BRPI0806451A2 - Composições e métodos para a prevenção do câncer com cupredoxinas - Google Patents

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A PREVENÇÃO DO CÂNCER COM CUPREDOXINAS PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica prioridade nos termos do 35 U.S.C. §§ 119 e 120 para o Pedido de Patente dos EUA, Número de Série 11/488.693, depositado em 19 de julho de 2006, Pedido de Patente dos EUA, Número de Série 60/844.358, depositado em 14 de setembro de 2006, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente dos EUA 11/244.105, depositado em 6 de outubro de 2005, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/616.782, depositado em 7 de outubro de 2004 e Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/680.500, depositado em 13 de maio de 2005, e é uma continuação em parte do Pedido de Patente dos EUA, Número de Série 10/720.603, depositado em 11 de novembro de 2003, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/414.550, depositado em 15 de agosto de 2003 e que é uma continuação em parte do Pedido de Patenie dos EUA, Número de Série 10/047.710, depositado em 15 de janeiro de 2002, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/269.133, depositado em 15 de fevereiro de 2001.

DECLARAÇÃO DE INTERESSE PÚBLICO

O teor na íntegra destes pedidos anteriores está incorporado neste documento por referência. O objeto deste pedido foi apoiado por fundos de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), Bethesda, Maryland, E.U.A. (Números de Fundos AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45441, CA09432 e N01-CM97567). O governo pode ter determinados direitos sobre esta invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições que compreendem variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas que inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. A invenção também se refere ao uso de cupredoxinas e suas variantes, derivados e equivalentes estruturais como agentes quimiopreventivos em mamíferos para inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas e, finalmente, o câncer.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO Quimioprevenção do câncer é o uso de agentes químicos naturais, sintéticos ou biológicos para reverter, suprimir ou prevenir a progressão carcinogênica ao câncer invasivo. Estudos clínicos recentes na prevenção do câncer em populações de alto risco sugerem que a terapia quimiopreventiva é um tratamento real para pacientes de alto risco, sendo baseada nos conceitos de carcinogênese de campo multifocal e carcinogênese de múltiplas etapas. Em carcinogênese de campo, a exposição generalizada do carcinógeno em todo o campo do tecido resulta em lesão epitelial difusa no tecido e proliferação clonal das células de mutação. Estas mutações genéticas em todo o campo aumentam a probabilidade de desenvolvimento de uma ou mais lesões malignas ou pré-malignas. A carcinogênese de múltiplas etapas no acúmulo gradual destas alterações genéticas e fenotípicos. A interrupção de uma ou mais etapas na carcinogênese de múltiplas etapas pode impedir ou prevenir o desenvolvimento do câncer. Vide em geral Tsao et al., CA Cancer J Clin 54:150-180(2004).

A azurina e outras cupredoxinas são células cancerígenas especificamente citotóxicas. A azurina induz apoptose em células do câncer de pulmão J774. Yamada et al., PNAS 99(22): 14098- 14103 (2002). Ao entrar nas células do câncer de pulmão J774, a azurina localiza-se nas frações citosol e nuclear, forma um complexo com a proteína supressora de tumor p53 e estabiliza-se 20 aumentando seu nível intracelular. Id. A indução de apoptose mediada por azurina não se limita às células J774. A azurina também pode entrar nas células cancerígenas, tais como as células do câncer de mama humano MCF-7 ou melanoma humano UISO-Mel-2. Yamada et al., Infect Immun. 70:7054-7062 (2002); Punj et al., Oncogene. 23:2367-2378 (2004). Em ambos os casos, a azurina permitiu a elevação dos níveis intracelulares p53, conduzindo para a formação Bax melhorada e 2 5 indução de apoptose nessas células. De maneira mais surpreendente, a injeção intraperitoneal de azurina em camundongos nus abrigando cânceres humanos Mel-2 ou MCF-7 xeno-enxertados levou à regressão estatisticamente significativa desses cânceres. Id.

O ensaio de cultura de órgão de glândulas mamárias de camundongos (MMOC) pode ser usado na avaliação dos efeitos inibitórios de potenciais agentes quimiopreventivos tanto na diferenciação estrutural induzida por hormônios de glândulas mamárias como no desenvolvimento de lesões semelhantes a nódulos alveolares hiperplásticos preneoplásticos induzidos por DMBA nas glândulas. As glândulas mamárias de jovens, animais virgens, quando incubadas por 6 dias na presença de insulina (I) + prolactina (P) + aldosterona (A) podem diferenciar-se em glândulas totalmente adultas. Estas glândulas remontam morfologicamente as glândulas obtidas a partir de camundongos prenhes. A aldosterona pode ser substituída por estrogênio (E) + progesterona (Pg). A inclusão de hidrocortisona (H) ao meio estimula a diferenciação funcional das glândulas mamárias. Mehta and Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501 (1975); Mehta and Moon, Breast Cancer: Treatment and Prognosis 300, 300 (Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986). Desse modo, a diferenciação estrutural e funcional induzida por hormônios, observada neste regime de cultura, imita as respostas aos hormônios observados durante vários estágios fisiológicos do animal.

Os camundongos exibem um estágio preneoplástico distinto antes da formação do câncer em MMOC. As lesões preneoplásticas em camundongos C3H são induzidas pelo vírus do tumor mamário murídeo ou em camundongos BALB/c por DMBA. A exposição das glândulas para DMBA de 2 μg/ml entre os dias 3 e 4 das fases de crescimento seguido pela regressão das 20 glândulas por 2-3 semanas no meio contendo apenas insulina resulta na formação de lesões do alvéolo mamário (MAL). Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002); Mehta et al., Methods in Cell Science 19:19-24 (1997). Além disso, o transplante de células epiteliais, preparado a partir de glândulas contendo as lesões mamárias induzidas por DMBA, em hospedeiro singenéico resultou no desenvolvimento de adenocarcinoma mamário. Telang et al., PNAS 76:5886-5890 25 (1979). Patologicamente, estes tumores eram similares àqueles observados in vivo, quando os camundongos da mesma cepa são administrados DMBA. Id. A formação em MMOC de lesão mamária induzida por DMBA pode ser inibida por uma série de classes de agentes quimiopreventivos, tais como retinóides. Estes agentes incluem agentes quimiopreventivos oriundos dos produtos naturais, tais como brassinina e resveretrol, tióis, antioxidantes, inibidores de ornitina decarboxilase, como OFMO e deguelin, inibidores da síntese 5 de prostaglandina, reguladores Ca etc. Jang et al., Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eur. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Metha et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997). Estes estudos demonstram claramente que este regime de cultura de órgão oferece um modelo único para determinar a eficácia de compostos contra o carcinogênese mamário. Espera-se que os resultados sejam correlatos na inibição obtida in vivo pela administração desses compostos.

A MMOC também pode ser induzida para a formação de lesões do duto mamário (MDL).

As MDLs podem ser induzidas se o estrogênio e progesterona, em vez de aldosterona e hidrocortisona, forem incluídas no meio. As estruturas alveolares na presença de esteróides ovarianos são muito pequenas, porém são observadas lesões intraductais em seções histopatológicas. Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001). Os anti-estrogênios, que 15 operam seletivamente sobre cânceres de mama ER+ dependentes de hormônios ovarianos, tais como tamoxifeno, a formação de MDL inibida e não MAL. Portanto, este modelo de cultura modificado além do protocolo de indução MAL convencional agora pode ser usado na avaliação dos efeitos de agentes quimiopreventivos sobre MAL e MOL.

O que é necessário é um agente quimiopreventivo que inibe o desenvolvimento de lesões 2 0 pré-malignas. Esse agente quimiopreventivo deve ser capaz de prevenir o desenvolvimento inicial de lesões pré-malignas, induzir a morte celular em lesões pré-malignas e/ou prevenir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em lesões malignas. Esse agente quimiopreventivo teria grande utilidade no tratamento, em particular, de pacientes que tenham alto risco de desenvolvimento de câncer devido à presença de características de alto risco, a presença de lesões 25 pré-malignas, ou lesões anteriores ao câncer oü pré-malignas. A entrada de uma proteína na célula de um mamífero é frequentemente ditada por um pequeno segmento da proteína, que é normalmente referido como “domínio de transdução de proteína” ou PTD. Este segmento pode ser usado como um sinal ligado a uma proteína estranha para facilitar o transporte dessa proteína para a célula do mamífero. Por exemplo, são usados 5 peptídeos anfipáticos para facilitar a absorção das metaloporfrinas separadas por DNA como possíveis medicamentos antitumores em fibroblastos humanos HS68 ou células L1210 de leucemia linfocítica de murídeos (Chaloin, L et al. Bioconjugate Chem. 12:691-700 (2001)). Os peptídeos chamados peptídeos célula-penetrantes, tais como penetratin, transportan, Tat (aminoácidos 47-57 ou 48-60) e o peptídeo anfipático modelo MAP têm sido usados como veículos de entrega para o 10 transporte de substâncias de transporte importantes do ponto de vista farmacológico, tais como oligonucleotídeos, proteínas e peptídeos anti-senso (Hallbrink, M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109 (2001); Lindgren, M., et al. Trends Pharmacol. Sei. 21:99-103 (2000)).

Esses peptídeos, especificamente o homeodomínio ligante de DNA de Antennapedia, um fator de transcrição Drosophila, ou o veículo de peptídeo de resíduo 21 Pep-I são internalizados por muitos tipos de células em cultura, tais como os fibroblastos HS68 humanos ou NIH-3T3 de murídeos a 37°C ou 4°C. A falta do efeito da mudança de temperatura sugere um mecanismo de penetração diferente daquele de endocitose clássico (Morris, M.C. et al. Nature Biotechnol. 19:1173-1176 (2001)), que requer proteínas de receptor quiral. Um dos peptídeos mais amplamente usados no transporte de compostos farmacologicamente ativos em células de mamíferos é o 2 0 domínio de transdução de proteínas rico em arginina (PTD) de 11 aminoácidos da proteína transativadora Tat do vírus da imunodeficiência humana tipo I (HIV-I) (Schwarze, S.R. et el. Science 285:1569-1572 (1999), Schwarze, S.R. et al. Trends Cell Biol. 10:290-295 (2000)). A injeção intraperitoneal da proteína da fusão de beta-galactosidase/Tat de 120 kDa resulta na transdução transcelular da proteína da fusão em virtualmente todos os tecidos em camundongos, incluindo a 2 5 passagem da barreira sangue-cérebro. Este domínio de peptídeo curto de HIV-I Tat demonstrou mediar a internaiização celular de grandes moléculas ou partículas, incluindo nanopartículas magnéticas, vetores de fase, lipossomos e DNA de plasmídeo. Diferentemente de outros peptídeos célula-penetrantes discutidos acima, a intemalização de proteínas de carga por Tat de corpo inteiro ou seu domínio de transdução de 11 aminoácidos é significativamente afetada a 4°C (Liu, Y. et al. Nat. Med. 6:1380-1387 (2000), Suzuki, T. et al. J. Biol. Chem. 277:2437-2443 (2002)) e requer 5 interações com receptores, tais como cadeias de sulfato heparano dos proteoglicanos do sulfato heparano de membrana celular.

A maioria dos PTDs identificados até a presente data surgiu de fontes virais e de mamíferos. Outras fontes de PTDs seriam úteis para o projeto de várias seqüências experimentais e para terapias animais e humanos e procedimentos profiláticos. Uma fonte alternativa de PTDs é a 10 célula bacteriana. Embora seja sabido que proteínas bacterianas, como a toxina de cólera, entrem no citosol de células de mamíferos (Sofer, A. and Futerman, A.H. J. Biol. Chem. 270:12117-12122 (1995)), a citotoxicidade dessas proteínas limitou o uso de proteínas bacterianas, ou PTDs delas derivados para o transporte de cargas farmacologicamente importantes em células de mamíferos.

RESUMO DAS CONFIGURAÇÕES A presente invenção refere-se a composições que compreendem peptídeos que podem ser

variantes, derivados e equivalentes estruturais das cupredoxinas que inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. Especificamente, estas composições podem compreender azurina de Pseudomonas aeruginosa, a região dos resíduos 50-77 da azurina (p28) SEQ ID NO: 2 e a região dos resíduos 50-67 da azurina (pl8) SEQ ID NO: 25. A presente 2 0 invenção também refere-se a composições que podem compreender cupredoxina(s), e/ou variante, derivados ou equivalentes estruturais de cupredoxinas, que conservam a habilidade de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos ou animais mamíferos. Essas composições podem ser peptídeos isolados ou composições farmacêuticas, entre outras. As composições da invenção podem ser usadas em métodos de prevenção do desenvolvimento do 2 5 câncer em pacientes mamíferos. Um aspecto da invenção é um peptídeo isolado que pode ser uma variante, derivado ou equivalente estrutural de uma cupredoxina e que pode inibir o desenvolvimento de lesões prémalignas em tecido de mamíferos. A cupredoxina pode ser azurina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina, Laz, auracianina, estelacianina e proteína básica do pepino e, especificamente, pode 5 ser azurina. A cupredoxina pode ser de um organismo como Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Ulva pertussis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororafis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus e, especificamente, Pseudomonas aeruginosa. Em algumas configurações, o peptídeo pode ser parte da SEQ ID NOS: 1, 3-19, ou ser 10 uma seqüência para a qual a SEQ ID NOS: 1, 3-19 tem no mínimo 80% da identidade da seqüência do aminoácido.

Em algumas configurações, o peptídeo isolado pode ser um truncamento da cupredoxina. Nesse caso, o peptídeo isolado pode ser mais do que cerca de 10 resíduos e não mais do que cerca de 100 resíduos. O peptídeo isolado pode compreender, ou alternativamente consistir em, azurina 15 de Pseudomonas aeruginosa de 50-77 resíduos SEQ ID NO: 2, azurina de Pseudomonas aeruginosa de 50-67 resíduos SEQ ID NOS: 25, azurina de Pseudomonas aeruginosa de 36-88 resíduos SEQ ID NOS: 26 ou SEQ ID NOS: 20-24.

Outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica que pode compreender, no mínimo, uma ou duas cupredoxinas ou peptídeos isolados da invenção em um veículo 20 farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada para administração intravenosa. Em algumas configurações, a cupredoxina na composição farmacêutica pode ser de um organismo tal como Pseudomonas aeruginosa, Ulva pertussis, Alealigenes faecalis, Achromobaeter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e 2 5 Vibrio parahaemolyticus e, especificamente, de Pseudomonas aeruginosa. A cupredoxina pode ser SEQ ID NOS: 1,3-19. Outro aspecto da invenção são os métodos para tratar um paciente mamífero que compreendem a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da invenção. O paciente pode ser humano e pode ter um risco maior de desenvolver o câncer comparado à população em geral, podendo ser, em algumas configurações, 5 câncer de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, astrocitoma, pulmão, colorretal, garganta e cabeça, bexiga, próstata, pele ou cervical. Em algumas configurações, o paciente pode ter, no mínimo, uma característica de alto risco, lesões pré-malignas ou ter sido curado de câncer ou lesões pré-malignas.

A composição farmacêutica pode ser administrada por injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea, inalação, administração tópica, transdérmica, supositório, injeção vítrea ou oral, e, especificamente, por injeção intravenosa. A composição farmacêutica pode ser co-administrada com pelo menos um medicamento quimiopreventivo e, especificamente, no mesmo período que outro medicamento quimiopreventivo.

Outro aspecto da invenção é um kit compreendendo a composição farmacêutica da invenção em um frasco. Esse kit pode ser projetado para administração intravenosa.

Outro aspecto da invenção é um método para estudar o desenvolvimento do câncer que consiste em pôr em contato células de mamífero com uma cupredoxina ou peptídeo da invenção e medir o desenvolvimento de células malignas e pré-malignas. Em algumas configurações, as células podem ser humanas e/ou células de mamíferos. Em outras configurações, as células são 2 0 induzidas a desenvolver lesões pré-malignas.

Outro aspecto da invenção é um vetor de expressão que codifica um peptídeo da invenção.

Outro aspecto da invenção é um complexo compreendendo um composto de carga e uma seqüência de aminoácidos, em que a seqüência de aminoácidos possui identidade de seqüência de pelo menos 90% com uma cupredoxina, ou seus fragmentos, a seqüência de aminoácidos, ou seus 2 5 fragmentos, é ligada ao composto de carga, sendo que a seqüência de aminoácidos facilita a entrada do composto de carga em uma célula cancerígena de mamíferos. Em algumas configurações, a seqüência de aminoácidos deste complexo possui identidade de seqüência de aminoácidos de pelo menos 90% a menos de uma cupredoxina de corpo inteiro do tipo natural ou proteína de membrana externa H.8. Em algumas configurações, o composto de carga é proteína, lipoproteína, polipeptídeo, peptídeo, polissacarídeo, ácido nucléico, corante, micropartículas, nanopartículas, 5 toxina e medicamento. Em algumas configurações, a carga é uma proteína ou polipeptídeo que é ligado à seqüência de aminoácidos para formar uma proteína de fusão. Em outras configurações específicas, o composto de carga é uma toxina, mais especificamente, a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Em outras configurações, a carga é uma substância detectável, mais especificamente detectável por fluometria, microscopia, CT de raio X, MRI ou ultrassom. 10 Finalmente, a invenção também abrange o complexo em um veículo adequado do ponto de vista farmacêutico.

Outro aspecto da presente invenção é um método para a entrega de composto de carga em uma célula. Em uma configuração, este método compreende a colocação em contato de uma célula ou células com o complexo acima. Em outras configurações, a célula ou células se originam de um paciente que sofre de câncer e são reintroduzidas no paciente. Em outras configurações, as células são uma célula cancerígena, mais especificamente uma célula de osteosarcoma, célula de carcinoma do pulmão, célula de carcinoma do colo, célula de linfoma, célula de leucemia, célula de sarcoma do tecido mole, célula de carcinoma da mama, célula de carcinoma do fígado, célula de carcinoma da bexiga ou célula de carcinoma da próstata. Em outras configurações, o complexo é 2 0 administrado a um paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em outras configurações, o complexo é administrado por via intravenosa, tópica, subcutânea, intramuscular ou em um tumor. Em outras configurações, o complexo é administrado em conjunto com outro tratamento do câncer. Em outras configurações ainda, abordagens de RNAi, resistência de medicamento, transferência de gene hematopoiético, recombinação homóloga, tecnologia de ribozima, tecnologia anti-senso, imunoterapia de tumor e supressores de tumor, pesquisa translacional, terapia do câncer, sistemas de entrega de gene (viral e não viral), terapia anti-gene (anti-senso, siRNA e ribozimas), apoptose; mecanismos e terapias, desenvolvimento de vacina, imunologia e imunoterapia, e síntese de DNA e reparo são usados no sentido da entrega de DNA e/ou RNA como compostos de carga nos complexos da presente invenção. Em uma configuração específica, o composto de carga é uma molécula anti-senso.

5 Outro aspecto da invenção é um método para o diagnóstico do câncer. Em algumas

configurações, o complexo com uma carga que é uma substância detectável é administrado a um paciente com câncer, sendo detectada a localização da carga. Em configurações específicas, o composto de carga é um agente de contraste de raio X detectado por CT de raio X, o composto de carga é um agente de contraste de imagem por ressonância magnética, sendo detectado por MRI, 10 sendo que a carga é um agente de contraste de ultrassom detectável por ultrassom. Em outras configurações, [síc] uma célula ou células são colocadas em contato com um complexo com uma substância detectável, sendo detectada a localização da carga.

Outro aspecto da invenção é um kit que contém qualquer dos complexos acima. Em algumas configurações, o kit ainda compreende um adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outras configurações, o kit ainda compreende um veículo para a administração do reagente.

Estes e outros aspectos, vantagens e recursos da invenção ficarão evidentes a partir das seguintes figuras e descrição detalhada das configurações específicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

2 0 SEQ ID NO: 1. Seqüência de aminoácido de azurina da Pseudomonas aeruginosa (Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala He Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu He Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).

SEQ ID NO: 2. Seqüência de aminoácido de p28, resíduos de azurina 50-77 Pseudomonas aeruginosa (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser GIy Leu 5 Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).

SEQ ID NO: 3. Seqüência de aminoácido de plastocianina de Phormidium laminosum (Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser 10 Tyr Glu He Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys He Thr Val Glu Gly).

SEQ ID NO: 4. Seqüência de aminoácido de rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans (Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala AIa Ala Val Leu Pro Gly 15 Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu Ile Pro Ala Gly AIa Thr VaI Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val He Asp Pro He Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys GIn Ile Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys He Val Val Lys).

2 0 SEQ ID NO: 5. Seqüência de aminoácido de pseudoazurina de Aehromobaeter cyeloelastes (Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val AIa Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe Ile Pro Thr Asp Lys GIy His Asn Val Glu Thr He Lys Gly Met Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys IIe Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp AIa Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn).

SEQ ID NO: 6. Seqüência de aminoácido de azurina de Alcahgenes faecalis (Ala Cys Asp Val Ser He Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser He Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe 5 Thr He Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr He Glu Leu Gly Ser).

SEQ ID NO: 7. Seqüência de aminoácido de azurina de Achromobacler xylosoxidans ssp. denitrifieans I (Ala Gln Cys Glu Ala Thr IIe Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys VaI Ile 15 Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly GIu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn).

SEQ ID NO: 8. Seqüência de aminoácido de azurina de Bordetella bronchiseptica (Ala Glu Cys Ser Val Asp He Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys GIn Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val 2 0 Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met GIn Ala Val Glu Lys Asp Gly He Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp). SEQ ID NO: 9. Seqüência de aminoácido de azurina de Methylomonas sp. J (Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser IIe Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr 5 Pro Gly Asp Lys Arg Val He Ala Phe Thr Pro He Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser Tyr Pro Gly His Phe Set Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu Glu).

SEQ ID NO: 10. Seqüência de aminoácido de azurina de Neisseria meningitidis Z249I (Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala 10 Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Vai Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly He Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val AIa His Thr Lys Leu He Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu 15 Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp).

SEQ ID NO: 11. Seqüência de aminoácido de azurina de Pseudomonas fluorescen (Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val 2 0 He Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro He Ala Thr Asp GIy Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val He Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys). SEQ ID NO: 12. Seqüência de aminoácido de azurina de Pseudomonas chlororaphis (Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu He Thr He Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr 5 Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys He Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys).

SEQ ID NO: 13. Seqüência de aminoácido de azurina de Xylelia fastidiosa 9a5c (Lys Thr Cys Ala Val Thr He Ser AIa Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr Ile Lys He Ala Ala Glu Cys Thr 10 His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser AIa Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met GIn Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Ile Ala His Thr Ala He Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly).

SEQ ID NO: 14. Seqüência de aminoácido de estelacianina de Cucumis sativus (Met Gln Ser Thr Val His He Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His 20 Cys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser He Asn VaI Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser).

SEQ ID NO: 15. Seqüência de aminoácido de auracianina A de Chloroflexus aurantiacus (Met Lys He Thr Leu Arg Met Met Val Leu AIa Val Leu Thr Ala Met Ala Met Val Leu Ala AIa Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr GIy Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr He Glu He Gly Ser Lys Gly GIu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr GIu Leu Thr Val Ser AIa Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln His Asn Trp He Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn He He Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr 5 Tyr Leu Tyr He Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn).

SEQ ID NO: 16. Seqüência de aminoácido de auracianina B de Chloroflexus aurantiacus (Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala GIn Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala 10 Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala MetLeu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr He Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro).

SEQ ID NO: 17. Seqüência de aminoácido da proteína básica do pepino de Cucumis salivus (Ala 15 Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr GIu Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln He Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe He Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala VaI Asn Ala Leu).

2 0 SEQ ID NO: 18. Seqüência de aminoácido de Laz de Neisseria gonorrhoeae F62 (Cys Ser Gln Glu Pro Ma Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp He Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr He Thr Leu Lys His Thr Gly Thr GIn Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val He Ala Lys AIa GIu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu He Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp).

5 SEQ ID NO: 19. Seqüência de aminoácido de azurina de Vibrio parahaemolyticus (Met Ser Leu Arg He Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser He Asp AIa Asn Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met GIy His Asn Val Val IIe Ala Asp Thr Ala Asn He Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val 10 Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly GIy GIy Glu Ser Thr Ser He Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala He Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys),

SEQ ID NO: 20. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 57 a 89 de auracianina B de Chloroflcxus aurantiacus (His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala GIn Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp).

SEQ ID NO: 21. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 51-77 da azurina Pseudomonas syringae (Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala He Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly He Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).

SEQ ID NO: 22. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 89-115 de Laz Neisseria meningitidis 2 O (He Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly He Phe Lys Asp Gly Val Gly AIa Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp). SEQ ID NO: 23. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 52-78 da azurina Vibrio parahaemolyticus (Ala Asp Thr Ala Asn He Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala GIy Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp).

SEQ ID NO: 24. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 51 -77 da azurina Bordetella bronchiseptica (Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn GIn Tyr Leu Lys Ala Gly Asp).

SEQ ID NO: 25. Seqüência de aminoácido de pl8, resíduos de azurina 50-67 Pseudomonas aeruginosa (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp GIy Met Ala Ser Gly)

SEQ ID NO: 26. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 36-88 da azurina Pseudomonas aeruginosa (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys Leu Ile Gly).

SEQ ID NO: 27. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 36 a 77 da azurina Pseudomonas aeruginosa (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).

SEQ ID NO: 28. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 36 a 89 da azurina Pseudomonas aeruginosa (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys Leu He Gly Ser).

SEQ ID NO: 29. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 36 a 128 da azurina Pseudomonas aeruginosa (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp GIy Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys Leu Ile GIy Ser GIy Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).

SEQ ID NO: 30. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 53 a 70 da azurina Pseudomonas aeruginosa (Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys).

SEQ ID NO: 31. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 53 a 64 da azurina Pseudomonas aeruginosa (Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met).

SEQ ID NO: 32. Seqüência de aminoácido DGXXXXXDXXYXKXXD.

SEQ ID NO: 33. Seqüência de aminoácido DGXXXXDXXYXKXXD.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura I. A Figura 1 mostra fotografias de todas as glândulas avaliadas pela eficácia de

p28 e azurina. A Figura IA mostra uma fotografia representativa de lesões alveolares em uma glândula tratada de DMBA e sua comparação com uma glândula que foi tratada com DMBA junto com um agente quimiopreventivo. As Figuras IB-IF mostram fotografias representativas dos efeitos de p28 sobre o desenvolvimento de lesões alveolares.

Figura 2. A Figura 2 mostra um gráfico que demonstra a eficácia de p28 contra lesões do

alvéolo mamário induzidas por DMBA.

Figura 3. A Figura 3 mostra fotografias de seções representativas de lesões ductais e o efeito de p28.

Figura 4. A Figura 4 mostra um gráfico que demonstra a eficácia de p28 contra lesões 2 0 ductais induzidas por DMBA.

Figura 5. Diagrama que demonstra a localização da azurina α-helix em wt, bem como no domínio de transdução da proteína 50-77 azurina wt. E indicada a substituição de três aminoácidos no domínio de azurina 50-77 por resíduos de prolina. Figura 6(A), (B) e (C). (A) Diagrama que demonstra a construção de uma proteína de fusão 50-77 GST-GFP-azu. O gene gfp foi introduzido nã extremidade de 3’ do gene gst (para GST-GFP) e a seguir o fragmento 50-77 azu foi ligado na extremidade de 3’ do gene gst na estrutura para produzir a proteína de fusão 50-77 GST-GFP-azu. GST-GFP-azu 50-77 foi 5 purificado como uma única proteína de fusão a partir dos lisatos celulares. As proteínas purificadas foram feitas agir em SDS-PAGE e detectadas por coloração Azul Coomassie (6(B) e também por borrão ocidental utilizando o anticorpo anti-azurina (6(C)).

Figura 7 (A), (B) e (C). Diagramas que demonstram um estudo cinético para a internalização da Proteína Fluorescente Verde (GFP) de GST e proteínas da fusão de azurina GST10 GFP. Foi feito o ensaio da fluorescência verde em células J774 tratadas com várias concentrações de GST-GFP (10(a)) ou GST-GFP-azu 50-77 (10(b)) a 37°C por 1 hora. Dez mil células foram analisadas por citometria de fluxo, (c) Dependência de tempo de internalização de GST-GFP-azu 50-77. As células J774 foram incubadas com 200 μ§/ιτι1 de GST-GFP-azu 50-77 por períodos indicados a 37°C e analisadas por citometria de fluxo.

Figura 8 (A), (B) e (C). Diagrama que demonstra a exotoxina A domínio III (aminoácidos

405-613), bem como parte do domínio Ib (aminoácidos 381-404), fundida com GST (GSTPEDIII), conforme anteriormente descrito para a fusão GST-GFP. Em seguida, o fragmento azu 50- 77 foi ligado à extremidade de carboxil de GST-PEDIII (GST-PEDIII-azu 50-77) utilizando PCR. (B) As proteínas da fusão foram purificadas por cromatografia de coluna de filtragem de gel de 2 0 coluna glutationa Sefarose 4B e feitas agir em SDS-PAGE para determinação de dimensão. (C) Diagrama que demonstra a ação da proteína da fusão GST-PEDIII-azu 50-77 em células do câncer UISO-Mel-2 e em células normais do fibroblasto (FBT), conforme determinado por citotoxicidade mediada por PEDIII. Várias concentrações, conforme indicadas, de GST-PEDIII e GST-PEDIIIazu 50-77 foram incubadas com as células UISO-Mel-2 e FBT por 24 horas. Em seguida, a 2 5 viabilidade celular foi determinada por ensaio de MTT. Figura 9. Diagrama que demonstra a citotoxicidade mediada por PEDIII da proteína de fusão de GST-PEDIII-rusticianina contra as células cancerígenas UISO-Mel-2 e células FBT. Várias concentrações, conforme indicadas, de GST-PEDIII e GST-PEDIII-azu 50-77 foram incubadas com as células UISO-Mel-2 e FBT por 24 horas. Em seguida, a viabilidade celular foi determinada por ensaio de MTT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Conforme usado neste documento, o termo “célula” inclui tanto o singular como o plural do termo, a menos que especificamente descrito como “célula única”.

Conforme usados neste documento, os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são

usados de modo trocável para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural. Os termos também se aplicam para polímeros de ocorrência natural. Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” também 15 são inclusivos de modificações, incluindo, mas não limitados a, glicosilação, anexação lipídica, sulfatação, gama carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação. Será apreciado que os polipeptídeos não são sempre completamente lineares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser ramificados como resultado de ubiquitinização e podem ser circulares (com ou sem ramificação), geralmente como resultado de eventos pós-translação, incluindo evento 2 0 de processamento natural e eventos provocados por manipulação humana que não ocorrem naturalmente. Os polipeptídeos circulares, ramificados ou polipeptídeos ramificados circulares podem ser sintetizados por processos naturais não-transiação, bem como por métodos totalmente sintéticos.

Conforme usado neste documento, o termo “atividade farmacológica” significa o efeito de um medicamento ou outro sistema químico ou biológico. O efeito da substância química pode ser benéfico (terapêutico) ou nocivo (tóxico). Os produtos químicos puros ou misturas podem ser de origem natural (planta, animal ou mineral) ou compostos sintéticos.

Conforme usado neste documento, o termo “pré-maligno” significa células précancerígenas ou células anormais que se dividem sem controle.

Conforme usado neste documento, o termo “lesão” significa a área do tecido abnominal.

Conforme usado neste documento, o termo “condição patológica” inclui desvios anatômicos e fisiológicos da normalidade que constituem um prejuízo do estado normal do animal vivo ou de uma de suas partes, que interrompe ou modifica o desempenho das funções corporais, e é uma resposta a vários fatores (como má nutrição, riscos industriais ou clima), para agentes 10 infecciosos específicos (como vermes, protozoários parasitas, bactérias ou vírus), para defeitos inerentes do organismo (como anomalias genéticas), ou uma combinação destes fatores.

Conforme usado neste documento, o termo “condição” inclui desvios anatômicos e fisiológicos da normalidade que constituem um prejuízo do estado normal do animal vivo ou de uma de suas partes, que interrompe ou modifica o desempenho das funções corporais.

Conforme usado neste documento, 0 termo “sofrendo de” inclui a apresentação de sintomas

de uma condição patológica, ter uma condição patológica mesmo sem sintomas observáveis, em recuperação de uma condição patológica, ou recuperado de uma condição patológica.

Conforme usado neste documento, o termo “quimioprevenção” é o uso de medicamentos, vitaminas ou outros agentes para tentar reduzir o risco ou retardar o desenvolvimento ou a 2 0 recorrência do câncer.

Conforme usado neste documento, o termo “tratamento” inclui prevenir, rebaixar, interromper, ou reverter a progressão ou a gravidade de uma condição ou sintomas associados com uma condição que está sendo tratada. Desta forma, o termo “tratamento” inclui a administração médica, terapêutica e/ou profilática, conforme apropriado. O tratamento também pode incluir a prevenção ou redução do desenvolvimento do câncer. Conforme usado neste documento, o termo “inibe o crescimento celular” significa a redução ou desaparecimento de divisão e/ou expansão celular. Este termo também inclui a inibição do desenvolvimento celular ou aumentos na morte celular.

“Quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade eficaz de prevenir, retardar, 5 interromper ou reverter o desenvolvimento ou aliviar, total ou parcialmente, os sintomas existentes de uma condição particular para a qual o indivíduo está sendo tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica.

O termo “substancialmente puro”, quando usado para modificar uma proteína ou outro produto celular da invenção, refere-se por exemplo a uma proteína isolada do teor celular ou meio 10 de crescimento, em uma forma substancialmente livre de, ou não adulterada por, outras proteínas e/ou outros compostos. O termo “substancialmente puro” refere-se a um fator em uma quantidade de pelo menos cerca de 75% por peso seco, da fração isolada, ou pelo menos “75% substancialmente puro”. Mais especificamente, o termo “substancialmente puro” refere-se a um composto de pelo menos cerca de 85%, por peso seco, do composto ativo, ou “85% 15 substancialmente puro”. Mais especificamente, o termo “substancialmente puro” refere-se a um composto de pelo menos cerca de 95%, por peso seco, da fração isolada, ou pelo menos “95% substancialmente puro”. O termo “substancialmente puro” também pode ser usado para modificar uma proteína ou composto da invenção sinteticamente feito, em que, por exemplo, a proteína sintética é isolada dos reagentes e por subprodutos da(s) reação(ões) sintética(s).

2 0 O termo “grade farmacêutica”, conforme usado aqui, quando se refere a um peptídeo ou

composto da invenção, é um peptídeo ou composto que é substancial ou essencialmente isolado de componentes que normalmente acompanham o material do modo como é encontrado em seu estado natural, incluindo a síntese de reagentes e subprodutos, e substancial ou essencialmente isolado de componentes que poderiam afetar o seu uso como produto farmacêutico. Por exemplo, um peptídeo 2 5 de “grade farmacêutica” pode ser isolado de qualquer carcinoma. Em alguns exemplos, a “grade farmacêutica” pode ser modificada pelo método pretendido de administração, tal como “grade farmacêutica intravenosa”, a fim de especificar um peptídeo ou composto que é substancial ou essencialmente isolado de qualquer substância que poderia tomar a composição imprópria para administração intravenosa a um paciente. Por exemplo, um peptídeo de “grade farmacêutica intravenosa” pode ser isolado de detergentes, tais como SDS, e agentes anti-bacterianos, tais como 5 azida.

Os termos “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” referem-se a material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material do modo que é encontrado em seu estado nativo. Portanto, os peptídeos isolados de acordo com a invenção preferencialmente não contêm materiais normalmente associados com os peptídeos em 10 seu meio ambiente in situ. Uma região “isolada” refere-se a uma região que não inclui a seqüência completa dos polipeptídeos dos quais a região foi derivada. Um ácido nucléico, proteína, ou fragmento respectivo dos mesmos “isolado” foi substancialmente removido de seu meio ambiente in vivo de tal forma que pode ser manipulado pelos especialistas na técnica, tais como, entre outros, o sequenciamento genético, digestão por restrição, mutagênese sitio-direcionada e sub-clonagem 15 em vetores de expressão para um fragmento de ácido nucléico, bem como a obtenção de proteína ou fragmento de proteína em quantidades substancialmente puras.

O termo “variante”, conforme usado neste documento em relação a um peptídeo, refere-se a variantes da seqüência de aminoácido que pode ter aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao polipeptídeo do tipo natural. As variantes podem ser truncamentos 2 0 do peptídeo do tipo natural. “Supressão” é a remoção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo, o qual um “truncamento” é a remoção de um ou mais aminoácidos de uma ou ambas as extremidades do polipeptídeo. Portanto, um peptídeo variante pode ser feito por manipulação dos genes que codificam o polipeptídeo. Uma variante pode ser feita por alteração da composição básica ou características do polipeptídeo, mas pelo menos, não em suas atividades fundamentais. 2 5 Por exemplo, uma “variante” da azurina pode ser uma azurina mutada que retém sua capacidade para inibir o crescimento de células pré-malignas em mamíferos. Em alguns casos, um peptídeo variante é sintetizado com aminoácidos artificiais, tais como resíduos de s-(3,5-dinitrobenzoil)-Lys. Ghadiri & Femholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990). Em algumas configurações, o variante não tem mais de 20 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural ou parte dele. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 5 15 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural ou parte dele. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 10 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural ou parte dele. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 6 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural ou parte dele. Em algumas configurações, 10 o variante não tem mais de 5 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural ou parte dele. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 3 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural ou parte dele.

O termo “aminoácido”, conforme usado neste documento, significa uma parte de aminoácido que compreende qualquer resíduo de um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência artificial ou sintético, isto é, qualquer parte compreendendo pelo menos uma carboxila e pelo menos um resíduo amino diretamente ligado por um, dois, três ou mais átomos de carbono, tipicamente um (a) átomo de carbono.

O termo “derivado”, conforme usado neste documento em relação a um peptídeo, refere-se 2 0 a um peptídeo que é derivado do peptídeo sujeito. Uma derivação inclui modificações químicas do peptídeo de tal forma que o peptídeo ainda retenha algumas de suas atividades fundamentais. Por exemplo, um “derivado” da azurina pode ser uma azurina modificada quimicamente que retém sua capacidade de inibir a angiogênese em células de mamíferos. As modificações químicas de interesse incluem, entre outras, a amidação, acetilação, sulfatação, modificação polietileno glicol 2 5 (PEG), fosforilação ou glicosilação do peptídeo. Além disso, um peptídeo derivado pode ser a fusão de um polipeptídeo ou seu fragmento para um composto químico, tal como outro peptídeo, molécula de medicamento ou outro agente terapêutico ou farmacêutico ou uma sonda detectável.

O termo “percentagem (%) de identidade de seqüência de aminoácido” é definido como a percentagem de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata quando duas seqüências são alinhadas. Para determinar a % de identidade de aminoácidos, as seqüências são alinhadas e, se necessário, são introduzidos intervalos para obter a % de identidade de seqüência máxima; as substituições conservadoras não são consideradas parte da identidade de seqüência. Os procedimentos do alinhamento da seqüência de aminoácidos para determinar a percentagem de identidade são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Freqüentemente, programas de computadores publicamente disponíveis, tais como os programas BLAST, BLAST2, ALIGN2 ou Megalign (DNASTAR) são usados para alinhar as seqüências de peptídeos. Em uma configuração específica, o Blastp (disponível pelo Centro Nacional para Informações de Biotecnologia, Bethesda MD) é usado com base nos parâmetros de default de filtro de longa complexidade, expect 10, word size 3, existence 11 e extension 1.

Quando as seqüências de aminoácidos estão alinhadas, a % de identidade de seqüência de aminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com, ou em comparação com uma dada seqüência B de aminoácidos (que pode ser redigida alternativamente como uma dada seqüência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa % de identidade de seqüência de 20 aminoácidos para, com ou em comparação com uma dada seqüência de aminoácidos B) pode ser calculada como:

% de identidade de seqüência de aminoácidos = X/Y* 100 em que:

X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como pares idênticos pelo 2 5 programa de alinhamento de seqüências ou alinhamento do algoritmo de A e B, e Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Se a extensão da seqüência de aminoácidos A não for igual à extensão da seqüência de aminoácidos B, a % de identidade de seqüência de aminoácidos de A para B não eqüivalerá a % de identidade de seqüência de aminoácidos de B para A. Comparando seqüências mais longas com seqüências mais curtas, a seqüência mais curta será a seqüência “B”. Por exemplo, comparando 5 peptídeos truncados com os correspondentes peptídeos do tipo natural, o peptídeo truncado será a seqüência “B”.

Geral

A presente invenção fornece composições que compreendem cupredoxina e variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxina, e métodos para inibir o crescimento de células 10 de câncer em mamíferos. A invenção também se refere a variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxina que conservam a habilidade para prevenir o desenvolvimento ou a recorrência do câncer em mamíferos. Mais particularmente, a invenção fornece composições que compreendem azurina de Pseudomonas aeruginosa, variantes, derivados e equivalentes estruturais de azurina, e seu uso no tratamento de pacientes, e especialmente pacientes com maior risco de 15 desenvolvimento de câncer comparado à população em geral. Finalmente, a invenção fornece métodos para estudo do desenvolvimento de câncer em células, tecidos e animais mamíferos através do contato das células com cupredoxina ou variante, derivado ou equivalente estrutural da mesma, antes ou após induzir lesões pré-malignas e observar o desenvolvimento de células prémalignas e/ou malignas.

2 O Anteriormente, sabia-se que uma proteína redox elaborada por Pseudomonas aeruginosa, a

azurina da cupredoxina, entra seletivamente nas células do câncer de pulmão J774, mas não nas células normais e induz apoptose. Zaborina et al.,Microbiology 146:2521-2530 (2000). A azurina pode também entrar e matar seletivamente as células UISO-Mel-2 de melanoma humano ou MCF7 de câncer de mama humano. Yamada et al., PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj et al., 2 5 Oncogene 23:2367-2378 (2004). A azurina de P. aeruginosa entra preferencialmente nas células de sarcoma de retículo murídeo J774, forma um complexo com a proteína p53 supressora de tumor e estabiliza a mesma, aumenta a concentração intracelular de p53 e induz apoptose. Yamada et al., Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002). Estudos detalhados de vários domínios da molécula de azurina mostraram que os aminoácidos 50-77 (P28) (SEQ ID NO: 2) representavam um domínio de transdução da proteína (PTD) crítico para internalização e subseqüente atividade apoptótica.

5 Yamada et al., Cell. Microbial. 7:1418-31 (2005).

Sabe-se agora que a azurina e peptídeos derivados da azurina, tais como p28 e pl8, possuem propriedades quimiopreventivas. Sabe-se agora que a azurina e p28 previnem a formação de lesões preneoplásticas pré-malignas na cultura de órgão de glândulas mamárias dos camundongos. Verificou-se em um modelo de cultura de órgão de glândulas mamárias dos camundongos que a azurina em 50 μg/ml inibe em até 67% a formação de lesões alveolares. Da mesma forma, verificou-se que p28 em 25 μg/ml inibe em até 67% a formação de lesões alveolares. Vide Exemplo 1. Além disso, verificou-se que a azurina em 50 μg/ml inibe em até 79% a formação de lesões ductais e p28 em 25 μg/ml inibe em até 71% a formação de lesões ductais. Vide Exemplo I. A microscopia confocal e FAC demonstraram que a azurina e p28 entraram em células epiteliais mamárias de murídeos normais (MM3MG) e células de câncer mamário (4T1). P28 também entrou em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de um modo dependente da temperatura, horário e concentração e inibiu a formação de tubo capilar de HUVEC plaqueado em Matrigel® de um modo dependente da dose. A microscopia confocal e FAC também demonstraram que pl 8 entrou seletivamente nas linhagens celulares do melanoma humano (Mel2 0 2,7,29), mama (MCF-7), ovariano (SK-OV3), pancreático (CAPAN-2), glioblastoma (LN-229), astrocitoma (CCF-STTG1), próstata (LN-CAP) e rim (ACHN-CRL1611). Além disso, a imagem de p 18 rotulada com coloração infravermelha (λεπι 800nm) em camundongos atímicos tendo tumores de melanoma xenoenxertados demonstrou claramente a absorção seletiva em tumores s.c primários e metástases de órgão distantes sem acúmulo em órgãos e tecidos normais. Sabe-se 2 5 agora, portanto, que a azurina e suas variantes podem ser utilizadas para inibir a formação de lesões preneoplásticas pré-malignas e assim o desenvolvimento do câncer e, especificamente, o câncer de mama em pacientes mamíferos.

Métodos padrão de tratamento do câncer, incluindo radioterapia e quimioterapia, implicam danos ao DNA da célula cancerígena. A resposta celular ao dano do DNA normal inclui ativação 5 reparo de DNA, o controle do ciclo celular e a letalidade (Hall, Radiobiology for the Radiologisl, Harper and Row, 1988). Por exemplo, a indução de rompimentos de duplo filamento de DNA resulta em desvios cromossomais letais que incluem supressões, ^dicentrics”, anéis e pontes anafásicos (Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1994).

Devido à absorção seletiva dos peptídeos da presente invenção por tumores e várias células 10 cancerígenas, sabe-se agora que estes peptídeos, incluindo em uma configuração, o p 3 8 pode ter uso como vetor não viral para a introdução de materiais em tumores e células cancerígenas. Por exemplo, Por exemplo, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para a introdução de fragmentos de DNA ou RNA em uma terapia de célula cancerígena fornecendo, desse modo, um tratamento de fragmentos de DNA ou RNA a um tumor ou célula cancerígena.

Abaixo é uma descrição de técnicas exemplares não limitativas e/ou fragmentos de DNA

ou RNA específicos que podem ser introduzidos com os peptídeos da presente invenção, e, em uma configuração, o p 18, que facilita a entrada de uma molécula ligada na célula cancerígena de um mamífero. Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada com terapia de gene, abordagens de RNAi, transferência de gene hematopoiético, recombinação homóloga, tecnologia de ribozima, 2 0 tecnologia anti-senso, imunoterapira de tumor e supressores de tumor, pesquisa translacional, terapia anti-gene (anti-senso, siRNA e ribozimas), apoptose, imunologia e imunoterapia, síntese de DNA e reparo.

A terapia de gene envolve a transferência de um gene estranho em uma célula cancerígena, por exemplo, um supressor de tumor ou indutor de apoptose, sob condições adequadas para 2 5 expressão do gene. Uma vez expressado, o produto do gene apresenta um efeito benéfico sobre a célula do tumor reduzindo o seu crescimento, inibindo seu potencial metastático ou exterminando-o completamente. Historicamente, a eficácia clínica da terapia do gene do câncer foi limitada por 1) falta de controle da expressão do gene terapêutico dentro do tumor, e 2) direção seletiva do vetor ao tumor. Os compostos da presente invenção tratam da direção seletiva das células de tumor. Além disso, diversas estratégias foram propostas para o controle da expressão de gene. Uma estratégia é a 5 direção transcricional na qual o promovedor que regula o gene terapêutico é ativado por fatores de transcrição tumor-seletivos. Exemplos incluem o uso do promovedor MUC-I no câncer de mama e o promovedor CEA no câncer do colo (Kurihara et al., “Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUCl antigen,” J. Clin. Invest. 106(6): 763-771, 2000; Konishi et al., “Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for 10 carcinoembrionic antigen-producing adenocarcinoma,” J. Med. Sci., 48(3): 79-89, 1999).

Técnicas anti-senso baseiam-se na introdução de uma molécula de ácido nucléico em uma célula que tipicamente é complementar a um mRNA expressado pelo gene selecionado. A molécula anti-senso tipicamente suprime a translação da molécula de mRNA e impede a expressão do polipeptídeo codificado pelo gene. Modificações da técnica anti-senso podem impedir a translação 15 do gene selecionado pela molécula anti-sensò ligando ao DNA do gene para formar um helix triplo. Um medicamento anti-senso específico que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é G3139 (também conhecido como oblimersen; fabricado pela Genta, Inc., Lexington, MA). Outra molécula anti-senso específica que pode ser utilizada é G4460 (também conhecida como c-myb antisense fabricada pela Genta, Berkeley Heights, NJ).

2 0 Também podem ser ligadas aos peptídeos da presente invenção moléculas baseadas na

interferência de RNA (RNAi). Em geral, RNAi é mediada por RNA de duplo filamento (“dsRNA”), RNA de curto grampo (“shRNA”) ou outras moléculas de ácido nucléico com características similares. Estas moléculas de ácido nucléico são processadas ou dividas em peças menores por enzimas celulares, incluindo Dicer e Drosha. A seguir, os fragmentos menores das 2 5 moléculas de ácido nucléico podem ser tomados por um complexo proteínico (o complexo RISC) que media a degradação de mRNAs. O complexo RISC degradará o mRNA que suplementarmente fundamentará os pares com as moléculas de ácido nucléico tomadas pelo complexo. Dessa maneira, o mRNA é especificamente destruído, impedindo assim as proteínas de serem codificadas.

As tecnologias de ribozima baseiam-se na introdução de uma molécula de ácido nucléico em uma célula que expressa uma molécula de RNA que liga e catalisa a clivagem seletiva de uma 5 molécula de RNA alvo. Tipicamente a molécula de RNA alvo é uma molécula de mRNA, podendo, no entanto, ser, por exemplo, uma molécula de RNA retroviral.

A supressão de gene alvo por recombinação homóloga que requer dois eventos de inativação de gene (um para cada alela) também é uma estratégia que pode ser utilizada com a presente invenção.

Terapias específicas entregues em conjunto com os compostos da presente invenção

também podem ser destinadas contra complexos de transcrição específicos do câncer (CSTCs) que possam controlar a expressão de proteínas que são cruciais para o desenvolvimento do câncer. Vide, por exemplo, Pedido de Patente dos EUA Na 2008/0027002 que é incorporada por referência na presente invenção por seus ensinamentos a respeito das terapias do câncer direcionadas contra CSTCs.

Devido ao alto grau de semelhança estrutural entre cupredoxinas, é provável que outras cupredoxinas também inibam a formação de lesões pré-malignas em mamíferos e também a azurina. Essas cupredoxinas podem ser encontradas, por exemplo, em bactérias ou plantas. Sabe-se que várias cupredoxinas possuem atividades farmacocinéticas similares àquelas de azurina de 2 0 Pseudomonas aeruginosa. Por exemplo, a rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans também pode entrar em macrófagos e induzir apoptose. Yamada et al., Cell Cycle 3:1 182-1 187 (2004); Yamada et al., Cell Micro. 7 :1418-1431 (2005). Plastocianina de Phormidium laminosum e pseudoazurina de Achromobacter cycloelastes também são macrófagos citotóxicos. Patente dos Estados Unidos No. 20060040269, publicada em 23 de fevereiro de 2006. Considera-se que essas outras 25 cupredoxinas possam ser usadas nas composições e métodos da invenção. Além disso, variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas que conservam a habilidade para inibir a formação de câncer em mamíferos podem também ser usados nas composições e métodos da invenção. Essas variantes e derivados podem incluir truncamentos de uma cupredoxina, substituições conservadoras de aminoácidos e modificações de proteínas, como peguilação e stabling 100% em hidrocarboneto de α-hélices, mas sem se limitarem a estes.

5 Composições da Invenção

A invenção fornece peptídeos que são variantes, derivados ou equivalentes estruturais de cupredoxina que inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. A invenção fornece ainda peptídeos que são variantes, derivados ou equivalentes estruturais de cupredoxina que inibem o desenvolvimento do câncer em células, tecidos e animais 10 mamíferos. Em algumas configurações, o peptídeo é isolado. Em algumas configurações, o peptídeo é substancialmente puro ou de grau farmacêutico. Em outras configurações, o peptídeo está em uma composição que compreende ou consiste essencialmente no peptídeo. Em outra configuração específica, o peptídeo é não-antigênico, e não ativa uma resposta imune em um mamífero, e mais especificamente em um humano. Em algumas configurações, o peptídeo é menor 15 do que uma cupredoxina de comprimento completo, e conserva algumas das atividades farmacológicas das cupredoxinas. Especificamente em algumas configurações, o peptídeo pode conservar a habilidade para inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas na cultura de órgão de glândulas mamárias dos camundongos.

A invenção fornece também composições que compreendem no mínimo um peptídeo que é 20 uma cupredoxina, variante, derivado ou equivalente estrutural de uma cupredoxina, especificamente em uma composição farmacêutica. Em configurações específicas, a composição farmacêutica é projetada para uma forma particular de administração, por exemplo, oral, intraperitoneal ou intravenosa. Essas composições podem ser hidratadas em água, podem ser secas (como através de liofilização) para posterior hidratação. Essas composições podem ser em 2 5 solventes distintos de água como álcool, não se limitando a este. A invenção também fornece composições que compreendem peptídeos que são variantes, derivados ou equivalentes estruturais de uma cupredoxina que seletivamente entra nas células cancerígenas e/ou tumores em células, tecidos e animais mamíferos. Em algumas configurações, o peptídeo é pl 8 tendo SEQ ID NO. 25. Em algumas configurações, o peptídeo é uma variante, 5 derivado ou equivalente estrutural de pl8. Em algumas configurações, a composição é p 18 acoplado ao DNA ou RNA. Em algumas configurações, o DNA ou RNA é um gene ou parte de um gene. Em algumas configurações, o DNA ou RNA tem um efeito terapêutico, uma vez liberado.

Devido à alta homologia estrutural entre as cupredoxinas, supõe-se que as cupredoxinas tenham as mesmas propriedades quimiopreventivas que a azurina e p28. Em algumas 10 configurações, a cupredoxina é, mas não se limita a, azurina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina, auracianina, estelacianina, proteína básica do pepino ou Laz. Particularmente em configurações específicas, a azurina é derivada de Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas 15 chlororaphis, Xylella fastidiosa, Ulva pertussis ou Vibrio parahaemolyticus. Em uma configuração muito específica, a azurina é da Pseudomonas aeruginosa. Em outras configurações específicas, a cupredoxina compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1, 3-19.

A invenção fornece peptídeos que são variantes da seqüência de aminoácidos que têm aminoácidos substituídos, excluídos ou inseridos em comparação com a cupredoxina de tipo 2 0 natural. Variantes da invenção podem ser truncamentos da cupredoxina de tipo natural. Em algumas configurações, o peptídeo da invenção compreende uma região da cupredoxina que é menor do que o polipeptídeo de tipo natural de comprimento completo. Em algumas configurações, o peptídeo da invenção compreende mais do que cerca de 10 resíduos, mais do que cerca de 15 resíduos ou mais do que cerca de 20 resíduos de uma cupredoxina truncada. Em algumas 25 configurações, o peptídeo compreende não mais do que aproximadamente 100 resíduos, não mais do que aproximadamente 50 resíduos, não mais do que aproximadamente 40 resíduos, não mais do que aproximadamente 30 resíduos ou não mais do que aproximadamente 20 resíduos de uma cupredoxina truncada. Em algumas configurações, a cupredoxina mantém com o peptídeo, e mais especificamente com a SEQ ID NOS: 1, 3-19 em relação ao peptídeo da invenção, no mínimo cerca de 70% de identidade de seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 80% de identidade de 5 seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüência de aminoácido ou no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácido.

Em configurações específicas, a variante de cupredoxina compreende os resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (p28, SEQ ID NO: 2), os resíduos 50-67 de azurina (p 18, SEQ ID NO: 25), ou os resíduos 36-88 de azurina (SEQ ID NO: 26). Em outras configurações, a variante de cupredoxina consiste nos resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (SEQ ID NO: 2), nos resíduos 50-67 de azurina (SEQ ID NO: 25) ou os resíduos 36-88 de azurina (SEQ ID NO: 26). Em outras configurações específicas, a variante consiste nos resíduos equivalentes de uma cupredoxina diferente de azurina. Supõe-se que outras variantes de cupredoxina possam ser projetadas, que tenham uma atividade farmacológica semelhante à dos resíduos 50-77 da azurina (SEQ ID NO: 2), ou os resíduos 36-88 da azurina (SEQ ID NO: 26). Para fazê-lo, a seqüência de aminoácido da cupredoxina em questão será alinhada à seqüência da azurina de Pseudomonas aeruginosa com o uso de BLAST, BLAST2, ALIGN2 ou Megalign (DNASTAR), os resíduos relevantes serão localizados na seqüência de aminoácido da azurina de P. aeruginosa, os resíduos equivalentes serão encontrados na seqüência da cupredoxina em questão e o peptídeo equivalente será assim projetado.

Em uma configuração da invenção, a variante da cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 57 a 89 da auracianina B de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 20). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 50-67 da 2 5 azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 25). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 51-77 da azurina de Pseudomonas syringae (SEQ ID NO: 21). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 89-115 de Laz de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 22). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 52-78 da azurina de Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO: 23). Em outra configuração da invenção, a 5 variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 51-77 da azurina de Bordetella bronchisepíica (SEQ ID NO: 24).

As variantes também incluem peptídeos feitos com aminoácidos sintéticos que não ocorrem na natureza. Por exemplo, aminoácidos que não ocorrem na natureza podem ser integrados em variantes de peptídeos para estender ou otimizar a meia-vida da composição na corrente 10 sanguínea. Essas variantes incluem, mas não se limitam a, D,L-peptídeos (diastereômero), (por exemplo, Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al., Biochem. Pharmacol. 36(l):169-76 (1987); peptídeos contendo aminoácidos incomuns (por exemplo, Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)); aminoácido não natural contendo olefina seguido por ligação de hidrocarboneto (por exemplo, 15 Schafmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466- 1470 (2004)) e peptídeos compreendendo resíduos s-(3,5-dinitrobenzoil)-Lys.

Em outras configurações, o peptídeo da invenção é um derivado de uma cupredoxina. Os derivados de cupredoxina são modificações químicas do peptídeo tais que o peptídeo conserva ainda algumas de suas atividades fundamentais. Por exemplo, um “derivado” de azurina pode ser 20 uma azurina modificada quimicamente que conserva sua habilidade para inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos ou animais mamíferos. As modificações químicas de interesse incluem, mas não se limitam a, ligação de hidrocarboneto, amidação, acetilação, modificação com polietileno glicol (PEG), fosforilação e glicosilação do peptídeo. Além disso, um peptídeo derivado pode ser uma fusão de uma cupredoxina, variante, derivado ou equivalente 25 estrutural da cupredoxina com um composto químico tal como, mas não se limitando a estes, um outro peptídeo, uma molécula de medicamento ou outro agente terapêutico ou farmacêutico ou uma sonda detectável. Derivados de interesse incluem modificações químicas pelas quais a meia-vida dos peptídeos e composições da invenção na corrente sanguínea possa ser estendida ou otimizada, como através de vários métodos bem conhecidos dos especialistas, incluindo, mas não se limitando a, peptídeos circularizados (por exemplo, Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78 (2005); DeFreest et 5 al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), modificações terminais N- e C- (por exemplo, Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8 (1990)), e aminoácido não natural contendo olefina seguido por ligação de hidrocarboneto (por exemplo, Shafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004)).

Em outra configuração, o peptídeo é um equivalente estrutural de uma cupredoxina. Exemplos de estudos que determinam homologia estrutural significativa entre cupredoxinas e outras proteínas incluem Toth et al. (Developmental Cell 1:82-92 (2001)). Especificamente, homologia estrutural significativa entre uma cupredoxina e o equivalente estrutural pode ser determinada usando o algoritmo VAST. Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995). Em configurações específicas, o valor p de VAST de uma comparação estrutural entre uma cupredoxina e o equivalente estrutural é menor do que cerca de IO'3, menor do que cerca de IO'5 ou menor do que cerca de IO'7. Em outras configurações, homologia estrutural significativa entre uma cupredoxina e o equivalente estrutural pode ser determinada usando o algoritmo DALI. Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993). Em configurações específicas, a pontuação DALI Z para uma comparação estrutural de 2 0 emparelhamento é no mínimo cerca de 3,5, no mínimo cerca de 7,0 ou no mínimo cerca de 10,0.

Supõe-se que os peptídeos da composição da invenção possam ser mais do que uma variante, derivado e/ou equivalente estrutural de uma cupredoxina. Por exemplo, os peptídeos podem ser um truncamento da azurina que foi peguilada, assim tornando-se tanto uma variante quanto um derivado. Em uma configuração, os peptídeos da invenção são sintetizados com 25 aminoácidos não naturais α,α-dissubstituídos contendo tethers que suportam olefina, seguidos por uma “ligação” inteiramente de hidrocarboneto, através de metátese de olefina catalisada com rutênio. Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soe. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004). Além disso, os peptídeos que são equivalentes estruturais de azurina podem ser fundidos com outros peptídeos, produzindo assim um peptídeo que é tanto um equivalente estrutural quanto um derivado. Esses exemplos destinam-se meramente a ilustrar e não a limitar a 5 invenção. Variantes, derivados ou equivalentes estruturais podem ou não ligar-se a cobre.

Em algumas configurações, a cupredoxina ou variante, derivado ou equivalente estrutural da mesma tem algumas das atividades farmacológicas da azurina de P. aeruginosa, e especificamente p28. Em uma configuração específica, as cupredoxinas e variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas podem inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas 10 em células, tecidos ou animais mamíferos e, especificamente, não se limitando a, células de glândulas mamárias. A invenção também fornece as cupredoxinas e variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxina que possam ter a habilidade de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em mamíferos e, especificamente, mas sem se limitar a, células de câncer de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, astrocitoma, pulmão, colorretal, garganta e cabeça, 15 bexiga, próstata, pele e cervical. A inibição do desenvolvimento de células de câncer é representada por qualquer redução, ou diminuição da velocidade de aumento, do desenvolvimento de lesões prémalignas que seja estatisticamente significativo em comparação com os tratamentos de controle.

Devido a atualmente se saber que as cupredoxinas podem inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas e finalmente o câncer em células, tecidos ou animais mamíferos, e 2 0 especificamente células da mama e, mais especificamente, as células de glândulas mamárias de camundongos, é possível agora projetar variantes e derivados de cupredoxina que conservam essa atividade quimiopreventiva. Essas variantes, derivados e equivalentes estruturais podem ser produzidos, por exemplo, criando-se uma “biblioteca” de várias variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas e peptídeos derivados de cupredoxina e então testando cada uma delas 25 quanto à atividade quimiopreventiva, e especificamente a atividade quimiopreventiva na cultura de órgão de células de glândulas mamárias de camundongos, usando um dos muitos métodos conhecidos na técnica, tais como os métodos do Exemplo 1. Supõe-se que as variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas resultantes com atividade quimiopreventiva possam ser usados nos métodos da invenção em vez da adição à azurina ou p28.

Em algumas configurações específicas, a variante, derivado ou equivalente estrutural da 5 cupredoxina pode inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas induzidas por 7,12-dimetiIbenz (a) antraceno (DMBA) em uma cultura de órgão de células de glândulas mamárias de camundongos (MMOC) a um grau estatisticamente diferente do controle sem tratamento. Um peptídeo pode ser testado quanto a essa atividade usando o sistema de modelo MMOC descrito no Exemplo 1 ou em Mehta et al. (J. Natl Cancer Inst 93:1103-1106 (2001)) e Mehta et al. (Meth Cell 10 Sci 19:19-24 (1997)). Outros métodos para determinar se o desenvolvimento do câncer é inibido são bem conhecidos na técnica e também podem ser usados.

Em algumas configurações, a variante, derivado ou equivalente estrutural da cupredoxina inibe o desenvolvimento de lesões do alvéolo mamário (MAL) no modelo de um MMOC em um grau que é estatisticamente diferente de um controle sem tratamento. Em algumas configurações, a 15 variante, derivado ou equivalente estrutural da cupredoxina inibe o desenvolvimento de lesões do duto mamário (MDL) no modelo de um MMOC em um grau que é estatisticamente diferente de um controle sem tratamento. Um peptídeo pode ser testado quanto a essas atividades usando o sistema do modelo MMOC induzido para formar lesões pré-malignas por DMBA, conforme descrito no Exemplo I. A avaliação do desenvolvimento de lesões pré-malignas no sistema do modelo de 2 0 MMOC pode ser determinada por análise morfomética ou análise histopatológica, conforme previsto no Exemplo 1.

Em algumas configurações específicas, a variante, derivado ou equivalente estrutural pode seletivamente entrar nas células cancerígenas e/ou tumores em células, tecidos e animais mamíferos. Em algumas configurações, a variante é um derivado ou equivalente estrutural de p 18. 2 5 Em algumas configurações, a variante, derivado ou equivalente estrutural pode seletivamente entrar nas células cancerígenas e/ou tumores em células, tecidos e animais mamíferos e liberar DNA ou RNA. Em algumas configurações, o DNA ou RNA é um gene ou parte de um gene. Em algumas configurações, o DNA ou RNA tem um efeito terapêutico, uma vez liberado.

Cupredoxinas

Essas pequenas proteínas de cor azul cobre (cupredoxinas) são proteínas de transferência 5 de elétrons (10-20 kDa) que participam das correntes de transferência eletrônica bacteriana ou que têm funções desconhecidas. O íon de cobre está unicamente ligado pela matriz protéica. Uma disposição especial planar triangular distorcida a dois ligandos histidina e um ligando cisteína à volta do cobre dá origem a propriedades eletrônicas muito peculiares do sítio do metal e a uma coloração azul intensa. Várias cupredoxinas foram caracterizadas cristalograficamente em 10 resoluções média a alta.

As cupredoxinas em geral possuem uma homologia de baixa seqüência, mas uma alta homologia estrutural. Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000). Por exemplo, a seqüência de aminoácidos da azurina é 31% idêntica à da auracianina B, 16,3% da rusticianina, 20,3 % da plastocianina e 17,3% da pseudoazurina. Vide 15 Tabela 1. Entretanto, a similaridade estrutural dessas proteínas é mais acentuada. O valor p VAST para a comparação da estrutura da azurina com a auracianina B é IO'74, da azurina com a rusticianina é IO'5, da azurina com a plastocianina é IO'5 6 e da azurina com a pseudoazurina é IO'41.

Todas as cupredoxinas possuem um cilindro beta [beta-barrel] grego com oito cepas ou dobra beta-sandwich e possuem uma arquitetura de sítio altamente conservada. De Rienzo et al., 2 0 Protein Science 9:1439-1454 (2000). Um importante adesivo hidrofóbico, devido à presença de vários resíduos alifáticos de cadeia longa, como as metioninas e leucinas, está presente à volta do sítio de cobre nas azurinas, amicianinas, plastocianinas cianobacterianas, proteína básica do pepino e, em menor proporção, nas plastocianinas pseudoazurinas e eucarióticas. Id. Os adesivos hidrofóbicos também são encontrados em menor proporção nos sítios de cobre estelacianina e 2 5 rusticianina, mas com diferentes características. Id. Tabela 1. Seqüência e alinhamento estrutural da azurina (IJZG) de P. aeruginosa a outras proteínas usando o algoritmo VAST.

PDB Comprimento % a a Valor P2 Classificação3 RMSD' Descrição Alinhamentos1 identidade IAOZ A 2 82 18,3 10e-7 12,2 1,9 Ascorbato oxidase IQHQA 113 31 10e-7,4 12,1 1,9 Auracianina B 1V54B 1 79 20,3 10e-6,0 11,2 2,1 Citocromo c oxidase 1 GY2 A 92 16,3 10e-5,0 11,1 1,8 Rusticianina 3MSP A 74 8,1 IOe-6,7 10,9 2,5 Principal Esperma Móvel Proteina5 IIUZ 74 20,3 10e-5,6 10,3 2,3 Plastocianina IKGYE 90 5,6 10e-4,6 10,1 3,4 Efrina b2 IPMY 75 17,3 10e-4,l 9,8 2,3 Pseudoazurina 'Comprimento Alinhado: O número de pares equivalentes de átomos C-alfa superposto entre as duas estruturas, isto é, quantos resíduos foram usados para calcular a superposição 3D.

2P-VAL: O valor p VAST é uma medida da relevância da comparação, expressa como

probabilidade. Por exemplo, se o valor p for 0,001, então as proporções são 1000 para 1 de ver uma combinação dessa qualidade por puro acaso. O valor p do VAST é ajustado para os efeitos de múltiplas comparações usando a suposição de haver 500 tipos independentes e não relacionados de domínios na base de dados MMDB. O valor p mostrado corresponde assim ao valor p da comparação pareada de cada par do domínio dividido por 500.

3Classificação: A classificação de similaridade estrutural VAST. Esse número se refere ao número de elementos estruturais secundários superpostos e a qualidade desta superposição. Maiores classificações VAST se correlacionam com uma maior similaridade.

4RMSD: A superposição do valor quadrático médio residual em Angstroms. Esse número é calculado após a superposição ideal de duas estruturas, como a raiz quadrada das distâncias médias quadráticas entre os átomos equivalentes C-alfa. Observe que o valor RMSD se equilibra com o alcance dos alinhamentos estruturais e que essa dimensão deve ser levada em consideração ao ser usado o RMSD como descritor de similaridade estruturai geral. A proteína do esperma principal 5C. elegans provou ser um antagonista da efrina na maturação do oócito. Kuwabara, Genes and Development 17:155-161 (2003).

Azurina

As azurínas são proteínas que contêm cobre de 128 resíduos de aminoácidos que pertencem 5 à família das cupredoxinas envolvidas na transferência de elétrons em determinadas bactérias. As azurinas incluem as de P. aeruginosa (PA) (SEQ ID NO: 1), A. xylosoxidans e A. denitrificans. Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-871 (2002). A identidade da seqüência de aminoácidos entre as azurinas varia entre 60-90%, e essas proteínas demonstraram uma forte homologia estrutural. Todas as azurinas têm uma característica de β-sandwich com motivo de letra grega e o átomo 10 simples de cobre é colocado sempre na mesma região da proteína. Além disso, as azurinas possuem um adesivo hidrofóbico essencialmente neutro à volta do sítio de cobre. Id.

Plastocianinas

As plastocianinas são proteínas solúveis de cianobactérias, algas e plantas que contêm uma molécula de cobre por molécula e são azuis em suas formas oxidadas. Ocorrem no cloroplasto, 15 onde operam como portadoras de elétrons. Como a determinação da estrutura da plastocianina poplar em 1978, a estrutura das algas (Scenedesmus, Enteromorpha, Chlamydomonas) e de plastocianinas de plantas (feijão francês) foi determinada tanto por métodos cristalográficos ou métodos NMR, e a estrutura poplar foi refinada para resolução 1,33 Â. A SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de aminoácidos da plastocianina de Phormidium laminosum, uma cianobactéria 2 0 termofílica. Outra plastocianina de interesse é de uivaperíussis.

Apesar da divergência de seqüência entre as plastocianinas de algas e de plantas vasculares (ex., 62% de identidade seqüencial entre Chlamydomonas e proteínas poplares), são conservadas as estruturas tridimensionais (ex., 0,76 Â rms de desvio nas posições C alfa entre a Chlamydomonas e as proteínas Poplar). As características estruturais incluem um sítio de ligação de cobre tetraédrico 2 5 distorcido em uma extremidade de um cilindro beta antiparalelo de oito cepas, um acentuado adesivo negativo e uma superfície hidrofóbica plana. O sítio de cobre é otimizado para sua função de transferência de elétrons, e os adesivos negativos e hidrofóbicos são propostos para envolvimento no reconhecimento de associados em reações fisiológicas. Experimentos de modificação química, de reticulações e de mutagênese direcionada para sítio confirmaram a importância dos adesivos negativos e hidrofóbicos nas interações de ligação com o citocromo f, e 5 validaram o modelo de dois caminhos de transferência de elétrons funcionalmente significativos envolvendo a plastocianina. Um suposto caminho de transferência de elétrons é relativamente curto (aproximadamente 4 Â) e envolve o ligando de cobre exposto a solvente His-87 no adesivo hidrofóbico, enquanto o outro é mais extenso (aproximadamente 12-15 Â) e envolve o resíduo quase conservado Tyr-83 no adesivo negativo. Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 10 (1994).

Rusticianinas

As rusticianinas são polipeptídeos de cadeia simples contendo cobre azul obtidas a partir de uma Thiobacillus (agora denominada Acidithiobacillus). Foi determinada a estrutura cristalina em raios-X da forma oxidada da rusticianina cupredoxina estável e altamente oxidante da Thiobacillus 15 ferrooxidans (SEQ ID NO: 4) por difração anômala multicomprimento de ondas e refinada para resolução 1,9A. As rusticianinas são compostas de uma dobra de núcleo beta-sandwich composta de uma folha b com seis e sete cepas. Como as demais cupredoxinas, o íon de cobre é coordenado por um aglomerado de quatro resíduos conservados (His 85, Cysl38, Hisl43, Metl48) dispostos em um tetraedro distorcido. Walter, R.L. et al., J. Mol. Biol 263:730-51 (1996).

2 0 Pseudoazurinas

As pseudoazurinas são uma família de polipeptídeos de cadeia simples contendo cobre azul. A seqüência aminoácida da pseudoazurina obtida a partir do Aehromobacter cyeloclastes é mostrada na SEQ ID NO: 5. A análise estrutural de raios-X da pseudoazurina mostra que possui uma estrutura similar à das azurinas, apesar de haver uma homologia de baixa seqüência entre essas 2 5 proteínas. Existem duas principais diferenças entre a estrutura geral das pseudoazurinas e das azurinas. Existe uma extensão terminal carboxílico nas pseudoazurinas, relativa às azurinas, que consiste em duas hélices alfa. Na região média do peptídeo, as azurinas contêm um Ioop estendido, reduzido nas pseudoazurinas, que forma um flap contendo uma curta hélice a. As únicas principais diferenças no sítio do átomo de cobre são a conformação da cadeia lateral MET e o comprimento da ligação de cobre Met-S, que é significativamente mais curta na pseudoazurina do que na 5 azurina.

Fitocianinas

As proteínas que se identificam como fitocianinas incluem, sem limitação, a proteína básica do pepino, a estelacianina, a mavicianina, a umecianina, uma cupredoxina da casca do pepino, uma suposta proteína azul cobre nas vagens de ervilhas e uma proteína cobre azul da 10 Arabidopsis thaliana. Em todas, à exceção da proteína básica do pepino e da proteína da vagem da ervilha, o ligando de metionina axial normalmente encontrado nos sítios de cobre azul é substituído pela glutamina.

Auracianina

Foram isoladas três pequenas proteínas azul cobre denominadas auracianina A, auracianina 15 B-I e auracianina B-2 a partir da bactéria fotossintética termofílica verde de deslizamento Chloroflexus aurantiacus. As duas formas B são glicoproteínas e possuem propriedades quase idênticas entre si, mas são distintas da forma A. A eletroforese do gel sódio dodecil sulfato poliacrilamida demonstra massas moleculares monoméricas aparentes como 14 (A), 18 (B-2) e 22 (B-I) kDa.

2 0 A seqüência aminoácida da auracianina A foi determinada e mostrou que a auracianina A é

um polipeptídeo com 139 resíduos. Van Dreissche et al·,. Protein Science 8:947-957 (1999). His58, Cysl23, His 128 e Metl32 são espaçadas de maneira a se esperar como se fossem os ligandos metálicos evolucionários conservados como nas conhecidas pequenas proteínas de cobre, plastocianina e azurina. A previsão estrutural secundária também indica que a auracianina tem uma 2 5 estrutura geral de cilindro beta grego similar à da azurina da Pseudomonas aeruginosa e da plastocianina de folhas poplares. Entretanto, a auracianina parece ter características seqüenciais de ambas as classes seqüenciais das pequenas proteínas de cobre. A similaridade geral com uma seqüência de consenso da azurina é aproximadamente a mesma que a da seqüência de consenso da plastocianina, isto é 30,5%. A região da seqüência N-terminal 1-18 da auracianina é notavelmente rica em glicina e aminoácidos hidroxílicos. Id. Vide seqüência aminoácida exemplar SEQ ID NO: 5 15 para a cadeia A da auracianina da Chloroflexus aurantiacus (NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874).

A molécula da auracianina B tem uma dobra padrão de cupredoxina. Foi estudada a estrutura cristalina da auracianina B da Chloroflexus aurantiacus. (Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001).) À exceção de uma cepa N-terminal adicional, a molécula é muito similar à da 10 cupredoxina bacteriana, a azurina. Como nas outras cupredoxinas, um dos ligandos de Cu se situa na cepa 4 do polipeptídeo, e os outros três se situam ao longo de um grande Ioop entre as cepas 7 e 8. A geometria do sítio Cu é discutida com referência ao espaçamento aminoácido entre os últimos três ligandos. O domínio da ligação Cu caracterizado cristalograficamente da auracianina B é provavelmente limitado ao lado periplásmico da membrana citoplásmica por uma cauda N-terminal 15 que demonstra identidade seqüencial significativa com conhecidas restrições em várias outras proteínas de transferência de elétrons associadas a membranas. As seqüências aminoácidas das formas B estão apresentadas em McManus et al. J. Biol Chem. 267:6531-6540 (1992). Vide seqüência aminoácida exemplar em SEQ ID NO: 16 para a cadeia B de auracianina do Chloroflexus aurantiacus (NCBI Protein Data Bank Accession No. I QHQA).

2 0 Estelacianina

As estelacianinas são uma subclasse de fitocianinas, lima família onipresente de cupredoxinas plantas. Uma seqüência exemplar de uma estelacianina está ora incluída como SEQ ID NO: 14. Também é conhecida a estrutura cristalina da umecianina, uma estelacianina de raizforte (Koch et al., J. Am. Chem. Soe. 127:158-166 (2005)) e estelacianina de pepino (Hart et al., 2 5 Protein Science 5:2175-2183 (1996)). A proteína tem uma dobra geral similar às demais fitocianinas. A estrutura terciária do ectodomínio da efrina B2 tem uma similaridade significativa com a estelacianina. Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001). Uma seqüência aminoácida exemplar de uma estelacianina é encontrada no National Center for Biotechnology Information Protein Data Bank as Accession No. IJER, SEQ ID NO: 14.

Proteína básica do pepino

Uma seqüência aminoácida exemplar de uma proteína básica do pepino está ora incluída como SEQ ID NO: 17. A estrutura cristalina da proteína básica do pepino (CBP), uma proteína cobre azul tipo 1, foi refinada com resolução 1,8 Â. A molécula assemelha-se a outras proteínas cobre azul tendo uma estrutura cilindro de beta grego, exceto pelo cilindro estar aberto de um lado, sendo melhor descrito como “beta-sandwich” ou “beta-taco”. Guss etal., J. Mol Biol. 262:686-705

(1996). A estrutura terciária do ectodomínio da proteína efrina B2 tem uma grande similaridade (desvio rms 1,5Â para os carbonos 50 a) com a proteína básica do pepino. Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001).

O átomo de Cu tem a coordenação NNSS' cobre azul normal com comprimentos de ligação Cu-N(His39) = 1,93 A, Cu-S(Cys79) = 2,16 A, Cu-N(His84) = 1,95 A, Cu-S(Met89) = 2,61 A. Uma ligação dissulfeto, (Cys52)-S-S-(Cys85), parece desempenhar um importante papel na estabilização da estrutura molecular. A dobra polipeptídeo é típica de uma subfamília de proteínas cobre azul (fitocianinas), assim como para a não metaloproteína, alérgeno da ambrosia americana Ra3, com a qual a CBP tem um alto grau de identidade seqüencial. As proteínas atualmente identificáveis como fitocianinas são CBP, estelacianina, mavicianina, umecianina, uma cupredoxina da casca do pepino, uma suposta proteína de cobre azul em vagens de ervilhas e uma proteína de cobre azul da Arabidopsis thaliana. Em todas, à exceção da CBP e a proteína de vagens de ervilhas, o ligando de metionina axial normalmente encontrado nos sítios de cobre azul é substituído pela glutamina. Uma seqüência exemplar da proteína básica do pepino é encontrada em NCBI Protein Data Bank Accession No. 2CBP, SEQ ID NO: 17.

Métodos de Uso A invenção fornece métodos para prevenir malignidades de novo em outros pacientes saudáveis, compreendendo a administração ao paciente de pelo menos um peptídeo que é uma cupredoxina ou variante, derivado ou equivalente estrutural da mesma, conforme descrito acima. As terapias quimiopreventivas são baseadas na hipótese de que a interrupção dos processos 5 envolvidos no cancergênese impedirá o desenvolvimento de câncer. Sabe-se agora que a cupredoxina da azurina Pseudomonas aeruginosa e o peptídeo p28 da azurina truncada inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas, seja inibindo a formação inicial de lesões pré-malignas ou exterminando ou inibindo o crescimento de lesões pré-malignas que estão presentes. Contempla-se, portanto, que uma cupredoxina, ou sua variante, derivado ou equivalente estrutural, conforme 10 descrito acima, com a habilidade de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas pode ser utilizado em terapias quimiopreventivas em outros pacientes saudáveis. Esses outros pacientes saudáveis são, em algumas configurações, pacientes com maior risco de desenvolvimento do câncer comparado à população em geral. Os tipos de câncer que podem ser prevenidos pelo tratamento com as composições da invenção incluem, entre outros, câncer de melanoma, mama, 15 pâncreas, glioblastoma, astrocitoma, pulmão, colorretal, garganta e cabeça, bexiga, próstata, pele e cervical. Em algumas configurações, o paciente pode ser humano. Em outras configurações, o paciente não é humano.

A invenção ainda inclui métodos para o estudo do desenvolvimento do câncer, compreendendo o contato com células de mamíferos antes e depois da indução de um carcinógeno 2 0 com uma composição que compreende cupredoxina ou uma variante, derivado ou seu equivalente estrutural, e observando o desenvolvimento das células. Em algumas configurações, as células são células de glândulas mamárias de camundongos, enquanto em outras são células que podem se tornar malignas nos mamíferos.

Os pacientes em maior risco de desenvolvimento de câncer comparado à população em 2 5 geral podem ser pacientes com maiores características de risco, pacientes com lesões pré-malignas e pacientes que foram curados de seus cânceres iniciais ou definitivamente tratados de suas lesões pré-malignas. Ver geralmente Tsao et al., CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004). As características de maior risco podem ser comportamentais, genéticas, ambientais ou fatores fisiológicos do paciente. Os fatores comportamentais que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, o fumo, dieta, consumo de álcool, terapia de reposição hormonal, maior 5 índice de massa corporal, nuliparidade, uso de noz betei, uso freqüente de enxágües bucais, exposição ao papiloma vírus humano, exposição solar na infância ou crônica, idade precoce no primeiro contato sexual, múltiplos, parceiros sexuais e uso de contraceptivos orais. Os fatores genéticos que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, histórico familiar de câncer, condição de portador genético de BRCAl e BRAC2, histórico anterior de 10 neoplasia de mama, polipose adenomatosa familiar (FAP) câncer colorretal não polipósico hereditário (HNPCC), cabelos vermelhos ou louros e fenótipo de pele, xenoderma pigmentosum e etnicidade. As características ambientais que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, a exposição ao radônio, a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, níquel, cromatos, arsênico, amianto, éteres clorometílicos, benzo[a]pireno, radiação e aminas aromáticas 15 de exposição ocupacional à borracha ou à tinta. Outros vários fatores que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, a doença pulmonar obstrutiva crônica com obstrução de fluxo de ar, infecções crônicas de bexiga, esquistossomíase, idade avançada e condição de imunocomprometimento.

Além disso, os pacientes com maior risco de desenvolvimento de câncer podem ser 2 0 determinados pelo uso de vários modelos de risco que foram desenvolvidos para determinados tipos de câncer. Por exemplo, os pacientes predispostos ao câncer de mama podem ser determinados usando o modelo de risco de Gail, ou o modelo de Claus, entre outros. Ver Gail et al., J Natl Cancer Inst 81:1879-1886 (1989); Cuzick, Breast 12:405-411 (2003); Huang et al., Am J Epidemiol 151:703:714(2000).

Os pacientes com lesões pré-malignas possuem maior risco de desenvolvimento de câncer

do que a população geral. A presença de lesões pré-malignas em um paciente pode ser determinada por vários métodos bem conhecidos na técnica. Marcadores intermediários ou biomarcadores que se originam das lesões pré-malignas podem ser medidos em um paciente para determinar se o paciente abriga lesões pré-malignas. As anormalidades cromossômicas ocorrem em células de tumor e nos tecidos adjacentes histologicamente normais na maioria dos pacientes de câncer. A 5 progressão das anormalidades cromossômicas está em paralelo com a progressão fenotípica da lesão pré-maligna do câncer invasivo. Thiberville et al., Cancer Res. 55:5133-5139 (1995). Portanto, as anormalidades cromossômicas associadas com o câncer podem ser usadas como marcadores intermediários para a detecção de lesões pré-malignas em um paciente. As anormalidades cromossômicas comuns associadas ao câncer incluem, sem limitações, deleções 10 alélicas ou a perda de heterozogosidade (LOH) nos genes de supressão de tumores como o 3p (FHIT e outros), 9p (9p21 para pl6!NK\ pl5,NK4li e pl9Am) 17p (17pl3 para gene p53 e outros.) e 13q (13ql4 para gene retinoblastoma Rb e outros). As deleções em 3p e 9p estão associadas ao fumo e aos primeiros estágios de câncer pulmonar. Mao et al., J. Natl Cancer Inst. 89:857-862

(1997). As deleções que afetam 3p, 5q, 8p, I7p e 18q são a alteração comum nos cânceres epiteliais. Ver geralmente Tsao et al., CA Clin Cancer J. Clin 54:153 (2004). Outras mutações cromossômicas associadas ao câncer incluem aquelas que ativam oncogêneses. Os oncogenes, cuja presença pode ser usada como marcadores intermediários incluem, sem limitações, Ras, c-myc, fator de crescimento epidérmico, erb-B2 e ciclinas E, Dl e BI. Ver geralmente id. em 154.

Outros marcadores intermediários podem ser produtos de genes regulados para cima nas 2 0 células pré-malignas e nas células de câncer. Os genes que podem estar regulados para cima nas células pré-malignas incluem, sem limitações, ciclooxigenases COX-I e COX-2, telomerase. Outros biomarcadores de células de câncer e de algumas células pré-malignas incluem, sem limitações, p53, receptor do fator de crescimento epidérmico (GFR), antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), RAS, COX-2, Ki-67, DNA aneuplóide, DNA-polimerase-α, ER, 2 5 Uer2neu, E-caderina, RARp, hTERT, pl6,NK4a, FHIT (3pl4), Bcl-2, VEGF-R, infecção pelo HPV, LOH9p21, LOH 17p, p-AKT, /z«RNP A2/B1, RAF, Myc, c-KIT, ciclina Dl, E e BI, IGFl, bcl-2, pl6, U3H3p21.3, LOH3ρ25, LOH9ρ21, L0H7 7ρ13, LOH 13g, LOH8ρ, hMSH2, APC, DCC, DPC4, JV18, ΒΑΧ, PSA, GSTP1, NF-kB, APl, D3S2, infecção HPV, LOH3ρ14, LOH4q, L0W5p, antígeno do tumor de bexiga (BTA), BTK TRAK (Alidex, Inc. Redmond WA), proteína da matriz do trato urinário 22, produto de degradação da fibrina, receptor do fator de motilidade autodrine, 5 BCLA-4, citoqueratina 20, ácido hialurônico, CYFRA 21-1, BCA, gonadotropina coriônica betahumana e antígeno polipeptídeo tissular (TPA). Ver geralmente id. em 155-157.

Os pacientes que foram curados de seus cânceres iniciais ou que foram tratados definitivamente de suas lesões pré-malignas também estão em maior risco de desenvolvimento de câncer que a população geral. Um segundo tumor primário se refere a um novo câncer primário em 10 uma pessoa com histórico de câncer. Os segundos tumores primários são a principal causa de mortalidade do câncer de garganta e cabeça. Id. em 150. Um segundo tumor primário é diferente de uma metástase, já que o primeiro se origina de novo enquanto o último se origina de um tumor existente. Os pacientes que foram curados de câncer ou de lesões pré-malignas da mama, cabeça e garganta, pulmão e pele estão particularmente em maior risco de desenvolverem segundos tumores 15 primários.

As composições que compreendem uma cupredoxina ou variante, derivado ou seu equivalente estrutural podem ser administradas ao paciente por várias vias e, em muitos regimes bem conhecidos na técnica. Em configurações específicas, a cupredoxina ou variante, derivado ou seu equivalente estrutural é administrada por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, 20 oral ou por inalação. As composições podem ser administradas ao paciente por qualquer meio que induza os peptídeos ao local no paciente que estiver em risco de desenvolvimento do câncer. Em configurações específicas, a cupredoxina ou variante, derivado ou seu equivalente estrutural é administrada por via intravenosa.

Em uma configuração, os métodos podem compreender a coadministração ao paciente'de 2 5 uma dose unitária de uma composição que compreende uma cupredoxina ou variante, derivado ou um equivalente estrutural da cupredoxina e uma dose unitária de uma composição que compreende outro medicamente quimiopreventivo, em qualquer ordem, administrado ao mesmo tempo ou em determinado tempo após a administração do outro, por exemplo, após um minuto a cerca de: 60 minutos após a administração do outro medicamento, ou cerca de 1 hora a cerca de 12 horas após a administração do outro medicamento. Os medicamentos quimiopreventivos de interesse incluem, 5 sem limitações, o tamoxifeno, os inibidores de aromatase como a letrozola e anastrozola (Arimidex®), retinóides como o N-[4-hidroxifenil]retinamida (4-HPR, fenretinida), agentes antiinflamatórios não esteroidais (AÍNES) como a aspirina e sulindac, celecoxib (inibidor COX2)difluoro metil ornitina (DFMO), ácido ursodeoxicólico, inibidores de reductase da coenzima A 3- hidroxi-3- metilglutaril, EKI-785 (inibidor EGFR), bevacizumab (anticorpo do receptor VEGF), 10 cetuximab (anticorpo do EGFR), retinol como a vitamina A, beta caroteno, ácido 13-cis retinóico, isotretinoína e palmitato de retinil, alfa-tocoferol, interferon, adenovírus oncolítico dll520 (ONYX

015), gefitinib, etretinato, finasteride, indole-3-carbinol, resveratrol, ácido clorogênico, raloxifeno e oltipraz.

Composições para Facilitar a Entrada Seletiva de Compostos em Células Cancerígenas e Tumores

A presente invenção diz respeito a métodos e materiais para a entrega de um composto de carga em uma célula. A entrega do composto de carga de acordo com esta invenção é realizada pelo uso de um polipeptídeo de transporte adequado. Em uma configuração da invenção, o composto de carga é ligado ao polipeptídeo de transporte. Peptídeos de transporte adequados 20 incluem uma cupredoxina, ou um fragmento de uma cupredoxina contendo um “domínio de entrada de cupredoxina”. A expressão “domínio de entrada de cupredoxina” se refere a um fragmento de uma cupredoxina que inclui a seqüência de amino que é necessária para a entrada de cupredoxina na célula cancerígena de um mamífero. Os compostos de carga entregues pela presente invenção incluem, não apenas, proteínas, lipoproteínas, polipeptídeos, peptídeos, 25 polissacarídeos, ácidos nucléicos, inclusive RNA, DNA e ácidos nucléicos anti-senso, corantes, etiquetas fluorescentes e radioativos, micropartículas ou nanopartículas, toxinas, moléculas orgânicas e inorgânicas, moléculas pequenas e medicamentos (por exemplo, medicamentos quimiopreventivos). Em algumas configurações, os medicamentos e toxinas matam células com tumor.

Em uma configuração da invenção, a cupredoxina é uma azurina, tal como a azurina de 5 Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: I). Em outras configurações da invenção, a cupredoxina é uma plastocianina, rusticianina ou pseudoazurina, entre outras. Em configurações específicas, a azurina é de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringa, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhea, Vibrio parahaemolyticus ou Bordetella bronchiseptica, entre outras.

Em uma configuração, um composto de carga é entregue para matar ou retardar a progressão do ciclo celular em uma célula, tal como uma célula cancerígena. Essa célula cancerígena pode ser, por exemplo, uma célula osteosarcoma, célula de carcinoma do pulmão, célula do carcinoma do colo, célula do linfoma, célula da leucemia, célula de sarcoma de tecido mole ou célula de carcinoma da mama, fígado, bexiga ou próstata, entre outras. Por exemplo, o composto de carga pode ser uma proteína de controle do ciclo celular, tal como p53; um inibidor de quinase dependente de ciclina, tal como pl6, p21 ou p27; uma proteína suicida, tal como timidiha, quinase ou nitroreductase; uma citoquina ou outra proteína imunomoduladora, tal como interleucin 1, interleucin 2 ou fator estimulador de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF); ou uma toxina, tal como exotocina A de Pseudomonas aeruginosa, entre outras. Em outras configurações, é fornecido um fragmento biologicamente ativo de uma das classes acima de compostos. Em outra 2 0 configuração, o composto de carga é fornecido para gerar uma imagem do tecido alvo. Por exemplo, o tecido alvo pode ser um câncer, e o composto de carga pode ser aquele normalmente utilizado para gerar uma imagem para detecção por tomografia computadorizada (CT) de raio X, Imagem de Ressonância Magnética (MRI) e ultrassom. Nestas configurações, o composto de carga é um raio gama ou radioisótopo emissor de positron, um agente de contraste por imagem de 2 5 ressonância magnética, um agente de contraste por raio X ou um agente de contraste por ultrassom. A invenção ainda inclui métodos de introdução seletiva de DNA ou RNA em célula cancerígena de um mamífero. Nessas configurações, o DNA ou RNA é o composto de carga. Em algumas configurações, o método inclui o fornecimento de p 18 acoplado ao DNA ou RNA e a introdução do composto no corpo de um mamífero. Em algumas configurações, o DNA ou RNA é 5 um gene ou fragmento de um gene. Em algumas configurações, o DNA ou RNA possui um efeito terapêutico, uma vez introduzido na célula de um mamífero.

Domínio de Entrada de Cupredoxina

A invenção prevê um domínio de transdução de proteínas que possibilita o transporte de cargas ligadas em células cancerígenas de mamíferos, e não em células não cancerígenas. 10 Descobriu-se que as proteínas de cupredoxina compreendem um domínio de transdução de proteínas, o domínio de entrada de cupredoxina, que facilita a entrada de cargas ligadas em células cancerígenas de mamíferos. Em algumas configurações, a proteína inteira de cupredoxina pode ser utilizada para facilitar o transporte ligado às cargas seletivamente em células cancerígenas. Em outras configurações, uma porção de uma cupredoxina pode ser utilizada para transportar cargas 15 ligadas em células cancerígenas. Em algumas configurações, o domínio de entrada de cupredoxina consiste em uma região de cupredoxina que é inferior à proteína de corpo inteiro tipo natural. Em algumas configurações, o domínio de entrada de cupredoxina consiste em mais de cerca de 10 resíduos, cerca de 15 resíduos ou cerca de 20 resíduos de uma cupredoxina. Em algumas configurações, o domínio de entrada de cupredoxina compreende não mais do que 20 aproximadamente 50 resíduos, aproximadamente 40 resíduos ou aproximadamente 30 resíduos de uma cupredoxina. Em algumas configurações, o domínio de entrada de cupredoxina possui no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüência de aminoácido ou no mínimo cerca de 99% de identidade de sequência: de aminoácido de uma cupredoxina.

2 5 Em algumas configurações, o domínio de entrada de cupredoxina é um domínio de entrada

de azurina. Em uma configuração da presente invenção, um domínio de entrada de azurina contém no mínimo aminoácidos 50 a 77 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 2). Em outra configuração da presente invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 36 a 77 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 27). Em outra configuração da presente invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo 5 aminoácidos 36 a 89 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 28). Em outra configuração da presente invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 36 a 128 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 29). Ainda em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 50 a 67 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 25). Em outra configuração da 10 invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 53 a 70 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 30). Ainda em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 53 a 64 de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 31).

Em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina é um domínio de 15 entrada de uma cupredoxina, exceto a azurina de P. aeruginosa. Em diferentes configurações·, o domínio de entrada de cupredoxina pode ser um fragmento de plastocianina da cianobactéria Phormidium laminosum (SEQ ID NO: 3), rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans (SEQ ID NO: 4); pseudoazurina de Achromobaeter eycloelastes (SEQ ID NO: 5), azurina de Pseudomonas syringae (SEQ ID NO: 21), azurina de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 10), azurina de Vibrio 20 parahaemolyticus (SEQ ID NO: 8) ou auracianina de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 15 e

16).

Em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 57 a 89 de auracianina B de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 20). Em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo 2 5 aminoácidos 51-77 de azurina de Pseudomonas syringae (SEQ ID NO: 21). Em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 89-115 de Laz Neisseria meningiíidis (SEQ ID NO: 22). Em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 52-78 de azurina Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO: 23). Em outra configuração da invenção, o domínio de entrada de cupredoxina contém no mínimo aminoácidos 51-77 de azurina de Bordetella bronchiseptica (SEQ ID NO: 24).

5 Modificação de Domínio de Entrada de Cupredoxina

Em outra configuração da presente invenção, um domínio de entrada de cupredoxina é quimicamente modificado ou geneticamente alterado para produzir variantes que retenham a capacidade de transportar um composto de carga em uma célula. Por exemplo, o Exemplo 14 demonstra que a azurina de Pseudomonas aeruginosa tendo resíduos de prolina introduzidos nas posições 54, 61 e 70 retém sua capacidade de entrada de células UISO-Mel-2.

Em outra configuração, o domínio de entrada de cupredoxina compreende uma seqüência de amino conservada DGXXXXXDXXYXKXXD (SEQ ID NO: 32) ou DGXXXXDXXYXKXXD (SEQ ID NO: 33) em que D é ácido aspártico, G é glicina, T é tirosina, K é Iisina e X é qualquer aminoácido. Vide Exemplo 17.

' Variantes de um domínio de entrada de cupredoxina podem ser sintetizados por técnicas padrão. Derivados são seqüências de aminoácidos formadas de compostos nativos diretamente ou por modificação ou substituição parcial. Análogos são seqüências de aminoácidos que possuem uma estrutura similar, mas não idêntica, ao composto nativo, mas diferem dele em relação a determinados componentes ou cadeias paralelas. Análogos podem ser sintetizados ou de uma 2 0 origem evolucionária diferente.

Variantes podem ser de corpo inteiro ou diferente de corpo inteiro se a derivada, ou análogo, contiver um aminoácido modificado. Variantes de um domínio de entrada de cupredoxina incluem, mas não apenas, moléculas compreendendo regiões que são substancialmente análogas ao domínio de entrada de cupredoxina pela identidade de cerca de pelo menos 65%, 70%, 75%, 85%, 2 5 90%, 95%, 98% ou 99% de uma seqüência de aminoácido de dimensão idêntica ou quando comparada a uma seqüência alinhada na qual o alinhamento é realizado por um algoritmo de homologia.

Em outra configuração, as variantes de um domínio de entrada de cupredoxina possuem uma semelhança estrutural significativa com resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (SEQ ID 5 NO: 2). Em outras configurações, as variantes de um domínio de entrada de cupredoxina possuem uma semelhança estrutural significativa com resíduos 50-67 de azurina de P. aeruginosa (SEQ ID NO: 25). Exemplos de estudos que determinam a homologia estrutural significativa entre cupredoxinas e outras proteínas incluem Toth et al. (Developmental Cell 1:82-92 (2001)). Especificamente, a homologia estrutural significativa entre uma variante do domínio de entrada de 10 cupredoxina e os resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (SEQ ID NO: 2) é determinada utilizando o algoritmo VAST (Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995)). Em configurações específicas, o valor p VAST a partir da comparação estrutural de uma variante do domínio de entrada de cupredoxina e os resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (SEQ ID NO: 2) é inferior a cerca de IO'3, inferior a IO'5 ou inferior a 15 IO'7. Em outras configurações, a homologia estrutural significativa entre uma variante do domínio de entrada de cupredoxina e os resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (SEQ ID NO: 2) pode ser determinada utilizando o algoritmo DALI (HoIm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)). Em configurações específicas, o escore Z DALI para uma comparação estrutural pairwise é cerca de no mínimo 3,5, 7,0 ou 10,0.

2 0 Podem ser feitas modificações ao domínio de entrada de cupredoxina utilizando métodos

conhecidos na técnica, tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeos (direcionada em paralelo), seanning de alanina e mutagênese por PCR. A mutagênese direcionada em paralelo (Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-50 (198Í7)), mutagênese cassette, mutagênese de seleção de restrição (Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)) ou 2 5 outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir um ácido nucléico variante do domínio de entrada de cupredoxina. Além disso, os nucleotídeos que codificam domínios de entrada com similaridade estrutural àquela dos domínios de entrada de cupredoxina podem ser sintetizados por métodos bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, moléculas; de proteína que forem domínios de entrada de cupredoxina variante ou do tipo natural podem ser sintetizadas por métodos bem conhecidos na técnica.

5 Ácidos Nucléicos Codificadores para um Domínio de Entrada de Cupredoxina e

Complexo de um Domínio de Entrada de Cupredoxina Ligado a um Composto de Carga

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico codificadora de uma proteína de fusão compreendendo um domínio de entrada de cupredoxina ligado a um composto de carga, em que o composto de carga é uma proteína ou peptídeo. A 10 molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser preparada por uma combinação de técnicas conhecidas. Por exemplo, as seqüências de ácido nucléico para o domínio de entrada de cupredoxina e o composto de carga podem ser individualmente preparadas por síntese química ou clonagem. As seqüências de ácido nucléico são então ligadas em ordem com um ligase para dar uma molécula de ácido nucléico de interesse.

Métodos de Entrega de Composto de Carga utilizando Domínio de Entrada de

Cupredoxina

Sabe-se que muitos peptídeos ricos em arginina se translocam através de membranas de células de mamíferos e transportam compostos de carga de proteínas dentro dessas células. Suzuki, T., et al., J. Biol. Chem. 277:2437-43 (2002). Por exemplo, um segmento curto de aminoácido 11 2 0 rico em arginina (aminoácidos 47-57) de proteína Tat HIV permite o transporte de proteínas de carga em células de mamíferos. Schwarze, SR., et al., Trends Cell Biol. 10:290-95 (2000). Foi demonstrado que domínios de entrada sintéticos que reforçam o teor alfa-helical e otimizam a colocação de resíduos arginina aumentaram o potencial como domínios de transdução de proteínas. Ho, A., et al., Cancer Res. 61:474-77 (2001). Em comparação, a azurina de P. aeruginosa possui 2 5 um resíduo de arginina único. Acredita-se, portanto, porém sem embasamento na presente invenção, que o seu modo de entrada é diferente daquele da proteína Tat. A presente invenção engloba o uso daqueles fragmentos de cupredoxina que facilitam a entrada de um composto de carga em uma célula. Esses fragmentos podem ser determinados por qualquer método que identifique aqueles fragmentos necessários para a entrada em uma célula. Nesse método, um fragmento de cupredoxina é ligado a uma substância marcadora e um teste 5 realizado para determinar se o fragmento de cupredoxina entra em uma célula. Esses métodos podem ser utilizados para identificar os fragmentos adequados das cupredoxinas discutidas acima.

Em várias configurações da presente invenção, o composto de carga é ligado a uma cupredoxina ou seu fragmento, tal como a azurina de P. aeruginosa (SEQ ID NO: 1); plastocianina da cianobactéria Phormidium laminosum (SEQ ID NO: 3); rusticianina de Thiobacillus 10 ferrooxidans (SEQ ID NO: 4); ou pseudoazurina de Achromobacter cycloclastes (SEQ ID NO: 5), um fragmento de azurina de Pseudomonas syringae (SEQ ID NO: 21), azurina de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 10), azurina de Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO: 19), azurina de Bordelella bronchiseptica (SEQ ID NO: 8), auracianina A e B de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 15 e 16), entre outras proteínas de azurina e semelhantes à azurina. Em outras 15 configurações, a carga é ligada a um domínio de entrada de cupredoxina, tal como p28 (SEQ ID NO: 2) ou pl 8 (SEQ ID NO: 25).

Em várias configurações da presente invenção, um domínio de entrada de cupredoxina entrega um composto de carga em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, a entrega pode ser realizada in vitro adicionando o complexo de um domínio de entrada de cupredoxina e um 2 0 composto de carga em uma cultura celular, tal como pap smear. Alternativamente, a entrega pode ser realizada ex vivo adicionando o complexo em uma amostra removida de um paciente, por exemplo, sangue, tecido ou medula óssea e devolvendo a amostra tratada ao paciente. A entrega

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também pode ser realizada pela administração do complexo diretamente a um paciente. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para fins terapêuticos, profiláticos, diagnósticos ou de 2 5 pesquisa. Compostos de carga entregues pela presente invenção incluem, mas não apenas, proteínas, lipoproteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucléicos, inclusive ácidos nucléicos anti-senso, colorantes, micropartículas ou nanopartículas, toxinas, moléculas orgânicas e inorgânicas, pequenas moléculas e medicamentos.

Em uma configuração, uma substância detectável, por exemplo, uma substância fluorescente, tal como a proteína fluorescente verde; uma substância luminescente; uma enzima, tal 5 como beta-galactosidase; ou uma proteína radio-rotulada ou biotinilada é entregue para conferir um fenótipo detectável a uma célula. Da mesma forma, podem ser entregues micropartículas ou nanopartículas rotuladas com uma substância detectável, por exemplo, uma substância fluorescente. Um exemplo de nanopartículas adequadas é verificado na Patente dos Estados Unidos Na 6.383.500, depositada em 7 de maio de 2002, a qual é expressamente incorporada nesta patente 10 por referência. Muitas dessas substâncias detectáveis são conhecidas pelos especialistas.

Em algumas configurações, o composto de carga é uma substância detectável que é adequada para tomografia computadorizada por raio X, imagem de ressonância magnética, imagem de ultrasson ou cintigrafia radionuclídea. Nestas configurações, o composto de carga é administrado ao paciente para fins de diagnóstico. Um agente de contraste é administrado como um 15 composto de carga para ampliar a imagem de CT por raio X, MRI e ultrasson. A administração de um composto de carga radionuclídeo que é destinado ao tecido do tumor por meio do domínio de entrada de cupredoxina pode ser utilizada para cintigrafia radionuclídea. Em algumas configurações, o domínio de entrada de cupredoxina pode conter o radionucleotídeo na presença ou ausência de um composto de carga. Em outras configurações, o composto de carga é um raio gama 20 ou radioisótopo emissor de positron, um agente de contraste por imagem de ressonância magnética, um agente de contraste por raio X ou um agente de contraste por ultrassom.

Os agentes de contraste de ultrassom adequados para uso como compostos de carga

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incluem, mas não apenas, microbolhas de um gás biocompatível, transportador líquido e uma microesfera surfactante, compreendendo ainda um componente de ligação opcional, Ln, entre os 2 5 componentes alvo e as microbolhas. Neste contexto, o termo transportador líquido significa solução aquosa e o termo surfactante significa qualquer material anfifílico que produz uma redução na tensão interfacial de uma solução. Uma relação de surfactantes adequados para a formação de microesferas surfactantes é revelada na EP0727225A2, expressamente incorporada nesta invenção por referência. O termo microesfera surfactante inclui nanoesferas, lipossomos, vesículas e semelhantes. O gás biocompatível pode ser ar ou fluorocarboneto, tal como C3-C5 perfluoroalcano, 5 que fornece a diferença em ecogenicidade e assim o contraste em imagem de ultrassom. O gás é encapsulado ou contido na microesfera à qual é ligado 0 domínio de entrada de cupredoxina, opcionalmente por meio de um grupo ligante. A ligação pode ser covalente, iônica ou pelas forças de van der Waals. Exemplos específicos desses agentes de contraste incluem perfluorocarbonetos encapsulados lipídicos com uma série de peptídeos ligantes de receptor de neovasculatura de 10 tumor, polipeptídeos ou componentes peptidomiméticos.

Agentes de contraste por raio X adequados para uso como compostos de carga incluem, mas não apenas, um ou mais átomos de absorção de raio X ou átomos “pesados” de número atômico 20 ou maior, compreendendo ainda um componente de ligação opcional, Ln, entre 0 domínio de entrada de cupredoxina e os átimos de absorção de raio X. O átomo pesado 15 frequentemente usado em agentes de contraste de raio X é 0 iodo. Recentemente, foram revelados agentes de contraste de raio X que consistiam em quelatos metálicos (por exemplo, Patente dos Estados Unidos Na 5.417.959) e poliquelatos que consistiam em uma série de íons metálicos (por exemplo, Patente dos Estados Unidos Na 5.679.810). Mais recentemente, foram revelados como agentes de contraste de raio X complexos de aglomerados multinucleares (por exemplo, Patente 20 dos Estados Unidos Nq 5.804.161, PCT W091/14460 e PCT W092/17215).

Agentes de contraste de MRI adequados para uso como compostos de carga incluem, mas não apenas, um 011 mais íons paramagnéticos metálicos, compreendendo ainda um componente de ligação opcional, Ln, entre o domínio de entrada de cupredoxina e os íons paramagnéticos metálicos. Os íons paramagnéticos metálicos estão presentes na forma de complexos metálicos ou 25 partículas de óxido metálicas. As Patentes dos Estados Unidos Na 5.412.148 e 5.760.191 descrevem exemplos de quelatos para íons paramagnéticos metálicos para uso em agentes de contraste de MRI. A Patente dos Estados Unidos N2 5.801.228, a Patente dos Estados Unidos Ns 5.567.411 e a Patente dos Estados Unidos N2 5.281.704 descrevem exemplos de poliquelantes úteis na complexação de mais de um íon paramagnético metálico para uso em agentes de contraste de MRI. A Patente dos Estados Unidos N2 5.520.904 descreve composições particuladas que 5 consistem em íons paramagnéticos metálicos para uso como agentes de contraste de MRI.

Em uma configuração, um composto de carga é entregue para matar ou retardar a progressão do ciclo celular em uma célula, tal como uma célula cancerígena. Essa céluia cancerígena pode ser, por exemplo, uma célula osteosarcoma, céluia de carcinoma do pulmão, célula do carcinoma do colo, célula do linfoma, célula da leucemia, célula de sarcoma de tecido 10 mole ou célula de carcinoma da mama, fígado, bexiga ou próstata. Por exemplo, o composto de carga pode ser uma proteína de controle do ciclo celular, tal como p53; um inibidor de quinase dependente de ciclina, tal como pl6, p21 ou p27; uma proteína suicida, tal como timidina, quinase ou nitroreductase; uma citoquina ou outra proteína imunomoduladora, tal como interleucin 1, interleucin 2 ou fator estimulador de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF); ou uma toxina, tal 15 como exotocina A de Pseudomonas aeruginosa. Em outras configurações, é fornecido um fragmento biologicamente ativo de uma das classes acima de compostos.

Ainda em outra configuração, o composto de carga é um ácido nucléico. Em algumas configurações, o ácido nucléico codifica uma das classes acima de compostos. Ainda em outra configuração, o composto de carga é um medicamento usado para o tratamento do câncer. Esses 2 0 medicamentos incluem, por exemplo, 5-fluorouracil; Interferon a; Metotrexato; tamoxifeno; e Vincrinstine. Os exemplos acima são fornecidos somente para ilustração, muitos outros componentes são conhecidos pelos especialistas. Em outras configurações, o ácido nucléico é útil para terapia genética.

Compostos de carga adequados para o tratamento do câncer incluem, mas não apenas, 2 5 agentes de alquilação, tais como mostardas de nitrogênio, alquil sulfonatos, nitrosoureas, etileniminas e triazenos; antimetabolitos, tas como antagonistas de folato, análogos de purina e análogos de pirimidina; antibióticos, tais como antraciclinas, bleomicinas, mitomicina, dactinomicina e plicamicina; enzimas, tais como L-asparaginase; inibidores farnesil-protein transferase; inibidores 5.alfa-reductase; inibidores de 17.beta-hidroxiesteróide de-hidrogenase tipo 3; agentes hormonais, tais como glucocorticóides, estrogênios/antiestrogênios, androgênios/anti5 androgênios, progestinas e hormônio liberador do hormônio luteinizante, acetato de octreotida, agentes microtubulares disruptores, tais como ectoinascidinas ou seus análogos e derivados; agentes microtubu lares estabilizantes, tais como taxanos, por exemplo, paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere™) e seus análogos, e epotilonas, tais como epotilonas A-F e seus análogos; produtos derivados de plantas, tais como vinca alcalóides, epipodofilotoxinas, taxanos; e inibidores 10 de topiosomerase; inibidores de prenil-protein transferase; e agentes diversos, tais como hidroxiuréia, procarbazida, mitotano, hexametilmelamina, complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina e carboplatina; e outros agentes usados como agentes anti-cancerígenos e citotóxicos, tais como modificadores de resposta biológica, fatores de crescimento; imunomoduladores e anticorpos monoclonais.

Exemplos representativos destas classes de agentes anticancerígenos e citotóxicos incluem,

mas não apenas, cloridrato mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, melfalan, ifosfamida, busulfan, carmustin, lomustina, semustina, estreptozocina, tiopeda, dacarbazina, metotrexato, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribina, citarabina, fluorouracil, cloridrato de doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, sulfato de bleomicina, mitomicina C, actinomicina D, 20 safracinas, saframicinas, quinocarcinas, discodermolidas, vincristina, vinblastina, tartrato de vinorelbina, etoposida, fosfato de etoposida, teniposida, paclitaxel, tamoxifeno, estramustina, fostato de sódio estramustina, flutamida, buserelina, leuprolida, pteridinas, diineses, levamisola, aflacon, interferon, interleucinas, aldesleucina, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, cloridrato de irinotecan, betametosona, cloridrato de gemcitabina, altretamina e topoteca 2 5 e quaisquer de seus respectivos análogos ou derivados. Membros preferidos destas classes incluem, mas não apenas, paclitaxel, cisplatina, carboplatina, doxorubicina, carminomicina, daunorubicina, aminopterina, metotrexato, metopterin, mitomicina C, ecteinascidina 743, ou pofiromicina, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurina, gemcitabina, citosina arabinosida, podofilotoxin ou derivados de podofilotoxin, tais como etoposida, fosfato de etoposida ou teniposida, melfalan, vinblastina, vincristina, leurosidina, vindesina e leurosida.

Exemplos de agentes anticancerígenos e outros agentes citotóxicos úteis como compostos de carga incluem os seguintes: derivados de epotilona, conforme verificado na Patente Alemã Ns 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 10 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 e WO 00/00485; inibidores de quinase dependentes de ciclina, conforme verificado em WO 99/24416 (vide também Patente dos Estados Unidos Na 6.040.321); e inibidores de prenilprotein transferase como encontrados em WO 97/30992 e WO 98/54966; e agentes tais como aqueles descritos genérica e especificamente na Patente dos Estados Unidos N2 6.011.029 (cujos 15 compostos a Patente dos Estados Unidos pode ser empregada com quaisquer moduladores de NHR (incluindo, mas não apenas aqueles da presente invenção) como, por exemplo, moduladores de AR, moduladores de ER, com moduladores de LHRH ou com castração cirúrgica, especialmente no tratamento do câncer).

Os outros agentes terapêuticos acima, quando empregados como compostos de carga com 2 0 os compostos da presente invenção podem ser utilizados, por exemplos, naquelas quantidades indicadas na Referência Médica (PDR) ou conforme determinadas de outra maneira pelos especialistas.

Composições Farmacêuticas Contendo um Domínio de Entrada de Cupredoxina

Composições farmacêuticas contendo o complexo de um domínio de entrada de 2 5 cupredoxina ligado a um composto de carga podem ser produzidas em qualquer forma convencional, por exemplo, por mistura, dissolução, granulação, formação de drágea, emulsificação, encapsulamento, entrapeamento ou processos liofilizantes. O complexo pode ser facilmente combinado com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Os referidos veículos possibilitam que a preparação seja formulada como comprimido, pílula, drágea, cápsula, líquido, gel, xarope, pasta semifluida, suspensão e similares. Excipientes apropriados 5 podem também incluir, por exemplo, enchimentos e preparações de celulose. Outros excipientes podem incluir, por exemplo, agentes aromatizantes, colorantes, detackificantes, espessantes e outros aditivos aceitáveis, inclusive adjuvantes ou ligantes.

Essas composições podem ser utilizadas, por exemplo, na detecção ou imagem de um tipo de célula ou no tratamento de uma condição relacionada com a morte celular ou na sua prevenção. 10 As composições podem ser administradas em uma quantidade suficiente para prevenir ou tratar uma condição relacionada com a resistência à morte celular. Conforme usado aqui, a expressão “uma condição relacionada com a resistência à morte celular” se refere a uma doença, estado ou enfermidade caracterizada por pelo menos uma tendência para vida celular prolongada, quando comparada com uma célula saudável de espécie semelhante, conforme determinado por um médico 15 ou clínico especialista. Tipicamente, o organismo hospedeiro é um mamífero, tal como um humano ou animal.

Administração de Composições Contendo um Domínio de Entrada de Cupredoxina

Composições contendo um domínio de entrada de cupredoxina podem ser administradas por quaisquer vias apropriadas, por exemplo, por via oral, bucal, inalação, sublingual, retal, 2 0 vaginal, trans-uretral, nasal, tópica, percutânea, ou seja, transdérmico ou parenteral (incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intracoronária). As suas composições e formulações farmacêuticas podem ser administradas em qualquer quantidade eficaz para atingir seu propósito. Quando administrada para tratar uma condição relacionada com a resistência à morte celular, a composição é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. “Quantidade 25 terapeuticamente eficaz” é uma quantidade eficaz para prevenir o desenvolvimento ou amenizar os sintomas existentes do indivíduo em tratamento. A prescrição de uma quantidade terapeuticamente eficaz compete aos especialistas.

A dosagem apropriada variará, naturalmente, dependendo, por exemplo, do composto que contém o domínio de entrada de cupredoxina empregado, o hospedeiro, a forma de administração e a natureza e gravidade das condições tratadas ou diagnosticadas. No entanto, em uma configuração dos métodos da presente invenção, resultados satisfatórios do tratamento em humanos são indicados para obtenção em dosagens diárias de cerca de 0,001 a cerca de 20 mg/kg do peso corporal do composto contendo o domínio de entrada de cupredoxina. Em uma configuração, uma dosagem diária indicada para o tratamento em humanos pode variar de cerca de 0,7 mg a cerca de 1400 mg de um composto contendo o domínio de entrada de cupredoxina convenientemente administrado, por exemplo, em doses diárias, doses semanais, doses mensais e/ou dosagem contínua. Doses diárias podem ser em dosagens discretas de 1 a 12 vezes por dia. Alternativamente, doses podem ser administradas todos os dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, a cada semana e da mesma maneira em incrementos de dia até 31 dias. A dosagem pode ser contínua, intermitente ou única, utilizando qualquer forma de dosagem aplicável, incluindo comprimido, adesivos, administração intravenosa (i.v.) e semelhante. Mais especificamente, a composição é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em configurações específicas, a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 0,01-20 mg/kg do peso corporal. Em configurações específicas, o nível de dose é de cerca de 10 mg/kg/dia, cerca de 15 mg/kg/dia, cerca de 20 mg/kg/dia, cerca de 25 mg/kg/dia, cerca de 30 mg/kg/dia, cerca de 35 mg/kg/dia, cerca de 40 mg/kg/dia, cerca de 45 mg/kg/dia ou cerca de 50 mg/kg/dia.

O método de introdução de compostos contendo o domínio de entrada de cupredoxina pára pacientes é, em algumas configurações, a administração com outros medicamentos conhecidos no tratamento do câncer. Esses métodos são bem conhecidos na técnica. Em uma configuração 2 5 específica, os compostos contendo o domínio de entrada de cupredoxina fazem parte de um coquetel ou a dosagem com outros medicamentos no tratamento do câncer. Esses medicamentos incluem, por exemplo, aqueles relacionados na presente invenção e especificamente 5-fluorouracil; Interferon a; Metotrexato; Tamoxifeno e Vincrinstina. Os exemplos acima são fornecidos somente para ilustração, sendo que muitos outros desses compostos são conhecidos pelos especialistas.

Moléculas de ácido nucléico que codificam um domínio de entrada de cupredoxina, ou uma proteína de fusão combinando um domínio de entrada e um composto de carga, podem ser inseridas em vetores e utilizadas como vetores de terapia genética. Os vetores de terapia genética podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, por injeção intravenosa, administração local (Nabel et al, Patente dos Estados Unidos Nfi 5.328.470 1994. EUA), ou por injeção estereotática (Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 91, pp 3054-57 (1994)). A preparação farmacêutica de um vetor de terapia genética pode incluir um diluente aceitável ou compreender uma matriz de baixa liberação na qual o veículo de administração genética é inserido. Alternativamente, quando o vetor de administração genética completo pode ser produzido separadamente de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de administração genética. Em um aspecto, a composição é administrada como DNA de modo que o complexo seja

gerado in situ. Em uma configuração, o DNA é “nu”, conforme descrito, por exemplo, em Ulmer et al., Science 259:1745-49 (1993) e revisado por Cohen, Science 259 1691-92 (1993). A absorção de DNA nu pode ser aumentada revestindo o DNA em um veículo, por exemplo, uma gota biodegradável, que é eficientemente transportada para as células. Nesses métodos, o DNA pode 2 0 estar presente em uma série de sistemas de administração conhecidos pelos especialistas, inclusive sistemas de expressão de ácido nucléico, sistemas de expressão bacteriana e viral. Técnicas pára incorporar o DNA nesses sistemas de expressão são bem conhecidas pelos especialistas. Vide, por exemplo, W090/11092, W093/24640, WO 93/17706 e a Patente dos Estados Unidos N2 5.736.524.

2 5 Vetores utilizados para o transporte de material genético de organismo para organismo

podem ser divididos em duas categorias gerais: Vetores de clonagem são plasmídeos ou fagos de replicação com regiões que não são essenciais para a propagação em uma célula hospedeira apropriada e na qual o DNA estranho pode ser inserido; o DNA estranho é replicado e propagado como se fosse um componente do vetor. Um vetor de expressão (tal como plasmídeo, germe ou genoma de vírus animal) é utilizado para a introdução de material genético estranho em uma célula 5 hospedeira ou tecido a fim de fazer a transcrição e translação do DNA estranho, tal como o DNA da composição. Em vetores de expressão, o DNA introduzido é operacionalmente ligado a elementos como promovedores que sinalizam a célula hospedeira para fazer a transcrição do DNA inserido. Alguns promovedores são excepcionalmente úteis, tais como promovedores de indução que controlam a transcrição genética em resposta a fatores específicos. Um polinucleotídeo! de 10 composição operacionalmente ligado a um promovedor de indução pode controlar a expressão do polipeptídeo ou fragmentos da composição do domínio de entrada de azurina-wt. Exemplos de promovedores de indução clássicos incluem aqueles que são sensíveis ao α-interferon, choque térmico, íons metálicos pesados e esteróides, tais como glucocorticóides (Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-51 1 (1990)) e tetraciclina. Outros promovedores de indução desejáveis incluem 15 aqueles que não são perigosos para as células nas quais a construção é introduzida, porém, são sensíveis àquelas células quando o agente de indução é fornecido de maneira exógena. Em geral, os vetores de expressão úteis são, com frequência, os plasmídeos. No entanto, são previstas outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defectiva, adenovírus e vírus adeno-associados).

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A escolha de vetor é ditada pelo organismo ou pelas células utilizadas, e o destino desejado

do vetor. Em geral, vetores compreendem seqüências de sinal, origens de replicação, genes marcadores, elementos estimuladores, promovedores e seqüências de terminação de transcrição. I Kits Compreendendo um Complexo de Domínio de Entrada de CupredoxiiiaComposto de Carga

2 5 Em outro aspecto, a invenção fornece kits contendo um ou mais dos seguintes em pacote

ou recipiente: (1) um reagente compreendendo um complexo de domínio de entrada de cupredoxina ligado a um composto de carga; (2) um reagente contendo um adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável; (3) um veículo para administração, tal como uma seringa; (4) instruções para administração. Também são previstas configurações nas quais dois ou mais dos componentes (1) - (4) são encontrados no mesmo recipiente.

5 Composições Farmacêuticas Compreendendo Cupredoxina, um Domínio de Entrada

de Cupredoxina, um Domínio de Entrada de Cupredoxina - Complexo de Composto'de Carga, ou suas Variantes, Derivadas ou Equivalentes Estruturais

Composições farmacêuticas compreendendo cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais podem ser produzidas em qualquer forma convencional, por exemplo, por mistura, dissolução, granulação, formação de drágea, emulsificação, encapsulamento, entrapeamento ou processos liofilizantes. A cupredoxina substancialmente pura ou de grade farmacêutica, ou suas variantes, derivadas e equivalentes estruturais podem ser prontamente

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combinadas com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Os referidos veículos possibilitam que a preparação seja formulada como comprimido, pílula, drágea, cápsula, 15 líquido, gel, xarope, pasta semifluida, suspeiisão e similares. Portadores ou excipientes apropriados podem também incluir, por exemplo, enchimentos e preparações de celulose. Outros excipientes podem incluir, por exemplo, agentes aromatizantes, colorantes, detackificantes, espessantes e outros aditivos aceitáveis, inclusive adjuvantes ou ligantes. Em algumas configurações, a preparação farmacêutica é substancialmente livre de conservantes. Em outras configurações, a 2 0 preparação farmacêutica pode conter pelo menos um conservante. Metodologias gerais em formas de dosagem farmacêuticas são encontradas em Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms dnd Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, BaItimore MD (1999)). I

A composição compreendendo a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais usados na invenção, pode ser administrada em diversas formas, inclusive por injeção 2 5 (por exemplo, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal e similar), por inalação, administração tópica, supositório, adesivo transdérmico ou por via oral. Informações gerais sobre os sistemas de liberação de medicamento podem ser encontradas em Ansel et al, Id.. Em algumas configurações, a composição compreendendo a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser formulada e usada diretamente como injetáveis, por injeção intravenosa e subcutânea, entre outras. A formulação injetável, em especial, pode ser 5 vantajosamente utilizada para tratar pacientes adequados para a terapia quimiopreventiva. A composição compreendendo uma cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode também ser tomada por via oral após mistura com agentes protetores como polipropileno glicóis ou agentes de revestimento similares.

Quando a administração for por injeção, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou 10 equivalentes estruturais, pode ser formulada em soluções aquosas especificamente em tampões fisiologicamente compatíveis como solução de Hanks, solução de Ringer, ou salina fisiológica tamponada. A solução pode conter agentes formuladores como os de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser em forma de pó para a constituição com um veículo apropriado, por exemplo, 15 água livre de pirógeno estéril, antes do uso. Em algumas configurações, a composição farmacêutica não compreende um adjuvante ou qualquer outra substância adicionada para melhorar a resposta imunológica estimulada pelo peptídeo. Em algumas configurações, a composição farmacêutica compreende uma substância que inibe a resposta imunológica ao peptídeo.

Quando a administração for por fluidos intravenosos, a cupredoxina, ou suas variantes, 2 0 derivadas ou equivalentes estruturais podem ser compostos de cristalóides ou colóides. Os cristalóides, tais como aqueles utilizados aqui, são soluções aquosas de sais minerais ou outras moléculas solúveis em água. Os colóides como os aqui utilizados contêm grandes moléculas insolúveis, como a gelatina. Os fluidos intravenosos podem ser estéreis.

Os fluidos cristalóides que podem ser usados por administração intravenosa incluem, mas 2 5 não se limitam à salina normal (uma solução de cloreto de sódio a uma concentração de 0,9%), solução ou lactato de Ringer e a solução aquosa de dextrose a 5%, às vezes chamada de D5W, conforme descrito na Tabela 2.

Tabela 2. Composição das soluções cristalóides comuns

Solução Outro Nome [Na+] [Cl] [Glicose] D5W Dextrose a 5% 0 0 252 Dextrose a 3,3% / 2/3 e 1/3 salina a 0,3% 51 51 168 Salina seminormal NaCl a 0,45% 77 77 0 Salina normal NaCl a 0,9% 154 154 0 Lactato de Ringer* Solução de Ringer 130 109 0 A I /T I TV + ^ 2+ * Lactato de Ringer também possui 28 mmol/L de lactato, 4 mmol/L de K+ e 3 mmol/L de Ca2+.

Quando a administração for por inalação, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser liberada em forma de spray de aerossol de volumes pressurizados ou um nebulizador com o uso de propulsor apropriado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para liberar a quantidade medida. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo a mistura em pó de proteínas e uma base em pó apropriada, como a lactose ou amido.

Quando a administração for tópica, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser formulada como soluções, géis, ungüentos, cremes, gelatinas, suspensões e similares, como são bem conhecidos na técnica. Em algumas configurações, a administração é feita por meio de adesivo transdérmico. Quando a administração for por supositório (por exemplo, via retal ou vaginal), a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas e equivalentes estruturais, também pode ser formulada em composições contendo bases convencionais de supositório.

Quando a administração for por via oral, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser facilmente formulada pela combinação da cupredoxina, ou suas 5 variantes, derivadas ou equivalentes estruturais com portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Pode ser empregado um portador sólido, como manitol, lactose, estearató de magnésio e similares; os referidos portadores permitem que a cupredoxina, e suas variantes, derivadas e equivalentes estruturais, seja formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas semifluidas, suspensões e similares, por ingestão oral pelo paciente a 10 ser tratado. Para formulações orais sólidas como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, excipientes apropriados incluem enchimentos como açúcares, preparação de celulose, agentes granulantes e ligantes.

Outros portadores convenientes, como bem conhecidos na técnica, também incluem portadores polivalentes, como polissacarídeos capsulares bacterianos, um dextran ou um vetor 15 geneticamente construído. Além disso, as formulações de liberação prolongada que incluem a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais permitem a liberação da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais por longo tempo, tal que sem as formulações de liberação prolongada, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais seria eliminada do sistema do paciente e/ou degradada, por exemplo, por 20 proteases e hidrólises simples, antes de produzir ou melhorar um efeito terapêutico.

A meia-vida na corrente sangüínea dos peptídeos da invenção pode ser aumentada ou otimizada por diversos métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica. As variantes !de peptídeos da invenção podem incluir, entre outras, diversas variantes que podem aumentar sua estabilidade, atividade específica, longevidade na corrente sanguínea e/ou diminuir a 2 5 imunogenicidade da cupredoxina, mantendo a capacidade do peptídeo de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. Essas variantes incluem, mas não se limitam àquelas que reduzem a hidrólise do peptídeo, reduzem a diamidação do peptídeo, reduzem a oxidação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade estrutural do peptídeo ou aumentam o tamanho do peptídeo. Esses peptídeos também incluem peptídeos circularizados (Monk et al, BioDrugs 19(4):261 -78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), 5 D,L-peptídeos (diastereômero), (Futaki et al, J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al, Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1): 169-76, (1987)); peptídeos contendo aminoácidos incomuns (ver Lee et al, J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), modificações de terminais N- e C- (ver Labrie et al, Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), encadeamento de hidrocarbonetos (ver Schafmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 10 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004)) e peguilação.

Em várias configurações, a composição farmacêutica inclui portadores e excipientes (incluindo, mas não se limitando a tampões, carboidratos, manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes, agentes de suspensão, espessantes e/ou conservantes), água, óleos, soluções salinas, soluções aquosas de dextrose e 15 glicerol, outras substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme requerido para aproximar as condições fisiológicas, como agentes de tamponamento, de ajuste de tonicidade, umectantes e similares. Reconhece-se que, embora nenhum portador conhecido pelos especialistas na técnica possa ser empregado para administrar as composições desta invenção, o tipo de portador dependerá do modo de administração. Os compostos podem ser encapsulados com lipossomas 20 usando uma tecnologia bem conhecida. Microesferas biodegradáveis também podem ser empregadas comç> portadores para composições farmacêuticas desta invenção. Microesfefas biodegradáveis apropriadas foram reveladas, por exemplo, nas Patentes norte-americanas Ns 4.897.268, 5.075.109, 5.928.647, 5.811.128, 5.820.883, 5.853.763, 5.814.344 e 5.942.252.

As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas por conhecidas técnicas 2 5 convencionais ou por filtração estéril. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como tais ou liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução estéril antes da administração.

Administração de Cupredoxina, ou suas Variantes, Derivadas e Equivalentes Estruturais

A cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais podem ser 5 administrados formulados como composições farmacêuticas e administrados por quaisquer vias apropriadas, por exemplo, por via oral, bucal, inalação, sublingual, retal, vaginal, trans-uretral, nasal, tópico, percutâneo, ou seja, transdérmico ou parenteral (incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intracoronária) ou administração vítrea. As suas formulações farmacêuticas podem ser administradas em qualquer quantidade eficaz para atingir seu propósito 10 pretendido. Mais especificamente, a composição é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em configurações específicas, a quantidade terapeuticamente eficaz é geralmente cerca de 0,01 a 20 mg/dia/kg de peso corporal.

Os compostos compreendendo a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais são úteis para a prevenção do câncer, isoladamente ou em combinação com outros agentes ativos e/ou compostos de carga. A dosagem apropriada, naturalmente, variará de acordo com, por exemplo, o composto da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais empregadas, do hospedeiro, do modo de administração e da natureza e gravidade do potencial câncer. Entretanto, em geral, resultados satisfatórios em humanos são obtidos em doses diárias de aproximadamente 0,01 a 20 mg/kg de peso corporal. Uma dosagem diária em humanos 2 0 indicada varia de aproximadamente 0,7 mg a 1400 mg do composto da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais convenientemente administrada, por exemplo, em doses diárias, doses semanais, doses mensais e/ou dosagem contínua. Doses diárias podem ser discretas de 1 a 12 vezes por dia. Alternativamente, as doses podem ser administradas a cada dois dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada seis dias, a cada semana e similarmente em 2 5 incrementos diários de até 31 dias ou mais. Alternativamente, a dosagem poderá ser contínua pelo uso de adesivos, administração I.V. e similares. A exata formulação, via de administração e dosagem são determinadas pelo médico atendente tendo em vista a condição do paciente. A quantidade da dose e o intervalo podem ser ajustados individualmente para obter os níveis plasmáticos da cupredoxina ativa, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais com ou sem um composto de carga que sejam suficientes para 5 manter o efeito terapêutico. Geralmente, a cupredoxina desejada, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, é administrada em uma mistura com um portador farmacêutico selecionado considerando a via pretendida de administração e prática farmacêutica padrão.

Em um aspecto, a cupredoxina ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais é liberado como DNA tal que o polipeptídeo é gerado in silu. Em uma configuração, o DNA é 10 “despido”, conforme descrito, por exemplo, em Ulmer et al, (Science 259:1745-1749 (1993)) e revisado por Cohen (Science 259:1691-1692 (1993)). A absorção do DNA despido pode ser aumentada revestindo o DNA em um portador, por exemplo, esferas biodegradáveis, que são eficientemente conduzidas nas células. Nos referidos métodos, o DNA pode ser apresentado dentro de qualquer um dos diversos sistemas de liberação conhecidos pelos especialistas na técnica, 15 incluindo sistemas de expressão de ácido nucléico, viral e bacteriana. As técnicas de incorporação de DNA nesses sistemas de expressão são conhecidas pelos especialistas na técnica. Vide, por exemplo, W090/11092, W093/24640, WO 93/17706 e Patente norte-americana Na 5.736.524.

Vetores usados para movimentar material genético de organismo para organismo podem ser divididos em duas classes gerais: vetores de clonagem são fagos ou plasmídeo de replicação 20 com regiões que são essenciais para a propagação em uma célula hospedeira apropriada e no quâl o DNA estranho pode ser inserido; o DNA estranho é replicado e propagado como se fosse üm componente de um vetor. Um vetor de expressão (como plasmídeo, levedura, ou genoma de vírus de animal) é usado para introduzir material genético estranho em uma célula ou tecido hospedeiro a fim de transcrever e traduzir o DNA estranho, como o DNA da cupredoxina. Em vetores de 2 5 expressão, o DNA introduzido é operacionalmente ligado aos elementos como promotores que sinalizam à célula hospedeira para alta transcrição do DNA inserido. Alguns promotores são excepcionalmente úteis, como os promotores induzíveis que controlam a transcrição genética em resposta a fatores específicos. Ligando, de forma operável, a cupredoxina e variantes, derivadas ou equivalentes estruturais de seus polinucleotídeos a um promotor induzível, a expressão da cupredoxina e variantes seus derivativos pode ser controlada em resposta a fatores específicos.

Exemplos de promotores clássicos induzíveis incluem as que respondem à α-interferona, choque a quente, íons metálicos pesados e esteróides como os glucocorticóides (Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)) e tetraciclina. Outros promotores induzíveis desejáveis incluem os que não são endógenos às células, nas quais o constructo está sendo introduzido, mas são responsivos nas células em que o agente de indução é exogenamente fornecido. Em geral, vetores

de expressão úteis geralmente são os plasmídeos. Entretanto, são contempladas outras formas de vetor de expressão, como os vetores virais (por exemplo, retrovirose de replicação imperfeita, adenovirose e viroses adeno-associadas). Além disso, os peptídeos da presente invenção, incluindo p 18 em uma configuração, podem ser usados como vetor para a liberação seletiva de compostos terapêuticos em células cancerígenas ou tumores.

A escolha do vetor é determinada pelo organismo ou células que estão sendo usadas e o

destino desejado do vetor. Em geral, os vetores compreendem seqüências de sinais, origens de replicação, genes do marcador, sítios de polylinker, elementos estimuladores, promotores e seqüências de terminação da transcrição.

Kits compreendendo Cupredoxina, ou suas Variantes, Derivadas ou Equivalentes Estruturais

2 0 Em um aspecto, a invenção fornece regimes ou kits contendo um ou mais dos seguintes em

uma embalagem ou recipiente: (1) uma composição biologicamente ativa compreendendo! ao menos uma cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais; (2) ’um medicamento quimiopreventivo, (3) aparelho para administrar a composição biologicamente ativa ao paciente como, por exemplo, seringa, nebulizador etc.

2 5 Quando um kit é fornecido, os diferentes componentes da composição podem ser

embalados em recipientes separados caso for apropriado e imediatamente misturados antes do uso. A referida embalagem de componentes separados pode permitir armazenamento em longo prazo sem perder as funções do princípio ativo.

Os reagentes inclusos nos kits podem ser fornecidos em recipientes de qualquer tipo desde que a vida dos diferentes componentes seja preservada e não seja absorvida ou alterada pelos materiais do recipiente. Por exemplo, ampolas de vidro vedadas podem conter cupredoxina e suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais liofilizadas ou tampões que tenham sido embalados por meio de gás não reativo, neutro, como nitrogênio. As ampolas podem consistir de qualquer material apropriado, como vidro, polímeros orgânicos, como policarbonato, poliestireno, etc., cerâmica, metal ou qualquer outro material tipicamente empregado para manter os reagentes similares. Outros exemplos de recipientes apropriados incluem frascos simples que podem ser fabricados de substâncias similares às da ampola e invólucros, cujos interiores podem ser metalicamente revestidos com, por exemplo, alumínio ou uma liga. Outros recipientes incluem tubos de teste, frascos, flaconetes, garrafas, seringas ou similares. Os recipientes podem ter uma entrada de acesso estéril, como um frasco com tampa que pode ser perfurada por agulha de injeção hipodérmica. Outros recipientes podem ter dois compartimentos separados por uma membrana facilmente removível, que mediante sua remoção permite que os componentes sejam misturados. As membranas removíveis pode ser de vidro, plástico, borracha etc.

Os kits também podem ser fornecidos com materiais de instrução. As instruções podem ser impressas em papel ou em outra base, e/ou pode ser fornecido em meio eletrônico, como disco 20 flexível, CD-ROM, DVD-ROM, Zip, videotape, audiotape, dispositivo de memória flash, etc. Instruções detalhadas podem não estar fisicamente associadas ao kit, em vez disso, o usuário pode ser encaminhado a uma página da internet especificado pelo fabricante ou distribuidor do kit ou fornecido por correio eletrônico.

Modificação de Cupredoxina, Domínios de Entrada de Cupredoxina e suas Variantes, 2 5 Derivadas e Equivalentes Estruturais A cupredoxina ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais podem ser quimicamente modificadas ou geneticamente alteradas para produzir variantes e derivadas, conforme acima exposto. As referidas variantes e derivadas podem ser sintetizadas por técnicas padrão. Os domínios de entrada de cupredoxina podem ser modificados da mesma forma.

Além das variantes alélicas de ocorrência natural da cupredoxina, alterações podem ser

introduzidas por mutação nas seqüências de código da cupredoxina, que incorrem em alterações nas seqüências do aminoácido da cupredoxina codificada, que não altera significativamente a habilidade da cupredoxina de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é aquele que pode ser alterado a partir das seqüências do tipo natural 10 da cupredoxina sem alterar a atividade farmacológica, sendo que o resíduo “essencial” do aminoácido é necessário para a referida atividade farmacológica. Por exemplo, espera-se que os resíduos de aminoácidos que são conservados entre as cupredoxinas sejam particularmente pouco sensíveis à alteração, portanto, “essencial”.

São bem conhecidos na técnica aminoácidos, para os quais podem ser feitas substituições 15 conservadoras sem alterar a atividade do polipeptídeo. Substituições conservadoras úteis são mostradas na Tabeia 3, “Substituições preferidas.” Substituições conservadoras por meio dos quais um aminoácido de uma classe é substituído por um outro aminoácido do mesmo tipo fazem parte do escopo da invenção, desde que a substituição não altere significativamente a atividade biológica do composto.

2 0 Tabela 3. Substituições preferidas i

Resíduo original Exemplos de substituição Substituições

preferidas

Ala(A) Arg (R) Asn (N)

Vai, Leu, Ile Lys, Gin, Asn Gin, His, Lys, Arg

Val

Lys

Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly(G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Arg He (I) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucina, He, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys (K) Arg, Gin, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, Ile Leu Phe(F) Leu, Vai, He, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser, Phe Val (V) He, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucina Leu Substituições não conservadoras que afetam (1) a estrutura do suporte principal do polipeptídeo, como a conformação β-folha ou a-hélice, (2) a carga, (3) hidrofobicidade ou (4) o volume da cadeia lateral do sítio alvo podem modificar a atividade farmacológica. Os resíduos são divididos em grupos baseados nas propriedades da cadeia lateral, conforme mostrado na Tabela 4. As substituições não conservadoras acarretam na troca de um membro de uma dessas classes para outra classe. As substituições podem ser introduzidas nos sítios de substituição conservadoras ou mais especificamente nos sítios não conservados.

Tabela 4. Classes de aminoácido Classe Aminoácidos Hidrofóbica Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile Hidrofílica neutra Cys, Ser, Thr Acídica Asp, Glu Básica Asn, Gin, His, Lys, Arg Conformação de cadeia rompida Gly, Pro Aromática Trp, Tyr, Phe Os polipeptídeos variantes podem ser feitos usando métodos conhecidos na técnica como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (sítio dirigida), escaneamento de alanina, e mutagênese de PCR. A mutagênese sítio dirigida (Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller e Smith, Methods Enzymol. 154:329-350 (1987)), mutagênese cassette, mutagênese de seleção restrita (Wells et al, 5 Gene 34:315-323 (1985)) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA variante da cupredoxina.

Mutações conhecidas de cupredoxinas também podem ser usadas para criar uma cupredoxina variante a fim de que esta seja usada nos métodos da invenção. Por exemplo, os mutantes C112D e M44KM64E da azurina são conhecidos por apresentarem citotóxicos e crescimentos que impedem a atividade que seja diferente da azurina nativa e a referida atividade alterada pode ser útil nos métodos de tratamentos da presente invenção.

Uma compreensão mais completa da presente invenção pode ser obtida por referência aos Exemplos específicos apresentados a seguir. Os exemplos são descritos apenas para fins de ilustração e não pretendem limitar o escopo da invenção. Mudanças na forma e substituição por 15 equivalentes são contempladas de acordo com as oportunidades surgidas ou recursos disponíveis. Embora termos específicos tenham sido aqui empregados, sua intenção é o sentido descritivo e não limitativo. Modificações e variações da invenção conforme estabelecidas anteriormente podem ser feitas sem sair do seu espírito e escopo. EXEMPLOS

Exemplo 1. Efeito do peptídeo P-28 nas lesões mamárias induzidas por DMBA no modelo MMOC

O modelo da cultura de órgão da glândula mamária do camundongo (MMOC) permite a avaliação da eficácia dos agentes potencialmente quimiopreventivos contra o desenvolvimento de lesões alveolares mamárias (MAL)ou de lesões ductais mamárias (MDL) em resposta ao DMBAL O DMBA em condições adequadas de incubação forma o MAL ou MDL com base no ambiénte hormonal do meio. Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002): Metha et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1 106 (2001). As glândulas tratadas com estrogênio ou progesterona em cultura desenvolvem lesões ductais, considerando que as glândulas tratadas com aldosterona e hidrocortisona formam lesões alveolares independentes de estrogênio e de progesterona. As glândulas mamárias não expostas a um agentes carcinogeno ou quimiopreventivo passam por regressão estrutural na ausência de hormônios promotores de crescimento, considerando que o tratamento com DMBA pelo período de 24 horas entre os dias 3 e 4 evita a regressão das estruturas provocada pela falta de hormônios. Supõe-sé que isto se deve ao fato de as glândulas terem perdido a responsividade hormonal normal e agora alteraram o curso de desenvolvimento. A geração de adenocarcinomas mamários pelo transplante de células transformadas em camundongos sinérgicos provou a natureza pré-neoplásica pré-maligna das áreas não reprimidas.

O par torácico de glândulas mamárias foi retirado de forma asséptica de cada camundongo 2 0 Balb/c, sendo as glândulas divididas em vários grupos. Os efeitos do p28 foram avaliados em 4 diferentes diluições no meio. As glândulas tratadas com carcinogenio sem o agente de teste serviram de medida para a determinação da incidência porcentual na ausência de um agente quimiopreventivo. Foi incluído um outro controle para servir como controle positivo para a quimioprevenção. A azurina foi incluída no meio em concentração de 50μg/ml. Para lesões 2 5 alveolares (MAL) glândulas manchadas foram avaliadas sobre a incidência de lesões (glândulas contendo qualquer lesão quando comparadas ao número total de glândulas em um determinado grupo de tratamento). Para as lesões ductais (MDL) foi adaptado protocolo similar; entretanto, como indicado abaixo na seção de métodos, a combinação hormonal é diferente nas lesões alveolares e ductais. As glândulas foram fixadas em formalina e então processadas para histopatologia. As seções foram manchadas com eosina e hematoxeleno, sendo avaliadas ao 5 microscópio. Aqui, foi comparada a multiplicidade de lesões ductais entre os grupos de controle e de tratamento.

Procedimento de Cultura de Órgão. Os animais experimentais usados nos estudos eram camundongos fêmeas BALB/c, virgens e jovens, com idades entre 3 e 4 semanas, adquiridos de Charles River, Wilmington, MA. Os camundongos foram tratados diariamente com injeções 10 subcutâneas de ^g de estradiol-17β + 1 mg de progesterona por 9 dias. Este tratamento é um prérequisito, já que os animais não tratados com esteróides não respondem aos hormônios in vitro. Todo o procedimento da cultura é descrito em detalhes. Jang et al. Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eu. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997); Mehta et al., J. Natl. Câncer Inst. 93:1103-1106 (2001).

Em breve, os animais foram mortos por deslocamento cervical, e o par torácico de

glândulas mamárias foi dissecado em seda e incubados por 10 dias em meio Waymouth MB752/1 isento de soro (5 glândulas/5 ml/prato). O meio foi suplementado com glutamina, antibióticos (penicilina e estreptomicina em meio de 100 unidades/ml) e hormônios promotores de crescimento, 5μg de insulina (I), 5μg de prolactina (P), ^g de aldosterona (A) e ^g de hidrocortisona (H) por 2 0 ml de meio do protocolo, para induzir as lesões mamárias alveolares (MAL). Para a indução das lesões ductais (MDL), o meio conteve 5μ§/ηι1, 5μg/ml P, 0,001 μ§/ιη1 de estradiol 17β& ^g/ml;de progesterona (Pg). Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001). Foi adicionado ao meio o carcinogênio, DMBA ^g/ml) entre os dias 3 e 4. Para o estudo atual, o DMBA foi dissolvido em DMSO em uma concentração final de 4mg/ml e 50μg I foram adicionados a 100 ml do meio, 25 resultando em concentrações finais de 2μg/ml. Os pratos de controle continham DMSO como veículo. No dia 4, o DMBA foi removido do meio, enxaguando as glândulas em meio fresco e transferindo-as para novos pratos contendo meio fresco sem DMBA. Após 10 dias de incubação, as glândulas foram conservadas por mais 14 dias no meio contendo somente I (5μg/ml). Durante todo o período da cultura, as glândulas foram conservadas a 37°C sob ambiente de 95% de O2 e 5% de 5 CO2. O agente quimiopreventivo foi incluído no meio durante os primeiros dez dias da fase de promoção de crescimento. O peptídeo de teste p28 foi avaliado em 4 concentrações, que variaram de 12^g/ml a 100 μg/ml. A azurina foi avaliada em 50μg/ml no meio. O peptídeo foi dissolvido em água estéril e filtrado antes do uso. O meio foi trocado três vezes por semana (segunda-feira, quarta-feira e sexta-feira). No final da exposição, as glândulas foram fixadas em formalina.

Os resultados foram analisados pela análise de qui-quadrado e pelo Teste Exato de Fisher.

Análise Morfomética de MAL. Para o exame de MAL, as glândulas foram manchadas em alume-carmine e avaliada a presença de lesões. As glândulas foram classificadas quanto à presença ou à ausência de lesões mamárias, gravidade das lesões por glândula e toxicidade do agente. Foram avaliadas as glândulas armazenadas em xileno quanto à presença ou à ausência, incidência e 15 gravidade de lesões mamárias em cada glândula sob um microscópio de dissecação. As glândulas foram classificadas como positivas ou negativas para lesões mamárias, e a incidência porcentual foi determinada como uma razão das glândulas que demonstraram lesões e 0 número total de glândulas naquele grupo. A dilatação dos dutos ou a desintegração da estrutura mamária devido ao tratamento com 0 agente quimiopreventivo foi considerada como efeito tóxico. Os dados foram submetidos à 20 análise estatística quanto à incidência para determinar a efetividade dos possíveis agentes quimiopreventivos.

A Figura IA mostra uma fotografia representativa das lesões alveolares em uma glândula tratada com DMBA e sua comparação com uma glândula que foi tratada com DMBA e um agente quimiopreventivo. Os efeitos do p28 no desenvolvimento da lesão alveolar estão mostrados nas Figuras IB-1F e resumidos na Figura 2. O peptídeo p28 inibiu a formação MAL em 67% na concentração de 25μg/ml. Aumentar a concentração em até 100μg/mI não ampliou a eficácia do peptídeo. A comparação do peptídeo com a azurina indicou que o p28 foi tão eficaz quanto a azurina no desenvolvimento MAL. A azurina em concentração de 5(^g/ml resultou em uma inibição de 67%. As análises estatísticas indicaram que o efeito do p28 foi estatisticamente significativa quando comparada com o controle DMBA em concentrações maiores que 12^g/mi 5 (p<0,01, Teste Exato de Fisher; análise qui-quadrado).

Avaliação Histopatológica do MDL. No MDL, as glândulas foram processadas para avaliações histopatológicas. As glândulas foram seccionadas longitudinalmente em seções dè 5 microns e manchadas com hematoxilina eosina. A seção longitudinal de cada glândula foi dividida em vários campos, sendo cada campo avaliado com relação a lesões ductais. Mehta et al.,]. Natl. 10 Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001). Em resumo, toda a glândula é avaliada no microscópio; glândulas menores têm menos campos totais quando comparadas a glândulas maiores. Assim, cada glândula terá um número variável de campos. Em geral, o número de seções pelos dutos também varia muito de glândula a glândula. Isto resulta em um número variável de grupo a grupo. Foram determinados os campos contendo hiperplasias ou atipias ductais e comparados com o número total 15 de campos avaliados em cada glândula. Não é feita discriminação entre a hiperplasia ou a atipia e entre glândulas gravemente ocluídas. Qualquer campo que contiver qualquer um desses padrões histológicos foi considerado como positivo para a lesão. Os grupos de tratamento foram comparados com os controles com relação à gravidade, sendo calculada a inibição porcentual.

A Figura 3 mostra uma lesão ductal representativa. O DMBA induz lesões ductais que 2 0 variam da hiperplasia, atipia até a oclusão completa dos dutos. Foi determinada uma razão das lesões ductais/número total de seções ductais. Novamente, a concentração de 12^g/ml de p28 suprimiu somente 15% da formação MDL. Entretanto, em 25μg/ml houve uma significativa inibição das lesões comparável à observada com 50μg/ml de azurina. A eficácia do p28 em concentrações maiores que 12^g/ml foi estatisticamente significativa (p<0,01, Teste Exato de 2 5 Fisher). Esses resultados estão resumidos na Figura 4. Em geral, os efeitos dos agentes quimiopreventivos podem ser diferenciados entre MAL e MDL. Por exemplo, o tamoxifeno inibiu o desenvolvimento do MDL, mas não do MAL. É interessante notar que a azurina e o p28 inibiram tanto· as lesões ductais dependentes de estrogênio como as dependentes de progesterona, assim como as lesões alveolares independentes.

Este exemplo indica que tanto o p28 como a azurina podem evitar o desenvolvimento de 5 lesões pré-cancerosas no tecido mamário. Assim, o p28 e a azurina podem ser usados como agentes quimiopreventivos em pacientes mamíferos. !

Exemplo 2. Penetração Seletiva de Células Cancerígenas por Cupredoxinas e Peptídeos Derivados como Potenciais vetores para Administração Genética

Demonstramos que a azurina, um membro da família de proteínas da cupredoxina, isolada 10 de Pseudomonas aeruginosa entra nas células cancerígenas e induz a apoptose mediada por p53 in vitro e in vivo. Foi avaliada a seletividade da penetração de cupredoxinas catiônicas e aniônicas e peptídeos derivados como potenciais vetores para administração genética. Foram testadas as seguintes cupredoxinas: azurina (14kDA, pi 5.7), rusticianina (17kDa, pi 8.0) e plastocianina (I IkDa, pl 5.4). Os resultados indicaram que a azurina teve a penetração mais seletiva.

25 fragmentos de aminoácidos (a.a.) de azurina (azu) foram sintetizados e avaliados por

sua penetração em uma série de células cancerígenas e células normais historicamente equiparadas. A análise microscópica confocal e citométrica de fluxo (FACS) demonstrou que 18 fragmentos de aminoácidos (l,7kDa, azu 50-67) (p 18) rotulados com Alexafluor 568 (800Da) penetraram seletivamente linhagens celulares do melanoma humano (Mel-2,7,29), mamário (MCF-7), ovariano 2 0 (SK-OV3), pancreático (CAPAN-2), glioblastoma (LN-229), astrocitoma (CCF-STTG1), próstata (LN-CAP) e rim (ACHN-CRL1611), e não seus respectivos controles, Os ensaios de hemólise e liberação de LDH demonstraram que o pl8 não destruiu a estrutura da membrana de célula cancerígena durante a penetração ou produziu hemólise de eritrócitos humanos, sugerindo que pl 8 penetra as células cancerígenas humanas sem destruir a estrutura da membrana. O pré-tratamento 2 5 de células Mel-2 com inibidores específicos de internalização celular (citocalasina D; inibição da polimerização de actina, taxol; inibição da despolimerização microtubule, clorpromazina; inibição de endocitose mediada por clatrina, ázida de sódio; inibição metabólica, ou estaurosporina; inibição do ciclo celular) teve um efeito insignificante sobre a penetração de p 18. No entanto, a incubação de células Mel-2 com nistatina (inibidor da formação de cavéolas) e brefeldina A (disruptor do aparelho de golgi) inibiu de maneira significativa a penetração de p 18, sugerindo que processos 5 endocíticos possam estar envolvidos, em parte, na penetração de p 18. A imagem de pl8 rotulado com um colorante infravermelho (Xem 800nm) em camundongos atímicos tendo tumores! de melanoma xenoenxertados demonstrou claraménte a absorção seletiva em tumores s.c primários e metástases de órgão distantes sem acúmulo em órgãos e tecidos normais. Como tais, os peptídeos da presente invenção, incluindo em uma configuração, p 18 parecem ter uso significativo como um 10 vetor não viral para terapia genética (ou qualquer fragmento de DNA/RNA).

Exemplo 3 - Construções de plasmídeos

Os plasmídeos expressando derivados da fusão de wt-azurina (azu) truncada -glutationa Stransferase (GST) foram construídos por reação de cadeia polimerase utilizando DNA polimerase à prova de leitura. A Figura 5 demonstra uma representação esquemática de várias construções de 15 wt-azurina truncada. Para pGST-azu 36-128 (SEQ ID NO: 34), um fragmento de PCR amplificado foi introduzido nos locais BamHI e EcoRI do vetor de expressão GST comercial pGEXSX (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855). O fragmento foi amplificado com pUC19-azu como padrão e iniciadores, 5’-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3’ (SEQ ID NO: 35) e 5’-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3’ (SEQ ID NO: 2 0 36), em que os locais BamHI e EcoRl adicionalmente introduzidos são respectivamente sublinhados. O truncamento de carboxil-terminus do gene azu foi cumulativamente realizado pela introdução de um códon de parada utilizando o kit de mutagênese direcionado em paralelo QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA 92037).

Para pGST-azu 36-50 (SEQ ID NO: 37), pGST-azu 36-77 (SEQ ID NO: 38) e pGST-azu 36-89 2 5 (SEQ ID NO: 39), códons de parada foram introduzidos em Ser51, Ser78 e Gly90, respectivamente. O plasmídeo transportador de pGST-azu 36-128 foi utilizado como DNA padrão. Três conjuntos de oligonucleotídeos para mutagênese direcionado em paralelo são demonstrados a seguir. Para pGST-azu 36-50: 5’-GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC gXc ATG CAG-3’ (SEQ ID NO: 40) e 5’-CTG CAT GTC GGC GGG GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC-3’ (SEQ ID NO: 41). Para pGST-azu 36-77: 5’-CCT GAA GCC CGA CGA CTG 5 ACG TGT CAT CGC CCA CAC C-3’ (SEQ ID NO: 42) e 5’-GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3’ (SEQ ID NO: 43). Para pGST-azu 36-89: 5’-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGG TGA CC-3’ (SEQ ID NO: 44) e 5’-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3’ (SEQ ID NO: 45). Os plasmídeos pGST-azu 50-77 e pGST-azu 67-77 foram gerados por PCR utilizando pGST-azu 36-77 como 10 DNA padrão.

Os fragmentos de PCR amplificados, azu 50-77 e azu 67-77 foram obtidos utilizando iniciadores dianteiros 5’-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G-3’ (SEQ

I

ID NO: 46) e 5’CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3 (SEQ ID NO: 47), em que o local BamHI adicionalmente introduzido é indicado pelo sublinhado. Em ambos

os casos foi utilizado o iniciador reverso, 5’-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3’ (SEQ ID NO: 48).

O plasmídeo transportador gst-azu 50-77 foi utilizado para gerar pGST-azu 50-66 pela introdução de um códon de parada em Gly67 utilizando oligonuclotídeos, conforme a seguir: 5’GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C-3’ (SEQ ID NO: 49) e 5’-GGT 2 0 AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC-3’ (SEQ ID NO: 50). O gene de proteína fluorescente verde (gfp) que codifica a proteína fluorescente verde também foi amplificado por PCR. Os iniciadores dianteiro e reverso utilizados eram 5’-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA

AGGGCG-3’ (SEQ ID NO: 51) e 5’-CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3’

I

(SEQ ID NO: 52) contendo os locais BamHIe EcoRl na extremidade 5’ de cada oligonuclotídeoi O 2 5 fragmento de PCR resultante foi ligado no vetor pGEXSX para criar pGST-GFP. Para a preparação do DNA plasmídeo transportador de gst-gfp-azu 50-77, o gene azu 50-77 foi amplificado por PCR com pGST-azu 50-77 como padrão e iniciadores 5’-CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CATGCA GGG-3’ (SEQ ID NO: 53) e 5’-TTTTCCTTTTGCGGÇCGÇ TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3’ (SEQ ID NO: 54), em que os locais Xho I e Not I introduzidos estão respectivamente sublinhados. O fragmento purificado azu 50-77 foi introduzido em pGST-GFP em locais únicos de enzima de restrição Xho /e Not I Exemplo 4 - Purificação de Proteínas

Wt-azurin e a azurina mutante M44KM64E foram preparadas e purificadas, conforme descrito por Yamada, T. et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, vol. 101, pp. 4770-75 (2004) e no pedido de patente dos Estados Unidos co-pendente, número de série 10/720.603, cujo teor é incorporado por esta referência. Em resumo, o gene wt-azurin foi amplificado por PCR de acordo com o método descrito por Kukimoto et al., FEBS Lett, vol. 394, pp 87-90 (1996). PCR foi realizado utilizando DNA genômico da cepa PAOl de P. aeruginosa como um DNA padrão.

O fragmento de DNA amplificado de 545 bp, digerido com HindIII e Pstl foi inserido nos correspondentes locais de pUC19 de modo que o gene da azurina fosse colocado a jusante do promovedor Iac para render o plasmídeo dé expressão pUC19-azuA. E. col JM109 foi utilizado como uma cepa hospedeira para expressão do gene da azurina. A cepa recombinante E. coil foi cultivada em meio 2YT contendo ampicilina a 50 μg ml'1, IPTG a 0,1 mM; e CuSO4 a 0,5 mM por

16 horas a 37°C para produzir azurina.

Para a preparação da azurina mutante M44KM64E, foi realizada a mutagênese de local direcionada do gene de azurina utilizando o kit de mutagênese de local direcionada QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA). As mutações foram confirmadas por sequenciamento de DNA. i

O DNA de plasmídeo, pET9a transportador do gene rus que codifica a rusticianina ide cupredoxina a partir de Acidithiobadilus ferrooxidans foi obtido do Dr. Kazuhiko Sasaki, Central Research Institute of Electric Power Industry, Chiba, Japão.

A rusticianina foi isolada de E. coli BL21 (DE3) que protege o gene rus utilizando o método de Sasaki, K., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 67, pp. 1039-47 (2003) com algumas modificações. Em resumo, o tampão de ácido acético (pH 4,0) e CM-Sefarose (Sigma Chemicals, St. Louis, MO 63178) foram utilizados em vez do tampão beta-alanina (pH 4,0) e coluna de TSK-gel CM-650 (Tosoh Biosciene, LLC, Montgomeryville, PA 18936). Duas outras cupredoxinas purificadas, plastocianina de Phormidium laminosum e pseudoazurina de 5 Achromobacter cycloclastes foram obtidas do Dr. Beatrix G. Schlarb-Ridley, Universidade de Cambridge, Reino Unido e Dr. Christopher Dennison, Universidade de Newcastle Upon Tyne, Reino Unido, respectivamente.

Todos os derivados da fusão-GST recombinantes foram purificados da seguinte forma: as células BL21 E. coli foram utilizadas como a cepa hospedeira. Após a indução com IPTG a 0,4 10 mM na fase inicial de crescimento em caldo L, as proteínas da fusão GST foram purificadas dos extratos celulares utilizando cromatografia de afinidade Glutationa Sefarose 4B e coluna de fitragem de gel Sefadex 75 com PBS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855). As proteínas purificadas, wt azurina e derivados de GST ou outras cupredoxinas rotuladas com ALEXA FLUOR® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402) foram isoladas segundo as 15 instruções do fabricante. A química fluorescente livre unbound foi removida por coluna de filtragem de gel.

Exemplo 5 - Culturas celulares

As células J774 e UISO-Mel-2 (disponíveis do Frederick Câncer Research and Development Center, Frederick, Mayland, EUA) foram cultivadas, conforme descrito em Yamada, 2 0 T. et al. Infect. Immun. vol. 70, pp. 7054-62 (2002); Goto, M., et al. Mol. Microbiol. vol. 47, pp. 549-59 (2003); e Yamada, T., et. al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA vol. 99, pp. 14098-103 (2002), cujo teor é incorporado por referência. As células humanas do fibroblasto normais (coletaide cultura de estoque do Departamento de Oncologia Cirúrgica, Universidade de Illinois em Chicago (UIC), Chicago) foram cultivadas em MEM com sal de Eagle contendo L-glutamina a 2 mM, 25 aminoácidos essenciais de MEM a 0,1 mM e complementadas com soro bovino fetal inativado aquecido a 10%, penicilina 100 Unidades/ml e estreptomicina a 100 μ§/ιη1. As células MCF-7 e MOF-IOF foram cultivadas, conforme descrito em Punj et al. Oncogene 23:2367-78 (2004).

Exemplo 6 - Co-cultura de Células J774, UISO-Mel-2 e Fibroblasto e microscopia confocal

As células J774, UISO-Mel-2 e fibroblasto foram cultivadas em lamínulas individuais. Após a incubação durante a noite, as células foram lavadas em meio puro e todas as três linhagens celulares foram colocadas em um prato de cultura contendo 200 μg/ml de wt-azurina conjugada com ALEXA FLUOR® 568. A seguir, as células foram incubadas por 0,5 ou 3,5 horas a 37°C em CO2 a 5%.

Para preparação de amostras de microscópio, as células foram cultivadas em lamínulas durante a noite a 37°C. As células cultivadas foram mantidas a 37°C ou 4°C por 2 horas antes do tratamento da proteína. O meio puro a 37°C ou meio puro resfriado com gelo a 4°C previamente aquecidos foram misturados com cupredoxinas vermelho-fluorescentes (rotuladas com ALEXA FLUOR® 568) ou derivados da fusão GST e incubados com as células. As células foram lavadas com PBS e fixadas com metanol a -20°C por 5 minutos. Após lavar com PBS duas vezes e a adição do meio de contagem contendo 1,5 μg/ml 4’,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) para coloração nuclei (VECTASHILD, Vector, Burlingame, CA), foram tomadas imagens por microscópio confocal.

Exemplo 7 - Entrada de Cupredoxinas em Células J774

A wt-azurina, sua variante mutante M44KM64E, plastocianina, pseudoazurina e rusticianina foram incubadas com as células J774 como no Exemplo 6 e as células foram examinadas utilizando microscopia confocal. Nestes experimentos, as cupredoxinas foram conjugadas com ALEXA FLUOR® 568 para produzir vermelho-fluorescente e incubadas com as células J774 por 1 hora a 37°C a uma concentração de 200 μg/ml, e, em um experimento separado, a azurina de tipo natural e rusticianina foram incubadas com as células J774 por 1 hora a 37°C a uma concentração de cerca de 6 a 7 μΜ. O núcleo foi colorado em azul com DAPI, sendo mantido um controle sem as proteínas. Em todos os casos, foi observado que as cupredoxinas entraram1 no citosol das células J774. Em experimentos semelhantes, a auracianina AeB entraram preferencialmente nas células cancerígenas MCF7 e não em células de controle não cancerosas.

5 Exemplo 8 - Entrada de Wt-azurina e Rusticianina em Vários Tipos de Célula

A wt-azurina exibe uma atividade citotóxica reduzida em relação às células MCF-IOF|em contraste com as células MCF-7. Punj et al. Oncogene 23:2367-2378 (2004). J774, macrófagos peritoneais, mastócitos, células MCF-7 do câncer de mama humano e células MCF-10F epiteliais humanas normais (coleta de cultura de estoque do Departamento de Oncologia Cirúrgica, 10 Universidade de Illinois em Chicago (U1C), Chicago) foram tratadas e examinadas como no Exemplo 5 e testadas para determinar se a wt-azurina poderia entrar nessas células.

A wt-azurina foi internalizada nas células J774 durante incubação de 45 mm, porém, de maneira muito ineficiente em macrófagos peritoneais ou mastócitos. Mesmo após 6 horas de incubação, essas células demonstraram ligeira entrada limitada. Da mesma forma, embora a wtazurina tenha entrado nas células MCF-7 do câncer de mama de maneira eficiente, demonstrou uma taxa extremamente reduzida de entrada nas células MCF-IOF mamárias normais.

A azurina conjugada com Alexa fluor® entrou de maneira eficiente nas células do câncer UISOMel-2 e MCF-7, mas não nas células MCF IOAl mamárias normais. Porém, a rusticianina conjugada com Alexa fluor® não só entrou no citosol das células cancerígenas UISO-Mel-2 e MCF-7, como também nas células MCF IOAl normais. Diferentemente das células cancerígenas em que a rusticinina foi distribuída de maneira uniforme no citosol, nas células MCF10A1, uma grande quantidade de rusticianina foi seqüestrada no espaço perinuclear ao redor do núcleo. ' Exemplo 9 - Citotoxicidade mediada por wt-azurina e Inibição de Crescimento Para avaliar ainda a especificidade da entrada de wt-azurina em várias células, determinamos a entrada de wt-azurina conjugada com Alexa fluor nas células J774, UISO-Mel-2 e células normais do fibroblasto durante a incubação a 37°C por 30 minutos e 3,5 horas. Foi observado que a wt-azurina entra rapidamente nas células J774 e UISO-Mel-2 em 30 mm; foi observada uma quantidade muito pequena de wt-azurina no citosol de fibroblastos durante este período. Após 3,5 horas de incubação, foram observadas apenas pequenas quantidades de wtazurina nos fibroblastos.

5 Foi realizado um ensaio de 3(brometo de 4,5 dimetiltiazol-2-il-2,5- tetrazolium) (MTT)

para a medição da citotoxicidade de wt-azurina, conforme descrito por Yamada, T., et al., Infect. Immun. 70:7054-62 (2002), Goto, M., et al. Mol. Microbiol 47:549-59 (2003) e no pedidq de patente dos Estados Unidos co-pendente, número de série 10/720.603, depositado em 24 de novembro de 2003, cujo teor é incorporado por referência. A Figura l(b) demonstra que1 foi 10 observada significativa citotoxicidade mediada por wt-azurina apenas com células J774 e UISOMel-2 mediante incubação durante 24 horas.

A azurina mutante M44KM64E demonstrou muito pouca atividade indutora de apoptose nas células J774, mas uma concentração de 1 mg/ml inibiu significativamente (cerca de 95%) a progressão do ciclo celular no Gi até a fase S. A progressão do ciclo celular foi analisada por 15 citometria de fluxo, conforme descrito por Hiraoka, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol, 101:6427-32 (2004) e Yamada, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 101:4770-75 (2004), cujo teor é incorporado por referência. A Figura l(a) demonstra que quando os fibroblastos foram tratados com 500 μg/ml ou 1 mg/ml da azurina mutante M44KM64E, a extensão de inibiçãoi da progressão do ciclo celular foi de cerca de 20%.

2 0 Exemplo 10 - Microinjeção de Wt-azurina em Fibroblasto e células MCF-10F

A wt-azurina foi microinjetada em fibroblasto e células MCF-IOF utilizando o método descrito por Punj, V., et al., Oncogene 23:2367-78 (2004). As células foram examinadas por indução de apoptose, levando à condensação e fragmentação de DNA nuclear. A condensação e fragmentação de DNA nuclear significativo (azul rotulado com DAPI) foram observadas em 25 células únicas microinjetadas após incubação de 5 horas com wt-azurina, mas não durante uma incubação de 30 minutos com azurina. Exemplo 11 - Internalização de Derivados da Fusão Wt-azurina a 37°C

Várias fusões GST de wt-azurina truncadas tanto em N- como em C-terminal foram preparadas e purificadas como no Exemplo 1 (Figura 2(a) e 2(b)). Utilizando wt-azurina conjugada com ALEXA FLUOR® 568, os derivados da fusão GST e GST-azu, a internalização em células J774 a 37°C mediante incubação por 1 hora foi examinada utilizando o método descrito no Exemplo 5. O núcleo foi colorado azul com DAPI.

Enquanto a wt-azurina foi internalizada, o GST restante na periferia das células não!foi internalizado. GST-azu 36-128 e GST-azu 36-89 foram internalizados, assim como o GST-azu 36-77. Outros truncamentos, no entanto, demonstraram que enquanto o GST-azu 50-77 era internalizado, o GST-azu 36-50 era altamente ineficiente e parecia formar aglutinações sobre a superfície.

Exemplo 12 - Internalização de Derivados da Fusão Azurina a 4°C

Foi examinada a internalização de wt-azurina e os derivados da fusão GST-azu nas células J774 incubadas a 4°C. A internalização de wt-azurina dentro das células J774 mediante incubação por 1 hora foi gravemente prejudicada a 4°C. Prejuízo semelhante também foi observado com GST-azu 36-128 e GST-azu 36-89. O GST-azu 36-77, GST-azu 50-77, GST-azu 50-66 e GST-azu 67-77 mais curtos demonstraram grave prejuízo de internalização a 4°C.

Exemplo 13 - Internalização Dependente de Energia da Proteína de Fusão GSTGFP-azu 50-77 nas Células J774 e Melanoma UISO-Mel-2 GST foi fundida com GFP para produzir um derivado da fusão GST-GFP. Adicionalmente,

a azu 50-77 foi fundida com a proteína de fusão GST-GFP (Mr 53 kDa) (Figura 6(a)). Foi examinada mobilidade dos derivados da fusão GST, GST-GFP e GST-GFP-azu 50-77 purificada em SDS-PAGE (Figura 6(b)). A detecção se deu por coloração Azul Coomassie e por borrão ocidental utilizando o anticorpo anti-azurina (Figura 6(c)).

2 5 A determinação citométrica de fluxo das células J774 tratadas a concentrações variadas de

GST-GFP demonstrou que esta proteína liga-se às células J774. A separação citométrica de fluxo das células J774 tratadas a concentrações crescentes da proteína de fusão GST-GFP-azu 50-77 demonstrou fluorescência significativamente reduzida em relação à GST-GFP isolada (Figura17). Deve ser observado que a internalização de GFP em células de mamíferos é conhecida por levar à perda de fluorescência. Esta redução de fluorescência também fica evidente quando as células J774 5 são tratadas com 200μg/ml de proteína de fusão GST-GFP-azu 50-77 e incubadas por períodos crescentes de tempo a 37°C.

Para determinar se há diferença no perfil de ligação e internalização de GST-GFP e GSTGFP-azu 50-77, tanto as células J774 como UISO-Mel-2 foram incubadas com GST-GFP e GSTGFP-azu 50-77 a 37°C e a 4°C. O verde fluorescente foi localizado utilizando microscopia 10 confocal. Nas células J774, a proteína de fusão GST-GFP ligou-se à superfície e não foi internalizada nem a 37°C, nem a 4°C. Por outro lado, observou-se que a GST-GFP-azu 50-77 foi internalizada a 37°C, mas não a 4°C. Nas células UISO-Mel-2, a proteína de fusão GST-GFP foi retida na superfície tanto a 37°C como a 4°C. Por outro lado, semelhante às células J774, observouse que a proteína de fusão GST-GFP-azu 50-77 foi internalizada a 37°C, mas não a 4°C.

Exemplo 14 - Entrada de Wt-azurina em Células de Mamíferos mediante Penetração

de Membrana Celular e Mecanismo Endocítico

Se a entrada de wt-azurina é exclusivamente dependente da endocitose mediada por receptor, esta poderia ser bloqueada pelo protonoforo cianeto de carbonila de m-clorofenil hidrazona (CCCP), um desacoplador mitocondrial de geração de energia, ou pré-incubação com 20 azurina não rotulada ou outras cupredoxinas que bloqueiam os receptores. Células J774 e UISOMel-2 foram incubadas com as cupredoxinas a concentração de excesso de 10 vezes por 2 horas a 4°C, as células completamente lavadas para remover as cupredoxinas e incubadas com a azurina conjugada com ALEXA FLUOR® 568 por 1 hora a 37°C. Houve até a internalização da azurina èm células não tratadas com as cupredoxinas. Também foram testados os efeitos da citocalasina D 25 (disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195), um inibidor conhecido de endocitose mediada por receptor que destrói a rede de microfilamentos celulares, e Brefeldina A (disponível da SigmaAldrich, St. Louis, Mo 63195), que é conhecido por destruir o aparelho de Golgi e inibir a secreção mediada pela vesícula clássica. O CCCP a uma concentração de 20 pM reduziu significativamente a absorção de azurina nas células UISO-Mel-2, como ocorreu com citocalasina D 0,25 a 0,5 pM. Brefeldina A, por outro lado, não teve efeito significativo.

Exemplo 15 - Entrada de um Derivado da Fusão GST-PEDIII-azu 50-77 nas Células UISO-Mel-2

Uma fusão GST de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa domínio III (PEDIII) foi construída, conforme descrito por Hwang, J. et al., Cell 48:129-36 (1987); Reiter, Y. and Pastanj I., Trends Biotechnol. 16:513-20 (1998). Este derivado da fusão GST-PEDIII continha aminoácidos 381-613 da exotoxina A. PEDIII é conhecido por proteger a atividade ADP-ribosil transferase e inibir a síntese de proteína celular em células eucarióticas pela inibição do fator 2 de alongamento eucariótico.

Utilizando PCR, conforme descrito para GST-GFP-azu 50-77, a seqüência azu 50-77 foi introduzida na extremidade de carboxil da proteína de fusão GST-PEDIII (Figura 8(a)). Estas duas proteínas de fusão (GSTPEDIII e GST-PEDIII-azu 50-77) foram purificadas por cromatografia de coluna glutaniona-sefarose 4B como as proteínas 52 e 54 kDa (Fig. 8(b)). A seguir, as células UISO-Mel-2 e fibroblasto normais (FBT) foram incubadas por 24 horas a 37°C com várias concentrações destas proteínas e a extensão da morte celular medida pelo ensaio MTT, conforme descrito no Exemplo 9.

Enquanto a GST-PEDIII demonstrou apenas a baixa citotoxicidade, a proteína da fusão GST-PEDIII-azu 50-77 teve alta citotoxicidade devido à entrada eficiente nas células UISO-Mel-2 (Figura 8(c)). Ao contrário, as proteínas da fusão demonstraram um baixo nível de citotoxicidade em relação às células do fibroblasto.

Exemplo 16 - A desestabilização da α-helix em wt-Azurina não tem Efeito Substancial sobre a sua Internalização nas células UISO-Mel-2 Para examinar se a α-helix desempenha um papel na entrada de azurina, três resíduos de prolina desestabilizantes de helix foram introduzidos nas posições 54, 61 e 70 de wt-azurina (Figura 6) e examinou-se a entrada da azurina mutante A54PT61PK70P de corpo inteiro nas células UISO-Mel-2. Também foram construídas e testadas mutações únicas e duplas nestas posições para entrada. A azurina mutante A54PT61PK70P foi preparada por mutagênese direcionada de iocal do gene da azurina utilizando o kit de mutagênese direcionado em paralelo QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA).

Os mutantes foram incubados em 200 μg/ml com as células UISO-Mel-2 por 1 hora a 37°C, após o qual foi localizada a fluorescência por microscopia confocal. Em todos os casos; as azurinas mutantes conjugadas com ALEXA FLUOR® 568 entraram nas células UISO-Mel-2. Da mesma forma, não foi observada nenhuma diferença significativa quando a proteína da fusão GSTGFP-azu 50-77, bem como sua variante mutante tripla A54PT61PK70P azu foram examinadas para entrada nas células UISO-Mel-2.

Exemplo 17 - Entrada de um Derivado da Fusão GST-PEDIII-Rusticianina nas Células UISO-Mel-2

Uma fusão GST de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa domínio III (PEDIIl) foi construída como no Exemplo 15. Utilizando PCR, conforme descrito para GST-GFP-azu 50-77, a seqüência de rusticianina de corpo inteiro foi introduzida à extremidade de carboxil da proteína de fusão GST-PEDIII. A proteína de fusão foi purificada por cromatografia de coluna glutationasefarose 4B. A seguir, as células UISO-Mel-2 e FBT foram incubadas por 24 horas a 37°C com várias concentrações da proteína de fusão e a extensão da morte celular medida por ensaios MTT, conforme descrito no Exemplo 7.

A proteína da fusão GST-PEDIII-rusticianina exibiu alta citotoxicidade contra as células UISO-Mel-2 (Figura 9). Por outro lado, a proteína da fusão demonstrou apenas um baixo nível de citotoxicidade em relação às células FBT.

Claims (69)

1. Peptídeo isolado caracterizado por ser uma variante, derivada ou equivalente estrutural de uma cupredoxina, e que pode inibir o desenvolvimento de lesões premalignas em tecidos de mamíferos.

2. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina é selecionada do grupo que consiste em azurina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina, Laz, auracianina, estelacianina e proteína básica do pepino.

3. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de què a cupredoxina é azurina.

4. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina se origina de um organismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus.

5. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por originar-se de Pseudomonas aeruginosa.

6. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser parte de úm peptídeo selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 1,3-19.

7. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo qual uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1, 3-19 tem pelo menos 80% da identidade de seqüência de aminoácidos.

8. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um truncamento de cupredoxina.

9. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é mais do que cerca de 10 resíduos e não mais do que cerca de 100 resíduos. í

10. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em resíduos 50- 77 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 50-67 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 36-88 de azurina Pseudomonas aeruginosa e SEQ ID NOS: 20-24.

11. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em resíduos 50- 77 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 50-67 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 36-88 de azurina Pseudomonas aeruginosa e SEQ ID NOS: 20-24.

12. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende resíduos equivalentes de uma cupredoxina como uma região de azurina Pseudomonas aeruginosa selecionada do grupo que consiste em resíduos 50-77·, resíduos 50-67 e resíduos 36-88.

13. Composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos uma cupredoxina ou peptídeo da reivindicação 1 em um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos duas das cupredoxinas ou peptídeos. !

15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de quç a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa. I

16. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a cupredoxina se origina de um organismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Aehromobacter xylosoxidan, Bordetella bronehiseptiea, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a cupredoxina é da Pseudomonas aeruginosa.

18. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a cupredoxina é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1, 3-19.

19. Método para tratar um paciente mamífero caracterizado por compreender a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composiçãoj da reivindicação 13.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o paciente é humano.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o paciente está em um grupo de maior risco de desenvolvimento do câncer comparado à população geral.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, atrocitoma, pulmão, colorretal, cabeça e pescoço, bexiga, próstata, pele e câncer cervical.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o paciente possui pelo menos uma característica de alto risco.

24. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o paciente tem lesões premalignas.

25. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato que o paciente foi curado de câncer ou lesões premalignas.

26. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por um método selecionado a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea, inalação, administração tópica, via transdérmica, supositório, injeção vítrea e por via oral.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o método de administração é por injeção intravenosa.

28. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada em conjunto com pelo menos outro medicamento quimiopreventivo.

29. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada ao mesmo tempo com outro medicamento quimiopreventivo.

30. Kit caracterizado por compreender a composição da reivindicação 13 em uma ampola.

31. Kit de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o kit é destinado para administração intravenosa.

32. Método para estudo do desenvolvimento do câncer caracterizado por compreender a colocação de células de mamíferos em contato com uma cupredoxina ou peptídeo da reivindicação 1; e a medição do desenvolvimento de células premalignas e malignas.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células são de humanos.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células são de glândulas mamárias.

35. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células são induzidas para desenvolver o câncer.

36. Vetor de expressão caracterizado por codificar o peptídeo da reivindicação 1.

37. Peptídeo isolado caracterizado por ser uma variante, derivada ou equivalente estrutura] de uma cupredoxina, e que está acoplado a um composto de carga e pode seletivamente entrar nas células cancerígenas de mamíferos.

38. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina se origina de um organismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus.

39. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina é azurina.

40. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a azurina se origina de Pseudomonas aeruginosa.

41. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 25.

42. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender a SEQID NO: 25.

43. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser um truncamento da cupredoxina.

44. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é mais de cerca de 100 resíduos e não mais de cerca de 10 resíduos.

45. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em resíduos de azurina de Pseudomonas aeruginosa 50-77 (SEQ ID NO: 2), resíduos de azurina de Pseudomonas aeruginosa 50-67 (SEQ ID NO: 25), resíduos de azurina de Pseudomonas aeruginosa 36-88 (SEQ ID NO: 26) e SEQ ID NO: 20-24.

46. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o composto de carga é DNA ou RNA.

47. Composição de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o composto de carga é uma molécula anti-senso.

48. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o composto de carga retarda ou mata células cancerígenas de mamíferos.

49. Composição de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o composto de carga é um medicamento citotóxico.

50. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o composto de carga é selecionado do grupo que consiste em proteínas, lipoproteínàs, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucléicos, corantes, micropartículas, nanopartículas, toxinas e medicamentos.

51. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que1 o composto de carga é selecionado do grupo que consiste em proteínas e polipeptídeos, e em que os peptídeos são ligados ao composto de carga para formar uma proteína de fusão.

52. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que' o composto é uma toxina.

53. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que1 o composto de carga é uma substância detectável.

54. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a composição da reivindicação 37 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

55. Método caracterizado por compreender o contato com uma célula ou células com a composição da reivindicação 37.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula ou células se originam de um paciente que sofre de câncer, e compreendendo ainda a reintrodução de célula ou células no paciente.

57. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena selecionada do grupo que consiste em célula osteosarcoma, célula de carcinoma do pulmão, célula de carcinoma do colo, célula de linfoma, célula de leucemia, célula de sarcoma de tecido mole, célula de carcinoma da mama, célula de carcinoma do fígado, célula de carcinoma da bexiga, célula de melanoma, célula de tumor do cérebro e célula do carcinoma da próstata.

59. Método de tratamento de um paciente com câncer, caracterizado pelo fato de que a composição da reivindicação 37 é administrada ao paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o complexo é administrado da forma selecionada do grupo que consiste em via intravenosa, tópica, subcutânea, intramuscular e no tumor. i

61. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o complexo é co-administrado com outro tratamento de câncer.

62. Método de imagem de câncer em pacientes, caracterizado pelo fato de que. a composição da reivindicação 53 é administrada ao paciente, sendo detectada; a localização do composto de carga.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o composto de carga é um agente de contraste por raio X, sendo a localização do composto de carga detectada por CT de raio X.

64. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o composto de carga é um agente de contraste por imagem de ressonância magnética, sendo a localização do composto de carga detectada por MRI.

65. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o composto de carga é um agente de contraste por ultra-som, sendo a localização do composto de carga detectada por imagem de ultra-som.

66. Método para o diagnóstico de câncer, caracterizado pelo fato de que uma célula é colocada em. contato com a composição da reivindicação 53, sendo detectada a localização da molécula de carga.

67. Kit caracterizado por compreender um reagente consistindo na composição da reivindicação 37.

68. Kit de acordo com a reivindicação 67, caracterizado por compreender ainda um reagente consistindo em um adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

69. Kit de acordo com a reivindicação 67, caracterizado por compreender ainda um veículo para a administração do reagente.