CN109420165B

CN109420165B - 预防和治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN109420165B
Application number: CN201710728578.2A
Authority: CN
Inventors: 王恒樑; 刘志成; 潘超; 朱力; 吴军; 冯尔玲; 刘先凯; 孙鹏; 王东澍; 曾明; 王斌; 井申荣
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2037-08-23
Also published as: CN109420165A

Abstract

本发明公开了预防和治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗及其制备方法。本发明公开的预防和治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗，活性成分为将SEQ ID No.1的第20‑156位或SEQ ID No.1的第1‑156位所示的蛋白质糖基化得到的鲍曼不动杆菌糖蛋白。本发明用基因工程法制备鲍曼不动杆菌多糖修饰的rCTB4573用于鲍曼多糖蛋白结合疫苗的制备，可以提高疫苗的均一性，提高疫苗的生产效率，降低成本，具有广泛的应用前景，可用于预防鲍曼病原菌引起的疾病。

Description

预防和治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，预防和治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗及其制备方法。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是一种需氧的、非发酵的革兰氏阴性球杆菌，在自然界中普遍存在，而且其具有生存能力强、无需特殊营养、定植率高、粘附能力强等特点，可引起获得性肺炎、血流感染、腹腔感染、脑膜炎、中枢神经系统感染、泌尿系统感染、皮肤软组织感染等。Ab已呈全球流行，是医院感染中最主要的一个条件致病菌，在医院中能引起爆发性流行感染，易在住院患者的皮肤表面、口腔、呼吸道、胃肠道和泌尿系统道定植。Ab感染危险因素包括：长时间住院、入住监护室、接受机械通气、侵入性操作、抗菌药物暴露以及严重基础疾病等。

由于抗生素的广泛使用，多重耐药、广泛耐药、全耐药的Ab检出率呈现出一个上升的趋势，Ab耐药情况日趋严重。由于多糖的免疫原性，可将其制成多糖疫苗，主要是将特异性的多糖纯化后制备而成，刺激机体产生保护性抗体，但多糖分子的大小也决定了免疫强度的大小，某些病原菌O-PS以及低分子量的CPS(如金黄色葡萄球菌CPS)作为疫苗的效果并不理想；而且多糖均属于2型T细胞非依赖抗原，在整个免疫过程中并没有T细胞的参与，因此不会形成免疫记忆。多糖-蛋白结合疫苗将细菌的聚糖共价连接到适当的蛋白载体上形成糖蛋白，不仅能刺激机体产生非T细胞依赖免疫反应，还能引起T细胞依赖免疫反应，从而产生长久的免疫效果，同时也克服了低分子量的多糖免疫效果不好的问题。

多糖-蛋白结合疫苗生产主要有两种方法，目前市场上多采用化学法制备，化学法是指CPS或者O-PS通过化学方法共价连接到载体蛋白，但化学方法质控困难，多糖与载体蛋白的随机交联导致产物均一性差，纯化和质量控制困难且生产过程步骤多，得率低，成本高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗和预防鲍曼不动杆菌所致疾病。

本发明首先提供了预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗的制备方法，包括：将鲍曼不动杆菌糖蛋白作为活性成分制备得到所述疫苗；

所述鲍曼不动杆菌糖蛋白按照鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法制备，所述鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法包括：将蛋白质(其名称为rCTB4573)在鲍曼不动杆菌中进行糖基化，得到所述鲍曼不动杆菌糖蛋白；

所述蛋白质为下述A1)-A4)中的任一种：

A1)CTB与序列表中SEQ ID No.1的第128-156位所示多肽的融合蛋白；

A2)DsbA信号肽、所述CTB与序列表中SEQ ID No.1的第128-156位所示多肽的融合蛋白；

A3)将A1)或A2)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述方法中，所述CTB可为c1)或c2)：

c1)序列表中SEQ ID No.1的第20-122位所示蛋白质；

c2)将序列表中SEQ ID No.1的第20-122位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述DsbA信号肽为b1)或b2)：

b1)序列表中SEQ ID No.1的第1-19位所示蛋白质；

b2)将序列表中SEQ ID No.1的第1-19位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述方法中，A1)所述蛋白质的序列为SEQ ID No.1的第20-156位；A2)所述蛋白质的序列为SEQ ID No.1的第1-156位。

上述方法中，所述将蛋白质在鲍曼不动杆菌中进行糖基化可包括1)或2)：

1)利用脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶催化rCTB4573的糖基化，得到所述鲍曼不动杆菌糖蛋白；

2)将表达脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶(其名称为PglL)与rCTB4573的表达载体导入所述鲍曼不动杆菌中完成所述蛋白质的糖基化，得到所述鲍曼不动杆菌糖蛋白。

上述方法中，步骤1)可在所述鲍曼不动杆菌中进行。

上述方法中，PglL可为下述D1)-D3)中的任一种：

D1)序列表中SEQ ID No.3所示的蛋白质；

D2)将序列表中SEQ ID No.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

D3)在D1)或D2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述方法中，所述表达载体载可有含有PglL编码基因的表达盒和rCTB4573的编码基因的表达盒；

所述PglL的编码基因可为如下e1)或e2)或e3)：

e1)编码序列是序列表中SEQ ID No.4的第180-1994位的cDNA分子或DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PglL的cDNA分子或基因组DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)限定的核苷酸序列杂交，且编码PglL的cDNA分子或基因组DNA分子；

所述rCTB4573的编码基因可为如下f1)-f4)中的任一种：

f1)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的第237-647位的cDNA分子或DNA分子；

f2)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的第180-647位的cDNA分子或DNA分子；

f3)与f1)或f2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码rCTB4573的cDNA分子或基因组DNA分子；

f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码rCTB4573的cDNA分子或基因组DNA分子。

所述鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法还可包括将rCTB4573进行纯化。

本发明还提供了所述鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法。

本发明还提供了下述M1)或M2)或M3)或M4)的产品：

M1)利用所述预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗的制备方法得到的疫苗；

M2)利用M1)所述疫苗免疫动物得到的抗血清；

M3)所述鲍曼不动杆菌糖蛋白；

M4)预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病的疫苗或药物，其活性成分为所述鲍曼不动杆菌糖蛋白。

所述产品可为药物或疫苗。

所述动物可为哺乳动物，如小鼠。

本发明还提供了下述N1)、N2)、N3)或N4)的产品：

N1)用于制备预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗或药物的成套蛋白质，由rCTB4573和PglL组成；

N2)用于制备预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗或药物的生物材料，为下述n21)至n23)中的任一种：

n21)成套核酸分子，由编码rCTB4573的核酸分子和编码PglL的核酸分子组成；

n22)成套表达盒或表达盒，所述成套表达盒由含有编码rCTB4573的核酸分子的表达盒和含有编码PglL的核酸分子的表达盒组成，所述表达盒含有n21)所述成套核酸分子；

n23)成套重组载体或重组载体，所述成套重组载体由含有编码rCTB4573的核酸分子的重组载体和含有编码PglL的核酸分子的重组载体组成，所述重组载体含有n21)所述成套核酸分子；

N3)rCTB4573；

N4)与rCTB4573相关的生物材料，为下述n11)至n14)中的任一种：

n11)编码rCTB4573的核酸分子；

n12)含有n11)所述核酸分子的表达盒；

n13)含有n11)所述核酸分子的重组载体、或含有n12)所述表达盒的重组载体；

n14)含有n11)所述核酸分子的重组微生物、或含有n12)所述表达盒的重组微生物、或含有n13)所述重组载体的重组微生物。

上述产品中，所述编码rCTB4573的核酸分子可为所述rCTB4573的编码基因。所述编码PglL的核酸分子可为所述PglL的编码基因。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码rCTB4573的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的rCTB4573的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码rCTB4573且具有rCTB4573功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码rCTB4573的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述产品中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述产品中，B2)所述的含有编码rCTB4573的核酸分子的表达盒(rCTB4573基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达rCTB4573的DNA，该DNA不但可包括启动rCTB4573基因转录的启动子，还可包括终止rCTB4573基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述rCTB4573基因表达盒的重组载体。

上述产品中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述产品中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为鲍曼不动杆菌。

本发明还提供了下述任一应用：

X1、上述M1)或M2)或M3)或M4)的产品或N1)、N2)、N3)或N4)的产品在制备治疗和/或预防鲍曼不动杆菌所致疾病产品中的应用；

X2、上述M1)或M2)或M3)或M4)的产品或N1)、N2)、N3)或N4)的产品在治疗和/或预防鲍曼不动杆菌所致疾病中的应用。

所述产品可为药物或疫苗。

本发明中，所述标签可为表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明用基因工程法制备细菌多糖修饰的rCTB4573用于鲍曼多糖蛋白结合疫苗的制备，可以提高疫苗的均一性，提高疫苗的生产效率，降低成本，具有广泛的应用前景，可用于预防鲍曼病原菌引起的疾病。利用本发明的方法制备的预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗具有治疗鲍曼不动杆菌所致疾病。

附图说明

图1为western blot分析pET28tacpglL-tacrCTB4573/Ab的表达产物。其中，M为分子量标准。

图2为SDS-PAGE分析糖基工程鲍曼不动杆菌糖蛋白的纯化结果。其中，A为糖蛋白纯化结果，1-7分别表示阳离子交换纯化线性洗脱收集的糖蛋白经SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色的结果；B为糖蛋白纯化后浓缩的结果；M均为分子量标准。箭头所示为目的糖蛋白。

图3为鲍曼不动杆菌糖蛋白免疫动物抗血清效果评价。腹腔组、皮下组和对照组分别表示皮下免疫组、腹腔免疫组和空白对照组。

图4为三次免疫后小鼠攻毒后的存活情况示意图。腹腔组、皮下组和对照组分别表示皮下免疫组、腹腔免疫组和空白对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的鲍曼不动杆菌ATCC产品，编号为ATCC17978。

实施例1、表达PglL与rCTB4573的重组载体的构建

1、表达PglL重组载体的构建

脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码序列如SEQ ID No.4的第180-1994位核苷酸所示。SEQ ID No.4的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，第2475-2480位核苷酸为SacI识别序列，第2487-2492位核苷酸为PstI识别位点，第2510-2515位核苷酸为XhoI识别位点。SEQ ID No.4的第105-2240位核苷酸为PglL表达盒的序列，PglL表达盒中，PglL的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacpglL。其中，SEQID No.4的第105-133位核苷酸为tac启动子的序列，SEQ ID No.4的第180-1994位核苷酸为脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL的编码序列。

用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.4所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到含有SEQ ID No.4所示的DNA分子的序列正确的重组载体，将该重组载体命名为pET28tacpglL。

2、重组CTB融合蛋白表达载体的构建

根据脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的三级结构，截取包含PilE第63位丝氨酸(S63)的多肽，以CTB为载体蛋白，将多肽融合至CTB的C端。具体方法如下：N端从PilE的第45位的丝氨酸(S45)起始，C端至第73位赖氨酸(K73)结束，截取S45～K73的29个氨基酸，将其融合至CTB的C端；为了避免CTB与肽段之间有空间位阻效应，CTB和肽段由5个氨基酸连接。由于糖基化修饰发生于周质空间，根据GeneBack公布的霍乱毒素B亚单位(X76390.1)氨基酸序列，将其信号肽(前21位氨基酸)替换为DsbA信号肽，同时在重组融合蛋白的C端融合6×His tag标签，以便后期检测工作，从而构建一系列重组CTB重组融合蛋白rCTB4573。rCTB4573的编码基因序列如SEQ ID No.2的第180-680位所示，其中自5’末端起第237-545位为CTB编码序列，第561-647位为PilE的第45至73位氨基酸编码序列，第180-236位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4573蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第156位为PilE的第45至73位氨基酸，第157至第166位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。

3、含有PglL表达盒与rCTB4573表达盒的重组载体的构建

具体构建方法如下：

将上述pET28tacpglL的SacI和HindⅢ识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2的第7-680位所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28tacpglL-tacrCTB4573，pET28tacpglL-tacrCTB4573能表达SEQ ID No.3所示的PglL和SEQ ID No.1所示的rCTB4573蛋白。其中，SEQ ID No.2的第105-133位核苷酸为tac启动子的序列，SEQID No.2的第180-680位编码SEQ ID No.1所示的rCTB4573蛋白。pET28tacpglL-tacrCTB4573中，rCTB4573的表达也由tac启动子启动，tac启动子与rCTB4573的编码基因组成的表达盒(即tacrCTB4573)位于pglL表达盒(tacpglL)下游。

实施例2、糖基工程鲍曼不动杆菌的构建及蛋白糖基化检测

1、鲍曼不动杆菌电转感受态制备

将鲍曼不动杆菌于37℃培养过夜，以体积比1:100传代于低盐LB液体培养基培养50ml的鲍曼(低盐LB液体培养基(500mL)配方：5g蛋白胨，2.5g酵母粉，2.5g NaCl，余量为水，pH 7.0)，30℃继续培养至OD₆₀₀值为0.6时,冰浴30min，再以6000r/min、4℃离心8min收集菌体，用高压灭菌过的10％甘油洗涤四次，最后用300μL的10％的灭菌甘油重悬细菌，获得电击转化用的鲍曼不动杆菌感受态细胞。

2、融合蛋白表达载体pET28tacpglL-tacrCTB4573在鲍曼中的表达和糖基化

将实施例1的pET28tacpglL-tacrCTB4573导入步骤1得到的鲍曼不动杆菌感受态细胞中得到糖基工程鲍曼不动杆菌重组菌，将该重组菌命名为pET28tacpglL-tacrCTB4573/Ab。

挑取pET28tacpglL-tacrCTB4573/Ab单克隆，接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导12h。取1ml菌液，1 2000r/min离心1min收集菌体，用100μl ddH₂O重悬，再加入100μl 2×SDS,沸水浴10min，得到SDS-PAGE样品，将样品用15％SDS-PAGE和western blot分析，western blot分析所用抗体为Anti-CTB和Anti-His，western blot分析结果(图1)显示pET28tacpglL-tacrCTB4573/Ab表达了目的糖蛋白：没有糖基化的蛋白大小约为18kD，当蛋白发生糖基化后，由于加上了多糖，因此分子量变大，多糖大小呈现5糖的重复，因此用Anti-CTB和Anti-His会出现规则的“带状”。

实施例3、糖基工程鲍曼不动杆菌糖蛋白的纯化

1、挑取实施例2的pET28tacpglL-tacrCTB4573/Ab单克隆，接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，以体积比1:100传代于LB液体培养基，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导12h，得到蛋白诱导培养液，离心，得到蛋白诱导菌体。

2、样品预处理

取步骤1的蛋白诱导菌体10g，加入100ml A1液(20mM pH7.5Tris-HCl、0.5M NaCl、10mM咪唑，调pH至7.0)，超声破菌(超声4s暂停5s，累计超声时间2h)，用12 000g的离心力离心，收集上清液，将上清液再次用12 000g的离心力离心，收集上清液，此上清为含有被鲍曼不动杆菌胞外多糖修饰的CTB蛋白的粗提液。

3、用Chelating亲和层析柱纯化样品用

利用Chelating亲和层析柱(GE Healthcare，产品目录号为17-5203-06)(Φ1.6cm*15cm)初步纯化样品。

首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO₄水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(20mM pH7.5Tris-HCl、0.5M NaCl、500mM咪唑，调pH至7.0)平衡至少一个柱床体积，最后用上述A1液平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道将步骤2得到的被鲍曼不动杆菌胞外多糖修饰的CTB蛋白的粗提液上样，再用A1液洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收(280nM)接近于0mAU，最后用含0％-100％(体积比)的B1液的溶液进行线性洗脱(A管道进A1液，B管道进B1液，纯化仪自动混合)，收集洗脱液80mL，得到初步纯化的样品。

4、用Zeba^TM Spin Dsealting Columns进行样品除盐

将步骤3中初步纯化的样品加入3 500kD的透析袋中，用聚乙二醇8 000进行浓缩，浓缩至4ml以内备用。将Zeba^TM Spin Dsealting Columns用1 200g离心1min，除去储存缓冲液，再加入平衡缓冲液A2液(A2液为醋酸根浓度为20mmol的pH5.4HAc-NaAc),1 200g离心1min，丢弃穿透组分，重复平衡3次，然后加入浓缩后的样品，1 200g离心1min，收集除盐样品。

5、用阳离子交换层析柱进一步纯化

将步骤4的除盐样品用阳离子交换层析柱进一步纯化。具体如下：

首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用A2液平衡至少3个柱床体积，将样品从A管道上样，用A2液洗去未结合糖蛋白，然后体积百分含量0％-100％的B2液(含有1M NaCl的A2液)进行线性洗脱，并收集洗脱液80ml，以上流速均为1mL/min，收集得到目的鲍曼不动杆菌糖蛋白。

将目的糖蛋白用15％SDS-PAGE和western blot分析。SDS-PAGE分析(图2中A)结果显示，纯化后成功得到了比较纯的目的糖蛋白。将目的糖蛋白再次用透析袋进行浓缩，得到浓度较高的糖蛋白，SDS-PAGE分析(图2中B)可进行动物实验。

实施例4、鲍曼不动杆菌糖蛋白动物免疫及效果评价

将实施例3中纯化收集得到的鲍曼不动杆菌糖蛋白用生理盐水稀释，制成免疫样品。取30只6周龄大(体重无显著差异)的雌性Balb/c小鼠(军事医学科学院实验动物中心)，随机分为3组(每组10只)：皮下免疫组、腹腔免疫组和空白对照组(不注射任何样品)，每只小鼠注射免疫样品100μl。各组分别在第1、14、28天进行免疫注射，第3次免疫注射后14天断尾取血。

用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗鲍曼不动杆菌的抗体滴度。

12 000r/min收集新鲜培养的鲍曼不动杆菌，用菌预处理液(0.25％福尔马林、0.02mol/L pH7.4的PBS(NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g，用ddH₂O溶解并定容到1L))洗3次后，再用菌预处理液稀释至10⁸cfu/ml，得到菌体悬液，4℃保存备用。用0.1mol/L的NaHCO₃溶液配制2.5％(体积百分比)戊二醛溶液，加入96孔板，150μl/孔，37℃孵育1h，再用蒸馏水洗4次，每次5min，拍干。然后向处理好的96孔板中加入菌体悬液，100μl/孔，37℃过夜直至干燥。用PBST(1L PBS加500μl吐温-20)洗3次，拍干，每孔加入含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST 200μl，37℃孵育2h，再用PBST洗3次，拍干，加入倍比稀释的小鼠血清(用含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST稀释)，100μl/孔，37℃孵育90min。PBST洗3次，拍干，加入驴抗鼠抗体(用含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST按1:10 000稀释)，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗3次，拍干，加入100μl/孔的OPD-H₂O₂显色液，避光显色15min，加入50μl终止液，测OD₄₉₀值，结果如图3所示。

结果显示，无论皮下组还是腹腔组，都产生了IgG抗体，说明糖蛋白免疫能够成功使小鼠产生拮抗鲍曼不动杆菌的抗体。相比较两种免疫方式，腹腔组优于皮下组。

实施例5、小鼠攻毒实验

实施例4中，在末次免疫后14天，给每只小鼠以2倍LD₅₀的鲍曼不动杆菌进行腹腔注射攻毒，每只小鼠注射体积为200μL，连续7天观察和记录每组小鼠死亡数。

结果如图4所示，结果显示，对照组存活4只，皮下组存活3只，腹腔组存活10只，可见腹腔组中注射鲍曼不动杆菌糖蛋白对小鼠的保护性极好，表明，鲍曼不动杆菌糖蛋白可以用来治疗鲍曼不动杆菌所致疾病。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120> 预防和治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗及其制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly

50 55 60

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Asp Gln Asn Ala Thr Ser

115 120 125

Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn

130 135 140

Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

His His His His His His

165

<210> 2

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gagctcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 60

cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 120

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattca 180

tgaagaaaat ttggctggcc ttagccggcc tggttctggc attcagcgcc agcgcaaccc 240

cgcagaacat caccgacctg tgcgccgagt accacaacac ccaaatttat accctgaacg 300

acaaaatttt tagctacacc gagagcctgg caggcaagcg cgagatggcc atcatcacct 360

tcaagaacgg cgccattttc caggtggagg tgccgggcag ccagcacatc gacagtcaga 420

agaaggccat cgagcgcatg aaggacaccc tgcgcatcgc ctacctgacc gaggccaagg 480

tggagaagct gtgcgtgtgg aacaacaaga ccccgcacgc catcgccgca atcagcatgg 540

ccaacgacca gaacgccacc agcgccgtga ccgagtacta tctgaaccat ggcgagtggc 600

cgggtaataa caccagcgcc ggcgtggcca caagcagtga gatcaagggc ggcggatccc 660

accatcacca ccaccattaa aagctt 686

<210> 3

<211> 604

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Met Pro Ala Glu Thr Thr Val Ser Gly Ala His Pro Ala Ala Lys Leu

1 5 10 15

Pro Ile Tyr Ile Leu Pro Cys Phe Leu Trp Ile Gly Ile Val Pro Phe

20 25 30

Thr Phe Ala Leu Lys Leu Lys Pro Ser Pro Asp Phe Tyr His Asp Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ile Val Leu Leu Phe Leu Thr Ala Gly Lys

50 55 60

Lys Leu Phe Asp Val Lys Ile Pro Ala Ile Ser Phe Leu Leu Phe Ala

65 70 75 80

Met Ala Ala Phe Trp Tyr Leu Gln Ala Arg Leu Met Asn Leu Ile Tyr

85 90 95

Pro Gly Met Asn Asp Ile Val Ser Trp Ile Phe Ile Leu Leu Ala Val

100 105 110

Ser Ala Trp Ala Cys Arg Ser Leu Val Ala His Phe Gly Gln Glu Arg

115 120 125

Ile Val Thr Leu Phe Ala Trp Ser Leu Leu Ile Gly Ser Leu Leu Gln

130 135 140

Ser Cys Ile Val Val Ile Gln Phe Ala Gly Trp Glu Asp Thr Pro Leu

145 150 155 160

Phe Gln Asn Ile Ile Val Tyr Ser Gly Gln Gly Val Ile Gly His Ile

165 170 175

Gly Gln Arg Asn Asn Leu Gly His Tyr Leu Met Trp Gly Ile Leu Ala

180 185 190

Ala Ala Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Lys Ile Pro Ala Ala Leu Gly Val

195 200 205

Ile Cys Leu Ile Met Gln Thr Ala Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Arg

210 215 220

Thr Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Ile Ala Leu Ile Leu Pro Phe Trp

225 230 235 240

Tyr Phe Arg Ser Asp Lys Ser Asn Arg Arg Thr Met Leu Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Ala Val Phe Leu Thr Ala Leu Phe Gln Phe Ser Met Asn Thr Ile

260 265 270

Leu Glu Thr Phe Thr Gly Ile Arg Tyr Glu Thr Ala Val Glu Arg Val

275 280 285

Ala Asn Gly Gly Phe Thr Asp Leu Pro Arg Gln Ile Glu Trp Asn Lys

290 295 300

Ala Leu Ala Ala Phe Gln Ser Ala Pro Ile Phe Gly His Gly Trp Asn

305 310 315 320

Ser Phe Ala Gln Gln Thr Phe Leu Ile Asn Ala Glu Gln His Asn Ile

325 330 335

Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Asn Leu Phe Thr His Ser His Asn Ile Val

340 345 350

Leu Gln Leu Leu Ala Glu Met Gly Ile Ser Gly Thr Leu Leu Val Ala

355 360 365

Ala Thr Leu Leu Thr Gly Ile Ala Gly Leu Leu Lys Arg Pro Leu Thr

370 375 380

Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ile Cys Thr Leu Ala Val Ser Met Cys His

385 390 395 400

Ser Met Leu Glu Tyr Pro Leu Trp Tyr Val Tyr Phe Leu Ile Pro Phe

405 410 415

Gly Leu Met Leu Phe Leu Ser Pro Ala Glu Ala Ser Asp Gly Ile Ala

420 425 430

Phe Lys Lys Ala Ala Asn Leu Gly Ile Leu Thr Ala Ser Ala Ala Ile

435 440 445

Phe Ala Gly Leu Leu His Leu Asp Trp Thr Tyr Thr Arg Leu Val Asn

450 455 460

Ala Phe Ser Pro Ala Thr Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Asn Arg Lys

465 470 475 480

Ile Asn Glu Leu Arg Tyr Ile Ser Ala Asn Ser Pro Met Leu Ser Phe

485 490 495

Tyr Ala Asp Phe Ser Leu Val Asn Phe Ala Leu Pro Glu Tyr Pro Glu

500 505 510

Thr Gln Thr Trp Ala Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ser Leu Lys Tyr Arg

515 520 525

Pro His Ser Ala Thr Tyr Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Met Arg Gln Gly

530 535 540

Lys Val Ala Glu Ala Lys Gln Trp Met Arg Ala Thr Gln Ser Tyr Tyr

545 550 555 560

Pro Tyr Leu Met Pro Arg Tyr Ala Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Val

565 570 575

Trp Ala Pro Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Ala Phe Ala

580 585 590

Ala Ala Pro Gly His Pro Glu Ala Lys Pro Cys Lys

595 600

<210> 4

<211> 2515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tctagaactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 60

cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 120

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattca 180

tgcccgctga aacgaccgta tccggcgcgc accccgccgc caaactgccg atttacatcc 240

tgccctgctt cctttggata ggcatcgtcc cctttacctt cgcgctcaaa ctgaaaccgt 300

cgcccgactt ttaccacgat gccgccgccg cagccggcct gattgtcctg ttgttcctca 360

cggcaggaaa aaaactgttt gatgtcaaaa tccccgccat cagcttcctt ctgtttgcaa 420

tggcggcgtt ttggtatctt caggcacgcc tgatgaacct gatttacccc ggtatgaacg 480

acatcgtctc ttggattttc atcttgctcg ccgtcagcgc gtgggcctgc cggagcttgg 540

tcgcacactt cggacaagaa cgcatcgtga ccctgtttgc ctggtcgctg cttatcggct 600

ccctgcttca atcctgcatc gtcgtcatcc agtttgccgg ctgggaagac acccctctgt 660

ttcaaaacat catcgtttac agcgggcaag gcgtaatcgg acacatcggg cagcgcaaca 720

acctcggaca ctacctcatg tggggcatac tcgccgccgc ctacctcaac ggacaacgaa 780

aaatccccgc cgccctcggc gtaatctgcc tgattatgca gaccgccgtt ttaggtttgg 840

tcaactcgcg caccatcttg acctacatag ccgccatcgc cctcatcctt cccttctggt 900

atttccgttc ggacaaatcc aacaggcgga cgatgctcgg catagccgca gccgtattcc 960

ttaccgcgct gttccaattt tccatgaaca ccattctgga aacctttact ggcatccgct 1020

acgaaactgc cgtcgaacgc gtcgccaacg gcggtttcac agacttgccg cgccaaatcg 1080

aatggaataa agcccttgcc gccttccagt ccgccccgat attcgggcac ggctggaaca 1140

gttttgccca acaaaccttc ctcatcaatg ccgaacagca caacatatac gacaacctcc 1200

tcagcaactt gttcacccat tcccacaaca tcgtcctcca actccttgca gagatgggaa 1260

tcagcggcac gcttctggtt gccgcaaccc tgctgacggg cattgccggg ctgcttaaac 1320

gccccctgac ccccgcatcg cttttcctaa tctgcacgct tgccgtcagt atgtgccaca 1380

gtatgctcga atatcctttg tggtatgtct atttcctcat ccctttcgga ctgatgctct 1440

tcctgtcccc cgcagaggct tcagacggca tcgccttcaa aaaagccgcc aatctcggca 1500

tactgaccgc ctccgccgcc atattcgcag gattgctgca cttggactgg acatacaccc 1560

ggctggttaa cgccttttcc cccgccactg acgacagtgc caaaaccctc aaccggaaaa 1620

tcaacgagtt gcgctatatt tccgcaaaca gtccgatgct gtccttttat gccgacttct 1680

ccctcgtaaa cttcgccctg ccggaatacc ccgaaaccca gacttgggcg gaagaagcaa 1740

ccctcaaatc actaaaatac cgcccccact ccgccaccta ccgcatcgcc ctctacctga 1800

tgcggcaagg caaagttgca gaagcaaaac aatggatgcg ggcgacacag tcctattacc 1860

cctacctgat gccccgatac gccgacgaaa tccgcaaact gcccgtatgg gcgccgctgc 1920

tacccgaact gctcaaagac tgcaaagcct tcgccgccgc gcccggtcat ccggaagcaa 1980

aaccctgcaa atgaaagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac 2040

agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg 2100

cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta 2160

gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct 2220

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 2280

aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg 2340

gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat 2400

ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 2460

tccgctcatg agacgagctc ggttggctgc agttttccat cgatggccgc tcgag 2515

Claims

1.预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗的制备方法，包括：将鲍曼不动杆菌糖蛋白作为活性成分制备得到所述疫苗；

所述鲍曼不动杆菌糖蛋白按照鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法制备，所述鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法包括：利用脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶催化蛋白质的糖基化或将表达所述脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶与所述蛋白质的表达载体导入鲍曼不动杆菌中完成所述蛋白质的糖基化，得到所述鲍曼不动杆菌糖蛋白；

所述蛋白质为下述A1）-A3）中的任一种：

A1）CTB与序列表中SEQ ID No.1的第128-156位所示多肽的融合蛋白；

A2）DsbA信号肽、所述CTB与序列表中SEQ ID No.1的第128-156位所示多肽的融合蛋白；

A3）在A1）或A2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CTB为序列表中SEQ ID No.1的第20-122位所示蛋白质；

和/或，所述DsbA信号肽为序列表中SEQ ID No.1的第1-19位所示蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：A1）所述蛋白质的序列为SEQ ID No.1的第20-156位；A2）所述蛋白质的序列为SEQ ID No.1的第1-156位。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶为下述D1）或D2）：

D1）序列表中SEQ ID No.3所示的蛋白质；

D2）在D1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表达载体载有含有所述脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶编码基因的表达盒和所述蛋白质的编码基因的表达盒；

所述脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶的编码基因为如下e1）或e2）或e3）：

e1）编码序列是序列表中SEQ ID No.4的第180-1994位的cDNA分子或DNA分子；

e2）与e1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶的cDNA分子或基因组DNA分子；

e3）在严格条件下与e1）限定的核苷酸序列杂交，且编码所述脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶的cDNA分子或基因组DNA分子；

所述蛋白质的编码基因为如下f1）-f4）中的任一种：

f1）编码序列是序列表中SEQ ID No.2的第237-647位的cDNA分子或DNA分子；

f2）编码序列是序列表中SEQ ID No.2的第180-647位的cDNA分子或DNA分子；

f4）与f1）或f2）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

f5）在严格条件下与f1）或f2）限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

6.权利要求1-5中任一所述鲍曼不动杆菌糖蛋白的制备方法。

7.下述M1）或M2）或M3）或M4）的产品：

M1）利用权利要求1-5中任一所述预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病疫苗的制备方法得到的疫苗；

M2）利用M1）所述疫苗免疫动物得到的抗血清；

M3）权利要求1-5中任一所述鲍曼不动杆菌糖蛋白；

M4）预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病的药物，其活性成分为权利要求1-5中任一所述鲍曼不动杆菌糖蛋白。

8.权利要求7所述产品在制备治疗和/或预防鲍曼不动杆菌所致疾病产品中的应用。