JP5345069B2 - 低出血性抗凝固性融合タンパク質の調製および使用 - Google Patents

Description

発明の技術分野
本発明は、生命工学の分野に属し、そして一種の低出血性の抗凝固性物質の構造および調製、ならびに血栓症および血栓症関連疾患の予防および治療に関する。特に本発明は、抗凝固性物質と、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ（ＦＸａ）およびＸＩａ（ＦＸＩａ）などを含む、幾つかの血液凝固因子によって認識可能な、かつ切断可能なアミノ酸配列とを結合することによって得られる新規物質、ならびに同一物の調製および医薬的使用に関する。

発明の背景
心臓・脳血管系疾患は、ヒトの健康および生命を脅かす第一位の死因であり、そして血栓症は、多くの心臓・脳血管系疾患の重大な原因である。したがって、抗凝固剤は、血栓症の予防のために使用される重要な医薬である。現在において、ヘパリンは、臨床治療において広く使用されている抗凝固剤である。しかし、その重大な欠点の一つは血小板減少症を引き起こすことである。新規に開発された低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンは、上の危険性を減少させるかもしれないが、完全にその欠点を克服することはできない。

人々は、上で言及された先の抗凝固剤の欠点について、さらに焦点を当てた。理想的な抗凝固剤として、それは明瞭かつ明確な抗凝固性効果を有するべきであり、そして臨床的安全性を増大させるために、全身投与の場合において出血の副作用を引き起こすべきではない。

この目的のために、本発明のための指針の重大な点は、抗凝固性機能は、条件付きに、および特異的に活性化されるべきである。すなわち、この種の物質は通常、抗凝固性活性を有さず、そして凝固系が活性化されるときのみに、および血栓が形成される可能性があるか、または血栓が形成されたときのみに、その後この種の抗凝固剤が局所的にそれらの抗凝固活性を示す。発症しつつある、または発症した血栓の付近における局所的な抗凝固性活性は、予防的／治療的目的を達成するように、血栓症または血栓の持続的な成長を予防するための、形成された微小血栓の分解さえするための微小環境を形成する。したがって、本発明は、ヘパリン、ヒルジンなどのような抗凝固剤の投与と共に通常起こる全身性出血の危険性を克服するだろう。

例えば、ヒルジンは、６５〜６６アミノ酸残基からなる一本鎖ポリペプチドであり、そのアミノ末端はトロンビンの触媒的活性部位と結合することができ、および抗凝固活性を有し、そして、Ｃ末端とトロンビン基質の認識部位との結合は、トロンビンに対して非常に強い特異的親和性を示す。本研究は、ヒルジンの抗凝固活性を一時的に減少させるために、ヒルジンのアミノ末端を塞ぐ方法を意図した。インビボ凝固系が活性化され、そして血栓が形成される時、血栓症によって誘発される特別な生化学的変化が、アミノ末端が塞がれたヒルジンを、潜在的または既に生じている血栓形成部位に対して特異的な抗凝固効果を示す元の形態のヒルジンに回復させ、それにより全身性出血の副作用が減少され得る。したがって、これは、新しい種類の安全かつ有効な抗凝固性薬剤である。

上で言及した創意の誘導のもと、ヒルジンは本研究において修飾された。一旦、凝固系が活性化された場合に、ヒルジン誘導体の抗凝固性活性が放出され、そして抗凝固性および抗血栓性の役割を果たし、同時に出血性の副作用も減少されるために、ヒルジンは初めに、アミノ末端でトロンビンによって認識可能かつ切断可能な、ＴＨと名づけられるオリゴペプチドと結合されるか、またはＦＨと名づけられる血液凝固因子Ｘａによって認識可能かつ切断可能なオリゴペプチドと結合された。当該結果は、修飾されたヒルジンが機能的であったが、当該有効性がまだ十分に高くないことを示した。それから我々は、我々の考えを発展させ、そしてヒルジンは、幾つかの血液凝固因子または他の因子によって認識され、および切断され得るオリゴペプチドと結合することによって修飾されてもよいと考えた。我々は、上で言及した修飾によって、臨床診療に適用可能な程度までに有効性が高められ得ると期待した。しかし現在において、関連する文献に基づいて、これらのオリゴペプチドが、高い効率性で対応する血液凝固因子によって認識され、および切断され得るか否かを我々は推測することができない。以下のように、２つの関連のあるタンパク質が我々の研究室において調製された：（１）ヒルジンは、そのアミノ末端で、トロンビンおよび凝固因子Ｘａの両方によって認識可能なかつ切断可能なオリゴペプチドと結合され、このヒルジン誘導体はＧＨと名づけられた；（２）ヒルジンは、そのアミノ末端で、凝固因子ＸＩａおよびＸａの両方によって認識可能なかつ切断可能なオリゴペプチドと結合され、このヒルジン誘導体はＥＨと名づけられた。

当該研究の結果は、ヒルジンのこれら２つの誘導体は通常、インビトロ、インビボを問わず抗凝固活性を有さず、そして一旦、凝固系が活性化された場合に、上で言及された血液凝固因子の共同の下、ヒルジンの抗凝固活性を局所的に、有効に放出することができ、そして抗凝固性および抗血栓性の両方の役割を果たすことができた。確かに、血栓が存在しない身体の部位においては抗凝固活性がなく、それゆえに、それらの全身性出血の副作用もまた、著しく減少された。したがって、ヒルジンおよびヘパリンのような抗凝固剤とは異なって、それらは一種の安全かつ有効な抗凝固および抗血栓剤である。結果として、低出血性の特性を有するこの種の抗凝固剤は、血栓症の予防および／または治療における適用において重要である。

発明の目的
本発明は、血栓症の予防および／または治療のために、それ自体抗凝固性活性を有さず、そして血栓形成が生じる傾向にある、または生じているときに、血栓形成部位周辺においてその抗凝固活性を放出することができる、一種の物質を提供することを目的とする。

図１は、ＥＨおよびＧＨのヌクレオチド配列を示す。 図２は、ＥＨおよびＧＨのアミノ酸配列を示す。

本発明の開示
本発明において、抗凝固物質の抗凝固性活性が、抗凝固物質を、凝固因子ＸＩａおよびＸａの両方によって認識可能な配列と、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａの両方によって認識可能な配列と結合することによって阻害されることができ、そして当該新規抗凝固物質は特定の条件において切断可能であることが発見される。誘導化された抗凝固物質は、以下の特性を有する：上で言及された二つの血液凝固因子によって認識可能な配列によって阻害された後、ヒルジンのような抗凝固物質は、インビトロおよび血液系の非血栓性部位の両方において抗凝固活性を有さず、その結果、ヒルジンのような抗凝固物質によって引き起こされる全身性の出血の副作用を避け、または減少させている；誘導化された抗凝固物質は、血栓形成が生じる時にのみ、血栓形成領域に特異的に存在する血液凝固因子の作用下において、遊離の抗凝固性物質を局所的に放出することができ、その結果、血栓症に対して予防的および／または治療的効果を示し、そしてしたがって全身性出血の副作用を著しく減少させる。さらに、ヒルジンのアミノ末端のように、二つの凝固因子認識配列を用いて塞がれている新規抗凝固物質は、二つの凝固因子によって一緒に切断されることができ、そしてその有効性は、一つの凝固因子認識配列によって抗凝固物質が塞がれているものよりも著しく優れている。上で言及された特性に基づいた本発明の発見は、現在において完成された。

したがって、一方においては、本発明は、凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチド、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチドを含む抗凝固物質に関する。

本発明は、他方では、凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチド、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチドを含む抗凝固物質の調製方法であって、凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能な、かつ切断可能な配列、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な、かつ切断可能な配列に相当する基本配列と、抗凝固タンパク質をコードする遺伝子とを結合し、それから当該組み換え遺伝子を、ｐＢＶ２２０、ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋのような好適な発現ベクター中へ挿入し、そして新規抗凝固物質を得るために、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母または動物細胞系のような好適な宿主細胞中で、興味のある遺伝子を含む組み換えベクターを発現させることを含む前記方法に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、上で言及された新規抗凝固物質および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物に関する。

本発明に従って、用語「抗凝固性物質」または「抗凝固物質」は、ヒルジン、抗トロンビンII、蛇毒など、またはそれらの変異体のような、血液凝固に逆らう物質；あるいは抗凝固活性を有する他の物質、好ましくはヒルジンまたはその変異体を示す。

本発明に従って、用語「凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能な結合ペプチド、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な結合ペプチド」または「凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能なオリゴペプチド、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能なオリゴペプチド」は、トリペプチドＥＰＲ（ＧｌｕＰｒｏＡｒｇ）もしくはＥＰＲを含むペプチド断片、またはＧＶＹＡＲ（ＧｌｙＶａｌＴｙｒＡｌａＡｒｇ）ペンタペプチドもしくはＧＶＹＡＲを含むペプチド断片を示すために使用される。

本発明に従って、凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチド、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチドを含む抗凝固物質は、好適な宿主系において発現されてもよく、好ましくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母中で発現されてもよい。

以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明におけるいかなる限定も意味しない。

ＥＰＲ−ＨＶ２（ＥＨ）およびＧＶＹＡＲ−ＨＶ２（ＧＨ）の調製、血栓症の予防および／または治療におけるそれらの機能

Ｉ．ＥＨおよびＧＨタンパク質の調製
ＰＣＲを通じて、制限領域ＸｈｏＩならびに凝固因子ＸＩａおよびＸａによって共に認識可能なＥＰＲ配列をコードする塩基配列、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能なＧＶＹＡＲ配列をコードする塩基配列を、ヒルジン（ＨＶ２）遺伝子の上流に導入し、そして制限部位ＥｃｏＲＩを、当該遺伝子の下流に導入した。この遺伝子を、同一の酵素によって消化されるｐＰＩＣ９プラスミド中に組み込み、その結果、組み換えプラスミドｐＰＩＣ９−ＥＨおよびｐＰＩＣ９−ＧＨを得た。ｐＰＩＣ−ＥＨおよびｐＰＩＣ９−ＧＨを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そして同一の酵素によって消化されるプラスミドｐＰＩＣ９Ｋと結合し、その後ｐＰＩＣ９Ｋ−ＥＨおよびｐＰＩＣ−ＧＨを得た。当該２つの組み換えプラスミドを、電気的形質転換法によって酵母ゲノム中へ導入し、そしてメタノールによる発現の誘導に供した。当該発現された産物を単離し、そして関心のある、ＥＨおよびＧＨのタンパク質を得た。

II．ＥＨおよびＧＨの生物学的活性
１、インビトロにおける活性の分析
ＥＨ、ＧＨ、ＦＨおよびＴＨを、それぞれトロンビン、ＦＸａおよびＦＸＩａによってそれぞれ切断し、その後、抗凝固活性をフィブリン−クロット法によってアッセイした。当該結果を表１に記載した。

ＧＨは、ＦＸＩａおよびＦＸａの二つの血液凝固因子のそれぞれによって認識され、および切断され得ることを、一方、ＦＨはＦＸａのみに、そしてＴＨはトロンビンによってのみに認識され、および切断され得ることを表１に示した。

２、抗凝固の分析ならびにＧＨおよびＥＨの出血性副作用
（１）ラット頸動脈血栓症モデルにおける、ＧＨ、ＥＨ、ＦＨおよびＴＨの抗凝固性および出血性副作用の分析ならびにその結果を表２および表３に示した。

（２）尾部切断されたマウスの出血性モデルにおける、ＧＨ、ＥＨ、ＴＨ、およびＦＨの出血性の副作用を分析し、そしてその結果を表４に示した。

血栓形成のために必要とされる時間は、ラット頸動脈血栓モデルにおいてＥＨ、ＧＨ、ＦＨ、およびＴＨによって用量依存的に延長されることが表２において観察され、そしてそれは、ヒルジンの４つの誘導体の各々が、それぞれ実質的に同一の有効性で、動脈血栓症に対して機能する能力を有することを示した。しかし、出血性の副作用は、それぞれまったく異なった。表３および４から、出血性のインデックスにおけるＧＨ、ＥＨ、ＦＨおよびＴＨの影響は、ＨＶ２のものよりも低く、そしてそれはＨＶ２のもの以上にそれらのより高い安全性を示している。しかし、ＧＨおよびＥＨは、ＦＨおよびＴＨのそれ以上に出血インデックスにおいてずっとより低い効果を有し、そして特に、ＧＨはＦＨおよびＴＨ群のそれ以上に、著しく短い出血時間を有し、そしてそのことは、ＧＨおよびＥＨが出血性の副作用を減らす場合において、ＦＨまたはＴＨ以上に著しく優れていることを示している。

Claims (7)

1. 二つの血液凝固因子によって、共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチドを含む、抗凝固性タンパク質であって、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する抗凝固性タンパク質ＥＨ又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗凝固性タンパク質ＧＨを含む、抗凝固性タンパク質。
2. 配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する抗凝固性タンパク質ＥＨである、請求項１記載の抗凝固性タンパク質。
3. 配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗凝固性タンパク質ＧＨである、請求項１記載の抗凝固性タンパク質。
4. 凝固因子ＸＩａおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチドを含む抗凝固性タンパク質、またはトロンビンおよび凝固因子Ｘａによって共に認識可能な、かつ切断可能なオリゴペプチドを含む抗凝固性タンパク質の製造方法であって、ＥＰＲまたはＧＶＹＡＲをコードするヌクレオチド配列を、ヒルジンである抗凝固性タンパク質をコードする遺伝子の上流へ導入し、その後、系において好適な発現ベクターによって前記遺伝子を発現させることを含む、前記方法。
5. 前記系が、Ｅ．コリ、酵母、または動物細胞である、請求項４記載の方法。
6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗凝固性タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
7. 医薬における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗凝固性タンパク質。

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