CN104387474B - 一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用。本发明的肿瘤血管梗塞剂是由224个氨基酸组成的融合蛋白，经原核表达、纯化获得。该融合蛋白由两部分组成：凝血功能的活性域和肿瘤血管靶向功能的靶向域；其中，所述的靶向域是一种具有肿瘤内皮结合功能的五氨基酸多肽CREKA；所述的活性域由219个氨基酸构成，来源于促凝因子‑组织因子(TF)的胞外功能区(tTF)。本发明以CREKA多肽作为靶向因子，tTF作为效应因子，构建了一种可选择性诱导肿瘤血管栓塞的促凝剂，通过阻断肿瘤部位的营养供给和代谢产物排泄，诱导肿瘤细胞缺血性死亡，是一种新型的基于阻断肿瘤血供的肿瘤治疗靶向剂。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤血管靶向药物技术领域，尤其涉及一种肿瘤血管梗塞剂多肽、基因、表达载体及其应用。
背景技术
肿瘤血管是肿瘤细胞获取营养物质及排除代谢产物的通道，也是肿瘤细胞逃逸、转移的重要途径之一，其形态学和功能都有别于机体的正常血管系统，因而是肿瘤靶向治疗的关键靶点之一。肿瘤血管靶向治疗主要包括两种模式：抑制新生血管生成和阻断已有肿瘤血管。其中阻断肿瘤已有血管疗法主要是通过选择性的破坏肿瘤已有的血管，切断肿瘤血供，诱发肿瘤细胞发生缺血性坏死，从而达到治疗肿瘤的目的。因此，如何实现特异的阻断肿瘤部位的血管，而对机体正常组织血管没有影响，成为研究的热点。
组织因子(TF)是一个分子量约为47kDa的跨膜糖蛋白，在血栓形成过程中起重要的作用。正常情况下，组织因子位于血管壁外膜细胞，不存在于循环中或不与循环血液接触。当血管壁的完整性遭到破坏时，组织因子就会暴露于循环血液,通过激活凝固级联反应发挥止血作用。组织因子由263个氨基酸残基组成，其中氨基端的219个氨基酸残基位于细胞膜外，是组织因子的活性部位。研究表明，当该区域处于游离状态时，并没有凝血活性；但当它被锚定在磷脂膜表面，并暴漏于血液中时，则会产生类似于全长因子的凝血活性，因此该段序列被称之为截断的组织因子(tTF)。鉴于此，如果用具有肿瘤血管靶向功能的分子将tTF特异的定位到肿瘤血管壁表面，则能够特异性的在肿瘤血管中诱发血栓形成事件，从而切断肿瘤部位的血供和代谢产物排除途径，达到治疗肿瘤的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种出一种肿瘤血管梗塞剂多肽，编码其的基因，表达其的表达载体以及其在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。本发明利用一种肿瘤血管靶向肽，将具有促凝活性的截断的组织因子tTF特异性的定位于肿瘤血管内皮表面，从而诱发血栓形成，阻断肿瘤血供，提供了一种具有高靶向性、安全性，免疫原性低的肿瘤血管梗塞剂。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂多肽，所述的肿瘤血管梗塞剂多肽由具有凝血功能的活性域与肿瘤靶向功能的靶向肽两部分构成，所述的靶向肽被连接到活性域的C末端。
作为优选，所述的活性域为截断的组织因子tTF，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(从N端到C端)如下：
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如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列即为组织因子位于细胞膜外的氨基酸残基序列，当其处于游离状态时，没有凝血活性；当其通过靶向肽定位于肿瘤血管内皮细胞膜上时，则会发挥组织因子的功能，激活凝血途径，诱发血栓形成。
作为优选，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(从N端到C端)如下：CREKA。
本发明中采用的肿瘤血管靶向分子是由5个氨基酸构成的一种多肽(CREKA)。该多肽通过噬菌体抗体库筛选技术而获得，能够特异性识别肿瘤血管壁表面的纤维蛋白-纤连蛋白复合物(fibrin-fibronectin complex)，从而定位到肿瘤血管内皮表面。
作为优选，所述肿瘤血管梗塞剂多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；SEQID NO:1所示的氨基酸序列(从N端到C端)如下：
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRECREKA。
本发明制备了一种将上述tTF与肿瘤血管靶向肽CREKA重组的融合蛋白，该融合蛋白能够通过CREKA定位到肿瘤血管内皮细胞表面，从而在肿瘤血管中启动tTF的凝血功能，诱发血栓形成，阻断肿瘤部位血液供应，以“饿死”肿瘤的方式达到治疗肿瘤的目的。
第二方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂基因，其编码如第一方面所述的肿瘤血管梗塞剂多肽。
本领域的技术人员应理解，由于密码子的简并性，本发明编码所述肿瘤血管梗塞剂多肽的核苷酸序列并不唯一，任何能够编码并表达所述肿瘤血管梗塞剂多肽的核苷酸序列都应当理解为本发明的肿瘤血管梗塞剂基因。
第三方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂表达载体，其包含如第二方面所述的肿瘤血管梗塞剂基因。
本领域的技术人员应理解，本发明对表达载体所采用的载体质粒并没有特别限制，因为本领域的技术人员在得知本发明的基因序列的基础上，结合本领域技术人员的公知常识能够选择合适的载体质粒用于本发明的基因表达。
虽然如此，本发明特别提供一种载体质粒，其为常用的pET30a载体质粒。因此，本发明的表达载体优选为采用pET30a载体质粒构建的表达载体。
第四方面，本发明提供了一种肿瘤血管梗塞剂组合物，其包含如第一方面所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如第二方面所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如第三方面所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如第二方面所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如第三方面所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明所述肿瘤血管梗塞剂多肽具体可以通过设计相应的基因序列，构建融合蛋白表达质粒，并将其转入如BL21大肠杆菌中，IPTG诱导表达并纯化，得到具有肿瘤靶向性及凝血活性的肿瘤血管梗塞剂。
本发明中，首先通过全基因合成融合蛋白的基因序列，两端分别设计Nde I和XhoI酶切位点。其次，将该基因序列连接到pET30a表达质粒中，将此表达质粒转化入BL21感受态大肠杆菌中。最后，用IPTG诱导表达、纯化得到目的蛋白。目的蛋白获得以后，用C57BL/6黑色素瘤模型检测其对肿瘤的治疗作用，尾静脉将该融合蛋白注入荷瘤小鼠体内，利用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，记录肿瘤体积。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的肿瘤血管梗塞剂的主体部分为自身来源的TF胞外区域，因此，免疫原性小，能够很好的躲避免疫系统的识别和清除；
(2)本发明的肿瘤血管梗塞剂利用了一种肿瘤靶向肽将tTF定位于肿瘤血管内皮表面，与其他配体-受体定位tTF的方法相比，特异性更强；
(3)本发明可以通过改变靶向分子，应用于其他出血性疾病，应用范围宽泛。
附图说明
图1是本发明融合蛋白SDS-PAGE电泳鉴定结果；
图2为本发明提供的肿瘤血管梗塞剂对黑色素瘤肿瘤生长抑制作用评价结果图，其中箭头代表给药时间点。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1融合蛋白质粒的构建
首先，从NCBI查得组织因子胞外219个氨基酸的基因序列；其次，将肿瘤靶向肽的氨基酸序列翻译出其基因序列，用全基因合成的方式，合成该融合蛋白的表达序列，并在两端分别设计Nde I和Xho I酶切位点；最后，将融合蛋白基因通过上述酶切位点，连接入pET30a载体中，从而得到融合蛋白表达载体。
实施例2融合蛋白的表达、纯化
(1)融合蛋白的表达
将上述融合蛋白表达载体转化入BL21大肠杆菌中，先接5μL菌液到5mLLB液体培养基中，37℃，200×rpm，摇床培养16h；将培养的菌液转接到500mLLB液体培养基中，37℃，200×rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)诱导表达4h。
(2)融合蛋白的纯化
将上述IPTG诱导表达的菌液离心(6000×rpm，5min)，弃上清，收菌；沉淀用25mL10mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液吹散，超声破菌，12000×rpm，离心10min，上清去除干净，用25mL 10 mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min。重复上述操作一次，得到沉淀。加入少量的10mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液重悬沉淀，再加8mL含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液溶解蛋白，12000×rpm，离心10min，收集上清。
通过SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白，结果如图1所示，可见形成清晰、纯净的条带，与预期相符。
实施例3肿瘤血管梗塞剂抗肿瘤效果评价
构建黑色素瘤移植模型，当肿瘤体积到达大约0.15cm3时，将一定剂量的蛋白药物溶液给荷瘤小鼠尾静脉注射，每隔2-3天注射一次并测量肿瘤体积大小，注射10天以后，统计分析肿瘤体积变化情况。肿瘤体积按照以下公式计算：体积＝(d2×D)/2，其中d是肿瘤的最小直径，D是最大直径。注射生理盐水组为阴性对照组，结果如图2所示。疗效分析结果显示，给荷瘤小鼠注射CREKA-tTF融合蛋白四次以后，能够有效的抑制肿瘤的生长，并使50％以上的肿瘤发生消退，与对照组相比具有显著的统计学意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (5)
1.一种肿瘤血管梗塞剂多肽，其特征在于，所述的肿瘤血管梗塞剂多肽由具有凝血功能的活性域与肿瘤靶向功能的靶向肽两部分构成，所述的活性域为截断的组织因子tTF，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种肿瘤血管梗塞剂基因，其编码如权利要求1所述的肿瘤血管梗塞剂多肽。
3.一种肿瘤血管梗塞剂表达载体，其包含如权利要求2所述的肿瘤血管梗塞剂基因。
4.一种肿瘤血管梗塞剂组合物，其包含如权利要求1所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如权利要求2所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如权利要求3所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体。
5.如权利要求1所述的肿瘤血管梗塞剂多肽、如权利要求2所述的肿瘤血管梗塞剂基因或如权利要求3所述的肿瘤血管梗塞剂表达载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
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