CN106749561B - 一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用。本发明提供的Smlt4123蛋白，是如下(a1)‑(a3)中任一种：(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列4自N端第53‑240位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。Smlt4123蛋白具有较强的免疫原性，制备的免疫血清调理的全血杀伤试验发现在体外该蛋白可以降低血中菌载量，且攻毒试验显示该蛋白免疫产生抗体在体内亦可降低血中菌载量，具有一定的保护作用，可作为重点疫苗候选分子。

Description

一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用。
背景技术
嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是广泛存在于自然界和医院环境的非发酵革兰阴性杆菌，为条件致病菌。随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的大量使用以及侵袭性医疗操作的不断增加，该菌的临床分离率呈逐年上升趋势，已成为医院获得性感染的重要病原菌。中国CHINET细菌耐药监测网2005-2011年资料显示，该菌分离率居于革兰阴性菌的第5-6位，非发酵菌的第3位，仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌；其中2011年该菌占所有革兰阴性菌的4.45％，非发酵菌的11.61％。SENTRY全球细菌耐药监测显示，2009-2012年在美国由该菌引起的肺炎占4.4％，欧洲和地中海地区为3.2％；在加拿大由嗜麦芽窄食单胞菌导致血流感染占0.4％-2.2％；最近在美国的一家医院ICU，由该菌引起的呼吸机相关肺炎(VAP)病例甚至超过鲍曼不动杆菌，已成为一种新兴的全球性条件致病菌。
嗜麦芽窄食单胞菌引起的感染常发生在免疫力低下、患有多种基础疾病的老年或危重患者，可引起肺炎、血流感染、心内膜炎、皮肤软组织、泌尿系及脑膜炎、骨关节、消化道感染等，其中以下呼吸道感染最为常见，特别是患有结构性肺病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化(CF)的患者。研究显示，长期接受广谱抗菌药物尤其碳青霉烯类、免疫功能低下、长期入住ICU病房、慢性呼吸系疾病、气管插管或气管切开、留置中心静脉导管、重度营养不良、肿瘤放化疗等是嗜麦芽窄食单胞菌感染的易患因素。另外的研究显示，该菌所致的血流感染病死率达14％-69％。一项台湾地区近10年的病例队列研究显示，由单一病原菌(嗜麦芽窄食单胞菌)所致的感染，住院14天的病死率为23.2％，住院总病死率为41.1％。血液恶性肿瘤患者中，由嗜麦芽窄食单胞菌感染引起的出血性肺炎，28天的病死率达100％。如此高的致死率除患者自身免疫功能低下、基础疾病多以外，还由于该菌具有多重耐药性，导致对目前大多数抗菌药物耐药有关；其次是体外药敏试验结果对该菌的不确定性，一些最初敏感的抗菌药物往往在治疗过程中很快产生耐药，从而导致治疗的失败而引起死亡。
该菌耐药机制复杂，包括膜通透性低、外排泵系统表达、产生钝化酶和水解酶等，使其对临床常用的多种抗菌药物耐药，甚至高度耐药，尤其对碳青霉烯类天然耐药，使该菌引起的相关感染的治疗非常棘手。以往推荐的治疗药物有甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氟喹诺酮类(左氧氟沙星)和替卡西林/克拉维酸。但是，随着对该菌较有效的磺胺类药物耐药性的增加，个体差异导致的药物耐受性差，使其临床使用受到限制，其所致感染已成为临床治疗难点。目前，临床上因无酶抑制剂或有效药物出现，尤其新的抗菌药物发展缓慢。
目前针对嗜麦芽窄食单胞菌保护性抗原研究较少。三种常见非发酵革兰阴性杆菌中，铜绿假单胞菌保护性抗原研究最早、内容最多，并制成菌体灭活疫苗、组分疫苗及基因工程疫苗等多种形式的疫苗制剂，取得较大的进展，近期对鲍曼不动杆菌保护性抗原研究也增多，而国内外针对嗜麦芽窄食单胞菌保护性抗原研究主要针对兽医学或渔业，且非常有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用。
本发明提供了一种蛋白质，获自嗜麦芽窄食单胞菌，命名为Smlt4123蛋白，是如下(a1)-(a3)中任一种：
(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)由序列表中序列4自N端第53-240位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a3)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
为了使(a1)中的Smlt4123蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(a3)中的Smlt4123蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a3)中的Smlt4123蛋白的编码基因可通过将序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述Smlt4123蛋白的基因(Smlt4123基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：
(b1)编码区如序列表中序列3自5′末端第1至723位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表中序列3自5′末端第157至723位核苷酸所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码与编码所述Smlt4123蛋白的DNA分子；
(b4)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述Smlt4123蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述Smlt4123基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还保护以Smlt4123蛋白作为抗原得到的抗体。
本发明还保护Smlt4123蛋白或Smlt4123基因或所述抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(c1)-(c3)中至少一种：
(c1)抑制嗜麦芽窄食单胞菌；
(c2)预防嗜麦芽窄食单胞菌感染；
(c3)治疗嗜麦芽窄食单胞菌感染。
本发明还保护一种预防嗜麦芽窄食单胞菌感染的疫苗，其活性成分为Smlt4123蛋白或所述抗体。
本发明还保护Smlt4123蛋白作为抗原在制备抗体中的应用。
本发明还保护Smlt4123蛋白的制备方法，包括如下步骤：将Smlt4123基因导入出发菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述蛋白质。
所述Smlt4123基因可通过含有所述Smlt4123基因的重组表达载体导入出发菌。
可用现有的表达载体构建含有所述编码基因的重组表达载体。使用所述编码基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；此外，使用所述编码基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
所述重组表达载体具体可为在pET-30a(+)载体的多克隆位点插入序列表的序列1自5′端第1-567位所示的DNA分子得到的重组表达载体。
所述重组表达载体具体可为将pET-30a(+)载体的EcoR I和Xho I酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列1第1-567位所示的DNA分子得到的重组表达载体。
所述出发菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述方法中，所述培养重组菌的条件具体可为37℃、180rpm振荡培养。
所述培养采用的培养基具体可为LB液体培养基。
所述培养结束时得到OD600nm＝0.6的菌液。
所述表达得到所述蛋白质包括向所述菌液中加入IPTG进行诱导的步骤。IPTG在培养体系中的浓度可为1mM。从加入IPTG开始计时，培养时间可为4小时。所述诱导条件可为30-37℃、180rpm。
所述诱导条件具体可为37℃、180rpm。
所述诱导条件具体可为30℃、180rpm。
所述表达得到所述蛋白质还包括如下步骤：
(d1)完成所述诱导后，收集菌体，进行菌体破碎，然后离心收集沉淀；
(d2)取步骤(d1)得到的沉淀，进行蛋白变性，然后离心收集上清；
(d3)取步骤(d2)得到的上清经过镍柱线性洗脱和尿素复性，得到所述蛋白质溶液。
所述步骤(d1)中，所述菌体破碎的方法可为超声破碎。所述菌体破碎的方式具体可为将菌体使用超声裂解液溶解后超声。所述超声时间具体可为1.5h。所述超声裂解液中含有0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-Cl。所述超声裂解液的pH值具体可为8.0。
所述步骤(d2)中，所述蛋白变性具体可为将步骤(d1)得到的沉淀使用A液溶解变性。所述变性的温度具体可为4℃。所述变性的时间具体可为12h。所述离心具体可为10000rpm离心15min。所述A液中含有8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述A液的pH值为8.0。
所述步骤(d3)中，所述镍柱线性洗脱具体可为用A液平衡柱子，然后将滤液上样，然后进行洗脱(60min时间，B液在洗脱液中的体积分数由0％线性上升至100％)，B液在洗脱液中的体积分数为90％时出峰，收集出峰时的流穿蛋白溶液。所述A液中含有8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述A液的pH值为8.0。所述B液中含有8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述A液的pH值为4.0。
以上任一所述抗体为多克隆抗体。
所述抗体的用途为如下(c1)-(c3)中至少一种：
(c1)抑制嗜麦芽窄食单胞菌；
(c2)预防嗜麦芽窄食单胞菌感染；
(c3)治疗嗜麦芽窄食单胞菌感染。
以上任一所述抑制嗜麦芽窄食嗜单胞菌具体可为抑制血液中的嗜麦芽窄食单胞菌。
以上任一所述嗜麦芽窄食单胞菌具体可为嗜麦芽窄食单胞菌K279a。
本发明提供了一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白，经过实验证明，该蛋白具有较强的免疫原性，制备的免疫血清调理的全血杀伤试验发现在体外该蛋白可以降低血中菌载量，且攻毒试验显示该蛋白免疫产生抗体在体内亦可降低血中菌载量，具有一定的保护作用，可作为重点疫苗候选分子。
附图说明
图1为实施例1蛋白纯化过程中各组分SDS-PAGE分析结果。
图2为实施例2抗血清效价测定结果。
图3为实施例4相对保护率统计结果。
图4为实施例5小鼠体内攻毒试验统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
嗜麦芽窄食单胞菌K279a：参考文献：Avison MB，von Heldreich CJ，HigginsCS，Bennett PM，Walsh TR.A TEM-2 beta-lactamase encoded on an active Tnl-liketransposon in the genome of a clinical isolate ofStenotrophomonasmaltophilia.J Antimicrob Chemother，2000，46(6)：879-884.，嗜麦芽窄食单胞菌K279a在文献中的名称为“S.maltophilia K279a”；公众可以从中国人民解放军307医院获得。
pET-30a(+)载体：Novagen公司。
大肠杆菌BL21(DE3)：北京全式金生物科技有限公司。
BALB/c小鼠：军事医学科学院试验动物中心。
弗氏完全佐剂：Sigma公司。
弗氏不完全佐剂：Sigma公司。
HRP标记的山羊抗鼠IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司。
实施例1、嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白的表达与纯化
1、提取嗜麦芽窄食单胞菌K279a的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物P1和引物P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
P1：5′CGGAATTCCAGGACAGCAGCTCCACCGAT-3′；
P2：5′-CCCTCGAGTCAGAAGCGGGCACCGAT-3′。
P1和P2中，下划线分别标注EcoR I和Xho I酶切位点。
3、用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产
4、用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切pET-30a(+)载体，回收约5388bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pET-30a-Smlt4123。根据测序结果，对重组载体pET-30a-Smlt4123进行结构描述如下：将pET-30a(+)载体的EcoR I和Xho I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-567位核苷酸所示的DNA分子。
序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。将序列2所示的蛋白质命名为Smlt4123蛋白，由188个氨基酸残基组成。将蛋白Smlt4123的编码基因命名为Smlt4123基因。Smlt4123基因编码区如序列表中序列1所示(567bp)。
外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，编码序列表的序列4所示的融合蛋白。
序列表的序列4中，自N端第53-240位氨基酸残基为Smlt4123蛋白区段。
序列表的序列3中，自5’端第157-723位核苷酸为Smlt4123基因区段。
6、将步骤5得到的重组载体pET-30a-Smlt4123转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将重组菌接种于LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至菌液OD600nm＝0.6。取菌液进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1的泳道1。
7、向步骤6得到的菌液中加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，30℃、180rpm诱导4h。诱导结束将整个体系离心，收集菌体。取菌体和上清分别进行SDS-PAGE电泳分析，上清的分析结果见图1的泳道2，菌体的分析结果见图1的泳道3。
8、向步骤6得到的菌液中加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，37℃、180rpm诱导4h。诱导结束将整个体系离心，收集菌体。取菌体和上清分别进行SDS-PAGE电泳分析，上清的分析结果见图1的泳道4，菌体的分析结果见图1的泳道5。
根据步骤7和步骤8的SDS-PAGE电泳分析判断，目的蛋白以包涵体形式出现。
9、将步骤8收集的菌体，线性洗脱方式纯化，得到重组蛋白ompW溶液，具体步骤如下：
(1)将收集的菌体用超声裂解液(0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-Cl，pH8.0)超声1.5h后离心收集沉淀，将沉淀用0.2M NaCl水溶液洗涤两次，然后用1％(体积百分比)的Triton-100洗涤一次。
(2)采用A液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01M Tris-Cl，pH8.0)溶解步骤(1)的沉淀，4℃变性12h，然后10000rpm离心15min，取上清，0.45mm滤膜过滤并收集滤液。
(3)将步骤(2)得到的滤液进行镍柱线性洗脱(pH8.0-pH4.0)。洗脱液由A液(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-Cl，pH8.0)和B液(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-Cl，pH4.0)组成。用A液平衡柱子，然后将滤液上样，然后进行洗脱(60min时间，B液在洗脱液中的体积分数由0％线性上升至100％)，B液在洗脱液中的体积分数为90％时出峰，收集出峰时的流穿蛋白溶液。
(4)将步骤(3)得到的流穿蛋白溶液用含有1M尿素的透析液4℃过夜透析复性，得到重组蛋白ompW溶液。
10、采用pET-30a(+)载体替代重组载体pET-30a-Smlt4123，按照步骤6-9进行操作，得到对照蛋白溶液。
实施例2、重组蛋白ompW免疫小鼠制备抗血清
实验小鼠：雄性BALB/c小鼠(6-8周)。
1、分别将步骤9得到的重组蛋白ompW溶液和步骤10得到的对照蛋白溶液进行蛋白定量并稀释至100μg/ml，得到重组蛋白ompW稀释液和对照蛋白稀释液。
2、将实验小鼠随机分为两组(每组10只)。
第0天时分组进行如下操作：
实验组：取免疫前血清(眼眶取血，室温静置60min后2500rpm离心5min，取上层血清，即为免疫前血清)，然后采用重组蛋白ompW抗原乳剂I免疫实验小鼠(腹部、背部进行皮下多点注射，100μL/只)。
对照组：取免疫前血清(眼眶取血，室温静置60min后2500rpm离心5min，取上层血清，即为免疫前血清)，然后采用对照蛋白抗原乳剂I免疫实验小鼠(腹部、背部进行皮下多点注射，100μL/只)。
重组蛋白ompW抗原乳剂I的配置方法为：弗氏完全佐剂与重组蛋白ompW稀释液等体积混合乳化。
对照蛋白抗原乳剂I的配置方法为：弗氏完全佐剂与对照蛋白稀释液等体积混合乳化。
第14天和第28天时分组进行如下操作：
实验组：取重组蛋白ompW抗原乳剂II免疫实验小鼠(腹部、背部进行皮下多点注射，100μL/只)。
对照组：取对照蛋白抗原乳剂II免疫实验小鼠(腹部、背部进行皮下多点注射，100μL/只)。
重组蛋白ompW抗原乳剂II的配置方法为：弗氏不完全佐剂与重组蛋白ompW稀释液等体积混合乳化。
对照蛋白抗原乳剂II的配置方法为：弗氏不完全佐剂与对照蛋白稀释液等集体混合乳化。
第29天，各组小鼠眼眶取血，室温静置60min后2500rpm离心5min取上层血清，得到免疫后血清。
实施例3、抗血清效价测定
待测血清：实施例2得到的免疫前血清、实验组免疫后血清、对照组免疫后血清。
1、将待测血清使用PBST缓冲液1∶1×105稀释，得到待测血清稀释液。
2、将实施例1得到的重组蛋白ompW溶液定量并稀释至10μg/ml后加入96孔板中(每孔100μl)，4℃过夜包被。
3、完成步骤2后，弃掉孔内溶液，采用0.5％(体积百分比)PBST溶液洗板。
4、完成步骤3后，每孔加入100μL步骤1的待测血清稀释液，37℃孵育30min。
5、完成步骤4后，弃掉孔内溶液，采用0.5％(体积百分比)PBST溶液洗板。
6、完成步骤5后，每孔加入100μL用HRP标记的山羊抗鼠IgG(1：8000稀释)，37℃孵育30min。
7、完成步骤6后，弃掉孔内溶液，采用0.5％(体积百分比)PBST溶液洗板。
8、完成步骤7后，每孔加入TMB显色液A液、B液各50μL，避光显色5-10min。9、完成步骤8后，每孔加入50μL终止液(2mol/L硫酸水溶液)，用酶联检测仪读取反应体系在OD450nm下的吸光度值。
间接ELISA法测抗体滴度的判断标准为：所测抗体OD450nm值大于0.2且与对照孔OD450nm的比值大于等于2.1时所测抗体的最大稀释度。通常当抗体滴度达到1×105时认为抗体效价达到要求。
实验组免疫前、后血清抗体1∶102400稀释后的实验结果见图2。结果表明，实验组免疫后血清抗体1∶102400稀释后OD450nm值大于0.2且与对照组OD450nm值的比值大于2.1，达到抗体效价要求，而免疫前血清不能满足上述条件。
上述结果表明，重组蛋白ompW具有较强的免疫原性。
实施例4、重组蛋白ompW抗血清调理杀伤作用
待测血清：实施例2得到的免疫前血清、实验组免疫后血清。
1、将待测血清使用PBST缓冲液按照1∶1稀释，得到待测血清稀释液。
2、将嗜麦芽窄食单胞菌K279a接种于LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD600nm＝1.0(浓度约4.0×108CFU/mL)。
3、取1mL步骤2得到的菌液，8000rpm离心5min，去上清，用100μL无菌PBS重悬菌体沉淀，得到菌悬液。
4、向步骤3得到的菌悬液中加入50μL待测血清稀释液，37℃，20rpm孵育30min后加入350μL健康人全血，于37℃、5％CO2培养箱中20rpm孵育1h。
5、完成步骤4后，取100μL步骤4处理后的菌悬液涂布于LB平板，于37℃、5％CO2培养箱中静置培养16h后统计菌落数，计算相对保护率。
实验重复两次。
相对保护率＝1-(免疫后血清处理后的菌落数/免疫前血清处理后的平均菌落数)。结果如图3所示。结果表明，重组蛋白ompW的抗血清调理人全血对嗜麦芽窄食单胞菌的相对保护率为37％左右。
实施例5、小鼠体内攻毒试验
实验小鼠：雄性BALB/c小鼠(6-8周)。
1、将嗜麦芽窄食单胞菌K279a接种于LB培养基中，LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD600nm＝1.0(浓度约4.0×108CFU/mL)。
2、取1mL步骤1得到的菌液，8000rpm离心5min，去上清，用200μL无菌PBS重悬菌体沉淀，得到菌悬液。
3、采用实施例2中的方法免疫小鼠，第29天时给对照组小鼠和实验组小鼠腹腔注射步骤2得到的菌悬液(200μL/只)，8h后摘眼球取血，取100μL血液均匀涂布于LB平板，于37℃孵育箱中静置孵育24h后进行菌落计数。
结果如图4所示。结果表明，实验组和对照组有显著差异，重组蛋白ompW作为抗原产生抗体可以有效的减少感染小鼠血中的细菌数，清除该菌在血中的生长，具有一定的保护作用。
<110> 中国人民解放军第307医院
<120> 一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 嗜麦芽窄食单胞菌
<400> 1
caggacagca gctccaccga taccgcttcg ggcaagcatt ttgccgtggt tggcggcgtc 60
gcgctgctgc agccgaagaa tgatccgatc gacggcatca agaaggtcga tggtggcccg 120
gcgccgaccg tcagcttcag ctactacatc aacgacaact gggccgttga actgtggggc 180
gccgccgaca agttcgacca caaggtgaag ggcccgaaca atgcccgcct gggcaacgtc 240
gagcagcagc cggtcgcgct gagcggccag taccacttcg gccaggctga caacgtgttc 300
cgtccgttcg tgggcgtggg ctactaccag tccagcttca gcaatgaaac gctggccgac 360
ggcagcagct ccgacatccg cctcaaggac gccaagggcg tgatcggcac cgtcggcgtg 420
gacatgaaca tcaactccac ctggttcgcc cgtgccgatg cccgctacat gcgttcgcgt 480
ccggacgtga aggtcggcgg cgagaagatc ggcgaagcca agatggatcc gtggaccgtc 540
ggcttcggca tcggtgcccg cttctga 567
<210> 2
<211> 188
<212> PRT
<213> 嗜麦芽窄食单胞菌
<400> 2
Gln Asp Ser Ser Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Lys His Phe Ala Val
1 5 10 15
Val Gly Gly Val Ala Leu Leu Gln Pro Lys Asn Asp Pro Ile Asp Gly
20 25 30
Ile Lys Lys Val Asp Gly Gly Pro Ala Pro Thr Val Ser Phe Ser Tyr
35 40 45
Tyr Ile Asn Asp Asn Trp Ala Val Glu Leu Trp Gly Ala Ala Asp Lys
50 55 60
Phe Asp His Lys Val Lys Gly Pro Asn Asn Ala Arg Leu Gly Asn Val
65 70 75 80
Glu Gln Gln Pro Val Ala Leu Ser Gly Gln Tyr His Phe Gly Gln Ala
85 90 95
Asp Asn Val Phe Arg Pro Phe Val Gly Val Gly Tyr Tyr Gln Ser Ser
100 105 110
Phe Ser Asn Glu Thr Leu Ala Asp Gly Ser Ser Ser Asp Ile Arg Leu
115 120 125
Lys Asp Ala Lys Gly Val Ile Gly Thr Val Gly Val Asp Met Asn Ile
130 135 140
Asn Ser Thr Trp Phe Ala Arg Ala Asp Ala Arg Tyr Met Arg Ser Arg
145 150 155 160
Pro Asp Val Lys Val Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Ala Lys Met Asp
165 170 175
Pro Trp Thr Val Gly Phe Gly Ile Gly Ala Arg Phe
180 185
<210> 3
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60
accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120
gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattccagg acagcagctc caccgatacc 180
gcttcgggca agcattttgc cgtggttggc ggcgtcgcgc tgctgcagcc gaagaatgat 240
ccgatcgacg gcatcaagaa ggtcgatggt ggcccggcgc cgaccgtcag cttcagctac 300
tacatcaacg acaactgggc cgttgaactg tggggcgccg ccgacaagtt cgaccacaag 360
gtgaagggcc cgaacaatgc ccgcctgggc aacgtcgagc agcagccggt cgcgctgagc 420
ggccagtacc acttcggcca ggctgacaac gtgttccgtc cgttcgtggg cgtgggctac 480
taccagtcca gcttcagcaa tgaaacgctg gccgacggca gcagctccga catccgcctc 540
aaggacgcca agggcgtgat cggcaccgtc ggcgtggaca tgaacatcaa ctccacctgg 600
ttcgcccgtg ccgatgcccg ctacatgcgt tcgcgtccgg acgtgaaggt cggcggcgag 660
aagatcggcg aagccaagat ggatccgtgg accgtcggct tcggcatcgg tgcccgcttc 720
tga 723
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile
35 40 45
Gly Ser Glu Phe Gln Asp Ser Ser Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Lys
50 55 60
His Phe Ala Val Val Gly Gly Val Ala Leu Leu Gln Pro Lys Asn Asp
65 70 75 80
Pro Ile Asp Gly Ile Lys Lys Val Asp Gly Gly Pro Ala Pro Thr Val
85 90 95
Ser Phe Ser Tyr Tyr Ile Asn Asp Asn Trp Ala Val Glu Leu Trp Gly
100 105 110
Ala Ala Asp Lys Phe Asp His Lys Val Lys Gly Pro Asn Asn Ala Arg
115 120 125
Leu Gly Asn Val Glu Gln Gln Pro Val Ala Leu Ser Gly Gln Tyr His
130 135 140
Phe Gly Gln Ala Asp Asn Val Phe Arg Pro Phe Val Gly Val Gly Tyr
145 150 155 160
Tyr Gln Ser Ser Phe Ser Asn Glu Thr Leu Ala Asp Gly Ser Ser Ser
165 170 175
Asp Ile Arg Leu Lys Asp Ala Lys Gly Val Ile Gly Thr Val Gly Val
180 185 190
Asp Met Asn Ile Asn Ser Thr Trp Phe Ala Arg Ala Asp Ala Arg Tyr
195 200 205
Met Arg Ser Arg Pro Asp Val Lys Val Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu
210 215 220
Ala Lys Met Asp Pro Trp Thr Val Gly Phe Gly Ile Gly Ala Arg Phe
225 230 235 240

Claims (4)

1.一种蛋白质作为抗原得到的抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制嗜麦芽窄食单胞菌；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4自N端第53-240位所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质的编码基因如SEQ ID NO：3自5′末端第157至723位所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质是通过含有权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌得到的。
4.权利要求1中所述的蛋白质作为抗原在制备抗体中的应用。
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The outer membrane proteins of Stenotrophomonas maltophilia are potential vaccine candidates for channel catfish (Ictalurus punctatus);Xingli Wang;《Fish & Shellfish Immunology》;20161031;第57卷;第318-324页 *

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