CN104387474B - 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 - Google Patents
一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104387474B CN104387474B CN201410652608.2A CN201410652608A CN104387474B CN 104387474 B CN104387474 B CN 104387474B CN 201410652608 A CN201410652608 A CN 201410652608A CN 104387474 B CN104387474 B CN 104387474B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- agent
- tumor vessel
- infraction
- targeting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 96
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 15
- 230000002792 vascular Effects 0.000 abstract description 8
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 abstract description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 abstract 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 abstract 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 abstract 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 abstract 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000004066 vascular targeting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用。本发明的肿瘤血管梗塞剂是由224个氨基酸组成的融合蛋白，经原核表达、纯化获得。该融合蛋白由两部分组成：凝血功能的活性域和肿瘤血管靶向功能的靶向域；其中，所述的靶向域是一种具有肿瘤内皮结合功能的五氨基酸多肽CREKA；所述的活性域由219个氨基酸构成，来源于促凝因子‑组织因子(TF)的胞外功能区(tTF)。本发明以CREKA多肽作为靶向因子，tTF作为效应因子，构建了一种可选择性诱导肿瘤血管栓塞的促凝剂，通过阻断肿瘤部位的营养供给和代谢产物排泄，诱导肿瘤细胞缺血性死亡，是一种新型的基于阻断肿瘤血供的肿瘤治疗靶向剂。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤血管靶向药物技术领域，尤其涉及一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用。
背景技术
肿瘤血管是肿瘤细胞获取营养物质及排除代谢产物的通道，也是肿瘤细胞逃逸、转移的重要途径之一，其形态学和功能都有别于机体的正常血管系统，因而是肿瘤靶向治疗的关键靶点之一。肿瘤血管靶向治疗主要包括两种模式：抑制新生血管生成和阻断已有肿瘤血管。其中阻断肿瘤已有血管疗法主要是通过选择性的破坏肿瘤已有的血管，切断肿瘤血供，诱发肿瘤细胞发生缺血性坏死，从而达到治疗肿瘤的目的。因此，如何实现特异的阻断肿瘤部位的血管，而对机体正常组织血管没有影响，成为研究的热点。
组织因子(TF)是一个分子量约为47kDa的跨膜糖蛋白，在血栓形成过程中起重要的作用。正常情况下，组织因子位于血管壁外膜细胞，不存在于循环中或不与循环血液接触。当血管壁的完整性遭到破坏时，组织因子就会暴露于循环血液,通过激活凝固级联反应发挥止血作用。组织因子由263个氨基酸残基组成，其中氨基端的219个氨基酸残基位于细胞膜外，是组织因子的活性部位。研究表明，当该区域处于游离状态时，并没有凝血活性；但当它被锚定在磷脂膜表面，并暴漏于血液中时，则会产生类似于全长因子的凝血活性，因此该段序列被称之为截断的组织因子(tTF)。鉴于此，如果用具有肿瘤血管靶向功能的分子将tTF特异的定位到肿瘤血管壁表面，则能够特异性的在肿瘤血管中诱发血栓形成事件，从而切断肿瘤部位的血供和代谢产物排除途径，达到治疗肿瘤的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种出一种肿瘤血管梗塞剂多肽，编码其的基因，表达其的表达载体以及其在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。本发明利用一种肿瘤血管靶向肽，将具有促凝活性的截断的组织因子tTF特异性的定位于肿瘤血管内皮表面，从而诱发血栓形成，阻断肿瘤血供，提供了一种具有高靶向性、安全性，免疫原性低的肿瘤血管梗塞剂。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂多肽，所述的肿瘤血管梗塞剂多肽由具有凝血功能的活性域与肿瘤靶向功能的靶向肽两部分构成，所述的靶向肽被连接到活性域的C末端。
作为优选，所述的活性域为截断的组织因子tTF，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(从N端到C端)如下：
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE。
如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列即为组织因子位于细胞膜外的氨基酸残基序列，当其处于游离状态时，没有凝血活性；当其通过靶向肽定位于肿瘤血管内皮细胞膜上时，则会发挥组织因子的功能，激活凝血途径，诱发血栓形成。
作为优选，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(从N端到C端)如下：CREKA。
本发明中采用的肿瘤血管靶向分子是由5个氨基酸构成的一种多肽(CREKA)。该多肽通过噬菌体抗体库筛选技术而获得，能够特异性识别肿瘤血管壁表面的纤维蛋白-纤连蛋白复合物(fibrin-fibronectin complex)，从而定位到肿瘤血管内皮表面。
作为优选，所述肿瘤血管梗塞剂多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；SEQID NO:1所示的氨基酸序列(从N端到C端)如下：
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRECREKA。
本发明制备了一种将上述tTF与肿瘤血管靶向肽CREKA重组的融合蛋白，该融合蛋白能够通过CREKA定位到肿瘤血管内皮细胞表面，从而在肿瘤血管中启动tTF的凝血功能，诱发血栓形成，阻断肿瘤部位血液供应，以“饿死”肿瘤的方式达到治疗肿瘤的目的。
第二方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂基因，其编码如第一方面所述的肿瘤血管梗塞剂多肽。
本领域的技术人员应理解，由于密码子的简并性，本发明编码所述肿瘤血管梗塞剂多肽的核苷酸序列并不唯一，任何能够编码并表达所述肿瘤血管梗塞剂多肽的核苷酸序列都应当理解为本发明的肿瘤血管梗塞剂基因。
第三方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂表达载体，其包含如第二方面所述的肿瘤血管梗塞剂基因。
本领域的技术人员应理解，本发明对表达载体所采用的载体质粒并没有特别限制，因为本领域的技术人员在得知本发明的基因序列的基础上，结合本领域技术人员的公知常识能够选择合适的载体质粒用于本发明的基因表达。
虽然如此，本发明特别提供一种载体质粒，其为常用的pET30a载体质粒。因此，本发明的表达载体优选为采用pET30a载体质粒构建的表达载体。
第四方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂组合物，其包含如第一方面所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如第二方面所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如第三方面所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如第二方面所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如第三方面所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明所述肿瘤血管梗塞剂多肽具体可以通过设计相应的基因序列，构建融合蛋白表达质粒，并将其转入如BL21大肠杆菌中，IPTG诱导表达并纯化，得到具有肿瘤靶向性及凝血活性的肿瘤血管梗塞剂。
本发明中，首先通过全基因合成融合蛋白的基因序列，两端分别设计Nde I和XhoI酶切位点。其次，将该基因序列连接到pET30a表达质粒中，将此表达质粒转化入BL21感受态大肠杆菌中。最后，用IPTG诱导表达、纯化得到目的蛋白。目的蛋白获得以后，用C57BL/6黑色素瘤模型检测其对肿瘤的治疗作用，尾静脉将该融合蛋白注入荷瘤小鼠体内，利用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，记录肿瘤体积。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的肿瘤血管梗塞剂的主体部分为自身来源的TF胞外区域，因此，免疫原性小，能够很好的躲避免疫系统的识别和清除；
(2)本发明的肿瘤血管梗塞剂利用了一种肿瘤靶向肽将tTF定位于肿瘤血管内皮表面，与其他配体-受体定位tTF的方法相比，特异性更强；
(3)本发明可以通过改变靶向分子，应用于其他出血性疾病，应用范围宽泛。
附图说明
图1是本发明融合蛋白SDS-PAGE电泳鉴定结果；
图2为本发明提供的肿瘤血管梗塞剂对黑色素瘤肿瘤生长抑制作用评价结果图，其中箭头代表给药时间点。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1融合蛋白质粒的构建
首先，从NCBI查得组织因子胞外219个氨基酸的基因序列；其次，将肿瘤靶向肽的氨基酸序列翻译出其基因序列，用全基因合成的方式，合成该融合蛋白的表达序列，并在两端分别设计Nde I和Xho I酶切位点；最后，将融合蛋白基因通过上述酶切位点，连接入pET30a载体中，从而得到融合蛋白表达载体。
实施例2融合蛋白的表达、纯化
(1)融合蛋白的表达
将上述融合蛋白表达载体转化入BL21大肠杆菌中，先接5μL菌液到5mLLB液体培养基中，37℃，200×rpm，摇床培养16h；将培养的菌液转接到500mLLB液体培养基中，37℃，200×rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)诱导表达4h。
(2)融合蛋白的纯化
将上述IPTG诱导表达的菌液离心(6000×rpm，5min)，弃上清，收菌；沉淀用25mL10mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液吹散，超声破菌，12000×rpm，离心10min，上清去除干净，用25mL 10 mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min。重复上述操作一次，得到沉淀。加入少量的10mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液重悬沉淀，再加8mL含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液溶解蛋白，12000×rpm，离心10min，收集上清。
通过SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白，结果如图1所示，可见形成清晰、纯净的条带，与预期相符。
实施例3肿瘤血管梗塞剂抗肿瘤效果评价
构建黑色素瘤移植模型，当肿瘤体积到达大约0.15cm3时，将一定剂量的蛋白药物溶液给荷瘤小鼠尾静脉注射，每隔2-3天注射一次并测量肿瘤体积大小，注射10天以后，统计分析肿瘤体积变化情况。肿瘤体积按照以下公式计算：体积＝(d2×D)/2，其中d是肿瘤的最小直径，D是最大直径。注射生理盐水组为阴性对照组，结果如图2所示。疗效分析结果显示，给荷瘤小鼠注射CREKA-tTF融合蛋白四次以后，能够有效的抑制肿瘤的生长，并使50％以上的肿瘤发生消退，与对照组相比具有显著的统计学意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (5)
1.一种肿瘤血管梗塞剂多肽，其特征在于，所述的肿瘤血管梗塞剂多肽由具有凝血功能的活性域与肿瘤靶向功能的靶向肽两部分构成，所述的活性域为截断的组织因子tTF，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种肿瘤血管梗塞剂基因，其编码如权利要求1所述的肿瘤血管梗塞剂多肽。
3.一种肿瘤血管梗塞剂表达载体，其包含如权利要求2所述的肿瘤血管梗塞剂基因。
4.一种肿瘤血管梗塞剂组合物，其包含如权利要求1所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如权利要求2所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如权利要求3所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体。
5.如权利要求1所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如权利要求2所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如权利要求3所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410652608.2A CN104387474B (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
| PCT/CN2015/094576 WO2016078549A1 (zh) | 2014-11-17 | 2015-11-13 | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410652608.2A CN104387474B (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104387474A CN104387474A (zh) | 2015-03-04 |
| CN104387474B true CN104387474B (zh) | 2018-01-23 |
Family
ID=52605445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410652608.2A Active CN104387474B (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104387474B (zh) |
| WO (1) | WO2016078549A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104387474B (zh) * | 2014-11-17 | 2018-01-23 | 北京华安科创生物技术有限公司 | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
| US10676537B2 (en) | 2016-08-22 | 2020-06-09 | Fudan University | Antibody targeted to tissue factor, preparation method therefor, and use thereof |
| CN108178783B (zh) * | 2017-12-21 | 2021-05-14 | 西南医科大学 | 肿瘤血管及m1型巨噬细胞靶向肽及其用途 |
| CN110790841A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-02-14 | 国家纳米科学中心 | 一种蛋白核酸复合物及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT988056E (pt) * | 1997-01-22 | 2003-09-30 | Univ Texas | Metodos e composicoes de factor tecidual para o tratamento da coagulacao e de tumores |
| DE10338733A1 (de) * | 2003-08-22 | 2005-03-24 | Berdel, Wolfgang E., Prof. Dr.med. | Fusionspolypeptide und deren Verwendung für die antivaskuläre Tumortherapie |
| CN102153653B (zh) * | 2010-12-30 | 2012-08-15 | 厦门大学 | 肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白及其制备方法 |
| CN104045717B (zh) * | 2014-07-08 | 2016-07-06 | 北京华安科创生物技术有限公司 | 一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
| CN104387474B (zh) * | 2014-11-17 | 2018-01-23 | 北京华安科创生物技术有限公司 | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 |
-
2014
- 2014-11-17 CN CN201410652608.2A patent/CN104387474B/zh active Active
-
2015
- 2015-11-13 WO PCT/CN2015/094576 patent/WO2016078549A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016078549A1 (zh) | 2016-05-26 |
| CN104387474A (zh) | 2015-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104045717B (zh) | 一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用 | |
| CN104387474B (zh) | 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 | |
| BRPI0713355A2 (pt) | tratamento de dor | |
| ES2240167T3 (es) | Polipeptido con actividad fibrinolitica. | |
| CN103952388B (zh) | 重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途 | |
| JP2020532316A (ja) | 局所用組成物及び使用 | |
| CN102373234A (zh) | 一种内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法 | |
| CN101003788A (zh) | 一种蝎抗肿瘤转移肽及其制备方法和应用 | |
| JP2006516113A5 (zh) | ||
| CN101070349B (zh) | 具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白与应用 | |
| CN100537765C (zh) | 重组人血管抑素k1-3的制备工艺及其制品在肿瘤治疗药物中的应用 | |
| KR20220127880A (ko) | 신경 손상 및 이의 관련 병증 치료 방법 | |
| JP5345069B2 (ja) | 低出血性抗凝固性融合タンパク質の調製および使用 | |
| CN106496329B (zh) | 一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白 | |
| CN106749561B (zh) | 一种嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白及其应用 | |
| Reitinger et al. | High-yield recombinant expression of the extremophile enzyme, bee hyaluronidase in Pichia pastoris | |
| CN101117635B (zh) | Ptd、hif的odd与肿瘤抑制基因的融合表达及其应用 | |
| CN110790841A (zh) | 一种蛋白核酸复合物及其制备方法和应用 | |
| CN103865899B (zh) | 具有vegfr2/kdr受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用 | |
| CN108676090B (zh) | 一种纤溶酶抑制剂及其应用 | |
| TWI577694B (zh) | 重組細胞毒素蛋白及其應用 | |
| CN101240284B (zh) | 一种重组葡激酶及其高效分泌表达的方法 | |
| Cai et al. | Computational design, functional analysis and antigenic epitope estimation of a novel hybrid of 12 peptides of hirudin and reteplase | |
| CN104356219A (zh) | 一种印鼠客蚤抗心律失常的多肽及其制备方法 | |
| KR20130126549A (ko) | 항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150923 Address after: 100085, A409, Haidian District, Beijing, 5 Applicant after: Beijing Huaan Kechuang Biotechnology Co., Ltd. Address before: 100190 Beijing, Zhongguancun, north of a No. 11, No. Applicant before: State Nanometer Science Center |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |