber basic protein), 구체적으로, 아주린이다. 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 울바 펄투씨스(Ulva pertussis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르 데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 이러한 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 서열의 일부이거나, 또는 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 서열과 최소한 80% 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다.
일부 구체예에서, 분리된 펩티드는 쿠프레독신의 절두일 수 있다. 이러한 분리된 펩티드는 대략 10개 이상의 잔기 및 대략 100개 이하의 잔기를 보유한다. 이러한 분리된 펩티드는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77 SEQ ID NO:2, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-67 SEQ ID NO:25, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 36-88 SEQ ID NO:26, 또는 SEQ ID NO:20-24를 포함하거나, 또는 대안으로 이러한 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 측면은 제약학적으로 허용되는 담체 내에 최소한 1개 또는 2개의 본 발명의 쿠프레독신 또는 분리된 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물이다. 이러한 제약학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제조된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물 내에서 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 울바 펄투씨스(Ulva pertussis), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택된다.
본 발명의 다른 측면은 포유동물 환자를 치료하는 방법인데, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 환자는 인간이고, 일반 개체군보다 암이 발병할 위험이 더욱 높다. 일부 구체예에서, 암은 흑색종(melanoma), 유방암, 췌장암, 아교모세포종(glioblastoma), 별아교세포종(astrocytoma), 폐암, 결장직장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암 또는 자궁경부암이다. 일부 구체예에서, 환자는 최소한 하나의 고위험 특징을 보유하거나, 전악성 병소를 보유하거나, 또는 암이나 전악성 병소가 치료되었다.
제약학적 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 흡입, 국소 투여, 경피 패치(transdermal patch), 좌약, 유리체 주입(vitreous injection) 또는 경구, 특히, 정맥내 주사로 투여된다. 제약학적 조성물은 최소한 하나의 다른 화학예방제와 함께, 구체적으로, 다른 화학예방제와 거의 동시에 공동-투여된다.
본 발명의 다른 측면은 바이알 내에 본 발명의 제약학적 조성물을 포함하는 키트이다. 이러한 키트는 정맥내 투여용으로 설계된다.
본 발명의 다른 측면은 암의 발생을 조사하는 방법인데, 상기 방법은 포유동 물 세포를 본 발명의 쿠프레독신 또는 펩티드와 접촉시키고, 전악성 세포와 악성 세포의 발생을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 인간 및/또는 유방 세포이다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 전악성 병소가 발생하도록 유도된다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터이다.
본 발명의 다른 측면은 적하 화합물(cargo compound)과 아미노산 서열을 포함하는 복합체에 관계하는데, 상기 아미노산 서열은 쿠프레독신 또는 이의 단편과 최소한 90% 서열 동일성을 갖고, 상기 아미노산 서열 또는 이의 단편은 적하 화합물에 연결되고, 상기 아미노산 서열은 적하 화합물의 포유동물 암 세포로의 침입(entry)을 조장한다. 일부 구체예에서, 상기 복합체의 아미노산 서열은 전장보다 작은 야생형 쿠프레독신(cupredoxin) 또는 H.8 외부 막 단백질에 최소한 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 핵산, 염료, 미립자, 나노입자, 독소, 또는 약물이다. 특정 구체예에서, 적하 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드이고, 이는 융합 단백질을 형성하는 연결된 아미노산 서열이다. 다른 특정 구체예에서, 적하 화합물은 독소, 더욱 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A이다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 검출가능 물질, 더욱 구체적으로, 형광분석법, 검경, X-레이 CT, MRI, 또는 초음파에서 선택되는 방법으로 검출되는 물질이다. 최종적으로, 본 발명은 상기 복합체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약학적 조성물 역시 포괄한다.
본 발명의 또 다른 측면은 적하 화합물을 세포 내로 전달하는 방법에 관계한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 암 환자로부터 유래되고, 상기 환자 내로 재도입된다. 다른 구체예에서, 세포는 암 세포, 더욱 구체적으로, 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 유방암종 세포, 간암종 세포, 방광암종 세포, 또는 전립선암종 세포이다. 다른 구체예에서, 복합체는 치료 효과량으로 환자에 투여된다. 다른 구체예에서, 복합체는 정맥내, 국소, 피하, 근육내, 또는 종양내(intratumor) 투여된다. 다른 구체예에서, 복합체는 다른 암 치료제와 공동-투여된다. 또 다른 구체예에서, RNAi 접근법, 약물 내성(drug resistance), 조혈 유전자 전달(hematopoietic gene transfer), 상동성 재조합(homologous recombination), 리보자임(ribozyme) 기술, 안티센스(antisense) 기술, 종양 면역요법(tumor immunotherapy)과 종양 억제인자(tumor suppressor), 번역 연구, 암 요법, 유전자 전달 시스템(바이러스와 비-바이러스), 항-유전자 요법(anti-gene therapy)(안티센스, siRNA & 리보자임), 아폽토시스(apoptosis); 기전과 요법, 백신 개발, 면역학과 면역요법, 그리고 DNA 합성과 복원이 본 발명의 배경에서 적하 화합물로서 DNA 및/또는 RNA를 전달하는데 이용된다. 특정 구체예에서, 적하 화합물은 안티센스 분자이다.
본 발명의 또 다른 측면은 암을 진단하는 방법에 관계한다. 일부 구체예에서, 검출가능 물질인 적하 화합물과의 복합체가 암 환자에 투여되고, 적하 화합물의 위치가 검출된다. 특정 구체예에서, 적하 화합물은 X-레이 조영제(contrast agent)이고 X-레이 CT에 의해 검출된다; 또는, 적하 화합물은 자기 공명 영상 조영제이고, MRI에 의해 검출된다; 또는 적하 화합물은 초음파 조영제이고, 초음파에 의해 검출된다. 다른 구체예에서, 세포가 검출가능 물질과의 복합체와 접촉되고, 적하 화합물의 위치가 검출된다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 복합체를 포함하는 키트에 관계한다. 일부 구체예에서, 키트는 제약학적으로 허용되는 어쥬번트 또는 부형제를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 반응물의 투여를 위한 운반제(vehicle)를 추가로 포함한다.
본 발명의 이와 같은 측면, 이점과 특징은 아래의 도면 및 특정한 구체예의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
서열에 관한 간단한 설명
SEQ ID NO: 1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).
SEQ ID NO: 2. P28, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77의 아미노산 서열(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
SEQ ID NO: 3. 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly).
SEQ ID NO: 4. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌의 아미노산 서열(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys).
SEQ ID NO: 5. 아크로모박터 사이클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린의 아미노산 서열(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn).
SEQ ID NO: 6. 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis)로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser).
SEQ ID NO: 7. 아크로모박터 실로속시단 ssp. 데니트리피칸스(Achromobacter xylosoxidan ssp. denitrificans) I로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn).
SEQ ID NO: 8. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp).
SEQ ID NO: 9. 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.) J로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu Glu).
SEQ ID NO: 10. 수막염균(Neisseria meningitidis) Z2491로부터 아주린의 아미노산 서열(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp).
SEQ ID NO: 11. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys).
SEQ ID NO: 12. 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)로부터 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys).
SEQ ID NO: 13. 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa) 9a5c로부터 아주린의 아미노산 서열(Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly).
SEQ ID NO: 14. 오이(Cucumis sativus)로부터 스텔라시아닌(stellacyanin)의 아미노산 서열(Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser).
SEQ ID NO: 15. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 A의 아미노산 서열(Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn).
SEQ ID NO: 16. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 아미노산 서열(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro).
SEQ ID NO: 17. 오이(Cucumis sativus)로부터 오이 기초 단백질(cucumber basic protein)의 아미노산 서열(Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu).
SEQ ID NO: 18. 임균(Neisseria gonorrhoeae) F62로부터 Laz의 아미노산 서열(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp).
SEQ ID NO: 19. 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린의 아미노산 서열(Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys).
SEQ ID NO: 20. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 아미노산 57 내지 89의 아미노산 서열(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp).
SEQ ID NO: 21. 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 아주린의 아미노산 51-77의 아미노산 서열(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).
SEQ ID NO: 22. 수막염균(Neisseria meningitidis) Laz의 아미노산 89-115의 아미노산 서열(Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).
SEQ ID NO: 23. 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 아주린의 아미노산 52-78의 아미노산 서열(Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp).
SEQ ID NO: 24. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51-77의 아미노산 서열(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp).
SEQ ID NO: 25. p18, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-67의 아미노산 서열(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly)
SEQ ID NO: 26. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36-88의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly).
SEQ ID NO: 27. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36-77의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
SEQ ID NO: 28. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36-89의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser).
SEQ ID NO: 29. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36-128의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).
SEQ ID NO: 30. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 53-70의 아미노산 서열(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys).
SEQ HD NO: 31. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 53-64의 아미노산 서열(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met).
SEQ ID NO: 32. 아미노산 서열 DGXXXXXDXXYXKXXD.
SEQ ID NO: 33. 아미노산 서열 DGXXXXDXXYXKXXD.
도 1에서는 p28과 아주린의 효능에 대하여 모든 선(gland)의 사진을 도시한 다. 도 1A에서는 DMBA-처리된 선에서 폐포성 병소 및 화학예방제와 함께 DMBA로 처리된 선(gland)과의 비교의 대표적인 사진을 도시한다. 도 1B-1G에서는 폐포성 병소의 발생에 대한 p28 효과의 대표적인 사진을 도시한다.
도 2에서는 DMBA-유도된 유방 폐포성 병소에 대한 p28의 효능을 증명하는 그래프를 도시한다.
도 3에서는 유방관 병소의 대표적인 절편과 p28 효과의 사진을 도시한다.
도 4에서는 DMBA-유도된 유방관 병소에 대한 p28의 효능을 증명하는 그래프를 도시한다.
도 5. wt-아주린 내에서 및 wt-아주린 50-77 단백질 형질도입 도메인 내에서 α-나선의 국소위치를 보여주는 다이어그램. 아주린 50-77 도메인 내에서 프롤린 잔기에 의한 3개 아미노산의 치환이 표시된다.
도 6 (a), (b)와 (c). (A) GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질의 구조를 보여주는 다이어그램. gfp 유전자가 gst 유전자의 3'-말단에 도입되고(GST-GFP의 경우에), 이후 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질을 산출하기 위하여 azu 50-77 단편이 gfp 유전자의 3'-말단에 인 프레임(in frame) 결찰되었다. GST-GFP-azu 50-77은 세포 용해질(cell lysate)로부터 단일 융합 단백질로서 정제되었다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE에서 이동시키고 쿠마시에 블루 염색(Coomassie Blue staining)(6(b)) 및 항-아주린 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting)(6(c))으로 검출하였다.
도 7 (a), (b)와 (c). GST-녹색 형광 단백질(GFP)과 GST-GFP-아주린 융합 단백질의 내재화(internalization)를 위한 동역학 연구 결과를 보여주는 다이어그램. 녹색 형광(green fluorescence)은 다양한 농도의 GST-GFP(7(a)) 또는 GST-GFP-azu 50-77(7(b))로 처리된 J774 세포 내에서 37℃에서 1시간동안 평가하였다. 유세포분석법으로 만개의 세포를 분석하였다. (c) GST-GFP-azu 50-77의 내재화의 시간-의존성. J774 세포는 37℃에서 지정된 시간동안 200 ㎍/㎖ GST-GFP-azu 50-77과 함께 배양하고 유세포분석법으로 분석하였다.
도 8 (a), (b)와 (c). (a) GST-GFP 융합에서 앞서 기술된 바와 같이 GST(GST-PEDIII)에 융합된 외독소 A 도메인 III(아미노산 405-613)과 도메인 1b의 일부(아미노산 381-404)를 보여주는 다이어그램. 그 다음, azu 50-77 단편은 PCR을 이용하여 GST-PEDIII(GST-PEDIII-azu 50-77)의 카르복시 말단에 결찰되었다. (b) 이들 융합 단백질은 글루타티온 세파로스(glutathione sepharose) 4B 칼럼 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되고 크기 결정을 위하여 SDS-PAGE에서 이동되었다. (c) PEDIII-매개된 세포독성에 의해 결정되는, UISO-Mel-2 암 세포와 정상 섬유아세포(FBT) 내에서 GST-PEDIII-azu 50-77 융합 단백질의 작용을 보여주는 다이어그램. 지정된 다양한 농도의 GST-PEDIII과 GST-PEDIII-azu 50-77은 24시간동안 UISO-Mel-2와 FBT 세포와 함께 배양하고, 이후 MTT 검사법으로 세포 생존능(cell viability)을 측정하였다.
도 9. UISO-Mel-2 암 세포와 FBT 세포에 대한 GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 단백질의 PEDIII-매개된 세포독성을 보여주는 다이어그램. 지정된 다양한 농도의 GST-PEDIII과 GST-PEDIII-azu 50-77은 24시간동안 UISO-Mel-2와 FBT 세포와 함께 배양하고, 이후 MTT 검사법으로 세포 생존능(cell viability)을 측정하였다.
정의
본 명세서에서, "세포"는 "단일 세포"로서 구체적으로 명시되지 않는 경우에, 상기 용어의 단수와 복수를 모두 포괄한다.
본 명세서에서, "폴리펩티드", "펩티드"와 "단백질"은 동일한 의미로서 이용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 지시한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. "폴리펩티드", "펩티드"와 "단백질"은 당화(glycosylation), 지질 부착(lipid attachment), 황화(sulfation), 글루타민산(glutamic acid) 잔기의 감마-카르복실화(gamma-carboxylation), 하이드록실화(hydroxylation), ADP-리보실화(ribosylation) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 변형 역시 포함한다. 폴리펩티드가 항상 완전하게 선형인 것은 아니다. 가령, 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로써 가지화되고, 일반적으로, 자연적인 가공 현상(natural processing event) 및 자연적으로 발생하지 않고 인간 조작에 의해 유발되는 현상을 비롯한 번역후 현상(post-translation event)의 결과로써 환형(가지화되거나 가지화되지 않음)이다. 환형 폴리펩티드, 가지화된 폴리펩티드와 가지화된 환형 폴리펩티드는 비-번역 자연 과정에 의해, 그리고 전적으로 합성 방법에 의해 합성될 수도 있다.
본 명세서에서, "약리 활성"은 생물계(biological system)에 대한 약물 또는 다른 화학물질의 효과를 의미한다. 화학물질의 효과는 유익(치료)하거나, 또는 유해(독성)하다. 순수한 화학물질 또는 혼합물은 자연 기원(식물, 동물, 또는 광물)이거나, 또는 합성 화합물이다.
본 명세서에서, "전악성(premalignant)"은 전암성(precancerous), 또는 통제 없는 비정상적 세포 분열 이전을 의미한다.
본 명세서에서, "병소(lesion)"는 비정상 조직의 부위를 의미한다.
본 명세서에서, "병리학적 장애(pathological condition)"는 생존 동물 또는 이의 일부분의 정상 상태(normal state)의 손상을 구성하고; 신체 기능의 수행을 교란시키거나 변형하고; 다양한 인자(가령, 영양실조(malnutrition), 산업재해(industrial hazards), 또는 기후), 특정한 감염성 병원체(가령, 벌레, 기생 원충, 세균 또는 바이러스), 생물체의 유전적 결함(가령, 유전적 이형(genetic anomaly)), 또는 이들 인자의 조합에 대응하는, 정상으로부터 해부학적 이탈과 생리학적 이탈을 포괄한다.
본 명세서에서, "장애"는 생존 동물 또는 이의 일부분의 정상 상태의 손상을 구성하고, 신체 기능의 수행을 교란시키거나 변형하는, 정상으로부터 해부학적 이탈과 생리학적 이탈을 포괄한다.
본 명세서에서, "고통받는"은 현재 병리학적 장애의 증상을 나타내고, 관찰가능 증상이 없음에도 병리학적 장애를 앓거나, 병리학적 장애로부터 회복 중이거나, 또는 병리학적 장애로부터 회복된 것을 포괄한다.
본 명세서에서, "화학예방(chemoprevention)"은 암의 위험을 감소시키거나, 또는 암의 발생이나 재발을 지연시키기 위한 약물, 비타민, 또는 다른 작용제의 이용이다.
본 명세서에서, "치료"는 치료하려는 장애 또는 이러한 장애와 연관된 증상의 진행 또는 심각도를 예방, 저하, 중단 또는 반전시키는 것을 포괄한다. 따라서 "치료"에는 적절한 의학적, 치료적 및/또는 예방적 투여가 포함된다. 치료에는 또한, 암과 같은 장애의 발생을 예방하거나 줄이는 것이 포함된다.
본 명세서에서, "세포 성장의 저해"는 세포 분열(cell division) 및/또는 세포 팽창(cell expansion)의 지연 또는 중지를 의미한다. 상기 용어는 세포 발달의 저해 또는 세포 사멸(cell death)의 증가 역시 의미한다.
"치료 효과량"은 치료되는 개체에서 특정한 장애의 발생을 예방, 지연, 중단 또는 반전시키고, 또는 이러한 장애의 기존 증상을 부분적으로 또는 완전하게 완화시키는데 효과적인 양이다. 치료 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위에 속한다.
본 명세서에서, 본 발명의 단백질 또는 다른 세포 산물을 수식하는데 이용되는"실질적으로 순수한"은 예로써, 다른 단백질 및/또는 다른 화합물이 실질적으로 존재하지 않거나 섞이지 않은 형태로 성장 배지 또는 세포 내용물로부터 분리된 단백질을 지시한다. "실질적으로 순수한"은 분리된 분획물의 건물 중량(dry weight)당 최소한 75%의 인자(factor), 또는 최소한 "75% 실질적으로 순수한" 인자를 의미한다. 더욱 적절하게는, "실질적으로 순수한"은 분리된 분획물의 건물 중량당 최소한 85%의 화합물, 또는 최소한 "85% 실질적으로 순수한" 화합물을 지시한다. 가장 적절하게는, "실질적으로 순수한"은 분리된 분획물의 건물 중량당 최소한 95%의 화합물, 또는 최소한 "95% 실질적으로 순수한" 화합물을 지시한다. "실질적으로 순수한"은 본 발명의 합성된 단백질 또는 화합물을 수식하는 데에도 이용될 수 있는데, 여기서 예로써, 이러한 합성 단백질은 합성 반응의 반응물과 부산물로부터 분리된다.
본 명세서에서, 본 발명의 펩티드 또는 화합물과 관련하여 "제약학적 등급(pharmaceutical grade)"은 합성 반응물과 부산물을 비롯한, 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분으로부터 실질적으로 또는 본질적으로 분리되고, 약물로서 이의 활용을 제약하는 성분으로부터 실질적으로 또는 본질적으로 분리된 펩티드 또는 화합물을 지시한다. 가령, "제약학적 등급" 펩티드는 임의의 암종(carcinogen)으로부터 분리된다. 일부 사례에서, "제약학적 등급(pharmaceutical grade)"은 조성물을 환자에 대한 정맥내 투여에 부적합하도록 만드는 임의의 물질로부터 실질적으로 또는 본질적으로 분리된 펩티드 또는 화합물을 명시하기 위하여, 의도된 투여 방법에 의해 수식된다(가령, "정맥내 제약학적 등급"). 가령, "정맥내 제약학적 등급" 펩티드는 SDS와 같은 세정제(detergent) 및 아지드(azide)와 같은 항균제(anti-bacterial agent)로부터 분리된다.
"분리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 물질을 지시한다. 따라서 본 발명에 따른 분리된 펩티드는 가급적, in situ 환경에서 이들 펩티드와 통상적으로 연관되는 물질을 포함하지 않는다. 폴리펩티드의 "분리된" 영역은 이러한 영역이 유래된 폴리펩티드의 전체 서열을 보유하지 않는 영역을 지칭한다. "분리된" 핵산, 단백질, 또는 이의 개별 단편은 뉴클레오티드 염기서열분석(nucleotide sequencing), 제한 절단(restriction digestion), 특정 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis), 핵산 단편에 대한 발현 벡터 내로 서브클로닝(subcloning) 및 실질적으로 순수한 양으로 단백질 또는 단백질 단편의 획득이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에 의한 조작으로 생체내 환경으로부터 실질적으로 이전된다.
본 명세서에서, 펩티드와 관련하여 "변이체(variant)"는 야생형 폴리펩티드와 비교하여, 아미노산이 치환된, 결실된, 또는 삽입된 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 변이체는 야생형 펩티드의 절두(truncation)일 수도 있다. "결실(deletion)"은 야생형 폴리펩티드 내로부터 하나 이상의 아미노산의 제거이고, "절두"는 야생형 폴리펩티드의 한쪽 또는 양쪽 단부로부터 하나 이상의 아미노산의 제거이다. 따라서 변이체 펩티드는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 조작으로 만들어진다. 변이체는 폴리펩티드의 약리 활성 중에서 최소한 일부에는 변화 없이 기본적인 조성이나 특성을 변화시킴으로써 만들어진다. 가령, 아주린의 "변이체"는 전악성 포유동물 세포의 발생을 저해하는 능력을 유지하는 돌연변이된 아주린일 수 있다. 일부 사례에서, 변이체 펩티드는 비-자연 아미노산, 예를 들면, ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기를 이용하여 합성된다(Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)). 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드 또는 이의 일부분과 비교하여 20개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드 또는 이의 일부분과 비교하여 15개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드 또는 이의 일부분과 비교하여 10개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드 또는 이의 일부분과 비교하여 6개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드 또는 이의 일부분과 비교하여 5개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드 또는 이의 일부분과 비교하여 3개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다.
본 명세서에서, "아미노산"은 임의의 자연-발생 또는 비-자연 발생 또는 합성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 모이어티(moiety), 다시 말하면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 탄소 원자, 전형적으로, 1개의 (α) 탄소 원자에 의해 직접적으로 연결된 최소한 하나의 카르복실 잔기와 최소한 하나의 아미노 잔기를 포함하는 임의의 모이어티를 의미한다.
본 명세서에서, 펩티드와 관련하여 "유도체"는 표적 펩티드로부터 유래된 펩티드를 의미한다. 유래(derivation)는 펩티드가 근본적인 활성 중에서 일부를 여전히 유지하도록 하는 상기 펩티드의 화학적 변형을 포함한다. 가령, 아주린의 "유도체"는 예로써, 포유동물 세포에서 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 목적하는 화학적 변형에는 펩티드의 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 황화(sulfation), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 유도체 펩티드는 화학적 화합물, 예를 들면, 다른 펩티드, 약물 분자 또는 다른 치료제 또는 조제약, 또는 검출가능 프로브에 폴리펩티드 또는 이의 단편의 융합체(fusion)일 수도 있다.
본 명세서에서, "아미노산 서열 동일성 비율(%)"은 두 서열을 정렬하는 경우에 후보 서열에서 아미노산 잔기와 일치하는 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 동일성 비율(%)을 결정하기 위하여, 서열은 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 비율(％)을 확보하기 위하여 갭(gap)을 도입한다; 보존성 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. 동일성 비율(％)을 측정하기 위한 아미노산 서열 정렬 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어가 펩티드 서열을 정렬하는데 이용된다. 특정 구체예에서, Blastp(National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD로부터 입수가능)는 long complexity filter, expect 10, word size 3, existence 11, extension 1의 디폴트 파라미터에서 이용된다.
아미노산 서열을 정렬하는 경우에, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 일정한 아미노산 서열 A(또는, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 특정의 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 일정한 아미노산 서열 A)의 아미노산 서열 동일성 비율(%)은 아래와 같이 산정될 수 있다:
아미노산 서열 동일성 비율(%) = X/Y * 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘 정렬에 의해 A와 B의 동일한 정합(match)으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고,
Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다.
아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 비율(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 비율(％)과 일치하지 않을 것이다. 더욱 짧은 서열에 더욱 긴 서열을 비교하는 경우에, 더욱 짧은 서열은 "B" 서열이 될 것이다. 가령, 상응하는 야생형 폴리펩티드에 절두된 폴리펩티드를 비교하는 경우에, 절두된 펩티드는 "B" 서열이 될 것이다.
총론
본 발명에서는 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물 및 포유동물에서 암의 발생을 예방하는 방법을 제시한다. 본 발명에서는 또한, 포유동물에서 암의 발생 또는 암의 재발을 예방하는 능력을 유지하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 제시한다. 가장 구체적으로, 본 발명에서는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린, 또는 아주린의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물 및 환자, 특히, 일반 개체군 보다 암이 발병할 위험이 더욱 높은 환자를 치료하기 위한 이들의 용도를 제시한다. 최종적으로, 본 발명에서는 포유동물 세포, 조직과 동물에서 암의 발생을 조사하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 전악성 병소를 유도하기 전후에 이들을 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물과 접촉시키고, 전악성 및/또는 악성 세포의 발생을 관찰하는 단계를 포함한다.
이전에, 녹농균(P. aeruginosa)에 의해 만들어지는 산화환원 단백질, 쿠프레독신 아주린은 J774 폐암 세포에만 선택적으로 들어가고 정상 세포에는 들어가지 못하며, 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Zaborina et al., Microbiology 146: 2521-2530 (2000)). 아주린은 또한, 인간 흑색종 UISO-Mel-2 또는 인간 유방암 MCF-7 세포 내로 선택적으로 들어가 이들을 사멸시킨다(Yamada et al., PNAS 99:14098-14103(2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378(2004)). 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린은 J774 뮤린 세망세포(reticulum cell) 육종 세포(sarcoma cell) 내로 우선적으로 들어가고, 종양 억제 단백질 p53과 복합체를 형성하여 이를 안정화시키고, p53의 세포내 농도를 강화시키고, 아폽토시스를 유도한다(Yamada et al., Infection and Immunity, 70:7054-7062(2002)). 아주린 분자의 다양한 도메인의 상세한 연구에서, 아미노산 50-77(P28)(SEQ ID NO: 2)은 내부화(internalization) 및 차후의 아폽토시스 활성(apoptotic activity)에 매우 중요한 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain, PTD)을 대표하는 것으로 밝혀졌다(Yamada et al., Cell. Microbial. 7:1418-31, (2005)).
현재, 아주린 및 아주린으로부터 유래된 펩티드, 예를 들면, p28과 P18은 화학예방 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 현재, 아주린과 p28은 생쥐 유선 기관 배양액에서 전악성 전암성 병소의 형성을 예방하는 것으로 알려져 있다. 생쥐 유선 기관 배양 모형에서, 50 ㎍/㎖에서 아주린은 폐포성 병소의 형성을 67% 저해하는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 25 ㎍/㎖에서 p28은 폐포성 병소의 형성을 67% 저해하는 것으로 밝혀졌다(실시예 1 참조). 더 나아가, 50 ㎍/㎖에서 아주린은 유방관 병소의 형성을 79% 저해하는 것으로 밝혀졌고, 25 ㎍/㎖에서 p28은 유방관 병소의 형성을 71% 저해하였다(실시예 1 참조). 공초점 검경(confocal microscopy)과 FAC에서, 아주린과 p28은 정상 뮤린 유방 상피 세포(murine mammary epithelial cell, MM3MG)와 유방 암 세포(4T1)를 침입하는 것으로 밝혀졌다. P28은 또한, 온도, 시간과 농도 의존성 방식으로 인간 배꼽 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에 침입하고 용량-의존성 방식(dose dependent manner)으로, Matrigel®에 도말된 HUVEC의 모세관(capillary tube) 형성을 저해하였다. 또한, 공초점 검경과 FAC에서, p18은 인간 흑색종(Mel-2,7,29), 유방(MCF-7), 난소암(SK-OV3), 췌장(CAPAN-2), 아교모세포종(LN-229), 별아교세포종(CCF-STTG1), 전립선(LN-CAP)과 신장(ACHN-CRL1611) 세포주를 선택적으로 침입하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 이종이식된 흑색종 종양을 보유하는 무흉선 생주 내에서 적외선염(infrared dye)(λem 800nm)로 표지된 p18의 영상은 정상적인 기관과 조직 내에서 축적되지 않으면서 원발성 s.c. 종양과 원위 기관 전이(distant organ metastasis)에서 선택적인 흡수를 분명하게 증명하였다. 이런 이유로, 아주린과 아주린의 변이체는 포유동물 환자에서, 전악성 전암성 병소의 형성 및 암, 특히, 유방암의 발생을 저해하는데 이용될 수 있다.
방사선요법과 화학요법을 비롯한 표준 암 치료 방법은 암 세포의 DNA를 파괴하는 단계를 수반한다. 전형적인 DNA 손상에 대한 세포 반응은 DNA 복원, 세포 주기 중기(cell cycle arrest)와 치사(lethality)의 활성화를 포함한다(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1988). 가령, DNA 이중-가닥 브레이크(double-strand break)의 도입은 결실체, 이동원체(dicentrics), 고리와 후기 가교(anaphase bridge)를 비롯한 치명적인 염색체 변형(chromosomal aberration)을 유발한다(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1994).
종양과 다양한 암 세포에 의한 본 발명의 펩티드의 선택적인 흡수로 인하여, 한 구체예에서 p18을 비롯한 이들 펩티드는 종양과 암 세포 내로 물질을 도입하기 위한 비-바이러스 벡터로서 이용될 수 있는 것으로 알려져 있다. 가령, 본 발명의 펩티드는 암 세포 내로 DNA 또는 RNA 단편 내로 도입하고, 따라서 종양 또는 암 세포에 치료적 DNA 또는 RNA 단편 처리를 제공하는데 이용될 수 있다.
아래에서는 포유동물 암 세포 내로 연계된 분자의 침입을 용이하게 하는 본 발명의 펩티드, 한 구체예에서, p18과 함께 도입될 수 있는 무제한의 전형적인 기술 및/또는 특정 DNA 또는 RNA 단편을 기술한다. 가령, 본 발명은 유전자 요법, RNAi 접근법, 조혈 유전자 전달(hematopoietic gene transfer), 상동성 재조합(homologous recombination), 리보자임(ribozyme) 기술, 안티센스(antisense) 기술, 종양 면역요법(tumor immunotherapy)과 종양 억제인자(tumor suppressor), 번역 연구, 항-유전자 요법(anti-gene therapy)(안티센스, siRNA & 리보자임), 아폽토시스(apoptosis); 면역학과 면역요법, 그리고 DNA 합성과 복원과 함께 이용될 수 있다.
유전자 요법은 외래 유전자, 예를 들면, 종양 억제자 또는 아폽토시스의 유도물질을 이러한 유전자의 발현에 적합한 조건 하에, 암 세포 내로 전달하는 단계를 수반한다. 발현된 유전자 산물은 종양 세포의 성장을 늦추거나, 종양 세포의 전이 능력(metastatic potential)을 저해하거나, 또는 종양 세포를 직접적으로 사멸시킴으로써 종양 세포에 대한 유익한 효과를 공여한다. 역사적으로, 암 유전자 요법의 임상적 효능(clinical effectiveness)은 1) 종양 내에서 치료 유전자 발현의 제어 부재, 그리고 2) 종양에 이런 벡터의 선택적 표적화(selective targeting)에 의해 제한되었다. 본 발명의 화합물은 종양 세포의 선택적 표적화를 해결한다. 게다가, 유전자 발현의 제어를 위한 여러 전략이 제안되었다. 한 가지 전략은 치료 유전자를 조절하는 프로모터(promoter)가 종양-선택적 전사 인자(tumor-selective transcription factor)에 의해 활성화되는 전사 표적화(transcriptional targeting)이다. 실례에는 유방암에서 MUC-I 프로모터와 결장암에서 CEA 프로모터의 이용이 포함된다(Kurihara et al., "Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen," J. Clin. Invest. 106(6): 763-771, 2000; Konishi et al., "Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producing adenocarcinoma," J. Med. Sci., 48(3): 79-89, 1999).
안티센스 기술은 전형적으로, 선택된 유전자에 의해 발현되는 mRNA에 상보적인 세포 내로 핵산 분자의 도입에 의존한다. 안티센스 분자는 전형적으로, mRNA 분자의 번역을 억제하고, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 예방한다. 이러한 안티센스 기술의 변형으로, 유전자의 DNA에 결합하여 삼중 나선(triple helix)을 형성하는 안티센스 분자로 선택된 유전자의 전사를 예방할 수 있다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 한 가지 안티센스 약물(antisense drug)은 G3139(일명, Oblimersen; Genta. Inc., Lexington, MA)이다. 이용될 수 있는 다른 안티센스 분자는 G4460(일명, c-myb 안티센스; Genta, Berkeley Heights, NJ)이다.
RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 기초된 분자 역시 본 발명의 펩티드에 부착될 수 있다. RNAi는 일반적으로, 이중 가닥 RNA("dsRNA"), 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA("shRNA"), 또는 유사한 특성을 갖는 다른 핵산 분자에 의해 매개된다. 이들 핵산 분자는 다이사(Dicer)와 드로셔(Drosha)를 비롯한 세포 효소(cellular enzyme)에 의해 가공되거나, 또는 더욱 작은 조각으로 절단된다. 핵산 분자의 더욱 작은 단편은 이후, mRNA의 변성을 매개하는 단백질 복합체(RISC 복합체)에 의해 흡수될 수 있다. RISC 복합체는 여기에 흡수되는 핵산 분자와 상보성 염기쌍을 형성하는 mRNA를 변성시킬 것이다. 이러한 방식으로, mRNA는 특이적으로 파괴되고, 따라서 인코딩된 단백질이 만들어지는 것을 예방한다.
리보자임 기술은 표적 RNA 분자에 결합하고 이의 선택적 절단(selective cleavage)을 촉진하는 RNA 분자를 발현하는 세포 내로 핵산 분자의 도입에 의존한다. 표적 RNA 분자는 전형적으로, mRNA 분자이지만, 예로써, 레트로바이러스 RNA 분자일 수도 있다.
2회의 유전자-불활성화 현상(gene-inactivating event)(각 대립유전자에 대하여 1회)을 필요로 하는, 상동성 재조합(homologous recombination)에 의한 표적된 유전자 결실 역시 본 발명과 병용될 수 있는 전략이다.
본 발명의 화합물과 공동으로 전달되는 특정 요법은 암 발생에 결정적인 단백질의 발현을 제어할 수 있는 암-특이적 전사 복합체(cancer-specific transcription complex, CSTC)를 지향할 수도 있다. CSTC를 지향하는 암 요법에 관한 교시를 위하여 예로써, 미국 특허 출원 No. 2008/0027002를 참조하는데, 이는 본 명세서에 참조로서 편입된다.
쿠프레독신 사이에 높은 구조적 유사성으로 인하여, 아주린뿐만 아니라 다른 쿠프레독신 역시 포유동물에서 전악성 병소의 형성을 저해할 가능성이 높다. 이들 쿠프레독신은 예로써, 세균 또는 식물에서 발견될 수 있다. 여러 쿠프레독신이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린의 약동학적 활성과 유사한 약동학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 가령, 티오바실루스 페록시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌 역시 대식세포에 침입하여 아폽토시스를 유도할 수 있다(Yamada et al., Cell Cycle 3:1182-1187 (2004); Yamada et al., Cell. Micro. 7:1418-1431 (2005)). 포르미디움 라미노슘(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌과 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린 역시 대식세포에 대하여 세포독성을 나타낸다(U.S. Pat. Pub. No. 20060040269; 2006년 2월 23일 공개). 이런 이유로, 다른 쿠프레독신이 본 발명의 조성물과 방법에 이용될 수 있을 것으로 고려된다. 더 나아가, 포유동물에서 암의 형성을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체와 구조적 등가물 역시 본 발명의 조성물과 방법에 이용될 수 있다. 이들 변이체와 유도체에는 쿠프레독신의 절두, 아미노산의 보존성 치환, 그리고 PEG화(PEGylation)와 α-나선의 전체-탄화수소 스테이플링(all-hydrocarbon stapling)과 같은 단백질 변형이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 조성물
본 발명에서는 포유동물 세포, 조직과 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩티드를 제시한다. 더 나아가, 본 발명에서는 포유동물 세포, 조직과 동물에서 암의 발생을 저해하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 분리된다. 일부 구체예에서, 펩티드는 실질적으로 순수하거나 제약학적 등급이다. 다른 구체예에서, 펩티드는 이러한 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 펩티드로 본질적으로 구성되는 조성물 내에 존재한다. 다른 특정 구체예에서, 펩티드는 비-항원성이고, 포유동물, 더욱 바람직하게는, 인간에서 면역 반응을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 전장 이하의 쿠프레독신이고, 쿠프레독신의 약리 활성 중에서 일부를 유지한다. 구체적으로, 일부 구체예에서, 펩티드는 생쥐 유선 기관 배양액에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 능력을 유지한다.
본 발명에서는 또한, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 최소한 하나의 펩티드를 함유하는 조성물, 구체적으로, 제약학적 조성물을 제시한다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 경구(oral), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 특정한 투여 방식에 적합하도록 설계된다. 이들 조성물은 물에서 수화되거나, 또는 후기 수화(hydration)를 위하여 건조된다(가령, 냉동 건조(lyophilization)에 의해). 이들 조성물은 물 이외의 용매, 예를 들면, 알코올에 용해될 수도 있다.
본 발명은 또한, 포유동물 세포, 조직과 동물에서 암 세포 및/또는 종양을 선택적으로 침입하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩티드를 함유하는 조성물을 제시한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO. 25를 갖는 p18이다. 일부 구체예에서, 펩티드는 p18의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이다. 일부 구체예에서, 조성물은 DNA 또는 RNA에 결합된 p18이다. 일부 구체예에서, DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부이다. 일부 구체예에서, DNA 또는 RNA는 전달되면 치료 효과를 나타낸다.
쿠프레독신 사이에 높은 구조적 상동성으로 인하여, 쿠프레독신은 아주린과 P28과 동일한 화학예방 특성을 보유할 것으로 고려된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신에는 아주린, 슈도아주린, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 아우라시아닌, 스텔라시아닌, 오이 기초 단백질, Laz 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 구체예에서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa); 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis); 아크로모박터 실로속시단 ssp. 데니트리피칸스(Achromobacter cycloclastes ssp denitrificans) I; 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica); 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.); 수막염균(Neisseria meningitidis); 임균(Neisseria gonorrhoeae); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis); 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa); 울바 펄투씨스(Ulva pertussis), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 유래된다. 더욱 특정 구체예에서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 다른 특정 구체예에서, 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-19인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서는 야생형 쿠프레독신과 비교하여 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 서열 변이체인 펩티드를 제시한다. 본 발명의 변이체는 야생형 쿠프레독신의 절두일 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 전장 이하의 야생형 폴리펩티드인 쿠프레독신의 한 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 절두된 쿠프레독신의 10개 이상의 잔기, 15개 이상의 잔기, 또는 20개 이상의 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 절두된 쿠프레독신의 100개 이하의 잔기, 50개 이하의 잔기, 40개 이하의 잔기, 30개 이하의 잔기 또는 20개 이하의 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신은 상기 펩티드, 더욱 구체적으로, 본 발명의 펩티드로서 SEQ ID NO: 1, 3-19에 최소한 70% 아미노산 서열 동일성, 최소한 80% 아미노산 서열 동일성, 최소한 90% 아미노산 서열 동일성, 최소한 95% 아미노산 서열 동일성 또는 최소한 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
특정 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(P28, SEQ ID NO: 2), 아주린 잔기 50-67(P18, SEQ ID NO: 25), 또는 아주린 잔기 36-88(SEQ ID NO: 26)을 포함한다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2), 아주린 잔기 50-67(SEQ ID NO: 25), 또는 아주린 잔기 36-88(SEQ ID NO: 26)로 구성된다. 다른 특정 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 아주린 이외의 쿠프레독신의 등가 잔기(equivalent residue)로 구성된다. 또한, 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2), 또는 아주린 잔기 36-88(SEQ ID NO: 26)과 유사한 약리 활성을 갖는 다른 쿠프레독신 변이체가 설계될 수도 있다. 이를 위하여, 표적 쿠프레독신 아미노산 서열은 BLAST, BLAST2, ALIGN2 또는 Megalign(DNASTAR)을 이용하여 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 서열, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 아미노산 서열 상에서 발견되는 관련된 잔기, 그리고 표적 쿠프레독신 서열 상에서 발견되는 등가 잔기에 정렬되고, 따라서 등가의 펩티드가 설계된다.
본 발명의 한 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 아미노산 57 내지 89(SEQ ID NO: 20)를 최소한 포함한다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 50-67(SEQ ID NO: 25)을 최소한 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 21)을 최소한 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 수막염균(Neisseria meningitidis) Laz의 아미노산 89-115(SEQ ID NO: 22)를 최소한 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 아주린의 아미노산 52-78(SEQ ID NO: 23)을 최소한 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 24)을 최소한 포함한다.
변이체에는 자연적으로 발생하지 않는 합성 아미노산으로 만들어진 펩티드 역시 포함된다. 가령, 비-자연 발생 아미노산은 혈류(bloodstream) 내에서 조성물의 반감기(half-life)를 연장하거나 최적화하기 위하여 변이체 펩티드 내로 통합된다. 이런 변이체에는 D,L-펩티드(부분입체이성질체(diastereomer))(가령, Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40(2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86(2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)); 특수한 아미노산을 보유하는 펩티드(가령, Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84(2004)); 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)이 후행하는 올레핀-보유 비-자연 아미노산(가령, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004)); ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기를 포함하는 펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 쿠프레독신의 유도체이다. 쿠프레독신의 유도체는 펩티드가 근본적인 활성 중에서 일부를 여전히 유지하도록 하는 상기 펩티드의 화학적 변형(chemical modification)이다. 가령, 아주린의 "유도체"는 포유동물 세포, 조직 또는 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 목적하는 화학적 변형에는 펩티드의 탄화수소 스테이플링, 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 황화(sulfation), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 유도체 펩티드는 화학적 화합물, 예를 들면, 다른 펩티드, 약물 분자 또는 다른 치료제 또는 조제약, 또는 검출가능 프로브에 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 융합체(fusion)일 수도 있다. 목적 유도체는 예로써, 원형화된 펩티드(가령, Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78,(2005); DeFreest et al., J. Pept. Res.63(5):409-19(2004)), N-과 C-말단 변형(가령, Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8,(1990)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)이 후행하는 올레핀-보유 비-자연 아미노산의 통합(가령, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004))이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 널리 공지된 여러 방법에 의해, 혈류 내에서 본 발명의 펩티드와 조성물의 반감기가 연장되거나 최적화될 수 있는 화학적 변형을 보유한다.
다른 구체예에서, 펩티드는 쿠프레독신의 구조적 등가물이다. 쿠프레독신과 다른 단백질 사이에 현저한 구조적 상동성을 결정하는 연구의 실례에는 Toth et al., Developmental Cell 1:82-92(2001)가 포함된다. 구체적으로, 쿠프레독신과 구조적 등가물 사이에 현저한 구조적 상동성은 VAST 알고리즘을 이용함으로써 결정된다(Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690(1995)). 특정 구체예에서, 구조적 등가물에 대한 쿠프레독신의 구조적 비교(structural comparison)로부터 VAST p 값은 대략 10-3 이하, 대략 10-5 이하, 또는 대략 10-7 이하이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신과 구조적 등가물 사이에 현저한 구조적 상동성은 DALI 알고리즘을 이용함으로써 결정된다(Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)). 특정 구체예에서, 쌍별 구조적 비교(pairwise structural comparison)에 대한 DALI Z 스코어는 최소한 3.5, 최소한 7.0, 또는 최소한 10.0이다.
본 발명의 조성물의 펩티드는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 및/또는 구조적 등가물 중에서 한 가지 이상일 수 있다. 가령, 이들 펩티드는 PEG화된 아주린의 절두이고, 따라서 변이체와 유도체가 모두 가능하다. 한 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 올레핀-보유 테터(olefin-bearing tether)를 보유하고, 루테늄(ruthenium) 촉매된 올레핀 메타세시스(olefin metathesis)에 의한 전체-탄화수소 "주요소(staple)"가 후행하는 α,α-이중치환된 비-자연 아미노산으로 합성된다(Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walensky et al., Science 305:1466-1470(2004)). 부가적으로, 아주린의 구조적 등가물인 펩티드는 다른 펩티드에 융합되고, 따라서 구조적 등가물과 유도체가 모두 가능한 펩티드를 산출한다. 이들 실례는 본 발명을 예시일 뿐이며 본 발명을 한정하지 않는다. 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 구리에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.
일부 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 녹농균(P. aeruginosa) 아주린, 구체적으로, P28의 약리 활성 중에서 일부를 갖는다. 특정 구체예에서, 쿠프레독신 및 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 유선 세포가 포함되지만 이들 세포에 국한되지 않는 포유동물 세포, 조직 또는 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하거나 예방한다. 본 발명에서는 또한, 포유동물 전악성 병소, 구체적으로, 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종(glioblastoma), 별아교세포종(astrocytoma), 폐암, 결장직장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암, 또는 자궁경부암 세포의 성장을 저해하는 능력을 갖는 쿠프레독신 및 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 제시한다. 암 세포 발생의 저해는 대조 치료(control treatment)와 비교하여 통계학적으로 유의한 전악성 병소 발생의 감소, 또는 증가 속도의 완화이다.
쿠프레독신이 포유동물 세포, 조직 또는 동물, 구체적으로, 유방 세포, 더욱 구체적으로, 생쥐 유선 세포에서 전악성 병소와 궁극적으로, 암의 발생을 저해할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 화학예방 활성을 유지하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 설계하는 것이 가능하다. 이런 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 예로써, 쿠프레독신과 쿠프레독신 유래된 펩티드의 다양한 변이체, 유도체와 구조적 등가물의 "라이브러리(library)"를 만들고, 이후 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 실시예 1에 기술된 전형적인 방법을 이용하여 이들 각각에서 화학예방 활성, 구체적으로, 생쥐 유선 기관 배양액에서 화학예방 활성을 조사함으로써 제조될 수 있다. 화학예방 활성을 갖는 쿠프레독신의 생성된 변이체, 유도체와 구조적 등가물은 아주린 또는 p28 대신에, 또는 아주린 또는 p28에 추가하여 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
일부 특정 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 처리되지 않은 대조로부터 통계학적으로 상이한 정도까지 생쥐 유선 기관 배양액(mouse mammary gland organ culture, MMOC)에서 7,12-디메틸벤즈(a) 안트라센(7,12-dimethylbenz(a) anthracene, DMBA) 유도된 전악성 병소(premalignant lesion)의 발생을 저해한다. 펩티드는 실시예 1, 또는 Mehta et al.. J Natl Cancer Inst 93:1103-1106 (2001)과 Mehta et al., Meth Cell Sci 19:19-24 (1997)에 기술된 바와 같은 MMOC 모형 시스템을 이용함으로써 이러한 활성에 대하여 조사될 수 있다. 암 발생이 저해되는 지를 결정하는 당분야에 널리 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.
일부 특정 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 처리되지 않은 대조로부터 통계학적으로 상이한 정도까지 MMOC의 모형에서 유방 폐포성 병소(mammary alveolar lesion, MAL)의 발생을 저해한다. 일부 특정 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 처리되지 않은 대조로부터 통계학적으로 상이한 정도까지 MMOC 모형에서 유방관 병소(mammary ductal lesion, MDL)의 발생을 저해한다. 펩티드는 실시예 1에 기술된 바와 같이, DMBA에 의해 전악성 병소를 형성하도록 유도된 MMOC 모형 시스템을 이용함으로써 이들 활성에 대하여 조사될 수 있다. MMOC 모형 시스템에서 전악성 병소의 발생 평가는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 구조계측 분석(morphometic analysis), 또는 조직병리학적 분석(histopathological analysis)에 의해 결정될 수 있다.
일부 특정 구체예에서, 이러한 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 포유동물 세포, 조직과 동물에서 암 세포 및/또는 종양을 선택적으로 침입할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 변이체는 p18의 유도체 또는 구조적 등가물이다. 일부 구체예에서, 상기 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 포유동물 세포, 조직과 동물에서 암 세포 및/또는 종양을 선택적으로 침입하고, DNA 또는 RNA를 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부이다. 일부 구체예에서, DNA 또는 RNA는 전달되면 치료 효과를 나타낸다.
쿠프레독신
이들 소형 청동(blue copper) 단백질(쿠프레독신)은 세균 전자 전달 연쇄(electron transfer chain)에 참여하거나, 또는 기능이 알려지지 않은 전자 전달 단백질(10-20 kDa)이다. 구리 이온은 단백질 매트릭스(protein matrix)에 의해서만 결합된다. 구리 주변에 2개의 히스티딘과 1개의 시스테인에 독특한 뒤틀린 삼각형 2차원 정렬은 금속 부위의 매우 고유한 전자 특성 및 강렬한 푸른색을 발생시킨다. 다수의 쿠프레독신이 중간 내지 높은 해상도(resolution)에서 결정학적으로 특성화되었다.
쿠프레독신은 일반적으로, 서열 상동성(sequence homology)이 낮은 반면 구조 상동성(structural homology)이 높다(Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)). 가령, 아주린의 아미노산 서열은 아우라시아닌 B의 아미노산 서열에 31%, 루스티시아닌의 아미노산 서열에 16.3%, 플라스토시아닌의 아미노산 서열에 20.3%, 슈도아주린의 아미노산 서열에 17.3% 동일하다(표 1 참조). 하지만, 이들 단백질의 구조 유사성(structural similarity)은 더욱 현저하다. 아주린 대 아우라시아닌 B의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10-7.4이고, 아주린 대 루스티시아닌의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10-5이고, 아주린 대 플라스토시아닌의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10-5.6이고, 아주린 대 슈도아주린의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10-4.1이다.
모든 쿠프레독신은 8개-가닥 그리스 열쇠 베타-배럴(beta-barrel) 또는 베타-샌드위치(beta-sandwich) 접힘(fold)을 공유하고, 고도로 보존된 부위 구조(site architecture)를 보유한다(De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)). 많은 장쇄 지방족 잔기, 예를 들면, 메티오닌(methionine)과 루이신(leucine)의 존재로 인한 현저한 소수성 패치(hydrophobic patch)가 아주린, 아미시아닌(amicyanin), 시아노박테리아(cyanobacterial) 플라스토시아닌, 오이 기초 단백질 및 정도가 덜하긴 하지만, 슈도아주린과 진핵생물 플라스토시아닌 내에서 구리 부위 주변에 존재한다(Id.). 소수성 패치는 정도가 덜하긴 하지만, 스텔라시아닌과 루스티시아닌 구리 부위 내에서도 관찰되긴 하는데, 하지만 특징이 상이하다(Id.).
VAST 알고리즘을 이용하여, 다른 단백질에 대한 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린(1JZG)의 서열과 구조 정렬
PDB 정렬 길이 1 aa 동일성 % P-값 2 스코어 3 RMSD 4 설명
1AOZ A 2 82 18.3 10e-7 12.2 1.9 아스코르브산 산화효소
1QHQ_A 113 31 10e-7.4 12.1 1.9 아우라시아닌B
1V54 B 1 79 20.3 10e-6.0 11.2 2.1 시토크롬 c 산화효소
1GY2 A 92 16.3 10e-5.0 11.1 1.8 루스티시아닌
3MSP A 74 8.1 10e-6.7 10.9 2.5 운동성 주요 정자 단백질5
1IUZ 74 20.3 10e-5.6 10.3 2.3 플라스토시아닌
1KGY E 90 5.6 10e-4.6 10.1 3.4 ephrinB2
1PMY 75 17.3 10e-4.1 9.8 2.3 슈도아주린
1정렬된 길이: 2개의 구조 사이에 중첩된 C-알파 원자의 동등 쌍(equivalent pair)의 수, 다시 말하면, 3D 중첩을 산정하기 위하여 이용되는 잔기의 수.
2P-VAL: VAST p 값은 확률(probability)로서 표시되는, 비교의 유의성(significance)의 척도(measure)이다. 가령, p 값이 0.001이면, 우연히 이러한 특성(quality)의 매치(match)를 볼 가능성(odds)은 1000 대 1이다. VAST로부터 p 값은 MMDB 데이터베이스 내에 500개의 독립되고 무관한 유형의 도메인이 존재한다는 가정을 이용하여 복수 비교의 효과에 대하여 조정된다. 이렇게 도출된 p 값은 500으로 나눗셈된, 각 도메인 쌍의 쌍별 비교에 대한 p 값에 상응한다.
3스코어: VAST 구조-유사성 스코어(structure-similarity score). 이 숫자는 중첩된 이차 구조 요소의 숫자 및 이러한 중첩의 특성에 관련된다. 더욱 높은 VAST 스코어는 더욱 높은 유사성과 상관한다.
4RMSD: 제곱 평균 제곱근(root mean square) 중첩 잔기(옹스트롬(Angstrom) 단위). 이 숫자는 두 구조의 최적 중첩이후, 동등한 C-알파 원자 사이의 평균 제곱 거리의 제곱근(square root)으로서 산정된다. 주목할 점은 RMSD 수치가 구조적 정렬의 정도에 비례하고, 이러한 크기가 전체 구조 유사성의 서술자(descriptor)로서 RMSD를 이용하는 경우에 고려되어야 한다는 것이다.
5난모세포(oocyte) 성숙에서 에프린 길항제인 것으로 입증된 꼬마선충(C. elegans) 주요 정자 단백질(Kuwabara, Genes and Development, 17:155-161(2003)).
아주린
아주린은 특정 세균에서 전자 전달에 관여하는 쿠프레독신 집단에 속하는 128개의 아미노산 잔기로 구성되는 구리-보유 단백질이다. 아주린에는 녹농균(P. aeruginosa)(PA)(SEQ ID NO: 1), 알칼리게네스 자일로족시단스(Alcaligenes xylosoxidans)와 알칼리게네스 데니트리피칸(Alcaligenes denitrifican)으로부터 유래된 것들이 포함된다(Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-71 (2002)). 이들 아주린 사이에 아미노 서열 동일성이 60-90% 사이에서 변하긴 하지만, 이들 단백질은 강한 구조적 상동성을 나타낸다. 모든 아주린은 그리스 열쇠 모티프를 포함하는 특징적인 β-샌드위치를 보유하고, 단일 구리 원자는 상기 단백질의 동일 영역에 항상 위치한다. 이에 더하여, 아주린은 구리 부위를 둘러싸는 본질적으로 중성의 소수성 패치를 보유한다(Murphy et al.).
플라스토시아닌
플라스토시아닌은 한 분자당 하나의 구리 분자를 보유하고 산화된 형태에서 푸른빛을 띠는 시아노박테리아(cyanobacteria), 조류(algae)와 식물의 가용성 단백질이다. 이들은 엽록소(chloroplast)에서 생성되는데, 여기서 이들은 전자 운반체(electron carrier)로서 기능한다. 1978년에 포플러 플라스토시아닌 구조의 결정이후, 조류(떼목말(Scenedesmus), 파래속(Enteromorpha), 클라미도모나스(Chlamydomonas))와 식물(강낭콩(French bean)) 플라스토시아닌의 구조가 결정학적 방법 또는 NMR 방법으로 결정되었는데, 이러한 포플러 구조는 1.33 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. SEQ ID NO: 3에서는 호열성 시아노박테리아인 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열을 도시한다. 목적하는 다른 플라스토시아닌은 울바 펄투씨스(Ulva pertussia)로부터 유래된다.
조류와 관속 식물(vascular plants)의 플라스토시아닌 사이에 서열 불일치(sequence divergence)(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 62% 서열 동일성)에도 불구하고, 이들 3차원 구조가 보존된다(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 C 알파 위치에서 0.76 Å rms 편차). 구조적 특징에는 8개-가닥 역평행 베타-배럴(beta-barrel)의 한 단부에서 뒤틀린 4배위자리(tetrahedral) 구리 결합 부위, 현저한 네거티브 패치(negative patch), 편평한 소수성 표면(hydrophobic surface)이 포함된다. 구리 부위는 전자 전달 기능을 위하여 최적화되고, 네거티브와 소수성 패치는 생리학적 반응 파트너의 인식에 관여하는 것으로 제안된다. 화학적 변형, 교차-결합과 특정부위 돌연변이 유발 실험은 시토크롬 f와의 결합 상호작용에서 네거티브와 소수성 패치의 중요성을 확증하고, 플라스토시아닌이 관여하는 2가지 기능적으로 중요한 전자 전달 통로의 모형을 확인하였다. 첫 번째 추정 전자 전달 통로는 상대적으로 짧고(대략 4 Å) 소수성 패치 내에 용제-노출된 구리 리간드 His-87을 수반하는 반면, 다른 통로는 더욱 길고(대략 12-15 Å) 네거티브 패치 내에 거의 보존된 잔기 Tyr-83을 수반한다(Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26(1):49-66 (1994)).
루스티시아닌
루스티시아닌은 티오바실루스(Thiobacillus)(현재, 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus))로부터 획득된 청동-보유 단일-사슬 폴리펩티드이다. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 극히 안정한 고도 산화성 쿠프레독신 루스티시아닌(SEQ ID NO: 4)의 산화된 형태의 X-레이 결정 구조는 다파장 비정상 회절(multiwavelength anomalous diffraction)로 결정되었고 1.9 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. 루스티시아닌은 6-개와 7-개 가닥 β-시트로 구성되는 코어 베타-샌드위치 접힘(core beta-sandwich fold)으로 구성된다. 다른 쿠프레독신과 유사하게, 구리 이온은 뒤틀린 4배위자리 내에 정렬된 4개의 보존된 잔기(His85, Cys138, His143, Met148)의 클러스터에 의해 동위(coordination)된다(Walter et al., J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)).
슈도아주린
슈도아주린은 청동-보유 단일-사슬 폴리펩티드 집단이다. 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 획득된 슈도아주린의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5에서 열거된다. 슈도아주린의 X-레이 구조 분석 결과는 슈도아주린이 아주린과의 서열 상동성(sequence homology)이 낮긴 하지만 아주린에 유사한 구조를 갖는다는 것을 보여준다. 2가지 주요한 차이는 슈도아주린과 아주린의 전체 구조 사이에 존재한다. 아주린과 비교하여 슈도아주린에는 2개의 알파-나선으로 구성되는 카르복시 말단 신장이 존재한다. 중간-펩티드 영역에서, 아주린은 슈도아주린에 비하여 연장된 루프를 보유하는데, 루프가 단축되면 짧은 α-나선을 보유하는 플랩(flap)이 형성된다. 구리 원자 부위에서 유일한 주요 차이점은 MET 측쇄의 형태(conformation)와 Met-S 구리 결합 길이인데, 상기 길이는 아주린에서보다 슈도아주린에서 훨씬 짧다.
피토시아닌
피토시아닌(phytocyanin)으로 확인된 단백질에는 오이 기초 단백질, 스텔라시아닌, 마비시아닌(mavicyanin), 우메시아닌(umecyanin), 오이 껍질(cucumber peeling) 쿠프레독신, 피 파드(pea pod)에서 추정 청동 단백질, 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 청동 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 오이 기초 단백질과 피-파드 단백질을 제외하고, 청동 부위에서 통상적으로 관찰되는 축 메티오닌 리간드(axial methionine ligand)가 글루타민(glutamine)으로 치환된다.
아우라시아닌
아우라시아닌 A, 아우라시아닌 B-1과 아우라시아닌 B-2로 명명된 3개의 소형 청동 단백질이 호열성 녹색 활주성 광합성 세균(thermophilic green gliding photosynthetic bacterium) 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 분리되었다. 2가지 B 형태는 당단백질이고 서로 거의 동일한 특성을 갖지만 A 형태와는 상이하다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서, 겉보기 단량체 분자 질량(apparent monomer molecular mass)이 14(A), 18(B-2)과 22(B-1) kDa인 것으로 확인되었다.
아우라시아닌 A의 아미노산 서열은 139개 잔기의 폴리펩티드인 것으로 밝혀졌다(Van Dreissche et al, Protein Science 8:947-957 (1999)). His58, Cys123, His128과 Met132는 이들이 공지된 소형 구리 단백질 플라스토시아닌과 아주린에서처럼 진화적으로 보존된 금속 리간드인 경우에 예상되는 방식으로 일정한 거리를 두고 위치한다. 2차 구조 예측 역시 아우라시아닌이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린 및 포플러 잎으로부터 플라스토시아닌의 베타-배럴 구조와 전반적으로 유사한 베타-배럴 구조를 갖는다는 것을 암시한다. 하지만, 아우라시아닌은 양쪽 소형 구리 단백질 서열 분류의 서열 특징을 모두 갖는 것으로 보인다. 아주린의 공통 서열과의 전반적인 유사성은 플라스토시아닌의 공통 서열과의 유사성과 대체로 동일하다(다시 말하면, 30.5%). 아우라시아닌의 N-말단 서열 영역 1-18은 글리신과 하이드록시 아미노산이 눈에 띄게 풍부하다(Id). 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 A에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15(NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874)를 참조한다.
아우라시아닌 B 분자는 표준 쿠프레독신 접힘을 보유한다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 결정 구조가 조사되었다(Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001)). 부가적인 N-말단 가닥을 제외하고, 상기 분자는 세균 쿠프레독신, 아주린과 매우 유사하다. 다른 쿠프레독신에서처럼, Cu 리간드 중에서 하나는 상기 폴리펩티드의 가닥 4에 위치하고, 다른 3개는 가닥 7과 8 사이의 대형 루프를 따라서 위치한다. 이러한 Cu 부위 기하학은 3개의 후자 리간드 사이에 아미노산 간격(amino acid spacing)을 참고하여 논의된다. 아우라시아닌 B의 결정학적으로 특성화된 Cu-결합 도메인은 아마도, 막-결합된 여러 다른 전자-전달 단백질 내에서 공지된 테터(tether)와 현저한 서열 동일성을 보이는 N-말단 꼬리에 의해 세포질 막의 주변세포질(periplasmic) 부분에 속박된다. B 형태의 아미노산 서열은 McManus et al., J Biol Chem. 267:6531-6540 (1992)에서 제시된다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 B에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16(NCBI Protein Data Bank Accession No. 1QHQA)을 참조한다.
스텔라시아닌
스텔라시아닌은 식물 쿠프레독신의 편재성 집단인 피토시아닌의 하위분류이다. 본 명세서에서 스텔라시아닌의 전형적인 서열은 SEQ ID NO: 14에서 열거된다. 양고추냉이 뿌리로부터 스텔라시아닌인 우메시아닌(umecyanin)(Koch et al., J. Am. Chem. Soc. 127:158-166(2005))과 오이 스텔라시아닌(Hart et al., Protein Science 5:2175-2183(1996))의 결정 구조 역시 공지되어 있다. 상기 단백질은 다른 피토시아닌과 유사한 전체 접힘을 보유한다. ephrinB2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 스텔라시아닌에 현저한 유사성을 갖는다(Toth et al., Developmental Cell1 :83-92(2001)). 스텔라시아닌의 전형적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:14(National Center for Biotechnology Information Protein DataBank Accession No. 1JER)에서 확인된다.
오이 기초 단백질
오이 기초 단백질로부터 전형적인 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO: 17에서 열거된다. 1형 청동 단백질인 오이 기초 단백질(CBP)의 결정 구조는 1.8 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. 상기 분자는 그리스 열쇠 베타-배럴 구조를 보유하는 점에서 다른 청동 단백질과 유사하지만, 상기 배럴이 한 측면에서 개방된다는 점에서 상이하고, "베타-샌드위치(beta-sandwich)" 또는 "베타-타코(beta-taco)"로서 기술된다(Guss et al., J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996)). 이러한 ephrinB2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 오이 기초 단백질에 높은 유사성을 갖는다(50 α 탄소에 대한 rms 편차 1.5 Å)(Toth et al., Developmental Cell 1: 83-92(2001)).
Cu 원자는 결합 길이 Cu-N(His39) = 1.93 Å, Cu-S(Cys79) = 2.16 Å, Cu-N(His84) = 1.95 Å, Cu-S(Met89) = 2.61 Å로, 정상적인 청동 NNSS' 동위(co-ordination)를 갖는다. 이황화 연결, (Cys52)-S-S-(Cys85)는 이러한 분자 구조를 안정화시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이러한 폴리펩티드 접힘은 청동 단백질(피토시아닌)의 부분집합(sub-family) 및 CBP가 높은 서열 상동을 갖는 비-금속단백질(non-metalloprotein)인 돼지풀 알레르겐(ragweed allergen) Ra3에 전형적이다. 현재 피토시아닌으로 확인된 단백질은 CBP, 스텔라시아닌, 마비시아닌, 우메시아닌, 오이 껍질 쿠프레독신, 피 파드에서 추정 청동 단백질과 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 청동 단백질이다. CBP와 피-파드 단백질을 제외하고, 청동 부위에서 통상적으로 관찰되는 축 메티오닌 리간드가 글루타민으로 치환된다. 오이 기초 단백질에 대한 전형적인 서열은 SEQ ID NO: 17(NCBI Protein Data Bank Accession No. 2CBP)에서 확인된다.
이용 방법
본 발명에서는 환자에서 de novo 악성을 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 최소한 하나의 폴리펩티드를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 화학예방 요법은 발암에 관련되는 과정의 교란이 암의 발생을 예방할 것이라는 가정에 기초한다. 쿠프레독신 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린과 절두된 아주린 펩티드 p28은 전악성 병소의 최초 형성을 저해하거나, 또는 현재하는 전악성 병소를 사멸시키거나 이들 병소의 성장을 저해함으로써, 전악성 병소의 발생을 저해하는 것으로 알려져 있다. 이런 이유로, 앞서 기술된 바와 같이, 전악성 병소의 발생을 저해하는 능력을 갖는 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 환자에서 화학예방 요법에 이용될 수 있을 것으로 고려된다. 일부 구체예에서, 이런 환자는 일반 개체군보다 암이 발병할 위험이 더욱 높다. 본 발명의 조성물로 치료에 의해 예방될 수 있는 암에는 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종, 별아교세포종, 폐암, 결장직장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암, 자궁경부암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 환자는 인간이다. 다른 구체예에서, 환자는 인간이 아니다.
이에 더하여, 본 발명에는 암의 발생을 조사하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 발암인자로 유도 전후에, 포유동물 세포를 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물과 접촉시키고, 이들 세포의 발생을 관찰하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 생쥐 유선 세포이고, 다른 구체예에서, 이들 세포는 포유동물에서 악성으로 변하는 다른 세포이다.
일반 개체군보다 암이 발병할 위험이 더욱 높은 환자는 고위험 특징(feature)을 갖는 환자, 전악성 병소를 갖는 환자, 그리고 초기 암이 치유되었거나 전악성 종양이 분명하게 치료되었던 환자이다(참조: Tsao et al., CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004)). 고위험 특징은 환자의 행동적(behavioral), 유전적(genetic), 환경적(environmental) 또는 생리학적(physiological) 인자이다. 환자를 다양한 형태의 암에 쉽게 걸리도록 하는 행동적 인자에는 흡연(smoking), 식이(diet), 알코올 소비(alcohol consumption), 호르몬 대체 요법(hormone replacement therapy), 높은 체질량 지수(body mass index), 미산(nulliparity), 빈랑 나무열매 사용(betal nut use), 빈번한 구강세척액 사용(frequent mouthwash use), 인간 유두종 바이러스(human papillomavirus)에 노출, 유아기와 만성 일광 노출, 어린 연령에서 첫 성관계, 복잡한 성적 파트너, 경구 피임제 사용(oral contraceptive use)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 환자를 다양한 형태의 암에 쉽게 걸리도록 하는 유전적 인자에는 암의 가족력(family history), BRCA1과 BRCA2의 유전자 보균자 상태(gene carrier status), 유방암(breast neoplasia)의 전력(prior history), 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis, FAP), 유전성 비용종성 대장암(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC), 빨간 머리 또는 금발 머리와 검은 피부(fair-skinned) 표현형, 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum), 인종(ethnicity)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 환자를 다양한 형태의 암에 쉽게 걸리도록 하는 환경적 특징에는 라돈(radon), 다환 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbon), 니켈(nickel), 크롬산염(chromate), 비소(arsenic), 석면(asbestos), 클로로메틸 에테르(chloromethyl ether), 벤조피렌(benzo[a]pyrene), 방사선(radiation), 고무 또는 페인트 작업 노출로부터 방향족 아민(aromatic amine)에 대한 노출이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 환자를 다양한 형태의 암에 쉽게 걸리도록 하는 기타 인자에는 기도 폐쇄(airflow obstruction)를 동반하는 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease), 만성 방광 감염(chronic bladder infection), 주혈 흡충증(schistosomiasis), 노령(older age), 면역저하된 상태(immunocompromised status)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
부가적으로, 암이 발병할 위험이 더욱 높은 환자는 특정 종류의 암에 대하여 개발된 다양한 위험 모형(risk model)의 이용으로 결정될 수 있다. 가령, 유방암에 걸리기 쉬운 환자는 특히, Gail 위험 모형(risk model), 또는 Claus 모형을 이용하여 결정할 수 있다(참조: Gail et al., J Natl Cancer Inst 81:1879-1886 (1989); Cuzick, Breast 12:405-411 (2003); Huang et al., Am J Epidemiol 151:703-714 (2000)).
전악성 병소를 갖는 환자는 일반 개체군보다 암이 발병할 위험이 더욱 높다. 환자에서 전악성 병소의 존재는 당업자에게 널리 공지된 다양한 방법으로 결정할 수 있다. 환자가 전악성 병소를 보유하는 지를 결정하기 위하여, 전악성 병소로부터 기원하는 중간 마커(marker) 또는 생물마커(biomarker)가 환자에서 측정될 수 있다. 염색체 비정상(chromosomal abnormality)은 대부분의 암 환자에서 종양 세포 및 인접한 조직학적으로 정상 조직에서 발생한다. 염색체 비정상에서 진행은 전악성 병소에서 침습성 암으로의 표현형 진행(phenotypic progression)과 병행한다(Thiberville et al., Cancer Res. 55:5133-5139 (1995)). 이런 이유로, 암과 연관된 염색체 비정상은 환자에서 전악성 병소를 검출하는 중간 마커로서 이용될 수 있다. 암과 연관된 통상적인 염색체 비정상에는 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), 예를 들면, 3p(FHIT 등), 9p(p16 INK4 , p15 INK4B 와 p19 ARF 의 경우에 9p21), 17p(p53 유전자 등의 경우에 17p13)와 13q(망막모세포종(retinoblastoma) 유전자 Rb 등의 경우에 13q14)에서 대립형질 결실(allelic deletion) 또는 이형접합성 소실(loss of heterozygosity, LOH)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 3p와 9p에서 결실은 흡연 및 폐암의 초기 단계와 연관된다(Mao et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:857-862 (1997)). 3p, 5q, 8p, 17p와 18q에 영향을 주는 결실은 상피 암(epithelial cancer)에서 공통적인 변화이다(참조: Tsao et al., CA Clin. Cancer J. Clin. 54:153 (2004)). 암과 연관된 다른 염색체 돌연변이는 종양유전자(oncogene)를 활성화시키는 돌연변이다. 존재 여부가 중간 마커로서 이용될 수 있는 종양유전자에는 Ras, c-myc, 표피 성장 인자(epidemral growth factor), erb-B2, 사이클린(cyclin) E, D1과 B1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(id. 154).
다른 중간 마커는 전악성 세포와 암 세포에서 상향-조절되는 유전자의 산물이다. 전악성 세포에서 상향-조절되는 유전자의 산물에는 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase) COX-1과 COX-2, 텔로메라아제(telomerase)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 암 세포 및 일부 전악성 세포의 다른 생물마커에는 p53, 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, GFR), 증식 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen, PCNA), RAS, COX-2, Ki-67, DNA 이수성(aneuploidy), DNA 중합효소-α, ER, Her2neu, E-cadherin, RARβ, hTERT, p16 INK4a , FHIT(3p14), Bcl-2, VEGF-R, HPV 감염, LOH 9p21, LOH 17p, p-AKT, hnRNP A2/B1, RAF, Myc, c-KIT, 사이클린 D1, E와 B1, IGF1, bcl-2, p16, LOH 3p21.3, LOH 3p25, LOH 9p21, LOH 17p13, LOH 13q, LOH 8p, hMSH2, APC, DCC, DPC4, JV18, BAX, PSA, GSTP1, NF-kB, AP1, D3S2, HPV 감염, LOH 3p14, LOH 4q, LOH 5p, 방광 종양 항원(bladder tumor antigen, BTA), BTK TRAK(Alidex, Inc., Redmond WA), 요도관 기질 단백질(urinary tract matrix protein) 22, 피브린 분해 산물(fibrin degradation product), 자가분비 이동성 인자 수용체(autocrine motility factor receptor), BCLA-4, 시토케라틴(cytokeratin) 20, 히알루론산(hyaluronic acid), CYFRA 21-1, BCA, 베타-인간 융모성선자극호르몬(beta-human chorionic gonadotropin), 조직 폴리펩티드 항원(tissue polypeptide antigen, TPA)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(id. 155-157).
초기 암이 치유되었거나 전악성 종양이 분명하게 치료되었던 환자 역시 일반 개체군보다 암이 발병할 위험이 더욱 높다. 이차 원발성 종양(primary tumor)은 암의 전력이 있는 개체에서 새로운 원발성 암을 지칭한다. 이차 원발성 종양은 두경부암(head and neck cancer)에서 주요 사망 원인이다(Id. 150). 이차 원발성 종양은 전이(metastasis)와 구별되는데, 전자는 de novo 기원하는 반면, 후자는 기존 종양으로부터 기원한다. 유방암, 두경부암, 폐암과 피부암, 또는 이들 암의 전악성 병소가 치유되었던 환자는 이차 원발성 종양이 발병할 위험이 특히 높다.
쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 당업자에게 널리 공지된 여러 경로에 의해 다양한 섭생(regimen)으로 환자에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가물은 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 또는 흡입에 의해 투여된다. 이들 조성물은 환자에서 암이 발병할 위험이 있는 부위에 이들 펩티드를 전달하는 임의의 수단으로 상기 환자에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 정맥내 투여된다.
한 구체예에서, 이들 방법은 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물의 1 단위 용량(unit dose) 및 다른 화학예방제를 함유하는 조성물의 1 단위 용량을 순차적으로, 거의 동시에, 또는 다른 약물의 투여후 일정한 시간 이내에, 예를 들면, 다른 약물의 투여후 대략 1분 내지 60분 이내에, 또는 다른 약물의 투여후 대략 1시간 내지 12시간 이내에 환자에 공동-투여하는 단계를 포함한다. 목적하는 화학예방제에는 타목시펜(tamoxifen), 아로마타아제 저해물질(aromatase inhibitor), 예를 들면, 레트로졸(letrozole)과 아나스트로졸(anastrozole)(Arimidex®), 레티노이드(retinoid), 예를 들면, N-[4-하이드록시페닐] 레틴아마이드(4-HPR, 펜레티니드(fenretinide)), 비-스테로이드성 소염제(nonsteriodal antiinflammatory agent, NSAID), 예를 들면, 아스피린(aspirin)과 술린닥(sulindac), 셀레콕시브(celecoxib)(COX-2 저해물질), 데플루오로메틸로르니틴(defluoromethylornithin, DFMO), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A 환원효소 저해물질, EKI-785(EGFR 저해물질), 베바시주맙(bevacizumab)(VEGF-수용체에 대한 항체), 세툭시맙(cetuximab)(EGFR에 대한 항체), 레티놀, 예를 들면, 비타민 A, 베타-카로틴(beta-carotene), 13-cis 레티노산(retinoic acid), 이소트레티노인(isotretinoin)과 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), α-토코페롤, 인터페론, 종양분해 아데노바이러스(oncolytic adenovirus) dl1520(ONYX-015), 게피티닙(gefitinib), 에트레티네이트(etretinate), 피나스테리드(finasteride), 인돌-3-카르비놀(indole-3-carbinol), 레스베라트롤(resveratrol), 클로로겐산(chlorogenic acid), 랄록시펜(raloxifene), 올티프라즈(oltipraz) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
암 세포와 종양 내로 화합물의 선택적인 침입을 용이하게 하는 조성물
본 발명은 세포 내로 적하 화합물을 전달하기 위한 방법과 물질에 관계한다. 본 발명에 따른 적하 화합물(cargo compound)의 전달은 적절한 수송 폴리펩티드(transport polypeptide)의 이용으로 달성된다. 본 발명의 한 구체예에서, 적하 화합물은 수송 폴리펩티드에 연결된다. 적절한 수송 펩티드에는 쿠프레독신, 또는 "쿠프레독신 침입 도메인(cupredoxin entry domain)"을 보유하는 쿠프레독신 단편이 포함된다. "쿠프레독신 침입 도메인"은 쿠프레독신이 포유동물 암 세포 내로 침입하기 위하여 요구되는 아미노산 서열을 보유하는 쿠프레독신 단편을 의미한다. 본 발명에 의해 전달되는 적하 화합물에는 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, RNA, DNA와 안티-센스 핵산을 비롯한 핵산, 염료, 형광과 방사능 태그, 미립자 또는 나노입자, 독소, 무기와 유기 분자, 소형 분자, 약제(가령, 화학예방제) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 약물과 독소는 종양 세포를 죽인다.
본 발명의 한 구체예에서, 쿠프레독신은 아주린, 예를 들면, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린(SEQ ID NO: 1)이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신은 특히, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 또는 슈도아주린이다. 특정 구체예에서, 아주린은 특히, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 또는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 유래된다.
한 구체예에서, 적하 화합물은 세포, 예를 들면, 암 세포를 사멸시키거나, 또는 이러한 세포에서 세포 주기 진행을 지연시키기 위하여 전달된다. 이런 암 세포는 예로써, 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 또는 유방, 간, 방광 또는 전립선 암종 세포일 수 있다. 가령, 적하 화합물은 특히, 세포 주기 제어 단백질, 예를 들면, p53; 사이클린(cyclin)-의존성 키나아제 저해물질, 예를 들면, p16, p21 또는 p27; 자살 단백질, 예를 들면, 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 또는 니트로환원효소(nitroreductase); 사이토킨 또는 다른 면역조절 단백질, 예를 들면, 인터루킨 1, 인터루킨 2 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 또는 독소, 예를 들면, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기한 분류의 화합물 중에서 하나의 생물학적 활성 단편이 전달된다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 표적 조직의 영상을 산출하기 위하여 전달된다. 가령, 표적 조직은 암일 수 있고, 적하 화합물은 X-레이 전산화 단층촬영(computed tomography, CT), 자기 공명 영상(MRI), 초음파에 의한 검출을 위한 영상을 산출하는데 통상적으로 이용되는 화합물일 수 있다. 이들 구체예에서, 적하 화합물은 감마선(gamma ray) 또는 양전자 방출 방사성동위원소(positron emitting radioisotope), 자기 공명 영상 조영제(magnetic resonance imaging contrast agent), X-레이 조영제(X-ray contrast agent), 또는 초음파 조영제(ultrasound contrast agent)이다.
본 발명은 또한, 포유동물 암 세포 내로 DNA 또는 RNA를 선택적으로 도입하는 방법에 관계한다. 이런 구체예에서, DNA 또는 RNA는 적하 화합물이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 DNA 또는 RNA에 결합된 p18을 제공하는 단계 및 상기 화합물을 포유동물의 체내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부이다. 일부 구체예에서, DNA 또는 RNA는 포유동물 세포 내로 전달되면 치료 효과를 나타낸다.
쿠프레독신 침입 도메인
본 발명은 연결된 적하가 포유동물 암 세포 내로만 수송되고 비-암 세포로는 수송되지 않도록 하는 단백질 형질도입 도메인을 제시한다. 쿠프레독신 단백질은 연결된 적하의 포유동물 암 세포로의 침입을 조장하는 단백질 형질도입 도메인인 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 일부 구체예에서, 전체 쿠프레독신 단백질은 연결된 적하의 암 세포 내로의 선택적인 수송을 촉진하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연결된 적하를 암 세포 내로 수송하는데 쿠프레독신의 일부가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 전장 이하의 야생형 단백질인 쿠프레독신의 한 영역으로 구성된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 쿠프레독신의 대략 10개 이상의 잔기, 대략 15개 이상의 잔기 또는 대략 20개 이상의 잔기로 구성된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 쿠프레독신의 대략 50개 이하의 잔기, 대략 40개 이하의 잔기 또는 대략 30개 이하의 잔기로 구성된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 쿠프레독신에 최소한 90% 아미노산 서열 동일성, 최소한 95% 아미노산 서열 동일성 또는 최소한 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 아주린 침입 도메인이다. 본 발명의 한 구체예에서, 아주린 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 50 내지 77(SEQ ID NO: 2)을 최소한 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36 내지 77(SEQ ID NO: 27)을 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36 내지 89(SEQ ID NO: 28)를 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 36 내지 128(SEQ ID NO: 29)을 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 50 내지 67(SEQ ID NO: 25)을 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 53 내지 70(SEQ ID NO: 30)을 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 아미노산 53 내지 64(SEQ ID NO: 31)를 최소한 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 이외의 쿠프레독신으로부터 침입 도메인이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 청록색 세균 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌(SEQ ID NO: 3), 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌(SEQ ID NO: 4), 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린(SEQ ID NO: 5), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)로부터 아주린(SEQ ID NO: 21), 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 10), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린(SEQ ID NO: 8), 또는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌(SEQ ID NO: 15와 16)의 단편이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 아미노산 57 내지 89(SEQ ID NO: 20)를 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 21)을 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 수막염균(Neisseria meningitidis) Laz의 아미노산 89-115(SEQ ID NO: 22)를 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 아주린의 아미노산 52-78(SEQ ID NO: 23)을 최소한 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 24)을 최소한 포함한다.
쿠프레독신 침입 도메인의 변형
본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 적하 화합물을 세포 내로 수송하는 능력을 유지하는 변이체를 생산하기 위하여 화학적으로 변형되거나 유전학적으로 조작된다. 가령, 실시예 16에서는 프롤린 잔기가 위치 54, 61, 70에 도입된 녹농균(P. aeruginosa) 아주린은 UISO-Mel-2 세포에 침입하는 능력을 유지한다.
다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 보존된 아미노산 서열 DGXXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO: 32) 또는 DGXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO: 33)를 포함하는데, 여기서 D는 아스파라긴산이고, G는 글리신이고, Y는 티로신이고, K는 리신이고, X는 임의의 아미노산이다.
쿠프레독신 침입 도메인의 변이체는 표준 기술로 합성될 수 있다. 유도체는 직접적으로, 또는 변형이나 부분적인 치환에 의해 고유 화합물로부터 형성된 아미노산 서열이다. 유사체는 고유 화합물과 동일하지는 않지만 유사한 구조를 보유하고 특정 구성요소 또는 측쇄의 측면에서 고유 화합물과 구별되는 아미노산 서열이다. 유사체는 합성되거나, 또는 상이한 진화적 기원으로부터 유래될 수 있다.
변이체는 전장이거나, 또는 유도체 또는 유사체가 변형된 아미노산을 보유하는 경우에 전장이 아니다. 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체에는 예로써, 동일한 크기의 아미노산 서열에서, 또는 상동성 알고리즘(homology algorithm)에 의해 정렬된 서열과 비교하여, 쿠프레독신 침입 도메인과 최소한 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성으로 실질적으로 상동한 영역을 포함하는 분자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2)과 현저한 구조적 유사성을 갖는다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-67(SEQ ID NO: 25)과 현저한 구조적 유사성을 갖는다. 쿠프레독신과 다른 단백질 사이에 현저한 구조적 상동성을 결정하는 연구의 실례에는 Toth et al., Developmental Cell 1:82-92 (2001)가 포함된다. 구체적으로, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체와 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2) 사이에 현저한 구조적 상동성은 VAST 알고리즘을 이용하여 결정된다(Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995)). 특정 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체와 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2)의 구조 비교로부터 VAST p 값은 대략 10-3 이하, 대략 10-5 이하, 또는 대략 10-7 이하이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체와 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2) 사이에 현저한 구조적 상동성은 DALI 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다(Holm & Sander, J. Mol. Biol.233:123-138 (1993)). 특정 구체예에서, 쌍별 구조 비교(pairwise structural comparison)에 대한 DALI Z 스코어는 최소한 3.5, 최소한 7.0, 또는 최소한 10.0이다.
쿠프레독신 침입 도메인에 변형은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-매개된(특정부위) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝(alanine scanning), PCR 돌연변이유발을 이용하여 달성될 수 있다. 특정부위 돌연변이유발(Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-50 (1987)), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 제한 선별 돌연변이유발(restriction selection mutagenesis)(Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)) 또는 다른 공지된 기술을 클론된 DNA에서 수행하여 쿠프레독신 침입 도메인 변이 핵산을 산출할 수 있다. 이에 더하여, 쿠프레독신 침입 도메인과 구조적 유사성을 갖는 침입 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드는 당분야에 널리 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 더 나아가, 야생형이나 변이 쿠프레독신 침입 도메인인 단백질 분자 역시 당분야에 널리 공지된 방법으로 합성될 수 있다.
쿠프레독신 침입 도메인 및 적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인의 복합체를 코딩하는 핵산
다른 측면에서, 본 발명은 적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제시하는데, 여기서 적하 화합물은 단백질 또는 펩티드이다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 당분야에 공지된 기술의 조합으로 제조될 수 있다. 가령, 쿠프레독신 침입 도메인과 적하 화합물에 대한 핵산 서열은 화학적 합성 또는 클로닝에 의해 개별적으로 제조될 수 있다. 이후, 이들 핵산 서열은 리가아제(ligase)로 순차적으로 결찰시켜 목적하는 핵산 분자를 제공한다.
쿠프레독신 침입 도메인을 이용하여 적하 화합물을 전달하는 방법
다수의 아르기닌-풍부한 펩티드는 포유동물 세포막을 통하여 전좌(translocation)되고 단백질 적하 화합물을 이들 세포 내로 수송하는 것으로 알려져 있다(Suzuki, T., et al. J. Biol. Chem. 277:2437-43 (2002)). 가령, HIV Tat 단백질의 짧은 아르기닌-풍부한 11개 아미노산(아미노산 47-57) 분절은 적하 단백질을 포유동물 세포 내로 수송할 수 있다(Schwarze, SR., et al. Trends Cell Biol. 10:290-95 (2000)). 알파-나선 함량(alpha-helical content)을 강화시키고 아르기닌 잔기의 배치를 최적화시키는 합성 침입 도메인은 단백질 형질도입 도메인으로서 강화된 잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌다(Ho, A., et al. Cancer Res. 61:474-77 (2001)). 대조적으로, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린은 단일 아르기닌 잔기를 보유한다. 이런 이유로, 비록 절대적인 것은 아니지만, 이의 침입 양식은 Tat 단백질의 침입 양식과 상이한 것으로 생각된다.
본 발명은 적하 화합물의 세포로의 침입을 조장하는 이들 쿠프레독신 단편의 이용을 포괄한다. 이들 단편은 세포 내로의 침입에 요구되는 이들 단편을 확인하는 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이와 같은 한 가지 방법에서, 쿠프레독신 단편은 마커 물질에 연결되고, 상기 쿠프레독신 단편이 세포로 침입하는 지를 결정하기 위한 검사가 수행된다. 이들 방법은 상기한 쿠프레독신의 적절한 단편을 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 적하 화합물은 쿠프레독신 또는 이의 단편, 예를 들면, 다른 아주린과 아주린-유사 단백질 중에서, 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 1); 청록색 세균 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌(SEQ ID NO: 3); 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌(SEQ ID NO: 4); 또는 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린(SEQ ID NO: 5), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)로부터 아주린의 단편(SEQ ID NO: 21), 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 10), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린(SEQ ID NO: 19), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린(SEQ ID NO: 8), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 A와 B(SEQ ID NO. 15와 16)에 부착된다. 다른 구체예에서, 적하는 쿠프레독신 침입 도메인, 예를 들면, p28(SEQ ID NO: 2) 또는 p18(SEQ ID NO: 25)에 연결된다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 시험관내에서, 탈체에서 또는 생체내에서, 적하 화합물을 세포 내로 전달한다. 가령, 전달은 쿠프레독신 침입 도메인과 적하 화합물의 복합체를 세포 배양물, 예를 들면, 자궁경부 세포검사체(pap smear)에 추가함으로써 시험관내에서 달성된다. 대안으로, 전달은 환자로부터 떼어낸 샘플, 예를 들면, 혈액, 조직 또는 골수에 복합체를 추가하고, 처리된 샘플을 환자로 재도입함으로써 탈체에서 달성된다. 전달은 또한, 환자에 직접적으로 복합체를 투여함으로써 달성된다. 본 발명의 방법은 치료, 예방, 진단 또는 연구 목적으로 이용된다. 본 발명에 의해 전달되는 적하 화합물에는 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 안티-센스 핵산을 비롯한 핵산, 염료, 미립자 또는 나노입자, 독소, 유기와 무기 분자, 소형 분자, 약물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 검출가능 물질, 예를 들면, 녹색 형광 단백질과 같은 형광 물질; 발광 물질; β-갈락토시다아제와 같은 효소; 또는 방사성표지된 또는 비오틴화된 단백질은 검출가능 표현형을 세포에 공여하기 위하여 전달된다. 이와 유사하게, 검출가능 물질, 예를 들면, 형광 물질로 표지된 미립자 또는 나노입자가 전달될 수 있다. 적합한 나노입자의 한 가지 실례는 2002년 5월 7일자 허여된 U.S. Pat. No. 6,383,500에서 확인된다. 이들 검출가능 물질은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 적하 화합물은 X-레이 전산화 단층촬영(CT), 자기 공명 영상(MRI), 초음파 영상 또는 방사성핵종 섬광계수법(radionuclide scintigraphy)에 적합한 검출가능 물질이다. 이들 구체예에서, 적하 화합물은 진단 목적으로 환자에 투여된다. 조영제는 X-레이 CT, MRI, 초음파에 의해 획득되는 영상을 강화시키기 위한 적하 화합물로서 투여된다. 쿠프레독신 침입 도메인을 통하여 종양 조직을 표적하는 방사성핵종 적하 화합물의 투여가 방사성핵종 섬광계수법에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 적하 화합물과 함께 또는 적하 화합물 없이 방사성핵종을 포함한다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 감마선이나 양전자 방출 방사성동위원소, 자기 공명 영상 조영제, X-레이 조영제, 또는 초음파 조영제이다.
적하 화합물로서 적합한 초음파 조영제에는 생체적합성 가스의 미세거품(microbubble), 액상 담체, 계면활성 마이크로스피어가 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 상기 조영제는 표적화 부분과 미세거품 사이에 선택적 연결 모이어티(linking moiety), Ln을 추가로 포함한다. 이런 배경에서, 액상 담체는 수용액을 의미하고, 계면활성제는 용액에서 경계면 장력(interfacial tension)에서 감소를 유도하는 임의의 양쪽친화성 물질을 의미한다. 계면활성 마이크로스피어를 형성하는데 적합한 계면활성제의 목록은 EP0727225A2에서 기술된다. 계면활성 마이크로스피어에는 나노스피어(nanosphere), 리포좀, 소포 등이 포함된다. 생체적합성 가스는 공기, 또는 불화탄소(fluorocarbon), 예를 들면, C3-C5 과플루오르알칸(perfluoroalkane)인데, 이는 에코발생도(echogenicity)에서 차이 및 초음파 영상에서 조영을 제공한다. 상기 가스는 선택적으로, 연결기를 통하여 쿠프레독신 침입 도메인에 부착된 마이크로스피어에 피포 또는 내포된다. 이러한 부착은 공유 결합, 이온 결합 또는 반 데르 발스 결합일 수 있다. 이런 조영제의 구체적인 실례는 복수의 종양 신생혈관 수용체 결합 펩티드, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체(peptidomimetic)를 갖는 지질 피포된 과불화탄소(perfluorocarbon)가 포함된다.
적하 화합물로서 적합한 X-레이 조영제에는 한가지이상의 X-레이 흡수 원자 또는 원자 번호 20 이상의 "중" 원자(heavy atom)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 상기 조영제는 쿠프레독신 침입 도메인과 X-레이 흡수 원자 사이에 선택적 연결 모이어티, Ln을 추가로 포함한다. X-레이 조영제에서 빈번하게 사용되는 중원자는 요오드(iodine)이다. 최근에, 금속 킬레이트로 구성되는 X-레이 조영제(참조: U.S. Pat. No. 5,417,959) 및 복수의 금속 이온으로 구성되는 폴리킬레이트(polychelate)(참조: U.S. Pat. No. 5,679,810)가 보고되었다. 더욱 최근에, 다핵 클러스터 복합체(multinuclear cluster complex)가 X-레이 조영제로서 보고되었다(참조: U.S. Pat. No. 5,804,161, PCT WO91/14460, PCT WO 92/17215).
적하 화합물로서 적합한 MRI 조영제에는 한가지이상의 상자성 금속 이온(paramagnetic metal ion)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 상기 조영제는 쿠프레독신 침입 도메인과 상자성 금속 이온 사이에 선택적 연결 모이어티, Ln을 추가로 포함한다. 상자성 금속 이온은 금속 착화물 또는 금속 산화물 입자의 형태로 존재한다. U.S. Pat. No. 5,412,148과 5,760,191에서는 MRI 조영제에 사용하기 적합한 상자성 금속 이온에 대한 킬레이터(chelator)의 실례를 기술한다. U.S. Pat. No. 5,801,228, U.S. Pat. No. 5,567,411, U.S. Pat. No. 5,281,704에서는 MRI 조영제에 사용하기 적합한 한 가지 이상의 상자성 금속 이온을 복합하는데 유용한 폴리킬란트(polychelant)의 실례를 기술한다. U.S. Pat. No. 5,520,904에서는 MRI 조영제로서 사용하기 적합한 상자성 금속 이온으로 구성되는 미립자 조성물을 기술한다.
다른 구체예에서, 적하 화합물은 세포, 예를 들면, 암 세포를 사멸시키거나, 또는 이러한 세포에서 세포 주기 진행을 지연시키기 위하여 전달된다. 이런 암 세포는 예로써, 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 또는 유방, 간, 방광 또는 전립선 암종 세포일 수 있다. 가령, 적하 화합물은 특히, 세포 주기 제어 단백질, 예를 들면, p53; 사이클린-의존성 키나아제 저해물질, 예를 들면, p16, p21 또는 p27; 자살 단백질, 예를 들면, 티미딘 키나아제 또는 니트로환원효소; 사이토킨 또는 다른 면역조절 단백질, 예를 들면, 인터루킨 1, 인터루킨 2 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 또는 독소, 예를 들면, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기한 분류의 화합물 중에서 하나의 생물학적 활성 단편이 전달된다.
다른 구체예에서, 적하 화합물은 핵산이다. 일부 구체예에서, 핵산은 적하 화합물은 상기한 분류의 화합물 중에서 하나를 코딩한다. 또 다른 구체예에서, 적하 화합물은 암을 치료하는데 사용되는 약물이다. 이런 약물에는 예로써, 5-플루오로우라실(fluorouracil); 인터페론 α; 메토트렉세이트(Methotrexate); 타목시펜(Tamoxifen); 빈크리스틴(Vincristine)이 포함된다. 이들 실례는 설명을 목적으로 제공되며, 많은 다른 화합물이 당업자에게 공지되어 있다. 다른 구체예에서, 핵산은 유전자 요법에 유용하다.
암을 치료하는데 적합한 적하 화합물에는 알킬화제(alkylating agent), 예를 들면, 질소 겨자(nitrogen mustard), 알킬 술포네이트(alkyl sulfonate), 니트로소우레아(nitrosourea), 에틸렌이민(ethylenimine), 트리아젠(triazene); 대사길항물질(antimetabolite), 예를 들면, 엽산염 길항제(folate antagonist), 퓨린 유사체(purine analogue), 피리미딘 유사체(pyrimidine analogue); 항생제, 예를 들면, 안트라사이클린(anthracycline), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin); 효소, 예를 들면, L-아스파라기나아제; 파르네실(farnesyl)-단백질 이전효소 저해물질; 5.알파.-환원효소 저해물질; 17.베타.-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제(hydroxysteroid dehydrogenase) 타입 3의 저해물질; 호르몬제, 예를 들면, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 에스트로겐(estrogen)/항에스트로겐(antiestrogen), 안드로겐(androgen)/항안드로겐(antiandrogen), 프로게스틴(progestin), 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 길항제(luteinizing hormone-releasing hormone) 길항제, 옥트레오티드 아세테이트(octreotide acetate); 미세소관-교란제(microtubule-disruptor agent), 예를 들면, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 또는 이들의 유사체와 유도체; 미세소관-안정화제(microtubule-stabilizing agent), 예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol™), 도세탁셀(docetaxel)(Taxotere™), 이들의 유사체와 같은 탁산(taxane) 및 에포틸론(epothilone) A-F와 이들의 유사체와 같은 에포틸론; 식물-유래된 산물, 예를 들면, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 탁산; 토포아이소머라제(topoisomerase) 저해물질; 프레닐(prenyl)-단백질 이전효소 저해물질; 기타 작용제(miscellaneous agent), 예를 들면, 하이드록시우레아(hydroxyurea), 프로카르바진(procarbazine), 미토탄(mitotane), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 백금 배위 착화물(platinum coordination complex)(가령, 시스플라틴(cisplatin)과 카르보플라틴(carboplatin)); 항암제와 세포독성제로서 사용되는 다른 약물, 예를 들면, 생물 반응 조절제(biological response modifier), 성장 인자(growth factor); 면역조절제(immune modulator)와 면역 항체(monoclonal antibody)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이들 분류의 항암제와 세포독성제의 대표적인 실례에는 메클로레타민 하이드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 이포스파마이드(ifosfamide), 부설판(busulfan), 카르무스틴(carmustin), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 티오테파(thiotepa), 다카르바진(dacarbazine), 메토트렉세이트(methotrexate), 티오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플루다라빈(fludarabine), 펜타스타틴(pentastatin), 클라드리빈(cladribin), 시타라빈(cytarabine), 플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 미토마이신(mitomycin) C, 악티노마이신(actinomycin) D, 사프라신(safracin), 사프라마이신(saframycin), 퀴노카르신(quinocarcin), 디스코데르몰리드(discodermolide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈 주석산염(vinorelbine tartrate), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate), 테니포시드(teniposide), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(tamoxifen), 에스트라무스틴(estramustine), 에스트라무스틴 인산염 나트륨(estramustine phosphate sodium), 플루타마이드(flutamide), 부세렐린(buserelin), 레우프롤리드(leuprolide), 프테리딘(pteridine), 디에네세스(diyneses), 레바미솔(levamisole), 아플라콘(aflacon), 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin), 알데스루킨(aldesleukin), 필그라스팀(filgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 리툭시맙(rituximab), BCG, 트레티노인(tretinoin), 이리노테칸 하이드로클로라이드(irinotecan hydrochloride), 베타메타손(betamethosone), 젬시타빈 하이드로클로라이드(gemcitabine hydrochloride), 알트레타민(altretamine), 토포테카(topoteca), 이들의 유사체 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이들 분류의 선호되는 구성원에서는 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 카르미노마이신(carminomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프테린(methopterin), 미토마이신(mitomycin) C, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 743, 또는 포피로마이신(pofiromycin), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 젬시타빈(gemcitabine), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 포도필로톡신(podophyllotoxin) 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들면, 에포토시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate) 또는 테니포시드(teniposide), 멜팔란(melphalan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 레우로시딘(leurosidine), 빈데신(vindesine), 레우로신(leurosine) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
적하 화합물로서 유용한 항암제와 다른 세포독성제의 실례는 German Patent No. 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/00485에 기술된 에포틸론(epothilone) 유도체; WO 99/24416(참조: U.S. Pat. No. 6,040,321)에 기술된 사이클린 의존성 키나아제(cyclin dependent kinase) 저해물질; WO 97/30992와 WO 98/54966에 기술된 프레닐-단백질 이전효소 저해물질; U.S. Pat. No. 6,011,029(상기 U.S. 특허의 화합물은 특히, 암의 치료에서 임의의 NHR 조절제, 예를 들면, AR 조절제, ER 조절제 또는 LHRH 조절제와 함께, 또는 외과적 거세(surgical castration)와 함께 이용될 수 있다)에 전반적으로/구체적으로 기술된 것들과 같은 작용제 등이다.
본 발명의 화합물과 함께 적하 화합물로서 이용되는 상기한 다른 치료제는 예로써, 의사 약전(Physicians' Desk Reference, PDR)에서 지정되거나 당업자에 의해 결정된 양으로 사용된다.
쿠프레독신 침입 도메인을 함유하는 제약학적 조성물
적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인의 복합체를 함유하는 제약학적 조성물은 임의의 통상적인 방식, 예를 들면, 통상적인 혼합, 분해, 과립화, 당의정-만들기, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 또는 냉동 건조 과정으로 제조될 수 있다. 이러한 복합체는 당분야에 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 쉽게 혼합될 수 있다. 이들 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 형태로 제조를 가능하게 한다. 적절한 부형제에는 예로써, 충전제와 셀룰로오스 조제물이 포함될 수 있다. 다른 부형제에는 예로써, 향료, 착색제, 농후제(thickener), 점증제(detackifier), 그리고 다른 허용되는 첨가제, 어쥬번트 또는 접합제가 포함될 수 있다.
이들 조성물은 예로써, 세포형의 검출이나 영상, 또는 세포 사멸(cell death)과 관련된 질환의 치료 또는 이의 예방에 사용될 수 있다. 이들 조성물은 세포 사멸에 대한 내성과 관련된 질환을 예방하거나 치료할 수 있을 만큼 충분한 양으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서, "세포 사멸에 대한 내성과 관련된 질환"은 숙련된 의사 또는 임상의에 의해 결정되는, 건강한 세포와 비교하여 연장된 세포 수명의 성향으로 최소한 특성화되는 질병, 상태 또는 병을 의미한다. 전형적으로, 숙주 생물은 포유동물, 예를 들면, 인간 또는 동물이다.
쿠프레독신 침입 도메인을 함유하는 조성물의 투여
쿠프레독신 침입 도메인을 함유하는 조성물은 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들면, 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도, 비강, 국소, 경피, 다시 말하면, 경피 또는 비경구(정맥내, 근육내, 피하, 관상동맥내 포함) 투여될 수 있다. 조성물과 이의 제약학적 제제는 의도한 목적을 달성하는 효과량으로 투여될 수 있다. 세포 사멸에 대한 내성과 관련된 질환을 치료하기 위하여 투여되는 경우에, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. "치료 효과량"은 치료되는 개체의 증상 발생을 예방하거나, 또는 기존 증상을 완화시키는 효과량이다. 치료 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위에 속한다.
적절한 용량은 예로써, 사용된 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 화합물, 호스트, 투여 방식, 치료되거나 진단되는 질병의 특성과 심각도에 따라 달라질 것이다. 하지만, 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 인간에서 만족스런 치료 결과는 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 20 ㎎/㎏의 쿠프레독신 침입 도메인 포함 화합물의 일일 용량(daily dosage)에서 달성되는 것으로 지시된다. 한 구체예에서, 인간에서 치료를 위한 지시된 일일 용량은 예로써, 1일 복용량, 1주일 복용량, 1개월 복용량 및/또는 연속 투약으로 편의하게 투여되는 대략 0.7 ㎎ 내지 1400 ㎎ 범위의 쿠프레독신 침입 도메인 포함 화합물이다. 1일 복용량은 1일 1 내지 12회 불연속적으로 투약될 수 있다. 대안으로, 복용량은 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격, 1주일 간격, 이와 유사하게 최대 31일까지 하루씩 증가하여 투약될 수 있다. 투약은 정제, 패치, i.v. 투여 등을 비롯한 임의의 적절한 투약 형태를 이용한 연속, 간헐적 또는 단일 투약일 수 있다. 더욱 구체적으로, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 효과량은 체중 ㎏당 대략 0.01-20 ㎎/㎏이다. 특정 구체예에서, 용량 수준은 대략 10 ㎎/㎏/day, 대략 15 ㎎/㎏/day, 대략 20 ㎎/㎏/day, 대략 25 ㎎/㎏/day, 대략 30 ㎎/㎏/day, 대략 35 ㎎/㎏/day, 대략 40 ㎎/㎏/day, 대략 45 ㎎/㎏/day 또는 대략 50 ㎎/㎏/day이다.
쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 화합물을 환자에 도입하는 방법은 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것으로 공지된 다른 약물과의 공동-투여이다. 이들 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 화합물은 암을 치료하기 위한 다른 약물을 포함하는 칵테일의 일부이거나, 또는 이들 약물과 공동-투약된다. 이들 약물에는 예로써, 본 명세서에 언급된 것들, 구체적으로, 5-플루오로우라실(fluorouracil); 인터페론 α; 메토트렉세이트(methotrexate); 타목시펜(tamoxifen); 빈크리스틴(vincristine)이 포함된다. 이들 실례는 설명을 목적으로 제공되며, 많은 다른 화합물이 당업자에게 공지되어 있다.
쿠프레독신 침입 도메인, 또는 침입 도메인과 적하 화합물을 통합하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 벡터 내로 삽입되고 유전자 요법 벡터로서 이용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 예로써, 정맥내 주사, 국소 투여(Nabel et al., US Patent No. 5,328,470, 1994. USA), 또는 뇌정위 주사(Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 91, pp 3054-57 (1994))로 개체에 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 제약학적 조제물은 허용가능 희석제를 함유하거나, 또는 유전자 전달 운반체가 삽입된 지연 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로, 완전 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터로부터 원형으로 제조될 수 있는 경우에, 제약학적 조제물은 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 함유할 수 있다.
한 측면에서, 조성물은 DNA로서 전달되고, 복합체가 in situ에서 산출된다. 한 구체예에서, DNA는 예로써 Ulmer et al., Science, Vol.259, pp-1745-49(1993)에서 기술되고 Cohen, Science, vol.259, pp-1691-92(1993)에서 검토된 바와 같이 "나신(naked)"이다. 나신 DNA의 흡수는 DNA를 담체, 예를 들면, 세포 내에 효과적으로 수송되는 생분해가능 비드에 피복하여 증가시킬 수 있다. 이런 방법에서, DNA는 핵산 발현 시스템, 박테리아 발현 시스템, 바이러스 발현 시스템을 비롯한 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템 내에 존재한다. DNA를 이런 발현 시스템 내로 통합하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706, U.S. Pat. No. 5,736,524).
생물체로부터 생물체로 유전 물질을 이동시키는데 사용되는 벡터는 크게 2가지 종류로 세분될 수 있다: 클로닝 벡터(cloning vector)는 적합한 숙주 세포에서 증식에 필수적이지 않고 외래 DNA가 삽입될 수 있는 영역을 보유하는 복제 플라스미드 또는 파지이다; 외래 DNA는 벡터의 구성요소인 것처럼 복제되고 증식된다. 발현 벡터(expression vector)(가령, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 외래 DNA, 예를 들면, 상기 조성물의 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 내로 외래 유전물질을 도입하는데 사용된다. 발현 벡터에서, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 전사하도록 숙주 세포에 신호하는 프로모터와 같은 요소에 작동가능하게 연결된다. 특정 인자에 반응하여 유전자 전사를 조절하는 유도성 프로모터와 같은 일부 프로모터가 특히 유용하다. 조성물 폴리뉴클레오티드를 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결하면, wt-아주린 침입 도메인 조성물 폴리펩티드 또는 단편의 발현을 조절할 수 있다. 고전적인 유도성 프로모터의 실례는 α-인터페론, 열 충격, 중금속 이온, 그리고 스테로이드, 예를 들면, 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990))와 테트라사이클린에 반응하는 프로모터이다. 다른 바람직한 유도성 프로모터는 구조체가 삽입되는 세포에 내인성이 아니지만 유도 인자가 외부로부터 공급되면 이들 세포에서 반응하는 프로모터이다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드이다. 하지만, 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(가령, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스)가 고려된다.
벡터 선택은 사용되는 생물체 또는 세포 및 벡터의 원하는 목적에 좌우된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 전사 종결 서열을 포함한다.
쿠프레독신 침입 도메인-적하 화합물 복합체를 포함하는 키트
다른 측면에서, 본 발명은 포장 또는 용기 내에 (1) 적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인의 복합체를 함유하는 반응물; (2) 제약학적으로 허용되는 어쥬번트 또는 부형제를 함유하는 반응물; (3) 투여용 운반기, 예를 들면, 주사기; (4) 투약설명서 중에서 한 가지 이상을 포함하는 키트를 제시한다. 구성요소 (1)-(4) 중에서 2가지 이상이 동일 용기에서 발견되는 구체예 역시 고려된다.
쿠프레독신, 쿠프레독신 침입 도메인, 쿠프레독신 침입 도메인-적하 화합물 복합체, 또는 이들의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 제약학적 조성물
쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 제약학적 조성물은 임의의 통상적인 방식, 예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-만들기, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 또는 냉동 건조 과정으로 제조될 수 있다. 실질적으로 순수한 또는 제약학적 등급 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 당분야에 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 용이하게 혼합될 수 있다. 이들 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로의 제조를 가능하게 한다. 적절한 담체 또는 부형제에는 예로써, 충전제와 셀룰로오스 제조물이 포함될 수 있다. 다른 부형제에는 예로써, 향료, 착색제, 점증제(detackifier), 농후제(thickener), 그리고 다른 허용되는 첨가제, 어쥬번트 또는 접합제가 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 제조물은 보존제가 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 구체예에서, 제약학적 제조물은 최소한 하나의 보존제를 함유한다. 제약학적 제형(dosage form)에 관한 전반적인 방법은 Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))에서 확인된다.
본 발명에 이용되는 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 주사(가령, 피내, 피하, 근육내, 복강내 등), 흡입, 국소 투여, 좌약, 경피 패치 또는 경구를 비롯한 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 약물 전달 시스템에 관한 전반적인 정보는 Ansel et al.,Id..에서 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 특히, 피하 주사와 정맥내 주사를 위한 주사가능물질(injectible)로서 제조되고 직접 이용될 수 있다. 이러한 주사가능 제제는 특히, 화학예방 요법이 적합한 환자를 치료하는데 유익하게 이용될 수 있다. 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 또한, 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol)과 같은 보호제(protective agent), 또는 유사한 코팅제(coating agent)와의 혼합이후 경구 복용될 수 있다.
주사로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 수용액, 바람직하게는, 생리 적합성 완충제, 예를 들면, Hanks 용액, 링거액, 또는 생리 식염수 내에서 제조된다. 용액은 제제 약물(formulatory agent), 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안으로, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 사용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 발열원 없는 무균수로 구성(constitution)을 위한 분말 형태로 존재한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 어쥬번트(adjuvant) 또는 이러한 펩티드에 의해 자극되는 면역 반응을 강화시키기 위하여 추가되는 임의의 다른 물질을 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 이러한 펩티드에 대한 면역 반응을 저해하는 물질을 함유한다.
정맥액(intravenous fluid)으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 투여하는데 이용되는 정맥액은 결정질(crystalloid) 또는 콜로이드(colloid)로 구성될 수 있다. 본 명세서에서, 결정질은 무기 염 또는 다른 수용성 분자의 수용액이다. 본 명세서에서, 콜로이드에는 젤라틴(gelatin)과 같은 대형 불용성 분자가 포함된다. 정맥액은 무균이다.
정맥내 투여에 이용되는 결정질액(crystalloid fluid)에는 표 2에 기술된 바와 같이, 정상 염수(0.9% 농도에서 염화나트륨 용액), 링거 락테이트(Ringer's lactate) 또는 링거액(Ringer's solution), 물에 녹인 5% 덱스트로스 용액(일명, D5W)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
공통 결정질 용액의 조성
용액 다른 명칭 [Na + ] [Cl - ] [글루코오스]
D5W 5% 덱스트로스 0 0 252
2/3 & 1/3 3.3% 덱스트로스/ 0.3% 염수 51 51 168
반-정상 염수 0.45% NaCl 77 77 0
정상 염수 0.9% NaCl 154 154 0
링거 락테이트* 링거액 130 109 0
*링거 락테이트는 28 mmol/ℓ 락테이트, 4 mmol/ℓ K+와 3 mmol/ℓ Ca2+ 역시 함유한다.
흡입으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 적절한 추진제(propellant), 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오르메탄(trichlorofluoromethane), 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 이용한, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위(dosage unit)는 정량을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예로써, 흡입기 또는 취입기에 이용되는 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 단백질 및 적절한 분말 기부(base), 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제조된다.
국소 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 용액, 겔, 연고, 크림, 젤리, 현탁액 등으로 제조된다. 일부 구체예에서, 투여는 경피 패치에 의해 달성된다. 좌약(가령, 직장 또는 질)으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 통상적인 좌약 기부(suppository base)를 함유하는 조성물 형태로 제조될 수도 있다.
경구 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 이러한 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 당분야에 널리 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 고형 담체, 예를 들면, 만니톨, 락토오스, 스테아르산마그네슘 등이 이용된다; 이들 담체는 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이 치료되는 개체에 의한 경구 섭취용으로 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제조될 수 있도록 한다. 경구 고형 제제, 예를 들면, 분말, 캡슐과 정제에 적합한 부형제에는 충전제(가령, 당), 셀룰로오스 제조물, 과립화제, 접합제 등이 포함된다.
당분야에 널리 공지된 다른 통상적인 담체에는 다가 담체(multivalent carrier), 예를 들면, 세균 캡슐 다당류, 덱스트란 또는 유전자 조작된 벡터 역시 포함된다. 이에 더하여, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 서방 제제는 연장된 기간 동안 이러한 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 방출하는데, 이런 서방 제제가 없는 경우에 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 치료 효과를 유도하거나 강화하기에 앞서, 예로써 프로테아제 및 간단한 가수분해에 의해 개체의 조직으로부터 제거되고 및/또는 분해될 것이다.
본 발명의 펩티드의 혈류에서 반감기는 당업자에게 널리 공지된 여러 방법으로 연장되거나 최적화될 수 있다. 본 발명의 펩티드 변이체에는 포유동물 세포, 조직과 동물에서 전악성 병소의 발생을 저해하는 쿠프레독신의 능력을 유지하면서, 상기 펩티드의 안정성(stability), 고유 활성(specific activity), 혈류 내에서 수명(longevity)을 증가시키고 및/또는 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는 다양한 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 변이체에는 펩티드의 가수분해(hydrolysis)를 감소시키거나, 펩티드의 탈아민화(deamidation)를 감소시키거나, 산화(oxidation)를 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 펩티드의 구조적 안정성(structural stability)을 증가시키거나, 또는 펩티드의 크기를 증가시키는 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 펩티드에는 원형화된 펩티드(circularized peptide)(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), D,L-펩티드(부분입체이성질체)(Futaki et al., J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)), 특수한 아미노산을 보유하는 펩티드(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), N-과 C-말단 변형(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004)), PEG화(PEGylation) 역시 포함된다.
다양한 구체예에서, 제약학적 조성물은 담체와 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산(가령, 글리신), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제, 현탁제, 농후제 및/또는 보존제 포함), 물, 오일, 염수 용액, 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액, 생리 조건을 근사하기 위하여 요구되는 다른 제약학적으로 허용되는 보조 물질(가령, 완충제, 긴장도 조절제(tonicity adjusting agent), 적심제(wetting agent) 등)을 함유한다. 당업자에게 공지된 임의의 담체가 본 발명의 조성물을 투여하는데 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 화합물은 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 내에 피포될 수도 있다. 생물분해성 마이크로스피어 역시 본 발명의 제약학적 조성물에 대한 담체로서 이용될 수 있다. 적절한 생물분해성 마이크로스피어는 예로써, U.S. Patent No. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,942,252에서 기술된다.
이들 제약학적 조성물은 널리 공지된 통상적인 멸균 기술로 멸균되거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 원상태로 포장되거나, 또는 냉동 건조되는데, 이러한 냉동 건조된 제조물은 투여에 앞서 무균 용액과 혼합된다.
쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 투여
쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 제약학적 조성물로서 제조되고, 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들면, 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도(transurethral), 비강, 국소, 경피, 또는 비경구(정맥내, 근육내, 피하, 관상동맥내 포함), 또는 유리체 투여에 의해 투여될 수 있다. 이러한 제약학적 조제물은 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 효과량은 일반적으로, 체중 ㎏당 대략 0.01-20 ㎎/㎏이다.
쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 포함하는 화합물은 단독으로, 또는 다른 활성제 및/또는 적하 화합물과의 조합으로, 암의 예방에 유용하다. 적절한 용량은 예로써, 이용된 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 화합물, 호스트(host), 투여 방식, 잠재적 암의 특성과 심각도에 따라 달라질 것이다. 하지만, 일반적으로, 인간에서 만족스런 결과는 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 20 ㎎의 일일 용량(daily dosage)에서 달성되는 것으로 지정된다. 인간에서 지정된 일일 용량은 예로써, 1일 복용량, 1주일 복용량, 1개월 복용량 및/또는 연속 투약(continuous dosing)으로 편의하게 투여되는 대략 0.7 ㎎ 내지 1400 ㎎ 범위의 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 화합물이다. 1일 복용량은 1일 1회 내지 12회 분리 투약될 수 있다. 대안으로, 복용량은 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격, 1주일 간격, 그리고 이와 유사하게 최대 31일 또는 그 이상까지 하루씩 증가하여 투약될 수 있다. 대안으로, 투약은 패치, i.v. 투여 등을 이용한 연속 투약일 수 있다.
정확한 제제, 투여 경로와 용량은 환자의 상태를 고려하여 담당 의사에 의해 결정된다. 용량과 간격은 치료 효과를 유지할 만큼 충분한 혈장 수준의 활성 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 적하 화합물과 함께 또는 적하 화합물 없이 제공하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다. 일반적으로, 원하는 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 의도된 투여 경로와 표준 제약학적 관례에 따라 선택된 제약학적 담체와의 혼합물로 투여된다.
한 측면에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 DNA로서 전달되고, 이러한 폴리펩티드가 in situ에서 산출된다. 한 구체예에서, DNA는 예로써, Ulmer et al., Science, Vol.259, pp-1745-49(1993)에 기술되고 Cohen, Science, vol.259, pp-1691-92(1993)에서 검토된 바와 같이 "나신(naked)"이다. 나신 DNA의 흡수는 DNA를 담체, 예를 들면, 세포 내로 효과적으로 운반되는 생물분해성 비드 상에 코팅함으로써 증가될 수 있다. 이런 방법에서, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 발현 시스템, 바이러스 발현 시스템을 비롯한 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템 내에 존재한다. DNA를 이런 발현 시스템 내로 통합하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(참조: WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706, U.S. Pat. No. 5,736,524).
생물체로부터 생물체로 유전 물질을 이동시키는데 사용되는 벡터는 크게 2가지 분류로 구분될 수 있다: 클로닝 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 증식에 필수적이고 외래 DNA가 삽입될 수 있는 영역을 보유하는 복제 플라스미드 또는 파지이다; 외래 DNA는 벡터의 구성요소인 것처럼 복제되고 증식된다. 발현 벡터(가령, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 외래 DNA, 예를 들면, 쿠프레독신의 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 내로 외래 유전물질을 도입하는데 이용된다. 발현 벡터에서, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 고도로 전사하도록 숙주 세포에 신호하는 프로모터와 같은 요소에 작동가능하게 연결된다. 특정 인자에 대응하여 유전자 전사를 조절하는 유도성 프로모터와 같은 일부 프로모터가 특히 유용하다. 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물 폴리뉴클레오티드를 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결하면, 특정 인자에 대응하여 쿠프레독신 및 이의 변이체와 유도체의 발현을 조절할 수 있다. 고전적인 유도성 프로모터의 실례는 α-인터페론, 열 충격, 중금속 이온, 그리고 스테로이드, 예를 들면, 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990))와 테트라사이클린에 반응하는 프로모터이다. 다른 바람직한 유도성 프로모터는 이러한 구조체가 도입되는 세포에 내인성이 아니지만 유도 인자(induction agent)가 외부로부터 공급되면 이들 세포에서 반응하는 프로모터이다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드이다. 하지만, 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(가령, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스와 아데노-연관된 바이러스) 역시 고려된다. 이에 더하여, 한 구체예에서, p18을 비롯한 본 발명의 펩티드는 암 세포 또는 종양 내로 치료 화합물을 선택적으로 전달하는 벡터로서 이용될 수 있다.
벡터 선택은 이용되는 생물체 또는 세포 및 벡터의 원하는 목적에 좌우된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 폴리링커 부위(polylinker site), 인헨서 요소, 프로모터와 전사 종결 서열을 포함한다.
쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 포함하는 키트
한 측면에서, 본 발명에서는 포장 또는 용기 내에 (1) 최소한 하나의 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 생물학적 활성 조성물; (2) 추가의 화학예방제; (3) 주사기, 분무기 등과 같은, 생물 활성 조성물을 환자에 투여하는 기구 중에서 한 가지 이상을 포함하는 섭생 또는 키트를 제시한다.
키트가 공급되는 경우에, 조성물의 서로 다른 구성요소는 별개의 용기 내에 포장되고 사용 직전에 혼합될 수 있다. 이들 구성요소의 이와 같은 개별 포장은 활성 구성요소의 기능 상실 없이 장기적인 저장을 가능하게 한다.
키트에 포함되는 반응물은 일정한 용기에 담아 공급함으로써, 서로 다른 구성요소의 수명이 보존되고 용기 물질에 의해 흡수되거나 변화되지 않도록 한다. 가령, 밀봉된 유리 앰풀은 냉동 건조된 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물, 또는 중성의 비-활성 가스, 예를 들면, 질소 하에 포장된 완충제를 포함한다. 앰풀은 임의의 적절한 재료, 예를 들면, 유리, 유기 중합체(가령, 폴리카보네이트, 폴리스트렌 등), 세라믹, 금속, 또는 유사한 반응물을 유지하는데 전형적으로 이용되는 임의의 다른 물질로 구성된다. 적절한 용기의 다른 실례는 앰풀과 유사한 물질로부터 제조되는 단순한 병 및 알루미늄이나 합금과 같은 박을 입힌 내부를 보유하는 덮개이다. 다른 용기에는 검사 튜브, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등이 포함된다. 용기는 무균 접근 포트(access port), 예를 들면, 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 달린 병을 보유한다. 다른 용기는 용이하게 제거가능하고, 제거 이후에 구성요소들이 혼합될 수 있도록 하는 막에 의해 분리되는 2개의 구획(compartment)을 보유한다. 제거가능 막은 유리, 플라스틱, 고무 등이다.
키트에는 사용설명서 역시 제공될 수 있다. 사용설명서는 종이 또는 다른 기질에 인쇄되고 및/또는 전자-판독가능 매체, 예를 들면, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프, 플래시 메모리 장치 등으로 제공될 수 있다. 상세한 사용설명서는 키트에 물리적으로 부착되지 않을 수도 있다; 대신에, 사용자는 이러한 키트의 제조업체 또는 유통업체에 의해 특정된 인터넷 웹 사이트를 안내받거나, 또는 사용설명서를 전자 메일로서 제공받을 수도 있다.
쿠프레독신, 쿠프레독신 침입 도메인, 또는 이들의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 변형
쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 앞서 기술된 바와 같이, 변이체와 유도체를 생산하기 위하여 화학적으로 변형되거나 유전학적으로 조작된다. 이런 변이체와 유도체는 표준 기술에 의해 합성될 수 있다. 쿠프레독신 침입 도메인은 유사하게 변형될 수 있다.
쿠프레독신의 자연-발생 대립형질 변이체 이외에, 전악성 병소의 발생을 저해하는 쿠프레독신의 능력을 현저하게 변화시키지 않는, 인코딩된 쿠프레독신의 아미노산 서열 내에서 변형을 유도하는 변화가 돌연변이에 의해 쿠프레독신 코딩 서열(cupredoxin coding sequence) 내로 도입될 수 있다. "비-필수"아미노산 잔기는 약리 활성의 변화 없이 쿠프레독신의 야생형 서열로부터 변형될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 이런 약리 활성에 필수적이다. 가령, 쿠프레독신 간에 보존되는 아미노산 잔기는 특히, 변형되지 않고, 따라서 "필수"일 것으로 예측된다.
폴리펩티드의 약리 활성을 변화시키지 않는 보존성 치환(conservative substitution)이 달성될 수 있는 아미노산은 당분야에 널리 공지되어 있다. 유용한 보존성 치환은 표 3, "바람직한 치환"에 열거된다. 한 분류의 아미노산이 동일 유형의 다른 아미노산으로 치환되는 보존성 치환은 이런 치환이 화합물의 약리 활성을 물리적으로 변화시키지 않는다면, 본 발명의 범위 내에 속한다.
바람직한 치환
최초 잔기 전형적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val, Leu, Ile Val
Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro, Ala Ala
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr, Phe Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucine Leu
(1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면, β-시트 또는 α-나선 구조, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위 측쇄의 크기에 영향을 주는 비-보존성 치환은 약리 활성을 변화시킬 수 있다. 잔기는 표 4에 열거된 바와 같이, 공통의 측쇄 특성에 기초하여 여러 군으로 구분된다. 비-보존성 치환은 한 분류의 구성원을 다른 분류의 구성원으로 교체하는 과정을 수반한다. 치환은 보존성 치환 부위, 또는 더욱 구체적으로, 비-보존된 부위 내로 도입될 수 있다.
아미노산 분류
분류 아미노산
소수성 Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile
중성 친수성 Cys, Ser, Thr
산성 Asp, Glu
염기성 Asn, Gln, His, Lys, Arg
교란된 사슬 구조 Gly, Pro
방향족 Trp, Tyr, Phe
변이체 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-매개된(특정 부위) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝과 PCR 돌연변이유발을 이용하여 만들 수 있다. 클론된 DNA에서 특정 부위 돌연변이유발(Carter, Biochem J. 237:1-7(1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol., 154:329-50(1987)), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 제한 선별 돌연변이유발(restriction selection mutagenesis)(Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)), 또는 다른 공지된 기술을 수행하여 쿠프레독신 변이체 DNA를 산출할 수 있다.
쿠프레독신의 공지된 돌연변이는 본 발명의 방법에 이용되는 변이체 쿠프레독신을 산출하는 데에도 이용될 수 있다. 가령, 아주린의 C112D와 M44KM64E 돌연변이체는 고유 아주린과 상이한 세포독성 활성과 성장 중지 활성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 이런 변형된 활성은 본 발명의 치료 방법에서 유용할 수 있다.
본 발명의 더욱 완전한 이해는 아래의 구체적인 실시예를 참조함으로써 달성될 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 기술되고, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 형태에서 변화 및 등가물의 치환은 편법으로 간주된다. 본 명세서에서 특정한 용어가 이용되고 있긴 하지만, 이들 용어는 설명을 목적으로 하고 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 본 발명의 다양한 개변이 가능하다.
실시예 1. MMOC 모형에서 DMBA-유도된 유방 병소에 대한 펩티드 P-28의 효과
생쥐 유선 기관 배양액(mammary gland organ culture, MMOC) 모형은 DMBA에 기인한 유방 폐포성 병소(MAL) 또는 유방관 병소(MDL)의 발생에 대항하는 잠재적 화학예방제의 효능 평가를 가능하게 한다. 적절한 배양 조건 하에 DMBA는 배지 내에서 호르몬 환경(hormonal milieu)에 기초하여 MAL 또는 MDL을 형성한다(Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40: 70-74 (2002); Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93: 1103-1106 (2001)). 배양액 내에서 에스트로겐과 프로게스테론-처리된 유선은 유방관 병소가 발생하는 반면, 알도스테론과 하이드로코르티손-처리된 유선은 에스트로겐과 프로게스테론-독립된 폐포성 병소를 형성한다. 발암인자 또는 화학예방제에 노출되지 않은 유선은 성장-촉진 호르몬(growth-promoting hormone)의 부재에서 구조적 퇴행(structural regression)을 겪는 반면, 3일과 4일 사이에 24시간 동안 DMBA로 처리는 호르몬 결핍에 의해 유발된 구조적 퇴행을 예방한다. 이는 유선이 정상적인 호르몬 반응성(hormonal responsiveness)을 상실하고, 발달 과정을 변화시켰기 때문인 것으로 추정된다. 형질전환된 세포를 동계(syngeneic) 생쥐 내로 이식함으로써 유방 선암종(mammary adenocarcinoma)이 발생한다는 것은 이들 억제되지 않은 부위의 전악성 전암성 성격을 증명한다.
유선의 흉부 쌍(thoracic pair)은 각 Balb/c 생쥐로부터 무균 상태로 절제하고, 이들 유선은 여러 군으로 분할하였다. p28의 효과는 배지에서 4가지 상이한 희석도에서 평가하였다. 시험 약물(test agent) 없이 발암인자 처리된 유선은 화학예방제의 부재에서 발생률(percent incidence)을 결정하는 척도로서 기능하였다. 화학예방에 대한 양성 대조(positive control)로서 기능하는 추가 대조가 포함되었다. 아주린은 50 ㎍/㎖ 농도로 배지에 포함되었다. 폐포성 병소(MAL)의 경우에, 염색된 유선은 병소의 발생률(일정한 치료군에서 유선의 총수와 비교하여 임의의 병소를 보유하는 유선)을 평가하였다. 유방관 병소(MDL)의 경우에, 유사한 프로토콜이 채택되었지만, 하기 방법 섹션에서 지시된 바와 같이 호르몬 조합(hormonal combination)이 폐포성 병소와 유방관 병소에서 상이하다. 이들 유선은 포르말린(formalin)에 고정시키고, 이후 조직병리검사를 위하여 처리하였다. 이들 절편은 에오신(eosin)과 헤마톡셀렌(hematoxelene)으로 염색하고 현미경 하에서 평가하였다. 여기서, 대조군과 치료군 사이에 유방관 병소의 다중도(multiplicity)를 비교한다.
기관 배양 절차. 연구에 이용된 실험 동물은 3 내지 4주령의 어린 처녀 BALB/c 암컷 생쥐(Charles River, Wilmington, MA)이었다. 이들 생쥐는 9일 동안 1 ㎍ 에스트라디올-17β + 1 ㎎ 프로게스테론의 피하 주입으로 매일 치료하였다. 이러한 치료는 스테로이드로 이전에 치료되지 않은 동물이 시험관 내에서 호르몬에 반응하지 않기 때문에 반드시 필요하다. 전체 배양 절차는 기존 문헌에서 상세하게 기술된다(Jang et al., Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eu. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997); Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)).
간단히 말하면, 이들 동물은 경추 탈골(cervical dislocation)로 희생시키고, 유선의 흉부 쌍은 실크 라프트(silk raft) 위에서 절제하고, 혈청 없는 Waymouth MB752/1 배지(5-유선/5 ㎖/접시)에서 10일 동안 배양하였다. 상기 배지는 유방 폐포성 병소(MAL)를 유도하는 프로토콜의 경우에, 글루타민(glutamine), 항생제(페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin) 100 unit/㎖ 배지)와 배지 ㎖당 성장-촉진 호르몬, 5 ㎍ 인슐린(I), 5 ㎍ 프로락틴(P), 1 ㎍ 알도스테론(A)과 1 ㎍ 하이드로코르티손(H)으로 보충하였다. 유방관 병소(MDL)의 유도를 위하여, 배지는 5 ㎍/㎖ I, 5 ㎍/㎖ P, 0.001 ㎍/㎖ 에스트라디올 17β와 1 ㎍/㎖ 프로게스테론(Pg)을 포함하였다(Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)). 발암인자, DMBA(2 ㎍/㎖)는 3일과 4일 사이에 배지에 첨가하였다. 본 연구에서, DMBA는 4 ㎎/㎖의 최종 농도(final concentration)로 DMSO에 용해시키고, 50 ㎍ I를 100 ㎖ 배지에 첨가하여 2 ㎍/㎖ 최종 농도를 산출하였다. 대조 접시는 운반제로서 DMSO를 포함하였다.
4일에, DMBA는 새로운 배지에서 유선을 씻어내고 이들을 DMBA가 없는 새로운 배지를 포함하는 새로운 접시에 이전함으로써, 배지로부터 제거하였다. 10일간 배양후, 이들 유선은 I(5 ㎍/㎖) 단독을 포함하는 배지에서 추가로 14일 동안 유지시 켰다. 전체 배양 기간 동안, 이들 유선은 95% O2와 5% CO2 환경 하에 37℃에 유지시켰다. 화학예방제는 첫 10일의 성장-촉진 단계(growth-promoting phase) 동안 배지에 포함되었다. 시험 펩티드 p28은 12.5 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 범위 내에 4가지 농도로 평가되었다. 아주린은 배지 내에서 50 ㎍/㎖로 평가되었다. 상기 펩티드는 무균수(sterile water)에 용해시키고 사용에 앞서 여과하였다. 배지는 주3회 교체하였다(월요일, 수요일과 금요일). 노출의 종결 시점에서, 이들 유선은 포르말린에 고정시켰다.
결과는 카이-제곱 분석(Chi-square analysis)과 피셔의 정확 검정(Fisher's Exact Test)으로 분석하였다.
MAL의 구조계측 분석. MAL의 검사를 위하여, 유선은 알룸 카민(alum carmine)에 염색시키고, 병소의 존재를 평가하였다. 이들 유선은 유방 병소의 존재 또는 부재, 각 유선(gland)에서 병소의 심각도 및 약물의 독성에 대한 스코어를 기록하였다. 자일렌(xylene)에 보관된 유선은 해부 현미경(dissecting microscope) 하에서 각 유선에 대한 유방 병소의 존재 또는 부재, 발생률과 심각도를 평가하였다. 유선은 유방 병소에 대하여 양성 또는 음성으로 스코어를 기록하고, 발생률은 각 군에서 유선의 총수에 대한 병소를 나타내는 유선의 비율로서 결정되었다. 화학예방제 처리에 기인한 유관의 확장(dilation) 또는 유방 구조의 붕괴는 독성 효과로서 간주되었다. 발생률에 대한 데이터는 통계학적 분석(statistical analysis)을 수행하여 잠재적 화학예방제의 효능을 결정하였다.
도 1A에서는 DMBA 처리된 유선에서 폐포성 병소 및 화학예방제과 함께 DMBA로 처리된 유선과의 비교의 대표적인 사진을 도시한다. 폐포성 병소의 발생에 대한 p28의 효과는 도 1B-1F에 도시되고 도 2에 요약된다. 펩티드 p28은 25 ㎍/㎖ 농도에서 MAL 형성을 67% 저해하였다. 최대 100 ㎍/㎖까지 증가하는 농도는 상기 펩티드의 효능을 강화시키지 못하였다. 상기 펩티드와 아주린의 비교는 p28이 MAL 발생에 대하여 아주린만큼 효과적이라는 것을 암시하였다. 50 ㎍/㎖ 농도에서 아주린은 67% 저해를 결과하였다. 통계학적 분석에서, p28의 효과는 12.5 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 DMBA 대조와 비교하여 통계학적으로 유의한 것으로 밝혀졌다(p<0.01, 피셔의 정확 검증; 카이 제곱 분석).
MDL의 조직학적 평가. MDL의 경우에, 유선은 조직병리학적 평가를 위하여 처리하였다. 이들 유선은 5-마이크론 절편으로 세로로 절단하고, 에오신 헤마톡셀린(eosin hematoxeline)으로 염색하였다. 각 유선의 세포 절편은 여러 필드(field)로 분할하고, 각 필드는 유방관 병소를 평가하였다(Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)). 간단히 말하면, 전체 유선은 스코프(scope) 하에서 평가한다; 더욱 작은 유선은 더욱 큰 유선과 비교하여 더욱 적은 총 필드(total field)를 보유할 것이다. 따라서 각 유선은 가변적인 숫자의 필드를 보유할 것이다. 종종, 유관을 통한 절편의 숫자 역시 유선마다 상당히 다르다. 이는 각 군으로부터 가변적인 숫자를 결과한다. 유관 이상증식(hyperplasia) 또는 비정형(atypia)을 포함하는 필드를 결정하고, 각 유선에서 평가된 필드의 총수와 비교하였다. 이러한 이상증식 또는 비정형과 심각하게 폐색된 유선은 구별되지 않는다. 이러한 조 직학적 패턴(histological pattern)을 포함하는 필드는 병소에 대하여 양성으로 간주되었다. 치료군은 심각도에 대하여 대조군과 비교하고, 저해 비율(percent inhibition)을 산정하였다.
도 3에서는 대표적인 유방관 병소를 도시한다. DMBA는 이상증식, 비정형에서부터 유관의 완전 폐색(occlusion)까지 다양한 유방관 병소를 유도한다. 유방관 병소/유관 절편의 총수의 비율을 결정하였다. 이번에도, 12.5 ㎍/㎖ p28은 MDL 형성을 15% 정도 억제하였다. 하지만, 25 ㎍/㎖에서 50 ㎍/㎖ 아주린에서 관찰되는 것에 필적하는 병소의 현저한 저해가 관찰되었다. 12.5 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 p28의 효능은 통계학적으로 유의하였다(p<0.01, 피셔의 정확 검증). 이들 결과는 도 4에 요약된다. 종종, 화학예방제의 효과는 MAL과 MDL 사이에서 차별될 수 있다. 가령, 타목시펜(tamoxifen)은 MDL의 발생을 저해하지만 MAL의 발생을 저해하지 못하였다. 흥미롭게도, 아주린과 p28은 독립된 폐포성 병소뿐만 아니라 에스트로겐과 프로게스테론-의존성 유방관 병소 역시 저해하였다.
본 실시예에서는 p28과 아주린 둘 모두 유방 조직 내에서 전암성 병소의 발생을 예방할 수 있음을 증명한다. 따라서 p28과 아주린은 포유동물 환자에서 화학예방제로서 이용될 수 있다.
실시예 2. 유전자 전달을 위한 잠재적 벡터로서 쿠프레독신과 유도체 펩티드에 의한 암 세포의 선택적 침투
본 실시예에서는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 분리된 쿠프레독신 단백질 집단의 구성원인 아주린이 암 세포에 침입하여 시험관내에서와 생체내에 서 p53-매개된 아폽토시스를 매개한다는 것을 증명하였다. 유전자 전달을 위한 잠재적 벡터로서 양이온성과 음이온성 쿠프레독신과 유래된 펩티드의 침투의 선택성(selectivity)을 평가하였다. 아래의 쿠프레독신을 조사하였다: 아주린(14kDa, pI 5.7), 루스티시아닌(17kDa, pI 8.0)과 플라스토시아닌(11kDa, pI 5.4). 이들 결과는 아주린이 가장 선택적으로 침투한다는 것을 암시하였다.
아주린(azu)의 25개 아미노산(a.a.) 단편을 합성하고, 다양한 암과 조직학적으로 대응되는 정상 세포 내로 침투를 평가하였다. 공초점 현미경 분석(confocal microscopic analysis)과 유세포분석(flow cytometry)(FACS)으로, Alexafluor 568(800Da)로 표지된 18개 아미노산(1.7kDa, azu 50-67) 단편(p18)이 인간 흑색종(Mel-2,7,29), 유방암(MCF-7), 난소암(SK-OV3), 췌장(CAPAN-2), 아교모세포종(LN-229), 별아교세포종(CCF-STTG1), 전립선암(LN-CAP), 그리고 신장암(ACHN-CRL1611) 세포주를 선택적으로 침투하지만 그들의 개별 대조에는 침투하지 못한다는 것을 증명하였다. LDH 방출과 용혈(hemolysis) 분석에서, p18은 침투 동안 암 세포 막 구조를 파괴하거나 인간 적혈구(erythrocyte)의 용혈을 유발하지 않는 것으로 밝혀졌는데, 이는 p18이 막 구조(membrane structure)를 파괴하지 않으면서 인간 암 세포에 침투한다는 것을 암시한다. 세포 내재화(cell internalization)의 특이적 저해물질(시토칼라신(cytochalasin) D; 액틴 중합화(actin polymerization)의 저해, 택솔(taxol); 미세소관 해중합(microtubule depolymerization)의 저해, 클로르프로마진(chlorpromazine); 클라트린-매개된 세포내이입(clathrin-mediated endocytosis)의 저해, 아지드화나트륨(sodium azide); 물질대사 저해(metabolic inhibition), 또는 스타우로스포린(staurosporine); 세포 주기 저해(cell cycle inhibition))로 Mel-2 세포의 전처리(pretreatment)는 p18의 침투에 거의 영향을 주지 않았다. 하지만, 니스타틴(nystatin)[포낭(caveolae) 형성 저해물질]과 브레펠딘(brefeldin) A[골지체(golgi apparatus) 파괴물질]와 함께 Mel-2 세포의 배양은 p18의 침투를 현저하게 저해하였는데, 이는 세포내이입 과정(endocytic process)이 p18의 침투에 부분적으로 관여한다는 것을 암시한다. 이종이식된 흑색종 종양을 보유하는 무흉선 생주 내에서 적외선염(infrared dye)(λem 800nm)로 표지된 p18의 영상은 정상적인 기관과 조직 내에서 축적되지 않으면서 원발성 s.c. 종양과 원위 기관 전이(distant organ metastasis)에서 선택적인 흡수를 분명하게 증명하였다. 따라서 한 구체예에서, p18을 비롯한 본 발명의 펩티드는 유전자(또는 DNA/RNA 단편) 요법을 위한 비-바이러스 벡터로서 유의한 활용도를 갖는 것으로 보인다.
실시예 3 - 플라스미드 작제
융합 글루타티온 S-이전효소(GST)-절두된 wt-아주린(azu) 유도체를 발현하는 플라스미드는 교정판독(proofreading) DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 작제하였다. 도 6에서는 다양한 절두된 wt-아주린 구조체의 개요도를 도시한다. pGST-azu 36-128(SEQ ID NO: 34)의 경우에, 증폭된 PCR 단편은 상업적 GST 발현 벡터 pGEXSX(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)의 BamHl와 EcoRl 부위 내로 도입하였다. 상기 단편은 주형(template)으로서 pUC19-azu 및 프라이머, 5'-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3'(SEQ ID NO: 35)과 5'- CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3'(SEQ ID NO: 36)으로 증폭하였는데, 여기서 부가적으로 도입된 BamHl과 EcoRI 부위는 각각 밑줄로 표시된다. azu 유전자의 카르복시-말단 절두는 QuickChange 특정부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA 92037)를 이용하여 종결 코돈을 도입함으로써 누적적으로 수행하였다.
pGST-azu 36-50(SEQ ID NO: 37), pGST-azu 36-77(SEQ ID NO: 38), pGST-azu 36-89(SEQ ID NO: 39)의 경우에, 종결 코돈은 각각, Ser51, Ser78, Gly90에 도입하였다. pGST-azu 36-128을 보유하는 플라스미드는 주형 DNA로서 이용하였다. 특정부위 돌연변이유발을 위한 3가지 세트의 올리고뉴클레오티드는 아래에 제시된다: pGST-azu 36-50의 경우: 5'-GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC GAC ATG CAG-3'(SEQ ID NO: 40)과 5'-CTG CAT GTC GGC GGC GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC-3'(SEQ ID NO: 41). pGST-azu 36-77의 경우: 5'-CCT GAA GCC CGA CGA CTG ACG TGT CAT CGC CCA CAC C-3'(SEQ ID NO: 42)과 5'-GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3'(SEQ ID NO: 43). pGST-azu 36-89의 경우: 5'-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGA AGG ACT CGG TGA CC-3'(SEQ ID NO: 44)와 5'-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3(SEQ ID NO: 45). 플라스미드 pGST-azu 50-77과 pGST-azu 67-77은 주형 DNA로서 pGST-azu 36-77을 이용한 PCR로 산출하였다.
증폭된 PCR 단편, azu 50-77과 azu 67-77은 정방향 프라이머 5'-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G-3'(SEQ ID NO: 46)과 5'-CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3'(SEQ ID NO: 46)을 이용하여 수득하였는데, 여기서 부가적으로 도입된 BamHI 부위는 밑줄로 표시된다. 양쪽 경우에 역방향 프라이머, 5'-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3'(SEQ ID NO: 48)이 이용되었다.
gst-azu 50-77을 보유하는 플라스미드는 아래의 올리고뉴클레오티드를 이용한, Gly67에 종결 코돈의 도입으로 pGST-azu 50-66을 산출하는데 이용되었다: 5'-GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C -3'(SEQ ID NO: 49)과 5'-GGT AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC- 3'(SEQ ID NO: 50). 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 녹색 형광 단백질 유전자(gfp) 역시 PCR로 증폭하였다. 이용된 정방향과 역방향 프라이머는 각 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 BamHl과 EcoRI 부위를 보유하는 5'-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3'(SEQ ID NO: 51)과 5'-CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3'(SEQ ID NO: 52)이었다. 생성된 PCR 단편은 pGST-GFP를 산출하기 위하여 pGEXSX 벡터 내로 결찰시켰다. gst-gfp-azu 50-77을 보유하는 플라스미드 DNA를 제조하기 위하여, azu 50-77 유전자는 주형으로서 pGST-azu 50-77 및 프라이머 5'-CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CAT GCA GGG-3'(SEQ ID NO: 53)과 5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3'(SEQ ID NO: 54)를 이용한 PCR로 증폭하였는데, 여기서 도입된 XhoI과 NotI 부위는 각각, 밑줄로 표시된다. 정제된 azu 50-77 단편은 pGST-GFP 내에서 XhoI과 NotI 제한 효소 부위로 도입되었다.
실시예 4 - 단백질의 정제
Wt-아주린과 M44KM64E 변이체 아주린은 Yamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 4770-75 (2004) 및 계류중인 U.S. 특허 출원 10/720,603에 기술된 바와 같이 제조하고 정제하였다. 간단히 말하면, wt-아주린 유전자는 Kukimoto et al., FEBS Lett, vol. 394, pp 87-90 (1996)에 기술된 방법에 따른 PCR로 증폭하였다. PCR은 주형 DNA로서 녹농균(P. aeruginosa) 균주 PAO1로부터 게놈 DNA를 이용하여 수행하였다.
Hindlll과 Pstl로 절단된 545 bp의 증폭된 DNA 단편은 pUC19의 상응하는 부위 내로 삽입하고, 따라서 아주린 유전자를 lac 프로모터 하류에 위치시켜 발현 플라스미드 pUC19-azuA를 산출하였다. E. col JM109는 상기 아주린 유전자의 발현을 위한 숙주 균주로서 이용하였다. 상기 재조합 대장균(E. coil) 균주는 50 ㎍ ㎖-1 암피실린, 0.1 mM IPTG, 0.5 mM CuSO4를 포함하는 2YT 배지 내에 37℃에서 16시간동안 배양하여 아주린을 생산하였다.
M44KM64E 변이체 아주린의 제조를 위하여, QuickChange 특정부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 아주린 유전자의 특정부위 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이는 DNA 염기서열분석으로 확증하였다.
액시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobadilus ferrooxidans)로부터 쿠프레독신 루스티시아닌을 인코딩하는 rus 유전자를 보유하는 플라스미드 DNA, pET9a는 Dr. Kazuhiko Sasaki, Central Research Institute of Electric Power Industry, Chiba, Japan로부터 입수하였다.
루스티시아닌은 Sasaki, K., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 67, pp. 1039-47 (2003)에 기술된 방법을 일부 변형하여 rus 유전자를 보유하는 대장균(E. coli) BL21(DE3)로부터 분리하였다. 간단히 말하면, 베타-알라닌 완충 액(pH 4.0)과 TSK-겔 CM-650 칼럼(Tosoh Bioscience, LLC, Montgomeryville, PA 18936) 대신에 아세트산 완충액(pH 4.0)과 CM-Sepharose(Sigma Chemicals, St. Louis, MO 63178)를 이용하였다. 2가지 다른 정제된 쿠프레독신; 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌 및 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린은 각각, Dr. Beatrix G. Schlarb-Ridley, University of Cambridge, UK와 Dr. Christopher Dennison, University of Newcastle Upon Tyne, UK로부터 입수하였다.
모든 재조합 GST-융합 유도체는 아래와 같이 정제하였다: 대장균(E. coli) BL21 세포는 숙주 균주로서 이용하였다. L 액체배지에서 성장의 초기 대수기(log phase)에서 0.4 mM IPTG로 유도후, GST-융합 단백질은 Glutathione Sepharose 4B 친화성 크로마토그래피 및 PBS를 포함하는 Sephadex 75 겔-여과 칼럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)을 이용하여 세포 추출물로부터 정제하였다. Alexa fluor®(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402)로 표지된 정제된 단백질, wt 아주린과 GST-유도체 또는 다른 쿠프레독신은 제조업체의 사용설명서에 따라 분리하였다. 결합하지 않는 자유 형광 화학물질은 겔-여과 칼럼으로 제거하였다.
실시예 5 - 세포 배양
J774와 UISO-Mel-2 세포(Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.)는 Yamada, T. et al. Infect. Immun. vol. 70, pp. 7054-62 (2002); Goto, M., et al. Mol. Microbiol. vol. 47, pp. 549-59 (2003); Yamada, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 99, pp. 14098-103 (2002)에 기술된 바와 같이 배양하였다. 인간 정상 섬유아세포(the Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC), Chicago의 보존 배양(stock culture) 컬렉션)는 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 필수 아미노산을 함유하는 Eagle 염을 포함하고 10% 열 불활화된 태아 소 혈청, 100 Unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 MEM에 배양하였다. MCF-7과 MOF-10F 세포는 Punj et al. Oncogene 23:2367-78 (2004)에서 기술된 바와 같이 배양하였다.
실시예 6 - J774, UISO-Mel-2와 섬유아세포의 공동-배양 및 공초점 검경
J774, UISO-Mel-2와 섬유아세포는 개별 커버 슬립 상에서 배양하였다. 하룻밤 배양후, 이들 세포는 새로운 배지로 세척하고, 3가지 세포주 모두 Alexa fluor® 568로 공동된 200 ㎍/㎖의 wt-아주린을 포함하는 배양 접시에 위치시켰다. 이후, 이들 세포는 37℃에서 5% C02 하에 0.5 또는 3.5 시간동안 배양하였다.
현미경 샘플을 준비하기 위하여, 세포는 37℃에서 하룻밤동안 커브-슬립 상에서 배양하였다. 배양된 세포는 단백질 처리에 앞서 2시간 동안 37℃ 또는 4℃에 위치시켰다. 미리-데워진 37℃ 새로운 배지 또는 차가운 4℃ 새로운 배지는 적-형광(Alexa fluor®568로 표지된) 쿠프레독신 또는 GST-융합 유도체와 혼합하고, 이들 세포와 함께 배양하였다. 이들 세포는 PBS로 세척하고, -20℃에서 5분간 메탄올로 고정시켰다. PBS로 2회 세척 및 핵을 염색하기 위한 1.5 ㎍/㎖ 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 포함하는 적재 배지(mounting media)(VECTASHILD, Vector, Burlingame, CA)의 첨가후, 공초점 현미경(confocal microscope)으로 영상을 획득하였다.
실시예 7 - 쿠프레독신의 J774 세포 내로 침입
Wt-아주린, 이의 돌연변이체 M44KM64E, 플라스토시아닌, 슈도아주린, 루스티시아닌은 실시예 6에서처럼 J774 세포와 함께 배양하고, 이들 세포는 공초점 검경을 이용하여 실험하였다. 이들 실험에서, 쿠프레독신은 적색 형광을 발하는 Alexa fluor® 568로 공동하고 200 ㎍/㎖의 농도에서 37℃에서 1시간동안 J774 세포와 함께 배양하며, 별개의 실험에서 야생형 아주린과 루스티시아닌은 대략 6 내지 7 μM의 농도에서 37℃에서 1시간동안 J774 세포와 함께 배양하였다. 핵은 DAPI로 푸른색으로 염색하였다. 이들 단백질이 없는 대조를 유지시켰다. 모든 경우에, 쿠프레독신은 J774 세포의 세포질 내로 침입하는 것으로 밝혀졌다. 유사한 실험에서, 아우라시아닌 A와 B는 MCF7 암 세포에 선호적으로 침입하고 비-암성 대조 세포에는 침입하지 않는다.
실시예 8 - Wt-아주린과 루스티시아닌의 다양한 세포형 내로 침입
Wt-아주린은 MCF-7 세포에 비하여 MCF-10F 세포에 대하여 감소된 세포독성 활성을 나타낸다(Punj et al. Oncogene 23:2367-2378 (2004)). J774, 복막 대식세포, 비만 세포, 인간 유방암 MCF-7과 인간 정상 상피 MCF-10F 세포(the Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC), Chicago의 보존 배양 컬렉션)는 실시예 5에서처럼 처리하고 실험하여 wt-아주린이 이들 세포에 침입할 수 있는 지를 검사하였다.
Wt-아주린은 45분 배양 동안 J774 세포에 내재화되었다. 하지만, 이는 복막 대식세포 또는 비만 세포에서 매우 비효율적으로 내재화되었다. 6시간 배양 이후에도, 이들 세포는 매우 제한된 침입을 보였다. 이와 유사하게, wt-아주린은 유방암 MCF-7 세포에 효율적으로 침입하는 반면, 정상 유방 MCF-10F 세포에서 극히 감소된 침입 비율을 보였다.
Alexa fluor®-공동된 아주린은 UISOMel-2와 MCF-7 암 세포에 효율적으로 침입하지만 정상 유방 MCF 10A1 세포에는 침투하지 못하였다. 하지만, Alexa fluor®-공동된 루스티시아닌은 UISO-Mel-2와 MCF-7 암 세포의 세포질에서뿐만 아니라 정상 MCF 10A1 세포에도 침입하였다. 루스티시아닌이 세포질 내에 균등하게 분포하는 암 세포에서와 달리, MCF10A1 세포에서는 대부분의 루스티시아닌이 핵 주변의 핵막 간극(perinuclear space)에 격리되었다.
실시예 9 - Wt 아주린-매개된 세포독성과 성장 저해
다양한 세포에서 wt-아주린의 침입 특이성을 더욱 평가하기 위하여, 37℃에서 30분과 3.5시간 배양 동안 J774, UISO-Mel-2와 정상 섬유아세포에서 Alexa fluor-공동된 wt-아주린의 침입을 측정하였다. wt-아주린은 30분 내에 J774와 UISO-Mel-2 세포에 급속하게 침입하는 것으로 관찰되었다; 이 기간 동안 섬유아세포의 세포질 내에서 wt-아주린은 거의 관찰되지 않았다. 3.5 시간의 배양후, 극히 소량의 wt-아주린이 이들 섬유아세포 내에서 관찰되었다.
Yamada, T., et al. Infect. Immun. 70:7054-62 (2002), Goto, M., et al. Mol. Microbiol 47:549-59 (2003) 및 2003년 11월 24일자 제출된 동시-계류중인 U.S. 특허 출원 10/720,603에 기술된 바와 같이 wt-아주린의 세포독성의 측정을 위하여 3(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-테트라졸리움 브롬화물)(MTT) 검사를 수행하였다. 도 1(b)에서는 현저한 wt-아주린-매개된 세포독성이 24시간 배양 동안 J774와 UISO-Mel-2 세포에서만 관찰된다는 것을 보여준다.
M44KM64E 변이체 아주린은 J774 세포에서 아폽토시스(apoptosis)-유도 활성을 거의 나타내지 않지만 1 ㎎/㎖ 농도에서 G1에서 S 단계로의 세포 주기 진행을 현저하게(대략 95%) 저해하였다. 세포 주기 진행은 Hiraoka, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101:6427-32 (2004)와 Yamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:4770-75 (2004)에 기술된 바와 같이 유세포분석법으로 분석하였다. 도 1(a)에서는 이들 섬유아세포를 500 ㎍/㎖ 또는 1 ㎎/㎖의 M44KM64E 변이체 아주린으로 처리하는 경우에, 세포 주기 진행의 저해 정도가 대략 20%임을 보여준다.
실시예 10 - Wt-아주린의 섬유아세포와 MCF-10F 세포로의 미세 주입
Wt-아주린은 Punj, V., et al., Oncogene 23:2367-78 (2004)에 기술된 방법을 이용하여 섬유아세포와 MCF-10F 세포 내에 미세주입(microinjection)하였다. 세포는 핵 DNA 응축(condensation)과 단편화(fragmentation)를 유발하는 아폽토시스의 유도를 조사하였다. 현저한 핵 DNA(DAPI로 푸른색으로 표지됨) 응축과 단편화는 wt-아주린과 함께 5시간 배양후 미세주입된 단일 세포에서 관찰되지만 아주린과 함께 30분 배양 동안에는 관찰되지 않았다.
실시예 11 - 37℃에서 Wt-아주린 융합 유도체의 내재화
N-과 C-말단 모두에서 절두된 wt-아주린의 일련의 GST 융합체는 실시예 3(도 6(a)와 6(b))에서처럼 제조하고 정제하였다. Alexa fluor® 568 공동된 wt-아주린, GST와 GST-azu 융합 유도체를 이용하여, 실시예 5에 기술된 방법에 따라 1시간 배양 동안 37℃에서 J774 세포에 내재화를 조사하였다. 핵은 DAPI로 푸른색으로 염색하였다.
wt-아주린은 내재화되는 반면, GST는 세포의 주변에 잔존하고 내재화되지 않았다. GST-azu 36-128과 GST-azu 36-89는 내재화되고, GST-azu 36-77 역시 내재화되었다. 하지만, 추가적인 절두에서, GST-azu 50-77은 내재화되는 반면, GST-azu 36-50은 매우 비효율적이고 표면상에 덩어리를 형성하는 것으로 확인되었다.
실시예 12 - 4℃에서 아주린 융합 유도체의 내재화
4℃에서 배양된 J774 세포에서 wt-아주린과 GST-azu 융합 유도체의 내재화를 조사하였다. 4℃에서, 1시간 배양 동안 J774 세포 내로 wt-아주린의 내재화는 심각하게 손상되었다. GST-azu 36-128과 GST-azu 36-89에서도 유사한 손상이 관찰되었다. 더욱 짧은 GST-azu 36-77, GST-azu 50-77, GST-azu 50-66, GST-azu 67-77은 4℃에서 내재화의 심각한 손상을 나타냈다.
실시예 13 - J774와 흑색종 UISO-MeI-2 세포에서 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질의 에너지-의존성 내재화
GST는 GFP와 융합하여 GST-GFP 융합 유도체를 만들었다. 부가적으로, azu 50-77을 GST-GFP(Mr 53 kDa) 융합 단백질에 융합시켰다(도 6(a)). 정제된 GST, GST- GFP, GST-GFP-azu 50-77 융합 유도체의 이동성(mobility)을 SDS-PAGE 상에서 조사하였다(도 6(b)). 검출은 쿠마시에 블루 염색(Coomassie Blue staining) 및 항-아주린 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 수행하였다(도 6(c)).
다양한 농도의 GST-GFP로 처리된 J774 세포의 유세포 분석 측정은 상기 단백질이 J774 세포에 결합한다는 것을 입증하였다. 증가하는 농도의 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질로 처리된 J774 세포의 유세포 분석 분리는 GST-GFP 단독에서보다 현저하게 감소된 형광을 입증하였다(도 7). 포유동물 세포에서 GFP의 내재화는 형광의 상실을 유발하는 것으로 알려져 있다. 형광의 이러한 감소는 J774 세포가 200 ㎍/㎖의 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질로 처리되고 37℃에서 증가하는 기간 동안 배양되는 경우에도 명확하게 관찰된다.
GST-GFP와 GST-GFP-azu 50-77의 결합과 내재화 프로필에서 차이가 존재하는 지를 결정하기 위하여, J774와 UISO-Mel-2 세포 둘 모두 37℃와 4℃에서 GST-GFP 및 GST-GFP-azu 50-77과 함께 배양하였다. 녹색 형광은 공초점 검경을 이용하여 위치를 확인하였다. J774 세포 내에서, GST-GFP 융합 단백질은 표면에 결합하고 37℃와 4℃ 모두에서 내재화되지 않았다. 대조적으로, GST-GFP-azu 50-77은 37℃에서 내재화되지만 4℃에서는 내재화되지 않는 것으로 밝혀졌다. UISO-Mel-2 세포에서, GST-GFP 융합 단백질은 37℃와 4℃ 모두에서 표면상에 유지되었다. 대조적으로, J774 세포에서와 유사하게, GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질은 37℃에서 내재화되지만 4℃에서는 내재화되지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 14 - 세포막 침투와 식작용 기전에 의한 포유동물 세포로의 Wt-아주 린 침입
wt-아주린 침입이 수용체-매개된 세포내이입(endocytosis)에 순전히 의존한다면, 이는 에너지 발생의 미토콘드리아 짝풀림물질(uncoupler), 프로토노포어 카르보닐 시아나이드 m-클로로피르닐하이드라존(protonophore carbonyl cyanide m-chlorophrnylhydrazone)(CCCP)에 의해, 또는 이들 수용체를 차단하는 표지되지 않은 아주린 또는 다른 쿠프레독신과의 사전배양에 의해 차단될 수 있을 것이다. J774와 UISO-MeI-2 세포는 4℃에서 2시간 동안 10배 초과 농도에서 쿠프레독신과 함께 배양하고, 이들 세포는 완전하게 세척하여 쿠프레독신을 제거하고 37℃에서 1시간동안 Alexa fluor® 568-공동된 아주린과 함께 배양하였다. 쿠프레독신으로 처리되지 않은 세포에서 만큼의 내재된 아주린이 존재하였다. 세포 미세섬유 네트워크를 파괴하는 수용체-매개된 세포내이입의 공지된 저해물질인 시토칼라신(cytochalasin) D(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195) 및 골지체(Golgi apparatus)를 파괴하고 고전적인 소포-매개된 분비를 저해하는 것으로 알려져 있는 브레펠딘(brefeldin) A(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195)의 효과 역시 조사하였다. 20 pM 농도에서 CCCP는 0.25 내지 0.5 pM 시토칼라신 D에서처럼 UISO-MeI-2 세포에서 아주린의 흡수를 현저하게 감소시켰다. 다른 한편, 브레펠딘 A는 별다른 효과를 나타내지 않았다.
실시예 15 - GST-PEDIII-azu 50-77 융합 유도체의 UISO-Mel-2 세포로의 침입
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 도메인 III(PEDIII)의 GST-융합체는 Hwang, J. et al., Cell 48:129-36 (1987); Reiter, Y. and Pastan, I., Trends Biotechnol. 16:513-20 (1998)에 기술된 바와 같이 작제하였다. 상기 GST-PEDIII 융합 유도체는 외독소 A의 아미노산 381-613을 포함하였다. PEDIII은 ADP-리보실 이전효소 활성을 보유하고 진핵 신장 인자(elongation factor) 2를 저해함으로써 진핵 세포 내에서 세포 단백질 합성을 저해하는 것으로 알려져 있다.
GST-GFP-azu 50-77에서 기술된 바와 같이 PCR을 이용하여, azu 50-77 서열을 GST-PEDIII 융합 단백질의 카르복시 말단에 도입하였다(도 8(a)). 이들 2가지 융합 단백질(GSTPEDIII과 GST-PEDIII-azu 50-77)은 글루타티온-세파로스(glutathione-sepharose) 4B 칼럼 크로마토그래피에 의해 52와 54 kDa 단백질로서 정제되었다(도 8(b)). 이후, UISO-Mel-2와 정상 섬유아세포(FBT) 세포는 다양한 농도의 이들 단백질과 함께 37℃에서 24시간동안 배양하고, 세포 사멸의 정도는 실시예 9에 기술된 바와 같이 MTT 검사로 측정하였다.
GST-PEDIII은 낮은 세포독성을 나타내는 반면, GST-PEDIII-azu 50-77 융합 단백질은 UISO-Mel-2 세포로 효율적인 침입으로 인하여 높은 세포독성을 나타냈다(도 8(c)). 대조적으로, 이들 융합 단백질은 섬유아세포에 대하여 낮은 수준의 세포독성을 나타냈다.
실시예 16 - wt-아주린 내에서 α-나선의 불안정화는 UISO-Mel-2 세포에서 이의 내재화에 별다른 영향을 주지 않는다.
α-나선이 아주린 침입에서 일정한 역할을 하는 지를 조사하기 위하여, 3개의 나선-불안정화 프롤린 잔기를 wt-아주린의 위치 54, 61, 70에 도입하고(도 6) 전장 A54PT61PK70P 변이체 아주린의 UISO-Mel-2 세포로의 침입을 조사하였다. 이들 위치에서 단일과 이중 돌연변이 역시 작제하고 침입을 조사하였다. A54PT61PK70P 변이체 아주린은 QuickChange 특정부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용한, 아주린 유전자의 특정부위 돌연변이유발로 제조하였다.
이들 변이체는 37℃에서 1시간 동안 UISO-Mel-2 세포와 함께 200 ㎍/㎖로 배양하고, 이후 공초점 검경으로 형광 위치를 확인하였다. 모든 경우에, Alexa fluor® 568-공동된 변이체 아주린은 UISO-Mel-2 세포를 침입하였다. 이와 유사하게, GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질 및 이의 삼중 A54PT61PK70P azu 돌연변이 변이체에서 UISO-Mel-2 세포로의 침입을 조사하는 경우에, 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 17 - GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 유도체의 UISO-Mel-2 세포로의 침입
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 도메인 III(PEDIII)의 GST-융합체는 실시예 15에 기술된 바와 같이 작제하였다. GST-GFP-azu 50-77에서 기술된 바와 같이 PCR을 이용하여, 전장 루스티시아닌 서열을 GST-PEDIII 융합 단백질의 카르복시 말단에 도입하였다. 상기 융합 단백질은 글루타티온-세파로스 4B 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 이후, UISO-Mel-2와 FBT 세포는 다양한 농도의 상기 융합 단백질과 함께 37℃에서 24시간동안 배양하고, 세포 사멸의 정도는 실시예 9에 기술된 바와 같이 MTT 검사로 측정하였다.
GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 단백질은 UISO-Mel-2 세포에 대하여 높은 세포독성을 나타냈다(도 9). 대조적으로, 상기 융합 단백질은 FBT 세포에 대하여 낮은 수준의 세포독성만을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ILLINOIS <120> COMPOSITIONS AND METHODS TO PREVENT CANCER WITH CUPREDOXINS <130> 14PR-135587 <140> PCT/US08/53493 <141> 2008-02-08 <150> 60/900,098 <151> 2007-02-08 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys 100 105 110 Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 Leu Ser 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Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp 130 135 140 Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Asp 165 <210> 19 <211> 150 <212> PRT <213> Vibrio parahaemolyticus <400> 19 Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser 1 5 10 15 Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn 20 25 30 Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys 35 40 45 Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln 50 55 60 Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala 65 70 75 80 Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys 85 90 95 Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly 100 105 110 Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly 115 120 125 Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln 130 135 140 Gly Lys Phe Glu Phe Lys 145 150 <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 20 His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro 20 25 30 Asp <210> 21 <211> 27 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 21 Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val 1 5 10 15 Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 22 Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly 1 5 10 15 Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Vibrio parahaemolyticus <400> 23 Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 24 Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala 1 5 10 15 Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp 20 25 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 25 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 26 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His 35 40 45 Thr Lys Leu Ile Gly 50 <210> 27 <211> 42 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 27 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 35 40 <210> 28 <211> 54 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 28 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His 35 40 45 Thr Lys Leu Ile Gly Ser 50 <210> 29 <211> 93 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 29 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His 35 40 45 Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val 50 55 60 Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro 65 70 75 80 Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 85 90 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 30 Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu 1 5 10 15 Asp Lys <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 31 Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(15) <223> Any amino acid <400> 32 Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(14) <223> Any amino acid <400> 33 Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 <210> 34 <211> 93 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 34 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His 35 40 45 Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val 50 55 60 Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro 65 70 75 80 Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 85 90 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 cgggatcccc ggcaacctgc cgaagaacgt catgggc 37 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 cggaattcgc atcacttcag ggtcaggg 28 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 37 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 38 <211> 42 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 38 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 35 40 <210> 39 <211> 54 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 39 Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His 35 40 45 Thr Lys Leu Ile Gly Ser 50 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ggccacaact gggtactgtg aaccgccgcc gacatgcag 39 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ctgcatgtcg gcggcggttc acagtaccca gttgtggcc 39 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 cctgaagccc gacgactgac gtgtcatcgc ccacacc 37 <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ggtgtgggcg atgacacgtc agtcgtcggg cttcagg 37 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 ccaagctgat cggctcgtga gagaaggact cggtgacc 38 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ggtcaccgag tccttctctc acgagccgat cagcttgg 38 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 cgggatcctg agcaccgccg ccgacatgca ggg 33 <210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 cgggatcccc ggcctggaca aggattacct gaagcccg 38 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 cggaattcgc atcacttcag ggtcaggg 28 <210> 49 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 gacggcatgg cttcctgact ggacaaggat tacc 34 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ggtaatcctt gtccagtcag gaagccatgc cgtc 34 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 cgggatcccc atggtgagca agggcg 26 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 cggaattcct tgtacagctc gtccatgccg 30 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 ccgctcgagc ctgagcaccg ccgccatgca ggg 33 <210> 54 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 ttttcctttt gcggccgctc agtcgtcggg cttcaggtaa tcc 43

Claims (69)

  1. 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이고, 포유동물 조직 내에서 전악성 병소의 발생을 저해할 수 있는 분리된 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 쿠프레독신은 아주린(azurin), 슈도아주린(pseudoazurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), Laz, 아우라시아닌(auracyanin), 스텔라시아닌(stellacyanin) 또는 오이 기초 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  3. 청구항 2에 있어서, 쿠프레독신은 아주린인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서, SEQ ID NO: 1, 3-19로 구성된 군에서 선택되는 펩티드의 일부인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  7. 청구항 1에 있어서, SEQ ID NO: 1, 3-19로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  8. 청구항 1에 있어서, 쿠프레독신의 절두인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  9. 청구항 8에 있어서, 10개 이상의 잔기 및 100개 이하의 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  10. 청구항 8에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-67, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 36-88, 또는 SEQ ID NO:20-24에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  11. 청구항 10에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-67, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 36-88, 또는 SEQ ID NO:20-24에서 선택되는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  12. 청구항 1에 있어서, 잔기 50-77, 잔기 50-67 또는 잔기 36-88에서 선택되는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 한 영역과 등가의 쿠프레독신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  13. 제약학적으로 허용되는 담체 내에 청구항 1의 최소한 하나의 쿠프레독신 또는 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 최소한 2개의 쿠프레독신 또는 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 정맥내 투여용으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  16. 청구항 13에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  18. 청구항 13에 있어서, 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-19로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  19. 포유동물 환자를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 13의 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 환자는 인간인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 환자는 일반 개체군보다 암이 발병할 위험이 더욱 높은 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 암은 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종, 별아교세포종, 폐암, 결장직장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암, 또는 자궁경부암에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 환자는 최소한 한 가지 고위험 특징(feature)을 갖는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  24. 청구항 19에 있어서, 환자는 전악성 병소를 갖는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  25. 청구항 19에 있어서, 환자는 암 또는 전악성 병소가 치료되었던 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  26. 청구항 19에 있어서, 제약학적 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 흡입, 국소 투여, 경피 패치, 좌약, 유리체 주입, 또는 경구에서 선택되는 방 식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  27. 청구항 24에 있어서, 투여 방식은 정맥내 주사인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  28. 청구항 21에 있어서, 제약학적 조성물은 최소한 하나의 다른 화학예방제(chemopreventive agent)와 공동-투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  29. 청구항 26에 있어서, 제약학적 조성물은 다른 화학예방제와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  30. 바이알에 담긴 청구항 13의 조성물을 포함하는 키트.
  31. 청구항 30에 있어서, 정맥내 투여용으로 설계된 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 암의 발생을 조사하는 방법에 있어서, 포유동물 세포를 청구항 1의 쿠프레독신 또는 펩티드와 접촉시키는 단계, 그리고 전악성과 악성 세포의 발생의 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조사 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조사 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 세포는 유선 세포인 것을 특징으로 하는 조사 방법.
  35. 청구항 32에 있어서, 세포는 암이 발생하도록 유도되는 것을 특징으로 하는 조사 방법.
  36. 청구항 1의 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터.
  37. 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이고, 적하 화합물(cargo compound)에 결합되며, 포유동물 암 세포를 선택적으로 침입할 수 있는 분리된 펩티드.
  38. 청구항 37에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리 된 펩티드.
  39. 청구항 37에 있어서, 쿠프레독신은 아주린인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  40. 청구항 39에 있어서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  41. 청구항 37에 있어서, SEQ ID NO: 25를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  42. 청구항 37에 있어서, SEQ ID NO: 25로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  43. 청구항 37에 있어서, 쿠프레독신의 절두인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  44. 청구항 37에 있어서, 10개 이상의 잔기 및 100개 이하의 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  45. 청구항 37에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77(SEQ ID NO: 2), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-67(SEQ ID NO: 25), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 36-88(SEQ ID NO: 26), 또는 SEQ ID NO:20-24에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  46. 청구항 37에 있어서, 적하 화합물은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  47. 청구항 46에 있어서, 적하 화합물은 안티센스 분자(antisense molecule)인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  48. 청구항 37에 있어서, 적하 화합물은 포유동물 암 세포의 성장을 방해하거나 사멸시키는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  49. 청구항 48에 있어서, 적하 화합물은 세포독성 약물인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  50. 청구항 37에 있어서, 적하 화합물은 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 핵산, 염료, 미립자, 나노입자, 독소, 또는 약물에서 선택되는 것을 특징 으로 하는 분리된 펩티드.
  51. 청구항 37에 있어서, 적하 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드에서 선택되고, 펩티드는 적하 화합물에 연결되어 융합 단백질을 형성하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  52. 청구항 37에 있어서, 적하 화합물은 독소인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  53. 청구항 11에 있어서, 적하 화합물은 검출가능 물질인 것을 특징으로 하는 분리딘 펩티드.
  54. 청구항 37의 펩티드 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약학적 조성물.
  55. 청구항 37의 펩티드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 세포는 암 환자로부터 유래되고, 이들 세포를 상기 환자 내로 재도입하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 청구항 55에 있어서, 세포는 암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 세포는 골육종(osteosarcoma cell) 세포, 폐암종(lung carcinoma cell) 세포, 결장암종(colon carcinoma) 세포, 림프종(lymphoma) 세포, 백혈병(leukemia) 세포, 연조직 육종(soft tissue sarcoma) 세포, 유방암종(breast carcinoma) 세포, 간암종(carcinoma) 세포, 방광암종(bladder carcinoma) 세포, 흑색종(melanoma) 세포, 뇌종양(brain tumor) 세포, 또는 전립선암종(prostate carcinoma) 세포에서 선택되는 암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 암 환자를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 37의 펩티드를 치료 효과량으로 상기 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 조성물은 정맥내, 국소, 피하, 근육내, 또는 종양내(intratumor)에서 선택되는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  61. 청구항 59에 있어서, 조성물은 다른 암 치료제와 공동-투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  62. 환자에서 암을 영상화(imaging)하는 방법에 있어서, 청구항 53의 분리된 펩 티드를 상기 환자에 투여하고, 적하 화합물의 위치를 검출하는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 적하 화합물은 X-레이 조영제(contrast agent)이고, 적하 화합물의 위치는 X-레이 CT에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  64. 청구항 62에 있어서, 적하 화합물은 자기 공명 영상 조영제이고, 적하 화합물의 위치는 MRI에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  65. 청구항 62에 있어서, 적하 화합물은 초음파 조영제이고, 적하 화합물의 위치는 초음파 영상(ultrasound imaging)에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  66. 암을 진단하는 방법에 있어서, 세포를 청구항 53의 분리된 펩티드와 접촉시키고, 적하 분자(cargo molecule)의 위치를 검출하는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  67. 청구항 37의 펩티드를 함유하는 반응물을 포함하는 키트.
  68. 청구항 67에 있어서, 제약학적으로 허용되는 어쥬번트 또는 부형제를 함유하 는 반응물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  69. 청구항 67에 있어서, 반응물의 투여를 위한 운반제(vehicle)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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