JPH04505554A - 可溶性トロンボモジュリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性トロンボモジュリン類似体 発明の背景 主皿生租朋立互 本発明は、例えば抗血栓治療に有用な可溶性トロンボモジュリン類似体を製造す るための製造方法及び組換えＤＮＡ技術の利用に関する。本明細書に、血栓症活 性を阻害する新規のタンパク質、核酸配列、ベクター、医薬品及び方法を開示す る。

舅ｊ葺１を この１０年において、研究者及び医師は、凝集形成を防ぐ抗血栓化合物及びフィ ブリン溶解治療後の再閉塞の機会を減少せしめることについての研究を強めてき た。複数の疾病症状は効果的な、安全な抗凝血物質による処置を必要とする。

例えば、抗凝血物質は長期間入院した、又は手術後の患者における静脈血栓を防 ぐために肺動脈塞栓症の処置に用いられ、そして血栓治療を伴った、又は伴わな い急性心筋梗塞の処置に用いられる。

現在、抗凝血治療はヘパリン又はワルファリン化合物に鎖るが、いずれも種々の 欠点を有す（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｅｎｏｕｓ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ ｓ　ａｎｄ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｅｍｂｏｌｉｓｍ、　Ｃｏｎ５ｅｎｓｕｓ　 ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ　１９８６ ．６（２）　：　１　＝２３）　、特にヘパリンは血流及び止血に影響する複数 のその他の生理的作用を有す、また、これらの治療は非常に厳密な試験室でのモ ニターを必要とし、なぜならこの患者は非常に危険な出血状態にあるからである 。これらの治療において、抗凝血性を提供しながら、過剰の出血を引き起こさな い適当な投与量を判定することは難しい。ワルファリン治療は有効になるまで数 日間かかり、そして治療を中止してからこの効果が収まる迄更に長い期間を必要 とする。

１０５ｋＤａ細胞膜タンパク質であるトロンボモジュリンは、抗凝血性を有する ことが示されている。人において、トロンボモジュリンは血管の内皮及び中枢神 経系を除く全ての器官に広く分散し、血液の凝集物の形成と溶解との間の均衡の 調節を助ける。特に、トロンボモジュリンは凝血において中心となる酵素トロン ビンの活性をコントロールする。トロンビン活性はフィブリノーゲンのフィブリ ンへの転化、並びに血小板の活性及び凝集の促進を含み、究極的に血液凝集物の 形成をもたらす。しかしながらトロンビンがトロンボモジュリンと結合した場合 、この複合体は凝集形成を促進せず、その代りそれはトロンビンの凝血促進活性 を阻害し、そしてプロティンＣの活性を促進することにより、抗凝血物質として 働く。活性化プロティンＣは凝血カスケードを崩壊する強力な抗凝血酵素である （例えば、Ｎ、Ｅｓｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）、　Ｊ、Ｂｔｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２５７　：　８５９〜８６４　；　Ｈ，Ｓａｌｅｍ　ｅｔ　ａｌ 、（１９８４）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ＤμＬ１％漫：　１２２４６〜５１参照）。

トロンボモジュリンのＤＮＡ配列は単離されそのゲノム型及びｃＤＮＡ分子とし ての両方においてシーケンスされ（Ｒ。

Ｊａｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、　８３　：　８８３４−３８及び（１９８７）、８４　： 　６４２５−２９　、両者は本明細書にて文献として組み入れている）、そして トロンボモジュリンのドメインも分っている（Ｄ、Ｗｅｎ旦虹、　（１９８７） 　、…匹画畦旦■、酋：４３５０〜５７）。複数のドメインについての機能的役 割はその他の既知のタンパク質、例えばＬＤＬリセブターとの比較に基づいて研 究されてきた。ある研究では、第５及び第６表皮成長因子（ＥＣ，Ｆ）一様ドメ イン（ＥＧＦ様ドメインにおける）はトロンビン活性合する能力を有すると述べ られている（Ｓ、　Ｋｕｒｏｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋　２６３　：　５９９３−５９９６）。他の研究では、ＥＧ Ｆ様ドメイン４，５及び６はプロティンＣ活性化活性を提供するのに十分である と考えられている（Ｚｕｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４　：　１０３５１．）残念ながら、天然のトロンボモジ ュリンは一般に抗血栓治療には通していない。商業的用途のために必要な量は剖 検又は生検サンプルからの精製を不可能とし、なぜなら−人当りの全内皮細胞に 存在するトロンボモジュリンはわずか約３００ｒ＠ｇと見込まれるからである。

天然トロンボモジュリンはその固有アミノ酸配列に起因し、膜結合性である。清 浄剤処理なしではそれは不溶性であり、一般にこのことは、全身治療、例えば抗 凝血のために不適当なものとする。しかしながら遺伝子工学的細胞を含む任意の 材料から生成又は単離することは困難であろう。プロティンＣのための単離され た、清浄化された溶解トロンボモジュリンのＫｍは、膜結合タンパク質のわずか ら５％であり、しかしながらこの単離したタンパク質をリン脂質小胞に組入れた 場合その親和性は強まる（Ｇａｌｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、　Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｒｍ、、　２５７（５）　：　２１９９−２２０５）。天然ヒト トロンボモジュリン調製物はヒトトロピンの抗凝血促進活性の遮断において有効 ではないと報告されている（Ｍａｒｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、　 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、。

７５　：　９８７−９９１）。

可溶性トロンボモジュリン様物質がヒト血漿及び尿において報告されている。こ れらの物質は、非常に低いプロティンＣを活性化する、そして細胞型のトロンボ モジュリンの分解生成物を活性化する能力を有する。このような型のトロンボモ ジュリンはその特性を明らかにすることが困難なほどの低い量において存在する （約０．８ｍｇ／成人男性）。最近では、２グループが流動性トロンボモジュリ ンのレベルは１０から２０の因子によって強（刺激されること明らかにした（Ｓ ｕｚｕｋｉｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）、　Ｊ、ＢｉｏＣｈｅｍ、、　１０４ 　：　６２Ｂ−６３２及びその中の参考文献）。天然トロンボモジュリンのエラ スターゼ分解フラグメントが詳述され、そして一部シーケンスされている（ｌｓ ｈｉｉ、（１９８５）、前述のＫｕｒｏｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、＋　（１９８７ ）、　Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、。

２６２　：　２２０６−２２１２　；　Ｋｕｒｏｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、、　（１９８８）。

２６３　：　５５９３−５９９６　；及び５ｔｅａｒｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋　１９８９＋２６４　：　３３５２−３３５６参照） 。エラスターゼフラグメント及びいくつかの小さいフラグメントはインビトロで プロティンＣの活性を高める能力を保持した。

ＥＰ２９０，４１９及び−０８８１０５０５３を含む更なる文献はトロンボモジ ュリンタンパク質の遺伝子配列のｃＤＮＡを開示する。

トロンボモジュリンの類似体はＮｏ／８８０５０５３に記載され、それはＥＧＦ ドメインの異なるナンバーの類似体を開示する。

トロンボモジュリンの抗凝血性を示す新規の組成物であって、血漿に溶け、そし て容易に大量に生産できるものについての必要性が存在する。本発明はこのよう な、そしてその他の必要性を満たす。

発明の内容 本発明は、以下のもの； ａ　）　ｈｉｓ、　ｔｒｐ、ａｌａ、ａｒｇ、ｇｌｕ、ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ 、ａｌａ、ｔｒｐ、ａｓｐ、−Ｙ−ａｓｐ、ｓｅｒ、ｇｌｙ、ｌｙｓ、ｖａｌ、 ａｓｐ　；ｂ　）　ｈｉｓ、　ｔｒｐ、ａｌａ、ａｒｇ、　ｇＩｕ、ａｌａ、　 ｐｒｏ４１ｙ、ａｌａ、　ｔｒｐ、　ａｓｐ、−Ｙ−ａｓｐ、ｓｅｒ　； ｃ　）　ｇｌｙ、ａｌａ、ａｒｇ、ｓｅｒ、−Ｑ　；及びｄ　）　ａｌａ、ｖａ ｌ、ｖａｌ、ｐｒｏ、ａｒｇ、ｓｅｔ、−Ｑ　；（ここでＹは表２のアミノ酸２ ２７からアミノ酸４６２の範囲において提供されるアミノ酸配列から選ばれるも の、そしてＱは表２のアミノ酸２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０から アミノ酸４６２又はアミノ酸２２７からアミノ酸４９７において提供されるアミ ノ酸配列から選ばれるもの）より成るグループから選ばれるペプチドをコード化 する核酸配列を提供する。Ｙ及びＱが表わす配列は天然ＴＭの表皮成ドメインを 示す。

また、前記ペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列であって、以下のもの ： ａ　）　ＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡ Ｃ−Ｘ−ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣ。

ｂ　）　ＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡ Ｃ−Ｘ−ＧＡＣＴＣＣ。

ｃ　）　ＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣ−Ｚ　；及びは番号８７９から１５８６．１ ２５１から１５８６又は８７９から１６９０を表わし、この全ての番号は表２に おいて記載した塩基の番号に関する）より成るグループから選ばれた配列及びこ のようなヌクレオチド配列を含んで成るベクターを提供する。

更に、前述のペプチドから選ばれる実質的に純粋なタンパク質組成物が提供され る。このような組成物は、その中のペプチドが非還元クロマトグラフィーのもと て前述のペプチドの予想される分子量をほぼ示すペプチドの分子の組成物であり うる。「予想される分子量をほぼ示す」とは、ペプチドのその構造に基づく予想 される分子量の約１０％以内において、このペプチドがクロマトグラフィーゲル 上にてバンドとして現われることを意味する（存在しうる全てのグリコジル化は 除外する）。それらは乾燥状及び無塩状、凍結乾燥粉末、及び／又は実質的に清 浄剤を有さない状態となりうる。他の態様において、この組成物はフィブリン溶 解酵素と化学結合した前述のペプチドを含んで成り、好ましくは化学結合は酵素 とペプチドのアミノ酸残基との間の共有結合である。

このような複合体におけるフィブリン溶解酵素は、好ましくはプラスミノーゲン 分子又はｔ−ＰＡと結合するストレプトキナーゼ分子である。

トロンボモジュリン様タンパク質の単位投与量の無菌調製物を含んで成る抗血栓 活性を有する医薬品組成物であって前述のアミノ酸配列を有するもの、及び哺乳 動物における血栓活性をこのような組成物の効果的な量の投与によってコントロ ールする方法を開示する。

更に、前述のペプチドのグループから選ばれるペプチドの結合する表層を有する 生体適合性ポリマーを含む組成物及び生存する哺乳動物にポリマーを植え込むこ とにより血液の凝集を防ぐ方法を開示し、ここでトロンボモジュリン様タンパク 質はこのポリマーに結合し、そしてこのポリマーは哺乳動物の中に植え込まれる 。

本発明は更に、多価可溶性ヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）類似体についてコー ド化するＤＮＡ配列を含む単離したＤＮＡフラグメントを開示し、この類似体は 天然ＴＭの３５０〜４６２、又は３９０〜４６２、又は２２７〜４６２のアミノ 酸残基及び標的成分を実質的に含む。この標的成分は、フィブリンと結合でき、 そしてまた好ましくは、例えば表９に記載のヒト組織プラスミノーゲン活性体の アミノ酸残基４〜５３０のフィブリン溶解活性を二価のＴＭ類似体に授けること ができる。このようなりＮＡ配列は好ましくは表現調節配列と結合でき、そして 細胞の中へ形質転換される。この類似体は好ましくは、停止翻訳ドメインを有さ ないトロンボモジュリンフラグメントを含む第１アミノ酸配列；及び標的成分を 含んで成る第２アミノ酸配列、を含んで成る融合タンパク質についてコードする ＤＮＡ配列と結合可能であり、ここでこの二価ＴＭ１１似体は宿主細胞から分泌 される。これらの類似体において好ましく用いられるＴＭ配列は以下の通りであ る：デルタ１−３８９、デルタ４６３−５５７ＴＭ、デルタ１−２２６、デルタ ４９８−５５７ＴＭ、デルタ１−２２６、デルタ４６３−５５７ＴＭ；及びデル タ１−３４９、デルタ４６３−５５７゜欠落したデルタ領域及びトロンボモジュ リンのアミノ酸番号は表２に記載している。二〇二価類似体は前述のｔ−ＦＡと の融合の結果、フィブリン溶解活性を有する。

本発明は更に、患者の凝血を抑制する方法について提供し、この方法は、更なる 凝血を抑制するのに有効な量の可溶性ＴＭ類似体を患者に投与することを含んで 成り、ここでこの類似体は前述のＴＭアミノ酸を含んで成る。本発明はまた、血 栓により引き起こされる急性心筋梗塞に苦しむ患者の処置について提供し、この 方法は更なる凝血及び血栓の溶解のために有効量の二価可溶性ＴＭ［個体を患者 に投与することであり、ここで二〇二価ＴＭ［個体は前述のＴＭアミノ酸を含ん で成り、ここでこのＴＭアミノ酸配列はヒトｔ−ＰＡのアミノ酸４−５３０に、 Ｃ末端又はＮ末端で融合される。

本発明はまた、天然トロンボモジュリンと実質的に同等のトロンビンに対する親 和力を有した、トロンビンを結合させることが可能な二価ＴＭＭ似体を提供し、 この類似体は機能的停止翻訳ドメインを有さない天然トロンボモジュリンを含ん で成り、ここでこの二価類似体は更に、フィブリンと結合且つプラスミノーゲン をプラスミンへと分解する能力により特徴づけられる。特に、実質的に表９に記 載のアミノ酸配列より成る類似体を提供する。また、ＴＭＩＩ似体であって、ト ロンボモジュリンの６ＥＧＦ一様ドメインのアミノ末端と共有結合するｔ−ＰＡ のシグナル配列を含み、そしてこのトロンボモジュリンの６ＥＣ；Ｆ一様ドメイ ンがｔ−ＰＡのアミノ末端に共有結合する類似体が提供される。

本発明は更に可溶性トロンボモジュリン類似体及びこのような類似体の製造方法 に関する。特に、可溶性トロンボモジュリン類似体の製造方法は以下の段階：こ の類似体をコード化するＤＮＡ配列の形質転換された宿主細胞を培養し；この宿 主細胞から生産された類似体を集めること、を含んで成り、ここでこの類似体は 宿主細胞において機能的な停止翻訳配列を含まない。この宿主細胞は好ましくは 、例えば酵母又は哺乳動物細胞のような真核細胞である。

好ましくはこの可溶性類似体は、可溶性ヒトトロンボモジュリン類似体について コード化するＤＮＡ配列を含む単離されたＤＮＡフラグメント由来の類似体であ り、このＤＮＡフラグメントにより形質転換された宿主細胞から分泌されるもの であり、ここでこのＤＮＡ配列は表２記載の天然ＴＭのアミノ酸残基２２７−４ ６２を含んで成るポリペプチドをコード化したものである。好ましいこの類似体 は前述した二価融合類似体及びその類似体である。このような類似体を生産する 組換細胞、タンパク質類似体、医薬調製品及びこの類似体の使用方法も本明細書 で開示する。この類似体は好ましくは天然トロンボモジュリンと同等又は増強さ れたトロンビンへの親和力を実質的に保持する。可溶性は、全体又は一部におい て停止翻訳ドメインを削除することで好適に成し遂げられた。

図面の簡単な説明 図１はトロンボモジュリンの抗凝血分子としての機能の図解を示す。

図２Ａ及び図２Ｂは本明細書で開示する類似体の図例である。

図３は実施例１に用いた２種類の合成オリゴヌクレオチド及びプラスミドｐＵｃ １９ｐｃｒＴＭ７である。

図４は実施例２記載の真核細胞表現プラスミドｐＴＭ１０８を示す。

図５は実施例３に記載の、ｐＴＨＲ５からｐＴＨＲ１３の過渡哺乳動物表現の構 造を示す。

図６は実施例４に記載のバクロウィルス感染ベクターｐＴＭＨＹＩＯＩの構造を 示す。

図７は実施例９記載の、抗血栓及びフィブリン溶解の活性の両方を有する融合タ ンパク質の製造に用いるベクターを示す。

図８はＴＭ類億個体共有結合したフィブリン溶解酵素（例えば溶解プラスミシー ケンストレプトキナーゼ複合体又はｔ−ＰＡ）を含んで成る多機能分子の図解を 示す。

図９は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた、多彩な型のＴＭｉ似体６ｈ− ２２７／４６２の分離にわたり得られた溶出図及び活性図を示す。

図１ＯＡは天然のウサギトロンボモジュリンとＴＭＭ似体６ｈ／２２７−４６２ のプロティンＣ活性化活性の比較図を示す。図１０ＢはプロティンＣ活性化アッ セイにおける、ＴＭＭ似体６ｈ／２２７−４６２についての投与量応答曲線を示 す。

図１１ＡはＡＰＴＴにおけるＴＭ６　ｈ／２２７−４６２の活性を示す。図１１ Ｂは、部分的トロンボプラスチン時間アンセイにおける、抗トロンビン■及びヘ パリンと比較したＴＭＭ似体６ｈ／２２７−４６２活性を示す。

図１２は三種類のアッセイ、ＡＰＴＴ、ＴＣＴ及びＰＴにより測定した、ＴＭＭ 似体６ｈ／２２７−４６２による凝血時間の延長を示す図である。

図１３はＴＭ類僚体６ｈ／２２７−４６２によるフィブリノーゲンからフィブリ ンへの転化がもたらす直接的なトロンビンの阻害を示す。

詳細な説明 本発明に関して、実質的に全ての天然のトロンボモジュリンの性質を有す新規の 組成物が提供され、ただしこれらは可溶性の型において作られ、そして生産細胞 から分泌される。

また、このような組成物の製造方法も提供される。これらの可溶性トロンボモジ ュリン類似体は経済的に生産でき、そして容易に精製且つ投与される。種々の治 療的使用、特に抗凝血及び／又は抗血栓治療への使用が期待できる。本発明が完 全に理解されるため、以下の詳細な説明を記載する。

本明細書に用いる「トロンボモジュリン」又はｒＴＭ、は、哺乳動物トロンボモ ジュリンの生物活性を有す、一般に内皮細胞表面に見い出され、そしてトロンビ ンのレセプターとして働くことができるタンパク質に関する（Ｎ、Ｅｓ請ｏｎ、 　（１９８７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅ ｍｏｔａｓｉｓ＋　１３（４）　：　４５４−４６３及び欧州特許出願に８６９ ０４３５４．７　：両方とも本明細書に参考文献として組入れている）。天然ヒ トトロンボモジュワンタンパク質を全体的にコード化するＤＮＡ配列はすでに単 離されている（欧州特許出［ｋ８８８７００７９．６　；本明細書に参考文献と して組入れている）。ｃＤＮＡ配列は５７５個のアミノ酸のタンパク質６０．３ ｋＤａをコード化し、その中に約１８個のアミノ酸のシグナル配列が含まれる。

この説明におけるトロンボモジュリンは個体間の間に存在しうる天然のアレリ・ ツク変異を含む。ウサギ、ウシ、マウス及びヒトのトロンボモジュリンについて の配列は、互いに度合いの高い同等性を示した。

その他のタンパク質に類似することで、トロンボモジュリンの構造はドメインと 分割できることが予想される。「ドメイン」なる語は特定の機能又は性質に関す る個々の部分から成るアミノ酸配列に関する。トロンボモジュリンの遺伝子全体 は、以下のドメイン： アミノ　のおよその亡Ｗ　ドメイン １−２２６　Ｎ末端ドメイン ２２７−４６２　６　Ｅ　Ｇ　Ｆ様ドメイン４６３−４９７　０−結合グリコシ ル化４９８−５２１　停止翻訳配列 ５２２−５５７　細胞質ドメイン を含む前駆体ペプチドをコード化する。

Ｃ，Ｓ、Ｙｏｓｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｃａ旦、　３４　：　７５９− ７６６及びり、Ｗｅｎ　ｅｔ虹、　（１９８７）Ｌ匹匝紅旦ｎ、酋：　４３５０ −４３５７参照；両方とも本明細書に参考文献として組入れている。

天然ＴＭと比較して、本発明のＴＭ１１似体は個体されて、選ばれた天然タンパ ク質の特定領域であって、即ち（ｉ）　ＥＧＦ様ドノドメイン４及び６、（ｉｉ ）６個のＥＦＧ様ドノドメインちの全てのＥＧＦ様ドノドメインは（ｉｉ）６つ のＥＧＦ様ドノドメイン−結合グリコシルドメイン、の領域を包含するようにな る。表１並びに図２Ａ及び図２Ｂは、本発明が描く特定の類似体を示す。

２種類のペプチド１１／６及び１１／２はエラスターゼ分解ＴＭと類似したペプ チドに関する。エラスターゼはエンドペプチダーゼであって少量の中性アミノ酸 にて分解せしめる酵素である。この１１／６はＥＧＦ様ドノドメイン２２フ６２ 領域の外にある、アミノ末端部及びカルボキシ末端部のそれぞれに存在するアミ ノ酸残基の数に関する。このペプチドはこの領域の外にあるウサギＴＭエラスタ ーゼフラグメントと、残基の数において類似する。第二のＴＭ類似体は１１／２ ペプチドである。この１１はアミノ末端側の２２７番目の残基を超えて位置する 残基の数に関し、そして２は４６２番目の残基を超えて位置する２つのアミノ酸 に関する。この１１／２類似体はヒトＴＭのエラスターゼフラグメントであると 考えられている。

その他の種類は天然トロンボモジュリンタンパク質の種々の領域を含む。翻訳工 程のため、これらの種類はシグナル配列由来の更なるアミノ酸配列を有する。例 えば、種類４ｔ／２２７−４６２，４ｔ／２２７−４６２：２２７−４６２゜４ ｔ／３５０−４６２、及び４ｔ／２２７−４９７の全ては４つのｔ−ＰＡシグナ ル配列由来の更なるアミノ酸を有す。

ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２，６ｈ／２２７　：　４６２　：２２７−４６ ２，６ｈ／３５０−４６２、及び６　ｈ／２２７−４９７の全てはハイポダーミ ンＡ　（ｈｙｐｏｄｅｒｏ＋ｉｎ　Ａ）シグナル配列からの６つの更なるアミノ 酸を有す。これらのＴＭｉ似体個体又は複数のＥＧＦＷ域及び／又は〇−結合グ リコシルドメインを含んで成る。このような種類に包含される特定領域を以下の 表に列挙する。表１並びに図２Ａ及び図２Ｂに更なるｍ類を示す。

Ｘ／２２７−４６２　ＥＧＦｓ　１−６に／２２７−４６２：２２７−４６２　 ＥＧＦｓ　Ｉ−６十ＥＧＦｓ　１−６Ｘ／　３５０−４６２　ＥＧＦｓ　４　、 　５、＆６Ｘ／２２７−４９７　ＥＧＦｓ　１−６±〇−結合Ｇｕｙ。

Ｘはシグナル配列由来のアミノ酸の数である。

本発明の他の見地は、多機能タンパク質、即ち、ＴＭ［個体の生物学的活性を引 き起こすことのないタンパク質に相当する配列と結合するＴＭＷ似体個体ンパク 質であって、通常天然トロンボモジュリンと一体化していないものを記載する。

これらの多機能のタンパク質はＴＭ異型体と称し、そしてそれらは、例えば天然 トロンボモジュリンと一体化しているトロンビン結合の第１機能、及び異種の第 ２機能、即ち天然トロンボモジュリン以外のもの由来の機能より成る。第２機能 はＴＭ異型体の局在化を及ぼすことがあり、これにより生体内、例えば細胞表層 又はフィブリン凝集体で現われる特異的組織構造に対する親和力が変化する。こ の異種ペプチド配列は更なる生物学活性、例えばタンパク譬加水分解活性を提供 しうる。好ましい酵素加水分解活性は、プラスミノーゲンのプラスミンへの酵素 的分解である。本発明の標的成分は、フィブリンを標的とするためデザインされ る。この標的成分もフィブリン溶解活性を有すことが好ましい。本明細書で開示 するこの多機能ＴＭ異型体は融合タンパク質であることができ、ここでこれらは オリジナルＴＭ配列のＮ−及び／又はＣ末端部分による異種タンパク質ドメイン を供給する。更に、多機能ＴＭ異型体はスペーサー物質を介して異種タンパク質 と化学結合されうる。Ｒｕｇｅｒ　ｅｔ　ａｉｒ　（１９８７）、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８４　：　７６５９−７６６２及びＳｍ １ｔｈ　ａｎｄ　Ｃａ５ｓｅｌｓ　（１９８８）＋Ｆｉｂｒｉｎｏｌ　ｓｆｓ　 ２　：１８９−１９５は、ｔ−ＰＡとその他の分子との間の化学結合を記載する 。これらの分子は、異なる細胞表層に対する親和力、又は強められたフィブリン に対する親和力を有す。

好ましい異種タンパク質ドメインは、組織プラスミノーゲン活性体又はプロウロ キナーゼから単離したヌクレオチド配列によりコード化されうる。適切なｔ−Ｐ Ａ配列は、以下のクリングル２、プロテアーゼ　１８０−５３０プロテアーゼ　 ２７９−５３０ ＡＭ４−２７８ をタンパク質全体に更に含む。Ｌ、Ｐａｔｔｈｙ、　（１９８５）　Ｃｅ１ｌ、 　４１　：６５７−６６３のｔ−ＰＡドメインの詳細を参照のこと。ヒトウロキ ナーゼから単離された異種ドメインについては、アミノ酸１−４１１が好ましい であろうＣＪａｃｏｂｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　ＤＮＡ。

４　：　１３９−１４６）、ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲン及びプラスミン誘導 体も異種ドメインとして有用であることが見い出され、これらは高いフィブリン 溶解活性を提供する。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸１−７９１はこのよ うな有用性を有す（Ｆ、Ｊ、Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　８０：３６５−３７８Ａｃａｄｅｏ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（ １９８１））。本発明の異種ドメインの特に好ましい態様は、ヒト組織プラスミ ノーゲン活性体（ｔ−ＰＡ）のアミノ酸４−５３０を含む。

本発明の一態様において、記載するＴＭ１１似体は個体らが生産される真核細胞 から分泌される。本明細書で用いる「可溶性ＴＭ［個体」はＴＭ類似体であって 水溶液に溶け、そして細胞から分泌されるものである。医薬的投与のため、この 可溶性ＴＭｉ似体個体任意的にリン脂質小胞体、清浄剤又はその他の医薬製剤に おける当業者によく知られる類似の化合物と一緒にされる。本発明のＴＭ類似体 は血流中に溶け、種々の抗凝血物質及びその他の治療薬においてこの類似体を有 用とする。

一般に、本発明のＴＭｉ似体個体血の状況を検査する１又は複数の機能的アッセ イにおいて活性を有する。これらは、トロンビンの共同因子として作用すること によるプロティンＣの活性化、トロンビンによるフィブリノーゲンからフィブリ ンへの転化の阻害（これにより、実質的に凝血活性を阻害する）又は血小板活性 及び凝集をもたらすトロンビンの阻害を含むことができる。後者の２つのアッセ イは、自動凝血タイマーにより、その製造者の説明書に従って行うことができる ：　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　Ｉｎｃ、 ＋　Ａ＋５ｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＭｃＧ ａｗ　Ｐａｒｋ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ配布（Ｈ，Ｈ，５ａｌｅａ＋　ｅｔａｌ、 （１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、、　２５９　：　１２２４６−１ ２２５１も参照のこと；これは本明細書に文献として組入れている）。多機能タ ンパク質は通常ＴＭと関連しない活性を測定するアッセイにおいても活性を有す るであろう。例えば、ＴＭｉ似体個体と例えばｔ、ＰＡの結合した融合タンパク 質のフィブリン溶解活性は、任意の複数のアッセイ、例えば、Ｈａｖｅｒｋａｔ ｅｔ　ａｎｄ　Ｂｒａｋｍａｎ、　（１９７５）　Ｐｒｏ　、ｉｎ　Ｃｈｅｍ、 Ｆｉｂｒｉｎ、Ｔｈｒｏａ＋ｂ、　１　：　１５１−１５９に記載のフィブリン プレートアッセイにより測定される。

これらのタンパク質をコード化する核酸配列は形質転換細胞に用いることができ る。これらの配列、最も一般にはＤＮＡは、一体化したシグナル配列を含んだり 含まなかったりすることができる。得られる形質転換された又は感染された細胞 は培養されて容易にこれらのタンパク質を大量に生産できる。

この記載の核酸配列は組織培養に適用される多くの宿主細胞において有用である 。一般に、この細胞は真核細胞、好ましくはヒト細胞であって、標準の培地調製 物中で迅速に生育できるものである。原核細胞又は酵母細胞も本発明の利用に適 することがある。

本発明は種々の既知の方法において成し遂げることができる分子遺伝学操作を含 む。本発明の組換細胞、プラスミド、及びＤＮＡ配列は医薬として有用な化合物 を製造する手段を提供し、ここでこの化合物は組換細胞から分泌され、そしてこ れは可溶性なトロンボモジュリン誘導体である。

以下の詳細な説明はトロンボモジュリンのコード化したＤＮＡ配列からの可溶性 トロンボモジュリン１（ｆｆ１体を製造するための択一的な方法を開示し、そし て好ましい方法の特定な実施例を示す。

゛　としてのトロンボモジュリンの１ 血栓障害の基礎となる病状は、刺激、例えば損傷を受けた血管壁の応答における 凝血物形成である。この刺激は、凝血カスケードを引き起こすトロンビンであっ てフィブリノーゲンをフィブリン、即ち、凝血物のマトリックスへと転化する能 力を有するものを誘発する。

組織学的に投与された可溶性トロンボモジュリン類似体は、血栓症の形成を防ぎ 、なぜならそれらは活性化プロティンＣシステムを介してトロンビンの発生を妨 げ、そして／又はその他の凝血パラメーターを妨害することなくフィブリノーゲ ンへのトロンビンの作用を阻害するからである。それ故、可溶性トロンボモジュ リンの利用は、不必要な血栓の形成を防ぐ上で安全且つ有効であろう。トロンボ モジュリンの効力は、止血栓を形成せしめる大きな血管の損傷により発生する大 量のトロンビンに打ち勝つことができる。

血栓が重大な原因となる疾病の中には、心筋梗塞、散在性腺管内凝血、静脈血栓 、肺動脈梗塞、敗血症ショック、急性呼吸困難症、不安定性アンギナ並びにその 他の動脈及び静脈の閉塞症が含まれる。血栓が病理的であるこれら全て及びその 他の疾病において、単独又は血栓溶解剤と組合せた可溶性トロンボモジュリン類 似体は、疾病の治療又はその更なる重大な症状への進行を防ぐためのいずれかの 処置に有用である。

また、可溶性トロンボモジュリン類似体は、例えば心臓バルブのような生体人工 器官を受け入れる患者、又は体外血清循環を必要とする患者において、安全且つ 有効な抗凝血物質を提供する。これらの化合物は例えば肺動脈梗塞又は急性心筋 梗塞の処置におけるヘパリン及びワルファリンに置き代わることができる。

特にこれらの化合物は静脈血栓症（ＤＶＴ）　、例えば術後の予防における機能 性が見い出せるであろう。足における凝血物の形成はそれ自身致命症ではないが 、しかしそれは肺動脈血栓（ＰＥ）への進行に非常に密接につながる。ＰＥは診 断するのに困難であり、そして致命症となりうる。研究及び複数の予防法の臨床 的利用にもかかわらず、ＤＶＴ及びもたらされるＰＥは多数の患者数において、 そして特に整形外科手術を受けた患者において重大な問題として残る（Ｐｒｅｖ ｅｎ　ｔｉｏｎｏｆ　Ｖｅｎｏｕｓ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｕ１Ｉ ＩＩｏｎａｒｙ　Ｅｍｂｏｌｉｓｍ、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ　１９８６＋　６（２）　：　 １−２３．）。

存在する予防治療薬、例えばヘパリン、ワルファリン、及びデキストランは一般 にこの処置を受けた患者のうち、全く予防を受けていない整形外科手術患者にお けるＤＶＴ発生率５０％を２５−３０％迄低下させる。これらの化合物には、主 に出血という副作用がある。日常の実験室試験及び投与量の調整が、ある程度効 力を保持しながら出血症状を最小とするのに必要である。

その他のトロンビンの阻害剤、例えば抗トロンビン■がＤＶＴの予防に有用であ ると考えられている。しかしながら、商業的に入手できるヒトＡＴＩ［［はヒト 血漿から精製され、そして潜在的に重大な汚染の可能性、例えば感染性ウィルス を有する。更に、ＡＴＩ［Ｉは直接トロンビンを阻害しながらも、プロティンＣ の活性を高めることはない。プロティンＣの活性化の作用は、明らかに抗凝血治 療を向上させる。現状の予防法の不足に基づき、患者に出血又はその他の併発症 を起こさせないでＤＶＴを予防するのに有効な抗血栓剤は、患者の回復及び健康 において大きな衝撃となることができる。

血管形成術は閉塞動脈における患者の回復のためによく利用される方法である。

患者は回復しうるが、この方法はしばしば動脈を覆う内皮質を損傷し、そしてそ の結果血液凝集物が形成し始める。この血管形成術と一緒に可溶性トロンボモジ ュリンを投与することは、この有害な副作用を防げる。

多数の急性血栓症及び肺動脈疾病は現在、血栓を除去するため、フィブリン溶解 性治療により処置される。最も広きにわたり研究されている症状は暑、性心筋梗 塞（心臓発作）である。急性心筋梗塞の処置のために現在用いられる薬剤は、ス トレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性体及びウロキナーゼを含む。これ らの薬剤の使用は深刻な出血症状を導くことがある。フィブリン溶解治療により 血栓の除かれた、そして血流の回復した患者は、度々患部の血管が再閉塞、即ち 凝集物の形成が起こる。血栓溶解剤による治療の抗与量又は投与時間の増大によ る再閉塞の予防の試みがなされているが、しかし出血の発生率は未だ増加してい る。それ故、これらの薬剤の治療上の指標は小さい。

可溶性トロンボモジュリン類似体の利用は、再閉塞に対する予防を提供し、そし てその特異的な作用は全身的よりもむしろ局在的、即ち、トロンビンが発生する 又は凝血物から遊離する場所に作用する。それ故、血栓溶解剤と組合せて用いた 場合、血栓溶解剤の量を減らすことができ、出血の危険性も実質的に低まる。

抗血栓活性との組合せにおけるフィブリン溶解活性を引き起こす更なるドメイン を含むＴＭＩＩＷ似体は、個体の有用な化合物に比べ、更に優れた有用性を提供 するであろう。これらの多機能タンパク質は、可溶性ＴＭ類似体をフィブリン凝 集物の部分へと導く。異種ドメインによる化合物が授けるこのフィブリン溶解活 性は、優れた血栓溶解剤を提供する。例えばｔ−ＰＡドメインのフィブリン溶解 活性により凝集物が溶解すると同様に、ＴＭドメインはトロンビンを結合せしめ るのに必要な場所に正確に、独自に局在下し、そして更なる凝集マトリックスの 成長を阻害する。このトロンビンは凝血血管から新たに発生したもの、又は溶解 している凝集物から遊離されたもののいずれかでありうる。この多機能タンパク 質い全身性作用への影響、及び全ての重大なる望ましくない副作用を少なくする 。

可溶性トロンボモジュリン類似体の投与は、一度に投与する静脈内注射、連続的 な静脈内注入、又は両方のルートの組合せによるであろう。又、適当な賦型剤と 混合した可溶性トロンボモジュリンは、筋肉内から循環系に入ってい（ことがあ る。本明細書の治療有効投与量は、病理的凝血の形成を防ぐのに必要なＴＭ、１ ［個体のレベルと定義する。

トロンボモジュリン類似体による全身系の処置は、患者から採取された経時的な 血清サンプルにおける活性化部分トロンホフラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定す ることでモニターできる。この方法で観察される凝血時間は、十分量のＴＭ類似 体が循環系に到達されたときに延長する。しかしながら、これは効力の全身系測 定であり、そしておそらく凝集物部位に有効な投与量はＡＰＴＴの延長に有効で はないであろう。

投与レベル及び摂取量は、例えばＡＰＴＴアッセイ又はプロティンＣ活性化アッ セイによる測定により、トロンボモジュリンの十分な濃度を維持せしめるために 調整されうる。

全長トロンボモジュリンと比較して、本発明の類似体は改善された医薬品を提供 するであろう。これらの類似体は製造する見地、医薬品としての見地の両方にお いて優れた特性を提供するであろう。

二瓜煎方抜 −ａに、本出願において用いる命名法の定義及び一般の実験室方法の詳細は、Ｔ 、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、に見い出すことができる。このマニュアルは 本明細書にて参照文献として組入れ、本明細書ではマニアティス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）と称する。

全ての酵素はメーカーの指示に従って用いた。

バタテリオファージラムダベクターにおけるライブラリーが構成されている。フ ァージはマニアティス記載の通りインビトロで集めた。組換ファージはＢｅｎｔ ｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ＋則：１８０〜１８２ 記載の通り、プラークハイブリダイゼーションにより同定した。コロニーハイブ リダイゼーションはＭ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ＋　（１９７５）　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、。

７２　：　３９６１−３９６５記載の一般的な方法により行った。ヌクレオチド のサイズはキロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）のいずれかで示した。これら は、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動又は開示したＤＮＡ配列に より換算した。

商業的に入手できないオリゴヌクレオチドは、Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｃａｇｅａｎｄ　 Ｍ、■、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ ｔｔｓ、、　２２（２０）　：１８５９−１８６２に最初に記載された固相ホス ホラミジットトリエステル法に従い、Ｄ、Ｒ，Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａ ｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、 　１２　：　６１５９−６１６８記載の通りに、自動化合成装置を用いて化学的 に合成した。オリゴヌクレオチドの精製はＪ、Ｄ、Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｆ 、Ｅ、Ｒｅｇｎｉｅｒ、　（１９８３）　Ｊ、Ｃｈｒｏｎ＋、、　２５５１３７ −１４９に記載の、自然アクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換ＨＰＬＣ のいずれかにより行われる。

クローン化遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ　ｅｔ　 ａｌ、（１９８０）　Ｍｅ旦ｒｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、　６５　： 　４９９−５６０の化学分解方法を用いて確認できる。この配列は、前記Ｍａｘ ａｍ　ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔの方法を利用したオリゴヌクレオチドフラグメント の二本鎖ＤＮＡ配列への組入れの後、又はＲ，Ｂ、Ｗａｌｌａｃｅ旦旦。

（１９８１）　Ｇｅｎｅ、　１６　：　２１−２６の二本鎖鋳型の配列決定のた めの鎖成長停止反応方法により確認できる。５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７５）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８　：　５０３に従い、サザンブ ロットハイプリダイゼーション技術を実施した。

本発明は真核細胞又は原核細胞における表現ベクターについての遺伝子のクロー ン化及び利用に関する。中間体ベクターは原核細胞、例えばＥ、ｃｏｌｉ、バチ ルス又はストレプトマイシスにおける用途のためにクローン化される。Ｅ、ｃｏ ｌｉが最も好ましく、なぜらなそれらの生物は培養が容易であり、そしてその他 の原核細胞よりもより完全に理解されているからである。マニアティスマニュア ルはＥ、ｃｏｌｔにおける以陣の記載の全ての取扱いのための十分な方法論を含 む。株ＭＨ−１は、他の良いものがない限り好ましい。Ｅ。

ｃｏｌｔ株の全てはグルコースを有するルリア培地（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ　 ：　ＬＢ）　、又はグルコース及び酸加水分解カゼインアミノ酸の添加されるＭ ９培地にて生育する。マニアナイス記載の薬剤濃度で抗生物質に耐性な株を維持 せしめた。形質転換は、Ｄ、Ａ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、（１９７７）　Ｊ、Ｂａｃ ｔ、、　１３２：３４９−３５１又はＪ、Ｅ、Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ　ａ ｎｄ　Ｒ，Ｃｕｒｔｉｓｓ、　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　 ｍｏｌｏ　＋１０１　：　３４７−３６２．　Ｅｄｓ、Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

記載の方法に従って行った。代表的なベクターにはｐＢＲ３２２及びｐＵＣ系で あって商業的に入手できるものを含む。

足−１ 本発明の目的のため、以下の語を以下に定義する。

「ベクター」なる語は、ウィルス表現系、自律的自己複製環状ＤＮＡ　（プラス ミド）に関し、そして表現及び非表現プラスミドの両者を含む。組換微生物又は 細胞培養物を、「表現ベクター」を宿すものとして記載した場合、これは体外染 色体環状ＤＮＡ及び宿主染色体に組入れられるＤＮＡの両者を含む。ベクターが 宿主細胞によって維持される場合、このベクターはこの細胞により自律的構造と して有糸分裂の間にわたり安定的に複製されるか、又は宿主ゲノムの中に一体化 される。

「プロモーター」なる語は翻訳を開始するためにＲＮＡポリメラーゼと結合する ＤＮＡが包含する領域である。

「連絡可能」なる語は並列の位置に関し、この状態でこれらの成分は配置されて その通常の機能を成すことができる。

それ故、コード化配列と連絡可能なコントロール配列又はプロモーターは、コー ド化配列の表現に作用することができる。

「コントロール配列」なる語は、ＤＮＡ配列又は配列であって目的のコード化配 列と適当に連結した場合にこのような配列の適合した宿主における表現に影響を 及ぼすものに関する。このようなコントロール配列には、少なくとも原核及び真 核宿主の両方におけるプロモーターを含み、そして任意に転写終結シグナルを含 む。表現に影響を及ぼすのに必要又は有用な更なる因子も同定できる。本明細書 に用いる「コントロール配列」は、簡単には、どのようなりＮＡ配列も用いた特 定の宿主において表現をもたらすのに有用なものを意味する。

「天然グリコジルを含まない」なる語は、多糖構造がヒトから生産された天然の ものと異なる分子に関する。

本明細書記載のペプチドの「実質的に純粋な組成物」は、標準電気泳動技術にお ける還元ゲル上にて大きく移動した単一バンドのものである。好ましくは、これ は約１０％未満、そして最も好ましくは３％未満の目的のもの以外のペプチドに よる夾雑物を有する均一組成物を称する。

１猛王金虞 ヒトトロンボモジュリンをコード化するＤＮＡ配列の公開可溶性トロンボモジュ リン類似体のコード化遺伝子の調製を容易にした。本発明の類似体は停止翻訳配 列を有さない可溶性誘導体である。更に、これらの類似体は真核細胞であって、 これらのポリペプチドのコード化された遺伝子を含むプラスミドにより感染され た又は形質転換された細胞から分泌される。修飾、例えばアミノ酸の置換、削除 又はクローン化遺伝子への更なるシグナル配列の挿入の方法は知られている。

トロンボモジュリンについての全長遺伝子は複数の方法により調製できる。ヒト ゲノミックライブラリーは商業的に入手できる。トロンボモジュリン遺伝子に特 異的なオリゴヌクレオチドプローブは公開された遺伝子配列を用いて合成できる 。オリゴヌクレオチドによるゲノミックライブラリーのスクリーニングの方法は 知られている。トロンボモジュリンの遺伝子配列の公開は、このコード化領域に おいてイントロンを含まないことを示す。それ故、ゲノミッククローンは既知の 方法を用いてトロンボモジュリンについての表現プラスミドを構成するための十 分な出発材料を提供する。

ＤＮＡフラグメントをコード化するトロンボモジュリンは、遺伝子の端側又は内 側における領域に同定された制限エンドヌクレアーゼ部位の利点を利用して回収 される（Ｒ，Ｗ、ＪａｃｋｌＩＩａｎ旦旦、（１９８７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、　８４　：　６４２５−６４２９）。

他方、全長遺伝子はｃＤＮＡバンクから得られる。内皮細胞から得られるメツセ ンジャーＲＮＡはｃＤＮＡの調製のための適切な出発材料を提供する。トロンボ モジュリンをコード化する遺伝子を含むｃＤＮＡ分子は前述の通り同定されてい る。ｃＤＮＡバンクの製造方法はよく知られる（マニアナイス記載のこと）。

合成オリゴヌクレオチドをＴＭ遺伝子の構成のために用いることができる。これ は、有意な、そして無意味な遺伝子鎖の両方を示す、通常４Ｏ−１２０ｂｐの長 さのオーバーラツプしたオリゴヌクレオチドの系列を用いて行われる。このよう なりＮＡフラグメントはアニールされ、連結され、そしてクローン化される。

その他の、そして好ましい方法は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型に基づく重合伸長に よる、合成オリゴヌクレオチドプライマーの利用を有する。このポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）方法は目的のヌクレオチド配列を伸長する。制限エンドヌクレ アーゼ部位をこのプライマーの中に組入れることができる。

米国特許４．６８３．１９５及び４，６８３，２０２にこの方法が記載されてい る。

ＰＣＲ反応によって伸長された遺伝子はアガロースゲルより精製でき、そして適 当なベクターの中にクローンすることができる。

可溶性トロンボモジュリン！［４１Ｊ体をコード化する遺伝子は、出発材料とし て全長トロンボモジュリンをコード化する遺伝子を用いて生成することができる 。他方、類似体は合成オリゴヌクレオチドから、又はＤＮＡ又はＲＮＡの鋳型の いずれかにおけるポリメラーゼ連鎖反応の利用により目的の遺伝子であってその 後クローンされるものの純粋なフラグメントにより生成することができる。これ らの方法を組合せて、目的のＤＮＡ配列を得るために用いることができる。

天然遺伝子配列における改質は、インビトロでの突然変異誘発の技術、又はプラ イマーによるポリメラーゼ連鎖反応の技術であって、適当な突然変異を組入れる ためにデザインされた方法によって導かれる。

合成オリゴヌクレオチドから全体的に生成される可溶性トロンボモジュリン類似 体のためには、転写及び翻訳を妨げるであろう第２構造を最小とし、そして天然 アミノ酸配列を変えることのないＤＮＡコドンが選択されうる（Ｈ，Ｇｒｏｓｊ ｅａｎ　ａｎｄ　Ｗ、Ｆｉｅｒｓ、　（１９８２）　Ｇｅｎｅ、　１８　：　１ ９９−２０９）。更に、固有の制限部位を組入れるため、トロンボモジュリンを コード化する天然遺伝子の配列を変更することが望ましい。このような制限部位 は、可溶性トロンボモジュリン類似体をコード化する遺伝子表現可能なベクター の構造内に有用である。また、特定の宿主細胞による表現において、効率性のた めに特定のコドンの利用をデザインすることも有用でありうる。

可溶性トロンボモジュリン類似体をコード化する遺伝子は、１種類以上の天然ド メインの複写体を有する。例示であって限定ではなく、本発明の可溶性トロンボ モジュリン類似体は１種類以上の６ＥＧＦ様ドメインの複写体を有することがあ る。このような物質は、医薬製品における有用性が高められ、なぜならこの領域 はトロンビンと結合するからである。

本明細書記載の可溶性ＴＭは真核細胞培養物において表現された場合に分泌され る。分泌は、トロンボモジュリン遺伝子の天然シグナル配列を利用することで得 られる。他に、本発明の可溶性トロンボモジュリン類似体をコード化する遺伝子 は、天然トロンボモジュリン遺伝子と関連するもの以外のシグナル配列と、適当 な解読フレームにおいて連結する。例えば、ｔ−ＰＡのシグナル配列（本明細書 に参照文献として組入れる１９８７年７月１６日出願、ＵＳＳＮＯ７４，０８３ ）又はハイボダーミンＡもしくはＢ（本明細書に参照文献として組入れる１９８ ９年１月２７日、米国出願随１４８，７４９）をこのポリペプチドと連結できる 。本発明の好ましい態様において、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子の第２イントロンを含む ｔ−ＰＡのシグナル配列が利用される。イントロンの包含は、近接の構造遺伝子 の生産性を高める（本明細書に参照文献として組入れる１９８７年１月１４日出 願ＵＳＳＮ＃００３．６１１参照）。

本発明の類似体は、トロンボモジュリンのカルボキシル末端部位全体をコード化 する遺伝子の一部を欠落する。そのため、停止コドンを加え、翻訳が目的の位置 で停止させる必要がある。他方、停止コドンは目的の表現プラスミドにより提供 されることができる。更に、真核細胞における可溶性トロンボモジュリン類似体 をコード化する適切なｍＲＮＡのプロセッシングを確実にするために、ポリアデ ニル化配列が必要である。また、もし開始コドンを有さない場合、可溶性ＴＭ類 似体の表現のためにそれを加えることが必要である。このような配列は天然遺伝 子又は表現プラスミドから提供される。

記載のＴＭｉ似体個体Ｎ−末端又はＣ−末端のドメインの少なくとも一方がＴＭ をコード化する天然のヒｌ−ＤＮＡ配列から除去され、そしてフィブリン溶解酵 素をコード化するＤＮＡ配列が置き代った遺伝子によってコード化されうる。ｔ −ＰＡ及びプロウロキナーゼはこのような類似体のために有用Ｑ゛フィブリン溶 解酵素である。天然トロンボモジュリンのＮ−末端及びＣ−末端ドメインの両方 を異種の遺伝子配列により置き代わることが望ましい。例えば、本発明の一態様 において、全長ＴＭをコード化する遺伝子は修飾され、これによってシグナル配 列及びアミノ酸−１とから２２６迄を含んで成るＮ−末端ドメインは除去され、 そしてｔ−ＰＡのシグナル配列（アミノ酸−３２から−１；表６記載の番号に従 う）をコード化したＤＮＡに置き代わる。他の態様において、前述のＴＭｌ［個 体は、天然トロンボモジュリンの〇−結合グリコシル、停止翻訳、及び細胞質ド メイン（アミノ酸４６３−５５７）に代わる、ｔ−ＰＡのアミノ酸４から５３０ をコード化するＤＮＡの利用によって更に修飾されうる。このような組換ＤＮＡ 分子は宿主細胞の中に挿入され、これによってフィブリンと結合可能、プロティ ンＣを活性化する、そしてプラスミノーゲンをプラスミンへと転化させる多機能 タンパク質を提供する。

ｔ−ＰＡ遺伝子の好ましい原料は、Ｅ、ｃｏｌｉ培養物（（株ＭＨ−１）添付番 号６７．４４３、Ａｏ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ｉｎ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ貯蔵）か らのｔ−ＰＡ遺伝子を単離することにより得られる。標準クローニング技術によ って十分にｔ−ＦＡプラスミドが得られ、そして異種ドメインを目的のＴＭ類似 体をコード化する遺伝子に挿入することができる。

ＴＭ類似体にフィブリン溶解活性を引き起こす、異種ドメインの利用は、本明細 書記載のその他のＴＭ１１似体の個体にも望ましく、そしてプロウロキナーゼを コード化する遺伝子の利用は、多機能タンパク質を作ることにおける同様の有用 性を有するであろう。

本発明のトロンボモジュリン類似体はそれらのアミノ酸配列及びそのＤＮＡ配列 により詳述され、その類似体は、それらの生物学的同等性を含むと理解され、即 ち、本発明は類似体の生物学的性質において実質的に影響しない、アミノ酸のわ ずかな置換及び削除を含む。変更した配列は種々の宿主細胞における可溶性トロ ンボモジュリン類イ以体を表現するために用いることができることも理解される であろう。更に、遺伝子コードの縮退により、同じポリペプチド配列をコード化 せしめるための等量のコドンが置き代わりうる。

クローニングベタ　− 原核細胞又は真核細胞における組換及び組込みのために適当であり、且つ転写及 び翻訳ターミネータ−を含むクローニングベクター、開始配列、並びに可溶性ト ロンボモジュリン類似体の表現の調節に有用なプロモーターを本明細書に記載す る。このベクターは、少なくとも１つの独立ターミネータ−配列を含む表現カセ ット、真核細胞及び原核細胞の両者におけるプラスミドの組換を行う配列、即ち シャトルベクター、並びに原核系及び真核系の両者のための選択マーカーを含ん で成る。

における可゛′トロンボモジュリンの クローン化配列の増幅のためのＥ、ｃｏｌｔにおけるクローニング方法の利用に 加え、原核細胞における可溶性ＴＭｌ［イ以体を表現せしめることが望ましいこ とがある。可溶性トロンボモジュリン類似体をコード化する表現プラスミドを形 質転換させたＥ、ｃｏｌｉから治療的機能タンパク質を回収することが可能であ る。実施例１２を参照のこと。

細菌におけるクローン化遺伝子の表現のための方法はよく知られている。高レベ ルのクローン化遺伝子、例えば原核細胞系における可溶性トロンボモジュリン類 似体をコード化するＤＮＡ配列を得るには、ｍＲＮＡ転写終結へと導く強力なプ ロモーターを最小限度で含む表現ベクターを組立てることが本質的なことである 。この目的のために適当な調節領域の例には、Ｅ、ｃｏｌｉβ−ガラクトシダー ゼ遺伝子、Ｅ、ｃｏ１ｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレー ター領域、又はファージラムダの左側のプロモーターがある。Ｅ、ｃＯｌｉ中に 形質転換されたＤＮＡベクターにおける選択マーカーの包含は有用である。この ようなマーカーの例には、アンピシリン、テトラサイクリン又はクロラムフェニ コールへの耐性を特定する遺伝子が含まれる。

Ｅ、ｃＯｌｉにおける利用のための選択マーカー及びプロモーターに関する詳細 はマニアテイスを参照のこと。本発明記載の態様において、ｐＵｃ１９は目的の 遺伝子配列のサブクローン化及び増幅のためのベクターとして用いられる。

ノ　におしる可ｒ　トロンボモジュリン　の当業者は目的のＴＭ類似体の表現の ために選べる表現系を知るものと考えられ、従って真核細胞において作られるで あろうタンパク質の表現のために既知の種々の方法を詳しく記載しない。

可溶性ＴＭ類似体をコード化するＤＮＡ配列は、宿主細胞培養物の形質転換にお いて用いるための種々の表現ベクターと連結できる。このベクターは一般に、マ ーカー遺伝子及び可溶性トロンボモジュリン類似体遺伝子の開始転写及び翻訳の ための遺伝子配列を含む。

このベクターは好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性 、例えばジヒドロフオレートリダクターゼ、メタロチオネイン、ヒグロマイシン 又はネオマイシンホスホトランスフェラーゼを含む。オートグラファカリフォル ニカ（Ａｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）からの核多角体病ウィ ルス群タンパク質は組換体を同定するための、スボドブテラ　フルギペルダ（Ｓ 　ｏｄｏ　ｔｅｒエ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ）及びボンビックス　モリ（Ｂ。

ｍ工　ｍｏｒｉ）由来形質転換昆虫細胞系のスクリーンを行うのに有用である。

酵母において、Ｌｅｕ−２，Ｕｒａ−３，Ｔｒｐ−１、及びＨｉｓ−３は選択マ ーカーとして知られる（Ｇｅｎｅ（１９７９）　８　：　１７−２４）。前述の 科学的な目的を具体化する既知及び未知のその他の真人な数のマーカーが存在し 、それら全ては本発明の包含するベクターにより形質転換された真核細胞の検定 のために有用なマーカーとなるであろう。

以降に提供する実施例において、ヒグロマイシンはＣＨＬ−１細胞における真核 細胞選択マーカーとして含まれる。可溶性ＴＭｉ似体個体現に対する真核細胞系 の高い有用性のために選択できる細胞系は真人にある。哺乳細胞系の実例には、 ＲＰＭＩ７９３２ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ ＨＯ）細胞系、ＷＩ３８．ＢＨＫ、Ｃ０５−７，Ｃ１２７又はＭＤＣＫ細胞系が 挙げられる。本発明における利用に適当な細胞はＡＴＣＣから商業的に入手でき る。例示する昆虫細胞系には、スポドプテラフルギベルダ（フォール　アーミー ウォーム（ｆａｌｌ　Ａｒｍｙｗｏｒｍ））及びボンビックスモリ（蚕）を含む 。

前述の通り、表現ベクター、例えばプラスミドであって宿主細胞の形質転換に用 いられるものは、好ましくは転写を開始するための遺伝子配列、及び可溶性ＴＭ ＩＩ位体タンパク質遺伝子配列の翻訳をコントロールする配列を含む。このよう な配列を表現コントロール配列と称する。宿主細胞のもとが昆虫又は哺乳動物の 場合、具体的な表現コントロール配列は、レトロウィルス終結繰返しくｒｅｔｒ ｏｖｉａｌ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）プロモーター（（１ ９８２）　Ｎａｔｕｒｅ、　２９７　：　４７９−４８３）、　ＳＶ４０プロモ ーター（（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２２　：　５２４−５２７）、チ ミジンキナーゼプロモーター（Ｊ、Ｂａｎｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２） 　Ｃｅ旦、　２７　：　２９９−３０８）、又はベーターグロブリンプロモータ ー（Ｐ、Ａ、Ｌｕｃｉｗ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）釦旦、井：　７０５−７１６）を含むが、しかしこれらに限定はし ない一表現コントロール配列を含む。この受容体ベクター核酸を、制限酵素によ って分裂せしめ、必要な又は目的のサイズに調整する。このセグメントを当業界 によ（知られる技術により、可溶性ＴＭ類似体をコード化するＤＮＡ配列と連結 させる。

酵母における異種タンパク質の表現について、以下のプロモーターが表現のため に有用である：　ＧＡＬ　１　、１０（（１９８４）包ムａｎｄ　Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ、、４　：　１４４０−４８）　；　ＡＤ）１２　（（１９８３）Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

リアデニル化配列の例には、ＳＶ４０由来のポリアデニル化配列であって転写タ ーミネータ−としても機能するものが含まれる。

適当なベクターに組入れられる遺伝子は、過２マ表現系又は安定クローンのいず れかにおいて、タンパク質の合成を誘導せしめるために用いられうる。先のケー スにおいては収率は低いが反応は速い。後者のケースにおいては、高い生産量の クローンを単離するにはより長い時間を必要とする。二種の異なる実験のために 二種のベクターが用いられる。特に、過度表現のケースにおいて、配列はプラス ミド中に含まれることができ、これによってプラスミドは細胞において高い複写 ナンバーへと複製される。これらの配列はウィルス、例えば５Ｖ４０（例えばＣ ，Ｄｏｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０ ０　ニア０４−７１４）又は染色体複製配列、例えばネズミ自律複製配列（Ｗｅ ｉｄｅ旦ａ１．　（１９８Ｂ）　Ｇｅｎｅ、　７３　：　４２７−４３７）由来 のものでありうる。過城表現における利用のためのベクターは、強力なプロモー ター、例えばＳＶ４０初期プロモーター（例えば、Ａ。

ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、。

８３　：　４６７０−４６７４）も目的の遺伝子の転写をコントロールするため に含むべきである。退域表現は遺伝子生成物のアッセイのための迅速な方法を提 供するが、このプラスミドＤＮＡは宿主細胞染色体に組込まれない。それ故、退 席表現ベクターの利用は安定形質転換細胞系を提供しない。退席表現のために適 当なプラスミドの詳細はＡ、Ａｒｕｆｆｏ　＆　Ｂ、５ｅｅｄ、　（１９８７） 　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、　８４　：　８５７３−８５７７に記 載されている。

開示する態様はＣＨＬ−１細胞を利用する。これらはＲＰＭＩ７９３２ミエロー マ細胞であってヒト細胞系から容易に得られるものから誘導される。このＣＨＬ −１細胞系はブタペスト条約の条件によってＡＴＣＣで保存される（譲渡番号＃ ＣＲＬ９４４６．１９８７年６月１８日保存）。

この可溶性ＴＭｉ似体個体母細胞において表現されうる。

酵母における異種タンパク質の表現はよく知られる。Ｆ、’５ｈｅｒｓｃａｎ　 ｅｔ　ａｌｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＋　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（１９８２ ）は、種々の方法の記載された論文として知られ、酵母における可溶性トロンボ モジュリン類似体の生産に有用な方法も記載されている。

可溶性ＴＭ類似体は、前述のバクロウィル系を利用して昆虫細胞系において択一 的に生産されうる。この系はＶ、Ａ、Ｌｕｃｋｏｉ＊　ａｎｄ　Ｍ、Ｄ、Ｓｕｍ ｍｅｒｓ（１９８Ｂ）Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　、６　：４７５５に記載され ている。一般に、この表現系はほとんどの哺乳動物系が提供するものよりも高い レベルの表現を提供する。バクロウィルスは宿主昆虫細胞に感染し、その染色体 を真人な回数複製し、その後大量のポリへドロン結晶を生成する。このポリへド ロン遺伝子をＴＭ類似体遺伝子に置き代えることができる。このポリヒデロンプ ロモーターは、培養宿主細胞に感染し、そしてバクロウィルスゲノムの複製後、 大量の類似タンパク質を作るであろう。非分泌遺伝子生成物は感染後３〜７日経 過の宿主から採取される。他方、この可溶性ＴＭタンパク質は、もし適当なシグ ナル配列がタンパク質上に存在するなら、細胞から分泌されるであろう。

宿主細胞は形質転換のために適当であるか、又は種々の方法により適当となる。

ＤＮＡを動物細胞に導入する複数の既知の方法が存在する。その中にはニリン酸 カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン技術、受容細胞とＤＮＡ含有細菌プロ トプラストとの融合、受容細胞のＤＮＡ含有リポソームによる処理、細胞へのＤ ＮＡの直接的なエレクトロポレーション及びマイクロインジェクシン、を含む。

Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ＋“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋”第２版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｗｉｇｌａｒ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｃｅ１ｌ 、　１６　：　７７７−７８５を参照のこと。

豊凶■看ｉ 宿主細胞は迅速な細胞培養が可能であり、且つ表現遺伝子生成物を適当にグリコ ジル化できるものが好ましい。組織培養において密な生育に適する既知の細胞が 特に望まれ、そして種々の無を椎動物又はを椎動物細胞の正常細胞系及び形質転 換細胞系が当業界において利用されている。

この形質転換細胞は当業界の手段により生育される。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ。

Ｋｕｃｈｌｅｒ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｄｏｗｄｅｎ、　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　ａｎ ｄ　Ｒｏｓｓ＋　Ｉｎｃ、（１９＋７７）を参照のこと。表現生成物は、タンパ ク質の宿主細胞からの分泌、又は当業界によく知られる例えば機械的な、又は酵 素的な手段による宿主細胞系の破砕後の細胞懸濁物により、細胞媒体から採取さ れる。

可？”　ＴＭ”　の 本発明は可溶性ＴＭ［個体であって、培養組換真核細胞から分泌されるものを提 供する。この類似体は無血清又は血清添加培地において生産され、そして完全に 分泌される。もし原核細胞を用いた場合、ＴＭ類似体は細胞内に蓄積される。

この類似体はグリコジル化又は非グリコジル化のものでありうる。組換細胞の生 育及び培地へのＴＭ［個体の分泌の後、この「コンディショニング培地」は採取 される。次いでこの「コンディショニング培地」は細胞及び細胞の残骸を除去す るため、遠心又は濾過によって浄化する。浄化培地に含まれるタンパク質は、任 意の適当な樹脂、例えばＱセファローズもしくは金属キレートへの吸着、又は硫 酸アンモニウム分画、ポリエチレングリコール沈渣、あるいは限外濾過により、 濃縮される。当業界におけるその他の知られる手段も同様に適当である。この可 溶性ＴＭ［個体の更なる精製は、Ｇａ１ｖｉｎ。

Ｊ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６２ 　；　２１９９−２２０５及びＳａｌｅｍ、　Ｈ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９８４ ）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５９　；　１２２４６−１２２５１に記載 の方法、並びに本明細書にて開示する態様に記載の方法により成し遂げられるこ とができる。培養細胞により分泌された可溶性ＴＭＩＩＷ似体の精個体、例えば アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズクロ マトグラフィー又はその他のタンパク質精製技術の異なる利用を必要とする。

組換ＴＭ類似体は非還元クロマトグラフィー条件下で検出可能な多彩な立体構造 において生産されうる。より大きい分子量のもの、及び低比活性を有するものの 除去が望ましく、そしてこれは、陰イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィ ーを含む、種々のクロマトグラフィー技術により成し遂げられる。

組換ＴＭ類似体は加圧透析及び直接揮発緩衝液への緩衝液交換（例えば、Ｎ−エ チルモルホリン（ＮＥＭ）、炭酸水素アンモニウム、酢酸アンモニウム、及び酢 酸とリジン）により濃縮される。更に、サンプルはこのような揮発性緩衝液での 凍結乾燥により、塩及び清浄剤を含まない安定なタンパク質粉末となる。更に、 組換類似体の凍結乾燥物は、注入に適合する緩衝液（例えば、リン酸生理緩衝液 ）に、使用前に効率的に再溶解される。その他の適当な緩衝液には、塩酸塩、臭 酸塩、硫酸酢酸塩、ベンゾエート、マレート、シトレート、グリシン、グルタメ ート、及びアスパルテートを含みうる。

口’′ＴＭ　’　のフィブリンｆ″、への　Ａフィブリン溶解酵素の活性部位を ブロッキングすることによりそれらの治療速度を向上できる。例えばヒト溶解プ ラスミノーゲン活性体複合体のＰ−アニソイル誘導体（プラスミノーゲンとスト レプトキナーゼとの間の複合体、又の名をＡＳＰＡＣ又はエミナーゼ（Ｅｍｉｎ ａｓｅ　：登録商標、Ｂｅｅｃｈａｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、、　Ｌｔ ｄ、、　Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、　Ｕ、に、））は、ストレプトキナーゼ単独と比 べた場合、例えばより長い半減期という臨床上の利点を示す。この溶解プラスミ ノーゲンストレプトキナーゼ複合体の活性部位のアシル化は、フィブリン結合部 位を自由にし、そのためにこの複合体は不必要な血栓に対する結合能力を保持す る（Ｓｎ＋ｉｔｈ、　ＲＡＧ、　Ｄｕｐｅ、　ＲＪ、Ｅｎｇｌｉｓｈ、　ＰＤ、 　＆　Ｇｅａｒｉ、　Ｊ、、　（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９０　；５０５− ５０７）。活性フィブリン溶解複合体はゆっ（つとした加水分解による脱アシル 化の後、生産される。同様の技術は、その他の分子の化学結合、例えば可溶性Ｔ Ｍ類４以体を、この類似体の自由アミン基を介してフィブリン溶解酵素の活性部 位へ結合させるために用いることができる。本明細書において開示するペプチド は、フィブリン溶解酵素、例えば溶解プラスミノーゲンストレプトキナーゼ、ｔ −ＰＡ等と、酵素とペプチドにおけるアミノ酸残基との間の共有結合を介して化 学結合せしめる。

ある態様において、溶解プラスミノーゲンストレプトキナーゼ複合体は、プラス ミンの異性二価特異性転化支持体を用いることによりＴＭ類似体と特異的、且つ 可逆的に結合されうる（例えば図８参照のこと）。第２の態様において、ＴＭ類 似体と結合するフィブリン溶解酵素は組織プラスミノーゲン活性体（ｔ−ＰＡ） でありうる。アシル酵素はＳｎ＋ｉｔｈ、　ＲＡＧ＆　Ｃａ５ｓｅｌｓ、　（１ ９８８）＋　Ｆｉｂｒｉｎｏｌ　ｓｉｓ、２　；　１９８−１９５記載の方法に 従って調製される。ゲル濾過による過剰アシル化剤の除去の後、このアシル酵素 をチオール化ＴＭ類似体と反応せしめる。アシル化反応は、プラスミノーゲン又 はｔ−ＰＡの分子いずれにおいても、その中心活性セリン残基に対して特異性が 高い。チオール化ＴＭは好ましくは、１個の自由アミン釜のみを有するグループ 、１１／２，４ｔ−２２７／４６２又は６ｈ−２２７／４６２であって分子のＮ −末端にあるものを用いて製造される。チオール化ＴＭ類似体は類似体を、Ｓｍ １ｔｈ　（１９８８）（前述）記載のとおり２−イミノチオレンと反応せしめる ことで生産される。次いでこのチオール化ＴＭＭ個体をアシル化フィブリン溶解 酵素（溶解プラスミシーケンストレプトキナーゼ複合体又はｔ−ＰＡ）と反応せ しめ、ＴＭ＞ＳＫ　：　Ｐ　ｌ　ｇ又はＴＭ＞ｔ−ＰＡを生産し、これらを次に 高性能ゲル濾過クロマトグラフィー又はその他のＳｍ１ｔｈ　（１９８８）（前 述）記載の方法により更に精製せしめる。

ＴＭｉ似体個体フィブリン溶解酵素の活性は、本明細書記載の方法により、それ ぞれアッセイされうる。アシル化酵素コンジュゲートの加水分解は、ＳＤＳゲル 上及びフィブリン溶解酵素活性の脱離によりモニターされうる。

化学架橋剤はアシル酵素プロドラッグを生産するために用いられる。この方法は 可逆フィブリン溶解コンジュゲートであって両分子の組合された特性を有するも のを提供し、それ故出血をコントロールするための、反応速度論的アプローチを 有する、溶解プラスミシーケンストレプトキナーゼ複合体又はｔ−ＰＡを介して の血栓に特異的な処Ｉを提供する。このＴＭ＞フィブリン溶解性アシル酵素プロ ドラッグはフィブリン溶解活性の比較的清掃率の遅い貯蔵物として作用する。

それ故、ＴＭｉ似体個体ィブリン溶解活性及び凝集物への特性の半減期は増大し 、そしてその清掃率及び全身への作用の両者は減少する。

工ｙ皿皿生曵■璽 トロンボモジュリン活性はトロンビンの活性の変化に依存する種々のアッセイに より検定できる。トロンボモジュリン又はその可溶性類似体の、プロティンＣの トロンビン触媒活性化を促進させる能力は、Ｓａｌｅｍ旦虹、（前述）及びＧａ ｌｖｉｎ部、１．記載のアッセイにより測定できる。簡潔には、このアッセイは 二段階より成る。第一段階は、定義した条件のもとての試験品の、トロンボモジ ュリン又はＴＭ類似体とトロンビン及びプロティンＣとのインキュベーションで ある。第２段階において、トロンビンはヒルジン又は抗トロンビン■及びヘパリ ンにより不活性化され、そして活性化プロティンＣの活性は、色素産性基質の利 用、すなわち、活性化プロティンＣのタンパク質加水分解活性による発色団の放 出により測定される。このアッセイは精製された薬剤により行われる。

他方、ＴＭＷ似体個体用は、凝血時間アッセイ、例えば活性化部分トロンボプラ スチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン凝血時間（ＴＣＴ）及び／又はプロトロン ビン時間（ＰＴ）における血漿の利用により測定できる。これらのアッセイは凝 血阻害の異なる機構によって区別される。このようなアッセイのいずれの阻害も 全身性凝血状態の存在を証明する。ＡＰＴＴは血小板、因子■及びカルシウムイ オンを除く凝血物に含まれる全ての成分の作用を測定し、ＴＣＴはトロンポンの 阻害を特に測定する。ＰＴは一定のりボタンバク賞及びカルシウム濃度で、プロ トロンビン活性を測定する。

これらのアッセイは、トロンビンと結合でき、そしてプロティンＣを精製系及び 血漿内の両方において活性化させる可溶性ＴＭｉ似体個体定せしめるのに用いら れる。

可溶性ＴＭ類似体のトロンビン由来フィブリン形成、トロンビン由来血小板活性 化／凝集及びトロンビン由来プロティンＳの不活性化の阻害による高められた可 溶性ＴＭＩ似体個体に因子■、■及びＸ■のトロンビン触媒活性化を評価するた めの更なるアッセイが次に利用される。トロンビンの不活性化を高める類似体の 能力は、抗トロンビン■及びヘパリン共同因子■によっても測定できる。治療的 薬剤としての有用性を有する可溶性ＴＭ類似体は生理学的カルシウムイオン濃度 においてプロティンＣを活性化できる。

トロンボモジュリン　゛　の１　び 本明細書記載の可溶性トロンボモジュリン類似体は凍結乾燥又は液状の形態にお いて調製されうる。材料は、注射可能な医薬品、又は静脈内調製物のいづれかに 用いられるために適切な濃度において用いられる。

これらの化合物は単独で、又はその他の生理学的受容される活性材料、例えば一 本１ｊ　ｔ　−Ｐ　Ａ、もしくは不活性材料と混合して、あるいは適当なキャリ アー、例えば水又は通常の生理溶液と共に投与できる。このような化合物は非経 口的、例えば注射によって投与できる。注射は皮下、静脈内又は筋肉内でありう る。このような化合物は医薬品として有効な量において投与され、そしてしばし ば医薬品として許容される塩、例えば酸添加塩として投与されうる。塩には、例 えば塩酸塩、臭酸塩、ホスフェート、スルフェート、アセテート、ベンゾエート 、マレート、シトレート、グリシン、ケ゛ルタメート、及びアスパルテート他が 含まれる。本明細書記載の類似体はミＪ抵、）混入化工より高められたイア１． −よ活性を示。

うる。イオン性浄化ミセル又はリン脂質への混入化の方法は知られている。

抗血栓剤は本明細書記載の可溶性ＴＭ類似体を用いて調製でき、そしてそれは完 全に精製されたトロンボモジュリン類似体単独、又は前述の血栓溶解剖との組合 せより成る。前述の生理学的作用を有すること示す本発明の化合物は、多大なる 治療的用途、例えば血液凝集形成の阻害において有用である。それ故、これらの 化合物は種々の循環系障害、例えば冠状動脈又は肺動脈塞栓、発作及び血栓溶解 治療後の再閉塞の処置において有用であり、そしてこれら化合物は梗塞症にわた る更なる凝血の増大を止める有用性を有する。更に、開示する化合物は全身性凝 血障害、例えばＤＩＣであって敗血症、特定の癌及び毒血症又は妊娠としばしば 関連する障害の処置のために有用となりうる。

これらの化合物は獣医学的利用のため哺乳動物、例えば飼育動物に投与され、そ して人間における臨床的利用のためには、その他の同様の治療剤と生理学的に許 容されるキャリアー中の状態にある。一般に、投与量は対象体の体重の約０゜０ ００１から１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより通常には０．００１から０．１Ｂ／ｋ ｇの範囲であろう。これらの投与量は、目的の循環系レベルが達せられる迄の長 時間にわたる連続注入、又は好ましくはポーラス注射によって投与されうる。

・のＴＭ　゛　による　・ 循環系の任意のケ所における改質された人工肉血管又は心臓血管装置の利用は、 血栓の形成、即ち、種々の血流状態のもとての止血機構の活性化の病理的な結果 として血液が引き起こす塊をもたらす。典型的な人工肉血管又は心臓血管装置と 関連するトロンビン発生は以下の連続段階：（ａ）循環血液への表面の暴露； （ｂ）血小板癒着、凝集及び血小板成分の遊離；（Ｃ）トロンビン発生及びフィ ブリン形成；（ｄ）プラスミン発生及びフィブリン溶解を必要とするトロンビン 分解； を含む。一般に、血液が人工的な表面と接する場合、その表面に直ちに吸着血漿 タンパク質の層がもたらされ、そしてこれはその後の血栓症をもたらす。この種 の症状はまた、血液が体外装置、例えば心臓／肺装置中を循環する場合にも起き る。

このような血液接触装置の重合表面上に種々の被膜を導入することは、血栓耐性 を促進するのに望ましい。トロンボモジュリンは血栓耐性表層を作り出すために 適する新規のクラスの分子を示す。これは特にこのような表層として適しており 、なぜならこれは既知の阻害物質を含まず、そして長期間にわたりこの能力を機 能することができるであろうからである。

本明細書記載のＴＭ類似体はこのような目的に特に好都合であり、なぜならそれ らは、全長ＴＭがブタ膵臓エラスターゼにより消化された場合のタンパク質フラ グメントと近接に関連するからである。固定化タンパク質の長期間の安定性は最 も重要である。それ故、より小さい、加水分解耐性ＴＭ類似体は、全長分子より もより好都合であり、なぜなら全長分子は血液中における酵素により加水分解さ れることがあり、これは生物材料表面からの活性成分の能力衰退をもたらす。

このＴＭｉ似体個体全長分子の利用に比べ、とりわけ、生理的ストレス、例えば 炎症が起きている間であって、リンパ球エラスターゼを含む強力なる白血球プロ テアーゼが生物材料表面に接近するときに特に好ましいであろう。

このＴＭ類似体は、動静脈シャント、静脈内シャント（例えば鯛帯、血管造影） 、血管移植、心臓バルブ、人工連結器、ペースメーカー、左心室補助装置等を含 むが、しかしこれらに限定しない種々の広い生物学用途において利用される被覆 ポリマーのために用いられる。

・　このＴＭ類似体は生体適合ポリマーと結合される。生体適合ポリマーは任意 の適当な重合生物材料又はそれらの組合せであって生物用途の技術にいて知られ 、且つ用いられているものであり、例えばポリウレタン、シリコンエラストマー 、ヒドロゲル（例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリエステ ル、ポリエーテル、ポリビニルアルコール）等である。

ＴＭｉ似体個体体ポリマーの活性化の後でポリマー材料を被覆せしめるために結 合されうる。活性化方法は当業界に知られる方法であり、そして被覆せしめる成 分のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基又はスルフヒドリル基を利用し うる。活性化は、種々の既知の単−及び／又は二価官能性試薬であって、グルタ ルアルデヒド、カルボジイミド活性化ＣＯＯＨ，イソシアネート、シアヌル酸、 又はヒドロスクシニミドエステルを含むが、しかしそれらに限定しないものを介 して得られる。

本明細書記載のい（つかのＴＭ類似体のＮ−末端の単一アミン官能基、例えば１ １／２．４ｔ／２２７−４６２及び６ｈ／２２７−４６２は、生物材料表面を活 性化せしめるため、高い配向性においてこのタンパク質を共有結合せしめる高い 選択性手段を提供する。生体適合ポリマーが被覆されたら、必要ならば当業界が 教示する手近な方法に従って哺乳動物に移植されることができ、又は血液と接触 する任意の装置であって血液が抗凝血を保たねばならないものに用いられうる。

以下の実施例を例示のために提供するが、しかしこれらは本発明の範囲を限定す るものではない。

実施例 全ての配列の説明において、当業界の慣例に従い、５′及び３′なる語は遺伝子 及びその周辺の配列の鎖をコード化する上での方向性を示す。他の説明がない限 り、本出願中の全ての一本鎖ＤＮＡは、遺伝子の鎖のコード化を表す。

実施例１．トロンボモジュ「ン　゛　コ−Ｆ　６ｆ’）−ｆヌクレオチドの６ ａ、アミノ酸２２７−４６２をコード化する遺伝子の単離。

アミノ酸２２７−４６２に相等するトロンボモジュリンの６ＥＧＦ様ドメインを コード化する遺伝子を単離せしめるためにヒトＤＮＡを用いた。このＤＮＡはＢ １１ｎ、　Ｎ及びり、５ｔａｆｆｏｒｄ、　（１９７６）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ＋ ｊｄｓ　Ｒｅｓ、　３　：　２３０３の方法に従い、胎児の肝臓から単離した。

次にこのＤＮＡを鋳型として、目的の領域を得るために選ばれた合成誘導プライ マーと共に、重合連鎖反応において用いた（図２及び３、並びに表１及び３参照 のこと）。

以下の段階は、アミノ酸（ａａ）２２７−４６２をコード化するＤＮＡインサー トを得ること並びにプライマー＃１Ｏ３３及び＃１０３４　（図３参照）の利用 を提供する。以下に示す択一的なプライマーの利用による方法の変更により、他 のＴＭ［が得られうろことが理解されるであろう。

＃１０３３及び＃１０３４プライマーの配列は、目的のドメインの５′から３′ 末端に相当するが、しかしそれらは修飾されてＢａｍＨ１部位を含む。終結コド ン（ＴＧＡ）を塩基１５８６の後に導入した。この重合連鎖反応は５ａｉｋｉ、 　ｅｔａｌ、、　（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ、　３２０　：　１３５０−１ ３５４記載の条件のもとで行ったが、ただしアニール化の開始温度は３７゛Ｃと した。１０サイクルの後、残り３０サイクルのためアニール化温度を４５゛Ｃ迄 上げた。反応生成物の一部を５％ポリアクリルアミドゲル上で分離せしめ、そし てエチジウムブロマイド染色によって識別化させた。予期されたサイズのバンド （７００ｂｐ）がはっきりと現れた。インサートの同定を確認するためには、任 意的にこのバンドをシーケンス化するか、又は内在プローブへそれをハイブリダ イズする。

ｂ、ＴＭのその他の領域をコード化する遺伝子の単離本明細書記載の重合連鎖反 応は同じ方法で、表１に列挙し、そして図２Ａに図解する領域に相当する付加ト ロンボモジュリンフラグメントを単離せしめた。特にこれらの領域は１又は複数 のＥＧＦ様ドノドメインＯ結合グリコシル化ドメインを包含する。目的の領域を 提供するために選ばれたプライマーの配列を表３に示した。

Ｃ１可溶性ＴＭ類似体遺伝子を含むプラスミドのクローニング ｉ、ｐＵｃ１９ｐｃｒＴＭ７ 前述のパート（ａ、）記載の重合連鎖反応混合物の残りをＢａｍＨＩによって制 限し、５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして７００ｔ＋ｐバンドを切 り出し、溶出せしめた。

これをＢａｍＨＩにより制限されたｐＵｃ１９と結合し、そしてこの新規のプラ スミドをＥ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの中へ形質転換せしめる。アンピシリン及び５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む培地上の 白色コロニーをグリッド上に採り、そしてランダムブライミングによる”Ｐ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の標識化前に、Ｅｃ　ｏＲＩ及びＨｉ ｎｄｌ［によってクローン化プラスミド（ｐＴＭ２．１）から切り出したＴＭの ａａ２８３−３５２に相当する合成誘導遺伝子と、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇ ｎｅｓｓ技術によりハイブリダイズした。

フィルターをＸ線フィルムに暴露後、ｐＴＭ２．１プローブ（ｐＵｃ１９ｐｃｒ ＴＭ７）とハイブリダイズした一つのコロニーが現れた。ＤＮＡを抽出し、そし てＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩのいずれかの制限によって分析した。制限分解物を アガロースゲル上で分離させ、そしてエチジウムブロマイド染色ハンドは、’１ ｏｏｂｐインサートが存在し、且つトロンボモジュリンの６ＥＣＦ様ドメインの 正しい制限地図を有することを証明した。このゲルをまたニトロセルロースに移 し、そしてｐＴＭ２．１由来の３１ｐ標識化インサートとのハイブリダイゼーシ ョンにより分析した。ＢａｍＨＩによる分解後に遊離した７ｏｏｂｐインサート は、４８６ｂｐＢｇｌｌｌフラグメントと同様にこのプローブとハイブリダイズ し、これはこのクローンがトロンボモジュリンの６ＥＣ；Ｆ様ドメインを含むこ とを証明する。重合連鎖反応の間に、ｐ　ＵＣｌ　９　ｐ　ｃ　ｒＴＭ７に突然 変異が誘導されなかったことが確証され、そしてクローニング工程はインサート のシーケンシングにより成された（図４参照）。

ｉｉ、その他ＴＭｉ個体遺伝子を含むプラスミドのクローニング その他のクローン化プラスミド、例えばｐＴＭ３０９及びｐＴＭ３２３は（１） に記載の類似した方法を用いて組立てた。プラスミドｐＴＭ３０９は天然ＴＭの アミノ酸３５０−４６２（ＥＧＦ様ドノドメイン４＆６）を含み、そしてｐＴＭ ３２３はアミノ酸２２７−４９７　ＣＥＧＦ様ドメイン十〇−結合グリコシル化 ドメイン）を含む。

その他のＴＭＩ似体遺体遺伝子配列む更なるプラミドを作った（図２Ａ及び表１ 参照）。

実施例２．　にお番るヒトＴＭ　゛　の　゛告ａ、ＴＭ類似体についての哺乳動 物表現ベクタ一本実施例は、実施例１０類似体遺伝子を含んで成る哺乳動物表現 ベクターを提供する。図４はこのようなベクターの構造の一つの全体図である。

この遺伝子はヒト組織プラスミノーゲン活性体のシグナル配列と結合可能である 。この表現プラスミド、ｐＰＡ１２４はクローン化遺伝子の表現のための、バー ビー　サルコマ（Ｈａｒｖｅｙ　Ｓａｒｃｏｍａ）ウィルス由来の長い末端繰り 返しの三つの複写体において含まれるプロモーターを含む。このプラスミドはｐ ＰＡ１１９及びｐｓｃ６２７由来であり、両方とも本明細書に参照文献として組 入れた１９８７年７月１６日の共同出願ＵＳＳＮ＃０７４．０８３に詳しく記載 されている。ＳＶ４０ポリアデニル化領域を含むＢｇｌｌＩ−Ｂｃｌｌフラグメ ントをｐＳＣ６７２から単離した。このフラグメントをＢｇｌｎ及びＢｃｌｌに よって分解されたｐＰＡ１１９中ヘクローン化した。得られたプラスミドｐＰＡ １２４において、ＢｇｌｌＩ及びＢｃｌＩ部位の両者は完全に残った。プラスミ ドｐＰＡ１２４は適当な制限部位に隣接するｔ−ＰＡシグナル配列を含み、そし てこのシグナル配列はまたヒトｔ−ＰＡ遺伝子の第２イントロンを含む。

可溶性ＴＭ１１似体を個体ド化する遺伝子をＢａｍＨＩによる処理によってｐＵ ｃ１９ｐｃｒＴＭ７から取出し、そしてＢｇｌｎにより処理されたｐＰＡ１２４ と結合させた。正しい方向性におけるインサートの存在についての形質転換体、 即ち、ｔ−ＰＡ配列が解放解読フレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍ ｅ）をコード化するトロンボモジュリンの５′末端に結合する状態にあるものを スクリーンした。このプラスミド、ｐＴＭｌｏｌを次いでＣ１ａＩにより分解し 、そしてＳＶ４０プロモーターのコントロール下でｄｈｆｒ遺伝子を含むＣ１ａ Ｉフラグメントと連結させた。このＣ１ａＩフラグメントはＷＯ３８１０２４１ １，２６頁に記載されている。このｄｈｆｒカセットの存在する形質転換体をス クリーンし、その後制限地図化によりプラスミドに関する方向性を検定した（ｐ ＴＭＩ　Ｏ３）。

トロンボモジュリン配列に対して異なる方向におけるｄｈｆｒ配列を含むプラス ミドｐＴＭ１０３をＢｃｌｌにより処理し、そしてＢａｍＨＩフラグメント上の ヒグロマイシン耐性を提供する遺伝子をコード化するＤＮＡフラグメントをこの プラスミドの中に結合せしめた。クローンの選別を、Ｅ。

ｃｏｌｔ株ＤＨ５αへの形質転換後、それらのアンピシリン及びヒグロマイシン Ｂ両者を含むプレート上での生存力によって行った。このプラスミドに関するヒ グロマイシンＢの方向性を制限地図化により検定した。一つのプラスミドｐＴＭ １０８であって、ヒグロマイシンＢ遺伝子がＴＭ遺伝子と反対の方向にわたるプ ラスミドを培地において生育させた。このプラスミドはトリプルＬＴＲプロモー ターのコントロール下のＴＭｉ似体個体−ド化する配列を有し、それはヒグロマ イシンＢ耐性を授け、且つプラスミド上に存在するｄｈｆｒをコード化する遺伝 子を有する。このトロンボモジュリン配列は組織プラスミノーゲン活性体シグナ ル配列と連結し、その分泌を確実にする（表６参照）。

ｂ、安定哺乳動物クローンの感染、選別及び増幅形質転換のため、１０μｇのｐ ＴＭ１０８をリボフエクチン試薬（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合し、そしてこれを６ウエルプレート中の１０５個 のＣＨＬ−１宿主細胞の単一層に加えた。形質転換から４８時間後、一定数の細 胞を選択培地上に散布した。ヒグロマイシンＢへの耐性を選択マーカーとして利 用した。細菌のヒグロマイシンＢ遺伝子により形質転換されたＣＨＬ−ｆｉｌｌ 胞はヒグロマイシン８０゜３ｍｇ／ｍｌ中で生育し続けた。

形質転換又は選別頻度は２／１０３であり、これは選別後に出現したコロニー数 を、散布した細胞全数で割ってめた。

培養上漬物は、細胞と接触して２４時間後に１．５Ｕ／ｍｌの７Ｍ活性を含んで いた。

第一選別条件に耐性な細胞を第２ラウンドの選別にかけた。

メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ：ＭＴＸ）１００ｎＭ又は５００ ｎＭのいづれかを生育培地に加え、ｄｈｆｒ遺伝子を表現する形質転換体の選別 を行った。ｄｈｆｒ遺伝子の増幅されたクローンのみがこの高いレベルのＭＴＸ の中で生育できるであろう。遺伝子増幅の工程において、その他のプラスミド配 列もｄｈｆｒ遺伝子により一緒に増幅され、そしてそれ故選別可能でない遺伝子 の表現遺伝子も同様に増大するであろう。耐性クローンは５から６週間で明らか となる。このようなレベルのＭＴＸに耐性な個々のクローンを単離し、そしてア ッセイした。選別後のＭＴＸｌｏｏｎＭにおける培養物は、プロティンＣ活性化 活性４．９−１４．７Ｕ／ｍｌを提供することを示した（以下参照）。プールし た細胞を１０倍濃度のＭＴＸ　（１ｌＭ又は５μＭ）の中に散布した。

クローンを再度この選別段階から回収し、そしてアッセイした。各段階のクロー ンはＴＭ類似体を生産し、そして培地の中に分泌することを示した。

実施例３．　にお番るＴＭ　゛　の′ ａ、過渡晴乳動物表現ベクターの製造 過渡表現実験のために適当な２種類のベクターを、商業的に入手可能なプラスミ ドから製造した。

ｉ、ｐＰＡ１３３ プラスミドｐＰＡ１３３は、Ｐｈｏｒａ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）から購入したプラスミドｐＬ１の修飾 体である（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　ｐ、ｌ　（１９８３）　 Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　３　：２８０−２８９）。このプラスミド、 ＰＬＩは初期領域転写プロモーター及びｍＲＮＡスプライシング配列の複製起源 ＳＶ４０を有する。これは、ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０起源（又は複製 体）のコントロール下のｔ−ＰＡシグナル配列に独特の制限部位を付加するポリ リンカー配列を含んだプラスミドを組立てるために用いた。ｍＲＮＡスプライシ ング部位は除去した。このプラスミド、ｐＰＡ１２９の構造は本明細書に参考文 献として組入れた共同特許出願ＵＳＳＮ３４５．３７２に記載されている。ｐＰ Ａ１３３を作るため、ｐＰＡ１２９をＢｇｌｎにより分解し、そして他のポリリ ンカー配列をｔ−ＰＡシグナル配列からの下流側隣接部に挿入した。このポリリ ンカーは独特の制限部位を有するプラスミドを作る（ＢｇｌＩＩ、Ｎｏｔ　Ｉ、 ５ｎａＢＩ及びＳｐ　ｌ　Ｉ）。

ｉｉ、ｐＴＨＲ５ プラスミドｐＴＨＲ５はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ＋　ＣＡ） より入手したプラスミドｐＣＤＭ８の修飾体であり、そしてサイトメガロウィル ス即時型プロモーターを有する。プラスミドｐＰＡ１３３をＸｈｏＩ及びＮｏｔ Ｉにより分解してもし−ＰＡシグナル配列を切り放し、このシグナル配列を単離 し、そしてＸｈｏｌ及びＮｏｔｌにより分解されたｐＣＤＭ８の中にクローン化 し、これによってｔ−ＦＡシグナル配列がサイトメガロウィルスプロモーターの コントロール下となるようにした（図５参照）。

ｂ、ＴＭ類似体遺伝子を含む過渡表現プラスミド実施例１記載のＴＭ類似体遺伝 子配列を含むクローン化プラスミドをＢａｍＨＩ及び／又は８ｇ２１１及び／又 はＮｏｔＩによって分解した。このＴＭ遺伝子配列を単離し、そしてｔ−ＰＡシ グナル配列隣接のｐＰＡ１３３又はｐＴＨＲ５のいずれかと連結し、過渡的に表 現されたペプチドが細胞培養培地中に分泌されることを確実にした。プラスミド ｐＴＨＲ１３のモデルを図５に示す。表２にプラスミド及びその親株プラスミド を含むその他のＴＭＩＩ似体を個体する。プラスミドｐＴＨＲ１３は、クローン 化プラスミドｐＴ３０１をＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩにより分解し、そしてＴＭ ［似体遺伝子フラグメントをｐＴＨＲ５のＢｇｌ［［部位の中に連結せしめるこ とで作られた。ｐＴＨＲ１３はｔ　−ＰＡシグナル配列と連結可能なトロンボモ ジュリンの６ＥＧＦ様ドメインについてコード化する遺伝子配列を含む。

これらのプラスミドをＳＶ４０形賞転換アフリカ産グリーンモンキー腎臓細胞（ ＣＯ３−１）の中ヘリボッエフチン技術によって形質転換せしめた。コントロー ルとして、ＣＯ５−１細胞を親株細胞により形質転換せしめるか、又はリン酸緩 衝生理食塩水（ＰＢＳ）による偽似感染のいずれかを行った。ＴＭＩｉ似体の個 体を検定するため、プロティンＣ活性化アッセイを、コンディショニングされた 細胞培養培地を用いて行った。表７は過渡表現プラスミドのリストを示す。

実施例４．バクロウィルス　ベクターによ　感賞されたにお番るヒトトロンボモ ジュリン　の１゛告オートグラフア　カリフォルニア（Ａｕｔｏ　ｒａ　ｈ、ａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）核−ポリへドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）をヒトトロ ンボモジュリン（ＴＭ）のための表現ベクターとして用いた。特殊構造プラスミ ドを用いることにより、ヒトトロンボモジュリンの選ばれた部位に対する配列を コード化するタンパク質をヒボダーミンＡのシグナル配列に結合せしめた。この ハイブリドヒポダーミンＡ　−Ｔ　ＭＩＷ似体遺体遺伝子リヘトリン過渡シグナ ルの下流側に挿入し、そしてこのＴＭ−ポリへドリンハイブリド遺伝子を相同性 組換により、感染したＡｃＮＰＶ表現ベクターに転写した。このウィルスにおい て、野性型ＡｃＮＰＶポリヘトリン遺伝子は組換ウィルスにおけるＴＭ類似体遺 伝子により置換される。次いでスボドブテラ　フルギペルダ（Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅ ｒａｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ）（Ｓｆａ）細胞を、ヒトＴＭ類体生成物のために感 染せしめた。

ａ、ＡｃＮＰＶ転写ベクターの構造 ｉ、ヒボダーミンＡシグナル配列を有するベクター：ｐＨＹｌ及びｐｓｃ７１６ 二つのオリゴマー、ＣＯＤ＃１１９　Ｂ及びＣＯＤ＃１１９９を合成した（表６ 参照）。これらのオリゴマーはヒボダーミンＡシグナル配列、翻訳開始コドン、 ＢｇｌＩＩクローン化部位、上部位向ＢａｍＨＩ３’及び上流方向Ｋｐｎ１３’ を含む。ＣＯＤ＃１１９８及びＣＯＤ＃１１９９をアニール化し、ｐＵｃ１９誘 導体のｐｓｃ６５４にクローン化し、ｐＨＹｌを作った。図６参照のこと。

プラスミドｐＨＹ１をＢａｍＨ（及びＥｃｏＲＩにより制限し、ヒポダーミンＡ シグナル配列を切り離した。この配列を次いでｐｓｃ７１４と連結させ、ベクタ ーｐｓｃ７１６を作った。プラスミドｐｓｃ７１４はｐＶＬ１３９３の誘導体で あり、Ｓｕｍ＋ａｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌにより得られる。この二種の間の由−の 違いは、ｐｓｃ７１４においてＢｇｌｆｆ部位が破壊されたことにある。

ｉｌ、ヒボダーミンＡシグナル配列がＴＭアミノ酸２２７−４６２をコード化す る遺伝子と連結するベクターの構造。

ｐＬＩｃ１９ｐｃｒＴＭ７からのＢａｍＨＩ７ラグメントをｐｆ（ＹｌのＢｇｌ ｌＩ部位の中ヘクローン化し、ヒボダーミンＡシグナル配列がアミノ酸２２７と 隣り合う方向性を選んだ。

このプラスミドはｐＨＹｌｏｌである。

ｉｉｉ、ＡｃＮＰＶ転写ヘクターの構造：ｐＴＭＨＹＬＯ１プラスミド−Ｌ旦ヱ 」」」−を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩにより処置し、ＴＭ［遺体コード化配列と 連結するヒポダーミンＡシグナル配列が切り離された。シャトルベクターｐＶＬ １３９３は一部が欠落したＡｃＮＰＶポリヘトリン遺伝子及び独自のＢａｍＨＩ 、並びにＥｃ　ｏＲＩクローニング部位を含む。ｐＨＹ１０１由来のＢａｍＨＩ ／ＥｃｏＲＩフラグメントをポリへドリンプロモーターの下流に挿入し、これに よりプラスミドｐＴＭＨＹ１０１であってそのバイブリド遺伝子がポリへドリン プロモーターのコントロール下にあるものが作られた。このプラスミドは図６に 示す。

Ｎ、その他のＡｃＮＰＶ転写ベクターの構造その他のＴＭＩＷ似体遺個体配列を 含む転写プラスミドを、前述と類似した方法を用いて組立てた。実施例１記載の クローン化プラスミド由来のフラグメントをｐｓｃ７１６のフレームにおいてク ローン化し、これによりＴＭ類似体遺伝子配列はヒポダーミンＡシグナル配列に 融合された。転写ベクター及びその中に含まれる遺伝子配列のリストについて、 表８を参照のこと。

ｂ、ＡｃＮＰＶ転写ベクターｐＴＭＨＹ１０２及びｐＴＭＨＹ１０３の構造 Ｂａ１Ｉクロ一ン化部位、上向きＢａｍＨＩ３’及び下向きＫｐｎ１３’を含む 新規のシグナル配列を合成した。この合成フラグメントを、ｐＨＹ２の製造に記 載の通り、アニール化し、そしてｐＳＣ６５４にクローン化した。

ヒト類似体１１／６又はヒト類似体１１／２を含む新規の遺伝子を実施例１記載 の通りに、重合連鎖反応においてヒトＤＮＡを用い単離した。このプライマーは ５′末端及び終止コドンにＢａｌＩ部位を、そして３′末端にＥｃｏＲＩ部位を 導入する（表３参照）。Ｂａ１Ｉ及びＥｃ　ｏＲＩによる処理後、この遺伝子を 、ｐＨＹ２であってこれもまたＢａ１ｌ及びＥｃｏＲＩによって処理されたもの へクローン化した。

このＥＣＯＲＩはｐＨＹ２を作るために用いられるオリジナルのｐＳＣ６５４ベ クターにおける固有の部位である。この新規プラスミドｐＨＹ１０２及びｐＨＹ １０３は、類似体１１／６及び類似体１１／２それぞれの遺伝子と融合したヒボ ダーミンＡのシグナル配列を含む。

プラスミドｐＨＹ１０２及びｐＨＹ１０３をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによって 処理し、そして切り離されたフラグメントを、ｐＶＬ１３９３に、その固有のＢ ａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、バイブリド遺伝子がポリへドリン プロモーターのコントロール化にあるプラスミド、ｐＴＭＨＹ１０２及びｐＴＭ ＨＹ１０３を作った。

Ｃ１遺伝子のＡｃＮＰＶゲノムへの転移ヒポダーミンＡシグナル配列及びＴＭ類 似体コード化配列をコード化した遺伝子を含むプラスミドｐＴＭＨＹ１０１、ｐ Ｔ）（Ｒ２２、その他を、インビボ組換によりＡｃＮＰＶゲノムに転移させた。

昆虫細胞のために改良されたリン酸カルシウム沈殿技術をＳｕｍｍｅｒｓ　ａｎ ｄ　Ｓ＋ｗｉｔｈに従って利用した。簡単には、個々の転移ベクター及びＡｃＮ ＰＶ　ＤＮＡをｓｆ９細胞の中に基本的に以下の通りに一緒に形質転換せしめた 。

Ｔ２５フラスコに２Ｘ１０’個の細胞を摂取せしめた。細胞が接触し合うよう室 温で１時間放置した。リン酸カルシウムにおいて沈殿せしめた転移ベクター１μ ｇ及びＡｃＮＰＶＤＮＡＩμｇをＳＦ９細胞と４時間インキュベートした。次い で１０％ＦＢＳの供給されたＴＭＮ−ＦＨ培地を補給した。

これによりストックウィルスが作られた。

プラスミドｐＴＭＨＹ１０２及びｐＴＭＨＹ１０３上に含まれる遺伝子をＡｃＮ ＰＶゲノムの中に、前述と同様の方法で転移させた。

ｄ１組組換ウィルス検定及び精製 組換ウィルスを検定するため、プラークアッセイを行った。

この形質転換ストックを形質転換７日後、１０−’、１０−’。

１０−”に希釈した。βつ”ラクトシダーゼがポリへドリンプロモーターのコン トロール下にあるコントロールベクターもこの実験系に含ませた。結果が示すに は、Ｘ−ｇａｌによりアッセイしたコントロールベクターは平均２％の組換青味 を帯びたプラークを提供した。約２％の閉塞症に陰性の組換ＴＭプラークが観察 された。ＴＭ転移ベクターにより形質転換された細胞由来の閉塞症に陰性のプラ ークを採り、そして１０−’。

１０−”及び１０弓希釈のプラークアッセイに散布した。７日目に、このプレー トは１００％純粋な閉塞症に陰性の組換プラークを示した。目的の各ＴＭ類似体 （６ｈ／２２７−４６２．６ｈ／２２７−４６２：２２７−４６２，６ｈ／３５ ０−４６２，６ｈ／２２７−４９７他）の単一コロニーを更なる研究のために選 別した。

ｅ、可溶性トロンボモジュリン類似体の製造。

ｉ、同時形質転換ストックによる７Ｍ活性の提供２Ｘ１０”ｓｆ９細胞を前述の 形質転換ストック１１１１に感染せしめた。３日目に、この細胞を沈殿させ、そ して無血清Ｅｘｃｅ　１１４００培地（ＪＲ５ｃｔｅｎｔｉｆｉｃ）中で更に３ 日間再懸濁させた。上清を集め、アッセイしたとき７Ｍ活性の存在を示した。

ｉｉ、ウィルスストックの生育。

Ｔ２５フラスコに１．５Ｘ１０”１５ａ＋ｌのｓｆ９細胞を摂取せしめた。単離 した組換プラークを採り（前述参照）、そしてウィルスストックのため、これを ＦＢＳＩＯ％の添加されたＴＭＳ−ＦＨ培地中のｓｆ９細胞に感染せしめた。３ 日目に、培養物の上清を集め、そしてそれらは７Ｍ活性を含むことを示した。

ｉｉｉ、組換ＡｃＮＰＶによる７Ｍ活性の形成３０ｍ１の振騰フラスコ５個に２ Ｘ１０７個の細胞を摂取せしめ、そしてこれに前述調製組換ウィルスストック２ ｍｌを感染させた。スピナーフラスコも前述調製ウィルスストンクの１つで感染 せしめた。４日目、上清を集めアッセイした。結果が示すには、組換体ＡｃＮＰ Ｖ　６ｈ−２２７／４６２（及びその他）により感染された昆虫細胞はトロンボ モジュリン活性を提供した。

■、その他の組換体による７Ｍ活性の形成前述のウィルスストックの同時形質転 換及び製造のための方法を、その他のＴＭＩＷ似体で似体て６ｈ／（２２７−４ ６２）２．６ｈ／３５０−４６２．６ｈ／２２７−４９７他を含むものを分泌す る感染昆虫細胞を生産するために用いた。

実施例５．ＴＭ　：ｔ−ＰＡキメラタンパクフィブリン溶解酵素とトロンボモジ ュリンポリペプチド配列とのキメラ融合体をコード化する遺伝子の組立てのため にｔ−ＰＡ遺伝子を利用した。この目的のために用いたｔ−ＰＡ遺伝子はプラス ミドｐＰＡＯＯ３（ＡＴＣＣ保存、添付階６７２９３）から単離された。プラス ミドｐ　ＰＡＯ０３は、本明細書に参照文献として組入れた、共同特許出＠Ｕｓ ｓＮＯＯ３゜６１１に詳しく記載されている。表７及び表８は、哺乳動物表現プ ラスミド、及びｔ−ＰＡ遺伝子と融合したトロンボモジュリン類似体遺伝子を含 むバクロウィルス形質転換プラスミドのリストが記載されている。

ａ、ｒ＃ｉ乳動物細胞において合成されたＴＭ異型体ｉ、ｔ−ＰＡのＮ末端に融 合したＴＭｍ４以体前起体前記例に記載のＴＭＩＩ似体遺転体遺伝子末端は全て 、終止コドンを有しておりｔ−ＰＡのＮ末端に融合したトロンボモジュリン遺伝 子配列を含むキメラタンパク質を作るため、これらは除去されなくてはならない 。ＰＣＲにおける有用なプライマーは、それらがＴＭｉ似体似体ＮＡ配列の中に 組込まれたときに３′末端の終止コドンが削除され、そしてＢｇＩ１１部位が導 入されるような状態となるよう合成した。ＴＭ遺伝子の５′末端は変更しなかっ た。これらプライマーは、実施例１記載のＴＭＩ似体遺体遺伝子彩なフラグメン トを合成するＰＣＲの系列において用いられる。これら新規のＴＭ類似体遺伝子 を実施例３記載の二つの過渡表現ベクター、ｐＰＡ１３３又はｐＴＨＲ５のいづ れかに連結せしめ、これによってＴＭ類似体遺伝子はｔ−ＰＡシグナル配列と融 合し、そしてＢｇｌＩＩ部位がその後に続く。これらのプラスミドをＢｇｌＵに よって処理し、ｔ−ＰＡのアミノ酸４がら５３０を完全にコード化する遺伝子を 挿入した。このフラグメントを表３に示すプライマーを用いて、ＰＣＨによって 作った。

得られるプラスミドは、融合タンパクであってｔ−ＦＡ由来シグナル配列、その 後に続＜ＴＭ類位体より成る、ＳＶ４０又はサイトメガロウィルスプロモーター のいずれかのコントロール下で成熟ｔ−ＰＡと融合するものをコード化する遺伝 子を含む。

ｉｉ、ｔ−ＰＡのＣ末端に融合したＴＭ類似似体−ＰＡ遺伝子の３′末端の終止 コドンを前述と同様の方法で削除した。新規ＢｇｌｌＩをアミノ酸５３０のプロ リン３′隣接位置に導入し、また終止コドンを削除、且つ天然ｔ−ｐＡ遺伝子配 列において見い出せるＢｇｌ　Ｉｆ部位の代りにＢａｍＨＩ部位をアミノ酸４の 位置に作るＰＣＨのために、２つのプライマーを合成せしめた。ＰＣＲの鋳型と して用いたｔ−ＰＡ遺伝子をプラスミドｐ　ＰＡ５０９から単離した。このプラ スミドはＡＴＣＣに貯蔵され（添付番号＃６７４４３）、そして本明細書に参照 文献として組入れた共同特許出１［ＵｓｓＮＯ７４゜０８３に詳しく記載されて いる。この新規のｔ−ＰＡ遺伝子フラグメントをｐＴＨＲ５のＢｇｌＩＩ部位に 挿入し、ｔ−ＰＡ遺伝子がｔ−ＰＡシグナル配列と融合し、プラスミドｐＴＨＲ １６が作られるようにした。図７参照のこと。

ＢｇｌｌＩ及び／又はＢａｍＨＩにより分解されたトロンボモジュリン遺伝子配 列をｐＴＨＲｌ　６にＢｇｌＩ［部位に挿入して、可溶性の分泌される融合タン パク質であってそのＮ末端がｔ−ＰＡの天然Ｎ−末端であり、天然のｔ−ＰＡの Ｃ−末端とＴＭ類似体遺伝子のＮ−末端とで融合したものを作る。

これらの融合ペプチドの図解例を図２Ｂに示す。ＴＭの６ＥＧＦ様ドメインと融 合したｔ−ＰＡのＤＮＡ及びアミノ酸配列を表９に示す。

ｂ、昆虫細胞において合成されたＴＭ異型体昆虫細胞における表現についてのＴ Ｍ異型体遺伝子配列を前述と同様の方法により組立てた。例えば、一つのＴＭ異 型体を製造するためのプラスミドであって、６ＥＧＦがｔ−ＰＡのＮ末端と連結 可能なものを、Ｎｈｅｌ及びＮｏｔＩによりプラスミドｐＴＨＲ６ｕ分解せしめ 、そして同様の酵素で分解した後のｐＴＨＲｌｏにこの遺伝子フラグメントを挿 入することで組立てた。ｐＴＨＲ６は、哺乳動物細胞における表現のためｔ−Ｐ Ａと融合した、６ＥＧＦを含む過渡表現ベクターである。ｐＴＨＲＬ　Ｏは６Ｅ ＧＦ様ドメインについての遺伝子配列を含むバクロウィルス形質転換ベクターで ある。

得られたプラスミド、ｐＴＨＲ２５は６ＥＧＦ様ドメイン及びバクロウィルス形 質転換ベクターにおけるｔ−ＰＡを含む。

５ＥＧＦ様ドメインがｔ−ＰＡのＣ−末端と融合する他の例において、ｐＴＨＲ ｌ７から切り離されたＳｍａ　Ｉ−Ｎ。

ｔｒフラグメントであって６Ｅ（：、Ｆドメインを含むものをｐＴＨＲ１２のＳ ｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ部位に連結させた。

実施例６．ＴＭ　’　６ｈ　２２７−４６２の　１ＴＭ類イ以体６ｈ／２２７− ４６２　を、　ＡｃＮＰＶ−６ｈ／２２７／４６２によって怒染せしめた細胞の コンディションニングされた培地から、細胞残骸の除去、そしてその後の５段階 のクロマトグラフィー：１）Ｑセファローズ、２）トロンビンアフィニティー、 ３）ゲル濾過、４）陰イオン交換、及び５）第２ゲル濾過工程により精製した。

第２クロマトグラフィ一段階（トロンビンアフィニティー）後、実質的に純粋な ６ｈ／２２７−４６２　（＞９５％）が得られるが、しかしながら、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲル上での分析を行った場合、類似体６ｈ　２２７−４６２の複数の活性 形態が観察された。

これら種々の形態はＭｏｎｏ　Ｑ樹脂による陰イオン交換を用い、互いに分離せ しめられる。ゲル濾過段階は緩衝液の交換に、有効である。全てのクロマトグラ フィ一段階は４°Ｃで行った。

ａ、材料 いくつかのクロマトグラフィー樹脂を商業的に入手した。

Ｑセファローズ及びセファデックスＧ２５はＳｉｇｍａ（ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｏ）から購入し、そしてＭｏｎｏ　Ｑ　５１５ＴＭはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ ＫＢ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）から購入した。

ＤＭＰ−１−ロンビンアガロースを、およそ以下の通りに調製した：２Ｏｎ＋Ｈ のリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）１００ｉｌ中の牛トロンビン３６０ｎ＋ｇを ５０％のアフィゲル１０樹脂スラリー約１００ｏ＋１に加え、そして４°Ｃで一 夜撹拌した。このアフィゲルエＯを製造者詳述の通りに調製し、そして添加緩衝 液により平衡化させた。残余活性エステルは、０．１Ｍのグリシン（ｐｔ１５． 　６）を加え、４°Ｃ１時間によってブロックした。次いでこのゲルを３０ｍＭ のトリスＩ（ＣＬ　２ＭのＮａＣ１、ｐＨ７，５で平衡化し、そして最終濃度約 １ｍＭのＤＦＰとなるようＤＦＰを２０μｌ加えた。４℃での１６時間の撹拌後 、更に６μｍのＤＦＰを加え、そして更に４時間撹拌し続けた。次いでこの樹脂 を２０ｍＭのトリス−ＭＣＩ、２ＭのＮａｃｌｐＨ７，５で洗浄し、４°Ｃで保 存した。

トロンビン活性をＫａｂｉ　Ｓ−２２３８基質を用いて測定し、そして〉８６％ のトロンビンがこの溶液から除去され（おそらく樹脂と結合したことを示す）、 樹脂１＋＋１当りに最終濃度約６ｍｇのトロンビンが示された。ＤＦＰ処理樹脂 の酵素活性は出発活性のく１％であった。

ｂ、純粋６ｈ／２２７−４６２の製造 コンディショニングした培地を集め、そしてマイクロボン（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ） ０．３平方フイートホローフアイバーフイルターユニツト上でクロスフロー濾過 によりｐＨ約６．０で濾過し、次いで超純水で５０％に希釈した。ｐＨを氷酢酸 により約６．２から約５．２のｐＨに調整した。調整した培地を次に、約１１０ −１５０ｍｌ／分の流速でＱセファローズ樹脂カラム上に添加した。カラムは予 め、約４カラム容量の洗浄バッファー１（１１７ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０ ２％のＮａ　Ｎｘ　、ｐＨ５，０）により平衡化させた。添加後、カラムをバッ ファー１で洗浄し、次いでバッファー２（２５１１Ｍの酢酸ナトリウム、０．１ ＭのＮａ　Ｃｌ、ｐＨ５，０）で洗浄し、そしてＴＭＷ似体似体、３ＭのＮａＣ １を含むバッファー２（ｐＨ５，０）で溶出させた。このカラムマトリックスは バッファー２＋２．０ＭのＮａＣ１で洗浄することで再利用できる。

プロティンＣ活性化活性において測定される活性を含むカラム画分（実施例１１ 参照）をプールし、そして０．３ＭのＮａＣｌ、２０ｄのトリス−ＨＣｌ、０． ５ａ＋ＭのＣａＣ１ｚ、０．０２％のＮａＮｘ　、ｐＨ７，５で３０％希釈した 。このプールのイオン強度はおよそ０．３ＭのＮａＣ１溶液のイオン強度のもの であった。この調整プールを重力により、トロンビンアガロースカラムであって Ｑセファローズブールを希釈するのに用いた同じバッファーで予め緩衝化したカ ラム上に添加せしめた。このカラムを希釈バッファーで洗浄し、そしてＴＭ類似 体は１．５ＭのＧｕＨＣｌ、２．０ＭのＮａＣ１，２０−のトリスＨＣＩ、ｌｌ １１ＭのＮａＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ、、ｐＨ７，５によりマトリックス から除去させた。

Ｃ９純度の評価 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をＬａｅｍｍｌｉの方法により、スタッ キングゲルにおいて３．３％のアクリルアミド、ランニングゲルにおいて１２． ５％のアクリルアミドを用いて行った。還元していないサンプルをＬａｅｍｍ１ １サンプル溶解バッファー（５０ｆｆｉＭのトリスＨＣ１％ｐＨ６，８，２５％ のグリセロール、２％のＳＤＳ及び０．０１％のブロモフェノールブルー）に希 釈し、ゲル上に直接添加した。還元サンプルは１０ｍＭのジチオスレイトールを 含むサンプル溶解バッファー中で１００°６１７分間インキュベートしたもので ある。インキュベーション後、最終濃度５０ｍＭとなるようにイオドアセタミド を加え、そしてこのサンプルをゲルに添加前に室温で更に５分間インキュベート した。ファルマシアＬＭＷキャリブレーションキットタンパク質標準物をＭＷマ マ−−として用い、そしてゲルは銀染色した。

還元アルキル化条件のもとで、単一のブロードバンドが約５３ｋＤａに見られ、 非還元条件のもとでは約３１及び約３６ｋＤａに２木兄られ、更に少量のより大 きいＭＷの物質も見られた（約５２ｋＤａの見かけ上分子量を有す）。２本のバ ンド両者は、このバンドのＳＤＳゲルからの溶出、そしてその後のプロティンＣ 活性化アッセイにより活性を有することが示された。非還元ゲルにて認められた ５　２　ｋＤａ　’ｌｌＪ質であって、ゲルスキャニングにより総タンパク質の １０％を見込まれたものも、活性トロンボモジュリン由来のものと思われ、なぜ ならプロティンＣ活性化アッセイにおいて、溶出せしめた高ＭＷハンドは活性有 していたからである。それ故、非還元ゲル上に見い出せた全ての物質はＴＭ活性 を有していた。非還元ゲルに見られる低ＭＷバンドは単離したタンパク質の主な 形態又は種類である。好ましいペプチドの分子は、他の低活性トロンボモジュリ ン様ペプチドを有さない高ＴＭ活性を有するペプチドである。この好ましい分子 は移動度の遅い、二つの低ＭＷハンドに相当する。このようなペプチド分子は、 この特定のペプチドについて予想される、期待通りの見かけ上分子量を有する単 一分子を、非還元クロマトグラフィーのもとて提供せしめるため、精製した。

このＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２遺伝子は、アミノ酸３６４及び３９１に２ つの潜在Ｎ−結合グリコシル化部位並びにアミノ酸３１９及び３９３に２つの潜 在〇−結合グリコシル部位を有する。トロンビンアフィニティー精製生成物は、 Ｎ−グリセロールでの処理によりグリコジル化され、見かけ上約２０００ダルト ンのＭＷの低下がもたらされた。

ｄ、アミノ酸組成及びシーケンシング。

ｉ、サンプルの調製。

予想生成物が１８個のジスルフィド結合における３６個のＣｙｓ残基を有するた め、サンプルはＮ−末端分析の前に還元し、且つアルキル化した。トリスバッフ ァー中のグアニジンを生成物１．５ｎ＋１（約３４３５　ｐｍｏｌｅｓ、９０μ ｇ）に加え、最終濃度が３．　０ＩＩ１１の容量において４Ｍのグアニジン、０ ゜１Ｍのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８，５とした。

得られた溶液を、ジスルフィドに対して４３倍モル過剰のＤＴＴ　（２，６７ｕ ｍｏＬｅｓ　、最終濃度Ｏ，ｒ７μＭ）により還元し、次いでＤＴＴに対して２ ．６倍過剰モルのヨード酢酸（６，９４ｇｍｏｌｅｓ　、最終濃度２．３ａＭ） の添加によって、からＣＨ３ＣＮ　７５％＋ＴＦＡ０．１％迄の直線勾配により 精製した。この還元及びアルキル化処理により、単一タンパク質ピークのみが得 られた。アミノ酸分析のため、アリコートを５ａｖａｎｔエバポレーター中で乾 燥せしめた。

ｉｉ、アミノ酸分析 アミノ酸組成を前述の通り、比活性の測定において分析し、それは加水分解段階 より出発する。見い出せたアミノ酸組成は期待していたものとよく一致した（表 ４参照）。例外はトリプトファン及びシスティンであって、これらはここで用い た方法によっては正確に分析されなかった。

市、シーケンシング アミノ酸配列分析はアプライドバイオシステムプロティン／ペプチドシーケンサ −（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ 　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）　（モデル４７７．９００Ａデーターモジユールと連結 ；又はモデル＃４７０Ａ、チャートレコーダーと連結）において行った。フェニ ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸をＢｒｏｗｎｌｅｅ　ＰＴＭ−Ｃ１８カ ートリッジ（２，Ｉ　Ｘ２２２ｍ５）を用いた逆相ＨＰＬＣにより、１２０Ａア プライドバイオシステムＰＴＨ分析器でのオンライン上にて同定した。

前述の通りに精製した還元−アルキル化サンプルは、以下の配列を提供した： Ａｌａ−Ｖａｌ−νａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（５）−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖ ａｌ−Ｇｌｕ（１０）−Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ／Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ 　（１５）　−Ｈｌｓ−Ａ　１ａ−Ｃｙｓ／Ｇｌ　ｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ　（２０ ）　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ　Ｉａ　−Ｐｒｏ　（２５）　−Ａｒｇ−Ｃ ｙｓ／Ｇｌｕ−Ｇ　Ｉｎ−ｘｘｘ−Ｐｒｏ　（３０）　−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌ ａ−ｙｙｙ−Ｌｅｕ（３５）−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ　。

見い出せた配列は、クローンされた物質に予想されるものと非常によく一致した 。複数の位置（即ち、１４，１８．２７）において、ＣｙｓとＧｌｕの区別がで きず、そして位置２９において、Ｃｙｓについての明白なシグナルが確証できな かった。また、配列Ａｌ　ａ−Ａｌａ　（３３−３４）のため、第２のＡｌａ　 （ｙｙｙ）は明白に認められなかった。その他の全ての残基は、ＤＮＡ配列から 予想されたものであった。

ｅ８種々のＴＭ類似体分子の選別。

ｉ、バッファー変換 実質的に純粋な、活性ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２をセファデックス０２５ カラムに適用し、そして０．２％のＮ−二チルモルフォリンアセテート（ＮＥＭ ）　、ｐＨ１，０において回収した。この段階で、ＧｕＨＣｌ及びＮａＣｌは除 去される。

１１、陰イオン交換クロマトグラフィー前述の通り、複数の形態のＴＭ［転体が 、非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流したトロンビン−アフィニティー 精製物質において検出された。このような変異体を解決せしめる方法が開発され た。セファデックスＧ２５カラムから集めたＴＭ類僚体６ｈ／２２７−４６２を 、０．２％のＮ−エチルモルホリン（ＮＥＭ）　、ｐＨ７，０により予め平衡化 させたＭｏｎｏ　Ｑカラムに適用した。このバッファーでの洗浄後、種々の型を ０〜０．４ＭのＮａＣ１の勾配を利用して分離せしめた。溶出液及び活性のプロ フィールを図９に示す。

各両分のサンプルを非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって評価した。

わずかな移動度の違いにより区別できる３つのバンドが染色ゲル上に見られた。

同じ移動度を存するペプチドを含む百分をプールしくＡ＝ｆｘｎｓ　３２−３５ ゜Ｂ＝ｆｘｎｓ　４０−４４．Ｃ＝ｆｘｎｓ７０−７１）、そして次に、総タン パク質含有量及びプロティンＣ活性化活性における活性について測定した。比活 性を以下の表に示す。

不活性ペプチドはいずれの両分においても検出されなかった。

−ル五１ユ見Ｚ■Ｌ Ｍｏｎｏ　Ｑ添加　１６６．０００±１２．０００ｆ　ｘ　ｎ　ｓ　３２−３５ 　４１６．０００：！：１９，０００ｆ　ｘｎｓ　４０−４４　２６２．０００ −４，０００ｆｘｎｓ　７０−７１　６７．６００±５．０００実施例１０．Ｔ Ｍ　４ｔ　２２７−４６２の　１コンデイシヨニングした細胞培養培地を集め、 そしてイオン強度をＩＭのＮａＣ１を用いて、０．３ＭのＮａＣｌのイオン強度 とおよそ同等になるよう調整せしめた。この調整培地を、予め０．３ＭのＮａＣ １，２０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２及び０．０２％のＮ　 ａ　Ｎ：ｌ　、ｐＨ７，５（洗浄バッファー）によって洗浄したトロンポンアフ ィニティーカラムに直接添加した。添加後、このカラムを洗浄バ、ツファーで洗 浄し、次いでＴＭ［転体をカラムから、１．５ＭのＧｕＨＣｌ、２．０ＭのＮａ Ｃ１，２０ｍＭのトリス、■１のＮａＥＤＴＡ及び０６０２％のＮａＮ＋により 除去した。

７Ｍ活性を含むピークを集め、そしてセファデックスＧ２５カラムに適用し、そ してバッファー交換（ＮａＣ１及びＧｕＨＣＩの除去）を行うため、０．２％の ＮＥＭで洗浄せしめた。この活性画分をプールし、そして０．２％のＮＥＭ％ｐ Ｈ７，０においてＭｏｎｏ　Ｑ５１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

ＬＫＢ）カラムに適用した。このＴＭｌ［転体を０．２％のＮＥＭ、ｐＨ７，０ における０〜０．６ＭのＮａＣ１勾配によって選択的に溶出せしめた。７Ｍ活性 を含む画分をプールし、そしてこのサンプルを還元及び非還元条件下の両者で、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した。ＴＭ類似体は約９０−９５％の純度として現 れた。残りの高分子量混在物質を分子排除クロマトグラフィーにより除去した。

Ｍｏｎｏ　Ｑカラムからの活性含有画分を凍結乾燥によって乾燥せしめ、そして １０％のＮＥＭ、ｐＨ７，０（３８０μｌ）に再懸濁させ、次いで５ｕｐｅｒｏ ｓｅ１２　（登録商標）　（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａ、　ＰｉｓｃａｔａｗａＶ、 　ＮＪ）に０．５ｍｌ／分で適用した。このクロマトグラフィ一段階から集めた 活性物質は銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析により９９％の純度のＴＭ類似体で あると見込まれた。

実施例７．トロンボモジュリン　゛　のアッセイアメリカンダイアグツステイカ （Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓ　ｔ　１ｃａ）より、ウサギトロンボモジ ュリン、ヒルジン及びヒトプロティンＣが供給された。ヒトトロンビンは擢々の 非商業的及び商業的媒体より入手できる。ウシトロンビンはＭｉｌｅｓ　Ｌａｂ ｓ、口ａｌｉａｓ、　Ｔｅｘａｓから購入した。Ｄ−バリル−し−ロイシル−し −アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２６６）及びＤ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ− Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）はＫａｂｉダイアグノスチイ力か ら購入した。

ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、クエン酸ヒト血小板、及びＡＰＴＴ試薬はＳｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌより購入した。マイクロタイタープレートはＣｏｒｎ ｉｎｇ　（＃２５８６１−９６）から供給された。その地金ての試薬は、入手で きる最高のグレードのものとした。

ｂ、方法及び結果 ｉ、プロティンＣ活性化活性（色素源）このアッセイは、以下の各タンパク質２ ０μｌをマイクロタイタープレート中にて混合せしめることにより行った：トロ ンボモジュリンサンプル（未知のもの又は標準品）、トロンビン（３ｎＭ）及び プロティンＣ（１，５μＭ）。各タンパク質のためのアッセイ希釈液は２０ｎ＋ ＭのトリスＨＣＩ、０．１ＭのＮａＣ１，２５１ＭのＣａ　Ｃ１ｚ　、５ｍｇ／ ｎ＋ＩのＢＳＡ。

ｐＨ７，４であった。ウェルは、アッセイ希釈液に２０μｌのヒルジン（０，１ ６ユニツト／μｌ、３７０ｎＭ）の添加及び更なる１０分間のインキュベーショ ンによるプロティンＣの活性化の停止後、３７℃で２時間インキュベートした。

得られる活性化プロティンＣの値は、１．０ｍＭのＳ−２２６６１００μＩ（希 釈液中）の添加、及びこのプレートを３７°Ｃでインキュベートし続けることで 検出された。各ウェルにおける４０５ｎＭの吸収をＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖ ｉｃｅｓプレートリーダーを用いて１０秒置きに３０分間にわたり測定した。吸 光度データーを記録、そして各ウェルにおける１秒ごとの吸光度の変化を計算し た。１秒ごとの吸光度の変化は活性化プロティンＣのｐａＩｏｌｅ　／ｍｌと比 例した。この速度は全活性化プロティンＣの濃度の変化を利用することで経験的 に決定できる。１００％の活性化プロティンＣを含むサンプルはＯ〜１．５μＭ のプロティンＣを６０ｎＭのウサギＴＭ及び３０ｎＭのトロンビンと混合せしめ 、０〜４時間時間インキ−ベートヒルジンを添加し、そして前述の通り３２２６ ６活性を測定することにより生成される。プロティンＣが１００％活性化された 状態を、３２２６６活性（Ａ４０５／秒）がプラトーに到達したものとして定義 する。

活性の単位は、前述に定義した試薬条件下での、ｍｌ／分当りに発生する１　ｐ ｍｏｌｅの活性化プロティンＣとして定義する。

ウサギＴＭ及び類似体６ｈ／２２７−４６２を含むコンディショニングした培地 の両者の、本アッセイにおける応答を図１０Ａに示する。図１０Ｂにおいて、精 製ＴＭ類似体による高められたプロティンＣ活性を示す。

あるケースにおいて、この報告される活性値はウサギトロンボモジュリンを標準 として計算される。タンパク質の￥ｉ″量を措定するためのアミノ酸分析を用い ることにより、］　ｎｍｏｌｅのＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２は１　ｎｍｏ ｌｅのウサギトロンボモジュリンと同等の活性を有することが分った。

プロティンＣ活性化増強活性を示すその他のＴＭＩ似体転体、４ｔ／２２７−４ ６２，４ｔ／２２７−４６２：２２７−４６２．ＰＡ：２２１−４６２　（哺乳 動物細胞）、６ｈ／２２７−４６２　：　ＰＡ、６ｈ／２２７−４６２　：　２ ２７−４６２、ＰＡ：２２７−４６２　（混虫細胞）、６ｈ−３５０−４６２、 及び６ｈ／２２７−４９７が含まれる。

ｉｉ、ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２の比活性の測定。

ＴＭ！（起体サンプルを０．２％のエチルモルホリンアセテート ノ酸組成についてアッセイした（透析による活性の損失は無い）。サンプルは分 析のため、サンプルを６０００　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ膜を用いて０．２％のＮ −エチルモルホリン−アセテート、０．０２％ＮＰ−４　０、９Ｍ７．５中にて 透析し、そして加水分解チューブ内で乾燥せしめることで準備した。加水分解は 蒸発チューブ内にて、１％フェノールを含む６Ｎの常時沸騰ＭＣＩを用いた蒸気 相において１１０°Ｃで２２時間行った。アミノ酸分析は、サンプルを乾燥せし め、そしてフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を導入後、行った。これら を、４μｍのアルキル結合（Ｃ１８）シリカカラム上の逆相ＨＰＬＣにより、２ ５４ｎｍの検出で分析した。

りＯ？トゲラムは溶出液Ａ（１３１ｍＭのＮａＯＡｃ，ｐＨ６。

４、０．０４７％のＴＥＡ、ｌｐｍのＥＤＴＡ）から溶出液Ｂ（水中の６０％の ＣＨ３ＣＮ）への勾配により成された．Ｐｉｅｒｃｅタンパク質加水分解物を標 準品として用い、ノルロイシンを内在コントロールとして組入れた。アミノ酸組 成からｎモル単位のタンパク質を、ＴＭＩ似体転体ｈ−２　２　７／４６２ペプ チドについての分子量値２６，２００を用いて、ｎｇ単位に換算した。サンプル はこの色素アッセイにおいて１ｎｇのタンパク質当り０．２５−Ｌ−・ント、又 は２５０，０００ユニット／ｍｇの活性を有していた。

市．活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の阻害 クエン酸血漿由来の凝集物の形成は、エラグ酸（ＡＰＴＴ試薬）及びカルシウム イオン中への脳セファリンの添加によって引き起こされる。凝集物の形成に必要 な時間は再現され、そしてトロンボモジュリンの添加に比例して増加する，ＡＰ ＴＴのための試薬を混合せしめる前に３７℃でインキュベートするが、ただしク エン酸血漿は４“Ｃに保った。

この反応は以下の通りに行った：　Ｓ　ｉ　ｇｍａクエン酸血漿１００ｇ２をプ ラスチックキュベツト（Ｓａｒｓｔｅｄｔ；＃６７、７４２）に加え、３７°Ｃ で１分間インキュベートし、Ｓｉｇｍａ　ＡＰＴＴ試薬を加え、そしてこの混合 物を３７°Ｃで２分間インキュベートシ；試薬すンプン（又はコントロールバッ フｙ　）１００μｌ及び２５ｍＭのＣａＣＩｚｌｏｏ・μｌを加え、そしてこの キュベツトを測定の間３７°Ｃに保つための循環湯浴の備ったＨｅｗｌｅｔｔ− Ｐａｃｋａｒｄ８４５１Ａ分光光度計にすばやく移した。３２０ｎｍでの光散乱 に基づく吸収を、Ｃ　ａ　Ｃ　ｌ　ｚを添加してから１５〜１２０秒の間、０． ５秒置きに測定した。時間に対する吸収のプロットはシグモイド型曲線を提供し 、凝集時間は曲線の変曲点に相当する、スロープが最も急勾配な時間として定義 する。

ＡＰＴＴアッセイにおける純粋な類似体６ｈ／２２７−４６２についての希釈曲 線を作成した（図１１Ａ参照）（示したμｇ値は１００μｍのサンプル量におけ るものである）。

ＡＰＴＴの長期化は投与量依存状態にあった。

精製６ｈ／２２７−４６２をＡＰＴＴアッセイにおいて、ヘパリン及び抗血栓剤 ■と比較した。図１１Ｂで分る通り、ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２は、ヘパ リン又はＡＴＩｆｆのいずれよりも少ない量でＡＰＴＴをより長期化する能力を 示した。この実験に用いたヘパリン及びＡＴｎの量はインビボで有効な投与量で はなく、これによりＴＭ類似体はいずれよりもより有効であることが考えられる 。

ｉｖ．）ロンビン凝血時間（ＴＣＴ）及びプロトロンビン反応（ＰＴ）の阻害。

ＰＴ及びＴＣＴの両者を、ＡＰＴＴのために用いるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａ ｒｄ　８４５２　Ａダイオード配列分光光度計を用いて測定した。ＰＴ反応のた め、ＴＭ類似体６ｈ／２　２　７−４　６　２又はＰＢＳいづれか９０μｍ、を キュベツト中のトロンボプラスチン２０μｌ及び２５＋ａＭのＣ　ａ　Ｃ　ｌ　 ｚ９０μｍに加えた。この混合物を３７℃で１分間インキュベートし、次いでク エン酸血漿１００μＩを加えた。このキュベツトを分光光度計に移した後、３２ ０ｎ＋ｗの光散乱に基づく吸収を、血漿添加から１５〜１２０秒の間、０．５秒 ごとに測定した。時間に対する吸収のブロンドはシグモイド型曲線を提供し、凝 集時間は曲線の変曲点に相当する、スロープが最も急勾配な時間として定義する 。

ＴＣＴも同じ方法で評価した。出発反応混合物は、クエン酸血漿１００μｌ、１ ００ｍＭのＣａＣｌｚ２５μｍ及びＰＢＳ又はＴＭ類４り体のいづれかを１６２ ．５μｌ含んだ。１分後、１２．５μｍのトロンビンを加えた。凝集時間は前述 の通りに測定した。

図１２は、ＴＭＭ似体転体／２２７−４６２がＰＴ及びＴＣＴの両方を長期化す ることを示す。

■．直接的抗凝血活性ーフィプリノーゲンからフィブリンへのトロンビン触媒転 換の阻害。

トロンビン及び種々の量のＴＭ［転体６　ｈ／２　２　７−４　６２をマイクロ タイタープレートウェル中で３７°Ｃ，２分間インキュベートした。開始反応全 容量は５０μｌであった（ＰＢＳ＋７．５ｍＭのＣ　ａ　Ｃ　ｌ　ｚ及び９０ｎ Ｍのトロンビン）。

初期インキュベーション後、３　、７　５　ａ＋ｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲ ン１００μｌを各ウェルに加え、そしてトロンビン誘導フィブリン形成はＭｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　Ｖｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅ ｖｉｃｅｓ＋　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，　ＣＡ）にて４０５ｎｍの吸収の変化を 測定することで追った。アッセイの終点は、最終的な吸光度の５０％が到達した 時間とした。残余トロンビン活性を、トロンビン標準曲線であってトロンビンの 濃度と凝集時間の関係を直線的に相関させたものと関連づけることによって決定 した。図１３に見られるように、ＴＭ［転体６ｈ／２２７−４６２は投与量依存 性において、フィブリノーゲンからフィブリンへの転換をするためのトロンビン の能力を阻害する。

■、血小板活性及び凝集の阻害。

ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２の血小板のトロンビン活性化への影響はＥｍｓ ｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：１２２ ３８−１２２４２の方法により試験した。このアッセイを用いて評価した場合、 ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２はトロンビンがもたらす血小板の活性化及び凝 集を阻害する。

■、フィブリン溶解−フイブリンブレートアッセイ。

ＴＭ異型体、ＴＭ類似体とｔ−ＰＡの融合物のフィブリン溶解活性を、Ｈａｖｅ ｒｋａｔｅｔ　ａｎｄ　Ｂｒａｋｍａｎ、　（１９７５）カＩＬユｎ　Ｃｈｅｗ 。

Ｆｉｂｒｉｎ、Ｔｈｒｏａ＋ｂ、　１　：　１５１−１５９に記載の通り、プラ スミノーゲンに冨むフィブリンプレート上でのゾーン浄化を利用して評価した。

ＴＭ異型体ＰＡ：２２７−４６２　（哺乳動物細胞）、ＰＡ：３５０−４６２　 （＠乳動物細胞）、６ｈ／２２７−４６２　：　ＰＡ、及びＰＡ：２２７−４６ ２　（昆虫細胞）全てはこのアッセイを用いてフィブリン溶解活性を示した。

報、因子■活性の阻害。

Ｐｏ１ｇａｒ＋　ｅｔ　ａｌ、＋　（１９８７）　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓ ｔａｓ、　５８　：　１４０の方法により、ＴＭ類イ以起体ｈ／２２７−４６２ はトロンビンによる因子■の活性化を阻害することが測定された。

ｉｘ、　７Ｍ抗血栓剤活性の更なる測定。

１　）　Ｅｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、　、　（１９８ ２）、　２５７　：　７９４４−７９４７の方法により、ＴＭ類似体はトロンビ ンによる因子Ｖの活性化を阻害することが測定された。

２）抗トロンビン■及びヘパリン共同因子■によるＴＭｉ似体転体ンビン複合体 の阻害を、Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６記載の通りに測定し た。

３）トロンビンによるプロティンＳの不活性化の、ＴＭ類似体の阻害を、Ｔｈｏ ｍｐｓｏｎ　＆　Ｓｅｌｅｍ、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、（１９８６） 。

７８（１）　：１３−１７記載の方法により測定した。

ＩＸ、　ＴＭ抗血栓活性の更なる測定。

Ｃ，インビボでのＴＭ＠似体転体性 ６ｈ／２２７−４６２のインビボ活性は、散在性静脈内凝血モデルのマウスにお いて試験した（Ｋｕｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）。

影μ星７１（３）　：　７２Ｂ−７３３）。６匹のマウス、３グループのそれぞ れを麻酔し、そして尾静脈を介してトロンビン３７．５ユニツトを注射した。こ れは死へ導く肺動脈塞栓症をその他の処置を受けないマウスに直ちに引き起こす 。２つのグループは、トロンビンのＩＸ又は２Ｘの濃度でＴＭ１１似体６転体２ ２７−４６２の注射により予め処置された（３分前に）。

６ｈ／２２７−４６２による処置を受けたグループはトロンビンの致命的な作用 から守られた。コントロールグループ（トロンビンのみ）における生存マウスは ３０分間にわたり昏睡状態にあったのに対し、予備処置されたグループは麻酔か らの回復後、直ちに正常状態となった。

実施例８１Ｌ剋及グ坦朋 大きな活性の損失を伴うことのない拘束のもとで、種々の溶液におけるＴＭ［転 体６ｈ／２２７−４６２の濃縮のための方法を開発した。

精製サンプルの多数のアリコートを、ＹＭ−１０膜の備ったＡｍ１ｃｏｎ　８５ ０撹拌セル濃縮器により、２０℃、４０ｐｓｉの窒素ガスでｆ！Ｉｌ縮した。

ｉ、２０ａ＋Ｈのトリス−ＨＣｌ、１．５Ｍのグアニジン〜ＨＣ１，２ＭのＮａ Ｃ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、０゜０９％ＮＰ−４０、ｐＨ７，５中のＴＭ類似体（ ７７４Ｕ／ｍｌ）を含むサンプル５６−１を、１５容量の０．０２％のアザイド を含む０゜２％のエチルモルホリン−アセテート（１７，４＋ｗＭ）により、２ 回バッファー交換を行った。２．３ａ＋１における最終濃度は２４、　１０８　 Ｕ／ａ＋１と換算され、そしてプロティンＣ活性化活性の回収率は９９％であっ た。

ｉｉ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１．ＯＭのＮａＣ１，Ｏ。

ｌａ＋ＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＮＰ−４０、ｐＨ７，５におけるＴＭ［転体（ ５４４Ｕ／ｍｌ）の溶液を、バッファー交換しないで５倍に濃縮し、オリジナル 活性の９５％の回収が得られた。

山、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１．０ＭのＮａＣ１，０゜１ｎＭのＥＤＴＡ、 ０．０２％ＮＰ−４０、ｐＨ７，５における７Ｍフラグメント（５４４Ｕ／ｍｌ ）の溶液１０ｍ１を、１０容量のＮ−エチルモルホリンバッファーで３回バッフ ァー交換して最終濃度１　、　５０９　Ｕ／ｍｌとし、オリジナル活性の６０％ の回収が得られた。

ｉｖ、２ＭのＮａＣ１，１，５Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ Ｏｎ＋Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５（ＮＰ−４０を含まず）におけるＴＭ　 １　、　９６０　Ｕ／ａｌを含むサンプルを、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏ ｎ　ＩＱマイクロ濃縮装置に用いて１０倍濃縮した。活性の回収率は＞９０％で あった。

更に、ＴＭ類似体は以降に記載の通り、乾燥、そして再溶解によって濃縮できる 。

ｂ、透析 透析にわたり、ＴＭ類似体は安定であることが示された。

透析は排除分子量１２，０００−１４，０００の透析チューブを用い、４°Ｃで 行った。２ＭのＮａＣ１，１，５Ｍのグアニジ７−ＨＣ１，１ｍＭ（７）ＥＤＴ Ａ、　２０ｍＭ（７）　ト！Ｊ　ス−ＨＣ１、ｐ）１７．５における精製ＴＭ類 似体（１，９２１Ｕ１０＋１）を０．２％のＮ−エチルモルホリン（ＮＥＭ）（ ｐＨ８，８）に対して透析した。活性における損失は検出されず、しがしながら タンパク質は１．　２倍に希釈された（最終濃度１，６６１Ｕ／ｍｌ）。

２ＭのＮａＣ１，１，５Ｍのグアニジン、１．０ｄのＥＤＴＡ、０．０２％ｆ７ ）ＮＰ４０を含む２０ｔｓＭＯ：）　）　’Ｊ　ス−ＨＣ１、ｐＦｒ７．　５に おける４　５０　Ｕ／ｍｌのＴＭ類似体を含む溶液を、Ｎ−エチルモルボリン− アセテートバッファー、ｐＨ７，５（ＮＰ−４０を含まず）に対して透析した。

活性の回収率は８５％であった。

Ｃ０凍結及び融解の間の安定性 ＴＭｉ似体転体結及び融解後の安定性を、種々の条件下で評価した。

出発材料として２０１Ｍのトリス−）１ｃＩ、１．０ＭのＮａＣ１，０，０２％ のＮＰ４０、ｐＨ７，５におけるＴＭ類似体の溶液を用いた。４つのアリコート それぞれを５倍に濃縮し、そしてそのうち３つは更に以下の溶剤１０容量により ３回バッファー交換を行った。それぞれ５回の凍結融解サイクルを行った（凍結 はドライアイス：メタノール中で、融解は室温中で）。

１）開始溶液濃度の５倍：ａ縮 ２）０．２Ｍのトリス−ＭＣＩ、０．０２％アザイド、ｐ）１７．５へのバッフ ァー交換後の５倍ｍ縮３）０．２Ｍのトリス−ＭＣＩ、０．２％のオクチルグル コシド、０．０２％のアザイド、９Ｈ７，５へのバッファー交換後の５倍濃縮 ４）０．２％のＮ−エチルモルホリンアセテート（１７゜４ｎ＋Ｍ）　、０．　 ０２％のアザイド、９Ｈ７，５へのバッファー交換後の５倍濃縮。

全てのサンプルは、凍結融解サイクルを行った後、〉９５％の活性の回収率を示 した。

ｄ、乾燥及び再溶解 ０．０２％のＮＥＭ　（ｐＨ８，８）の溶液０．５ｎ＋１におけるＴＭｉ似体転 体つの等量のアリコートをエッペンドルフチューブ中に調製し、そしてこれら２ アリコートのＮＰ−４０を０．０２％の最終濃度となるように加えた。アリコー トは５ａｖａｎｔミクロ濃縮器にて乾燥せしめた。ＰＢＳ　（リン酸緩衝生理食 塩水）又は０．２％のＮＥＭのいづれか５０μｌを、各サンプルを４　”Ｃで一 夜再懸濁せしめるために用いた。

プロティンＣ活性化アッセイは全てのサンプルにおいて行った。結果は表５に提 供する。

他の実験において、ＴＭ類似体６ｈ／２２７−４６２を精製せしめるため、サン プルセファデックスＧ２５においてＰＢＳとバッファー交換し、そして純水で５ 倍希釈した。０゜２２ｎ＋ｇのＴＭｉ似体転体パク質を含むサンプル１ｍ＋１を 凍結乾燥し、そしてこれを０．２ｍｌの水で再懸し、最終濃度を１゜１ｍｇ／ｍ ｌとした。９５％より大きい活性が回収できた。残余凍結乾燥タンパク質を一７ ０°Ｃで数週間保存し、再懸濁に基づく活性の損失は無かった。

これら実験は、以下の事項を示した。

ａ）ＴＭ類似体は、清浄剤の存在下で、トロンビン溶出バッファーから揮発性バ ッファーＮ−エチルモルホリン、ｐＨ８，８への透析を効率的にでき、 ｂ）ＮＥＭバッファー中のＴＭ類似体サンプルは凍結乾燥でき、そして塩、清浄 剤又はその他の安定剤の存在下で保存でき、 ｃ）ＴＭＩＷ似体の転体プルはＮＰ−４０を有するもしくは有さないＮＥＭ又は ＰＢＳのいずれかにおいて再溶解でき、生物学的活性はわずかに、又は全つく損 失しない。利用できるその他の塩には、ハイドロブロマイド、スルフェート、ア セテート、シトレート、マレート、ポレート、ラクテート、グリシン、グルタメ ート及びアスパルテート他が含まれる。

ｄ）サンプルは本工程により、少なくとも１．１ｍｇ／ｍｌ迄効率的に濃縮でき る。

実施例９．Ｅ、ｃｏｌｉにおけるＴＭ　″　の原核表現ベクターをＥ、ｃｏｌｉ におけるＴＭ類似体の表現のために組立てた。親株プラスミドはＡｍｅｒｓｈａ ｍより購入したｐＲＩＴ５であってプロティンＡプロモーターのコントロール下 のプロティンＡをコード化する遺伝子を含み、そしてプロティンＡシグナル配列 を有する。このプラスミドをＢａｍＨＩにより分解し、そしてプラスミドｐＵｃ １９ｐｃｒＴＭ７由来のＢａｍＨＩフラグメントを挿入した。このＢａｍＨＩフ ラグメントは、天然トロンボモジュリンの６ＥＧＦ様ドメインのための遺伝子コ ードを有する。得られたプラスミドｐＴＨＲ８をＥ、ｃｏｌｉの中に形質転換せ しめた。

培養物を生育させ、Ａｍｅ；ｓｈａｍ詳述の方法により、ＴＭ類似転体ンパク質 の部分精製をＩｇＧセファローズカラムを用いて行った。このタンパク質はプロ ティンＣ活性化アッセイにおいて活性を有した。

表　１ 名−１プーイマ−ＣＯＤ　＃　ヱー亙−ムー直表　３　合成オリゴヌクレオチド ブライマーＣＯＤ　４１２９２ ＣＯＤ　１１２９］ ａａ　３５０ ＣＯＤ　１　１２９４ ＣＯＤ　１１４０８ ａａ　ココ９ ＣＯＤ　１１４０９ ＣＯＤ　１１４１０ 表　３（続） ＣＯＤ　＄１４１２ ＣＯＤ　１１４３：３ ＣＯＤ　＄１４３４ ＣＯＤ　４１４コ５ ＣＯＤ　番１４８０ 表　３（続） ＣＯＤ　番１４７９ ＣＯＤ　１１４７８ ＣＯＤ　者１４８１ ＣＯＤ　９３０５　−　５曾 表　４　アミノ酸組成結果 表　５　乾燥後のトロンボモジュリンの活性サンプル　＃Ｚ畦　ＬＩＺ畦　ＸＪ ｉ呪圭透析出発材料　１６６１　８．８８　−ＰＢＳ溶解　１７２７７　９２． ４　１０４ＰＢＳ　（ＮＰ　−４０）溶解　１６６３５　８Ｂ、　９　１１００ ＮＥ溶解　１３５６８　７２．５　８２ＮＥＭ　（モＮＰ　−４０）溶解　１７ ９３９　９５．９　１０８表　６　シグナル配列 ＋−ＰＡ　シグナル配列 ヒボダーミンＡ　シグナル配列−ｐＨＹ１ヒポダーミンＡ　シグナル配列−９１ １Ｙ　２表　７　過渡表現プラスミド 至菫二　ＬＪＴＵｉ肚３　刊■１ ｐＴＨＲ１ｐＰ入１コ３　ａａ　２２７−４６２（−）　４ｔ／２２７−４６２ ａｐＴＨＲ７ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−４６２（−）　４ｔ／２２７−４６２ｂ ｐτＨＲＩコ　ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−４６２（＋）　４ｔ／２２７−４６２ （＋３ｐＴＫＲ１９ｐＴＨＲ５ａａ　コ５０−４６２　４ｔ／３５０−４６２ｐ ＴＨＲ２０ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−４６２（−）　＋４ｔ／２２７−４６２＝ ２２７−４６２２２７−４６２（＋） ｐＴＥＲ２１ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−４９７　４ｔ／２２７−４９７ｐＴＨＲ ］ｏ　ｐＴ）［Ｒ５ａａ　２２７−４２：Ｌ　４ｔ／２２７−４２１゜ｐ７１ｍ ３１　ｐＴｎ５　ａａ　コ５ｏ−ａ２１　４ｔ／コ５Ｏ−４２１ｐＴＨＲ３２ｐ Ｔ）［Ｒ５ａａ　コ９０−４６２　４ｔ／３９０−４６２ｐＴＨＲ３３ｐＴ）［ Ｒ５ａａ　３５０−３８６　４ｔ／３５０−３８６ｐＴ１（Ｒ３４ｐＴ）［Ｒ５ ａａ　３９０−４２１　４ｔ／コ９Ｏ−４２１ｐＴＨＲコ５　ｐＴＨＲ５ａａ　 ４２７−４６２　４ｔ／４２７−４６２ＰＴＨＲ４：Ｓ　ＰＴＨＲ５ａａ　２２ ７−コ４コ　４ｔ／２２７−３４３ｐＴＨＲ４４ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−３８ ６　４ｔ／２２７−３８６加ｕ１ ｐＴＨＲ４ｐＰＡｌ：１３　ａａ　２２７−４６２（−）　２２７−４６２：Ｐ Ａ　ａｐＴｌ（Ｒ６ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−４６２（−）　２２７−４６２： ＰＡ　ｂｐＴＨＲ１７ｐＴＨＲ５ａａ　２２７−４６２（＋）　Ｐへ二２２７− ４６２ｐＴＨＲ１８ｐＴＴ（Ｒ５ａａ　コ５０−４６２　ＰＡ：コ５０−４６２ ＋／−はＴＭ遺伝子３′末端における停止コドンの有無を示す。

表８ ｐＴＨＲｌｏ　ｐｓｃ７１６　ａａ　２２７−４６２（＋）　６ｈ／２２７−４ ６２ｐＴＨＲ１１ｐｓｃ７１６　ａａ　２２７−４６２（−）＋２２７−４６２ （４−）　６ｈ／（２２７−４６２）２ｐ’！’ｌｆｆ１２２　ｐｓｃ７１６　 ａａ　３５０−４６２　６ｈ／コ５Ｏ−４６２ｐＴＨＲ２コ　ｐｓｃ７１６　ａ ａ　２２７−４９７　６ｈ／２２７−４９７ｐＴＨＲ４５ｐｓｃ７１６　ａａ　 コ５０−４２１　６ｈ／３５０−４２１ｐτＨＲ４６ｐｓｃ７１６　ａａ　３５ ０−３８６　６ｈ／コ５Ｏ−４８６ｐＴＨＲ４７ｐｓｃ７１６　ａａ　３９０− ４２１　６ｈ／コ９Ｏ−４２１ｐＴＨＲ４８ｐｓｃ７１６　ａａ　４２７−４６ ２　６ｈ／４２フ−４６２ｐＴＫＨＹ１０２　ｐＨＹ２　ａａ　２１６−４６８ ｐＴＭＨＹ１０コ　ｐＨＹ２　ａａ　２１６−４６４１１／２　ＬＬＩ塾 ｐＴＨＲ２４ｐｓｃ７１６　ａａ　２２７−４６２（−）　６ｈ／２２７−４６ ２二ＰＡｐＴＨＲ２５ｐｓｃ７１６　ａａ　２２７−４６２（＋）　ＰＡ：２２ ７−４６２＋／−はＴＭ遺伝子３′末端における停止コドンの有無を示す。

表　９　成熟組織プラスミノーゲン活性のＣ末端に融合したトロンボモジュリン の６ＥＧＦ様ドーメインＧｌｙ入１ａ入ｒｇｓｅｒＴｙｒＧｌｎＶａｌ工１ｅｃ ｙｓＡｒｇ入ｓｐＧ工ｕＬｙｓＴｈｒＧ工ｎＭｅセエｌｅＴｙｒＧｌｎＧｌｎＨ ｉｓＧ工ｎＳｅｒＴｒｐＬａｕＡｒｇＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇＳｅｒＡｓｎＡ ｒｇＶａｌＧｌｕＴｙｒＣｙｓＴｒｐＣｙｓＡｓｎＳｅｒＧｌｙＡｒｇＡｌａＧ ｌｎＣｙｓＨｉｓＳ　ｅｒＶａ　ＩＰｒｏＶａｌＬｙｓ５ａｒＣｙｓＳｅｒＧｌ ｕＰｒｏＡｒｇＣｙＳＰｈｅＡｓｎＧｌｙＧユｙＴｈｒＣｙｓＧ工ｎＧｌｎ入１ ａＬａｕＣＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＣ入ＡＧＧＴＧττＴ ＣλＡＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧ入ＣＡＧＴτ τＴＣＡＡＣＧＴＣＧＣＴＣＧＧＴＴＣＣ入ＣＡＡＡＧＴＴＧＣＣＣＣＣＧＴＧ ＧＡＣＧＧＴＣＧＴＣこＧＧＧ入ＣＴｙｒＰｈｅＳｅｒＡｓｐＰｈｅＶａｌｃｙ ｓＧ！ｎＣｙｓＰｒｏＧｌｕＧｌｙＰｈｅＡｌａＧｌｙＬｙｓＣｙｓＣｙｓＧｌ ｕＸｌｅＡｓｐＴｈｒＡｒｇＡｌａＴｈｒＣｙｓＴｙｒＧｌｕＡｓｐＧｌｎＧｌ ｙＸ　ｌａｓｅｒＴｙｒＡｒｇＧｌｙＴｈｒＴｒｐｓｅｒＴｈｒ表　９　（続） 人１ａＧｌｕｓｅｒＧｌｙ入１ａＧｌｕＣｙｓＴｈｒＡｓｎＴｒｐＬ＋ｎＳｅｒ ＳａｒＡｌａＬｅｕ入１ａＧｌｎＬｙｓＰｒｏＴｙｒＳｓ　ｒＧｌ　ｙＡｒｇＡ ｒｇＰ　ｒｏＡｓｐＡｌａ　Ｘ　ｌ　ｅＡｒｇＬｅｕＧｌ　ｙＬｅｕＧ１　ｙＡ ｓ　ｎＨ土ｓＡｓｎＴｙｒＣｙｓ`ｒｇＡｓｎ ＰｈｅＣｙｓＳｅｒＴｈｒＰｒｏＡｌａｃｙｓＳｅｒＧｌｕＧｌｙＡｓｎＳｅｒ ＡｓｐＣｙｓＴｙｒＰｈａＧｌｙ入ｓｎＧｌｙｓｅｒ人１ａＴｙｒＡｒｇＧｌｙ ＴｈｒＧｌｎｓｅｒＬｅｕＴｈｒＧｌｕｓｅｒＧｌｙＡｌａｓｅｒｃｙｓＬｅｕ ＰｒｏＴｒｐＡｓｎｓｅｒＭｅｔ工１ｅＬｅｕ工１ａＧｌｙＬｙｓＶａｌＴｙｒ ＴｈｒＡユａＧｌｎＡｓｎＰｒｏｓｅｒＡｌａＧｌｎ入１ａＬｅｕＧｌｙＬｅｕ ＧｌｙＬｙｓＨｉｓＡｓｎＴｙｒＣｙｓＡｒｇ入ｓｎＰｒｏＡｓｐＧｌｙＡｓｐ ＡｌａＬｙｓＰｒｏＴｒｐＣｙｓＨｉｓＶａｌＬｅｕＬＹ　５　ＡＳ　ｎｘｒ９ ＡｒｑＬｅｕＴｈｒＴｒｐＧ　ｌｕＴｙ　ｒＣ　ｙｓＡｓ　ｐＶａ　ＩＰ　ｒｏ ｓ　ｆｉｒＣｙ　Ｓ　Ｓ　ｅ　ｒsｈ　ｒＣｙＳ　Ｇ　Ｉ　Ｉ／Ｌｅ　ｕ 表９（続） 人ｒｇＧｌｎＴｙｒＳｅｒＧｌｎＰｒｏＧｌｎＰｈｅλｒｇｌｌｅＬｙｓＧｌｙ ＧｌｙＬｅｕＰｈａＡｌａＡＳｐｌｌｅＡｌａＳｅｒ｝ＬｉｓＰｒｏＴｒｐＧｌ ｎ入１ａ入１ａ工１ｅＰｈｅＡｌａＬｙｓ｝ｌｉｓ入ｒｇ入ｒｇｓｅｒＰｒｏＧ ｌｙＧ工ｕＡｒｇＰｈｅＬｅｕＣｙｓＧｌｙＧ１ｙｌｌｅＬｅｕ工１ｅＳｅｒＳ ｅｒＣｙｓＴｒｐ工１ｅＬｅｕＳｅｒＡｌａＡユａＨｉｓｃｙｓＰｈｅＧｌｎＧ ｌｕ人ｒｇＰｈｅＰｒｏＰｒｏＨｉｓＨｉｓＬｅｕＴｈｒＶａ工１１ｅＬｅｕＧ ｌｙＡｒｇτｈｒＴｙｒＡｒｇＶａｌＶａｌＰｒｏＧｌｙＧ工ｕＧｌｕＧｌｕＧ ｌｎＬｙｓＰｈｅＧｌｕＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｙｒ工１ｅＶａｌＨｉｓＬｙｓＧ ｌｕＰｈｅＡｓｐＡｓｐＡｓｐＴｈｒＴｙｒＡｓｐＡｓｎＡｓｐ工ｌｅＡｌａＬ ａｕＬｅｕＧｌｎＬｅｕＬｙｓＳｅｒＡｓｐＳｅｒＳｅｒＡｒｇＣｙｓ八ｌａＧ ｌｎＧユｕｓｅｒＳｅｒＶａｌＶａｌＡｒｑＴｈ！：ＶａｌＣｙＳＬｅｕＰＸ： ｏＰＸ：ｏＡ工ａ入ｉｐＬｅｕＧｌｎＬｅｕＰｒｏＡｓｐＴｒｐＴｈｒＧｌｕｃ ｙｓＧｌｕＬｅｕｓｅｒＧｌｙＴｙｒＧｌｙＬｙｓＨｉｓＧｌｕＡｌａＬｅｕＳ ｅｒＰｒｏＰｈｅＴｙｒＳｅｒＧｌｕ表９（続） ＡｒｇＬｅｕＬｙｓ　ＧｌｕＡｌａＨｉｓＶａｌＡｒｇＬｅｕＴｙｒＰ　ｒｏｓ ｅｒｓｅ　ｒＡｒｇｃｙｓＴｈｒｓ　ｅ　ｒＧｌｎＨ　ｉ　刀@Ｌｅｕ ＬｅｕＡｓｎＡｒｇＴｈｒＶａｌＴｈｒＡｓｐ入ｓａｌ−１ｅｔＬｅｕｃｙｓ入 １ａＧｌｙＡｓｐＴｈｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｉｎ入１＆入ｓｎＬ ｅｕ｝ｌｉｓＡｓｐＡｌａＣｙｓＧｌｎＧＩＹＡ！ｐＳａｒＧｌｙＧｌｙＰｒｏ ＬｅｕＶａｌＣｙｓＬｅｕＡｓｎ人ｓｐＧｌｙＡｒｇＭｅセτｈｒＬｅｕＶａｌ Ｇｌｙ工１ｅＸｌｅｓａｒＴｒｐＧｌｙＬｅｕＧｌｙＣｙｓＧｌｙＧｌｎＬｙｓ 入ｓｐＶａｌＰｒｏＧｌｙＶａｌＴｙｒＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＡｊｎＴｙｒ Ｌａ　ｕＡｓｐＴｒｐ　工１ｅＡｒｇＡｓｐＡｓｎＭｅセ入ｒｑＡｌａＰｒｏＡ ｒｇＣｙｓＧｌｎｃｙｓＰｒｏＡｌａＧｌ　ｙＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｎＡｌａ ＡｓｐＧｌｙＡｒｇｓｅｒｃｙｓＴｈｒＡｌａＳｅｒＡｌａＴｈｒＧｌｎＳｅｒ ＣｙｓＡｓｎＡｓｐＬｅｕＣｙｓＧｌｕ｝ｉｉｓＰｈｅＣｙｓＶａｌＰｒｏＡｓ ｎＰｒｏＡｓｐ表　９（続） ＣｙｓＶａｌＧｌｕＰｒｏＶａｌＡｓｐＰｒｏＣｙｓＰｈａＡｒｇＡｌａ入１ｎ ＣｙｓＧｌｕＴｙｒＧｌｎＣｙｓＧ１ｎＰｒｏＬａｕＡｓｎＧｌｎＴｈｒｓｅｒ ＴｙｒＬａｕｃｙｓＶａｉｃｙｓＡｌａＧｌｕＧｌｙＰｈａＡｌａＰｒｏ工工＠ ＰｒｏＨｉｓＧ工ｕＰｒ。

Ｈ１ｓＡｒｇＣｙｓＧｌｎＭａｔＰｈｅＣｙｓＡｓｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＣｙｓ Ｐｒｏ入１ａ入５ｐＣｙｓＡｓｐＰｒｏＡｓｎＴｈｒＧｌｎＡｌａＳｅｒＣｙｓ Ｇｌ＋ａＣｙｓＰｒｏＧｌｕＧｌｙＴｙｒ工１ｅＬｅｕＪＬ＋ｐＡｓｐＧｌｙＰ ｈａ工１ｅｃｙｓＴｈｒＡｓｐ工１ｅ入５ｐＧｌｕＣｙｓＧｌｕＡｓｎＧｌｙＧ ｌｙＰｈｅＣｙｓＳｅｒＧｌｙＶａｌｃｙｓＨ１ｓＡｓｎＬｅｕＥ’ｒｏＧｌｙ Ｔｈｒ表　９（続） ＡｓｐＣｙｓＯＰ Ｆｉｇ、　１ ＣＯＤ　＃１０３３ ａａ　４５６　ａａ　４６２ に中色ｓｎべ臥四−Ａ斗ｑ（３）コニ −ＢＢｒｒｌＨＩ　５ｉｔｅ　− ＣＣ−ＣＣＡＣＡ’ＩＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴ（工℃αゴＡＧ天然 配列ＣＯＤ　＃１．０３４ ａａ　２２７　ａａ　２３４ ＣｙｓＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｓｎＧｌｙＧｌｙｃｙｓ：二３ｍＴｒＣ”ＴαスＧ ＡＡＣαに３℃で工　プライマー／コード配列Ｆｉｇ、　３Ｂ。

ＦＩＧ、４ 過渡性表現 Ｔ−Ｐ日　シグナル ペプチド ＦＩＧ、５ バクロウィルス表現 ｐｉｃａ　＜ククー配列ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ −ト活性 一→−吸光度 Ｆｉｇ、　９ Ａ：コンディショニング培地　Ｖ　天然ＴＭＢ：Ｂ：精製６　ｈ　／２２７−４ ６２Ａ：　精製ＴＭ類似体６　ｈ−２２／４６２のＡＰＴＴ活性岡　−類似体　 ６ｈ−２２７／４６２ Ｆ１ｇ、ＩＩＡ Ｂ：　６ｈ／２２７−４６２　ｖｓ、ヘパリン及びＡＴＩＩＩ・−一２２７／４ ６２　ロヘパリン　・π工＝国藻臘審謡失 一一一一＾−−−１轍　Ｋゴ／１Ｉ５９０／α刃５５＋ｍｗ＋ｗｓｅ＋ｗｌ静崗 １２　にゴバ芯匍／ＣＫη５５↑！：°妥ニジｇ−７幕）“ Ｉｌ、Ｃｌａｍ＝　９−２７，３ろａｎｄ　５４−６１．ｄｒａｗｎ　ｔｏａ　 ５ｏｌｕｂｌｅ廿ｈｏｍｂｏｍｏｄｕｈｎａｒ：ａ＋ｏｇ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏ ａｓ　＊ｒ　ｕｓｔｎｇ　ｔｈｅ　５ａｒｒ、ｅ、ｃｌａｈｉｆｉｍ　ｉｎ　Ｃ １ａｓｓｅｓ　５３０@ａｎｄ　５１４゜ ５ｕｂｃ＋ａｓｓｅｓ　３δＯａｎｄ　２．　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＩＩｌ 、　Ｃｌａｊｍ　２６−３７．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ＤＮ＾５ｑｕｅｎｃｅ 、　ａ　ｃｅｌｌ　ｕｄ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｕ 　ｔｏ　ｍｔ＠ａ　ｍｕ！Ｌｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉ ｎ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅ奄氏B ＣＩａ！５ｊｆｌｅｄ　ｉｌｌ　Ｃ１ａｓｓ５３６．５ｕｂｃ＋ａｓｓ　２７　 旺６　Ｃ１ａｓｓ　４３５．５ｕｂｃｌａｓｓｅｓ　６９．U．１７２４　ａｎ ｄ ニア＋、：１＆Ｉ！１１ｓ３９−’、−・ｊｌ’ａ’ｒ／ｎ’、：ｒａ１１’− 二’４ｒ’Ｍ、二ｕ（弔妃℃ヱＩＩ″會：＋ｍｂＯｍＯｄｕ獅獅■浮唐撃盾■■ ｐｒ＊＝ｅ＋ｒ＋ａｎｄａｍｅｔよ１０Ｇｉ：ｕｓｔｒ＋ｇ＊’、５ａｒｒＡ・ 二Ｉ？、；Ｅｌｆｌ’）！Ｉｎｕａｓｓｅｓ５３ｏａｎｄ５P４゜ ：１４ｊ／ｉ、ｉ％５台！　？・言θｐ、：’１】：、ｆ！５１−５１−１ｌ２ ＋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下のペプチド： ａ）【配列があります】； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれるペプチドをコード化する、核酸塩基配列（ここで 、Ｙはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ酸配列であり；そして Ｑはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０からアミノ酸４６２、 及びアミノ酸２２７からアミノ酸４９７より成るグループから選ばれるアミノ酸 配列であり、ここで全ての番号は表２において提供するアミノ酸に関する）。 ２．請求項１記載のペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列であって、そ の配列が以下のもの：ａ）【配列があります】； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれる配列（ここで、Ｘは番号８７９〜１５８６の核酸 塩基を表し、そしてＺは番号８７９〜１５８６、１２５１〜１５８６、又は８７ ９〜１６９０のグループから選ばれる核酸塩基を表し、すべての番号は表２にお いて提供する塩基に関する）。 ３．以下の配列： 【配列があります】； を有する、請求項２記載のポリヌクレオチド配列。 ４．以下の配列： 【配列があります】、 を有する、請求項２記載のポリヌクレオチド配列。 ５．以下の配列： 【配列があります】、 を有する、請求項２記載のポリヌクレオチド配列。 ６．以下の配列： 【配列があります】、 を有する、請求項２記載のポリヌクレオチド配列。 ７．以下のペプチド： ａ）【配列があります】； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれるペプチドをコード化する、核酸配列を含んで成る 組換ベクター（ここで、Ｙはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ 酸配列であり；そしてＱはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０ からアミノ酸４６２、及びアミノ酸２２７からアミノ酸４９７より成るグループ から選ばれるアミノ酸配列であり、ここで全ての番号は表２において提供するア ミノ酸に関する）。 ８．請求項７記載のベクターであって、その核酸配列が以下のもの： ａ）【配列があります】； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれるもの（ここでＸは番号８７９〜１５８６の核酸塩 基を表し、そしてＺは番号８７９〜１５８６、１２５１〜１５８６、又は８７９ 〜１６９０のグループから選ばれる核酸塩基を表し、全ての番号は表２において 提供する塩基に関する）。 ９以下のペプチド： ａ）【配列があります】； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれるペプチドの実質的に純粋なタンパク質組成物（こ こで、Ｙはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ酸配列であり；そ してＱはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０からアミノ酸４６ ２、及びアミノ酸２２７からアミノ酸４９７より成るグループから選ばれるアミ ノ酸配列であり、ここで全ての番号は表２において提供するアミノ酸に関する） 。 １０．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項９に記載のペプチド。 １１．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項９に記載のペプチド。 １２．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項９に記載のペプチド。 １３．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項９に記載のペプチド。 １４．前記のペプチドが、非還元クロマトグラフィー下で、該ペプチドについて のおよそ予想されうる分子量を示すペプチドの種類のペプチドを含んでなる、請 求項９に記載の組成物。 １５．前記のペプチドがフィブリン溶解酵素に化学結合している、請求項９に記 載の組成物。 １６．前記の化学結合が、酵素と前記ペプチドにおけるアミノ酸残基の間の共有 結合より成る、請求項１５に記載の組成物。 １７．前記の酵素がプラスミノーゲン分子と結合するストレプトキナーゼ分子で あり、そして前記ペプチドがプラスミノーゲンの活性部位に結合する、請求項１ ５に記載の組成物。 １８．前記のフィブリン溶解酵素がｔ−ＰＡである、請求項１５に記載の組成物 。 １９．前記の組成物が乾燥状態及び無塩状態にある、請求項９に記載の組成物。 ２０．人由来の夾雑物を含まない、単位投与量のトロンボモジュリン様タンパク 質の無菌調製物を含んで成る、抗血栓活性を有する医薬組成物であって、以下の もの：ａ）【配列があります】； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれるアミノ酸配列を有するもの（ここで、Ｙはアミノ 酸２２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ酸配列であり；そしてＱはアミノ酸 ２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０からアミノ酸４６２、及びアミノ酸 ２２７からアミノ酸４９７より成るグループから選ばれるアミノ酸配列であり、 ここで全ての番号は表２において提供するアミノ酸に関する）。 ２１．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】； を有する、請求項２０に記載の医薬組成物。 ２２．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項２０に記載の医薬組成物。 ２３．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項２０に記載の医薬組成物。 ２４．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 を有する、請求項２０に記載の医薬組成物。 ２５．人由来の夾雑物を含まない、そして以下のもの：ａ）【配列があります】 ； ｂ）【配列があります】； ｃ）【配列があります】；及び ｄ）【配列があります】； より成るグループから選ばれるアミノ酸配列を有する（ここで、Ｙはアミノ酸２ ２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ酸配列であり；そしてＱはアミノ酸２２ ７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０からアミノ酸４６２、及びアミノ酸２２ ７からアミノ酸４９７より成るグループから選ばれるアミノ酸配列であり、ここ で全ての番号は表２において提供するアミノ酸に関する）有効な量のトロンボモ ジュリン様タンパク質の無菌水溶液を投与することにより、哺乳動物において血 栓活性をコントロールする方法。 ２６．表面が、以下のもの： ａ）ｈｉｓ．ｔｒｐ．ａｌａ．ａｒｇ．ｇｌｕ．ａｌａ．ｐｒｏ．ｇｌｙ．ａｌ ａ．ｔｒｐ．ａｓｐ．−Ｙ−ａｓｐ，ｓｅｒ．ｇｌｙ．ｌｙｓ．ｖａｌ．ａｓｐ ；ｂ）ｈｉｓ．ｔｒｐ．ａｌａ．ａｒｇ．ｇｌｕ．ａｌａ．ｐｒｏ．ｇｌｙ．ａ ｌａ．ｔｒｐ．ａｓｐ．−Ｙ−ａｓｐ．ｓｅｒ； ｃ）ｇｌｙ．ａｌａ．ａｒｇ．ｓｅｒ．−Ｑ；及びｄ）ａＩａ．ｖａｌ．ｖａ１ ．ｐｒｏ．ａｒｇ．ｓｅｒ．−Ｑ；より成るグループから選ばれるペプチド（こ こで、Ｙはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ酸配列であり；そ してＱはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０からアミノ酸４６ ２、及びアミノ酸２２７からアミノ酸４９７より成るグループから選ばれるアミ ノ酸配列であり、ここで全ての番号は表２において提供するアミノ酸に関する） に結合することを有する、生体適合ポリマーを含んで成る構造品。 ２７．生体の哺乳動物の中に植え込まれるポリマーによって引き起こされる血液 凝集を阻害せしめる方法であって、トロンボモジュリン様タンパク質を該ポリマ ーに結合せしめ、そして該ポリマーを哺乳動物に植え込むことを含んでなる方法 （ここで該タンパク質は以下のもの：ａ）ｈｉｓ．ｔｒｐ．ａｌａ．ａｒｇ．ｇ ｌｕ．ａｌａ．ｐｒｏ．ｇ１ｙ、ａｌａ．ｔｒｐ．ａｓｐ．−Ｙ−ａｓｐ．ｓｅ ｒ．ｇｌｙ．ｌｙｓ．ｖａｌ．ａｓｐ；ｂ）ｈｉｓ．ｔｒｐ．ａｌａ．ａｒｇ． ｇｌｕ．ａｌａ．ｐｒｏ．ｇｌｙ．ａｌａ．ｔｒｐ．ａｓｐ．−Ｙ−ａｓｐ．ｓ ｅｒ； ｃ）ｇｌｙ．ａｌａ．ａｒｇ．ｓｅｒ．−Ｑ；及びｄ）ａＩａ．ｖａｌ．ｖａ１ ．ｐｒｏ．ａｒｇ．ｓｅｒ．−Ｑ；より成るグループから選ばれるペプチド（こ こで、Ｙはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２の範囲のアミノ酸配列であり；そ してＱはアミノ酸２２７からアミノ酸４６２、アミノ酸３５０からアミノ酸４６ ２、及びアミノ酸２２７からアミノ酸４９７より成るグループから選ばれるアミ ノ酸配列であり、ここで全ての番号は表２において提供するアミノ酸に関する） である）。 ２８．多機能可溶性ヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）類似体であって、該類似体 が天然ＴＭのアミノ酸残基３５０−４６２及び標的成分より本質的に成るものを 含む、単離ＤＮＡフグメント。 ２９．実質的に、アミノ酸残基： デルタ１−３８９、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４ ９８−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；及びデ ルタ１−３４９、デルタ４６３−５５７、より成る、二価ＴＭ類似体をコード化 する請求項２８記載のＤＮＡフラグメント。 ３０．前記の標的成分が、二価ＴＭ類似体にフィブリン溶解活性を引き起こすポ リペプチド配列を含んで成る、請求項２８記載のＤＮＡフラグメント。 ３１．前記標的成分が、表９記載の通りのヒト組織プラスミノーゲン活性体のア ミノ酸残基４−５３０を含んで成る、請求項２８記載のＤＮＡフラグメント。 ３２．表現コントロール配列と結合可能な、請求項２８に記載のＤＮＡフラグメ ント。 ３３．請求項２８記載のＤＮＡ配列を形質転換せしめた細胞。 ３４．二価可溶性ＴＭ類似体を製造する方法であって、トロンボモジュリンフラ グメントを含んでなり、停止翻訳領域を有さない、第１のアミノ酸配列；及び標 的成分を含んで成る第２のアミノ酸配列、を含んで成る融合タンパク質について コード化するＤＮＡ配列と結合可能な表現コントロール配列を有する少なくとも １種類の組換ＤＮＡセグメントにより形質転換された宿主の培養を含んで成る方 法（ここで該二価ＴＭ類似体は該宿主よた分泌される）。 ３５．前記の第１アミノ酸配列が、以下のものデルタ１−３８９、デルタ４６３ −５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４９８−５５７　ＴＭ；デルタ１− ２２６、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；及びデルタ１−３４９、デルタ４６３− ５５７、より成るグループから選ばれる配列である、請求項３４記載の方法。 ３６．前記二価類似体がフィブリン溶解活性を有する、請求項３５に記載の方法 。 ３７．前記標的成分がヒト−ｔ−ＰＡのアミノ酸４−５３０より実質的に成る、 請求項３６記載の方法。 ３８．患者において凝血を抑制せしめる方法であって、患者に凝血を抑制せしめ るのに有効な一定量の可溶性ＴＭ類似体を投与せしめる方法（ここで該類似体は 以下のもの、デルタ１−３８９、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２ ６、デルタ４９８−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４６３−５５７　 ＴＭ；及びデルタ１−３４９、デルタ４６３−５５７、より成るグループから選 ばれるＴＭアミノ酸配列を含んで成る）。 ３９．血栓により引き起こされる急性心筋梗塞に苦しむ患者を処置する方法であ って、更なる凝血を抑制、且つ血栓を溶解せしめるのに有効な一定量の二価可溶 性ＴＭ類似休を患者に投与せしめる方法（ここで該二価可溶性ＴＭ類似体は、以 下のもの、 デルタ１−３８９、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４ ９８−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；及びデ ルタ１−３４９、デルタ４６３−５５７、より成るグループから選ばれるＴＭア ミノ酸配列を含んで成り、ここで該アミノ酸配列はヒトｔ−ＰＡのアミノ酸４− ５３０に、Ｃ末端又はＮ末端にて融合される）。 ４０．前記ＴＭ類似体が、天然トロンボモジュリンと実質的に同等又はより高い トロンビンに対する親和力を保持する、請求項３９に記載の方法。 ４１．天然トロンボモジュリンと実質的に同等又はより高い親和力によってトロ ンビンと結合可能な二価ＴＭ類似体（該類似体は機能的停止翻訳ドメインを有さ ない天然トロンボモジュリンを含んで成り、ここで該二価類似体はフィブリンと 結合する能力及びプラスミノーゲンをブラスミンヘと分解する能力により特徴付 けられる）。 ４２．前記類似体が、図９に示すアミノ酸配列より実質的に成る、請求項４１記 載のＴＭ類似体。 ４３．前記類似体が、トロンボモジュリンの６ＥＧＦ様ドメインのアミノ末端に 共有結合するｔ−ＰＡのシグナル配列より実質的に成る、請求項４１記載のＴＭ 類似体。 ４４．前記類似体が、ｔ−ＰＡのアミノ末端に共有結合するトロンボモジュリン の６ＥＧＦ様ドメインより実質的に成る、請求項４１記載のＴＭ類似体。 ４５．可溶性トロンボモジュリン類似体の製造方法であって、以下の段階： 該類似体をコード化するＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を培養せしめ ；そして、 該宿主細胞より分泌される類似体を集めること、を含んで成る方法（ここで該類 似体は宿主細胞において機能する停止翻訳領域を有さない）。 ４６．前記宿主細胞が真核細胞である、請求項４５記載の方法。 ４７．可溶性ヒトトロンボモジュリン類似体についてコード化するＤＮＡ配列を 含む、単離したＤＮＡフラグメントであって、該ＤＮＡフラグメントにより形質 転換される宿主細胞から分泌可能なもの（ここで該ＤＮＡ配列は、天然ＴＭのア ミノ酸残基３９０−４６２を含んで成るポリペプチドをコード化する）。 ４８．前記のポリペプチドが、以下のもの：デルタ１−３８９、デルタ４６３− ５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４９８−５５７　ＴＭ；デルタ１−２ ２６、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；及びデルタ１−３４９、デルタ４６３−５ ５７、より成るグループから選ばれる、請求項４７に記載の単離したＤＮＡフラ グメント。 ４９．表現コントロール配列と結合可能な、請求項４７記載のＤＮＡ配列。 ５０．請求項４９記載のＤＮＡ配列により形質転換された細胞。 ５１．可溶性トロンボモジュリン（ＴＭ）類似体を製造する方法であって、少な くとも一種類の組換ＤＮＡセグメントにより形質転換された宿主を培養する方法 （該セグメントは、機能的停止翻訳ドメインを有さないＴＭ類似体をコード化す るＤＮＡ配列と結合可能な表現コントロール配列を含んで成り、ここで該ＴＭ類 似体は該宿主細胞から分泌され、そして以下のもの： デルタ１−３８９、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４ ９８−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；及びデ ルタ１−３４９、デルタ４６３−５５７、より成るグループから選ばれる）。 ５２．前記ＴＭ類似体がシグナル配列を含んで成る、請求項５１記載の方法。 ５３．前記宿主が真核細胞である、請求項５１記載の方法。 ５４．患者において凝血を抑制する方法であって、凝血を抑えるのに有効な一定 量の可溶性トロンボモジュリン（ＴＭ）を患者に投与せしめる方法（ここで該Ｔ Ｍ類似体は以下のもの： デルタ１−３８９、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４ ９８−５５７　ＴＭ；デルタ１−２２６、デルタ４６３−５５７　ＴＭ；及びデ ルタ１−３４９、デルタ４６３−５５７、より成るグループから選ばれる）。 ５５．前記ＴＭ類似体が、天然トロンボモジュリンと実質的に同等又は高められ たトロンビンに対する親和力を保持する、請求項５４に記載の方法。 ５６．天然トロンボモジュリンと実質的に同等の親和力によってトロンビンと結 合可能な可溶性トロンボモジュリン（該類似体は機能的停止翻訳ドメインを有さ ない天然トロンボモジュリンを含んでなる）。 ５７．前記類似体が天然トロンボモジュリンの停止領域ドメインの全てのアミノ 酸を含まない、請求項５６記載の類似体。 ５８．トロンビンの抗凝血活性を活性化せしめる方法であって、トロンビンと請 求項５６の可溶性トロンボモジュリン類似体とを複合せしめる方法。 ５９．抗凝血治療の必要な患者を処置する方法であって、治療的有効投与量の請 求項５６記載の可溶性ＴＭ類似体を患者に投与せしめることを含んで成る治療方 法。 ６０．心筋梗塞の回復した愚者における、再閉塞の危険性を緩和せしめる方法で あって、治療的有効投与量の請求項５６記載の可溶性類似体を患者に投与せしめ ることを含んで成る方法。 ６１．静脈血栓に苦しむ危険性にある患者の予防処置方法であって、治療的有効 投与量の請求項５６記載の可溶性類似体を患者に投与せしめることを含んで成る 方法。