JPH07503849A - プロテアーゼ−耐性トロンボモジュリン・アナログ - Google Patents

プロテアーゼ−耐性トロンボモジュリン・アナログ

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JPH07503849A JP5514241A JP51424193A JPH07503849A JP H07503849 A JPH07503849 A JP H07503849A JP 5514241 A JP5514241 A JP 5514241A JP 51424193 A JP51424193 A JP 51424193A JP H07503849 A JPH07503849 A JP H07503849A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼ−耐性トロンボモジュリン・アナログ本出願は、１９９０年４月９ 日に出願された米国逐次番号第０７７５０６．３２５号の一部継続出願である１ ９９０年８月１５日に出願された米国逐次番号第０７７５６８．４５６号の一部 継続出願である米国逐次番号第０７／８３０．５７７号の一部継続出願であり、 そして本出願は、１９８９年４月２８日に出願された米国逐次番号第０７／３４ ５．３７２号の−゛部継続出願である１９８９年９月１３日に出願された米国逐 次番号第０７／４０６．９４１号の一部継続出願である１９９０年２月１６日に 出願されたＰＣＴ逐次番号第９０７００９５５号に対応する。
発明の背景 本発明は、プロテアーゼによる解裂を受けにくいトロンボモジュリン（ｔｈｒｏ ｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ（７Ｍ″））のアナログを含む一重鎖トロンポモジュリン ・ポリペプチドに関する。これらのアナログは、例えば、抗血栓療法において有 用である。新規のタンパク質、核酸遺伝子配列、医薬、及び血栓活性を阻害する 方法を、開示する。
安全且つ効果的な抗血液凝固／抗血栓による治療から利益を受けるであろう病的 症状が多数存在する。これらの症状の性質は、様々である。例えば、抗血液凝固 治療は、心筋梗塞における又は例えば、敗血症（ｓｅｐｔｒｃｅｍｒａ）に関連 する多発住血管内血液凝固（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌ ａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ（ＤＩＣ））の治療における血栓治療の間の如き 急性の症状において有用である。抗血液凝固は、また、急性ではない症状、例え ば、心弁移植を受けた患者における慢性的な使用又は深部の静脈血栓（ｄｅｅｐ 　ｖｅｎｏｕｓ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ（ＤＶＴ））の危険を減少させるために 患者を外科手術することにおける予防的使用のために、有用である。
トロンボモジュリンは、抗血液凝固の性質を示す膜タンパク質である。その生理 学的重要性が研究されてきた（例えば、Ｎ、　Ｅｓｍｏｎ。
生来のトロンボモジュリンをエンコードする遺伝子は、そのゲノム形態において 及びｃＤＮＡクローンとしての両方において幾つかの種から、単離され、そして 配列決定されている（Ｊａｃｋｍａｎ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、。
（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８ ３：８８３４−８８３８及び（１９Ｂ？）８４：６４２５−６４２９　（これら の両方を、引用により本明細書中に取り込む。））。公知のタンパク質、ＬＤＬ レセプタとの比較が、機能的ドメインを示唆した（Ｗｅｎ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、　（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：４３５０−４３５７ ）。１つの研究は、第５及び第６表皮成長因子（１！ＧＦ）一様ドメインがトロ ンビンに結合する能力をもつことを示唆しくＫｕｒｏｓａｗａ、　Ｓ、。
ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：５９ ９３−５９９６）；他は、ＥＧＦ一様ドメイン４．５、及び６がトロンビン−仲 介物質プロティンＣ活性化活性のための補因子として働くのに十分なものである ということを示唆する（Ｚｕｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４：１０３５１−１０３５３）。トロンビンの直 接の前血液凝固活性（フィブリノーゲンのフィブリンへの変換）の阻害は、部分 的に、そのトロンボモジュリン分子上のゲルコサミノグリカン置換基を原因とし ている（Ｂｏｕｒｉｎ。
Ｍ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：５９２４−５９２８）。
この〇−結合糖添加（ｇＪｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）　ドメインは、これらのタ イプの硫酸化糖の添加のための可能性のある部位をもつ。
トロンボモジュリン・アナログであって様々な修飾をもち、可溶性分子を含むも のは、公知である。例えば、その分子の酸化耐性を与えるトロンボモジュリン内 の酸化−感受性アミノ酸残基に対する修飾がある。また、酵素的除去を通しての 硫酸化〇−結合炭水化物の除去によるトロンボモジュリンに対する修飾又はトロ ンビンの重要な性質である、トロンビン−仲介血小板凝集の阻害及びフィブリン へのフィブリノーゲンのトロンビン−仲介変換の阻害を減少させるそのペプチド の糖添加部位の修飾が、在る。これらの修飾は、１９９０年８月１５日に出願さ れた米国逐次番号第０７７５６８．４５６号（これを、引用により本明細書中に 取り込む。）中に開示されている。
ヒトにおける使用のために最近認可された抗血液凝固剤は、等しく有効ではなく 、そしてより有効な化合物のための必要性が在る（例えば、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｖｅｎｏｕｓ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｕ１ｍｏｎａｒｙ Ｅ＋＋＋ｂｏｌｉｓｍ、　Ｃｏｎ５ｅｎｓｕｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏ ｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ、　ＮＩＨ。
１９８６、６（２）：１−２３を参照のこと。）。
その生来の形態におけるトロンボモジュリンは、抗血液凝固治療に好適ではない 。なぜなら、その固有のアミノ酸配列によりそれが膜に結合しており、そして洗 剤処理なしには不溶であるからである。
それは、検死（ａｕｔｏｐｓｙ）又は生検（ｂｉｏｐｓｙ）サンプルからの精製 が実施できないほど少量で（約３００ｍｇ　トロンホモ２３９２フ人）存在する 。
可溶性トロンボモジュリン一様分子は、ヒト血漿及び尿中の非常に少量において 検出される。これらの分子は、プロティンＣ活性化を促進する減少された能力を もっており、そしてそれらが、少な（とも一部数化を原因として少なくとも部分 的に不活性とされることが可能である。これらの分子が膜結合分子の分解生成物 であることが示唆される（Ｉｓｈｉｉ、　Ｈ，ａｎｄ　ＭａＪｅｒｕｓ、　Ｐ、 ＋　（１９８５）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ。
７６：２１７８−２１８１）が、それらは、それらを特徴付けるのが困難である ような低い量（〜０．８＋＋＋ｇ／成人男子）で存在する。精製生来分子のタン パク質分解断片が、トリプシン又はエラスターゼを使用して製造される。（ｌｓ ｈｉｉ、前記、　Ｋｕｒｏｓａｗａ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｊ、　 Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ。
２６３　：５５９３−５９９６及び５ｔｅａｒｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、＋　（１９ ８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：３３５２−３３５６を参照の こと。）。これらの断片の幾つかは、インビトロにおけるプロティンＣのトロン ビン仲介活性化を促進する能力を保持している。
異種細胞における、例えば、細胞培養における組換え技術によるＴＭ及び７Ｍア ナログの製造は、インビボにおける用途における使用のために許容できる生成物 を達成することにおいて多くの問題に遭遇した。例えば、ＴＭのＮ−末端は、そ の組換え体遺伝子を含む細胞内並びに生来の細胞内で正確に解裂されず、非ユニ ークＮ−末端をもつ生成物をもたらす。これは、他の困難の中にあって、例えば 、調節目的のための、単離されたポリペプチドの純度の保証を提供することにお ける問題を引き起こす。また、組換えにより製造されたＴＭの糖添加が、その糖 添加部位の幾つかが生物学的活性を最大化することに明らかに関係し、一方、他 の部位がＴＭの血流をクリアするためのインビボにおけるシグナルとして明らか に認識され、それ故に、そのように糖添加されたＴＭの循環半減期を減少させる という問題であることが、判明した。また、最大に有用な組換えにより製造され た耐ポリペプチドの製造を妨害するという、他の、よく定められていない問題が 在ることが知られている。
このように、トロンボモジュリンの抗血液凝固の性質を示し、そして大量にであ るが、異種細胞によるＴＭの組換え製造における問題に遭遇することなく容易に 製造される、新たな組成物の必要性が在る。本発明は、これらの及び他の必要性 を遂行する。
発明の要約 本発明は、二本鎖ＴＭを実質的に欠いている一本鎖トロンボモジュリン（ＴＭ） を提供する。このＴＭは、それを含む調製物から二本鎖ＴＭを除去し、又は−末 鎖ＴＭの解裂を防ぐことにより、提供される。
他の態様においては、本発明は、単一のＮ−末端をもつＴＭを提供する。このＴ Ｍは、二本鎖ＴＭの非存在により、及び／又は天然の異種Ｎ−末端シグナル配列 プロセシング部位を除去することにより、提供される。
他の態様においては、本発明は、−末鎖Ｃ−末端をもつＴＭを提供する。このＴ Ｍは、エクソカルポキシペブチダーゼに感受性のあるＣ−末端の非存在により提 供される。
他の態様においては、本発明は、真核細胞、例えば、動物細胞、を椎動物細胞、 昆虫細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞等、例えば、ＣＨＯ又はＣＨＬＩ細胞内で発現 されることができる一本鎖ＴＭを提供する。
本発明は、−末鎖トロンボモジュリン又はそれらのアナログ、典型的には、プロ テアーゼ解裂に耐性であり且つトロンボモジュリンの生物学的活性を保持してい るものの有効投与量を投与することによる血栓疾患の治療方法を提供する。ある 態様においては、このポリペプチド組成物は、単一のＮ−末端及び単一のＣ−末 端のみを表し、プロティンＣのトロンビン−仲介活性化を強化するための少なく ともほとんど生来の能力をもち、及び／又はフィブリノーゲンのフィブリンへの トロンビン−仲介変換を不活性化するために減少された能力をもつ。ある態様に おいては、このアナログは、水溶液中で可溶性であり、及び／又は長い循環半減 期をもち、例えば、酸化及び／又はプロテアーゼ耐性であることが、好ましい。
他の態様においては、そのアナログがその〇−結合糖添加ドメインの糖残基内で 修飾されることが、好ましい。修飾は、その〇−結合糖添加ドメインが変更され た糖添加パターンをもつということを意味している。これは、生来の糖残基の置 換、及び全体の又は部分的な欠失を包含する。この修飾は、糖添加部位として細 胞により認識されるアミノ酸残基を欠失させ、例えば、部位指定突然変異誘発に より、達成されることができる。あるいは、その糖を、化学的に、部分的又は全 体的のいずれかで、除去することができる。他の修飾においては、糖を、硫酸置 換基を除去するために酵素的に処理することができる。さらに他の修飾において は、その糖添加ドメインの全体を、欠失させることができる。
本性における使用のための幾つかの好ましいアナログは、プロティンＣのトロン ビン−仲介活性化を強化する能力を保持し、及び／又はフィブリノーゲンのフィ ブリンへのトロンビン−仲介変換を不活性化するための生来のトロンボモジュリ ンの能力の８０Ｘ以下をもつであろう。さらに特に、これらの７Ｍアナログは、 生来の洗剤−可溶化ウサギ・トロンボモジュリンに比較して標準プロティンＣ活 性化検定において等しい活性をもつように標準化されるとき、フィブリノーゲン のフィブリンへのトロンビン−仲介変換を測定する標準検定における生来のトロ ンボモジュリンの同一量のたった８０％以下の活性をもつであろう。本発明の１ つの好ましくはアナログは、上記フィブリン検定における生来のトロンボモジュ リンの同一量の５０％以下の活性をもつ。これらの能力は、本明細書中先に記載 した標準検定を使用して測定される。
本発明は、さらに、哺乳類における血栓疾患の治療のための滅菌組成物であって 、上記の性質の中の１以上をもつトロンボモジュリン・アナログの単位投与量を 含んで成るものを、提供する。好ましいアナログは、様々な方法について先に記 載したものと同じである。
本発明は、さらに、トロンボモジュリン・アナログのインビボにおける循環半減 期を増加させる方法であって、例えば、６　ＥＧＦ一様ドメイン内の、その糖部 分の全部又はほとんどを除去することを含んで成る方法を、提供する。
図面の簡単な説明 図１は、Ｍｏｎｏ　Ｑカラム上で分けられた可溶性ＴＭ、　（ＳＦ３）の溶出及 び活性プロフィールを示す。
図２は、図１中に示したカラム・プロフィールからのサンプルの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析を示す。
図３は、還元条件下で走らせたサンプルのゲル電気泳動プロフィールを示す。
図４は、ゲル電気泳動プロフィールのウェスタン・プロットを示す。
図５は、トロンビンに結合するＴＭの２軸逆数プロツトを示す。
図６は、ｌＯｘβ−メルカプトエタノール中のサンプル・バッファー中で還元さ れ、そして８％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロード供給された、アンヒドロトリプ シン・カラムからのサンプルの５Ｏ８−ＰＡＧＥを示す。
ＴＭｔ、！ｏ　（ＣＨＯ）Ｍｓｓｓ　Ｌ　ｌｏｔ＃１０２４９１Ａ（供給又は出 発材料）、切り取られたＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）Ｍｉｌｌ　Ｌ　（結合又はプール ）、無傷ＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）Ｍｓｓｓ　Ｌ（流出）、及び分子量マーカー（ｋ Ｄａ）の位置を示す。
図７は、図６の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのゲル・スキャンを示す。ゲルを、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅ ｒ上で走査し、そしてその装置と共に提供されたプログラムＩｍａｇｅＱｕａｎ ｔを使用して分析した。
ＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）Ｍｓｓｓ　Ｌ　ｌｏｔ＃１０２４９１Ａ（供給又は出発材 料）は、切り取られたＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）Ｍｓｓｓ　Ｌである矢印により示さ れた肩をもっている。
この肩は、無傷ＴＭＬ１．ｏ　（Ｃ）１０）Ｍｓｓｓ　Ｌ　（流出）から脱水素 トリプシン・カラムにより除去される。切られたＴＭ、！、　（ＣＨＯ）Ｍｓｓ ｓ　Ｌでは、そのカラムから純粋な形態で溶出される。
発明の詳細な説明 本発明に従えば、新規の７Ｍアナログ、方法、及び組成物であって血栓疾患を治 療することができるものが、提供される。それらは、プロテアーゼ解裂に耐性で ある一本鎖トロンポモジュリン（ＴＭ）又はトロンボモジュリン・アナログに基 く。さらに、他の修飾であって抗血栓の有効な医薬の他の改善された性質をもた らすものを、導入することができる。例えば、そこでは、そのＴＭがトロンビン の直接的な前血液凝固活性を阻害する減少された能力を示し又は他の性質、例え ば、フィブリノーゲンのフィブリンへのトロンビン−仲介変換、酸化耐性、糖添 加耐性、インビボにおける増加された半減期等を示す。薬理学者は、単一の治療 に有効な均一な組成物を含む医薬を好む。このような医薬は、それらが不定の生 物学的効果を含む種を含む多数の種を含む医薬よりも不所望の副作用を少なく誘 導するので、好ましい。本発明は、より生物学的に純粋で、またしばしば化学的 に純粋である種であって従来技術の欠点をもたないものを含む利点をもつ。
従来技術のトロンボモジュリン組成物、特に異種細胞における組換え技術により 製造されたものが、最適な医薬用途を提供するポリペプチドの構造についてのパ ラメーターを決定するために、本発明者により広範に研究された。これらの調査 の経過において、驚くべきことに、分かれた鎖の間のシスティン結合が精製条件 下でそのＴＭの２本鎖形態が一本鎖形態と同時に振る舞うようにさせるので、純 粋な一本鎖ポリペプチドを含むと従来考えられていたトロンボモジュリン調製物 が実際には内部のペプチド解裂をもつトロンボモジュリン・ポリペプチドにより かなり汚染されているが、そのポリペプチドがＴＭの一本鎖形態と共に同時に精 製され続けることが、見つかった。これは、完全長生来ＴＭ、及び可溶性７Ｍ分 子の両方に適用できよう。
この従来分からなかった問題は、部分的に、組換えにより製造されたトロンボモ ジュリンが２−相の非線型結合特性を表すということを現したこれらの調製物の 注意深い分析により、発見された。２軸の逆数プロット分析は、その組成物内の 異なる結合アフィニティーをもつ２つの種の存在を示した。これは、異なる種の 性質に関してのさらなる調査を導いた。還元、非還元、又は生来の条件下で走ら せたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ）を使用した、そして高感度検出技術、例えば、銀又は免疫学的染色を使 用したＴＭ調製物の注意深い分析は、このようなゲル上に、特定の可溶性７Ｍア ナログの予測された９４キロダルトンのバンドに加え、約８０キロダルトンの見 掛は分子量をもつ第二の免疫反応性バンドが存在するという発見につながった。
次に、この組成物は、内部Ｎ−末端の存在と一致する第二Ｎ−末端アミノ酸配列 をもつことが示された。これは、たぶん、ＴＭ配列内の位置における、プロテア ーゼ解裂の結果であり、ＴＭの見掛けの一本鎖形態が解裂した２本鎖種により汚 染されていたということを示している。この種は、ＴＭのトロンビン結合部位の 近く又はその内で解裂される。したがって、２本鎖形態の物理的特徴が一本鎖形 態に同時精製をもたらすように非常に類似しているので、実際には、その混合物 の、生物学的活性、例えば、結合特性は、この従来分からなかった別個の種によ り影響されるようである。本発明は、このような２本鎖汚染物を実質的に含まな いトロンボモジュリン・アナログ組成物を提供することである。
本発明の他の態様においては、トロンボモジュリンの他の改善された組成物が、 提供される。例えば、７Ｍアナログ、特に組換え条件下で異種細胞により製造さ れたものは、成熟Ｎ−末端の上流のアミノ酸配列のシグナル配列プロセシングに より製造されたＮ−末端をもつ。
実際に、この生成物は、そのアミノ末端において同種性を示す。２つのプロセシ ング部位、すなわち、生来のＮ−末端アミノ酸ｌを提供するもの、及び使用され るとき、そのＮ−末端において２以上のアミノ酸を含む、例えば、アミノ酸−２ において開始する、解裂生成物を作り出す第二部位が、在る。７Ｍポリペプチド のＮ−末端をエンコードするＤＮＡ配列の修飾により、そのシグナル配列プロセ シング部位が修飾され、単一のＮ−末端プロセシング部位を、そしてそれ故に得 られる７Ｍアナログのための単−Ｎ−末端を提供することができる。したがって 、生来の分子の最初の３つのアミノ酸を欠失した７Ｍアナログは、ユニークであ るシグナル配列プロセシング部位を提供し、それ故に、単一のＮ−末端配列をも つポリペプチド組成物を作り出す。
そしてさらに、−末鎖ＴＭアナログを作るための内部解裂の除去は、同種のカル ボキシ末端をもつ組成物をもたらす。プロテアーゼ又は他のタンパク質分解解裂 に耐性の構築物が、同様に単一〇−末端を提供するように作られる。これは、プ ロテアーゼ解裂部位の除去又は修飾により行われることができる。例えば、医薬 用途における生物学的機能に決定的でないポリペプチドのＣ−末端領域の一部の 欠失により、その配列がエクソカルポキシベブチダーゼ活性に特に耐性であるア ミノ酸４８９−４９０における一Ｐｒｏ−Ｐｒｏ配列内で終わるポリペプチドを 提供することができる。
他の態様においては、本発明は、また、特定の生来の糖添加パターンを修飾し又 は欠失させることにより、又はプロテアーゼ−感受性配列を除去することにより 、７Ｍアナログのインビボにおける半減期を増加させる方法を提供することであ る。我々の初期の研究は、可溶性ＴＭのタンパク質分解−耐性形態が動物内でよ り長い循環半減期をもつということを示した。したがって、７Ｍ不活性化の原因 であある生理学的機作は、その蛋白の同定領域における又はその近くにおけるタ ンパク質分解であるようである。不活性化を避けるためのその配列の上記セグメ ントの修飾により、より高く有効な治療剤が製造される。増加した半減期は、７ Ｍ治療のために有利である。なぜなら、それは、生来の医薬に比べてより少ない 量のＴＭの投与が等価な薬理学的効果を達成することを、可能にするからである 。少なくとも数分よりも長い生物学的半減期は、より予言できる治療的養生法を 提供する。
さらに、これらの可溶性トロンボモジュリン・アナログを、経済的に製造し、そ して容易に精製し且つ投与することができる。様々な治療用途が、特に抗血液凝 固及び／又は抗血栓治療に関して、期待される。本発明を十分に理解するために 、以下の詳細な説明を記載する。
１、トロンボモジュリンの生物学的活性血栓失調の主要な病因は、刺激、例えば 、損傷血管壁に反応して血塊が形成するということである。この刺激は、血液凝 固カスケードの引き金を引き、そしてそれ故、フィブリノーゲンをフィブリン、 すなわち血塊のマトリックスに変換する能力をもつトロンビンを作り出す。トロ ンボモジュリンは、トロンビンのためのレセプタとして働く内皮細胞膜タンパク 質である。ヒトにおいては、それは、血管の内皮及び中枢神経系を除く全ての臓 器のリンパ上に分布する。
トロンビンは、トロンボモジュリンに可逆的に結合する能力をもつ。
トロンボモジュリンに結合したとき、トロンビンは、プロ血液凝固酵素から抗血 液凝固酵素へ変換される。このトロンビン／−トロンボモジュリン複合体は、少 なくとも２つの別個の方法で血液凝固カスケードを示す。第一に、トロンボモジ ュリンへのトロンビンの結合がプロティンＣのトロンビン−仲介活性化を強化す る。活性化されたプロティンＣは、血液凝固カスケードの他のプロ血液凝固成分 、例えば、因子Ｖａ及びＶｉｌｌａを不活性化し、これは、次に、プロトロンビ ンのトロンビンへの変換を阻害する。プロティンＣのトロンビン−仲介活性化は 、トロンビンがトロンボモジュリンに結合するとき、非常に増強され、すなわち 、プロティンＣ活性化の速度は、少なくとも１０００倍増加される。第二に、ト ロンボモジュリンへの結合は、抗血液凝固効果、例えば、フィブリノーゲンのフ ィブリンへのトロンビン−仲介変換及び血小板のトロンビン−仲介活性化及び凝 集の阻害を、もつ。正常には内皮細胞膜の組み込まれた成分であるけれども、ト ロンボモジュリンは、十分な洗剤の存在中でその膜から解放されることができ、 そして溶液中にあってもトロンビンへの結合能力を保持することができる。
本発明の好ましいトロンボモジュリン・アナログは、全身に投与されたとき、血 栓形成に対して保護するであろう。なぜなら、それらは、他の血液凝固パラメー ター、例えば、血小板の不活性化及び凝集を妨害することなく、トロンビンの生 成を阻害するであろうからである。したがって、可溶性トロンボモジュリン・ア ナログの使用は、血栓形成の予防において有効であろう、さらに、生来のトロン ボモジュリン及び本分野において知られた他の抗血栓剤よりも安全である。
血栓形成が重要な病因学的役割を演じる疾患は、心筋梗塞、多発性血管内血液凝 固、深部静脈血栓、肺塞栓症、敗血症ショック、急性呼吸不全症候群、不安定ア ンギナ（ｕｎｓｔａｂｌｅ　ａｎｇｉｎａ）　、及び他の動脈又は静脈の閉塞症 状を含む。本発明のトロンボモジュリン・アナログは、これらの全てにおいて、 及び血栓形成が病因である他の疾患において、有用である。有用とは、その化合 物が、その疾患を予防するか又はより重篤な状態への進行を防ぐかのいずれかの ための、治療に有用であることを意味する。また、本発明の化合物は、例えば、 生体補綴、例えば、心臓弁を取り込む患者において、安全で且つ有効な抗血液凝 固を、提供する。これらの化合物は、例えば、肺塞栓症又は急性心筋梗塞の治療 におけるヘパリン及びワーファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）を置き換えることがで きる。
特に、これらの化合物は、例えば、外科手術後の、深部静脈血栓（ＤＶＴ）の予 防における役割を見つけられるであろう。脚における血塊の形成は、それ自体、 非致死的な症状であるが、診断が困難であり且つ致死的である、肺塞栓症（ＰＥ ）の発展に非常に密接に関係している。幾つかの予防的養生法の調査及び臨床的 な用途にもかかわらず、ＤＶＴ及び得られたＰＥは、多くの患者の集団において 及び特に整形外科の手術を経験する患者において、かなりの問題を残している。
現存の予防的治療、例えば、ヘパリン、ワーファリン及びデキストランは、典型 的に、整形外科手術患者におけるＤＶＴの事件を、予防を受けていない危険な状 態にある患者における５０％以上から治療された患者の中の２５−３０％まで、 減少させる。初期の出血合併症は、重篤な副作用が在る。最近、日々の実験室テ スト及び投与量における調節は、いくふんの効果を保持しながら出血症状発現を 最小化することを要求される。現存の予防の欠点に基づき、患者を出血に前もっ て置くことなく、ＤＶＴを防ぐことにおいて有効な抗血栓剤は、患者の回復及び 福祉にかなりの衝撃となることができよう。
血管形成術（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）は、閉塞した動脈において開通性を回復 するためにしばしば必要な手順である。開通性は回復されることができるけれど も、血管形成手順においては、動脈の内皮内層がひどく損傷し、そして血塊がし ばしば形成し始めることが、内在している。血管形成と一緒に投与される可溶性 トロンボモジュリン・アナログは、この有害な副作用を防ぐであろう。
多くの急性血栓及び塞栓疾患が、最近、血栓を取り除くために、フィブリン分解 療法により治療されている。最も調査された症状は、急性心筋梗塞（心臓発作） である。急性心筋梗塞の治療に最近使用される剤は、ストレプトキナーゼ、組織 プラスミノーゲン活性化剤及びウロキナーゼを含む。これらの剤の使用は、重篤 な出血合併症を導くことができる。フィブリン分解療法により除去された血栓を もち、そしてその血液の流れが回復された患者は、しばしば、患った血管を、再 閉塞する、すなわち、血塊が再形成される。血栓剤による治療の投与量又は時間 を増加させることによる再閉塞を防ぐ試みが行われたが、出血の事件は、未だ増 加している。したがって、これらの医薬についての治療的インデックスは、狭い 。
トロンボモジュリン・アナログの使用は、その作用が局所的であることを一部の 理由として、再閉塞に対する保護を提供する。すなわち、そこでは、トロンビン が生成されていおり又は血塊から解放されている。それ故、その投与量が次に減 少されることができるトロンビン分解剤との組み合わせにおいて使用されるとき 、出血の危険は、実質的に減少されることができる。
−末鎖トロンボモジュリン又は７Ｍアナログの投与は、ポーラス静脈内注射によ り、一定の静脈内注入により、行われることができる。
また、適当な賦形剤と混合された可溶性トロンボモジュリンは、筋、肉内の部位 から循環中に取り出されることができる。トロンボモジュリン・アナログによる 全身的な治療は、患者から取り出された血液の逐次サンプル上の活性化部分的ト ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより監視されることができ る。この検定において観察される血液凝固時間は、十分なレベルのトロンボモジ ュリンがその循環中で達成されるときに、延長される。しかしながら、これは、 効果の全身的な測定であり、そして発明者は、可溶性７Ｍアナログの有効投与量 が必ずしもＡＰＴＴに影響を与えないということを発見した。本明細書中で使用 するとき、治療的有効投与量とは、病因の血塊の形成を防ぐのに十分なＴＶアナ ログのレベルとして定義する。
投与レベル及び養生法は、例えば、活性化部分的トロンボプラスチン血塊化時間 （ＡＰＴＴ）、トロンビン血塊化時間（ＴＣＴ）　、又はプロティンＣの活性化 プロティンＣ（ＡＰＣ）への変換の検定により測定されるようなトロンボモジュ リンの適当な濃度が維持されるように、当業者により、定例的に調節されること ができる。
血栓疾患の検出及び監視のための幾つかの方法は、公知である。
深部静脈血栓症は、例えば、静脈造影法（ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｖｅｎｏｇｒａｐ ｈｙ）（Ｋｅシンーダンス肢体容積計（ｔｍｐｅｄａｎｃｅ　ｐｌｅｔｈｙｓｍ ｏｇｒａｐｈｌ／）（Ｂｙｎｕｍ、　Ｌ、Ｊ。
ｅＬ　ａｌ、、　（１９７８）　Ａｎｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ　８９：１６２）　、及びトロンボシントスキャン（ｔｈｒｏＩｌｌ ｂｏｓｃｉｎｊｏｓｃａｎ）（Ｅｎｎｉｓ、　Ｊ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｉ！Ｉｎ＋ｅ ｓ。
Ｒ，Ｊ、　（１９７７）　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１２５：４４１）により、検出 されることができる。
これらの方法は、本明細書中に記載する方法及び組成物の効果を監視するために 有用である。
＋１．　７Ｍアナログ 完全長生来ヒト・トロンボモジュリン・タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列 は、単離されている（欧州特許出願第８８８７００７９．６号（これを、引用に より本明細書中に取り込む。））。このｃＤＮＡ配列は、６０．３ｋＤａの５７ ５アミノ酸であって約１８アミノ酸のシグナル配列を含むものを、エンコードし ている。
ウシ、マウス及びヒトのトロンボモジュリンのための配列は、互いに高い程度の 相同性を示す。他のタンパク質との類似性により、トロンボモジュリンの構造は 、推定によりドメインに分けられることができる。用語”　ドメイン”は、特定 の機能又は特徴と関係することができる別個のアミノ酸配列をいう。典型的には 、ドメインは、特徴的な三次構造単位を示す。完全長のトロンボモジュリン遺伝 子は、以下のドメインを含む前駆体ペプチドをエンコードしている二大体のアミ ノ酸の位置　ドメイン −１８−１シグナル配列 １−２２６　１１ｊ−末端（レクチン）ドメイン（Ｌ）２２７−４６２　６　Ｅ ＧＦ一様ドメインＣＢ）４６３−４９７　０−結合筒添加（０）４９８−５２１ 　５ｔｏｐ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ（膜透過ドメイン） ５２２−５５７　細胞質ドメイン。
り本明細書中に取り込む。）を参照のこと。
本明細書中で使用する命名において、添字は、７Ｍアナログ内に含まれるドメイ ンをいう：Ｌ：　レクチン・ドメイン、Ｅ　＝　６　ＥＧＦ一様ドメイン、０・ 〇−結合糖添加ドメイン、Ｍ・膜透過ドメイン、及びＣ：細胞質ドメインである 。したがって、ＴＩＪアナログ６ｈ／２２７−４６２は、ＴＭＥアナログに対応 し、ＴＭ、　（ＳＦ３）は、それが昆虫細胞内で発現されていることを示し、Ｔ ＭＬ、。（Ｃ）１０）は、それがＣＨＤ細胞内で発現されていることを示し、そ してＴＭＤ１２３（Ｚｕｓｈｉ、　Ｍ、、　Ｇｏｍｉ、　Ｋ、、　Ｙａｍａｍｏ ｔｏ。
Ｓ、、　Ｍａｒｕｙａｍａ、１．、　Ｈａｙａｓｈｉ、　Ｔ、、　ａｎｄ　５ｕ ｚｕｋｉ、　Ｋ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
Ｂ、Ｗ、、Ｍｏｏｒｅ、Ｒ，Ｅ、、Ｈｏ５ｋｉｎｓ、Ｊ、、Ｖｌａｈｏｓ、Ｃ， Ｊ、、ａｎｄ　Ｂａｎｇ、Ｎ、［Ｊ。
（１９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、　２８５．１２６０２−１２ ６１０）は、ＴＭＬＥＱアナログに対応する。
特に好ましい一末鎖ＴＭアナログ組成物は、以下の特徴の１以上をもつものであ る： （ｉ）　それらがプロテアーゼ耐性を示し、（ｉｉ）　それらが同種のＮ〜又は Ｃ−末端をもち、（ｉｉｉ）それらが、例えば、生来のトロンボモジュリンの糖 添加部位の少なくとも幾つかの糖添加により、翻訳後修飾されており、 （ｉｖ）　それらが線型の２軸逆数トロンビン結合特性をもち、（ｖ）　それら が比較的低い量の洗剤中の水溶液中で可溶性であり、そして典型的には、移動停 止（膜透過）配列を欠いており、（ｖｉ）　それらが酸化体にさらされた後、活 性を保持し、（ｖｉｉ）　トロンビンに結合したとき、それらがプロティンＣの トロンビン−仲介物質活性化を強化するが、トロンビンの直接的なブロー血液凝 固活性、タンパク質フィブリノーゲンのフィブリンへの変換又は血小板の活性化 及び凝集を阻害する減少された能力をもつ。
最後の２つの特徴についての検定は、製造者の指示書；　ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、　ｌ１ｌｉｎ ｏｉｓにより供給されるＭｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｕｔｏｍａ ｔｉｏｎ　Ｉｎｃ、に従って自動血液凝固タイマー上で走らせることができる。
（また、Ｈ，Ｈ，５ａｌｅＩＩｌｅｔ　ａｔ、。
（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２５９：１２２４６−１ ２２５１（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。生 来のトロンボモジュリンとの比較において、好ましい７Ｍアナログは、６表皮成 長因子［ＥＧＦ］一様ドメインを包むように修飾されており、そしてまた、〇− 結含糖添加及び／又はレクチン・ドメインを含むことができる。
好ましい態様においては、可溶性ＴＭアナログは、オキシダント耐性である。こ れは、オキシダントに晒された後に活性を保持するアナログをいう。このような アナログは、１９９０年８月９日に出願された同時係属中の共同の米国出願逐次 番号第０７７５０６．３２５号（これを、引用により本明細書中に取り込む。） 中に詳細に記載されている。
本発明の目的のために、以下の用語を定義する：”プロテアーゼ部位”は、本明 細書中で使用するとき、プロテアーゼの活性を受けやすい、認識、結合、解裂、 又は他の部位を定める７Ｍポリペプチド内の１又は一連のアミノ酸をいう。例え ば、この部位に含まれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸酸基により置換さ れ又は欠失されたとき、プロテアーゼは、もはや、その部位においてＴＭを解裂 させることができない。この用語は、また、例えば、立体配置的に露出され、そ してプロテアーゼ活性を利用されることにより、プロテアーゼに固有に感作され やすい７Ｍ分子を包含する。
”プロテアーゼ解裂部位”は、本明細書中で使用するとき、プロテアーゼが７Ｍ ポリペプチド・アナログを解裂する正確な位置をいう。
”単−Ｎ−末端”及び”単−Ｃ−末端”は、本明細書中で使用するとき、それら の文字通りの意味をもち、それは、機能的にその組成物の所有物をいう、例えば 、慣用の逐次的アミノ酸配列分析の間、それぞれの分解サイクルは、異なるアミ ノ酸残基を本質的に欠いたアミノ酸残基の除去をもたらす。したがって、Ｎ−末 端アミノ酸の段階的除去の数サイクル、例えば、ｌＯプサイルの後、本質的にた った１つのアミノ酸がそれぞれのサイクルにおいて回収される。特に、使用され た分析手順に従って完全に純粋な一本鎖から統計的に予測されるであろうよりも 多くの配列内の異種性は、検出されないであろ”−末鎖ＴＭ″は、非解裂ペプチ ド鎖の実質的に全てを含むＴＭの組成物をいう。−重鎖組成物内のポリペプチド の全ては、同一のアミノ又はカルボキシ末端を示す必要はない。
”２本鎖ＴＭ”は、典型的には、壊れたペプチド結合をもつポリペプチドの約０ ．５〜３％の過剰において、物理的に検出可能な量を含む組成物をいう。
”２本鎖トロンボモジュリンを欠いた”とは、本明細書中で使用するとき、その 組成物が本質的に全ての一本鎖ＴＭを含んで成ることを意味する。典型的には、 ２本鎖ＴＭの量は、モル量において約２５Ｘ未満、より典型的には、１５％未満 、好ましくは約１０Ｘ未満、より好ましくは５％未満、そして特に好ましい態様 においては、３Ｘ未満である。
あるいは、組成物内の２本鎖ＴＭの量は、純粋な一本鎖ＴＭの比活性におけるか なりの減少を引き起こすであろうものよりも少ない、例えば、２本ＭＴＭの量は 、本明細書中で定義する線型２軸逆数プロツトを変更する量よりも少ない。した がって、２本鎖ＴＭ分子は、追加のＮ−及び／又はＣ−末端の製造をもたらす少 なくともｌの切断をもつポリペプチド鎖の形態で存在する。
”実質的に生来のトロンボモジュリンの生物学的活性を保持する”とは、本明細 書中で使用するとき、そのトロンボモジュリンが生来の膜結合７Ｍ分子と生物学 的活性を共有するというこを意味する。
一般的には、タンパク質の１グラム当たりの単位における活性は、生来のトロン ボモジュリンの活性の、少なくとも約５０ｘ、普通には７５ｘ、典型的には８５ ｘ、より典型的には９５％、好ましくは１００！％そしてより好ましくはｔｏｏ ｘを超えるものである。この生物学的活性は、トロンビン−仲介のプロティンＣ 活性化（ＡＰＣ）の、活性化部分的トロンボプラスチン血塊化時間（ＡＰＴＴ） の、トロンビン血塊化時間（ＴＣＴ）の、又はＴＭの生物学的、好ましくは治療 的活性の、ものであることかできる。生来の比較標準は、ＴＭの完全長膜結合変 異体であるが、多くの場合には、レクチン／ＥＣＦ１０−結合ドメイン（ＴＭ　 Ｌ、。）を含んで成る可溶性ＴＭを、より便利な標準として使用することができ る。
”糖添加部位”は、糖残基の付着のための位置として真核細胞により認識される アミノ酸残基をいう。糖が付着されるアミノ酸は、典型的には、（Ｎ−結合糖の ための）Ａｓｎ、（〇−膜結糖のための）トレオニン又はセリンの残基である。
付着の特異的な部位は、典型的には、アミノ酸の配列、例えば、はとんどのＮ− 結合付着のためのＡｓｎ−Ｘ−（Ｔｈｒ又は５ｅｒ）及びほとんどの〇−膜結合 付着ための（Ｔｈｒ又は５ｅｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ　Ｉここで、Ｘは、いずれか のアミノ酸である）により、印を付けられている。グリコサミノグリカン（硫酸 化糖の特定タイプ）の認識配列は、一般的には、５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＧＩＹで あるが、Ｘ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｖａｌであることもできる。用語Ｎ−結合及 び〇−膜結合、その糖とそのアミノ酸残基との間の付着部位として作用する化学 基をいう。Ｎ−結合糖は、アミド基を通して付着し；〇−膜結糖は、ヒドロキシ ル基を通して付着する。
”インビボにおける循環半減期”は、哺乳類内の投与された血漿活性がｌ／２程 減少するのにかかる平均時間をいう。
”生来のトロンボモジュリン”とは、それが天然において生じるような完全長タ ンパク質をいう。生物学的活性が生来のＴＭに関して記載されるとき、この用語 は、洗剤可溶化水溶液形態を包含する。
しばしば、活性に対する比較の文脈において、トランスフェクトされた可溶化ポ リペプチドは、実質的に同一の性質を示すことができる。
″〇−結合された糖添加ドメイン”は、表１中に記載するような生来のトロンボ モジュリン配列の４６３から４８５まで番号を付けられたアミノ酸の配列をいう 。
”酸化耐性アナログとは、酸化剤、例えば、酸素ラジカル、クロラミンＴ、過酸 化水素、又は活性化好中球に晒された後に、実質的な量の生物学的活性を維持す ることができるトロンボモジュリンのアナログをいう。
”医薬賦形剤”とは、医薬治療剤を完全化するために使用される非毒性の、医薬 として許容される材料をいう。これらの材料は、不活性であり、例えば、水及び 塩、又は生物学的に活性な、例えば、抗生物質又は鎮痛剤であることができる。
”減少された能力”とは、生物学的性質の統計的に有意な低下をいう。この性質 は、非限定であり、そおしてその性質の測定又は定量化は、標準的な手段による 。
”糖残基”とは、グルコサミン並びにタンパク質に共有結合する他の炭水化物誘 導体及び部分を含むヘキソース及びペントースの炭水化物をいう。
”硫酸塩置換基”は、ペントース又はヘキソース糖上の硫黄含有置換基である。
”フィブリノーゲンのフィブリンへのトロンビン−仲介物質変換”とは、トロン ビンが、その後重合し血塊を形成するフィブリン・モノマーを作るために前駆体 タンパク質フィブリノーゲンを解裂させるところの酵素活性をいう。
”血栓疾患”とは、哺乳動物の健康に有害である又は有害であることができる１ 以上の血栓の形成を特徴とする哺乳動物における病的症状をいう。
”　トロンボモジュリン・アナログは、先に記載したように、天然のＴＭの生物 学的活性を実質的に保持しており、そして天然変異体ＴＭのものと異なる分子構 造をもつペプチドである。例えば、この用語は、生来のトロンボモジュリンのも のと同−又は相同なアミノ酸配列をもつタンパク質、不溶性及び可溶性のトロン ボモジュリンのペプチド又は断片、及び酸化耐性７Ｍ種であって、全てがトロン ボモジュリン様活性をもつものをいう。これらの化合物は、生来のＴＭと比較す るとき、そのタンパク質のプロティンＣ活性化補因子の特性を有意に減少させな いアミノ酸の変更を含んで成る誘導体及び分子をも含む。
“伝達ベクター”とは、他の細胞、例えば、昆虫細胞中に、例えば、野性型バキ ュロウィルスにより、同時トランスフェクトされたベクターをいう。この伝達ベ クターは、ウィルス、例えば、バキュロウィルス、のゲノムと、その伝達ベクタ ーとの間の組換えを、例えば、異種標的遺伝子によりそのバキュロウィルス多角 体遺伝子を置き換えながら、行うような方法で、構築される。ベクターが宿主細 胞により維持される場合には、そのベクターは、自己複製構造物とし、て細胞分 裂の間にその細胞により安定して複製されることができるか、又はその宿主のゲ ノム内に取り込まれるかのいずれかである。
本明細書中で使用するとき、”可溶性７Ｍアナログは、水溶液中に溶解する７Ｍ アナログであり、そして、典型には、細胞により分泌されることができる。薬理 学的投与のためには、生来の細胞質ドメイン又はアナログを含んで成る可溶性７ Ｍアナログ又は不溶性アナログは、場合により、リン脂質小胞、洗剤、又は薬理 学的配合の分野における当業者によく知られた他の類似の化合物と、組み合わさ れることができる。本発明の好ましい７Ｍアナログは、血流中で可溶性であり、 そのアナログを様々な抗血液凝固及び他の治療において有用なものにするもので ある。これらの修飾は、典型的には、生来のトロンボモジュリンに比べて多くの 活性、例えば、トロンビンにっいてのアフイニテス−又はプロティンＣ活性化に おける活性に有意には影響を与えない。
２つの好ましいアナログは、６ＥＧＦ一様ドメインを包含し、そして４　ｔ／２ ２７−４６２（ここで、そのアナログはヒト組織プラスミノーゲン活性物質シグ ナル・ペプチドの最後の４残基をもつ。）及び６ｈ／２２７−４６２（６ｈは、 ヒボダーミンＡシグナル配列の最後の６残基である。）である。より好ましいも のは、３８８位においてロイシンによりメチオニンを置換することにより酸化耐 性を与えられるようなアナログである。
他の好ましい態様は、ＭｅＬ３８８、Ａｒｇ４５６、旧５４５７．５ｅｒ４７４ に対する修飾並びにびＮ−及びＣ−末端における欠失による、アミノ酸３−４９ ０に対応するアナログである。この態様は、真核細胞内、例えば、動物細胞、を 椎動物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞等、特にＣＩ（０及びＣＨＬＩ細 胞内でその遺伝子を発現させるときに、特に有用である。
Ａ、７Ｍアナログ製造のための一般的方法本発明は、様々な公知の方法で達成さ れることができる分子遺伝子操作を包含する。本発明の組換え体細胞、プラスミ ド、及びＤＮＡ配列は、組換え体細胞から分泌された化合物がトロンボモジュリ ンの可溶性誘導体であるところの医薬として有用な化合物を製造する手段を提供 する。
一般的には、本出願において使用される一般的実験手順の命名の定義及び記載は 、Ｊ、　５ａＩｒｌｂｒｏｏｋ　ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、　Ａ（すｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　（１９８９）　Ｃｏ１ｄ 　５ｐｒｉｒ＋ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ中に見られることができる。このマニ ュアルは、以下、Ｓａｍｂｒｏｏｋとしていい、そして引用により本明細書中に 取り込む。さらに、Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓｌＣｕｒｒｅｎｔ 　ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｗｉｌｅｙｌｎｔｅｒｓｃｉｅ ｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋは、本出願にお（Ｘで有用な方法について開示して いる。
すべての酵素を、製造者の指示に従って使用する。
商業的に入手可能でないオリゴヌクレオチドは、Ｄ、Ｒ，Ｎｅｅｄｈａｍ−Ｖａ ｎＤｅｖａｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２：６１５９−６１６８中に記載されているような自動合 成装置を使用してＳ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅａｎｄ　Ｍ、ｔｌ、　Ｃａｒｕｊ ｈｅｒｓ、　（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ、、　２２（ ２０）：１８５９−１８６２により最初に記載されている固相ホソホルアミジッ ト・トリエステル法に従って化学的に合成されることができる。オリゴヌクレオ チドの精製は、生来のアクリルアミド・ゲル電気泳動又はＰｅａｒｓｏｎ。
Ｊ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｒｅｇｎｉｅｒ、　Ｆ、Ｅ、　（１９８３）　Ｊ、　Ｃｈ ｒｏｍ、、　２５５：１３７−１４９中に記載されているアニオン−交換ＨＰＬ Ｃのいずれかによる。ヌクレオチドのサイズを、キロベース（ｋｂ）又は塩基対 （ｂｐ）のいずれかで与える。
これらは、アガロース若しくはアクリルアミド・ゲル電気泳動から又は公開され たＤＮＡ配列から得られた推定値である。
クローン化された遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、Ｍａｙａｍ、　 ／ＬＭ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　）ｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ、　６５：４９９−５６０の化学分解法、又は類似の方法を使用し て、確認されることができる。この配列は、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ ｔ法、前記、又はＷａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、。
ｅｔ　ａｔ、、　（１９８１）　Ｇｅｎｅ、　１６：２１−２６の二本鎖テンプ レートを配列決定するための鎖停止法を使用して、そのオリゴヌクレオチド断片 を二本鎖ＤＮＡ配列中に組み立てた後に、確認されることができる。サザン・プ ロット・ハイブリダイゼーション技術を、５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｔ、。
（１９７５）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８：５０３に従って行った。
本発明の態様は、しばしば、インビトロにおける突然変異誘発による新たなペプ チド及び遺伝子の創出を含む。標的遺伝子は、中間体ベクター内で単離され、モ して原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕ ｓ）、又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）内での増幅のために クローン化される。最も好ましいのは大腸菌である。
なぜなら、その生物は、培養が容易であり、そして他の種の原核生物よりもより 十分に理解されているからである。Ｓａｍｂｒｏｏｋマニュアルは、その後に記 載された大腸菌内クローニングの全てを導くのに十分な方法論を含んでいる。Ｍ ｌｌ−１株は、特にことわらないかぎり好ましい。大腸菌株の全ては、グルコー スを含むＬｕｒｉａブリス（ＬＢ）又はグルコース及び酸−加水分解カゼイン・ アミノ酸を補われたＭ９培地上で、培養される。抗生物質に耐性をもつ株を、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ中に記載する薬剤濃度において維持した。形質転換を、Ｍｏｒｒ ｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ。
（１９７７）　Ｊ、　Ｂａｃｔｌ、　１３２：３４９−３５１により又はＣ１ａ ｒｌ−Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、Ｅ、。
ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｒ，（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ、１０１：３４７−３６２゜Ｅｄｓ、　Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋにより、記載さている 方法に従って行った。代表的なベクターは、商業的源から入手可能なｐＢＲ３２ ２及びｐＵＣシリーズを含む。
Ｂ、　遺伝子合成 生来のトロンボモジュリンをエンコードしている遺伝子は、幾つかの種から、そ のゲノム形態で且つｃＤＮＡとして、単離し、そして配列決定されている（Ｊａ ｃｋｍａｎ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：８８３４−８８８３８　ａｎｄ　（１９８７）　８ ４：６４２５−６４２９（これらの両方を、引用により本明細書中に取り込む。
）。
ヒト・トロンボモジュリン及びトロンビンをエンコードしている完全長ＤＮＡ配 列の公開は、遺伝子の調製を容易にし、そして７Ｍペプチドをエンコードしてい るＤＮＡ配列を構築するための出発点として使用される。例えば、Ｇｅｎｅｂａ ｎｋ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ　ｃｌｏ　ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ。
Ｉｎｃ、、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａを参照のこ と。本発明のペプチドは、好ましくは、内部のアミノ酸置換をもつことに加えて ＴＭの移動停止配列を欠く可溶性誘導体である。イーのＪ二、これらのアナログ は、これらのポリペプチドをエンコードしている遺伝子を含むプラスミドにより トランスフェクト又は形質転換された真核細胞から分泌される。修飾、例えば、 アミノ酸置換、欠失、又はシグナル配列のクローン化遺伝子ヘノ付加を作るため の方法は、公知である。本明細書中で使用する特定の方法を、以下に記載する。
トロンボモジュリンのための完全長遺伝子を、幾つかの方法により調製すること ができる。ヒト・ゲノム・ライブラリーは、商業的に入手可能である。これらの 遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド争プローブを、公開された遺伝子配列を使 用して合成することができる。オリゴヌクレオチド・プローブによるゲノム・ラ イブラリーのスクリーニング方法は、公知である。トロンボモジュリンのための 遺伝子配列の公開は、そのコーディング領域内にイントロンが全く存在しないと いうことを証明した。したがって、ゲノムのクローンは、公知方法を使用してト ロンボモジュリンのための発現プラスミドを構築するための必要な出発材料を提 供する。
トロンボモジュリンをエンコードしているＤＮＡ断片は、その遺伝子に隣接する か又はその内部にある領域内で同定された制限エンドヌクレアーゼ部位を利用す ることにより、持ってくることができる。
（Ｊａｃｋｍａｎ、　Ｒ，Ｗ、、　ｅｔ　ａｔ、、　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、。
８４　：　：６４２５−６４２９）。
あるいは、完全長遺伝子を、ｃＤＮＡライブラリーから得ることもできる。例え ば、内皮細胞から作られたメツセンジャーＲＮＡは、ｃＤＮＡの調製のための好 適な出発材料を提供する。トロンボモジュリンをエンコードしている遺伝子を含 むｃＤＮＡ分子は、先に記載したように同定される。ｃＤＮＡライブラリーの調 製方法は、よく知られている（前記、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）。
７Ｍペプチドをエンコードしている遺伝子を、完全長トロンボモジュリンをエン コードしている遺伝子を使用して最初に構築された野性型７Ｍ遺伝子から、作る ことができる。その後の突然変異のための野性型７Ｍペプチド遺伝子の好ましく は調製方法は、合成オリゴヌクレオチド・プライマーの使用と、ｍＲＮＡ又はＤ ＮＡテンプレート上のポリメラーゼ伸長とを組み合わせる。このポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）法は、所望のヌクレオチド配列を増幅する。米国特許第４．６ ８３．１９５号及び第４．６８３．２０２号は、この方法について記載している 。制限エンドヌクレアーゼ部位は、上記プライマー中に取り込まれることができ る。上記ＰＣＲ反応により増幅された遺伝子は、アガロース・ゲルから精製され 、そして適当なベクター中にクローン化されることができる。天然の遺伝子配列 内の変更は、インビトロにおける突然変異誘発の技術により又は適当な突然変異 を取り込むように設計されたプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応の使用によ り、導入されることができる。Ｉｎｎ１ｓ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、 　（１９９０）、　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ａｃａｄｅｏ＋ｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓを参照のこと。
本明細書中に記載する７Ｍペプチドは、典型的には、真核細胞培養において発現 されるときに、分泌される。分泌は、トロンボモジュリン遺伝子の生来のシグナ ル配列の使用により、得られることができる。あるいは、本発明の７Ｍペプチド をエンコードしている遺伝子を、生来のトロンボモジュリン遺伝子に対応するも の以外のシグナル配列に適当な読み取り枠内で結合することができる。例えば、 （−ＰＡの（引用により本明細書中に取り込むＷｏ　８９１００６０５を参照の こと。）、又はヒボダーミンＡ若しくはＢの（引用により本明細書中に取り込む ＢＰ　３２６，４１９を参照のこと。）シグナル配列を、そのポリペプチドに結 合することができる（表２を参照のこと。）。本発明の好ましい態様においては 、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子の第二イントロンを含むｔ−ＰＡのシグナル配列が使用さ れる。このイントロンを含むことは、その隣接する構造遺伝子の発現レベルを増 強する。
本発明のあるアナログにより、生来のトロンボモジュリン遺伝子のカルボキシル 末端領域の移動停止及び細胞質のドメインをエンコードしている遺伝子のこれら の部分が、欠失される。それ故、翻訳が所望の位置において終止するように、終 止コドンを付加することが必要である。あるいは、終止コドンは、所望の発現プ ラスミドにより提供されることができる。さらに、ポリアデニレーンヨン配列が 、７Ｍアナログをエンコードしている真核細胞内でｍＲＮＡの適当なプロセシン グをかうほするために、使用されることができる。また、７Ｍアナログの発現の ために、それが存在しない場合には、開始コドンを提供することが有用であるこ とができる。このような配列は、生来の遺伝子から又は発現プラスミドにより提 供されることができる。
原核生物及び真核生物内での複製及び組み込みに好適な、そして転写及び翻訳タ ーミネータ−１開始配列及び７Ｍペプチドの発現の調節に何周なプロモーターを 含むクローニング・ベクターを、本明細書中に記載する。このベクターは、少な くとも１の独立したターミネータ−配列、真核生物及び原核生物の両方内でのプ ラスミドの複製を許容する配列、すなわち、シャトル・ベクター、及び原核生物 及び真核生物の系の両方のための選択マーカーを含む発現カセットクローニング 方法の使用に加えて、原核生物内で７Ｍアナログを発現させることが望ましいか もしれない。以下にさらに詳細に討議するが、成熟タンパク質の炭水化物部分は 、プロティンＣの活性化のための補因子としての活性のために不可欠ではないが 、７Ｍアナログの直接的抗血液凝固性質並びに循環中でのその分子の半減期に対 する効果をもっている。大腸菌内のトロンボモジュリン・アナログの発現は、こ の論点の分析のための有用な道具を提供した。可溶性７Ｍアナログをエンコード している発現プラスミドにより形質転換されたバクテリア内でのクローン化遺伝 子の発現方法は、よく知られている。原核生物系においてクローン化遺伝子の高 いレベルの発現を得るためには、最小限、ｍＲＮＡ転写終止に向けられる強いプ ロモーターを含む発現ベクターを構築することが、しばしば不可欠である。
この目的に好適な調節領域の例は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダ ーゼ遺伝子のプロモーター及びオペレーター領域、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ） 　トリプトファン生合成経路、又はラムダ・ファージからの左側のプロモーター である。大腸菌内に形質転換されたＤＮＡベクター内に選択マーカーを含むこと が、有用である。このようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン 、又はクロラムフェニコールに対する耐性を指定する遺伝子を含む。
大腸菌内での使用のための選択マーカー及びプロモーターに関する詳細について は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記を参照のこと。本発明の１つの記載された態様にお いては、ｐＵｃ１９が、所望の遺伝子配列のサブクローニング及び増幅のための ベクターとして、使用される。
Ｄ、　真核細胞内での７Ｍペプチドの発現所望の７Ｍペプチドの発現のために選 ばれた発現系において当業者が知得可能であることが予測され、そして真核生物 内でのタンパク質の発現のために知られた様々な方法を詳細に記載する試みを、 全く行わない。
可溶性７ＭアナログをエンコードしているＤＮＡ配列を、宿主細胞培養物を形質 転換することにおける使用のための様々な発現ベクターに連結することができる 。このベクターは、典型的には、マーカー遺伝子並びにその異種遺伝子の転写及 び翻訳を開始させるための遺伝子配列を含む。
このベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の 特色、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メタロチオネイン、ハイグロマイシ ン、又はネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼを、提供する。オートグラフ ァ・カリフォルニアスフエクトされた昆虫細胞をスクリーンするために有用であ る。酵母のためには、Ｌｅｕ−２、Ｕｒａ−３、Ｔｒｐ−１、及び旧ｓ−３が公 知の選択マーカーである（Ｇｅｎｅ　（１９７９）　８：１７−２４）。上記の 科学的原理を具体化し、公知の及び非公知の両方の、多数の他のマーカーであっ て、その中の全てが、本発明により包含されるベクターによりトランスフェクト された上記の真核細胞を検出するためのマーカーとして有用であろうものが、在 る。
ＴＭアナログの発現に有用なより高等な真核細胞系の中に、選択される多数の細 胞系が在る。哺乳類細胞系の例示的な例は、ＲＰＭＩ　７９３２、ＶＥＲＯｌ及 び）ＩｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ２Ｂ５ 、ＢＨＫ　、　Ｃ０８−７、Ｃ１２７、又はＭＤＣＫ細胞系を含む。好ましい哺 乳類細胞系は、ＣＨＬ−１又はＣＨＯである。ＣＨＬ−１を使用するとき、ハイ グロマイシンが真核生物の選択マーカーとして含まれる。ＣＨＬ−１細胞は、Ｒ ＰＭＩ　７９３２メラノーマ細胞、すなわち、容易に入手可能なヒト細胞系から 得られる。ＣＨＬ−１細胞系は、ブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣに寄託 されており、そして１９８７年６月１８日に寄託された＃ＣＲＬ　９４４６を与 えられている。本発明における使用に好適な細胞は、ＡＩＩＩｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから商業的に入手可能である。
先に記載したように、宿主細胞を形質転換するために使用される発現ベクター、 例えば、プラスミドは、好ましくは、転写を開始させるための遺伝子配列、及び ＴＭペプチド遺伝子配列の翻訳を制御するための配列を、含む。これらの配列は 、発現制御配列という。宿主細胞が昆虫又は哺乳類起源の内にあるとき、例示的 な発現制御配列は、これに限定されないが、以下のニレトロウィルスのロング・ ２７：２９９−３０８）　、又は他のベーターグロブリン・プロモーター（Ｌｕ ｃｉｗ。
Ｐ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｃｅ１ｌ、　３３ニア０５−７１ ６）を、含む。発現制御配列を含む受容体ベクターの核酸を、制限酵素を使用し て解裂させ、そして必要な又は望ましいサイズにおいて調節する。このセグメン トを、本分野においてよく知られた手段により７Ｍペプチドをエンコードしてい るＤＮＡ配列に連結する。
より高等な動物細胞を使用するとき、ポリアゾニレ−ジョン又は転写終止配列は 、正常には、そのベクター中に取り込まれることが必要である。ポリアゾニレ− ジョン配列の例は、転写ターミネータ−としても作用することができるＳＶ４０ からのポリアゾニレ−ジョン配列である。
適当なベクター内に取り込まれた遺伝子を、過渡的な発現系又は好適なりローン 内のいずれかにおいて、使用することができる。前者においては、収率はあ、低 いが、その実験は、迅速である。後者においては、高生産クローンを単離するた めにはより長い時間を要する。異なるベクターを、上記２つの異なるタイプの実 験のために使用することができる。特に、過渡的発現の場合には、配列は、その 細胞内でそのプラスミドが高いコピー数まで複製されることを可能にするプラス ミド内に含まれることができる。これらの配列は、ら得られることができる。ま た、過渡的発現における使用のためのベクターは、しばしば、強いプロモーター 、例えば、ＳＶ４０初期プロを制御するために、含むであろう。過渡的発現は、 遺伝子生成物の検定のための迅速な方法を提供スルガ、そのプラスミドＤＮＡは 、その宿主細胞染色体内に取り込まれない。したがって、過渡的発現ベクターの 使用は、安定したトランスフェクトされた細胞系を提供しない。過渡的発現に好 適なプラスミドに記載は、Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ、、　ａｎｄＳｅｐｄ、Ｂ、（１ ９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８４： ８５７３−８５７７により提供される。
ＴＭアナログは、あるいは、バキュロウィルス系を使用して先に記載した昆虫細 胞系内で製造されることができる。この系は、Ｌｕｃｋｏｗ。
Ｖ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、Ｄ、（１９８８）　Ｂｉｏ／ｌｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６：４７−５５により記載されている。一般的には、この 発現系は、はとんどの哺乳類系により提供されるものよりも高いレベルの発現を 提供する。バキュロウィルスは、宿主細胞に感染し、多数のサイクルを通してそ のゲノムを複製し、そして次に多量の多角体結晶を作り出す。この多角体遺伝子 を、７Ｍペプチド遺伝子と置き換えることができる。次に多角体プロモーターは 、培養宿主細胞の感染及びバキュロウィルス・ゲノムの複製の後に、多量のアナ ログ・タンパク質を作るであろう。
この非分泌遺伝子生成物を、感染３−７日後にその宿主から収穫する。
あるいは、７Ｍペプチドは、適当なシグナル配列がそのタンパク質上に存在する 場合には、その細胞から分泌されることができる。この宿主細胞は、コンピテン トであり、又は様々な手段によりトランスフェクションのためにコンピテントに される。動物細胞中にＤＮＡを導入する幾つかのよく知られた方法が在る。これ らはニリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン技術、受容体細胞とその ＤＮＡ　ＷＯ含むバクテリアのプロトプラストとの融合、エレクトロポレーショ ン及びその細胞内へのそのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションを含む。
Ｐｅｒｂａｌ、　Ｂ、”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆ 　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｗｉｇｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、。
（１９８７）−５壮ん−１６＋７７７−７８５　（これらを、それぞれ引用によ り本明細書中に取り込む。）を参照のこと。
Ｅ、培養細胞 宿主細胞が速い細胞培養を可能とし、そして発現された遺伝子生成物を適当に糖 添加することができることが、好ましい。組織培養における濃密な増殖に好適で あることが知られている正常な及び形質転換された両方の細胞が、特に望ましく 、そして様々な無を椎又はを椎動物細胞が本分野において使用されている。特に 、組換えＴＭ発現に好適な宿主であり、そして培養条件下、生来のトロンボモジ ュリンの解裂をもたらすプロテアーゼを生産し又は含む細胞は、目下、突然変異 されたプロテアーゼ非感受性７Ｍアナログの解裂におい７仝く問題を提出しない 。このような細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＩＩＬ−１（ヒト・メラノーマ細胞としで 特徴付けられる）　、Ｓｆ９細胞、等であってＡＴＣＣから公に入手可能なもの を含む。
トランスフェクトされた細胞を、本分野においてよく知られた手段により増殖さ せる。例えば、Ｋｕｃｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　Ｂｉｏｃｈｃｎ ＋ｉｃａ１Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ、を参照のこと。この発現生成物は、そのタンパク質が宿主細胞から 又は、例えば、本分野においてよく知られた機械的又は酵素的手段によりその宿 主細胞の破壊の後、細胞懸濁液から分泌されるような系内で、その細胞培地から 収穫される。
Ｆ、７Ｍアナログの精製 本発明の７Ｍペプチドが組換え真核細胞を培養することにより分泌されることが 好ましい。この７Ｍアナログは、血清不合又は血清を補った培地中で生産され、 そして無傷で分泌される。原核細胞を使用する場合には、ＴＭアナアログは、細 胞内に置かれることができる。
組換え体細胞の増殖及びこれに付随する７Ｍアナログのその培養基中への分泌の 後に、この”ならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉａ）”を収穫する 。このならし培地を、次に、遠心分離又は濾過により清澄化し、細胞及び細胞死 骸を除去する。この清澄化培地中に含まれるタンパク質を、いずれかの好適な樹 脂、例えば、Ｑ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ又は金属キレートへの吸着により、又は硫 酸アンモニウム分画、ポリエチレンン・グリコール沈降の使用により、又は限外 濾過により、濃縮する。
本分野において知られた他の手段も、等しく好適であることができる。７Ｍアナ ログのさらなる精製を、Ｇａ１ｖｉｎ、　Ｊ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１ ９８７）並びに本明細書中に開示する態様中に記載するやり方で、行うことがで きる。培養細胞により分泌された７Ｍアナログの精製は、例えば、アフィニティ ー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー・−、サイズ・クロマ トグラフィー、又は他の慣用のタンパク質精製技術の追加の使用を必要とする。
例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ　（ｅｄ、）。
Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”　ｉｎ　）Ｊ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｒｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ。
１８２　（１９９０）を参照のこと。
組換え体７Ｍアナログは、非還元クロマトグラフィーの条件下で識別可能な様々 な形態で見つけられることができる。低い比活性をもつような種の除去が、望ま しく、そしてアニオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーを含む様々なりロ マトグラフィーの技術により、達成される。組換え体７Ｍアナログを、圧力透析 及び揮発性バッッファー（例えば、Ｎ−エチルモフフォリン（ＮＥＭ）　、２炭 酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、及び酢酸ピリジン）中へ直接に交換される バッファーにより、濃縮することができる。さらに、サンプルを、このような揮 発性バッファーから直接に凍結乾燥し、塩及び洗剤を欠いた安定なタンパク質粉 末をもたらすことができる。さらに組換え体アナログの凍結乾燥サンプルを、注 入液（例えば、リン酸塩バッファー生理食塩水）と相溶性のバッファー中で使用 する前に効率よく再溶解させることができる。他の好適な塩又はバッファーは、 塩化水素、臭化水素、硫酸塩、酢酸塩、ベンゾエートリンゴ酸塩、クエン酸塩、 グリシン、グルタメート、及びアスパルテートを含むことができた。
Ｇ、　酸化耐性７Ｍアナログ 生来のトロンボモジュリンは、酸化を受けやすく、そして酸化されたとき、プロ ティンＣの活性化を促進するその能力を失う。また、抗血液凝固を必要とする疾 患症状の多くが、生体分子を不活性化し、そしてかなりの組織損傷を引き起こす ことができる高いレベルの毒性酸素ラジカルと関連している。これらの症状の例 は、心筋梗塞関連の再潅流損傷、敗血症関連ＤＩＣ及び成人呼吸不全症候群関連 の肺胞繊維症（ａｌｖｅｏｌａｒ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ）である。（Ｏｔａｎｉ、 　！（、、ｅｔ　ａｌ、。
（１９８４）　Ｃ１ｒｃ、Ｒｅｓ、５５：１６８−１７５．　５ａｌｄｅｅｎ、 Ｔ、、（１９８３）　Ｓｕｒｇ、Ｃｌ１ｎ。
ば、外科的手順において生じるようなものは、毒性酸素種を作り出すことができ る活性化された単球、多型核白血球等の流入、並びにエラスターゼの如きタンパ ク質分解酵素の宿主の解放を含む。内皮細胞損傷、炎症、及び血栓症の間の関係 は、長い間認められてきた（例えば、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃ ｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｗｏｕｎｄ　Ｒｅｐａｉｒ。
ｃｄ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｒ，Ａ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｆ’、Ｍ、　Ｈｅｎ５ｏｎ　（ １’９８８）を参照のこと。）。トロンボモジュリンは、毒性酸素種に晒される ことにより不活性化を受け、そしてこれは、多くの病的症状において重要な役割 をもっていると予想される。
酸化に耐性なアミノ酸、特にメチオニンを与える方法は、本分野においてよく知 られている。例えば、酸化耐性スルホニウム基を作るために、ヨード酢酸により チオール・エーテル基を化学的に修飾することが可能である（Ｇｕｎｄｌａｃｈ 、　Ｈ，Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９５９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ＋、　２３４：１７５４）。好ましい方法は、上記の感受性アミノ酸の 除去又はオキシダントと反応しないであろう１以上の異なるアミノ酸によりそれ を置換することによる。アミノ酸、ロイシン、アラニン、及びグルタミンが、そ れらのサイズ及び中性の特徴のために、特に好ましいアミノ酸である。可溶性ト ロンボモジュリンの４つのメチオニンであって、特に、２９１及び３８８残基に 位置するものは、酸化を受けることができる。たった１つのメチオニンを遮断し 又は除去する場合には、それが３８８位における残基であることが好ましい。
タンパク質の配列内でアミノ酸が除去され又は置換されることができるところの 方法は、よく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔａｌ、、前記；　 Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、前記；　Ｕ、Ｓ、　４，７３７，４６２；　ｕ 、ｓ、　４，５８８，５８５゜ＥＰ−０２８５１２３，及びその中で引用された 文献を参照のこと。変更されたアミノ酸配列をもつペプチドをエンコードしてい る遺伝子を、例えば、合成的に作ることができる。好ましい方法は、インビトロ における部位指定突然変異誘発の使用である。部位指定突然変異誘発は、−末鎖 標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を特異的に変更するために設計された所望のヌク レオチドの置換、挿入、又は欠失を含む合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの 使用を含む。プライマーともいわれるこのオリゴヌクレオチドの、その−末鎖テ ンプレートとのハイブリダイゼーション及びその後のプライマー伸長は、異種２ 本＃ＪＤＮＡを作り出し、これが、形質転換細胞内で複製されるとき、所望の突 然変異をもつタンパク質配列をエンコードするであろう。
酸化によるトロンボモジュリン活性の損失に対する耐性を測定するために、テス ト材料（１００−２５０μｇ／ｍｌ）を、最初に、オキシダント、例えば、クロ ラミンン−Ｔ、　５−１０＋ｎＭクロラミンーＴにおける過酸化水素、又はｐＨ ７，０における０、２％Ｎ−二チルセチルオリン及び０．００８％Ｔｗｅｅｎ８ ０中の２００−１０００ｍＭ過酸化水素と共に、室温において２０分間、インキ ュベートする。Ｏ，ｌ！％ＢＳＡを含むＰＢＳのバッファーを使用することもで きる。このようなオキシダントに晒した後、このテスト材料を、例えば、特にプ ロティンＣの活性化のための補因子として作用する能力について以下に記載する 生物活性検定の中の１つを使用して評価する。オキシダントに晒される前にそれ らがもつ活性の、少なくとも６０％１普通には７０％、より正常には８０％、及 び好ましくは９０％を保持するような突然変異体７Ｍアナログは、野性型（非− 突然変異体）７Ｍアナログ又は生来のトロンボモジュリンと比べて酸化耐性であ ると考えられる。
Ｈ，７Ｍ活性の測定のための実験室検定７Ｍ活性を測定するための多くの実験室 検定を、利用できる。プロティンＣ補因子活性を、Ｓａｌｅｍ、　ｅｔ　ａｌ、 、　（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２５９（１９）：１２２４６−１２２５１及びＧａ１ｖｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、 （１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２６２（５）　：２１９９−２２０５により記載された検定において測定するこ とができる。簡単に言えば、この検定は、２段階から成る。第一は、定義した条 件下（以下の実施例を参照のこと。）でのテストＴＭアナログとトロンビン及び プロティンＣとのインキュベーションである。第二段階においては、このトロン ビンがヒルジン又はアンチトロンビンＩＩ＋及びヘパリンにより不活性化され、 そして新たに活性化されたプロティンＣの活性が発色基質の使用により測定され 、そこでは、その発色団が活性化プロティンＣのタンパク質分解活性により解放 される。この検定は、精製された試薬にいより行われる。
あるいは、７Ｍアナログの効果は、血液凝固時間検定、例えば、活性化部分的ト ロンボプラスチン時間（＾ＰＴＴ）、トロンビン血塊化時間（ＴＣＴ）及び／又 はプロトロンビン時間（ＰＴ）において血漿を使用して測定されることができる 。のＡＴＰＰ検定は、プロティンＣの活性化、並びにトロンビンの直接的阻害の 両方に対し依存しているが、一方、このＴＣＴ及びＰＴ検定は、トロンビンの阻 害に対してのみ依存している。これらの検定の中のいずれか１つにおける血液凝 固時間の延長は、その分子が血漿中の血液凝固を阻害することができることを示 している。
上記の検定は、精製系及び血漿環境の両方においてトロンビン及び活性化プロテ ィンＣに結合することができる可溶性７Ｍアナログを同定するために使用される 。次に、さらなる検定を、生来のトロンボモジュリンの他の活性、例えば、トロ ンビンにより触媒されたフィブリノーゲンからのフィブリン形成の阻害（Ｊａｋ ｕｂｏｗｓｋｉ、　ｅｔ　ａｌ、。
（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１（８）＋３８７６−３８ ８２）、因子■のトロンビン活性化の阻害（Ｅｓｍｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　（ １９８２）　、１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７：７９４４−７９４７） 　、アンチトロンビンＩ１１及びヘパリン補因子ＩＩによるトロンビンの加速さ れた阻害（Ｒｓｍｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ。
２５８：１２２３８−１２２４２）、因子ＸＩＩ［のトロンビン活性化の阻害（ Ｐｏｌｇａｒ。
ｅｔ　ａｌ、、（１９８７）　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｌｌｌｏｓｔａｓ、　５ ８：１４０）　、プロティンＳのトロンビン仲介不活性化の阻害（Ｔｈｏｍｐｓ ｏｎ　ａｎｄ　Ｓａｌｅｍ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。
ｌｎｖ、　７８（１）：１３−１７）並びにトロンビン仲介血小板の活性化凝集 の阻害（Ｅｓｍｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｊ、　［１ｉｏ１．　 Ｃｈｅｍ、　２５８：１２２３８−１２２４２）を評価するために使用される。
本発明においては、７Ｍアナログは全て、必ずしも、生来のトロンボモジュリン のものと等しい活性をもっていない。例えば、ある者が本発明の７Ｍアナログの 量を生来のコンドロイチン・スルホン化膜結合トロンボモジュリンの等価な量と 比較する場合には（以下に定義するプロティンＣ補因子活性の単位として測定さ れる）、その７Ｍアナログは、普通には、生来のトロンボモジュリンと比較して トロンビン仲介のフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を阻害するその能力に おいて、少なくとも２０％の減少を、そして好ましくは、５０％の減少をもつで あろう。
１、　７Ｍアナログの糖添加を変更する方法タンパク賃上の炭水化物置換基は、 生物学的活性及び循環半減期の両方に影響を与えることができる。本発明の幾つ かの７Ｍアナログを作るために、生来のトロンボモジュリン・タンパク質内にあ るような〇−結合グリコサミノグリカン炭水化物が、除去されなければならない 。この目的を達成する多数の方法が在る。１つの方法は、〇−膜結炭水化物含有 タンパク質を、硫酸化されたグリコサミノグリカンを特異的に分解することで知 られるグリコヒドラーゼ、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ又はヒアルロニダ ーゼにより処理することであろう。この方法は、Ｂｏｕｒｉｎ、　Ｍ、　ｅｔ　 ａｌ、、　（１９８８）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２６３（１７）　：８０４４−８０５２（これを、引用により本明細書中に取り 込む。）中に記載されている。
〇−結合炭水化物を除去する第二の方法は、そのタンパク質中に部位指定突然変 異を導入することによる。グリコサミノグリカンの付着は、典型的には、アミノ 酸Ｘ−セリン−グリシン−Ｘ−グリシン−Ｘ（ここで、Ｘがアミノ酸であるｏ　 ｌ　（ｌｌｏｕｒｄｏｎ、　Ｍ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、。
（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　 ８４：３１９４−３１９８）のコンセンサス認識配列により、指定される。他の タイプの〇−膜結糖の認識配列は、一般的には、トレオニン／セリン−Ｘ−ｘ− プロリンである。天然のトロンボモジュリンの〇−結合ドメインは、正常には、 少なくともｌの可能性のあるグリコサミノグリカン付加部位（ａａ　４７２及び ／又は４７４）及び１つの他の可能性のある〇−結合炭水化物付加部位（ａａ　 ４６４．４７２．４７４．４８０及び４８６）を、その細胞型に依存して、もつ 。この認識配列内の１以上のアミノ酸のいずれかの同一性を除去し又は変するヌ クレオチド配列内に導入される変更のいずれも、この可能性のある〇−結合炭水 化物付着部位を除去することができた。ヌクレオチド配列内へ部位指定突然変異 を導入する方法は、先に記載されている。例えば、これらのセリン又はトレオニ ン残基の１以上が、糖添加不可能アミノ酸、例えば、アラニンに修飾されること ができる。
７Ｍアナログから〇−結合炭水化物を除去する好ましい方法は、〇−結合ドメイ ンであると考えられるアミノ酸、すなわち、表１中に示すような生来のトロンボ モジュリン遺伝子配列のアミノ酸４６８〜４８５を含まないアナログ・ペプチド を作ることよる。これを達成する方法は、本分野においてよく知られており、そ して先に記載されている。
タンパク質の循環半減期は、それに付着した炭水化物の量及び組成により変更さ れることができる。本発明の７Ｍアナログは、〇−膜結及びＮ−結合の炭水化物 の両方を含む。先に討議した可能性のある０−糖添加部位に加えて、例えば、ア ミノ酸２９．９７．９８．３６４．３９１及び３９３における可能性のあるＮ− 結合部位、及びアミノ酸３１９．３９３及び３９６における可能性のある〇−結 合部位が、在る。先に記載したものに加えた炭水化物組成を変更する方法は：１ ）哺乳類タンパク質を糖添加するのに必要な細胞機構をもたない、バクテリア、 例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内での７Ｍアナログ遺伝子の発現、２）様々な 真核細胞であってそれぞれが特徴的な糖残基の添加に起因するそれ自体の特徴的 な酵素をもつもの内での７Ｍアナログ遺伝子の発現、及び３）化学物質、例えば 、フッ化水素酸による処理、である。フッ化水素酸は、例えば、酸性及び中性の 糖を化学的に消化し、一方、例えば、Ｎ−アセチル・グルコサミン、そして特定 の条件下で、ガラクトサミンのような糖を、無傷で残す。
Ｊ、　プロテアーゼ耐性アナログ 先に述べたように、組換えにより作られたＴＭが培養において、特に真核細胞、 例えば、ＣＨＯ細胞内で発現されるとき、そのＴＭは、実質的な量の２本鎖変異 体を含む。これは、例えば、培養条件下又はその精製工程の間に存在するエンド ペプチダーゼによる異種タンパク質の解裂による、存在する異なる結合定数をも つ種が存在するということを示す結合性質プロフィールにより、検出可能である 。このエンドペプチダーゼは、例えば、宿主細胞、微生物学的汚染体、培養基、 等であることができる。還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の分析は、７Ｍアナ ログがＣ）１０細胞内で調製され、そして本明細書中で開示するようなならし培 地から単離されるとき、約８０ｋＤの分子量に対応するタンパク質バンドが、昆 虫細胞６ＥＧＦに対するウサギのポリクロナール抗体、例えば、ＴＭ、　（ＳＦ ３）　、又は染色ゲルを使用して測定されるような、−末鎖可溶性ＴＭアナログ に対応する９４ｋＤのタンパク質バンドに加えて存在することを、現した。しか しながら、ＣＨＬ−１細胞内で発現された同一物質は、明らかに、この分解物質 をほとんどもっていない。これは、タンパク質分解活性の程度が細胞系依存であ ることができるにとを示している。
ヒト・トロンボモジュリン細胞外ドメイン内のユニーク・プロテアーゼ解裂部位 を、今般、様々なヒト・アナログ内で同定した。シグナル配列の解裂異種性によ り引き起こされるＮ−末端内の予想された異種性（ＦＰＡＰＡＥＰ及びＡＰＡＥ Ｐの両方のＮ−末端がある）に加えて、これらのアナログは、Ａ、ｇ１′８と旧 Ｓ″′との間の一本鎖ＴＭのタンパク質分解と一致する新たな配列−ＩＧＴＤＤ Ｋを含む。この解裂形態において存在するタンパク質の量は、ＴＭ鎖の５０％と 同程度に高い。
このタンパク質解裂部位は、第６のＥＧＦ　ドメインの最後の（Ｃ）ループ内で 形成され、そしてそれ故、そのタンパク質断片は、そのループ内で最後のジスル フィド結合により一緒に共有結合されている。
これは、さらに、この２つのバンドが還元ゲル上にのみ見られるという事実によ り支持される。この８０ｋＤａバンドは、サイズ及び免疫反応性に基き、Ｎ−末 端断片である。それ故、ＣＨＯ細胞内、並びに、７Ｍアナログを分解する類似の プロテアーゼを有する他の細胞系内で発現される７Ｍアナログは、類似の分子の 性質、例えば、同一条件下で検定されるときの分子量及びアミノ酸配列を示す解 裂した２本鎖物質により、汚染されている。それ故、精製の性質は、その７Ｍア ナログがジスルフィド結合により一緒になった２本鎖変異体に解裂されているに もかかわらず、しばしば類似となろう。
先に述べたように、この解裂部位は、ＴＭの６８ＧＦドメインのＣループ内で生 じる。様々な構築物内のこのループの欠失は、トロンボモジュリンについてのに 、における高い増加（〜７倍）により証明される、トロンボモジュリン結合にお ける実質的な損失をもたらすことが示された。それ故、汚染する２本鎖物質は、 たぶん、このような調製物の比活性の類似の損失をもたらす。さらに、その分子 上の他の結合部位が無傷であるので、その２本鎖物質は、−重鎖ＴＭアナログの 競合的阻害剤として作用するはずである。この無傷の一末鎖種から２本鎖物質を 分離することは非常に困難であるので、タンパク質解裂を受けない高（相同性の ある無傷の一本鎖ＴＭを作ることが重要である。この結果は、本明細書中に開示 するように、タンパク質解裂部位を除去及び／又は置換し、そしてこのようにこ れまでの不所望の問題を解決する７Ｍアナログの構築を通して、達成される。
本発明は、完全長の膜会合又は可溶性の両方の７Ｍアナログであって上記プロテ アーゼによる解裂に耐性のものの提供を可能にする。
突然変異を、本明細書中に記載する手順に従って、プロテアーゼ解裂部位を修飾 するために、７Ｍアナログ内に導入することができる。
しかしながら、６８ＧＦのＣループは、トロンビン結合において重要であること が示されており、そしてこの領域の結合の性質が作られたアナログ内で維持され ることが重要である。このように得られた分子の生物学的活性は、タンパク質分 解を防ぐことにより、維持されるであろうし、又は７Ｍアナログ組成物の全体的 な活性における増加が、達成される。これは、トロンビンへのＴＭの結合におい て重要であると考えられる最初のドメインの構造における変更により引き起こさ れる活性の損失を回避するであろう。例えば、ウサギ、マウス、及びウシにおい ては、ＴＭの４５６−４５７配列は、ヒトＴＭにおけるのと同様に、Ａｒｇ−Ｈ ｉｓの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｎであるので、この修飾は、特定の問題の内に在る 。他の、類似の部位特異的突然変異を、タンパク質分解を受けないが未だ生物学 的活性の望ましいレベルを維持している修飾配列を定例的に同定するために使用 することができる。例えば、他の類似のＥＧＦ一様タンパク質への相同性により 、その分子の上記領域が逆回転Ｐｒｏ　ｔ　Ｓ　Ｏ／ＡＳｐ＋　６１　とＴｈｒ ４′。／ＡＳｐ１′　との間のβ−シート構造内のものと非常に類似しているこ とを、見ることができる。この分析により、特に好ましい置換は、β−シート構 造内に高頻度にあるアミノ酸、例えば、Ｈｉｓ　、　Ｖａｌ　、ｌｉｅ　、　Ｐ ｈｅ　、　Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及びＴｈｒを取り込むものであろう。他の好ましい 置換は、β−シート構造内にほとんどないようなアミノ酸、Ｃｙｓ　、　Ｇｌｕ 　、　Ｌｙｓ、Ａｓｐ　、　Ａｓｎ　、及びＰｒｏを取り込むものであろう。特 定の他の残基は、例えば、構造的に重要な他のシスティンとの不正確なジスルフ ィド結合を防ぐための、Ｃｙｓ　；　β−シート構造とほとんど一致しないＰｒ ｏ　；他のプロテアーゼ解裂部位を取り込むことができるＬｙｓ及びＡｒｇを、 含む。したがって、当業者は、上記部位又は他のプロテアーゼ解裂部位において 、プロテアーゼ解裂に対し耐性であろう７Ｍアナログの構造を容易に且つ定例的 に決定できる。本明細書中に記載する要求に合うこのような構造の全ては、本発 明の部分として包含される。
もちろん、上記修飾を、本明細書中に開示する１以上の他の修飾に加えて、酸化 耐性を導入し、糖添加部位、同種アミノ酸末端、同種カルボキシ末端等を除去す ることにより血清中のアナログの半減期を増加させるために、使用して、幾つか の部位において改善された特徴をもつ分子を提供することができる。
先に記載した修飾に加えて、−末鎖ＴＭは、定例的なタンパク質精製方法により それを含む調製物から２本鎖ＴＭを除去することにより提供されることができる 。
Ｋ、　ユニークＮ−末端をもつトロンボモジュリン・アナログの製造内部のエン ドプロテアーゼによる解裂による１以上のＮ−末端を示すＴＭポリペプチド組成 物の製造を防止する先の問題に加えて、生来のトロンボモジュリンは、シグナル 配列の不正確なプロセシングによる正常なＮ−末端における追加の固有の異質性 をもつ。例えば、特にインビボにおける投与についての規制認可のための、タン パク質精製の定義において使用される純度の１つの特徴は、単一のユニークＮ− 末端配列の検出である。最終製品の性質に関して可能性のある曖昧さのいずれを も回避するために、ユニークＮ−末端プロセシング部位をもつＴＭポリペプチド 組成物を製造することができることが、商業的に、そして他に、有利である。そ れ故、本ポリペプチドのＮ−末端領域フェンコードしているヌクレオチド配列を 、その宿主細胞のプロセシング酵素が成熟ポリペプチドの単−Ｎ−末端を作り出 すであろうように、修飾することができる。これは、例えば、そのプロセシング 部位の中の１つを構成するＮ−末端の３つのアミノ酸を欠失させることにより達 成されることができ、これは、生来のＴＭのアミノ酸４（Ｇｌｕ）において開始 する全体として機能性のポリペプチドをもたらす。これは、さらに、単一の且つ ユニークなプロセシング後Ｎ−末端だけをもつポリペプチドを提供する。また、 他の単−Ｎ−末端をもつ他の機能的な構造物を、生来のＴＭ　Ｎ−末端のさらな る欠失又は他の同質なＮ−末端プロセシング部位の置換のいずれかを通して、定 例的に、製造することができる。
Ｌ、　ユニークＣ−末端をもつトロンボモジュリン・アナログの製造本発明のゴ ールに従って作られることができるさらなる修飾は、それがユニーク・カルボキ シ末端を示すように７Ｍアナログ組成物を修飾することである。−末鎖物質の提 供は、本明細書中に開示する手順に従って少なくともｌのＣ−末端を除去するこ とを確保する。■つの特に有利な構築物は、分解に耐性なＣ−末端を提供するこ とにより、プロテアーゼ又は他の因子、例えば、翻訳後プロセシング酵素若しく はＣ〜末端エクソプロテアーゼに耐性な７Ｍアナログを提供する。
これらのアナログは、そのポリペプチドのＣ−末端アミノ酸をコーディングして いるＤＮＡを修飾することにより提供される。例えば、本明細書中に開示するよ うに、生来のＴＭのアミノ酸４９７において終止する機能的アナログのＣ−末端 は、便利には、特にプロテアーゼ耐性であるーＰｒｏ−Ｐｒｏ記列内で終止する Ｃ−末端を提供するために７アミノ酸程短くされることができる。生物学的に活 性な７Ｍアナログを提供する他のアミノ酸欠失及び置換は、本分野において知ら れた方法の定例的な修飾に従って及び本明細書中に記載するように、調製される ことができる。
Ｍ、トロンボモジュリン・アナログの配合及び使用本明細書中に記載する可溶性 ７Ｍアナログは、凍結乾燥又は液体配合物において製造されることができる。こ の物質は、注射可能な又は静脈内の調製物のいずれかとして医薬用途に好適な濃 度において提供されるであろう。
これらの化合物は、単独であるいは他の生理学的に許容される活性物質、例えば 、抗生物質、他の抗血液凝固剤、−末鎖ｔ−ＰＡ、又は不活性物質との混合物と して、又は好適な担体、例えば、水若しくは正常の生理食塩水と共に、投与され ることができる。このアナログを、非経口的に、例えば、注射により投与するこ とができる。注射は、皮下、静脈内又は筋肉内である。これらの化合物は、医薬 として有効な量で、そしてしばしば医薬として許容される塩、例えば、酸添加塩 として、投与される。このような塩は、例えば、とりわけ、塩化水素塩、臭化水 素塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ベンゾエート、リンゴ酸塩、クエン酸塩、グ リシン、グルタメート、及びアスパルテートを含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ ｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ　ｅｄ、 ）、　Ｍａｅｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　 Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、及びＧｏｏｄｍａｎ　＆　Ｇｉ１ｍａｎ’ｓ、　Ｔ ｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｔｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕ −ｔｔｃｓ、　８ｔｈ　ｅｄ、、　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５ （これらの両方を、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。本明細 書中に記載するアナログは、ミセル及び／又はリン脂質凝集体内への取り込みに より増強されたインビボにおける活性を表すことができる。イオン性洗剤凝集体 又はリン脂質ミセル内への取り込み方法は、公知である。
抗血栓剤は、本明細書中に記載する可溶性７Ｍアナログを使用して製造されるこ とができ、そして完全に精製されたアナログ単独で、又は先に記載した血栓溶解 剤とに組み合わせにおいて、成ることができる。先に引用した生理学的効果をも つことが示された本発明の化合物は、多数の治療用途、例えば、血塊形成の阻害 における使用を見つけられることができる。したがって、これらの化合物は、様 々な循環失調、例えば、冠状又は肺の塞栓、鼓動の治療、並びに血栓溶解治療の 後の再閉塞の予防における治療剤としの使用を見つけられることができ、そして これらの化合物は、梗塞事件の間の血塊のさらなる拡大の停止における用途をも つ。さらに、開示する化合物は、全身性血液凝固失調、例えば、多発性静脈内血 液凝固（＋）　ＩＣ）であってしばしば敗血症、特定の眼及び妊娠中毒症（ｌｏ ｘｅｍｉａ　ｏｆｐｒｅｇｎａｎｃｙ）の治療に有用であることができる。
これらの化合物は、獣医学的用途のために、哺乳動物に、例えば、家畜動物に、 そして他の治療剤と類似のやり方で、すなわち、生理学的に許容される担体中で 、ヒトにおける臨床的使用のために、投与されることができる。一般的には、７ Ｍアナログのための投与の投与量は、少なくとも約０．０００２、より普通には ０．０２から、５０００未満、普通には２０００．より普通には５００１１ｇ／ 宿主の体重ｋｇまでの、普通には、０．０２〜２０００μｇ／宿主の体重ｋｇ、 そしてより普通には、０．０２〜５００μｇ／宿主の体重ｋｇの範囲であろう。
これらの投与量は、所望の循環レベルが達成されるまで、長い時間にわたり一定 注入により、又は好ましくは、ポーラス注射により、投与されることができる。
特定の患者のための最適投与量は、当業者により定例的に決定されることができ る。
さらに詳述することなく、当業者は、先の記載を使用して、本発明をその最大限 まで使用することができると、信じられる。それ故、以下の好ましい特定の態様 は、単に例示的であり、そしていかなる方法においてもその開示の残りを限定し ないと、考えられるべきである。
先の及び以下の実施例中、全ての温度を、摂氏において補正せずに記し；そして 特にことわらないかぎり、全ての部及びパーセンテージは重量による。
先に及び以下に引用する、全ての出願、特許及び刊行物の開示の全体を、引用に より本明細書中に取り込む。
組換えトロンボモジュリン・アナログ・ペプチドの製造のための遺伝子を、１９ ８９年４月２８日に出願された同時係属出願米国逐次番号３４５、３７２号、１ ９８９年９月１３日に出願された米国逐次番号第４０６．９４１号、及び１９９ ０年２月１６日に出願されたＰＣＴ逐次番号第９０７００９５５号（それぞれを 、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されるように単離した。簡単に 言えば、ヒトＤＮＡを、アミノ酸２２７−４６２に対応するトロンボモジュリン の第６　ＥＧＦ一様ドメイン、並びにトロンボモジュリン・ペプチドの他の部分 をエンコードしている遺伝子を単離するために使用した。（表１を参照のこと。
）このＤＮＡを、Ｂ１１ｎ、　Ｎ　ａｎｄ　ＤＷ　５ｔａｆｆｏｒｄ、　（１９ ７６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　３：２３０２に従って、胎児 肝臓から単離した。次に、このＤＮＡを、所望の領域を含むように選択された合 成誘導プライマーとのポリメラーゼ連鎖反応におけるテンプレートとして使用し た（表３＆４を参照のこと。）。
例えば、Ｉｎｎ１ｓ　ｅｔ　ａ［、、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌ、　Ａ　Ｇｕｉｄ ｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（１９９０）、 　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
■、　アミノ酸２２７−４６２をエンコードしている遺伝子の単離以下の段階は 、アミノ酸（ａａ）　２２７−４６２をエンコードしているＤＮＡ挿入物を得る ための手段を提供し、そしてプライマー＃１０３３及び＃１０３４（表３を参照 のこと。）を使用する。他のプライマーを使用することによる以下に述べる手順 を修飾することにより、他の可溶性７Ｍアナログを得ることができるということ が、理解されよう。
＃１０３３及び＄１１０３４プライマーの配列は、所望のドメインの５°及び３ °末端に対応するが、それらは、それらがＢａｍ）１１部位を含むように修飾さ れている。終止コドンを、塩基１５８６の後に導入した。ポリメラーゼ連鎖反応 を、５ａｉｋｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　３２０： １３５０−１３５４により記載されている条件下で走らせた。但し、アニーリン グの最初の温度は３７℃であった。ｌＯサイクル後、アニーリング温度を残りの ３０サイクルのために４５℃まで上げた。反応生成物のアリコツトを、５％アガ ロース・ゲル上で分離し、そして臭化エチジウム染色により可視化した。予言サ イズのバンド（７００ｂｌ））は、はっきりと見ることができた。あるいは、あ る者は、その同一性を確認するために、このバンドを配列決定し又は内部プロー ブとそれをハイブリダイズさせることができる。
列配スる領域に対応するｌ・ロ：ノボモジュリンの追加の断片を単離するために 、それど同一なやり方で使用した。特に、これらの領域は、１以上のＥＧＦ一様 ドメイン及び〇−膜結糖添加ドメインを包含する。所望の領域を作るために選ば れたプライマーの配列を表３中に示す。
先の（１）に記載したポリメラーゼ連鎖反応混合物の残りを、Ｂａｍ１ｌｌによ り制限酵素処理し、５ｘポリアクリルアミド・ゲル上で分離し、そして７００塩 基対のバンドを切除し、そして溶出させた。それを、Ｂａｍ１ｌｌにより制限酵 素処理されたｐＵｃ１９に連結し、そして新たなプラスミドを、大腸菌（Ｈ，ｃ ｏｌｉ）　ＤＨ５−α株内に形質転換させた。絹換え体コロニーを、アンピシリ ン及び５−ブロモ、−４−クロロ−３−インドールイル−β−Ｄ〜ガラクトシド を含む培地上で選択した。白色のコロニーを、格子上に拾い上げ、そしてランダ ム・ブライミングによる＋２ｐによる標識（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ）による標識付けの前にＥｃｏＲｌ及び旧ｎｄｌｌｌによりクローニング ・プラスミド（９７Ｍ２．　ｌ　）から切り出されたトロンボモジュリンのａａ 　２８３−３５２に対応する合成により得られた遺伝子と、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓ技術により、ハイブリダイズされた。
Ｘ−線フィルムにそのフィルターを露出させた後に、９７Ｍ２．　ｌプローブと ハイブリダイズした１つのコロニーを、選択し、そして培養物を増殖させた。Ｄ ＮＡを、抽出し、そして正しい制限マツプにより挿入の存在を確認するために、 ＩｌａｍＨｌ又はＢｇｌｌｌのいずれかにより制限酵素処理するおとにより分析 し、た。また、切除された挿入物を、ニトロセルロースに転移させ、そして標識 された９７Ｍ２．１とのハイブリダイゼーションにより分析した。両方の方法は 、この７００塩基対の挿入物がトロンボモジュリンの第６　ＥＧＦ一様ドメイン のためのコーディング配列を含むことを、確かなものとした。この挿入物を、突 然変異がＰＣＲ手順の間にうっかりと導入されていないことを確認するために、 配列決定した。所望の遺伝子断片を含むプラスミドを、ｐＵｃ１９ｐｃｒＴＭ７ と名付けた。
Ｂ、ＴＭの発現 １、ＡｃＮＰＶ伝達ベクターの構築 以下に記載する伝達ベクターは、米国逐次番号第０７／３４５．３７２号の継続 である同時係属出願米国逐次番号０７／８１２．８９２号中にも記載され含む。
ｉ、ｐＨＹｌ及びｐｓｃ７１６ ヒポダーミン＾シグナル配列、翻訳開始コドン、Ｂｇｌｌｌ　クローニング部位 、Ｂａｍ１ｌｒ　５°オーバーハング及びＫｐｎｌ　３°オーバーハング、ＣＯ Ｄ＃１１９８及びＣＯＤ＃１ｌ−９９（表２を参照のこと。）を含むオリゴマー を、アニールし、そしてｐＳＣ６５４、すなわちｐυＣ１９誘導体内にクローン 化合物し、ｐＨＹｌを作った。プラスミドｐＨＹ１を、Ｂａｗｌ（１及びＥｃｏ ＲＩにより制限酵素処理し、ヒボダーミンＡシグナル配列を解放した。この配列 を、次にｐｓｃ７１４と連結し、ベクターｐｓｃ７１６を作った。プラスミドｐ ＳＣ７１４は、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、から得られたｐＶＬ１３９３の 誘導体である。この２つの間の差異は、ｐｓｃ７１４内でＢａ１１１部位の中の １つが破壊されているということだけである。
ｉｉ、ｐＨＹｌｏｌの構築 ｐＵｃ１９ｐｃｒＴＭ７（上記Ａ１１ｉを参照のこと。）からのＢａｍ旧断片を 。ｐＨＹｌ（７）Ｂａｌ１１部位内にクローン化し、そしてその方向を、ヒポダ ーミンＡシグナル配列がアミノ酸２２７に隣接するように選んだ。このプラスミ ドが、ｐＨＹＩ　０１である。
ｉｉｉ、ＡｃＮＰＶ伝達ベクターｐＴＭｔ（Ｙｌｏｔの構築プラスミドｐＨＹ１ ０１を、７Ｍアナログ・コーディング配列に連結されたヒポダーミンへシグナル 配列を解放するＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩにより処理した。シャトル・ベクターｐ ＶＬＩ３９３は、部分的（ご欠失したＡｃＮＰＶ多角体遺伝子及びユニークＢａ ｍＨＩ及びＥｃｏＲｌ　クローニング部位を含む。
ｐＨＹｌｏｌからのＢａｍＨｌ／ＥｃｏＲ！断片を、この多角体プロモーターの 下流に挿入し、これによりプラスミドｐＴＭＨＹ１０１を作った。ここでは、ハ イブリッド遺伝子が多角体プロモーターの制御下にあった。
ｉｖ、他のＡＣＮＰＶ伝達ベクターの構築他のＴＭアナログ遺伝子配列を含む伝 達ベクターを、先に概説したものと類似の戦略を使用して構築した。先に記載し たクローニング・プラスミドからの断片を、そのＴＭアナログ遺伝子配列がヒボ ダーミンＡシグナル配列と融合さてるように、フレーム内でｐｓｃ７１６内にク ローン化した。このＴＭ遺伝子配列を、表４中に列記する。
■、　純粋なファージ株の製造 細胞トランスフェクションを、Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈに従って昆 虫細胞のために変更されたリン酸カルシウム沈降を使用して行った。
簡単に言えば、Ｔ２５フラスコを、２　Ｘ　１０’　Ｓｆ９細胞により接種し、 そしてその細胞を、室温において１時間、付着に供した。２μｇの伝達ベクター 、例えば、ｐＴＨＲ２８、及びｌμｇのＡｃＮＰＶ　ＤＮＡを、リン酸カルシウ ム中で共沈させ、そしてその細胞と共に４時間インキュベートした。この細胞を 、増殖培地で濯ぎ、そして再飼養し、次に、２８℃のインキュベーター内に３− ４日装置いた。このインキュベーションの間に、その細胞は、その増殖培地中に 蓄積する、組換え体及び非組換え体ウィルスの両方を生産する。混合ウィルス株 を含むこの培地を、プロティンＣ補因子活性の存在について検定した。
組換え体ウィルスを、プラーク検定により検出した。トランスフェクション株を 、希釈しく１０−’、ｌＯ′−６、及び１０−’）　、そしてトランスフェクシ ョン４−７日後にブレーティングした。閉塞陰性（組換え体）プラークを、ブレ ーティング７日後に拾い上げ、そして再ブレーティングした（１０−’、１０− ２、及びｉｏ−”希釈）。さらに７日後、このプレートは、１００％の純粋な閉 塞陰性組換え体プラークを示した。
それぞれからの単−ｐｆｕを、製造のために選んだ。高い力価のウィルス株を、 ４−５日間増殖させた単−ｐｆｕにより５ｍｌのＳｆ９細胞（Ｅｘｃｅｌｌ　４ ００培地（ＪＲ５ｅｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１　ｘ　１０　’　／＋ｎｌ）を感染 させることにより、増殖させた。次に、この株の一部を、タンパク質株を作るた めに対数期中間まで増殖したＳｆ９細胞中に１：５０〜１：１００に希本実施例 は、実施例ｍＡのアナログ遺伝子を含んで成る哺乳類発現ベクターを提供する。
遺伝子を、ヒト組織プラスミノーゲン活性物質のシグナル配列に作用可能な状態 で結合することができる（表２を参照のこと。）。発現プラスミド、ｐＰＡ１２ ４は、クローン化遺伝子の発現のためのＨａｒｖｅｙ　Ｓａｒｃｏｍａウィルス 由来のロング・ターミナル・リピートの３つのコピー内に含まれるプロモーター を含む。
このプラスミドは、その両方が１９８８年９月２９日に出願された同時係属中の 米国逐次番号第２５１．１５９号（これを、引用により本明細書中に取り込む。
）中に詳細に記載されている、ｐＰＡ１１９、及びｐｓｃ６７２から得られた。
ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョン領域を含むＢａｌ　ＩＩ−Ｂｃｌ　ｌ断片を、ｐ ＳＣ６７２から単離した。この断片を、Ｂｇｌｌｌ及びＢｃｌ　Ｉにより消化さ れたｐＰＡ１１９内にクローン化した。得られたプラスミド、ｐＰＡ１２４内で は、Ｂｇｌｌｌ及びＢｃ１１部位の両方が無傷で残った。プラスミドｐＰＡ１２ ４は、適当な制限部位に隣接したｔ−ＰＡシグナル配列を含み、そしてこのシグ ナル配列は、また、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子の第二イントロンを含む。
可溶性ＴＭアナログをエンコー・ドしている遺伝子を、ｌｌａｍ旧による処理に よりｐＵｃ１９ｐｅｒＴＭ７から除去し、そおしてＢｇｌｌｌにより処理された ｐＰＡＩ２４に連結した。形質転換細胞を、正しい方向における挿入物の存在に ついてスクリーニングした。すなわち、そこでは、ｔ−ＰＡシグナル配列がオー ブン・リーディング・フレームをエンコードしているトロンボモジュリン挿入物 の５′末端に結合している。このプラスミド、ｐＴＭＩｏｌを１１次に、Ｃ１ａ ｌにより消化し、そしてＳＶ４０プロモーターの制御下のｄｈｆｒ遺伝子を含む Ｃ１ａｌ断片に連結した。このＣ１ａｌ断片は、ＷＯ３８１０２４１１のページ ２６中に記載されている。形質転換細胞を、このｄｈｆｒカセットの存在につい てスクリーニングし、そして次に、そのプラスミドに関しての方向を、制限マツ プ作成により決定した（ｐＴＭ１０３）。
トロンボモジュリン配列に対し基準外方向にあるｄｈｆｒ配列を含むプラスミド ｐＴＭ１０３を、Ｂｃｌｌにより処理した。Ｒａｍ旧断片上にハイグロマイシン 耐性を提供する遺伝子をエンコードしているＤＮＡ断片を、このプラスミドに連 結した。クローンを、大腸ｍｃＢ、ｃｏｌＯ株Ｄ）１５α内に形質転換させた後 、アンピシリン及びハイグロマイシンＢの両方を含むプレート上での増殖のそれ らの能力により、選択した。そのプラスミドに関してのハイグロマイシンＢ遺伝 子の方向を、制限マツプ作成により決定した。ハイグロマイシンＢ遺伝子がＴＭ 遺伝子と反対の方向にある１つのプラスミドｐＴＭ１０８を、培養において増殖 させた。このプラスミドは、３つのＬＴＲプロモーターの制御下の７Ｍアナログ をエンコードしている配列をもち、ハイグロマイシンＢ耐性を与える遺伝子とそ のプラスミド上に存在するｄｈｆｒをエンコードしている遺伝子との両方をもつ 。類似の発現プラスミド、ｐＴ１１Ｒ１３も、また、サイトメガロウィルス・プ ロモーターの制御下の第６　Ｉ！ＧＰ　一様ドメインをエンコードしている配列 に作用可能な状態で結合されたｔ−ＰＡシグナル配列を含む。それらのプラスミ ドは、それを、以下に記載する部位指定のインビＩ・口における突然変異誘発に 有用であるようにする、Ｍ１３の複製起点を含む。このトロンボモジュリン配列 は、組織プラスミノーゲン活性物質シグナル配列に結合し、その分泌を確かなも のにする。両方のこれらのプラスミド、４ｔ／２２７−４６２により作られた７ Ｍアナログは、ｔ−ＰＡシグナル・ペプチドのプロセシングの結果であるＮ−末 端上の追加の４アミノ酸をもつトロンボモジュリンの第６　ＥＧＦ一様ドメイン がら構成される。
トランスフェクションのために、１０μｇのＩ）７Ｍ１０８を、リボフェクシコ ン試薬ＣＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と 混合し、そして６ウエル内の１０’　ＣＨＬ−１宿主細胞の単層に添加した。ト ランスフェクションの４８時間後に、既知数の細胞を、選択培地上にプレートし た。
ハイグロマイシンＢに対する耐性を、選択マーカーとして使用した。
バクテリアのハイグロマイシンＢによりトランスフェクトされたＣＨＬ−１細胞 は、０．３ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ中で生存増殖することができる。
トランスフェクション又は選択頻度は、２／１０”であり、そしてプレートされ た細胞の全数により割った選択後に生じたコロニーの数として測定した。この培 養上澄液は、細胞との接触において２４時間後に１．５０／ｍｌ　７Ｍ活性を含 むことが示された。
第一選択条件に対し耐性の細胞の集団を、次に、第二ラウンドの選択圧に供した 。１１００ｎ又は５００ｎＭのいずれかのメトトレキサート（ＭＴＸ）を、ｄｈ ｆｒ遺伝子を発現したトランスフェクト体を選択するためにその増殖培地に添加 した。このｄｈｆｒ遺伝子を増幅したコロニーだけが、この高いレベルのＭＴＸ 中で増殖することができるであろう。
遺伝子増幅の工程において、他のプラスミド配列は、ｄｈｆｒ遺伝子と同時増幅 され、そしてそれ故、同様な非選択性遺伝子の増加した遺伝子発現を導くであろ う。耐性コロニーは、５〜６週間後に明らかであった。ＭＴＸのこれらのレベル に耐性な個々のコロニーを、単離し、そして検定した。ｌｏＯｎＭ　ＭＴＸ中の 選択後の培養物は、プロティンＣ活性化活性１ｍｌ当たり４．９〜１４．７Ｕを 作り出すことが示された（以下を参照のこと。）。プールした集団を、ＭＴＸの １０倍高い濃度中にプレートした（ｌμＭ又は５μＭ）。クローンをこの選択か ら再び回収し、そして検定した。それぞれの段階において、クローンは、７Ｍア ナログを生産し、そしてその培養基中にそれを分泌することが生来のトロンボモ ジュリンの第６　ＥＧＦ一様ドメイン領域は、２つのメチオニン残基、すなわち 、２９１位におけるｌ及び３８８位におけるｌをもつ（表１を参照のこと。）。
部位指定のインビトロにおける突然変異誘発を、これらのメチオニンのいずれか 又は両方を他のアミノ酸に変換するために使用した。部位指定突然変異誘発は、 −重鎖テンプレートＤＮＡのヌクレオチド配列を特異的に変更するために、所望 のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失を含む合成りＮＡ配列を、使用する。こ の合成りＮＡのテンプレートへのハイブリダイゼーション及びその後のプライマ ー伸長は、所望の突然変異を産生ずるための細胞形質転換を可能にする異種２本 鎖ＤＮＡを作り出す。この工程を表すダイアグラムは、米国特許出願逐次番号第 ０７１５６８．４５６号の図１中に示されている。
類似の方法を、可能性のあるプロテアーゼ感受性領域を除去し、糖添加部位を修 飾し、そして所望の７Ｍアナログのアミノ酸カルボキシ末端を修飾するために、 使用することができる。
−水路ＤＮＡコピー、ｐＴｌｌＲ１４を作るためのプラスミドを、Ａｓｅｌ−３ ｅａｌ断片上に含まれるＦｌの複製起点を昆虫細胞伝達ベクター、ｐＴＭＨＹｌ ｏｌであって先にＮｄｅ　Ｉ及び５ｅａｌにより消化されているものと連結させ ることにより、構築した。プラスミドｐＴＭ）ＩＹＩＯＩは、トロンボモジュリ ンの第６８ＣＦ一様ドメイン、すなわち、アミノ酸２２７−４６２に対応するペ プチドを作り出す遺伝子配列を含み、そして先に記載されている。
ｐＴＭＨＹｌｏｌは、同時係属出願米国逐次番号第３４５．３７２号並びに先の Ｂ（１）　（ｉｉｉ）中に記載されている。レクチン・ドメイン、６　ＥＧＦ　 、及び〇−結合ドメインを含む類似のベクターを、１つの好ましい態様をエンコ ードしているｐＴＨＲ５２５を突然変異させ、そしてこれを構築するために使用 した。
特異的な突然変異性オリゴヌクレオチド・プライマーを、合成し、そしてＭＵＴ ＡＴＯＲ”−ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＩＩ　５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ ｅｄ　ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ　（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　＃２００５００ ．　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）と共に使用した。但 し、とくにことわらないかぎり、第二鎖合成をプライムし、そして非酸化性アミ ノ酸に変更されたメチオニンの１又は両方のいずれかをもつトロンボモジュリン ・アナログ遺伝子を作り出した。
好ましいアミノ酸、ロイシン、グルタミン又はアラニンへのプライマー指定変換 を、表５中に示す。これらのプライマー内には、成功した突然変異誘発について の診断として有用なユニーク制限酵素部位を添加するが必ずしも対応するアミノ 酸配列を変更しないヌクレオチド配列内の置換が、含まれる。このヌクレオチド 置換を、表５中に示すプライマーにおいて下線を引いた。例えば、プラスミドｐ ＴＨＲ２８内では、生来のトロンボモジュリン・タンパク質的の３８８位におけ るメチオニンがロイシンにより置換され、そしてその工程において、ユニークＰ ｖｕ　ｌ　１部位が導入された。他の置換非酸化性アミノ酸が本発明の本態様に おいて等しく有用であろうことが理解されよう。
精製された一末鎖ＤＮＡテンプレートを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｉｎｓけｕｃ ｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃａｔ、　ｎｏ。
１７０−３５７６、　ｐａｇｅ　３３−３４）により記載されている手順を使用 して調製した。但し、本分野において知られた他の手順が等しく好適であろう。
それぞれの突然変異原性プライマーの５′末端を、アニーリング・バッフｙ−（ ２０ｄ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ　ｐｉｔ　７．５．８ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｔ　、及び ４０ｍＭ　ＮａＣＩ）中に、２ｍＭ　ｒＡＴＰ、　０．４０／μｍポリヌクレオ チドを含む溶液中で、ｏ、５ｎｇ／μｌのプライマーを、３７℃において３０分 間、インキュベートすることにより、リン酸化した。この反応を、６５℃におい て１５分間その混合物をインキュベートすることにより、熱不活性化した。
リン酸化は、首尾良い突然変異の割合を増加させる。このリン酸化プライマーを 、２５μｌのアニーリング・バッファー中で１１００ｎのテンプレート及び２． ５ｎｇのプライマーを６５℃まで５分間加熱し、次にその混合物を室温において １０分間冷却及びアニールさせることにより、−水路テンプレートに、アニール した。２本鎖ＤＮＡを、Ｔｓｕｒｕｓｈ　ｉ　ｔ。
Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、、（１９８８）　Ｇｅｎｅ　６２：１３５−１３９及びＯ ’Ｄｏｎｎｅ１１．　Ｍ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、。
（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：１２８７５−１２８８ ３により本質的に記載されているようにプライマー伸長により行った。簡単に言 えば、テンプレート／プライマー混合物を、ＩＯＸアニーリング・バッファー加 え８０μｇ／＋ｒ＋ｌウシ血清アルブミン、２．５ｎ＋Ｍジチオトレイトール、 ０．２５ｍＭ混合ｄＮＴＰｓ　、　２ａ＋Ｍ　ｒＡＴＰ及び１ｘグリセロール加 えｌμｇの一末鎖ＤＮＡ結合タンパク質により希釈（１：１）　した。二の反応 物を、その結合タンパク質が一末鎖ＤＮＡテンプレートをコートすることができ るように室温において５分間インキュベートした。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホ ロ酵素（大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）、１．７μｌの５０　Ｕ溶液）を添加し、 そしてその反応物を、３０℃において１０分間インキュベートした。Ｔ４　ＤＮ Ａリガーゼを添加しく０．５μｌ　、　２　ｗｅｉｓｓ　ｕｎｉｔｓ）、そして その反応物を、さらに３０℃において５分間インキュベートした。この混合物を 、大腸菌を形質転換するために使用し、そして適当に突然変異したクローンを制 限消化パターンにより選択した。
これと同一の方法を、例えば、一本鎖ＤＮＡテンプレートを作るためのＭ１３複 製起点をもつｐＴＲ１３（先に記載した）を使用して哺乳類細胞内で発現される ことができる突然変異体を作るために、使用することができる。
Ｄ、　組換え体タンパク質の製造及び精製Ｔ２５フラスコを、５ｍｌ　ＴＭＮ− ＦＨ培地加え１０％ＥＢＳ又はＥｘｃｅｌｌ　４００中のＳｆ９細胞を２　ｘ　 １０’の密度において接種し、次に先のバートＢ又はＣからの単離組換え体プラ ークにより感染させた。ウィルス株を、３日後に回収した、フラスコ（３０−１ ００＋＋＋１振とうフラスコ又は１００−３００ｍ１回転フラスコ）を、細胞（ １−１，８Ｘ　１０　’　／＋ｎｌ）により接種し、そして最終容量の１１５０ 〜１／１００に等しいウィルス株のアリコツトにより感染させた。この感染細胞 培養物を、組換え体酸化耐性ＴＭアナログ・タンパク質を含むならし培地を収穫 する前に４日間増殖させた。
７Ｍアナログを、細胞死骸の除去、その後の５つのクロマトグラフィ一段階：　 １）Ｑ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　、　２）　Ｉ−ｏンビン−アフィニティー、３） ゲル濾過、４）アニオン交換、及び５）第ニゲル濾過段階により、ならし培地か ら精製した。このゲル濾過段階は、バッファーの交換を行う。
すべてのクロマトグラフィーを４℃において行った。
１、　材料 クロマトグラフィー樹脂の幾つかを、商業源から購入した。ＱＳｅｐｈａｒｏｓ ｅ及び５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ ）から、Ｍｏｎ。
Ｑ５１５■をＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ） から購入した。
ＤＦＰ−トロンビン・アガロースを、だいたい以下のように調製した：１００ｍ １の２０ｍＭリン酸Ｎａ、　ｐＨ７，５中の３６０ｍｇのウシ・トロンビンを１ ００ｍ１の５０％Ａｆｆｉｇｅｌ　１０樹脂スラリーに添加し、そして４℃にお いて一夜混合した。このＡｆｆｉｇｅｌ　１０を、製造者により記載されたよう なに使用のために調製し、そして充填バッファーにより平衡化した。
残りの活性エステルを、１００ｍ１の０．１Ｍグリシン・メチルエステル（ｐＨ ５，６）の添加により、１時間、４℃においてブロックした。次に、このゲルを 、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　２Ｍ　ＮａＣＩ　、ｐＨ７，５により平衡 化し、そして２０７１１のＤＦＰを添加し、約１＋ｎＭ　ＤＦＰの最終濃度を与 えた。４℃において１６時間混合した後、さらに６μｌのＤＦＰを添加し、そし てさらに４時間混合を続けた。この樹脂を次に２０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ　、 　２ＭＮａＣｌ　ｐｔ（７，５により洗浄し、４℃において保管した。
トロンビン活性は、Ｋａｂｉ　Ｓ−２２３８基質を使用して測定され、そして〉 ８６ｘのトロンビンがその溶液から除去され、そしておそらくその樹脂に結合し 、樹脂１ｍｌ当たり約６ｍｇのトロンビンの最終濃度を与えることを示した。こ のＤＦＰ処理樹脂の酵素活性は、出発活性のく１ならし培地を収穫し、そして１ ４００　ｘ　ｇにおいて１０分間遠心分離により清澄化した。このｐＨを氷酢酸 により約６．０から約５．２まで調整した。次にこの調整培地を、Ｑ　５ｅｐｈ ａｒｏｓｅ樹脂のカラム上に供給した。このカラムは、前もって洗浄バッファー １（１１７＋ｎＭ酢酸Ｎａ、０，０２Ｘ　ＮａＮ　Ｉ　Ｉ）Ｈ５，０）の約４カ ラム容量により平衡化してあった。供給後、このカラムを、洗浄バッファー１そ の後洗浄バッファー２（２５ｍＭ酢酸Ｎａ、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１ｐｌ　５．０） により洗浄し、次に酸化耐性７Ｍアナログを、０．３Ｍ　ＮａＣｌを含む洗浄バ ッファー２、ｐ）１５．０により溶出させた。
プロティンＣ活性化検定（上記参照）において測定されるような活性を含むカラ ム画分をプールし、次に０，３Ｍ　ＮａＣ１、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−４１ＣＩ、 ０．５ｍＭ　ＣａＣＩｔ　、０．０２％　ＮａＮ　、　、ｐＨ７，５により希釈 した。この希釈物のｐＨを測定し、モしてＮａＯＨにより約７．５に調整した。
このプールのイオン強度は、はとんど０．３Ｍ　ＮａＣ１の溶液のイオン強度で あった。
この調整プールを、ならし培地を希釈するために使用したものと同一のバッファ ーにより前平衡化されたトロンビン・アガロース・カラム上に重力により一夜供 給した。このカラムを希釈バッファーにより洗浄し、そして７Ｍアナログを２． ＯＭ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　、１ｍＭＮａＥＤＴＡ、０． ０２％ＮａＮ　ｚ　、ｐＨ７，５によりそのマトリックスから除去した。
実質的に純粋な７Ｍアナログを、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムに適用し、モ して０．２％Ｎ−二チルセチルォリン・アセテート（ＮＥＭ）　ｐＨ’ｙ、ｏ中 に回収した。この段階をＮａＣｌを除去する。
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムから回収された７Ｍアナログを、０．２Ｘ　Ｎ −、：Ｃ，チルモルフォリン（ＮＥＭ）　ｐＨ７，０により前平衡化されたＭｏ ｎｏ　Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ｔｏミクロン粒子、第四アミン）に適 用した。このバッファーにより洗浄した後、様々な形態を０〜０．４Ｍ　ＮａＣ Ｉのグラジェントを使用して分離した。それぞれの画分のサンプルを、非還元条 件下５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で評価した。ＳＤＳ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　 Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ−ｅｓｉｓを、スタッキング・ゲル内における ３、３ｘアクリルアミド及びランニング・ゲル内における１２．５％アクリルア ミドを使用してＬａｅｍｍｌ　ｉの方法により行った。非還元サンプルを、Ｌａ ｅｍｍｌｉサンプル可溶化バッファ　−（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ６ ，８，２５％グリセロール、２％ＳＯ３゜及び０．０１％ブロモフェノール・ブ ルー）中で希釈した。ＰｈａｒｍａｃｉａＬＭＷＣａ１ｉｂｒａｔｉｏｎ　Ｋｉ ｔタンパク質標準標準ＭＷ？−カーとして使用し、そしてそのゲルを銀染色した 。幾つかの画分において、たった１つの主要なバンドが銀染色により可視化され る。
類似の易動度をもつペプチドを含む両分をプールし、そして次に全タンパク質含 量について及び以下に記載するようなプロティンＣ活性化検定における活性につ いて検定した。
Ｅ、　トロンボモジュリン・アナログについての検定■、　材料 ウサギ・トロンボモジュリン、ヒルジン及びヒト・プロティンＣを、Ｉｎｔｅｇ ｒａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ又はＡｏ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃａから得た。ヒト・トロンビンは、様々な非商業的及び商業的な源から入手可 能である。アフィニティー・クロマトグラフィーのためのウシ・トロンビンを、 Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｓ、　Ｄａｌｌａｓ、　Ｔｅｘａｓから購入した。Ｄ−バリ ールーＬ−ｏイシン−Ｌ−７／ｌ／ギ、：シーｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２６ ６）及びＤ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）を Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍから購入した。
ウノ血清アルブミン（画分Ｖ）、クエン酸化ヒト血漿、及びＡＰＴＴ試薬を、Ｓ ｉｇｍａ　ＣｈｅＩｒｌｉｃａｌｓから購入した。マイクロタイター・プレート は、Ｄｙｎａｔｅｃｈ（＃２５８６１−９６）により供給された。他の試薬のす べては、入手可能な最も高いグレードを有していた。
本検定を、マイクロタイター・プレート内で２０μｍ以下のそれぞれのタンパク 質を混合することにより行った：　トロンボモジュリン・サンプル（未知又は標 準）、トロンビン（３μＭ）　、及びプロティンＣ（１，５μＭ）。それぞれの タンパク質についての検定希釈物は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、０．１Ｍ　Ｎ ａＣ１、２，５ｎ＋Ｍ　ＣａＣｌ２．５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　ｐＨ７，４であ った。このウェルを３７℃において２時間までインキュベートし、その後、プロ ティンＣ活性化を、検定希釈物中の２０μｌのヒルジン（０，１６ユニツト／μ ｌ　、５７０　ｎＭ）の添加及びさらなる１０分間のインキュベーションにより 、終了させた。
形成された活性化プロティンＣの量を、１００μｌの１．０　ｍＭ　Ｓ−２２６ ６（検定希釈物中）の添加、及び３７℃におけるプレートのインキュベート継続 により検出した。それぞれのウェル内の４０５　ｎ＋ｎにおける吸光度をＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓプレート・リーダーを使用して１５分間にわたり １０秒間毎に読んだ。吸光度データを保存し、そしてそれぞれのウェルにおける １分間当たりの吸光度における変化（傾き）を計算した。１分間当たりの吸光度 における変化は、活性化プロティンＣのｐモル／ｍＩに正比例する。
この比を、全体として活性化されたプロティンＣの変化した濃度を経験的に使用 して、測定した。十分に活性化されたプロティンＣを含むサンプルを０〜１．５ μＭにおいてプロティンＣを６０ｎＭウサギＴＭ及び３０ｎＭ　トロンビンと混 合し、０〜４時間時間インキュベート用ヒルジン加し、そして上記の如＜　３２ ２６６活性を測定することにより、作った。プロティンＣが十分に活性化されて いるところの条件を、３２２６６活性（Ａ４０５／分）がプラトーに達するとこ ろの時間として定義した。
活性のユニットは、先に定義した試薬条件下でＩ＋ｌｌ／分当たりに生じる１モ ルの活性化プロティンＣとして定義される。あるいは、活性値は、生来の洗剤可 溶化ウサギ・トロンボモジュリン又は他のトロンボモジュリン標準と比較して報 告される。
ｉｉ、オキシダントへ晒した後のプロティンＣ補因子活性クロラミン−Ｔ（Ｎ− クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド・ナトリウム塩、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を、オ キシダントに対する突然変異７Ｍアナログ・ペプチドの耐性を特異的にテストす るために使用した。突然変異体ＴＭ遺伝子配列又はｐＴＭＨＹｌｏｌ（野性型、 ａａ　２２７−４６２）によりエンコードされているペプチドを含むトランスフ ェクション培養上澄液（１ｍｌ）を、ＮＡＰ−１０カラム（ＬＫＢ／Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）上の１．５Ｄ１１の０．２％Ｎ−二チルセチルォリン（Ｎ［４Ｍ）　 、ｐＨ７，０，０，００８％Ｔｗｅｅｎ　８０中て脱塩し、そして次に凍結乾燥 し、そして１００μｌの上記バッファー中で再懸濁させた。
このサンプルを、等しく分割し、そして５μｌの水（対照）又は５μｌの０．１ ）Ｊクロラミン−Ｔ（最終濃度＝９．１ｍＭ）のいずれかを添加した。このサン プルを、室温において２０分間インキュベートし、次に、オキシダントのいずれ をも除去するためにＮＡＰ−５カラム上を通過させた。使用した脱塩バッファー は、プロティンＣ検定希釈剤であった。突然変異体ペプチドは、クロラミン−Ｔ に晒された後その活性の全てを保持し、一方、野性型ペプチドは、実質的に不活 性化された。
ｉｉｉ、活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の阻害クエン酸化血 漿からの血塊の形成は、エラグ酸中の脳ケファリン（”ＡＴＰＰ試薬″）、及び カルシウム・イオンの添加により、引き金を引かれる。血塊が形成するのに必要 な時間は、再現性があり。そしてトロンボモジュリンの添加により正比例して増 加する。このＡＰＴＴのための試薬を、混合前３７℃においてインキュベートす る。但し、クエン酸化血漿を４℃において維持する。
反応を以下のように行った：　ｔｏｏ　μｌのＳｉｇｍａ　Ｃ１ｔｒａｔｅｄ　 Ｐｌａｓｍａを、プラスチック・キュベツト（Ｓａｒｓｔｅｄｔ　＃６７．７４ ２）に添加し、３７°Ｃにおいて１分間インキュベートし；　１００μｍのＳｉ ｇｍａ　ＡＰＴＴ試薬を添加し、そしてその混合物を３７℃において２分間イン キュベートシ。
１００μｍのテスト・サンプル（又は対照バッファー）及び１００μｌの２５　 ＤＩＭ　ＣａＣｌ＋を添加し、そしてそのキュベツトを、読みの間３７℃におい てそのキュベツトを維持するためにＨａａｋｅ　ＫＴ２循環水浴を備えたＨｅｗ ｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　８４５１八分光光度計内に直ちに置いた。３２０ｎ ｍにおける光散乱による吸光度をＣａＣｌ□の添加から計測した１５から１２０ 秒間まで、０．５秒間毎に測定した。吸光度対時間のプロ・ットは、その傾きが 最も急になる時間として定義した血塊化時間がその曲線の変曲点と一致しながら シグモイド曲線を作り出した。
生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）にけるＡＰＴＴ検定を先に記載したようなやり方で行 った。但し、インビボにおける実験において使用した動物からのクエン酸化血漿 を、商業的に得られるクエン酸化血漿の代わりに使用した。
あるいは、ＡＰＣ又はＴＣＴを記載するように行うことができる。
ＰＣＴ及びＴＣＴの両方を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　８４５２Ａダイ オード−アレイ（ｄｉｏｄｅ−ａｒｒａｙ）分光光度又はＡＰＴＴのために使用 された等偽物を使用して測定する。ＰＴ反応のために、９０μｌの、ＴＭアナロ グ６ｈ／２２７−４６２又はＰＢＳのいずれかをキュベツト内の２０μｍのトロ ンボプラスチン及び９０μｌの２５ｍＭ　ＣａＣ１２に添加した。この混合物を 、３７℃において１分間インキュベートし、次に１００μｍのクエン酸化血漿を 添加した。キュベツトを分光光度計内に装填した後、３２０ｎｍにおける光散乱 による吸光度を、血漿の添加から計測した１５から１２０秒間まで、０．５秒間 毎に測定した。吸光度対時間のプロットは、その傾きが最も急になる時間として 定義した血塊化時間がその曲線の変曲点と一致しながらシグモイド曲線を作り出 した。ＴＣＴを、上記と同じやり方で評価した。最初の反応混合物は、１００μ ｌのクエン酸化血漿、２５μ＋の１００ｍＭ　ＣａＣＬ及び１６２．５μｌのＰ ＢＳ又は７Ｍアナログのいずれかを含む。１分後、１２．５μｍのトロンビンを 添加する。この血塊化時間を先に記載したように測定する。
Ｖ、　直接的抗血液凝固活性−フィブリノーゲンからフィブリンへのトロンビン 及び変化量の７Ｍアナログ６ｈ／２２７−４６２を、マイクロタイター・プレー ト・ウェル内で３７℃において２分間インキュベートした。開始反応客員の全体 は、５０μｌＰ［ｌｓ加えて７．５　ｍＭ　ＣａＣ１２、及び９０　ｎＭ　Ｉ・ ロンビンであった。最初のインキュベーションの後、１００μｌの３．７５　ｍ ｇ／ｍｌのヒト・フィブリノーゲンをウェル毎に添加し、モしてフィブリンのト ロンビン誘導形成を、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＤｅｖｉｃｅｓＶ＋ｎａｘ分光光度 計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ） 内で４０５　ｎｍでの吸光度における変化を測定することにより追跡した。この 検定の終点は、最終的な吸光度の５０％が達成さるところの時間であった。
残りのトロンビン活性を、トロンビン濃度の逆数と血塊化時間とを線型に関係付 けるトロンビンの標準曲線を参照することにより測定した。洗剤可溶化生来ウサ ギ・トロンボモジュリン及びプロティンＣ補因子活性により測定されるような等 しい活性を示す７Ｍアナログ６ｈ／２２７−４６２の量を、直接的抗血液凝固活 性検定において比較するとき、７Ｍアナログは、フィブリノーゲンのフィブリン へのトロンビン−仲介変換を阻害するかなり減少された能力（約１／１０）を示 す。
ｖｉ、血小板活性化及び凝集の阻害 血小板のトロンビン活性化の対する７Ｍアナログ６ｈ／２２７−４６２の効果を 、Ｅｓｍｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２５８：１２２３８−１２２４２の方法によりテストした。この検定を使用 して評価するとき、７Ｍアナログ６ｈ／２２７−４６２は、血小板のトロンビン −仲介の活性化及び凝集を有意に阻害しなかった。
ｖｉｉｉ、７Ｍ抗血栓活性の追加の測定ｌ）トロンビンにより因子Ｖの活性化の ７Ｍアナログ阻害を、Ｅｓｍｏｎ。
ている方法により測定する。
２）アンチトロンビンＩＩＩ及びヘパリン補因子ＩＩによる７Ｍアナログ・トロ ンビン複合体の阻害を、Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ　ｅＬ　ａｌ、　（１９８６）、 前記により記載されるように測定する。
３）トロンビンによるプロティンＳの不活性化の７Ｍアナログ阻害を、Ｔｈｏｍ ｐｓｏｎ　＆　Ｓａｌｅｍ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｔｎｖｅｓｔ、　（１９８６） 　７８（１）二１３−１７１こより記載されている方法により測定する。
、４）因子ｘｔｔｉのトロンビン−仲介活性化の阻害を、Ｐｏｌｇａｒ、　ｅｔ 　ａｌ、。
ンビボにおける活性 血栓の形成を排除する７Ｍアナログの能力を、ラットにおける修飾した血行停止 ／内皮損傷−誘導静脈血栓モデルにおいて評価した（Ｍａｇｇｉ、　Ａ、　ｅｔ 　ａｌ、、　（１９８７）　Ｈａｅａ＋ｏｓｔａｓｉｓ　１７：３２９−３３５ 又はＰｅ５ｃａｄｏｒ。
Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　 ５３：１９７−２０１を参照のこと。１麻酔した雄のＳｐｒａｇｕｅ　ＤＩＬＷ Ｉｅｙラット（４５０グラム）の大静脈（ｖｅｎａｃａｖａ）を外科手術により 単離し、次にその動物を、トロンボモジュリン・アナログ（生来のトロンボモジ ュリンの第６８ＧＦ一様ドメインを含む６ｈ／２２７−４６２）　、標準的なヘ パリン又は対照としての正常な生理食塩水（０，１ｍｌ／ラット）をその大腿動 脈中にポーラス注射することにより処理した。ヘパリンの投与量は、４５ユニツ ト／ラツトであった。トロンボモジュリン・アナログの投与量は、１００．１０ １１　。
０．１又は０．Ｏ１μｇ／１μトであった。注射２分後に、工大静脈を、左の腎 静脈において連結し、血行停止を誘導し、そして血管内皮を、ビンセットにより 優しくはさむことにより損傷を与えた。１０分後、大静脈を切除し、そして血栓 の存在について検査し、存在する場合には、取り出し、そして計量した。すべて の場合において、１００、ｌＯｌ又は１μｇ／ラットにおいてヘパリン又はトロ ンボモジュリン・アナログ（６ｈ／２２７−４６２）により処理された動物は、 血栓形成の証拠を全くしめさなかったが、一方、生理食塩水処理された動物及び 最も低い投与量のトロンボモジュリン・アナログ（０，０１ｔｔｇ）を受けたも のは、１４．　ｈ＋ｇ／血栓の平均重量をもつ血栓をもっていた。０．１μｇの トロンボモジュリン・アナログにより処理されたラットは、取り出し且つ計量さ れる程十分に多くない微量の血栓を示した。
本研究において使用した投与量レンジは、ｌμｇ／ｍｌのトロンボモジュリン・ アナログがＡＰＴＴを延長する程十分ではないが１０μｇ／ｍｌの添加がかなり の延長をもたらすようなインビトロにおけるＡＰＴＴ検定に基づいて選ばれた。
処理されたラットのそれぞれから取り出された血漿サンプルに対して行われたＡ ＰＴＴ検定の結果は、７Ｍアナログ処理及び対照のラットにおける延長（１００ μｇ　ＴＭアナログ＝４５秒間、他のすべての投与量の７Ｍアナログ及び生理食 塩水対照＝　３０−３５秒間）を、全く示さなかった。しかしながら、ヘパリン 処理ラットにおけるＡＰＴＴは、かなり延長された（１００秒間）。
この実験系は、血管損傷及び減少された血流を特徴とするヒトにおける深部静脈 血栓のための直接的に比較可能なモデルである。先に記載した結果は、プロティ ンＣのトロンビン−仲介活性化の補因子として作用することができる７Ｍアナロ グの非常に低い投与量が、未だ、血栓形成の防止において有効なフィブリンへの フィブリノーゲンのトロンビン−仲介変換を阻害するための実質的に減少れた能 力をもつということを、証明している。そのうえ、生体外において測定されたＡ ＰＴＴにおける延長の非存在は、この７Ｍアナログが血液凝固パラメーターに対 する全身的な効果を全くもっておらず、そしてそれ故に、不安全な出血副作用を 促進しないであろうということを示している。
実施例３：　静脈及び動脈の両方の血栓の霊長類モデルにおける耐アナログのイ ンビボにおける活性 トロンボモジュリン・アナログの抗血栓の性質を、Ｈａｎｓｏｎ　Ｓ、Ｒ。
な修正を使用してヒヒにおける動脈と静脈とのシャント（ａｒｔｅｒｉｏｖｅ− ｎｏｕｓ　５ｈｕｎｔ）モデルにおいて評価した。このモデルは、ヒヒとヒトと の間の止血の類似性のため及び動脈と静脈とのシャントが動脈型と静脈型血栓と の両方についてのモデルとして役立つために、選ばれた。
ダクロン・チュービング（直径３．２＋ｎｍ）の片その後テフロン・チャンバー （直径９．３ｍｍ）により修飾されたシラスチック・チュービング・シャントを 、血液がそのシャントを通って動脈から流れ出し、そして大腿静脈を介してヒヒ に戻るように、ヒヒの大腿静脈中に、挿入した（米国特許出願逐次番号第０７７ ５６８．４５６号の図２を参照のこと。）。
ダクロン・チュービングは、天然の血液凝固過程、及び特に移植片表面上の血小 板の沈着を刺激する血栓形成表面を提供し、そして動脈の、すなわち、血小板の 豊富な、フィブリンにより一緒に取り込まれた血栓の生成についてのモデルとし て役立つ。上記チャンバーは、血液の流れの速度が減少される場合に、静脈内に 見られるものと類似の血行停止状態を作り出し、そして特に、静脈弁の周りの領 域を真似て、それ故、深部静脈血栓をもたらすものと類似の流れ条件のモデルを 作っている。このチャンバー内で形成された血栓は、静脈型で、フィブリン豊富 な血栓である。また、静脈型血栓は、血小板を含むが、動脈型血栓よりも少ない 。ダルコン移植片又はチャンバーのいずれかの内の血栓形成は、血小板沈着及び フィブリン付着成長（ａｃｃｒｅｔ　１ｏｎ）の両方を測定することにより評価 される。血小板沈着を、ヒヒから血小板を取り出し、Ｃａｄｒｏｙ、　Ｙ、、　 ｅｔ　ａｌ、。
（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１１３（４）：４３６−４４８の方法を使用し てその血小板をｌｌ＋インジウム−オキシンにより放射標識し、そして次にそれ らをその動物に戻すことにより、測定する。シンチレーション・カメラ、例えば 、Ｐｉｃｋｅｒ　ＤＣ４／１１　Ｄｙｎａシンチレーション・カメラ（Ｐｉｃｋ ｅｒ　Ｃｏｒｐ、、　ＮｏｒＬｈｆｏｒｄ、　Ｃｏｎｎ、）を、Ｃａｄｒｏｙ、 　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、、前記中に記載されているような血栓の一部として沈着 している血小板からの放射能の量を直接に測定するためにその移植片の上に置い た。血栓形成の第二の測定として、５μＣｉ投与量の１２ｓ１−標識されたヒヒ ・フィブリノーゲンを、上記シャントの挿入に先立って静脈内に与える。この実 験の終わりに、そのシャントを取り外し、洗浄し、モして１１インジウム放射能 （半減期、２．８日間）を壊変させるために３０日間保管する。１１１インジウ ムは１２％インジウムよりもかなり速く壊変するため、そのシャント内に残る検 出可能な放射能は、血栓の一部として沈着したフィブリンの量を表している。全 フィブリン沈着を、ＴＣＴ検定により測定されるようなヒヒ血液中に存在する血 塊化可能なフィブリノーゲンの量により、沈着した１分間当たりの上記カウント を割ることにより、計算する。このシリーズ内の第一シャントは、第ニジヤント の対照として役立つ。
シリーズ内の２つのシャントを、ヒヒに挿入し、そして７Ｍアナログ（６ｈ／２ ２７−４６２　、表４を参照のこと。）を、１時間にわたり７又は８ｍｇ／時間 の速度においてその２つのシャントの間の点において注入した。米国特許出願逐 次番号第０７１５６８．４５６号の図３中に見られることができるように、血小 板は、対照シャント内の上記チャンバーとダルコン移植片との両方の内に沈着し たが、血小板の沈着は、７Ｍアナログの第ニジヤント中への注入の後にかなり減 少された。
これらの実験は、トロンビン−仲介のプロティンＣ活性化のための補因子として 作用する能力をもち、そしてフィブリノーゲンのフィブリンへのトロンビン−仲 介変換並びに血小板のトロンビン−仲介活性化及び凝集を阻害するかなり減少さ れた能力をもつ７Ｍアナログが、インビボ・モデルにおける動脈型又は静脈型の いずれかの血栓の形成を、防止することができるということを、証明している。
このような７Ｍアナログは、それ故、動脈に又は静脈に局在化するかにかかわら ず、いかなる血栓疾患の医薬治療に有用であろう。
実施例４：　インビボにおける循環半減期幾つかの７Ｍアナログの循環半減期を 、Ｂａｋｈｉｔ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｔ、。
（１９８８）　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　２：３１−３６の手順の修正を使用 して評価した。
トロンボモジュリン・アナログを、５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｓ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ 、、、　（１９８８）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３ニア８６２−７８ ６７のラクトペルオキシダーゼ法に従って１２５　ヨウ素により放射標識した。
約１００．０００ｃｐ重量の標識アナログを、麻酔したマウスの大腿静脈中に注 射し、そして少量のサンプルを、選ぼれた時間間隔において回収した。循環中に 存在する放射標識されたトロンボモジュリン・アナログの量に対応して、それぞ れのサンプル中に存在する放射能のレベルを、ガンマ・カウンター（Ｂｅｃｋｍ ａｎ）内での計数により測定し、そしてその循環中の放射能の量をその元の値の １／２まで減少させるのに必要な時間を測定した。
また、これらは、ＡＰＣ検定及びＩ！ＬＩＳＡ測定に基くことができる。
３つのトロンボモジュリン・アナログを、上記の方法を使用して評価した：　６ ｈ／２２７−４６２（上記を参照のこと。）、６ｈ／２２７−４６２であって炭 水化物の幾つか又は全部を除去するためにフッ化水素酸（ＨＦ）により前処理さ れたもの、及び４ｔ／２２７−４６２（表４及び実施例１．８．２を参照のこと 。）。この処理を、Ｍｏｒｔ、　Ａ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｌａｍｐｏｒｔ、　Ｔ、Ａ 。
（１９７７）　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８２：２８ ９−３０９の方法に従って行った。簡単に言えば、０．８ｍｇの７Ｍアナログ（ ６ｈ／２２７−４６２）を、１ｍｌアニソール＋　ｌ０ｍ１　ＨＦ（濃）中で、 ０℃において１時間、真空下でインキコベートした。この時間の後、揮発性液体 を蒸発させ、そしてそのタンパク質残渣を、２回の、０．１Ｍ酢酸の３ｍｌ洗浄 その後の２回の５０％酢酸の３ｍｌ洗浄によりその反応チャンバーから濯いだ。
この合わせた洗浄液を、残ったアニソールのいずれをも除去するために２ｍｌの エチルエーテルにより抽出した。水相を含むペプチドを、ＰＤ１０カラム上で脱 塩し、タンパク質の９２％を、その出発物質から回収した。
表６中の結果から見られるように、糖添加を修飾するために７Ｍアナログを処理 することは、その循環半減期をかなり変更することができる。これは、炭水化物 を除去するか又は異なる細胞型内での発現によりその組成を変更させるかのいず れかにより、行われることができきる。
ＧＧＣＡＣＧ　ＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＭＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡ 　ＣＧＧＡＣＡＧＧＡ　４６ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＧ　ＡＧＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡ ＴＣＧＧＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴ　ＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣ９６ＡＣＧＧＣ ＣＣＴＧＴ　ＣＧＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣ ＡＣＧＣＧＧＣＧＣＧ　１４６表１（続き） 表１（続き） 表１（続き） ＴＣＣＭＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＣＧＴＧ　ＣＧＧ 　ＡＣＣＧＡＧ　ＣＧＧ　ＡＣＧ　１８６９ＣＣＧ　ＣＡＣＡＧＡ　ＣＴＣＴＧ Ａ　ＧＣＧＧＣＣＴＣＣＧ　ＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣ１９０４Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａ ｒｇ　Ｌｅｕ　ＯＰ表２ ハイポダーミンＡシグナル配列−ｐＨＹＩＣＯＤ　＃１１９９ ＣＯＤ　＃］、２９２ ＣＯＤ　＃１２９３ ＣＯＤ　＃１４０Ｂ ＣＯＤ　＃１４０９ 表３（続き） ＣＯＤ　＃１４１０ ＣＯＤ　＃１４：１１ ＣＯＤ　＃１４１２ ＣＯＤ　＃１４３３ ＣＯＤ　＃１４３４ 表３（続き） ＣＯＤ　＃１４：＋５ ＣＯＤ　＃１４８０ ＣＯＤ　８．１４７９ ＣＯＤ　：〕４７ａ ＣＯＤ　ｉｉｌ、４１＋１ 昆虫内での発現 哺乳動物細胞内での発現 ドメイン 表５ ａａ２９１におけるメチオニンの置換のためのプライマーＴＧＣＧＡＧ　ＡＣＣ ＧＧＣＴＡＣＣＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧａａ３８１におけるメチオニン の置換のためのプライマーＴＴＴ　ＴＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＣＣＴＧＴ 　ＣＣＡ　ＧＣＣＧＴＴＴ　ＴＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＣＣＴＧＴ　ＣＣ Ａ　ＧＣＣＧＴＴＴ　ＴＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＣＣＴＧＴ　ＣＣＡ　Ｇ ＣＣ０表６ サンプル　半減期（分間） ６　ｈ　／２２７−４６２　２．７ ＨＦ処理６　ｈ　／２２７−４６２　７．３４　ｔ　／２２７−４６２　８．１ 実施例５：　ＣＨＯ細胞内での組換え体トロンボモジュリン遺伝子の発現 細胞系ＣＨＯＤＸＢＩＩを、Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｔｔｙのしａｒ ｒｙ　Ｃｈａｓｉｎから得た。細胞を、９％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びゲンタ マイシンを補ったＲＡＭ’ｓ　Ｆ−１２完全培地（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた 。
Ａ、トランスフェクション 細胞、ｌ　ｌ［１０’を、トランスフェクションの１日前にｌｏｈ＋ｍベトリ皿 内にプレートした。可溶性７ＭアナログをエンコードしているプラスミドｐＴＨ Ｒ５２５を、以下の実施例９中に記載するように調製した。
この遺伝子を、以下の修飾をもつトロンボモジュリンのアナログをエンコードす るために構築した：δ３（天然のアミノ末端から３アミノ酸を切り詰められたも の）　、Ｎｅｔ３８８Ｌｅｕ（ロイシンによる位置番号３８８におけるメチオニ ンの置換）　、Ａｒｇ４５６Ｇｌｙ（グリシンによる位置４５６におけるアルギ ニンの置換）、旧５４５７Ｇｌｎ（グルタミンによる位置４５７におけるヒスチ ジンの置換）　、５ｅｒ４７４Ａ１ａ（アラニンによる位置４７４におけるセリ ンの置換）、及びδ７（４９７における可溶性ＴＭのカルボキシ末端からの７ア ミノ酸を切り詰められたもの、すねわち、このアナログは、アミノ酸４９０にお いて終わる。）。それぞれの皿について、トランスフェクトされるべきｐＴＨＲ ５２５ＤＮＡ（メルカプトエタノール（１：　１０００希釈）による補われた１ ００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＢＲＬ）中で溶解された２０　ｕ　ｇ）を、リボ フエクチン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、　１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の６０ μｇ）の溶液と共に混合した。この混合物を、室温において１５分間放置した。
ＤＮＡ混合物の添加に先立ち、細胞を、Ｏｐｔｉ−ＮＥＭにより２回洗浄し、そ して３ｍｌのＯｐｔｉ−ＮＢＭをそれぞれの皿内にプレートした。このＤＮＡ及 びリボフエクチン混合物を、そのプレートされた細胞に添加し、そして−夜イン キユベートした。次にこの培地を、ＲＡＭ’ｓ　Ｆ−１２選択培地（Ｗ１０グリ シン、ヒボキサンチン、及びチミジン）に変更し、そしてその細胞を、−夜回収 に供した。次に、この培地を、ハイグロマイシンを含むＨＡＭ’ｓ　Ｆ−１２完 全培地（１５０μｇ／ｍｌ、　ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）に変更し、そしてその細 胞を、この培地中で３日間維持した。この時の終わりに、９％透析ＦＢＳ及びゲ ンタマイシンを補ったＲＡＭ’ｓ　Ｆ−１２選択培地（グリシン、ヒボキサンチ ン、及びチミジンを含まないもの）に変更した。クローンを、生じさせ（約７〜 ｌＯ日間）、そしてその混合集団を、ＡＰＣ及びＥＬＩＳＡ検定により検定した 。この細胞集団を、製造目的のために培養フラスコ（２２５ｃｎ＋”　）内で増 加させた。
口、　製造＋　（Ｉ　Ｌ　回転培養ｘ　２）培養を、３ｇ　Ｃｙｔｏｄｅｘ　３ 微小担体ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、５Ｘ　ＦＢＳを補った５０ｈ＋ｌ　 ＨＡＭ’　ｓ　Ｆ−１２完全培地、及び８．４　ｘ　１０　’全細胞により開始 した。後日、培地をその容量をルにもっていくまで添加した。上澄を約６週間に わたり１日おきに収穫した。４５０ｍ１を最初の２回、そして１５００ｍｌをそ の後の全ての機会に収穫した。全収穫物は、１１．３５してあり、そして４．１ ４　ｘ　１０　’　Ｕを含んでいた。
実施例６：　培養上澄液からのＴＭアナログの精製Ａ、　ＴＭ　ＬＥＯ（ＣＨＯ ）の精製 Ｃ）１０細胞発現され、そして分泌されたコンドロイチンを含み又は硫酸塩を含 まないＴＭ　ＬＥＯ（ＣＩＯ）アナログを含む培地を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　 ８０まで調製し、濾過しく１．２ＨＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃａｐｓｕｌｅ　＃１２１ ６８及び０．２　μＭ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　＃１２１４０．　Ｇ ｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ。
Ｍ＋）　、ｌｏＯｍＩ　Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に供給し、５０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８，０，２Ｍ　ＮａＣ１，０，１ｍＭ　ＲＤＴＡ、 　０．０１Ｘ　Ｔｗｅｅｎ　８０により洗浄し、そして同一バッファー中のＮａ ＣＩグラジェント（０，２〜２　Ｍ）により溶出させた。ピークＡ（硫酸コンド ロイチンを含まないＴＭ）及びビークＢ（硫酸コンドロイチンを含む）を、０． ３　Ｍ　ＮａＣ１，２０１１ＸＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ、　０．５ｍＭ　ＣａＣ ｌ　２　ＥＤＴＡ、　０．０２％ＮａＮ　！　、　ｐＨ７，５まで希釈した。ト ロンビン・アフィニティー・クロマトグラフィ一段階を、本質的に先に記載した ように行い、そしてそのサンプルを脱塩する。活性画分をプールした。
Ｂ、　ＴＭ　Ｅ　（ＳＦ３）　（７）精製これらの生成物を、先に記載したよう に又は以下のように単離することができる： すべての手順を４℃において行った。濾過した昆虫細胞収穫物を、水によりｌ： ｌに希釈し、酢酸によりｐＨ５，２まで滴定し、そしてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 高速樹脂（２５ｍＭ　酢酸Ｎａ、　ｐＨ５，０，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，０，０２％ ＮａＮ５　）上に供給した。活性画分を、同一バッファー中の０．３ＭＮａＣ１ により溶出させ、プールし、０．３　Ｍ　Ｎａ１ｌ、　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　０．５ｍＭ　ＣａＣｌ　ｔ　、　０．０２％ＮａＮ　２まで希釈し、 ｐｉ（７，５に調整しくＮａ０Ｈ）、１２０ｍ１　ＤＦＰ−不活性化トロンビン Ａｆｆｉｇｅｌ−１０樹脂（上記）上に供給し、そして２　Ｍ　ＮａＣ１，２０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　１ｍＭ　Ｎａｇ　ＥＤＴＡ、　０．０２Ｘ　ＮａＮ 　ｓ　。
ｐＨ７，５により溶出させた。活性画分をプールし、脱塩し、そして５ｅｐｈａ ｄｅｘ　Ｇ−２５カラム上で０．２％　ＮＥＷ−Ａｃ、　ｐＨ７にバッファー交 換し、Ｍｏｎｏ−Ｑ　ＨＲＩＯ／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に供給し 、そして同一バッファー中のＯとＩＭとの間のＮａＣｌでグラジェント溶出させ た。高い比活性画分（ＡＰＣ検定）をプールし、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５上 でＰＢＳ又は０．２％ＮＥＭ−Ａｃ、　ｐＨ７中に脱塩し、そして冷凍又は凍結 乾燥保存した。
Ｃ，ＣＨＬＩ細胞内での可溶性ＴＩＪ＋、＝ｏ発現！ｆ性型並びにＴＩＪ、アミ ノ酸１〜４９７、及び完全長ＴＭ、アミノ酸１−５５７のＭ３８１］Ｌ突然変異 体形態の両方をコーディングしているＤＮＡを、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得られた哺乳類発現ベクター’− １）Ｒｅ／ＣＭＶを使用してＣｏｓ　７及びＣＨＬＩ内で発現させた。過渡的発 現のために、完全長ＴＩＪを発現しているＣｏｓ　７細胞を、トランスフェクシ ョンの４８〜７２時間後に収穫した。ＣＨＬＩ細胞は、ヒト・メラノーマ細胞系 であり、ＡＴＣＣから入手可能である。
Ｄ、ＴＭＬ、。（Ｃ）ＩＬＩ）の精製 ＣＩＩＬＩ細胞により発現及び分泌された硫酸コンドローｒチンを含むＴＭｖｃ ｏ　（ＣＨＬＩ）アナログを含む培地を、Ｔｗｅｅｎ　８０において０．０１％ とし、濾過しく１．２μＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃａｐｓｕｌｅ　＃１２１６８及び０ ．２　ＢＭ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ＃１２１４０．　Ｇｅｌｍａｎ　 ５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍｌ）　、１００ｍＩ　Ｑ−３ｅ ｐｈａｒｏｓｅカラム上に供給し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８， ０，２Ｍ　ＮａＣ１，０，１ＩＩＩＭＥＤＴＡ、　０．０１Ｘ　Ｔｗｅｅｎ　８ ０により洗浄し、そして同一バッファー中のＮａＣｌグラジェント（０，２〜２ 　Ｍ）により溶出させた（ＡＰＣ検定により１Ｍ付近のＮａＣ１を溶出する）。
この溶出液を、ＨｔＯにより３倍に希釈し、第二５ａ＋Ｉ　Ｑ−５ｅｐｈａｒｏ ｓｅカラム上に供給し、０．００１Ｘ　Ｔｗｅｅｎ　８０及び０．７　Ｍ　Ｎａ Ｃｌを含むことを除き上記と同一なバッファーにより洗浄し、そして第二の浅い グラジェント（３０カラム容量；ｏ、７〜１．６ＭＮａＣ１）により溶出させた 。少量（＜５００　μｇ）を、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｒｏｓｅ６（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）上の分子排除クロマトグラフィーにより、さらに精製した。
Ｂ、　アニオン交換クロマトグラフィー先に記載したように、１以上のＴＭ、ア ナログを、非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で走らせたＳｆ９細胞からの トロンビン−アフィニティー精製材料中で検出する。方法を、これらの変異体を 分割するために開発した。ＴＭ、　（ＳＦ３）アナログ６ｈ／２２７−４６２、 すなわち、先に記載したような５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムから回収したＴ Ｍｗ　（ＳＦ３）を、０．２ｘＮ−エチルモルフォリン（ＮＲＭ）　ｐＨ７，０ により前平衡化したＭｏｎｏ　Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　１０ミクロン 粒子、第四アミン）に適用した。このバッファーにより洗浄した後、様々な形態 を、Ｏ〜・０．４Ｍ　ＮａＣ１のグラジェントを使用して分離した。溶出及び活 性プロフィールを、図１中に示す。それぞれの画分からのサンプルを、非還元条 件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で評価した。僅かに異なる易動性をもつ３つの別 個のバンドを、その染色ゲル上に見ることができた。類似の易動性をもつペプチ ドを含む画分をプールしくＡ　＝　画分３２−３５　、Ｂ・画分４０−４４　、 Ｃ＝画分７Ｏ−７１）、そして次に全タンパク質含量について及びプロティンＣ 活性化検定における活性について検定した。比活性を、以下の表中に列記する。
不活性ペプチドは、その画分のいずれにおいても全く検出されなかった。
テスト材料　比活性（Ｕ／ｍｇ） Ｍｏｎｏ　Ｑ供給物　１６６、０００±１２，０００画分３２−３５（Ａ）　４ １６．０００±１９．０００画分４Ｏ−４４（Ｂ）　２６２．０００±　４．０ ００画分７０−７１　（Ｃ）　６７、６００±　５．０００Ｂ、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析 Ｍｏｎｏ−Ｑカラム上で精製したＴＭ、　（！Ｍ９）のそれぞれの画分又は他の それぞれの画分を、以下のように５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した：４．５μｍ の画分を、還元剤を含まない４ｘ濃縮５Ｏ８−ＰＡＧＥサンプル・バッファーと 共に混合し、約１０〜１５分間、約９０℃において加熱し、そして提供された櫛 及びプロトコールを使用してＰｈａｒｍａｃｉａからの８−２５％アクロルアミ ドＰｈａｓ　ｔゲル上に供給した。このゲルを、製造者により提案されたプロト コールを使用してＰｈａｓ　ｔゲル系上で走らせた。
このゲルは、ピークと肩であって、それぞれＰｏｏ　Ｉと８と作るためにプール されたものを横切る画分を示している（図２）。略号は、以下の如きである： 番号−画分番号は、図１中に記載され、そして上記表に比活性を列記する。
Ａ−パネルＡ上のロードにおいて場合により見られる人工産物バンド、画分２８ 及び画分３９；　これは、実験制作物上のフィンガープリントからのタンパク質 由来のものであるようである。
Ｄ−Ｐｏｏｌ　Ｃ中に溶出するＴＭ、ジスルフィド結合ダイマー。
ＭＵ−上のモノマー、これは、−末鎖ＴＩＪ、であるようである。
Ｍし−下のモノマー、ＭＵと同じＮ−末端（ＡＩａＶａｌＶａｌＰｒｏ、、、） をもつが、そのＣ−末端付近でタンパク質分解が予想されるような、より速い電 気泳動易動性をもつもの。
Ｌ−Ｄ、ＭＬＩ及びＭＬを含むＭｏｎｏ−Ｑカラム上に供給された材料。
上記の表中に示した両分をプールすることにより、ＭＵ又はＭＬを、必要なとき に、かなり濃縮することができる。
実施例７・　２末鎖ＴＭの存在の証明 Ａ、ＣＩＩＬＩ及びＣｌｌ０細胞からの解裂形態の分離以下のサンプルを、Ｇｅ ｌ　Ｎｏｖｅｘからの８Ｘ　Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル上で分析し、すべて のサンプルを、還元条件下で走らせた。図３は、以下のサンプルについての結果 を示している：と二２ １　Ｎｏｖｅｘ　Ｗｉｄｅ　Ｒａｎｇｅ　１Ｊａｒｋｅｒ２　ＴＭ　Ｌ、ｏ（Ｃ ＨＯ）　＃８２８９１　ＬＪ３７Ｍ、Ｅ。（Ｃｔ（０）　ＰｋＢ　＋　ｍｌ　： ／ドロイチナーゼＡＢＣ（’／ニードモナス・４　７Ｍ　ＬＥＯ（ＣＨＯ）　Ｐ ｋＢ＋コンドロイチナーゼＡＣ（フラボバクテリウム・ヘバリウム（Ｆｌａｖｏ ｂａｃｔｅｒｔｕｍ　ｂｅｐａｒｉｕｍ））５　ＴＭ　Ｌｉｏ　（ＣＨＬＩ）　 ＰｋＢ＋　コンドロイチナーゼＡＣ（フラボバクテリウム・ヘバリウム（Ｆｌａ ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｕｍ））６７Ｍ、１．。（Ｃ）１０）　 ＰｋＢ＋コンドロイチナーゼＡＣ（アントロバクター・アウレッセンス（Ａｎｔ ｈｒｏｂａｃｋｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ））７ＴＩＪ＋、ｔ。（ＣＩ（ＬＬ ）　ＰｋＢ＋　コンドロイチナーゼＡＣ（フラボバクテリウム−へバリウム（Ｆ ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　ｈｅｐａｒｉｕｍ））８ＴＭｃｔ。（Ｃ）ＩＬ Ｉ）　ＰｋＢ　十：Ｉ　＞ド０−（−ｆ−ナーゼＡＢｃ（シュードモナス・ブル ガリス（Ｐ、　ｖｕｌｇａｒｉｓ））９ＴＭＬ！。（Ｃ）ＩＬＬ）　ＰｋＢ　＃ Ｑ６１７１０　Ｎｏｖｅｘ　Ｗｉｄｅ　Ｒａｎｇｅ　Ｍａｒｋｅｒこのゲルを、 様々な源からの商業的コンドロイチナーゼをテストするために元々走らせた。Ｃ Ｉ（０細胞及びＣＨＬＩ細胞がらのサンプルは、両方共、完全長可溶性７Ｍアナ ログの切り詰められた形態であるようである８０ｋＤａバンドを含んでいる。６ ６ｋＤａにおけるバンドは、安定にするために商業的コンドロイチナーゼ調製物 に添加されているＢＳＡである。レーン９は、十分に供給されていない（ｕｎｄ ｅｒｌｏａ、ｄｅｄ）。
Ｂ、　ウェスタン・プロット 精製されたＴＭ及び７Ｍアナログのサンプルを、８％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ゲル上で分析し、これを、１２５ボルトにおいて２時間走らせた。このタンパク 質を、１２０＋ｎＡにおいて３時間ニトロセルロースにエレクトロプロット転移 させた。次に、このニトロセルロースを、４℃において３％ＢＳＡと共に一夜イ ンキユベートした、次に、このプロットを、減少され且つ変成されたＴＭの６Ｅ ＧＦ領域に対して作られた第一マウス・ポリクロナール抗体調製物に、１：５０ ０希釈において３０分間晒した。
次に第二抗体、すなわち、商業的なビオチン化ヤギを、３０分間添加した。得ら れたによるセルロース・プロットを、次に、商業的供給者からのアビジン−ＨＲ Ｐ結合体及び４−クロロ−Ｔ−ナフトールにより顕色させた。
図４は、ウェスタン・プロット・ゲルを示し、ここで：とニヱ １１０μｌ　ＢＲＬビオチン化マーカー２ＴＭＬ！。（Ｃ）ＩＬＩ）ＰｋＢ　＃ ＱＧＩ７　（〜１２５ＯＡＰＣユニット）３　７Ｍ　ＬＥＯ（ＣＨＯ）　ＰｋＢ 　＋　１１８２８９１　ＬＪ　（〜１３０　ＡＰＣユニット）４Ｔ！Ｊ＋−ｉ。
（ＣＨＯ）　ＰｋＡ　＋　＃８２８９１　ＬＪ　（〜１２５　ＡＰＣユニット） ５　ＴＭ　ＬＥ、　（Ｃ１（Ｌｌ）　ＰｋＢ＋　コンドロイチナーゼＡＢＣ＃Ｑ Ｇ２１　（〜１０６ＡＰＣユニット） ６　ＴＭ　Ｌ、Ｏ（ＣＩＯ）　ＰｋＢ＋コンドロイチナーゼＡＢＣ＃ＱＧ３９　 （〜３４ＡＰＣユニット） ８　５μｍ″Ｒａｉｎｂｏｗ”　ｖ−カー、　Ａｍｅｒｓｈａｍ図４中の分子量 マーカー、　ＢＲＬビオチン化　”Ｒａｉｎｂｏｗ”９７．４　ｋＤａ　２００ 　ｋＤａ ６６、２　９７．４ ４２、７　６９．０ ３１、０　４６．０ 染料前面と共に＋２１．５　３０．０ 走る＋１４．４　２１．５１染料前面と１４、３＋　共に走る このウェスタン・プロット検定は、ＣＨＯ細胞内で発現されたＴＭＬｔ。
のすべてのサンプルがＴＭの切り詰められた形態であるようである８゜ｋＤａに おいて免疫反応性のバンドをもち、モしてＣＨＬＩ細胞内で発現されたＴＭＬＦ 、Ｏの幾つかのサンプルが８０ｋＤａバンド（レーン２）をもっことを示してい る。”レクチン−６Ｉｌ！ＧＦ″アナログ、ＴＭＬｔを含むレーン７は、十分に 供給されていない。
Ｃ，Ｋ、測定 に、を、組換え体トロンボモジュリンの単離調製物について測定した。ＴＭＬｌ 、。（ＣＩＯ）を、先に記載したようにＩＩ！！２ｔ、た。測定を、検定希釈剤 （２０＋ｏＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐ）ｌ　７．５．０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１ ，０，１％ＮａＮ５．０．５！１１ＢＳＡであって０．２５又は２．５　ｍＭ　 ＣａＣ１□のいずれかを含むもの）中で９６ウエル・プレート内で行った。この に、測定のために、トロンビン（１ｎＭ）を、７Ｍアナログ（０，５〜２５０　 ｎＭ）に添加し；反応を、プロティンＣ添加（３μＭ）により開始させた。列記 したすべての濃度は、最終濃度である。混合物を、１０−６０分間インキュベー トしく７５μｍ、２０℃）、そしてヒルジン（５７０ｎＭ）によりクエンチした 。変更された検定希釈剤中の１ｏｏμｌ／ウエルのＳ−２２６６基質（Ｋａｂｉ 　Ｖｉｔｒｕ＋＋＋）を、次に添加した（２　ｍＭ）。
図５中の２軸逆数プロツトから見ることができるが、高いＴＭ濃度に対応する、 実際の第一点は、より低いＴＭ濃度における測定値から得られた線型投影から配 置される。これは、かなり高いに、をもっ他のＴＭ酸成分テスト・サンプル中に 存在するということを示している。サンプル中に２つのクラスのトロンビン結合 種が在り、それらの両方が、活性複合体の形成を導く。低いアフィニティー形態 は、解裂した又は切り詰められた形態、例えば、非解裂ＴＭと同等にしっかりと トロンビンに結合しない７Ｍアナログに、対応するようである。
実施例８：２つの異なるアミノ末端を示す配列データＡ、Ｎ−末端配列分析 精製されたタンパク質を乾燥させ、そして配列決定した（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ、　９００Ａデータ・モジュール装備Ｍｏｄｅｌ　＃４７７又は チャート・レコーダー装備Ｍｏｄｅｌ　＃４７０Ａ）。ＰＴＨ−アミノ酸を、Ｒ Ｐ−ＨＰＬＣ（Ｂｒｏｗ−ｎｌｅｅ　ＰＴＨ−Ｃ１８カートリッジ、２．Ｉ　ｘ 　２２２ｍｍ）により１２０Ａ　ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＴＨ アナライザー上で同定した。
Ｂ、Ｎ−末端分析 ７Ｍアナログの様々な調製物を、上記のように分析した。表７中に見ることがで きるように、ＴＭＬえ。（Ｃ）ｔｏ）ビークＡからのサンプルは、異質な訃末端 を含んでいる。例えば、ＣＨＯ細胞内で発現された非修飾配列を含むプラスミド により作られたＴＭの表７中に示す３サンプルのＮ−末端分析は、存在するタン パク質の５〜１９に１１±４％）にも達する強い解裂部位配列を示した。
これに反して、ＤＸＢ−１１、すなわち、示された位置（δ３．　Ｍ３８８Ｌ。
Ｒ４５６Ｇ、　Ｈ４５７Ｑ、　５４７４Ａ、δ７）における７Ｍ突然変異を含む ｐＴＨＲ５２５プラスミドにより形質転換されたＣＨＯ細胞から単離された７Ｍ 調製物、の少なくとも１００ピコモルのＮ−末端分析は、このポリペプチドが本 質的にＮ−末端の異質性を全く含まない（最大第二配列は０．６±１．３５０ζ ０％）ということを、確かなものとした。特に、：ＨＩＧＴの天然の配列に対応 する第二アミノ末端は全く見られず、これ故に、その、又は他のいずれかの、部 位における検出可能なプロテアーゼ解裂の非存在を示している。
表７ ＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）ＰｋＡとＴ東ｔ。（Ｃ）１０）　δ３．　Ｍ３８８Ｌ、Ｒ ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、５４７４Ａ。
δ７とのサンプルの配列比較 記： ｌ）　データは、ｌサイクル当たりのアミノ酸のピコモル及びｌサイクル当たり の計算された切り取りパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ　ｃｌｉｐｐｅｄ）である。
２）信頼して定量するのが困難なアミノ酸：　Ｈｉｓ、　Ａｒｇ、　Ｓｅｒ、　 Ｔｈｒ３）　Ｃｙｓは定員されない、なぜなら、サンプルが還元され且つアルキ ル化されていないからである。
４）　Ｐｒｏは、しばしば良好に解裂されない、それ故、収率が低くなることが できる。
５）　ピコモル・データは、背景シグナルについて補正され、そして”遅れ（ｌ ａｇ）”シグナルは、先にサイクルからのものである。
Ａ）サンプル：　ＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）ＰｋＡ　８２８９１．１０／２３／９１ サイクル　Ｎ−末端＃ＩＮ−末端＃２　命数　切り取り　ＬＬ　ＡＩａ　１１０ 　Ｐｈｅ　５７　１６７　旧ｓＯ，６２Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−１１５１１ａｌｌ　９ ．５３　Ａｌａ−Ａｌａ−１２７ＧＩｙ２４　１８．９４　ＧＩｕ３０　Ｐｒｏ ４９　７９　Ｔｈｒｌｏ　１２．６５　Ｐｒｏ７２　ＡＩａ７１　１４３　Ａｓ ｐ７．１　５．０６　ＧＩｎ４１　Ｇ１ｕ２６　６７　Ｃｙｓ−７Ｐｒｏ−Ｐｒ ｏ−８６Ａｓｐ８．５　９．９Ｂ）サンプル：　ＴＭＬ−０（ＣＨＯ）ＰｋＡ　 ９１９９１；　１０／２８／９１サイクル　Ｎ−末端＃ＩＮ−末端＃２　魚肚　 切り取り　ＬＩ　Ａｌａ　２２１　Ｐｈｅ　１０８　３２９　Ｈｉｓ　８２　Ｐ ｒｏ−Ｐｒｏ−２２８＋１ｅ１３　５．７３　Ａｌａ−Ａｌａ−３２１０Ｉｙ３ ７　１１．５４　Ｇｌｕ　１２８　Ｐｒｏ　１１４　２４２　Ｔｈｒ　７５　Ｐ ｒｏ１８２　ＡＩａ１２５　３０７　Ａｓｐ４０　１３６　Ｇｉｎ　１４７　Ｇ ｌｕ　１１４　６７　Ｃｙｓ　−７Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−３２８Ａｓｐ１２６Ｃ）サ ンプル：　ＴＩＪ＋、ｚ。（ＣＨＯ）ＰｋＡ　１０２４９１〜Ａ；　ｌ／１７／ ９２１に之沙　乳」」靴ロ　リ籏Ｖ　念肚　切り取り　ＬＩ　ＡＩａ１４２　Ｐ ｈｅ６０　２０２　Ｈｉｓｏ　０２　Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−１１８１１ｅ２０　１７ ３　Ａｌａ−Ａｌａ−１６０Ｇｌｙ２０　１２．５４　Ｇｌｕ４Ｂ　Ｐｒｏ３８ 　８８　Ｔｈｒ８　９．３５　Ｐｒｏ　４８　Ａｌａ　６０　１０８　Ａｓｐ　 ４１６　Ｇ１ｎ５２　Ｇｌｕ３９　９１　Ｃｙｓ−？　Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−５８Ａ ｓｐ４２ Ｄ）サンプル：　ＴＭ、Ｅ、　（Ｃ）ｔｏ）δ３．１ｉ１３８８１．、　Ｒ４５ ６Ｇ、　Ｈ４５７Ｑ、　５４７４Ａ、δ７；　ｐＴＨＲ５２５ サイクル　Ｎ−末端　切り取り　％ Ｉ　Ｇｌｕ　８８　Ｇｉｎ　Ｏ０ ２Ｐｒｏ　１８４　ｌｉｅ　Ｑ、４　０．２３　ＧＩｎ１７１　Ｇｌｙ６　３． ５ ４　Ｐｒｏ１７２　ＴｈｒＯＯ ５Ｇｌｙ１４９　Ａｓｐｏ　０ ６　Ｇｌｙ　１４３　Ｃｙｓ　− ７５ｅｒ２８　Ａｓｐｏ　０ 実施例９：　プロテアーゼ−耐性７Ｍアナログの製造のための突然変異誘発及び オリゴヌクレオチド選択の方法プロテアーゼ−耐性ＴＭの好ましい態様をコーデ ィングしているプラスミドｐＴＨＲ５２５を、７Ｍ遺伝子の突然変異誘発により 構築した（米国特許逐次番号第０７／３４５．３７２号、ＧｅｎＢａｎｋ■、又 は表８中に示すｐＴＨＲ３２４の配列を参照のこと；　Ｉ）ＴＨＲ３２４は、ｐ ＲＣ／ＣＭＶベクター内に７Ｍ遺伝子を含んでいる）。発現の間、アミノ酸３− ４９０に対応するポリペプチドを発現する遺伝子構築物を、標準的な突然変異誘 発技術をにより調製した。
Ａ、　プロテアーゼ解裂部位の修飾 Ａｒｇｌｋ＠　／Ｈｉｓ”　−＋−＞　Ｑｌ、％６１　／に１ｎ４ｓｙ突然変異 を、プライマーとしてオリゴマーＣ０Ｄ−２２１８を使用して実施例１（Ｃ）中 に開示するように構築した。
Ｂ、　Ｏ−結合硫酸コンドロイチン結合部位の修飾Ｓｅ、　＋７４−＞　Ａｌａ １１１突然変異を、プライマーとしてオリゴマーＣ０Ｄ−１８８６を使用して実 施例１（Ｃ）中に開示するように構築した。
Ｃ，Ｎ−末端の修飾 異質シグナル配列解裂部位をもつ生来ＴＭの最初の３アミノ酸のＮ−末端欠失を 、プライマーとしてオリゴマーＣ０Ｄ−２３２１を使用して実施例１　（Ｃ）中 に開示するように構築した。この構築物は、そのシグナル配列のプロセシング後 、Ｎ−末端配列を提供することに加え、そのシグナル配列の第４グリシン（すな わち、アミノ酸−３）内にｃｔｙからＶａｌへの変更をもつ。この構築物を、ｙ ｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ用してシグナル解裂効果の予言 に基づき、調製した。
表８（続き） 表８（続き） ”　Ｃ０３Ｉ細胞内でのＤＮｆ’Ｌの発現のためのｐｌｉｃｃＭＶのＩＩＩＮＤ ３−ＮＯＴ１部位への１１ＮＦＩ、′ｒＭ逍伝了を含むｐＴＩＩＲ３２２からの １ｌｌＮＤ３−ＮＯＴＩ断片列を含む。ｐＴ）ＩＲ５１１をＣ０Ｄ２３２０によ り突然変異誘発し、７つのＣ−末表９ Ｃ−末端修飾 Ｅ（ＪＣＧＰＤＳＡＬＡＧＱＩＧＴＤＣＤＳＧＫＶＤＧＧＤＳＧＡＧＥＰＰＰＳ ＰｒＰＧＳＴＬＴＰＰＤ、　Ｃ−末端の修飾 エクソブロテアーゼー耐性Ｐｒｏ−Ｐｒｏ配列Ｃ−末端を作るために（生来のヒ ト・タンパク質に関する）ＴＭのアミノ酸４９０において終止するポリペプチド を作るためのＴＩＪＬ　！。ポリペプチドの末端の７アミノ酸のＣ−末端欠失を 、プライマーとしてオリゴマーＣ０Ｄ−２３２０を使用して実施例１　（Ｃ）中 に開示したように構築した。このＣ−末端に対する修飾の概要を、表９中に示す 。
ピ、ｐＴｌｌＲ５２５の構築の要約 以下の構築のための出発プラスミド、ｐＣＤＭ８を、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。
Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得た。それは、サイトメガロ ウィルスの即時型初期プロモーターを担持している。ｐＴＨＲ２１９を、切断し 、モしてＭｌｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を単離した。この断片を、ｐＴＨＲ２１１内に 挿入し、ｐｉ’ＨＲ２５３を得た。ｐＴｔｌＲ２５３を、ＣＯ［１２２１８によ り突然変異誘発し、Ｒ４５６Ｇ及び１１４５７　Ｑを変換し、ｐＴ）１４９１を 得た。ｐＴＨＲ４９１を切断し、Ｋｐｎ−Ｎｏｔｌ断片を単離した。この断片を 、５４７４Ａ突然変異を担持しているｐＴＨＲ４７０のＫｐｎ−Ｎｏｔ１部位内 に挿入し、ｐＴＨＲ４９６を得た。このプラスミドは、突然変１ｓ４７４Ａ　、 　Ｒ４５６Ｇ　、及び旧５７Ｑを含む。ｐＴＨＲ４９６を切断し、そしてＭｌｕ ［−ＮｏＬＩ断片を単離した。この断片を、ｐＴ）ＩＩ？２３５のＭｌｕｌ−Ｎ ｏｔ１部位内に挿入し、ｐＴＨＲ５１１を得た。このプラスミドは、突然変異５ ４７４Ａ　、　Ｉ？４５６Ｇ　、及びＨ４５７Ｑ及びＮｏｔ１部位からの上流Ｔ Ｍ配ρＴ朋４９１ 端アミノ酸を除去し、ｐＴ１１Ｒ５１４を得た。ｐＴＨＲ５１４を切断し、そお してＭｌｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を単離した。この断片をｐＴＨＲ５１８内に挿入し 、ｐＴＨＲ５２４を得た。ｐＴＨＲ５１８をｐＴＩ（Ｒ５１５からのＣ１ａｌ− Ｓｍａ＋断片をｐＴ）ＩＲ５１２内に挿入することにより構築した。ｐＴＨＲ５ ２４を切断し、モしてＸｂａｌＡＡ（ＪＣｍｌａｆＣＴｌ：ＣＴＩＪτＡＣＣｉ ＣｅＴＡ丁τＴＴＴＡＴＡ１．ｅＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＣ＾ＴＡＡＴ＾＾ＴＧＧ ＴＴＴＣ丁s＾ａ＾ｃｃｒｃ ｐＴ１１Ｒ２３５ 露口ａｍｏｆｐＴＮ貯１１ｃｏｎｊａｌｎｇｌｎｇｔｈｅＦｌｏｒｌＩｎｔｈｅ ｏｐｐｏｓｌ！ａｏｒｌｅｎｔａｔｌｅｒ＋ａｓｐＴＨ１２{９゜ ｔｐＴＨＲ２１９と反対の方向にあるＦｌｏｒｉを含むｐＴＨＲ２１１のＭＬＵ Ｉ−ＮＯＴ１部位への６ＥＧＦｓ−０結合を含むｐＴｌ−ＩＲ２１９からのＭＬ ＵＩ−ＮＯＴＩ断片。この新たなプラスミドは、０結合及び６ＦＧＦｓ領域のイ ンビトロにおける突然変異誘発のためのものである。
零ＭＰＳＶプロモーター＋　ＣＭＶエンハンサ−を使用してＤＮＦＬを発現し、 そしてＳＶ４０後期ブローターからの発現されたＤＨＰＲ遺伝子をもつ哺乳類発 現プラスミドを作るためにｐＢＢＳ３７のＸＢＡＩ−３ＡＬ１部位へのＤＮＦＬ 遺伝子を含むｐＴＩＩＲ４８３からのＸＢＡＩ−３ＡＬＩ断片。このプラスミド は、また、ハイグロマイシンＢ遺伝子を含む。
様ＴＨＲ５１２のＣＬＡＩ−５ＭＡＩ（部分的）へのＤＮＦＬのＮ末端の３ａａ 欠失を含むｐＴＨＲ５１５からのＣＬＡＩ−５ＭＡＩ断片。
ＣＣＣ（５１丁””５ 零Ｃ０Ｄ２３２１を、レクチン・ドメインの最初の３コドンを欠失させ、そして ｐＴＨＲ３５６内のインビトロにおける突然変異誘発によりそのシュグナルの第 ４グリシンをバリンに変換するために使用した。また、Ｃ０Ｄ１６９０を、ＡＭ Ｐ感受性をＡＭＰ耐性に変換するために使用した。これは、ＰＳＴ１部位を創出 した。
ｐＴ鵠３５６ ｔｐｓＥＬＥｃＴ＋の旧ＮＤ３−３ＭＡＩへのトロンボモジュリンのシグナル配 列を含むＩ）ＴＨＲ３２２の旧ＮＤ３−３１．ｌＡｌ断片。このプラスミドは、 ＴＭシグナル解裂部位の突然変異誘発のために使用されるであろう。
本インビトロにおける突然変異誘発のために使用されることができる大腸菌（Ｅ 、ｃｏｌｉ）発現ベクターを作るためにｐＴＨＲ１６１のＭＬＵＩ−ＮＯＴ１部 位への６ＥＧＦｓ内のＭｅｔ３８８−＞Ｌｅｕ突然変異を含むｐＴＨＲ１２７か らのＭＬＵＩ−ＮＯＴＩ断片。
ｔｐＧＥＭ９Ｚｆ−＋７）ＮＯＴＩ−ＸＢＡ１部位内ヘノＤＮＦし遺伝子を含む ｐＴＨＲ４９ＢからのＮ０ＴＩ−ＸＢＡＩ断片。このプラスミドは、特許の７Ｍ 生産プラスミドの構築のための戦略においてＡ”と名付けられる。
ネｐＴＨＲ１６１の５ＣＡＩ−３ＣＡＩ部位内へのｆ１複製起点を含むｐＧＥＭ ３ｚ４−からの５ＣＡＩ−３ＣＡＩ断片。これは、ｐＴＨＲ１６１と反対のスト ランドを使用する新たな突然変異誘発ベクターである。
ｐＴＩｌｔ５１５ ＄Ｃ０Ｄ２３２１を、レクチン・ドメインの最初の３コドンを欠失させ、そして ｐＴＨＲ３５６内のインビトロにおける突然変異誘発によりそのシュグナルの第 ４グリシンをバリンに変換するために使用した。これは、ｓＴｕ　ｉを創出した 。また、Ｃ０ＤＩ６９０を、ＡＭＰ感受性をＡＭＰ耐性に変換するために使用し た。これは、ＰＳＴ１部位を創出した。
ｐＴ順４７′。
零ＳＶ４０初期ブローターからのＤＮＦＬ遺伝子及びＳＶ４０後期プロモーター からのＤＨＰＲ遺伝子を発現する発現プラスミドを作るためのｐＴＨＲ３５９の 旧ＮＤ３部位内へのＳＶ４０プロモーターを含むｐＴ）ｌＲ３５９からの旧ＮＤ ３゜注意：ＳＶ４０後期プロモーターは、幾つかの位置から転写を開始させる。
主要な転写開始領域は、このプラスミド内に含まれていない。
さらに注意：この後期プロモーターとＤＨＦＲのＡＴＧとの間に３つのＡＴＧが 在り、これがＤ）ＩＦＲの発現を妨害することができる。そのような発現は、非 常に弱＜　ＤＨＰＲ遺伝子を発現することができない。
ρ■龍５２５ ｔｐＴ！＋Ｒ４９８のＸＢＡＩ−ＮＯＴ１部位内への、ＤＮＦＬの、Ｎ−末端加 え第４ａａ　Ｇｌｙ−Ｖａｌの３ａａ欠失、Ｃ−末端の７ａａ欠失、５４７４Ａ 突然変異、及びＲ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ突然変異を、含むｐＴＨＲ５２４からの ＸＢＡＩ−ＮＯＴＩ断片。
５ｌｔｅ富ｏｆ　ｐＴＮＲ５＋８゜ ｔｐＴ１１Ｒ５＋８のＭＬＵＩ−ＮＯ７１部位内への、ＤＮＦＬの〇−結合領域 の末端における７ａａ欠失、５４７４Ａ　、　Ｒ４５６Ｇ及び旧５７Ｑ突然変異 を、含むｐＴＨＲ５１４からのＭＬＵ−ＮＯＴＩ断片。
ｐＴｌｌ１１５１４ ｔｃＯＤ２３２０を、ｐＴｌ（Ｒ５１１のインビトロにおける突然変異誘発によ りＴＭの〇−結合ドメインのＣ−末端からの７アミノ酸を欠失するために使用し た。これは、ＡＣＣＩ部位を創出した。また、ＣＯＤ　１６８９を、ＡＭＰ感受 性をＡＭＰ耐性に変換するために使用した、これは、ＰＳＴ１部位を創出した。
ネｐＴＨＲ２３５のＭＬＵＩ−ＮＯＴ１部位内への、ＤＮＦＬ遺伝子５４７４Ａ 　５Ｒ４５６Ｇ及びＨ４５７Ｑ突然変異を、含むｐＴＨＲ４９６からのＭＬＵＩ −ＮＯＴＩ断片。
ｐＴ）ＩＲ５２５配列 ｐＴ）ＩＲ５２５配列Ａ 表１１は、プラスミドを突然変異させるために使用した様々なプライマーの配列 を示す。
表１１ オリゴマー合成要求形ｆ３　Ｃ０Ｄ−２３２１オリゴマーサイズ＝４８　プロジ ェクト：Ｔλ１ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＣＣＣαｉｃ　ＴＯＣＧＧＣＴＣＯα℃ＭＧ＾ ＣＣＡωＣσＧＣＣＡＧＧ　ＧＣＣＡＧＣ注意：ＳＴυ１による検出 Ｃｏｄｅの意味 オリゴマー合成要求形＠　Ｃ０Ｄ−２３２０オリゴマーサイズ：５１　プロジェ クト：１Ｍ５”　＞　３’ ３　６　９　１２　１５　ｉｌｌ　２１　２４　２７　３０　３３　３６　３９ 　４２　４５　４８ＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ　ＣＴＣＴＡＣＣｒＴＧＡＣＴＣ ＣＴＣＣＯＴＧ　ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＯＡＴＣＣＣＣ注意：　ＡＣＣＩによ る検出 Ｃｏｄｅの意味 オリゴマー合成要求形態　ＣＯＤ、、２３１８５’、□　−−−−−−＞３’ ３　（、９１２１５１８２１２４２７３０３３３５ＧＡＣＴＣＧ　ＧＣＣＣＴｒ 　ＧＣＴ　ＧＧＣＣＡＧ　ＡＴｒ　ＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣｏｄｅの意味 オリゴマー合成要求形態　ＣＯＤ−２３１８（ＣＨＯ）Ｍ＋　＊　＋　Ｉ−から の切り取りの分離及び精製Ａ、　材料及び方法 切り取られた（ｃｌｉｐｐｅｄ）可溶性ヒトＴＭ出発材料は、ＣＨＯ細胞、口ｙ 　ト＃ｌ０２４９１Ａ内で作られたＴＭＬ！。　ピークＡであった。Ｎ−末端配 列分析に基つき、このロットは、ＩＯＸの２本鎖形態及び９０％の一本鎖形態を 含む。固定化された脱水素トリプシン・カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆ− ｏｒｄ、ＩＬ）を、非切り取りＴＭ１１゜から切り取り物を分離するために使用 した。脱水素トリプシン（ａｎｈｙｄｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）は、その活性部位セ リン残基１９５が脱水素アラニン残基に変換されているトリプシンの触媒として 不活性の誘導体である。弱い酸性条件下で、このカラムは、Ｃ−末端のＡｒｇ　 、　Ｌｙｓ又はＳ−アミノエチル−Ｃｙｓ残基をもつペプチドに結合する。Ｋｕ ＋ｎａｚａｋｉ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　１０３−２９７を参照のこと。
無傷のＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ）１１１１１１　Ｌは、Ｃ−末端Ｓｅｒを含む。Ａｒ ｇ　＋ｓｓにおけるタンパク質分解解裂は、Ａｒｇ内で終止する第二のＣ−末端 を生成する。このジペプチドは、ジスルフィド結合により一緒に共有結合してい る。このカラムは、出発材料中に存在する２本鎖の切り取られたＴＭＬＥＯ（Ｃ ＨＯ）Ｍ３ｓ＊　Ｌに結合し、−末鎖の無傷のＴＭｉ、ｉｏ（ＣＨＯ）Ｍ−ｓａ Ｌが流出するのを可能にする。
約１．２９ｍ１の、０．８７ｍｇ／ｍ１（４５９，０００Ｕ／ａ＋１；　５８８ ，０００　Ｕ全体、　１００％）の出発材料は、脱水素トリプシン結合バッファ ー（０，０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０であって２０ｍＭ塩化カルシウム及 び０．０５！％アジ化ナトリウムを含むもの）を使用して１５ｍ１に希釈され、 そしてシリンジ・ポンプを使用して０．３ｍｌ／分においてそのカラム上に供給 された。供給の間、流出液は回収され、そして無傷のＴＭ、Ｅ、　（ＣＨＯ）Ｍ 、ｓａ　Ｌを含み、一方、切り取られたＴＭＬ、：Ｏ（ＣＨＯ）ＭＳＩＳ　Ｌは 、そのカラムに結合した。次に、このカラムを、２０容量の結合バッファーによ り洗浄し、そして切り取られたＴＩＪＬＥＯ（ＣＨＯ）Ｍｓｓｓ　Ｌを、脱水素 トリプシン溶出バッファー（０，１Ｍ　蟻酸、ｐＨ２，５）を使用して溶出させ た。２１両分（１分間、約３００μｌ）を回収し、そしてＡＰＣ検定のために１ ／１０００に希釈した。活性のピークは、５−１１画分内にあった。プールされ た画分は、２．１ｍｌを含んで成り、そして４５．７７１　Ｕ／ｍ１（９６，０ ００Ｕ全体、１６％）を含んでいた。出発材料、流出物及びプールした溶出物の アリコットを、分析のために０．２％　ＮＥＭ、ｐＨ７，５内に脱塩した。
ヒト・トロンボモジュリンへの可溶性ＴＭ結合についてのに、を、マイクロタイ ター・プレート内で測定した。可溶性７Ｍサンプルを希釈しく全ての希釈物は、 ＡＰＣ検定希釈物中のものである）、約３ｎＭの実行溶液とし；ヒト・トロンボ モジュリンを、ストック溶液から６００．３００．１５０．７５．３７．５．１ ８．８．９．４．４．７．２．３．１．２．０．６及びＯｎＭの実行溶液に希釈 した。実行溶液の追加の試薬は：ヒト・プロティンＣ，１，５μＭ：ヒルジン、 　１６０　Ｕ／ｍｌ；及びＳ−２２６６基質１ｍＭであった。それぞれのトロン ビン希釈物の４連の２５μｌサンプルを、マイクロタイター・プレートの１７２ カラムに添加し；２５μｍアリコツトの可溶性ＴＭを、４テスト列の３つに添加 し、そして２５μＩＡＰＣ検定希釈物を、１テスト列においてＴＭと置換した。
このプレートを穏やかに叩くことにより混合し、プレート・シーラーによりシー ルし、そして室温において５分間インキュベートした。２５μｌのプロティンＣ を、それぞれのウェルに添加し、そのプレートを叩き混合し、シールし、そして 室温において１５分間インキュベートし：次に２５μＩのヒルジンを、それぞれ のウェルに添加し、そしてそのプレートを叩き混合した。１００μｍのＳ−２２ ６６をそれぞれのウェルに添加し、そのプレートを叩いて混合し、そしてＳｏｆ ｔＭａｘ分析及び制御ソフトウェア−・プログラムを使用してＭｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ　（Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃ Ａ）内で１５分間、動力学的に読んだ。Ｓ−２２６６加水分解の線型速度を、適 当な背景速度を差し引いた後に形成される活性化プロティンＣの尺度として使用 し。このデータは、ＩＢＭ　ＰＣ上でプログラムＥｎｚｏｆｉｔｔｅｒ、　Ｒｏ ｂｉｎ　Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−ＢｉｏＳｏｆｔ、 　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　［ＪＫを使用してに、を与えるのにふされしいもので あった。
Ｂ、　結果 以下の分析を、上記出発材料、流出物及びプール上で、行った：１）還元条件下 テ（７）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ（図６及び７）、２）　ＡＰＣ検定（３連ニオケる ２希釈物）　、３）　２連におけるアミノ酸分析、４）　Ｎ＝末端アミノ酸分析 、及び５）ヒトα−トロンビンについてのに、の測定（結果ヲ表１２及び１３中 に示す。）。
封 切す取うレタＴＭＬＥ０（ＣＨｏ）Ｍ３８８Ｌと無傷（７）　ＴＭＬ、。（ＣＨ Ｏ）Ｍ３８８Ｌとの比較ピコモル（全体の％） １　）　Ｈ［ＧＴＤＣＤＳＧＫ、、、　３　（８％）　ｎｄ’　１８６　（５３ ％）（切り取り部位） ２　）　ＦＰＡＰＡＥＰＱＰＧ、、、１４　（３６％）　３０（３２％）　４０ （１１％）（Ｎ−末端＃ｌ） ３　）　ＡＰＡＥＰＱＰＧＧＳ、、、２２　（５６％）　６５（６８％）　１２ ７　（３６％）（Ｎ−末端＃２） これらの結果は、ＴＩＩＩＬＥＯ（ＣＨＤ）Ｍ３８８Ｌがアフィニティー・クロ マトグラフィー精製段階によりＲｔｓｅの後に切り取られた形態及び無傷形態に 、きれいに分離されることができるとうことを、示している。
切り取られたＴＭＬＥＯ（Ｃｔ（Ｏ）Ｍ３８８Ｌは、無傷のＴＭＬＥＯ（ＣＨＯ ）Ｍ３８８Ｌの比活性の６３±１５Ｘをもつことが示された。この２つの形態は 、プロティンＣの活性化がヒト・トロンビンの増加する濃度において測定される ような検定において比較され、そして切り取られたＴＭＬＥ。（ＣＨＯ）Ｍ３８ ８Ｌが無傷のＴＭＬ、。（ＣＨＯ）Ｍ３８８Ｌよりも２倍程弱く結合するという ことが、測定された。
先の実施例は、先の実施例において使用されたものの代わりに本発明の一般的に 又は特別に記載された反応体及び／又は操作条件に置き換えることにより、同様 に首尾よく繰り返されることができる。
これまでの記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を突き止めることができ 、そしてその核心及び範囲から外れることなく、本発明の様々な変更及び修正を 行い、それを他の用途及び条件に適合させることができる。
ＦＩＧ、　１ ＩＩ　ＩＩ　ＩＩ　ＩＩ ＦＩＧ、３ ｋＤａ　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０ｋＤａ　１　２　３４５６ 　７８　ｋＤａＩＧ　６ −染料最前 ３（石慣Ｂｇ目七〇Ｔ誓晶 フロントページの続き

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. １．トロンボモジュリン・タンパク質・アナログであって、プロテアーゼ解裂部 位のアミノ酸配列が修飾され、それにより、そのアナログがその部位におけるプ ロテアーゼ解裂に耐性であるような、アナログ。
  2. ２．タンパク質の非修飾プロテアーゼ解裂部位のアミノ酸配列が天然のトロンボ モジュリンのＡｒｇ４５６とＨｉｓ４５７との間にある、請求項１に記載のトロ ンボモジュリン・アナログ。
  3. ３．プロテアーゼ解裂部位のアミノ酸配列がＧｌｙ４５６−Ｇｌｎ４５７に修飾 されている、請求項２に記載のトロンボモジュリン・アナログ。
  4. ４．Ｎ−末端のアミノ酸配列が修飾され、それにより、そのアナログが単一のＮ −末端をもつような、トロンボモジュリン・タンパク質・アナログ。
  5. ５．Ｎ−末端アミノ酸が天然のトロンボモジュリンのＧｌｕ４である、請求項４ に記載のトロンボモジュリン。
  6. ６．Ｃ−末端のアミノ酸配列が修飾され、それにより、そのアナログが単一のＣ −末端をもつような、トロンボモジュリン・タンパク質・アナログ。
  7. ７．Ｃ−末端アミノ酸が天然のトロンボモジュリンの−Ｐｒｏ４００−Ｐｒｏ４ ００である、請求項６に記載のトロンボモジュリン。
  8. ８．一本鎖トロンボモジュリン・ポリペプチドと二本鎖トロンボモジュリン・ポ リペプチドとの混合物を含んで成るトロンボモジュリンの活性を増強する方法で あって、二本鎖トロンボモジュリンをそこから除去することを含んで成る方法。
  9. ９．トロンボモジュリンの活性を増強する方法であって、一本鎖トロンボモジュ リンの解裂を防ぐことを含んで成る方法。
  10. １０．請求項１に記載のトロンボモジュリン・アナログをコーディングしている ＤＮＡ配列。
  11. １１．請求項４に記載のトロンボモジュリン・アナログをコーディングしている ＤＮＡ配列。
  12. １２．請求項６に記載のトロンボモジュリン・アナログをコーディングしている ＤＭ配列。
  13. １３．好適な宿主内で発現されることができるプロモーター配列に作用可能な状 態で結合されている、請求項１０に記載のＤＮＡ配列を含んで成るベクター。
  14. １４．好適な宿主内で発現されることができるプロモーター配列に作用可能な状 態で結合されている、請求項１１に記載のＤＮＡ配列を含んで成るベクター。
  15. １５．好適な宿主内で発現されることができるプロモーター配列に作用可能な状 態で結合されている、請求項１２に記載のＤＮＡ配列を含んで成るベクター。
  16. １６．ＣＨＯ細胞内で発現されることができる、請求項１３に記載のベクター。
  17. １７．ＣＨＯ細胞内で発現されることができる、請求項１４に記載のベクター。
  18. １８．ＣＨＯ細胞内で発現されることができる、請求項１５に記載のベクター。
  19. １９．請求項１に記載のトロンボモジュリン・アナログの有効量及び医薬として 許容される賦形剤を含んで成る医薬組成物。
  20. ２０．請求項１に記載のトロンボモジュリン・アナログの有効量を投与すること を含んで成る、血栓疾患の治療方法。
  21. ２１．そのポリペプチドを解裂させることができるプロテアーゼを生産する細胞 内で一本鎖ポリペプチドを発現させる方法であって：ａ）その発現生成物中の解 製したポリペプチドの存在を検出し；ｂ）アミノ酸配列分析によりその解裂部位 を決定し；ｃ）その解裂部位においてそのポリペプチドをコードしている遺伝子 のヌクレオチド配列を修飾し、それにより、このようにして生産されたポリペプ チドがその部位においてプロテアーゼ解裂に耐性であり、そして生物学的活性を 維持するようにし；ｄ）そのプロテアーゼを生産する細胞内で修飾された遺伝子 を発現させ；そして ｅ）このようにして生産された一本鎖ポリペプチドを単離する、を含んで成る方 法。
  22. ２２．解製したポリペプチドが生物学的活性を欠いており、及び／又は非解裂ポ リペプチドの競合的阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
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