JPH06503950A - 血栓症に作用する組換え薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、タンパク質過水分解反応によってＸａｉ因子に変換可能な一本鎖前駆物質 ポリベブチドの生成方法であって、該一本鎖前駆物質ポリペプチドをコードする ＤＮＡを発現させるのに好ましい条件下で請求項１３に記載の細胞を培養し、そ して 産生された該前駆物質ポリペプチドまたはそのタンノ〈り質分解生成物を回収す ることを包含する、方法。 １５、動物被検体における血栓症を予防または治療するのに用いる製薬組成物で あって、血栓症を緩和するかまた（ま予防するのに有効な量の請求項１に記載の Ｘａｉ図子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成 物。 １６、動物被検体における炎症を予防または治療するの（ご用いる製薬組成物で あって、炎症を緩和するかまたは予防するのに有効な量の請求項１に記載のＸａ ｉ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成物。 １７、動物被検体における再狭窄を予防または治療するのに用いる製薬組成物で あって、再狭窄を緩和する力）また（ｉ予防するのに有効な量の請求項１に記載 のＸａｉ因子を、製薬的（こ受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬 組成物０１８、動物被検体における移植手術時の合併症の予防または治療に用い る製薬組成物であって、移植手術時の合併症を緩和するかまたは予防するのに有 効な量の請求項１に記載のＸａｉ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した 状態で含有する、製薬組成物。 １９、血栓症を治療するのに有用なＸａｉ因子の調製方法であって、 請求項４に記載の前駆物質ポリペプチドを、該前駆物質を開裂するのに有効な量 のプロテアーゼと接触させ、そして生成したＸａｉ因子を回収することを含有す る、方法。 ２０、前記プロテアーゼが、ラノセルクサリヘビ毒の抽出物中に含有されている 、請求項１９に記載の方法。 ２１．請求項１９に記載の方法で製造されるＸａｉ因子。 ２２、血清中での半減期を延長するように改変されたＸａ因子であって、該改変 された型のｘ３因子が血清の存在下で活性Ｘａ因子を生成する、Ｘａ因子。 ２３、前記改変されたＸａ因子がアシル化Ｘａ因子である、請求項２２記載の改 変されたＸａ因子。 ２４、血友病の治療に用いる製薬組成物であって、請求項２２に記載の改変され たＸａｔＪ子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組 成物。 ２５、動物被検体における血栓症を予防または治療する方法であって、そのよう な治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の 有効量を投与することを包含する、方法。 ２６、動物被検体における炎症を予防または治療する方法であって、そのような 治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の有 効量を投与することを包含する、方法。 ２７、動＊被検体における再狭窄を予防または治療する方法であって、そのよう な治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の 有効量を投与することを包含する、方法。 ２８、動物被検体における移植手術時の合併症を予防または治療する方法であっ て、そのような治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその 製薬組成物の有効量を投与することを包含する、方法。 ２９、ヒト被検体の血友病を治療する方法であって、そのような治療を要する被 検体に、該被検体における血友病の作用を相殺するのに有効な量の、改変されて 血清中での半減期を延長されたＸａ因子を投与することを包含する、方法。 明細書 に　る　− 技ＪＬＬ野 本発明は、血栓症の予防もしくは治療に用いるペプチド医療に関する。さらに詳 しくは、本発明は、プロテアーゼ活性が欠除し、かつプロトロンビンをトロンビ ンに変換する内在的Ｘａ因子の性能を阻害するＸａ因子類似体に関する。さらに 本発明は、血友病の治療に眉いる、安定した形態のＸａ因子を提供するものであ る。 良未旦茨亘 トロンビンは、いくつもの重要な生物学的プロセスを調節する多機能プロテアー ゼである。例えばトロンビンは、公知の血小板賦活剤の中で最も有力なものであ る。その上にトロンビンは、フィブリノーゲンを開裂してフィブリンにして、血 餅の形成を開始するのに必須のものである。上記の２つの成分は、通常の止血に 関与しているが、アテローム性動脈硬化症の動脈内では、血栓の形成を開始する ことがある。この血栓は、心筋梗ｌＩ症、不安定狭心症、血管形成術または血栓 崩壊の治療を行った後の冠状動脈の非出血性発作と再閉塞のような血管閉塞症状 の病因の主要因子である。またトロンビンは、平滑細胞増殖の有力な誘導物質で もあり、それ故、血管形成術後の再狭窄および移植誘発アテローム性動脈硬化症 のような各種の増殖反応に関与している。さらにトロンビンはリンパ球に対して 走化性なので炎症において役割を果している（　Ｈｏｏｖｅｒ、　Ｒ，Ｊ、ら、 Ｃｅ１ｌ　（１９７８）　１４：４２３；　Ｅｔｉｎｇｉｎ、　Ｏ，Ｒ１ら、Ｃ ｅ１ｌ　（１９９０）虹：６５７゜）これらの観察結果は、トロンビン形成の阻 害またはトロンビン自体の阻害を行うと血栓症の予防または治療に有効であり、 再狭窄を制限し、炎症を抑制することを示してる。 トロンビンは、その前駆動物貰のプロトロンビンが、２７Ｌ−２７２位のＡｒｇ −Ｔｈｒ結合部と３２０−３２１位のＡｒｇ−１１ｅ結合部でタンパク質分解開 裂された結果生成する。この活性化は、プロトロンビナーゼ複合体で触媒され、 この複合体は、血小板、単球および内皮細胞の膜表面で揖築される。この複合体 はＸａ因子（セリンプロテアーゼ）、Ｖａ因子（補因子）、カルシウムイオンお よび酸性リン脂質表面で構成されている。Ｘａ因子は、その前駆物質ＸＩＮ子の 活性化された形態であり、このＸ因子は、肝臓により５８ｋｄの前駆物質として 分泌され、外因性および内因性の血液凝固経路の両方で、活性化型のＸａ因子に 変換される。Ｘ因子と、Ｖａｌｌｆｆｉ子の前駆物質であるＶ因子の循環レベル は、１０−７Ｍのオーダーであることが知られている。対応する活性因子Ｖａと Ｘａのレベルはまだ測定されていない。 ヒトのＸ因子とＸａ因子の完全アミノ酸配列が知られている。 図１は、Ｃｏ１ｅｒａａｎ、Ｒ，Ｗ、ら編集、Ｆｌｅｍｏｓｔａｓｉユａｎｄ　 Ｔｈｒｏｍｂｏｓ’ｓ第２版（１９８７）　ｐ、　２５０にＤａｖｉｅ、　Ｅ、 Ｗ、が記載した前駆物質型（７）Ｘ因子の完全配列を示す。Ｘ因子は、カルシウ ムイオン結合性で、γ−カルボキシグルタミル（Ｇｌａ）を含有し、ビタミンに 依存性の血液凝固性糖タンパク質ファミリーのメンバーであす、コノファミリー には、ｖ１１因子、ＩＸ因子、プロトロンビン、プロティンＣおよびプロティン Ｓ　（Ｆｕｒｉｅ、Ｂ、ら、Ｃｅ１ｌ　（１９８８）且：５０５）も含まれてい る。 図１に示すように、成熟Ｘ因子タンパク質は４ｏ残基のブレープロリーダー配列 が先行しており、この配列は細胞内でのプロセシングおよび分泌中に除去される 。Ｘａ因子の前駆物質の成熟Ｘ因子は、次いで、軽鎖のＣ末端および活性化ペプ チド／重鎖のＮ末端の間に示されている３つのアミノ酸ＩＩ？の欠失によって開 裂されて二本鎖型になる。最終的に、この二本鎖Ｘ因子は、図の上部右側の部分 に示す「活性化ペプチド」　（１〜５２と番号を付けである）が欠失してＸａ因 子に変換され、残基１〜１３９として示す軽鎖と残基１〜２５４として示す重鎮 を生成する。これらは、軽鎖の１２８位と重鎮の１０８位との間の単一のジスル フィド結合を介して連結されている。さらに図に示すように、軽鎖はＧｌａｌミ ドメイン殖因子ドメインを含有し、一方、プロテアーゼ活性部分が重鎮内にあり 、４２位にヒスチジン、８８位にアスパラギン酸、および１８５位にセリンがあ り、図中丸印を付けである。 二本鎖Ｘ因子のインビボでの活性化については２つの公知の経路がある。活性化 は、プロテアーゼがプロトロンビナーゼ複合体に組み込まれる前に起こらなけれ ばならない（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、Ｍ、ら、Ｈｅｍｏｓｔａｓ’ｓ　ａｎｄ　Ｔ ｈ　ｏｍｂｏｓｉｓ、Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｒ，Ｉｆ、ら編、（１９８７）　Ｊ、Ｂ 、　Ｌｆｐｐｅｎｃｏ仁ｔ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｆａ、　ＦＡ、ｐ、Ｉｆ２ に記載）。内因性経路において、Ｘ因子は、ＩＸａ因子、Ｖｌｌ＋因子およびカ ルシウムイオンからなり細胞表面上に構築された「テナーゼＪ　（ｔｅｎａｓｅ ）複合体によって開裂されて５２アミノ酸の活性化ペプチドを放出する。外因性 経路では、この開裂は、膜上の組織因子に結合されたＶｌ　ｌａ因子で触媒され る。しかし、ここで興味深いことは、ラッセルクサリヘビ毒に含有されているよ うなプロテアーゼを用いて、インビトロで開裂することによってＸ因子をＸａ因 子に変換する能力である。このプロテアーゼは、ＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ，Ｇ、 ら、Ｌｚｊ匝旺ｕ（１９７７）　ｉ：５２５３に記載されている。 本発明の薬剤のいくつかでは、過度の凝結を防止するために、Ｘａ因子が機能す るのを阻害することが望ましい。しかし血友病患者の場合、逆の問題があるが、 この問題は正常な個体内で起こる活性化プロセスと無関係にＸａ因子の起源を提 供することによって援助されるであろう。血友病の通常の形態の両方は、活性化 の内因性経路にのみ欠陥を伴うが、外因性経路の作用は出血を止めるのに成功し ていないようである。 最も普通の形態の血友病は、Ｖｌｌ＋因子の機能の欠乏を示す血友病ＡとＩＸ因 子（クリスマス因子としても知られている）の機能の欠乏を示す血友病Ｂである 。これらの形態の血友病は、Ｌｅｖｉｎｅ、Ｐ、Ｈ，、−Ｐｌａｓｍａ　Ｃｏａ ｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ−（１９）、編、　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　 Ｃｏ、。 １）、　９７−１１０に記載されている。これらの因子のどちらかが欠乏すると Ｘａ因子の供給が不充分になるので、Ｘａ因子を与えることは両方の血友病の治 療に有効のはずである。さらに、Ｘ因子自体では活性のＸａ因子を与えることが できないといういくつかの例が見出されている。この比較的まれな種類の先天的 疾患は、例えばＲａｄｄｙ、　Ｓ、Ｂ、ら、Ｂｌｏｏｄ　（１９８９）　７４： １４８６−１４９０；Ｗａｔｚｋｅ、Ｈ，Ｈ，ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｉ＋　 （１９９０＞　２８５＋１１９８２−１１９８９：Ｂａ５ｓａｎ、Ｈ，Ｊ、ら、 Ｂｌｏｏｄ　（１９８８）　７１：１３５３−１３５６：Ｆａｉｒ、Ｄ、Ｓ、ら 、吋ｏｏｄ、（１９８９）７３：２１０８−２１１６；　およびＢｅｒｎａｒｄ ｉ、　Ｆ、ら−、Ｂｌｏｏｄ　（１９８９）　７３：２１２３−２１２７に記載 されている。 Ｘａ因子は、血清中での半減期が極めて短くて約３０秒に過ぎないので、従来、 医薬として有用ではなかった。以下に説明する本発明では、この薬剤の血清中で の半減期が除放性アシル化型を提供することによって延長され、このアシル化型 では、活性部位のセリンに結合されたアシル基がクリアランスを阻害し、ごくゆ っくりと加水分解されてＸａ因子の活性型を生成する。 血液凝固因子の半減期を延長するためにアシル化反応を用いることは開示されて いる。例えばＣａ５ｓｅｌｓ、　Ｒ，ら、Ｌｌ泣鵠Ｊ　（１９８７）　２４７： ３５９−４００では、種々のアシル化剤がウロキナーゼ、ｔＰＡおよびストレプ トキナーゼーブラスミ／−ゲン活性化因子複合体とに結合したままで残り、その 半減期の期間が、アシル化基の種類と因子の種類によるが４０分間から１０００ 分間を超える範囲にあることを見出した。ｔＰＡもしくはストレプトキナーゼの アシル化はまた、米国特許第４．３３７．２４４号に記載されている。血清中で の安定性を高める目的で、置換ベンゾイル基を活性部位に一時的に導入するため 、アルギニン類似体として機能するアミジノフェニル基を使用することは、Ｆｅ ａｒｓ、Ｒ，ら、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈ ｅｍｅｏｓｔａｓｉｓ　（１９８９）■・１２９−１３９で考察されている。こ のより全般的な概説は、Ｆｅａｒｓ、　Ｒ，らのト旦■（１９８７）　３３：　 ５ｕｐｐ、３５？−６３での短い報告に続いて行われたものである。５ｔｕｒｚ ｅｂｅｃｈｅｒ、　Ｊ、らも、ｔＰＡの安定化されたアシル誘導体を、Ｔｈｒｏ ｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ　（１９８７）　４７：６９９−７０３に報告した。アシ ル化されたプラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ ）の使用に関する別の報告が、Ｃｒａｂｂｅ、Ｓ、Ｊ、ら、Ｐｈａｍａｃｏ−ｔ ｈｅｒａ　（１９９０）　１０：１１５−１２６によって刊行された。 Ｘａ因子自体の機能に戻ると、プロトロンビンをトロンビンに変換するＸａ因子 の活性は、プロトロンビナーゼ複合体内にこの因子が包含されていることに依存 している。プロトロンビナーゼ複合体（プロトロンビンのトロンビンへの変換が 、可溶型のＸａ因子よりも２７Ｂ、０００倍速い）の生成が研究されている（Ｎ ｅｓｈｅｉｍ、　Ｈ，Ｅ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩｌｌ（１９７９）　２５ ４：１０９５２）。これらの研究は、活性部位特異的阻害剤であるダンシルグル タミルグリンルアルギニル（ＤＥＧＲ）クロロメチルケトンを利用しており、こ の阻害剤は、蛍光リポータ−基をＸａＥｆｆｉ子に共宵結合させる。この阻害剤 で処理されたＸａ因子はプロテアーゼ活性を欠いているが、化学量論的にＸａ因 子と同様にプロトロンビナーゼ複合体に組み込まれ、解離定数は２．７　Ｘ　１ ０−６Ｍである（Ｎｅｓｈｅｉｍ、Ｍ、Ｅ、、Ｊ　Ｂｏｉｌ　Ｃｈｅｗ　（１９ ８１）　２５６：６５３７−６５４０；Ｓｋｏｇｅｎ、Ｗ、Ｆ　ら、Ｊ　Ｂｉｏ ｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８４）　２５６：２３０６−２３１０：Ｋｒｉｓｈｎａｓ ｖａｍｙ、Ｓ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩａ（１９８８）　２６３：３８２３ −３８２４；Ｈｕｓｔｅｎ、Ｅ、Ｊ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８７ ）　２６２：１２９５３−１２９６１）。 プロトロンビナーゼ複合体の形成を阻害する公知の方法には、ヘパリンおよびヘ パリン様化合物によって処理する方法力する。この方法は、ヘパリンとともにア ンチトロンビンＩＩＩを用いて該複合体の生成をを阻害する方法である。Ｘａ因 子阻害の他の新規な形態としては、リポタンパク質結合凝固阻害剤（ＬＡＣＩ） 　（Ｇｉｒａｒｄ、Ｔ、　Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）　３３８：５１ ８；Ｇｉｒａｒｄ。 Ｔ、　Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２４８：１４２１）、ヒル由来 のアンチスタチン（Ｄｏｎｗｉｄｄｉｅ、　Ｃ，ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　 （１９８９）　２６４：１６６９４）、およびマダニ由来のＴＡＰ　（Ｗａｘｍ ａｎ、Ｌ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２４８：５９３）がある。ある いはクマリンのような、ビタミンに依存性Ｇｌａ変換酵素を阻害する薬剤が使用 されている。これらの方法は、特異性を欠いていること、多量の投与量が必要な こと、有毒な副作用、および効力の長期間の遅延などのため、満足すべきもので はない。 従って、本発明は、活性プロトロンビナーゼ複合体の形成を阻害する作用の特異 性を増大しかつ作用の持続時間を延長する別の方法を提供するものである。 主豆旦回示 本発明は、血栓形成ならびに再狭窄および炎症のようなトロンビンで誘発される 血管系での他の病変プロセスの予防および治療に用いる有効な治療薬剤を提供す る。血栓形成は西洋社会では死亡の第一の原因であり、再狭窄は血管形成術およ び他の侵襲性処置の利用が増大するのに伴って拡大している問題なので、上記の ことは非常に重要である。本発明の治療物質は、不活性化型のヒ）Ｘａ因子であ り、それにもかかわらず、プロトロンビナーゼ複合体に組み込むことができるの で、活性プロトンビナーゼ複合体が内因性Ｘａ因子から生成するのを防止するこ とができる。これらの医薬は、急性の状況において血栓症を予防するのに特に有 用である。これには、安静狭心症の患者の冠状動脈における血栓形成の予防、血 栓崩壊後に再度起こる血栓症の予防、および複雑な血管形成術中の血栓症の予防 が含まれる。これらの医薬はまた、血管形成術または他の血管の侵襲性処置の後 の平滑筋細胞の増殖を防止するのにも有用である。本発明の治療法は、ヘパリン を用いる現在の標準の治療法（Ｈａｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８８）■：３１８４）を越える著しい利益を与え る。本発明の化合物は、プロトロンビナーゼ複合体に関与できるが不活性化複合 体をもたらす、二本鎖または一本鎖のポリペプチドである。 １つの局面において、本発明は、Ｘａｉ因子と呼称される二本鎖ポリペプチドに 関し、そのポリペプチドはプロトロンビナーゼ複合体を形成できるが、タンパク 質分解活性を欠いた複合体をもたらすものである。この二本鎖ポリペプチドは、 ２橿の新規な前駆物質のうちの１つから生成され得る。一方の種類は、本願では Ｘｉ因子と呼称されるが、実質的にＸ因子のアミノ酸配列を有するが、通常の凝 固処理プロテアーゼによるか、またはクサリヘビの毒液由来のＸ因子の活性化因 子を用いるインビトロでの処理によって開裂すると、不活性化二本鎖ポリペプチ ドであるＸａｉ因子を生成するように、本願に記載されているように改変されて いる。他方の種類は、本願ではＸ。 ｉ因子と呼称されるが、−末鎖Ｘ因子の切形の形態であり、ここで図１にＲＫＲ として示す軽鎖のＣ末端におけるタンパク質分解開裂部位（またはその一部もし くは延長部）は、図３の１つの実施態様に示す重鎮の活性化された形態のＮ末端 に、　（１つもしくはいくつかのアミノ残基を任意に付加するとともに）直接結 合している。開裂すると、ｘ′ｉ因子もまた、本発明の二本鎖Ｘａｉ因子になり 、このＸａｉ因子はタンパク質分解活性を欠いたプロトロンビナーゼ複合体にな る。もちろん、活性補因子のＸａ因子はまた、図２に示す、Ｘ°因子タイプの類 似の前駆物質を用いて生成され得る。 従って、池の局面において、本発明は、Ｘａｉ因子の二本鎖プロトロンビナーゼ 複合体およびＸａｉ因子の治療用タンパク質の新規な前駆物質に関し、ならびに これらをフードするＤＮＡ配列、および一般にこれらを生成することができる組 換え物質および方法に関する。 本発明のその他の局面には、治療するのに有用なＸａｉ因子タンパク質の医薬組 成物、および血栓症またはトロンビンによって開始される他の病理学的事象を、 これらの組成物を用いて予防もしくは治療する方法が含まれる。 組換え法で生成したＸａ因子は利用し易いので、この物質は血友病の治療に用い るのに便利な原料になる。Ｘａ因子は、組換え法で直接生成したり、組換え法で 生成したＸ因子を、例えばラノセルクサリヘビ毒を用いて活性化して得たり、ま たは皿漿から単離して同様にＸａ因子に変換したりすることのいかんにかかわら ず、その血清中での半減期を延長することによって使用可能な医薬を生成するよ うに変換し得る。この変換は、活性部位におけるセリンをアシル化することによ って達成され、その結果徐放形態の活性因子が得られる。 従って、別の局面において、本発明は、適切な時間に活性Ｘａ因子に変換する薬 剤で、重鎮の１８５位のセリン残基がアシル化されているＸａ因子に関する。本 発明の他の局面には、本発明のアシル化Ｘａｌｆｆｌ子を含有する血友病治療用 の製薬組成物、およびこれらの組成物を用いて血友病を治療する方法が含まれる 。 図面の簡単な説明 図１は、ヒ）Ｘ因子の構造および従来技術に記載されているその関連する開裂部 位を示す。 図２は、プロトロンビナーゼ複合体の形成に関与する二本鎖開裂生成物を得るた めの前駆物質である一末鎖Ｘ°因子の１つの実施態様の構造を示す。この図に示 す形態は、複合体内にタンパク質分解活性を保持する二本鎖ペプチドを生成する ：以下に示す改変された形態は触媒として不活性である。 図３は、ｘ′ｉ因子の１つの実施態様を示す。 図４は、Ｘ因子をコードするｃＤＮＡ配列を示す。 図５は、組換え法によって生成した、潜在的に活性のＸ因子およびＸａ因子のウ ェスタンプロットである。 図６は、組換え法によって生成した、不活性型のＸ因子とＸａ因子のウェスタン プロットである。 図７ａ〜７ｄは、活性化型に変換された天然のＸ因子および組換え法で生成した Ｘ因子の酵素活性性を示す一連のラインライ−バー−パークプロットである。 図８ａ〜８ｄは、各種のＸ因子型のプロトロンビナーゼ複合体の活性を比較する 図である。 図９は、各種の型のＸ因子について２段階プロトロンビン凝固検定を行った結果 を示す。 図１０は、不活性型のＸ因子による、プロトロンビン複合体形成の阻害を示す。 日　る≦ 一般に、本発明の１つの局面には、本願においてＸａｉ因子と呼称される、治療 に用いるのに有用な二本鎖ポリペプチド、およびこの二本鎖タンパク質の一本鎖 前駆物質が含まれる。 これらのペプチドは、図１中で１−１３９位（軽鎖）および１−２５４位（重鎮 ）に示すアミノ酸配列に約８０％相同であり、好ましくは約９０％相同である。 図１において、プレープロリーダー配列は、軽鎖のＮ末端で始まる番号付けの前 に、−４０から−１の番号を付けて示しであることに留意しなけらばならない。 軽鎖には１−１３９の番号が付けである。介在トリペプチドＲＫＲは、成熟Ｘ因 子には欠失しており、番号を付けていない。この介在トリペプチドに続いて始ま る活性化ペプチドには、１−５２の番号が付けである；活性化ペプチドの「５３ 位」と以後呼称されるインロイシンは、実際には、活性化型の重鎖の第１アミノ 酸である。図中の番号付けはこのアミノ酸から再出発するので、重鎮には１−２ ５４の番号が付けである。 二本鎖ペプチドＸａｉ因子の実施態様は、プロトロンビナーゼ複合体を形成する のに有効であり、Ｘａ因子を含有する天然のプロトロンビナーゼ複合体の形成を 阻害（またはその生成と競合）するそれらの能力によって決定される。プロトロ ンビナーゼ複合体の形成を阻害するそれらの能力は、上で引用されたＫｒｉｓｈ ｎａｓｗａｍｙ、　Ｓ、、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８Ｂ＞　２６３： ３８２３−３８３４の方法によって筒便に測定することができる。しかしながら 、このＸａｉ因子がプロトロンビナーゼ複合体に組み込まれると、その複合体は タンパク質分解活性を示すことができない。これは、ｖａｎ、Ｄｉｅｉｊｅｎ、 Ｇ、ら、Ｌ１■上」ｌ岨（１９８１）　２５６　：　３４３３、またはＳｋｏｇ ｅｎ、Ｗ、Ｆ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩｌｌ（１９８４）　２５６＋２３０ ６の方法で測定できる。これらのＸａｉ因子タンパク質は、ヒトＸ因子に特異的 な市販の抗体を含めて、天然のＸａ因子またはＸ因子に対して生じた抗体と免疫 反応性であるかまたは免疫反応性でない。Ｘａｉ因子タンパク質は抗体血栓性物 質である。 本発明はまた、Ｘａ因子に対する上記の不活性競合体の前駆物質に関する。これ らの前駆物質一群は、Ｘ゛因子呼称される、新規な改変型のＸ因子であり、ここ でその重鎮の４２．８８または１８５位の残基の１つ以上が別のアミノ酸残基に 変換され、その結果そのペプチドのタンパク質分解特性が不活性化される。この Ｘ因子改変型は、活性化ペプチドに結合された軽鎖配列および重鎮配列を少なく とも含んでいる。介在トリペプチド（軽鎖のＣ末端と活性化ペプチドのＮ末端と の間）とプレープロリーダー配列はあってもなくてもよい。従ってＸ因子は、− 末鎖タンパク質であるか（トリペプチドが含まれている場合）、またはＸａ因子 の二本鎖前駆物質である（トリペプチドが欠失している場合）。 好ましくは、プロテアーゼ活性部位の残基の変更は、欠失か、または、二本鎖タ ンパク質の三次元コンホメーションを維持するために、保存的な、置換したアミ ノ酸への変換である。「保存的」という用語によって、適正な活性を保持する置 換というよりはむしろ、適正なコンホメーションを保持する置換を意味する。従 って４２位のヒスチジン残基は、好ましくはフェニルアラニンで置換され；８８ 位のアスパラギン酸は、好ましくはアスパラギンまたはグルタミンで置換され、 そして１８５位のセリン残基は、好ましくはアラニンもしくはグリシンで置換さ れる。 本発明の抗血栓性二量体ペプチドの前駆物質の他の群は、ｘ′ｉ因子と呼称され る。ｘ′ｉ因子前駆物質には、活性化ペプチドの少なくともかなりの部分、好ま しくは活性化ペプチド全体が欠失している。しかしながら、二本鎖型のＸ’を因 子の前駆物質は、軽鎖と重鎮との間にタンパク質分解開裂部位を保持していなけ ればならない。それゆえに、内因性タンパク質分解を受けるアミノ酸は、軽鎖の カルボキシ末端を、開裂部位によって重鎮のＮ末端へ延ばす、−重鎖前駆物質型 に便宜土倉まれる。二本鎖ｘ′ｌ因子の一本鎖前駆物質（プレープロリーダーを 含む）の代表的な実施態様は、活性化ペプチド配列がないこと（従ってＸａｉ因 子になる）によって自動的に活性化され、図３に示されている。この実施態様で は、ヘキサペプチド配列のＲＫＲＲＫＲが、軽鎖のＣ末端を重鎖のＮ末端のイン ロイ　−シン残基に直接結合している。この−末鎖Ｘ′ｌ因子が開裂してＸ’　 ａｉになる。このような改変ｘ′ｉ型前駆物質を構築する際には、疎水性アミノ 酸を重鎮のＮ末端に保持しなけらばならない（天然の場合はイソロイシン）。例 えば、Ｄａｙｈｏｆｆ、　Ｍ、Ｏ，、”Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ−（１９７２）　’４：　（Ｂｆ ｏａｍｅｄ、　Ｒｅｓ、　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈ、Ｄ、Ｃ，）およ びＧｒｅｅｒ、Ｊ、、ムーＭｏ１ｅｅ、　Ｂｉｏｌ、（１９８１）　１５３：１ ０４３−１０５３を参照せよ。 −末鎖Ｘ′因子前駆物質もまた新規であることは明らかであり、タンパク質分解 によって開裂されると、通常の、酵素的に活性な型の二量体タンパク質であるＸ ａ因子が得られる。これの対応する構成を図２に示す。 従って、Ｘａ因子またはＸａｉ因子のいずれかの一本鎖前駆物質が、組換え法に よって適切な宿主細胞中に産生されると、その宿主細胞の内在性酵素が（１）− 末鎖前駆物質Ｘ因子またはＸ゛因子開裂して二本鎖型にし、−末鎖Ｘ因子または Ｘ°因子の場合、さらに活性化ペプチドを開裂することによってその因子を活性 化し；ｘ゛因子末鎖前駆物質の場合、活性化ペプチドが存在しないので、その− 末鎖前駆物質は開裂されて二量体ペプチドになったときに自動的に活性化される 。Ｘ因子前駆物質については、活性化ペプチドを含む二本ｇｉ型もまた、ラノセ ルクサリヘビ毒のＸ因子の活性化因子のような適切なプロテアーゼを用いて、イ ンビトロで開裂され得る。Ｘａ因子またはＸａｉ因子のいずれかは、さらに以下 に述べるように、適当なコドンを変更することによって活性部位が不活性化され るか否かによって得られる。 本願中に用いられる用語を要約するために、以下の用語解が有用であり得る： 「Ｘ因子」は、天然のもしくは組換え法で生成した、−末鎖または二本鎖のＸ因 子配列を意味し、図１に示すように、本質的に、少なくともそのＮ末端に活性化 ペプチドを結合した重鎖、および軽鎖を含む。これらは図中に示すように、開裂 配列によって連結されていてもいなくてもよい。ｒｒＸＪは、特に組換え法で生 成した型のこの因子を意味する。 「ｘｉ因子」は、上記のように活性部位を改変することによって、タンパク賀分 解活性を欠いた、組換え法で生成した型のＸ因子を意味する。ｒｒＸｉＪという 表示もまたこのタンパク質に用いられる。 ｒＸａ因子」は、軽鎖および重鎮だけを含む、天然のもしくは組換え法で生成し た、酵素として活性な二量体を意味する。 この複合体中には活性化ペプチドは存在しない。　ｒｒＸａＪは特に組換え法で 生成したときのこの複合体を意味する。 ｒ　Ｘａｉ因子」は、改変された型のＸａ因子を意味し、結合してプロトロンビ ナーゼ複合体を形成するという意味で活性化されているが、その活性部位の改変 によってセリンプロテアーゼ活性を有しない。このタンパク質が組換え法によっ てのみ生成されるとき、ｒ　ｒＸａｉ　Ｊもまたこの複合体を呼ぶのに用いられ る。 「ｘ′Δ子」は、改変された一本鎖型のＸＩＪ子を意味し、図２に示すように、 軽鎖、重鎮、および中間の特異的なタンパク質分解開裂部位だけを有している。 この−末鎖前駆物質はまた、ブレープロ配列を含んでいることもある。この因子 も組換え法だけで得られる場合、それもまたｒ　ｒＸ’　Ｊと呼称される。 活性化させるためにプロテアーゼで開裂されるとき、その生成物はＸａ因子（ま たはｒＸａ）と区別できないので、この用語を再度使用する。 同様にｒＸ’ｉ因子」は、上記のようにその触媒部位でか不活性化された改変型 のＸ゛因子意味する。１つの型を図３に示す。二本鎖型に変換すると、活性化ペ プチドが前駆物質中に存在しないので、生成物はＸａｊまたはｒＸａｉと区別で きない。 「アシル化Ｘａ因子」またはｒ　ＡｃＸａＪは、特に断わりがなけらば、組換え 法で生成されるかされないかにかかわらず、次のようなＸａ因子を意味する。す なわち、１８５位のセリン残基が、血清中での半減期が少なくとも５〜１ｏ分間 、好ましくは１５分間を越えるＸａ因子を与え、かっこの期間にわたって活性型 であるＸａ因子を放出する置換基でブロックされているＸａ因子を意味する。血 清中での半減期は、適切に樟識された盟を用いて、インビボで直接測定され得る 。しかしながら、寿命を延長されたＡｃＸａが、必要な時間枠内で活性因子をイ ンビトロで生成する能力は、Ｘａ因子が触媒であるインビトロ検定法を基準とし て用いて評価するのが好ましい。これらの条件下で、本発明で用いる適切な型の ＡｃＸａには、約５分間から数時間の半減期が達成できるような、ｐＨが７．４ で３７℃の等張水性媒体中における加水分解の速度定数を有するものが含まれる 。その半減期は、所望により、凝固を活性化するその能力、またはＸａ影形成対 する基準としてプロトロンビナーゼ反応を用いて、アシル化Ｘａ因子の加水分解 速度を測定することによって、インヒドロで直接決定され得る。 （以下余白） 水ｉ＋とｉズｆ」セｌ−製 ヒトのＸ因子のゲノム構成およびコーディング配列は公知であり、そのｃＤＮＡ は検索され配列が決定されている（Ｌｅｙｔｕｓ。 Ｓ、Ｐ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｉ　ＵＳＡ　（１９８４）　 ８ｉ：３６９９；　Ｋａｕｌ、Ｒ１にら、虹匹（１９８６）　４１：３１１−３ １４）。その全ｃＤＮＡ配列を図４に示す。 全長のＸ因子をｃＤＮＡの挿入物は、部位特異的変異誘発を行うためにＭ１３ｍ ｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９のベクター中にサブクローニングされる。　（Ｘ因 子をコードする正しい配列はジデオキシ配列決定法で確認される。）標準の改変 法は現在、当該技術分野では容易に利用可能なので、Ｘ因子をコードする配列を 改変して、Ｘ′因子、Ｘｉ因子、ｘ゛１１因子−ドするＤＮＡが得られる。 Ｘ°因子、Ｘｉ因子およびｘ′ｌ因子の改変コーディング配列を、次いで、ポリ ペプチドを組換え法で産生させるために、適切な発現ベクターに結合する。その 発現ベクター中には、哺乳類宿主のような適合性宿主細胞中で発現させるために 、プレプロリーダー配列を保持させる方が好ましい。細菌または酵母での発現が 所望の場合、細菌中のベニシリナーゼ配列または酵母中のα因子配列のような適 合性リーダー配列を置換することが望ましい。あるいは、細胞内タンパク質を産 生させるために、ＡＴＧ開始コドンを、軽鎖をコードする配列のアミノ酸１の前 に直接配置してもよい。 宿主および発現制御系の選択は、所望の結果の性質で支配される。タンパク質分 解による開裂により内因性活性化が所望の場合は、哺乳類系が好ましい。しかし ながら、培養の簡便さを提供する微生物内での生成は、必要なカルボキシグルタ ミル残基を産生させるためにカルボキシル化のインビトロ系が使用するか、ある いはこの翻訳後のプロセシング系を本来欠いている微生物または他の宿主が形質 転換されてそれを提供するならば、除外されない。組換えＤＮＡ配列の種々の発 現系は、当該技術分野で公知である。 Ｘ°因子、Ｘｉ因子またはｘ′ｉ因子をコードする改変ＤＮＡは、好ましくはク ローニングベクターおよび発現ベクターに結合するためのリンカ−を備えている 。このようなベクターを調製する方法は当該技術分野では充分に理解されている 。所望のＸ゛因子Ｘｉ因子またはｘ′ｉ因子をコードするＤＮＡは、予定の組換 え宿主細胞の性質によって、プロモーター、上流のエンハンサ−１終止配列など を含む制御配列と、作動可能な結合で連結されている。酵母、哺乳類または鳥類 または昆虫の細胞および植物細胞を含む、原核生物の宿主と各種の真核生物を含 めた各種の宿主内に、異種の遺伝子を発現させる方法は、現在利用することがで きる。発現ベクター中の制御配列およびマーカーの種類は、これらの宿主に対し て適当に選択される。 例えば、原核生物の宿主には、ｔｒｐプロモーターおよびλファージＰＬプロモ ーターのような誘導プロモーターを含む各種プロモーターが使用され得る。ｔａ ｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが用いられ得るが、このプロ モーターは、ｌａｃオペレーターと共同でｔｒｐポリメラーゼ結合領域を含有し ている。適切なマーカーは、一般に、構成物質耐性に関するマーカーである。一 方、哺乳類の細胞培養に通常用いられるプロモーターは、ウィルス由来のもので あり、例えば初期および後期のＳＶ４０プロモーターおよびアデノウィルスプロ モーターがある。メタロチオネイン−Ｉ＋プロモーターのような、哺乳類の調節 可能なプロモーターもまた使用され得る。 このメタロチオネイン−ＩＩプロモーターは、グルココルチコイド類または重金 属類によって調節される。これらのプロモーター系は、典型的な哺乳類宿主に対 して適合性であり、そのうち最も普通に用いられるのは、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＦＩＯ）細胞である。 池の普通に使用される系は、昆虫細胞と適合性のバキニロウィルス発現系である 。例えばノパリンシンテナーゼプロモーターとともに用いられる植物細胞、およ び解糖経路において重要な酵素に関連するプロモーターとともに用いられる酵母 細胞もまた使用され得る。−Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、−Ａｕ５ｕｂｅ１．　Ｆ、Ｍ、ら編、Ｗｉｌ ｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉａｎｃｅ出版、最新版の適当な車に、多数の適切な発現 系が記載されている。 本発明のＡｃＸａは、例えば、先に引用したＣａ５ｓｅｌｓ、　Ｒ，ら、旦ｉｏ ｃｈｅｍ　Ｊ　（１９８７）　２４７：３９５−４００または米国特許第４．３ ３７．２４４号に記載もしくはり照されているのと類似の方法に従って、組換え 法で生成されているかまたは血漿から単離されているかにかかわらず、Ｘａ因子 を標準のアシル化部分によって調製する。適切なエステルには、４−トルオイル エステル、３．３−ジメチルアクリリルエステル、ンクロヘキシリジンアセチル エステル、シクロヘキシー１−エンカルボニルエステル、１−メチルシクロベキ ンリジンアセチルエステル、４−アミノベンゾイルエステル、ｒ−グアニジノベ ンゾイルエステル、４−アニフィルエステル、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノベン ゾイルエステル、およびＰＤＡＥＢ　（４−Ｎ−（２−Ｎ’　（３−（２−ピリ ジルジチオ）−プロペニル）アミノ−エチル）アミノベンゾイルエステルが含ま れる。一般に、アシル化剤は、活性化型の無毒の酸であり、これは１つのカルボ キシルが置換されている飽和、不飽和もしくは芳香族の５または６炭素環を与え る。この環は、アミノ、アルコキシ、アルキル、追加の環系、または他の非干渉 性の無毒の置換基のような置換基を、さらに含み得る。セリンのヒドロキシル基 をアシル化できるか、さもなければセリンを可逆的な様式でブロックできる任意 の化合物が、ＡｃＸａを合成するのに適切である。米国特許第４，３３７，２４ ４号に記載されるように、一般に直接アシル化剤または逆アシル化剤が用いられ 得る。 直接アシル化剤の場合、アシル化部分はそれ自体がＳａ因子の触媒部位に引きつ けられるが、逆アシル化接近の場合は、従って脱離基が引きつけられる。アシル 化型のＸａは、次いで、標準の精製法、例えば透析、クロマトグラフィー、選択 抽出法などを用いて反応混合物から精製される。 ＡｃＸａの医薬として役立つ本発明の化合物は、インビボで適当なりリアランス 時間を保証する適当な脱アクリル化速度を有しなければならない。この脱アクリ ル化速度は、緩衝液中、インビトロで少なくとも５分間の半減期を有して（する 場合、プロトロンビナーゼ検定法および／または凝固検定法を用−１で、測定さ れ得る。脱アクリル化反応は、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｒ，Ａ、Ｇ、ら、”Ｐｒｏｇｒｅ ｓｓ　ｉｎ　Ｆｉｂｒｏｎｏｌｏｓｉｓ−（１９８５）■巻、ｐｐ、　２２７− ２３１　（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）に記載されて（入る よう（こして直接ｉ１１定され得る。プロトロンビナーゼおよび凝固検定法（よ 、Ｗｏｌｆ。 Ｄ、　Ｌ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９９１）　（印刷中）（こ記載さ れて０る。 皮王虱えで１立 本発明のＸａｉ因子ペプチドはプロトロンビナーゼ阻害剤であるので、血栓症に よって複雑になった処置法、および病因力ｆトロンビン生成を伴う症状に有用で ある。これらの症状（こ（よ、冠状および末梢の血管形成術およびアテレクトミ ーを含む血管介入中、および血管１＜イノくス装置（末梢および冠状の）の前後 での不安定狭心症（すなわち安静狭心症）および急性血管閉鎖、心筋梗塞形成に 対する血栓崩壊治療後の再閉塞、血栓による発作（徐々にひどくなる発作）、お よび脈管炎による血栓症（川崎病）のような動脈血栓症を伴う症状力；含まれる 。また下肢の深部静脈の血栓症、肺塞栓症、腎静脈、肝静脈および工大静脈の血 栓症、ならびに海綿静脈洞の血栓症のような静脈血栓症を伴う症状も含まれる。 他の標的症状としては、散在した脈管内凝固を伴う敗血症、他の状況ζこお（す る散在した脈管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、および未知の病因によるま れな症状（抗凝血性ル−プス（Ｌｕｐｕｓ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ））の ような凝固系の散在性活性化を伴う症状である。 本発明のＸａｉの因子はまた、心肺バイパス、器官の採取時、血液製品または血 液試料の調製時、器官の輸送時および移植時および受容者の関連する治療時にお いて、抗凝固剤および抗炎症剤としても有用である。徐放型のＸａｉ因子は、留 置血管内器具（ｉ、ｖ、ｓ、カテーテル、移植片、バッチ）に特に有用である。 血栓症はまた、血管形成術、アテレクトミーまたは血管内膜切除術のような血管 介入に続いて、直接的または間接的に平滑筋細胞の増殖を起こすことによって起 こる再狭窄にも関与しているので、本発明のＸａｉ因子はまたこの症状の治療に も有用である。 成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）は、プロ血栓（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ） 内皮が炎症および増殖の成分とともに存在していると思われる「内毒素」疾患で あると考えられる；従って、Ｘａｉ因子はまたＡＲＤＳの治療にも有用である。 治療に用いる本発明のＸａｆ因子ペプチドは、例えば、肚１罰ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、最新版、Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡに記載されているように 、典型的に注射によってタンパク賃を投与するのに通常用いられる賦形剤を用い て、投与用に調剤される。抗血栓症効果を与えるために、Ｘａｉ因子タンパク質 は、好ましくは注射により、および好ましくは静脈注射によって全身に投与され る。投与量のレベルは、被検者の症状および選択される特定のＸａｉ因子の実施 態様を含む、多くの因子に依存している。しかしながら、適切な投与量の範囲は 、連続注射投与量当り１人の患者に対して１〜５０５ｇのオーダーである。注射 を行うために、このタンパク質は、例えばハンクス液、リンゲル液、ブドウ糖溶 液、および各種の緩衝液のような液体媒体に溶解させるかまたは懸濁させる。安 定剤のような追加の賦形剤もまた使用され得る。 本発明のペプチドは、注射の他に、全開、経口投与、鼻腔内噴霧法を含む経粘膜 投与、および徐放性製剤によって全身に投与され得る。他の製剤には、リポソー ムのような被包製剤が含まれる。 Ｘａｉ因子は、治療剤としての用途に加えて、ポリクローナル抗血清を生成させ るか、または不朽化パートナ−に融合させて、このペプチドに特異的なモノクロ ーナル抗体の起源が得られ得る細胞を作るために使用され得る。これらの抗体は 、受動的治療または診断の手段として有用である。 改変されてインビボでの半減期が延長された、本発明のＸａ因子は、血友病の原 因がＸ因子の遺伝子にあるのか、またはさらに広く蔓延している種類の血友病Ａ およびＢにあるのかにかかわらず、血友病を治療するのに有用である。この用途 では、半減期を延長されたＸａ因子を、Ｘａｉ因子について先に述べたのと類似 の投与量レベルおよび製剤を用いて、非経口でまたは全身に投与される。投与は 典型的に注射によって行われるが、経粘膜法、経皮法などのような他の全身系の 方法もまた利用され得る。これらの投与経路に用いる製剤は、上記のものと同様 でる。特に、当該技術分野で広く知られているような各種の小胞または徐放系を 利用するのが有利である。例えばＧ１１ｅｓ、　Ａ、Ｒ，ら、　ｒｉｔ　Ｊ　Ｈ ｅｍａｔｏｌ　（１９８ｇ）　６９：４９１−４９７には、ホスファチジルコリ ン−ホスファチジルセリンの小胞にＸａ因子を配合することが記載されている。 同様に、寿命を延長されたＸａ因子はこの方式で投与され得る。 以下に述べる実施例は本発明を例示するのを目的とし、本発明を限定するもので はない。 Ｌ立史上 して１′　の　゛ヒトｘｒｘ。 コード　るＤ　の ヒトＸ因子の全長ｃＤＮＡクローンを、Ｗ、Ｒ，Ｃｈｕｒｃｈ博士、Ｕｎｉｙｅ ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｅｒｍｏｎｔから入手した（図４）。このｃＤＮＡは図１ のアミノ酸配列また対立遺伝子の変異型をコードする。このヒトＸ因子のｃＤＮ Ａを、ベクターｐＢｓＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ［部位にクロ ーニングしてｐＢＳＸを得た。全Ｘ因子のコーディング領域を含有するｐＢｓＸ のＨｉｎｄｌｌ　Ｉ−Ｘｂａｌフラグメントを、ベクターＭ１３ｍｐ１９　（Ｍ ｐ１９Ｘ）の旧ｎｄｌｌ　Ｉ−Ｘ　ｂａ１部位にサブクローニングした。 次に、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、Ａ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　’　ｎｚ　ｎｏ　（１９８ ）”）１５４：３６７に記載されているようにして、オリゴヌクレオチド部位特 異的突然変異誘発を行った。 下記の形態のものが生成した。 オリゴマーＴＧＣＣＧＡ　ＧＧＧ　ＧＡＣＧＣＣＧＧＧ　ＧＧＣＣＣＧ　ＣＡＣ を用いて、Ｘ因子の重鎖の１８５ａａ位置におけるセリン（Ｓ＋ａｓ）をアラニ ン（ＡｌＢ２）に変換してｒＸｉＡ＋８ｓを得たＯオリゴマーＡＣＣＴＡＴ　Ｇ ＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧ　ＣＴＣを用いて、Ｘ因子の重鎖の８８ａ ａ位置におけるアスパラギン酸（Ｄｓｓ）をアスパラギン（Ｎｅｓ）に変換して ｒＸｉ１１８ｓをコードする遺伝子を得た。 両方のオリゴマーを使って、ｒＸｉＮｅｓＡ＋ｓｓをコードする遺伝子を得た（ これらの部位の位置については図１参照）。オリゴヌクレオチド特異的突然変異 誘発の確認は、ジデオキシ配列決定法で行った。 Ｌ皿五ｌ ヒトＸａ　の　を　ったｊ　ｒＸ’　をコード　るＤＮＡの 活性化ペプチドを欠失させ、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発（Ｋｕ ｎｋａｌ、　Ｔ、　Ａ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　（１９８ ７＞　１５４：３６７）　ｌ、：よッテ、ヒトＸ因子（Ｍｐ１９Ｘ）のｃＤＮＡ を、種々の切り形の形態のヒトＸａ因子（集合的にｒＸ’と称する）をコードす るように変換した。対応するアミノ酸の変更において採用された次に続くオリゴ ヌクレオチドは次のとおりである。 ｒＸ゛△Ｏ：　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣ ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧＣｌこれはＸ因子の軽鎖のＣ末端 に続くアルギニン（Ｒ１４２）と、Ｘ因子の活性化ペプチドの５３ａａのインロ イシン（１５３）（連鎖の１ａａ）とを−直線上に配列した。 ｒＸ’△ｌ　：　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＡＧ Ａ　ＡＴＣＧＴＧ　ＧＧＡＧＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧＣ、コレハ上記（ＤＲ（ ｔ２と、Ｘ因子の活性化ペプチドのアルギニン（Ｒ５２）とを−直線上に配列し た。 ｒＸ’△２：　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＣＧＧ 　ＣＧＧ　ＡＡＡ　ＡＧＡＡＴＣＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧ Ｃ，コれはＸ因子の軽鎖に続＜Ｒ＋４２を２つのアミノ酸、アルギニン（Ｒ＋ａ ｉ）とりシン（Ｋ＋４ａ）で延長し、この末端とＸ因子の活性化ペプチドのＲ５ ２とを一直線上に配列した（図２）。 ｒＸ’△３　：　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＣＣ Ｔ　ＡＧＧ　ＣＣＡ　ＴＣＴＣＧＧ　ＡＡＡ　ＣＧＣＡＧＧ　ＡＴＣＧＴＧ　Ｇ ＧＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧＣ，これはＥｈｒｉｌｉｃｈ、　Ｈ，Ｊ、ら 、　ＬＬ加」１聾（１９８９）　２ｉｉ：１４２９ｇに記載されているようにし てＸ因子の軽鎖に続＜　Ｒ１４２を７つのアミノ酸、プロリン（Ｐ冒３）、アル ギニン（Ｒ１４４）、プロリン（ＰＩ４５）、セリン（Ｓ＋４６）、アルギニン （Ｒ＋４７）、リジン（ＫＩ４８）、アルギニン（Ｒ１−９）で延長し、次いで この末端とＸ因子の活性化ポリペプチドのＲ５２とを一直線上に配列した。 上記のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発の確認はジデオキシ配列決定法で 行った。 さらに以下に説明するように、ｒＸ’Δ２由来の前駆物質は、ＣＨＯ細胞内で組 み換え法により産生されると内因的に開裂されて、直接、活性型のｒＸａが得ら れた。ｒＸ゛△０由来の前駆物質は、組み換え法により産生された場合、ＣＨＯ 細胞内で内因的に開裂されることはなかった。ｒＸ’△１またはｒＸ°△３由来 の前駆物質は不完全に開裂された。ｒＸ’△０、ｒＸ’△１およびｒＸ’Δ３由 来の二量体ペプチドは酵素として活性ではなかった。 見立史ユ として＼　な　ンの＋　ｒＸ’ｉ をフード　るＤＮＡの 実施例２に記載したｃＤＮＡ　Ｘ’因子構造体を、実施例１に記載のオリゴヌク レオチド部位特異的突然変異誘発によって、触媒として不活性型のＸ’　（ｒＸ ’　ｉ）をコードするように変換した。 これらの構造体には、図３に示すようなｒＸ’　ｉ　（△２）　Ｎｅ８（ｒＸ’ ｉ（△２）　Ｎｅｔ）およびｒＸ’ｉ（Δ２）　Ｎ５ｓＡ＋ａｓが含まれる。 Ｌ立五工 Ｔ　ｒｘおよびｒＸ’　をコード　る゛　の発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ　（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、そのＣＭＶプロモーターをＳＲαプロモーター（Ｔａ ｋａｂｅ、Ｙ、ら、Ｍｏ１ｅｃ　Ｃａｌ　Ｂ’　１（１９８８＞　８・４６６） で置換して改変した。ＳＲαプロモーターを含有するＣｌａｌ部位にタレノウポ リメラーゼによって満たされたＣ１ａｌ−Ｘｂａｌフラグメントを発現ベクター ｐＢＪ１　（Ｌｉｎ、　Ａ、ら、鉦ムｌコ（１９９０）　２４９：６７７および Ｍ、　Ｄａｖｉｓ、　５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能） から単離し、発現ベクターｐＢＮを生成するｐＲＣ／ＣＭＶのＮｒｕｌ−Ｘｂａ １部位にサブクローニングした。ＳＲαプロモーター、ラン成長ホルモンポリア デニル化部位およびＭ１３複製起点を含有するｐＢＮの５ｔｕｌフラグメントを 、発現ベクターｐＢＤを生成するｐｓＶ２ＤＨＰＲの５ｔｕ１部位にサブクロー ニングした。実施例に記載した前駆物質ＤＮＡのＭｐ１９　Ｓｍａｌ−ＥｃｏＲ ’／フラグメントは、クレノウボリメラーゼによって満たされたｐＢＮおよびｐ ＢＤのＸｂａ１部位にサブクローニングした。 得られた発現ベクターを、リボフェクシヲン（１ｉｐｏｆｅｃｔｉ。 ｎ）　（ＢＲＬ）によって、ＣＨＯ中にトランスフェクトした。トランスフェク トされたクローンの選択は、１＋＊ｇ／ｍｌのＧ４１８ネオマイシン（Ｇｉｂｃ ｏ）または２５ｍｇ／ｍｌのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ）によって行った。 シングルクローンをクローニングシリンターによって単離し広げ、発現レベルを 、Ｈａｒｌｏｔ、　Ｅ、およびＬａｎｅ、　Ｄ、、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ １９８ｇ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載のようにして標準的な固相抗体捕獲検定法（ＥＬＩＳＡ ）によって、２４時間、血清を除去した培地上で測定した。 このＥＬＩＳＡ法では、ウサギポリクローナル抗ヒトＸ因子（ＳＴＡＧＯ，Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）の−次抗体、およびペルオ キシダーゼ複合ヤギＩｇＧのウサギ特異的二次抗体を利用した。 構造体ｐＢＮＸ、、ｐＢＮＸ’△０、ｐＢＩＩＩＸ’Δ１、ｐＢＮＸ’△２およ びｐＢＮＸ’Δ３由来のクローンを１０％仔ウシ血清、ペニシリン、ストレプト マイシン、グルタミンおよび１０μｇ／＋ｉｌのビタミンＫを補ったＲＰＭＩ培 地を入れたＴ−７５組織培養フラスコ中で密集状態になるまで広げ、血清を除去 した培地で４回洗浄し、血清を除去した培地とともに一夜インキュベートした。 インキュベート後、培地を収穫し、３０００ｒｐｍで遠心分離し、２ｍｌを１０ ％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈澱させた。そのＴＣＡペレットを１００％アセ トンで３回洗浄し、０．０５＋＊１の５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液、またはＩＭ のβメルカプトエタノール含有５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液０．０５ｍに再懸濁 させた。得られた懸濁液の１０μｍずつの２つを、１２％ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル上で電気泳動し、［ｍｍｏｂｉｌｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｆｐｏｒｅ ）に移行した。−次ヒトＸ因子ポリクローナルウサギ血清（ＳＴＡＧＯ，Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ、）の、１％脱脂乾燥乳、０．１ ％Ｎｌ’４０、ＩＱＭＭ　ｌ−リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５、および１５０ｍｍＮ ａＣ１からなる液による１／４０００希釈液についてウェスタンプコツト分析を 行った。二次抗体は１２５Ｉで標識したＦａｈロバ抗ウサつＩｇＧ　（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ）であった。オートラジオグラフィーを増感スクリーンを用いて一７０ ℃で一夜実施した。 抗体反応性のパターンが、予想した生成物が生成したことを示した。５つの全生 成物、すなわちｒＸ、ｒＸ’△Ｏ，ｒＸ’△１、ｒＸ’△２およびｒＸ’△３由 来の生成物は、ウサギ多価ヒトＸ因子抗血清に基づいた上記ＥＬＩＳＡ法で陽性 であった。ＥＬＩＳＡ法は、マウスのモノクローナル抗体であるＭａｂ３２３、 Ｍａｂ７４３およびＭａｂ３２５についても実施した。Ｍａｂ３２３は特に活性 化ペプチドに対して反応性である。Ｍａｂ７４３は、活性型または不活性型のヒ トＸ因子のいずれに対しても反応性である。Ｍａｂ３２５はカルシウム依存性で かつ軽鎖に対して特異的であり、この抗体はγカルボキシル化領域と反応する。 上記５つの構造体を含有する培養由来のどの上澄み液も、ＥＬＩＳＡ法で、Ｍａ ｂ７４３とＭａｂ３Ｚ５に対して陽性であった。従って、翻訳後のＧＬＡプロセ ７ングがすべての場合に示された。ｒＸ’変異体はすべてＭａｂ３２３と反応で きなかったが、このことはこの変異体には活性化ペプチドが存在しないことを確 証している。 図５は、ｒＸ、　ｒＸ’△Ｏ，ｒＸ’Δ１、ｒＸ’△２、ｒＸ’△３およびＣｌ ｌ０対照培地由来の生成物について、ホゾクローナルウサギ抗血清を用いて行っ たウェスタンプロット分析の結果を示す。Ｘに対するウサギポリクローナル抗血 清は、ヒトＸａ因子の十分に処理した重鎮を局在化させるのに宵効でなかった。 そのためすべての場合において、活性化重鎖によって占められると予想された位 置が現れていない。図；ａはこれらの組み換えタンパク質の還元型を示し、図５ ｂは同タンパク質の非還元型を示す。レーン１は０．７μｇの天然のヒトＸ因子 （Ｃ，Ｅｓｍｏｍ博士、ＯＭＲＦ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　０ｋｌａｈｏ ＋＊ａ）　；　レーン２はｒｘ；　レーン３はｒＸ’△０；　レーン４はｒＸ’ △ｌ；　レーン５はｒＸ’△２；　レーン６はｒＸ’△３；レーン７はＣＨＯ対 照培地をそれぞれ示す。 図５８は、ｒＸとｒＸ’△２の組み換え生成物が、還元条件下で分離可能な二量 体タンパク質であることを示している。ｒＸ’Δ０、ｒＸ’△１およびｒＸ’△ ３の発現生成物は、明らかに大部分が一本鎖の生成物である。処理されていない Ｘ°因子−重鎖は、レーン３−７に示されているように、重鎮と変則的に共移動 （ＣＯ冒ｉｇｒａｔｅ）するようであり、これは明かに、新規な開裂部位のタン パク質分解プロセシングの度合が原因である。これらのＸ゛前駆物質タンパク質 が適切に処理されないことは、実施例８に記載した凝固検定法の結果と一致した 。実施例８は、Ｘａ因子、ＲＶＶで活性化されたＸ因子もしくは組み換えＸ因子 、およびＸ°△２は同等に活性であるが、一方残りのＸ゛が分泌した生成物は、 効率が劇的に低く、少なくとも５桁はど低い。酵素活性に関するデータを表１に 示す。 退二Ｌ 「触媒効率」と記載した表１の欄は、必要に応じてＲＶＶで活性化された各種の 因子、アミド分解性基質活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ　５ｕｂａｔｒａｔｅ　ａ ｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。提示した触媒効率はｋｃａｔ／Ｋｍの比率であり、血 漿のＸ因子に対する結果に標準化した。表に示すように、組み換えＸ因子および Ｘ°△２の両方は、Ｘ因子依存性２ＰＴ凝固検定法では活性であったが、残りの 組み換えタン７４り質の酵素活性は４桁低かった。 図５ｂからみて、Ｘｏをコードする遺伝子の発現生成物は、分子量が「Ｘもしく は天然のＸ因子より低いことは明らかである。 支五五五 ｒｌにおよびｘ゛２の 組み換えＸ因子およびＸ゛Δ２の両方は、均質になるまで次のように精製した。 すなわち密集状態まで増殖させた後、ｐＢＮＸもしくはｐＢＮＸ’△２でトラン スフェクトされたＣＨＯ細胞を血清を除去した培地で４〜５回洗浄した。次にそ の細胞を、４μｇｅｍｌのビタミンに３を補った血清を除去した培地中、３７° Ｃで連続２４時間培養した。 収穫した培地を１５．０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心分離し、次いで０．２μｍ のフィルターで上澄み液を濾過した。培地に、トリスＨＣＩｐｉ１７．　Ｓを２ ０ｄまでおよびＮａＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加し、得られたものをＱ−Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でりｏｖトゲラフイ ーを行った。クロマトグラフィーの全工程を４℃で行った。 カラムを、２０ｍＭ　トリス、ｐＨ７，５，１０＋ａＭ　ＥＤＴＡ、　０．１５ Ｍ　ＮａＣ１で徹底的に洗浄し、タンハク質を、２０１Ｍ　）　’Ｊ　スｐＨ７ ，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１，５！ＩＭ　ＣａＣｌ２で溶離した。ピーク画分をプ ールし、−２０’Ｃで凍結して貯蔵するか、またはＣｈｕｒｃｈ、　Ｗ、Ｒ，ら 、Ｔｈｒｏ＋ａ　Ｒｅｓ　（１９８５）　３８：４１７−４２４に記載されてい るようにして、抗Ｘ因子モノクローナル抗体アフィニティーカラムに直接加えた 。単離に用いた抗体（ａＨＦＸ−１ｄ、Ｍａｂ　Ｂ１２−Ａ５）はヒトＸ因子に 対して特異的であり、Ｃａ”によって影響されず、かっＸ因子およびＸａ因子の 両方に結合する（未発表データ）。ｒＸ’因子を、さらに、Ｋｒｉｓｈｎａｓｖ ａｍｙら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８７）　２６ユ：３２９１−３２９ ９に記載されていルヨウにして、ベンズアミジン−セファロース　カラム（Ｐｉ ｅｒｃｅ）で精製した。タンパク質の濃度は、定量ＥＬＩＳＡ法、タンパク質比 色検定法（Ｈａｒｌｏｗ、　Ｅら、−Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−（１９８８＞、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）および吸光係数 が１１６、そしてＸ因子については分子量５８．９００、およびＸ°△２につい ては分子量４６．０００を用いた２８０ｎｍにおける吸光度測定法で測定した。 ＰＩ製された因子を、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行って銀で染色したとこ ろ、組み換え法で生成したＸ因子は、全長の前駆物質（７５ｋＤ）、活性化ペプ チドを含有する重鎖（４５ｋＤ）および軽鎖（２２ｋＤ）を表す３つのバンドに に分離されていることを示した。 ナイロンフィルターにエレクトロトランスファー（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆ ｅｒ）を行ってからアミ／末端の配列分析を行ったところ、軽鎖は、不均質で、 ２７％がＶａ１３７で始まり、そして７３％がＡｌａ４！で始まり、一方７５Ｋ Ｄの種も不均質で、４１％が’／ａｌｘ７で始まり、そして５９％がＡｌａａ＋ で始まることが分かった。 尖１」■ 飄　えヒトｘ−ｒｘｊおよびｒＸ’ｉ　をコード　る゛　の 不活性型に変換するために選択したＸ°型は、図４に示すｒＸ゛△２型であった 。ｒＸ、ｒＸ’（△２）、ｒＸｉＮｓｓＡ＋ｓｓ、ｒＸｉＡ＋ｓｓ、ｒＸ’１（ △２）Ｎ［ｌｓＡ＋ｓｓおよびｒＸ’　１Ｎｓｓ（△２）のためにｐＢＮで誘導 された細胞系を、実施例４に記載したようにしてｌ１００ｃＯ＋２＋：７−ラビ ン内で密集状態にまで増殖させ、血清を除去した培養液で４回洗浄し、５０ｍ１ の血清を除去した培養液とともに一夜インキュベートシた。その培養液は毎日補 充して収穫した。 連続収穫物をプールして、３０００ｒｐ＋＊で遠心分離し、次に、ＣＥｓｍｏｎ 博士（ＯＭＲＦ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｒ　Ｏｋｌａｈｏｍａ）より提供 されたＸ因子特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）アフィニティーカラム（Ｍａ ｂ７１７）に直接通過させた。結合した「Ｘ因子」を８０％のエチレングリフー ルでＭａｂ７１７カラムから溶出し、１０ｍＭ　ｌ−リス　ＨＣＩ　ｐＨ７，５ ，１５ＱＩＩＩＭ　ＮａＣｌに対して通板し、Ｃｅｎ　ｔｒｉｃｏｎｌ　Ｏ透過 装置（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。「Ｘ因子」タンパク質の濃度は、実施例４に 記載されているように連続希釈液を用いて、ヒトＸ因子の標準製剤（Ｈａｅｍａ ｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　［ｎｃ、、　Ｃ，Ｅｓｍｏｎ、 　ＯＭＲＦ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｏｋｌａｈｏｍａ＞と比較して、 ＥＬＩＳＡ法で測定した。 精製したタンパク質は、実施例４に概説したウェスタンプロット分析法で特性を 決定した。図６は、これらのβ−メルカプトエタノールで還元され、Ｍａｂ７１ ７で精製された組換えヒトＸ因子類似体のウェスタンプロットを示す。レーン１ は、０．１μｇのヒトＸ０１ａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ、Ｉｎｃ、）　：　レーン２は０．１　μｇのヒトＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏ ｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、）　；　Ｌ／　−ン３は０．１μ ｇのｒｘ；　レーン４は０．１６ＭｇのｒＸ’△２；　レーン５は０．１３Ｍｇ のｒＸｉＮｓｓｒＡ＋ｅｓ　；　レーン６は０．１５ＭｇのｒＸｉＡ＋ａｓ　： 　レーン７は０．１８７ＭｇのｒＸ’　ｉ　（Δ２）Ｎｓｓ　；　レーン８は０ ．０５ＭｇのｒＸ’ｉ（△２）ＮｓｇＡ＋ｇｓである。 還元条件で、ヒ）ＸおよびヒトＸａは二量体型であり；　ヒ１−Ｘａは、活性化 ペプチドがないため、低分子量型の重鎮を示すことは明らかである。レーン３の 組換えヒトｘは天然のヒトＸに類似しているが、ある種の一本鎖前駆物質である ことは明らかである。レーン４には、組み換えｒＸ’△２も重鎖と軽鎖に開裂す ることが示されている。レーン５および６においては、改変された組み換えＸｉ タンパク質が組み換えヒトＸと類似の様式で挙動している。予想されるように、 レーン７および８は、ｘ゛１のタンパク質分解開裂によって誘導されたモノマー 、重鎖および軽鎖が存在していることを示す。 支血史工 み　えヒトＸ　の 天然のヒトｘ因子；ｘａ因子、組み換えＸ（ｒＸ）、ｒＸ’△０、ｒＸ’△１、 ｒＸ’△２、ｒＸ’△３、ｒＸｉＮｓｓＡ＋ｓｓ、ｒＸｉＮｓｓ、ｒＸ’ｉ（△ ２）ＮｓｓＡ１８５、および不活性のウシＸａ％Ｃ，Ｅｍｏｎ博士（ＯＭＲＦ、 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　０ｋｌａｈｏｎａ）から提供されたＸａｉ−Ａ ＰＭＳＦ（Ｓｋｏｇｅｎ、　Ｗ、Ｆ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８４ ）　２５９：２３０６）による、クロモシムＸ（ｃｈｒｏｍ。 ｚｙｍ　Ｘ）　（Ｎ−メト牛ジカルボニルーＤ−ノルロイシーグリシルーアルギ ：−７−４−：−トラニリドアセテート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）の加水分解の動力学的測定を、室温で、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃ ｅｓＶｍａｘ分光光度計の９６ウエルのマイクロタイタープレート中で試験した 。４０５ｎＭの吸光度を連続的にモニターして、反応速度をその機械によって直 接測定し、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（１：１ｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ） によってプロットした。タンパク質の濃度はＥＬＩＳＡ法（実施例６）によって 測定した。酵素はすべて、０．１％ラウン清アルブミン（ＢＳＡ）、５０ｍＭ　 トリスＨＣＩ、　ｐＨ８，０，１５０１ＭＮａＣ１で適当な濃度に希釈した。　 ５０ｍＭ　）リスＨＣＩ、　ｐＨ８，０，１５０ｍＭ　ＮａＣ１および２．５＋ ｍＭ　ＣａＣｌ２中で反応は２回行った。すべての組み換えヒトＸ°因子は、Ｑ ＡＥ−セファロース（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ）を用いて精製され濃縮されたＲＸ °△０、ｒＸ’△１およびｒＸ’△３を除いて、すべてＭａｂ７１７で精製され た〈実施例６　）　（Ｓｋｏｇｅｎ、　Ｖ／、　Ｆら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩ ｌｌ（１９８４）　２５９：２３０６）。 ｒＸ、　ｒＸｉＮａｓＡ＋ｓｓ、ｒＸｉＮｓｓおよびｒＸａｉＮｓｓＡ＋　８５ を含有するベクター由来の組み換え法で生成したペプチドをラッセルクサリヘビ 毒とともに５分間予備インキニベーションを行って処理して、これらをＸａ型ま たはＸａｉ型に変換した。ｒＸ’△０．　ｒＸ’△ｉ、ｒＸ’Δ２およびｒＸ’ △３含有のベクター由来のペプチドは、この方法では処理されなかった。 図７は、天然のヒ＋−Ｘ因子およびＸａ因子と組み換えヒトｒＸおよびｒＸ’由 来の活性化型とを比較するラインウィーバーーバークブロノトである。図７３は ヒトＸ；図７ｂはヒトｘａ；図７ｃはヒトｒＸ（ラッセルクサリヘビ毒のプロテ アーゼで処理した）；図７ｄはヒトｒＸ’（プロテアーゼで処理しなかった）で ある。 表２は、ＫｃａｔとＫｍの値について、組み換え法で生成したヒトＸ因子類と、 Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、から供給さ れた天然のヒ）Ｘ因子およびＸａ因子との比較を示す。 （以下余白） 表」− Ｘａ　コロ７　１８４　１９９６　Ｘ　１０３ｒＸ’ΔＯＮ、Ｄ、　−− ｒＸ’Δｌ　Ｎ、Ｄ、　−− ｒＸ’Δ２　１７　１４９　１１５　Ｘ　１０コｒＸ’Δコ　Ｎ、Ｄ、　−− ｒＸｉＮ８８ＡＡ１８５Ｎ、Ｄ、　−−もちろん不活性化型はいずれも値を示さ ず；　ｒＸ’型のながのｒＸ゛Δ２だけが活性を示した。 １血史盈 ヒトＸ　Ｘａな゛びに　えヒト「ＸおよびｒＸ’のＸ　プロトロンビナーゼ　八 　の゛ Ｘ因子依存性プロトロンビナーゼ複合体の活性を、トロンビンによるクロモシム ＴＨ（ｈ　フルーグリシル−プロリル−アルギニン−４−ニトロアニリドアセテ ート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の加水分解の速度を、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ｖＩＩｌａｘ分光光度計の９６ウエルのマイク ロタイタープレート中で、室温で測定することによって決定した。４０ＳｎＭの 吸光度を連続的にモニターし、最初の１分間の反応速度を、その機械で直接測定 し、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を用いてプロットした 。反応混合物は３つずつ次の組成で作った。すなわちＥＬＩＳＡ法（実施例６） で測定された０、０５ｘ　１０−’Ｍから１．５Ｘ　１０−９Ｍの「Ｘ因子」、 ０．５×１０−８Ｍヒトプｏトｏンビン（ＳＴＡＧＯ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓ。 Ｉｎｃ、）、７．５Ｘ　１０−’ＭヒトＶａ因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、２０Ｘ　１０−８Ｍホスホコリン／ホ スホセリン７５％／２５％（ＰＣＰＳ）　（ｆ、Ｒ，Ｃｈｕｒｃｈ博士、Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｅｒｍｏｎｔにより提供）または等量のウサギ脳セフ ァリン（Ｓｉｇｍａ）　（実ｍＮ９）、０．１％ＢＳＡ　（Ｓｉｇｍａ）、０． ｌＸ１０−３ＭクロモシムＴＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、 ２５ｍＭ　）リス）ＩＣＩ　ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　Ｎａｃｌおよび５ｄ　Ｃ ａＣｌ２の組成である。 ヒトｒＸ因子およびｒＸ’因子依存性のプロトロンビナーゼ複合体の活性はＰＣ ＰＳを利用し、ヒトＸ因子およびＸａ因子依存性のプロトロンビナーゼ複合体の 活性はセファリンを利用した。ヒトＸ因子およびｒＸ因子は、ラノセルクサリヘ ビ毒（Ｈａｅｍａｔｏｌ。 ｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）とともに５分間予備インキュ ベートした。蛍光シグナルの増大によって測定した、クロモシムＴＨのトロンビ ンによる加水分解は、実験プロトコル全体を通じて通じて直線的であツタ。５９ ．２Ｘ　１０−’Ｍノ濃度（Ｄ　ｒＸｉＮ８８Ａ＋　ａｓ、１０．２Ｘ　１０− ９Ｍの濃度のｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦの場合は観察可能な速度を示さなかった。図 ８ａ〜８ｄは、ヒトＸ（図８ａ）、ヒトＸａ（図８ｂ）（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇ ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）　、組換えヒトｒＸ（プロテア ーゼで処理した後）（図８ｃ）および組換えヒトｒＸ’Δ２（プロテアーゼで処 理しなかった後）（図８ｄ）の、Ｘ因子依存性プロトロンビナーゼ複合体活性を 比較している。すべて同等に活性を有する。 支敷医ｌ 二ユ旦盤二 Ｍａｂ７１フで精製したｒＸおよびｒＸａを、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ８００７ 　イブロメーターを用い自動２段階プロトロンビン検定法で血漿凝固活性につい て検定した。酵素タンパク質の濃度はＥＬＩＳＡ法（実施例６）によって測定し 、使用する前に０．１％ＢＳＡ、　１５０ａ＋Ｍ　Ｎａｃｌで希釈した。ウシＸ 因子およびＶＩＩ因子が不足している血漿（Ｓｉｇｍａ）ならびにウサギ脳セフ ァリン（Ｓｉｇｍａ）を、メーカーの説明書にしたがって調製した。ラッセルク サリヘビ毒０．１Ｍｇ／ｍｌをヒトｘおよびｒＸの検定液に添加した。反応混合 物は、０．１＋ｉｌのＸ因子、０．１ｍｌの１５０ｍＭ　Ｎａｃｌ、　０．１ａ ＋１のセファリンおよび０１３１の２５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含有した。各濃度に ついて２回ずつ試験し、２回の実験結果の平均値を計算した。図９は、ヒトｘ、 ヒトＸａ、ヒ）ｒＸおよびヒｈ　ｒＸａの血漿凝固活性を比較しティる。計算の 結果、ヒｈｒＸは活性がヒトＸの４５％であり、ヒトｒＸａは活性がヒトＸａの ３２％であった。 実ｉｆ町」 ｒＸｉＮｓｓＡ＋ｓｓ　ヒトｒＸ°ｉ　Δ２Ｎ９８ＡＩ８５およびウシｂＸａｉ −ＡＰＭＳＦによるプロトロンビナーゼ　４　°　のヒトｒＸｉＮｓｓＡ＋ａｓ による、天然ヒトＸ因子依存性プロトロビナーゼ複合体活性の阻害、ならびにヒ トｒＸ’ｉ（Δ２）　Ｎ５ｓＡ＋ｓｓ　（ｒＸａｉ）およびウシｂＸａｉ−ＡＰ ＭＳＦ　（Ｃ，Ｅｓｍｏｎ、　ＯＭＲＦ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｏｋｌ ａｈｏｍａ）による、天然Ｘａ因子（５Ｘ　１０−９Ｍ）依存性のプロトロンビ ナーゼ複合体活性の阻害を、実施例８に詳細に述べたようにして試験した。動力 学的因子および１度形成された複合体の強度のために、ＸとＸｉおよびＸａとＸ ａｉを直接比較する必要がある。ヒトｒＸｉＮａｓＡｓ＋ｓは、Ｏ−１Ｍｇ／ｍ ｌのラッセルクサリヘビ毒とともに５分間予備インキュベートした。ヒトＸ因子 およびＸａ因子の濃度はＩＸＬＯ−９Ｍであった。 図１０は、ｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦおよびｒＸ’　ｉ　（Δ２）　Ｎ５ｓＡｔａｓ 　（ｒＸａｉ）による、ヒ）Ｘａ因子依存性プロトロンビナーゼ複合体の濃度依 存性阻害、ならびにｒＸｉＮｓｓＡ＋ｓｓによるヒトＸ因子依存性プロトロンピ ナーセ複合体の阻害を示す。ｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦによる５０％阻害は０．９Ｘ １０−９Ｍの濃度で得られ、ｒＸＭ（Δ２）　Ｎ５ｓＡ＋ｓｓによる５０％阻害 は６Ｘ１０−９Ｍの濃度で得られ、およびｒＸ　１ＮｓｓＡ＋　ａｓによる５０ ％阻害は１０．６　Ｘ　１０−’Ｍの濃度で得られた。 １血匠且 アシル　Ｘａ　の ヒト組換えＸａ（ｒＸａ）を実施例５に記載されているように調製し、ラッセル クサリヘビ毒で開裂した。ｒＸａを生理食塩水溶液（２ｕ　ｎｏｔ／２５ｍ１） に溶解し、４°Ｃで２０分間攪拌しながら、ｐ−トルオイル酸のｐ−ニトロフェ ニルエステル５μｍｏｌで処理した。 得られた反応混合物を、グリセリン／生理食塩水に対して透析し、得られた透析 液は０°Ｃで貯蔵する。 Ｆｉｇｕｒｅｌ、＋ｚｌ−Ｙ、、　ｌＥｒ１Ｆ１ｇｕｒｅ２．　ｊ４ｘｌ）ｊｌ ｌ−に’（ｒ’）Ｃ’）ｅｉ２’ｓ’已凪Ｊ旦ｊ １８−−一・・・・・−一　訃→、 ？’（５１（ＬＬＭ） Ｆ；ｇｕｒｅ　７ｂ、×＠４　フイ／ウィ−ｒ＼’−−ｔ（”−７７°口　７Ｆ １／（５１（μＭ） １／［！５１　（μＭ） Ｆｉｇｕｒｅ　７ｄ、　ｒＸａｓライどＩ−ハ’−１ｊ−クフ”−ｂＦＩＧＵＲ Ｅ　８ａ ＼□ｉ：；）□；ｉＫイ）す・ｔプロＰロ゛ル゛アー゛旬＝７”↑ｂ鋒ン右す′ ４＝。 ＦＩＧＵＲＥ　８ｂ ［Ｘａｌ　（ｎＭ） ＦＩＧＵＲＥ　８ｃ ｒＸ目シ１に今・はフ・レトＯ’ｙ　Ｃｚ’たｚ°棟右εを元ト五［「ｘｌ　（ ｎＭｌ Ｆ工ＧＵＲＥ　８ｄ Ｆ工ＧＵＲＥ　９ 人固ト衣ゴ）十エエ４突Ｔ鳴フ゛ｃＬｌ−０７１１／゛ンー珪しｈ口手火、ツ］ Ｆ工ＧＵＲＥ　１０ ［Ｐ４ｉ１＋　（ｎｍ１ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ ／／Ｃ０７Ｋ　７／１．ＯＺＮＡ　８３１８−４ＨＩ

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．図１に示す軽鎖の１−１３９位および重鎖の１−２５４位のアミノ酸配列と 少なくとも８０％の相同性を有する二本鎖Ｘａｉ因子ペプチドであって、該Ｘａ ｉ因子がプロトロンビナーゼ複合体の形成時にＸａ因子と競合することが可能で あり、そして、該Ｘａｉ因子が該複合体に含有されているときにはタンパク質が 水分解活性をもたらさない、二本鎖Ｘａｉ因子ペプチド。
2. ２．図１に示す軽鎖の１８５位の残基に相当するセリン残基が、異なるアミノ酸 で置換されているか、および／または図１に示す重鎖の８８位の残基に相当する アスパラギン酸残基が他のアミノ酸で置換されている、請求項１に記載のＸａｉ 因子。
3. ３．セリンの置換がアラニル残基で、アスパラギン酸の置換がアスパラギン残基 である、請求項２に記載のＸａｉ因子。
4. ４．タンパク質加水分解反応によってＸａｉ因子に変換し得る一本鎖前駆物質ポ リペプチドであって、該Ｘａｉ因子が図１に示す軽鎖の１−１３９位および重鎖 の１−２５４位のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、該Ｘａｉ因 子がプロトロンビナーゼ複合体の形成時にＸａ因子と競合することが可能であり 、そして、該Ｘａ因子が該複合体に含有されているときにはタンパク質加水分解 活性をもたらさない、一本鎖前駆物質ポリペプチド。
5. ５．Ｘ因子に対して生成する抗体と反応性である、請求項４に記載のポリペプチ ド前駆物質。
6. ６．図１に示す重鎖の１８５位の残基に相当するセリン残基が他のアミノ酸で置 換されているか、および／または図１に示す重鎖の８８位の残基に相当するアス パラギン酸残基が他のアミノ酸で置換されている、請求項４に記載のポリペプチ ド前駆物質。
7. ７．改変されていない型で、図１に示す軽鎖の１−１３９位のアミノ酸および重 鎖の１−２５４位のアミノ酸のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のポリペ プチド前駆物質。
8. ８．前記軽鎖および重鎖が、図１に示す活性化ペプチドと少なくとも８０％の相 同性を有するアミノ酸配列によって連結されている、請求項６に記載のポリペプ チド前駆物質。
9. ９．前記軽鎖および重鎖が、本質的にプロテアーゼ開裂部位からなるアミノ酸配 列で連結されている、請求項６に記載のポリペプチド。
10. １０．前記開裂部位がＲＫＲＲＫＲであって、前記軽鎖および重鎖が、本質的に プロテアーゼ開裂部位からなるアミノ酸配列で連結されている、請求項９に記載 のポリペプチド。
11. １１．請求項４に記載の前駆物質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
12. １２．発現系が宿主細胞にトランスフエクトし、形質転換させ、そして、該宿主 細胞を該発現に好ましい条件下で培養した時に、請求項４に記載の前駆物質ポリ ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現可能な組み換え発現ベクターであって、 該発現系が該ＤＮＡを発現させるための制御配列に作動可能に連結された、請求 項４に記載の前駆物質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する、組み換 え発現ベクター。
13. １３．請求項１２に記載の発現系で形質転換された組み換え宿主細胞。
14. １４．タンパク質過水分解反応によってＸａｉ因子に変換可能な一本鎖前駆物質 ポリペプチドの生成方法であって、該一本鎖前駆物質ポリペプチドをコードする ＤＮＡを発現させるのに好ましい条件下で請求項１３に記載の細胞を培養し、そ して 産生された該前駆物質ポリペプチドまたはそのタンパク質分解生成物を回収する ことを包含する、方法。
15. １５．動物被検体における血栓症を予防または治療するのに用いる製薬組成物で あって、血栓症を緩和するかまたは予防するのに有効な量の請求項１に記載のＸ ａｉ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成物 。
16. １６．動物被検体における炎症を予防または治療するのに用いる製薬組成物であ って、炎症を緩和するかまたは予防するのに有効な量の請求項１に記載のＸａｉ 因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成物。
17. １７．動物被検体における再狭窄を予防または治療するのに用いる製薬組成物で あって、再狭窄を緩和するかまたは予防するのに有効な量の請求項１に記載のＸ ａｉ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成物 。
18. １８．動物被検体における移植手術時の合併症の予防または治療に用いる製薬組 成物であって、移植手術時の合併症を緩和するかまたは予防するのに有効な量の 請求項１に記載のＸａｉ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含 有する、製薬組成物。
19. １９．血栓症を治療するのに有用なＸａｉ因子の調製方法であって、 請求項４に記載の前駆物質ポリペプチドを、該前駆物質を開製するのに有効な量 のプロテアーゼと接触させ、そして生成したＸａｉ因子を回収することを含有す る、方法。
20. ２０．前記プロテアーゼが、ラッセルクサリヘビ毒の抽出物中に含有されている 、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．請求項１９に記載の方法で製造されるＸａｉ因子。
22. ２２．血清中での半減期を延長するように改変されたＸａ因子であって、該改変 された型のＸａ因子が血清の存在下で活性Ｘａ因子を生成する、Ｘａ因子。
23. ２３．前記改変されたＸａ因子がアシル化Ｘａ因子である、請求項２２記載の改 変されたＸａ因子。
24. ２４．血友病の治療に用いる製薬組成物であって、請求項２２に記載の改変され たＸａ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成 物。
25. ２５．動物被検体における血栓症を予防または治療する方法であって、そのよう な治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の 有効量を投与することを包含する、方法。
26. ２６．動物被検体における炎症を予防または治療する方法であって、そのような 治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の有 効量を投与することを包含する、方法。
27. ２７．動物被検体における再狭窄を予防または治療する方法であって、そのよう な治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の 有効量を投与することを包含する、方法。
28. ２８．動物被検体における移植手術時の合併症を予防または治療する方法であっ て、そのような治療を要する被検体に、請求項１に記載のＸａｉ因子またはその 製薬組成物の有効量を投与することを包含する、方法。
29. ２９．ヒト被検体の血友病を治療する方法であって、そのような治療を要する被 検体に、該被検体における血友病の作用を相殺するのに有効な量の、改変されて 血清中での半減期を延長されたＸａ因子を投与することを包含する、方法。