JP2005511600A

JP2005511600A - Ｖｉｉ因子ポリペプチドおよびトロンボモジュリンポリペプチドを含む薬学的組成物

Info

Publication number: JP2005511600A
Application number: JP2003541877A
Authority: JP
Inventors: ロジクジアエル、ラスムス
Original assignee: ノボノルディスクヘルスケアアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2005-04-28
Also published as: EP1446151A1; WO2003039586A1

Abstract

本発明は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む組成物、並びに出血の発症を治療するためのその使用（例えば、凝固時間を減少すること、止血を増強すること又は血餅強度を増大すること）に関する。

Description

発明の分野

本発明は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。また、本発明は、出血の発症を被っている被検者を治療する又は防止するための薬物の製造のための、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの組み合わせの使用に関する。また、本発明は、被検者における出血の発症（ｂｌｅｅｄｉｎｇｅｐｉｓｏｄｅｓ）を治療するための方法に、および被検者における血餅形成（ｃｌｏｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を増強するための方法に関する。また、本発明は、これらの化合物を含むキットに関する。

発明の背景

止血は、血管壁に対する傷害後に循環血液に暴露された組織因子（ＴＦ）と、総ＦＶＩＩタンパク質の質量（ｍａｓｓ）の約１％に対応する量で循環中に存在するＦＶＩＩａとの間の複合体の形成によって開始される。この複合体は、ＴＦを有する細胞にアンカーされ、細胞表面においてＦＸをＦＸａに、およびＦＩＸをＦＩＸａに活性化する。ＦＸａは、プロトロンビンをトロンビンに活性化し、これがＦＶＩＩＩ、ＦＶ、ＦＸＩ、およびＦＸＩＩＩを活性化する。さらに、この止血における初期段階で形成される限られた量のトロンビンは、血小板をも活性化する。血小板に対するトロンビンの作用に続き、これらは形を変えて、それらの表面に電荷をもったリン脂質を露出する。この活性化された血小板の表面は、さらなるＦＸ活性化および完全なトロンビン生成のための鋳型を形成する。活性化された血小板表面において、活性化された血小板の表面上に形成されたＦＩＸａ−ＦＶＩＩｌａ複合体を経て、さらなるＦＸの活性化が生じ、次いでＦＸａは、依然として表面上でプロトロンビンをトロンビンに転換する。次いで、トロンビンは、フィブリノーゲンを、不溶性であり、かつ初期の血小板栓（ｐｌａｔｅｌｅｔｐｌｕｇ）を安定化するフィブリンに転換する。このプロセスにより、ＴＦを発現または暴露する部位に区画化、すなわち局在化させ、これにより凝固系が全身的に活性化するリスクを最小にしている。栓を形成する不溶性のフィブリンは、ＦＸＩＩＩで触媒されるフィブリン線維の架橋によってさらに安定化される。

ＦＶＩＩａは主に単鎖酵素前駆体として血漿中に存在し、これがＦＸａによって、その２本鎖の活性型のＦＶＩＩａに切断される。組換え活性型ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）は、前止血性（ｐｒｏ−ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ）の薬剤として開発されている。ｒＦＶＩＩａの投与は、迅速で高度に有効な前止血応答（ｐｒｏ−ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ）を、出血を伴う血友病被験者（該被験者は、抗体形成により凝固因子製品で治療することができない）において提供する。また、ＶＩＩ因子を欠損する出血被験者、または正常な凝固系を有するが、過剰の出血を受けている被験者は、ＦＶＩＩａでうまく治療することができる。これらの研究において、好ましくないｒＦＶＩＩａの副作用（特に血栓塞栓症の発生）には、遭遇しなかった。

余分な（Ｅｘｔｒａ）外因的に投与されたＦＶＩＩａは、活性化された血小板表面におけるトロンビンの形成を増大する。これは、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩを欠き、それゆえ完全なトロンビン形成のための最も強力な経路を欠いている血友病被検者において生じる。また、血小板数の低下または機能に欠陥がある血小板の存在下では、余分なＦＶＩＩａが、トロンビン形成を増大する。

組換えヒトＦＶＩＩａの商業的な標品は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）として販売されている。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、血友病ＡおよびＢの患者における出血の発症の治療のために指定されている。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、有効かつ信頼できる出血の発症の治療のための、市場において入手可能な唯一の組換えＦＶＩＩａである。

プロテインＣは、約６２．０００ｋＤａのビタミンＫ−依存的セリンプロテアーゼであり、止血応答のダウンレギュレーションに関与している。活性化プロテインＣは、オート−プロトロンビンＩＩ−Ａと同一である。プロテインＣは、４６１アミノ酸長の単鎖前駆物質（酵素前駆体）として、肝臓において合成される。成熟したプロテインＣは、それぞれ１５５および２６２アミノ酸長の２つのポリペプチド鎖からなる。プロテインＣは、トロンボモジュリン（ＴＭ）に結合したトロンビンにより、内皮細胞の表面で活性化される。そのコファクター（ビタミンＫ−依存的プロテインＳ）と共に、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、凝固因子ＶおよびＶＩＩＩ因子の膜結合型トロンビン活性化型（ＶａおよびＶＩＩＩａ）のタンパク分解性の分解を触媒する。この機構は、血液凝固の局所的な阻害のために重要である。

トロンボモジュリン（ＴＭ）は、内皮に局在するトロンビンの高親和性受容体である。トロンビンの特異性における劇的な変化は、そのＴＭへの結合に関連している。ＴＭ−結合は、その凝血原の特性（即ち、フィブリノーゲンを活性化する並びに血小板およびＶ、ＶＩＩＩおよびＸＩＩＩ因子を活性化する能力）を失う、しかし、プロテインＣの強力なアクチベーターである。ＴＭは、動脈、静脈、毛細管およびリンパ管（ｌｙｍｐｈａｔｉｃｖｅｓｓｅｌｓ）の内皮細胞の管表層（ｖａｓｃｕｌａｒｓｕｒｆａｃｅ）に存在する。それは血小板において、表皮の扁平上皮において、様々な培養細胞において、および内皮細胞の新生物においても低濃度で存在する。可溶型（おそらくタンパク質分解性の産物）は、ヒトの血漿において、および尿において同定されている。ＴＭは統合型膜タンパク質（ａｎｉｎｔｅｇｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ）であって、単一のポリペプチド鎖として合成される。成熟糖蛋白質は５５７アミノ酸を含有し、アポタンパク質（６０．３００ｋＤａの分子量）を生じる。トロンビンによるプロテインＣの活性化は緩徐であるが、トロンビン−ＴＭ複合体（例えば、内皮細胞の表面上で）形成は、活性化の割合において２０，０００倍以上の増加を生じる。トロンビンおよびＴＭは、高親和性を有する１．１の複合体を形成する。

プロテインＳは、ビタミンＫ−依存的な血漿タンパク質であり、肝臓において、内皮細胞において、および精巣のライディッヒ細胞において合成される。プロテインＳは、ＶａおよびＶＩＩＩａ因子の分解において、ＡＰＣに対するコファクターとして機能するが、その作用機序は未知である。ビタミンＫ−依存的なタンパク質のなかで、プロテインＳは、ネガティブに荷電したリン脂質に対して最大の親和性を有しており、そしてこのタイプのリン脂質に対するＡＰＣの親和性を増大させることが示された。プロテインＳおよびＡＰＣは、脂質の表面で１：１の複合体を形成するように思われる。また、プロテインＳおよびＡＰＣは、血小板、血小板微粒子（ｐｌａｔｅｌｅｔｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の表面で、および内皮細胞で相互作用する。ＡＰＣの存在下、プロテインＳ結合は１０倍以上に増加する。プロテインＳが補体系の古典経路の制御にも関与していることが、ヒト血漿におけるプロテインＳの約６０％がＣ４ｂ結合タンパク質との高分子量で非共有結合性の複合体において発生するとの事実に基づいて提唱されている。遊離型のプロテインＳのみがＡＰＣコファクターとして機能する。

プロテインＣ抗凝血系は、インビボの血液凝固の制御に関して最も重要なものである。この事項は、プロテインＣまたはプロテインＳのホモ接合欠損（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）の個体に影響する重篤な血栓塞栓性疾患（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃｄｉｓｅａｓｅ）によって、また、何れかのタンパク質のヘテロ接合欠損の人々における血栓症の高発生率によって実証される。

手術または重大な外傷に付随して過度に出血し、輸血の必要がある被検者では、いかなる出血も受けていない人々よりも多くの合併症を発症することが周知である。しかし、また、ヒトの血液または血液製剤の投与を必要とする中等度の出血（凝固欠陥の治療のための血小板、白血球、血漿に由来する濃縮物、その他）では、ヒト・ウイルス（肝炎、ＨＩＶ、パルボウイルス、およびその他の現在未知のウイルス）を伝達するリスクに関連した合併症を引き起こすかもしれない。大量の輸血を必要とする大量の出血は、肺および腎機能の障害を含む多臓器不全の発症を引き起こすかもしれない。一旦被検者がこれらの深刻な合併症を発病すると、多くのサイトカインおよび炎症反応に関与するイベントのカスケードが開始され、どのような治療も極めて困難となり、残念なことにうまくいかないことが多い。したがって、手術における、並びに主要な組織損傷の治療における主な目標は、出血を避けること、または最小にすることである。このような出血を避けるため、または最小にするために、線維素溶解酵素によって容易に溶解されない安定な、および堅固な止血栓（ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃｐｌｕｇｓ）の形成を確実にすることが重要である。さらに、このような栓または血餅の迅速かつ効率的な形成を確実にすることは、重要である。

今日、外傷被害者および手術に付随して出血している被験者を含む、出血の発症を受けている被験者は、いくらかのＦＶＩＩａの注射または輸液によって治療されることが多く、ＦＶＩＩａの短い半減期（２．５時間）のため、特定のレベルの止血能を維持するために二回以上の投与が必要とされる。より迅速な出血の阻止は、このような被検者に対して重要な利益となろう。そうなれば、出血を止めて、止血し続けるために必要な投与数が減少するであろう。

欧州特許第２２５，１６０号（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）は、凝固因子の欠陥または凝固因子阻害剤によって引き起こされるものではない出血障害の治療のための、ＦＶＩＩａ組成物および方法に関する。

欧州特許第８２，１８２号（ＢａｘｔｅｒＴｒａｖｅｎｏｌＬａｂ．）は、被検者において、血液凝固因子の欠陥に、または血液凝固因子に対する阻害剤の効果に対抗する際に使用するためのＶＩＩａ因子の組成物に関する。

国際特許公開番号ＷＯ９３／０６８５５（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩａの局所適用に関する。

国際特許公開番号ＷＯ８８／０９８１１は、血栓発症（ｔｈｒｏｍｂｉｃｅｐｉｓｏｄｅｓ）治療または防止のための、組換え型ヒトトロンボモジュリンおよび方法に関する。

当該技術分野において、出血の発症が、手術、外傷、または組織損傷のその他の形態；多回輸血された被検者における凝固障害を含む凝固障害の誘導；肝機能の減少（「肝疾患」）を含む、先天性または後天性の凝固または出血の障害；血小板機能の欠陥または血小板数の減少；凝固に必須の「化合物」（たとえば、血小板またはフォンビルブラント因子タンパク質）の欠乏または異常；線維素溶解の増大；抗凝固療法または血栓溶解療法；または幹細胞移植による被験者を含む、出血の発症を受けている被検者の治療を改善する必要性がなお存在する。

当該技術分野において、改善された、信頼のおける、かつ広く適用できる、凝固を増強するか、安定な止血栓の形成を確実にするもしくは増強するか、または治療される被検者のための便宜を増強するか、または被験者、特にトロンビン生成が損なわれている被験者における完全な止血を達成する方法が依然として必要とされている。また、出血の阻止（ｂｌｅｅｄｉｎｇａｒｒｅｓｔ）に対する時間が短縮された方法の必要性が存在する。

発明の概要

本発明の１つの目的は、出血の発症および凝固障害の治療または予防において有効に使用することができる組成物を提供することである。

本発明の第２の目的は、出血の発症の治療もしくは予防に、または凝血原として、有効に使用することができる単一の単位剤形の組成物を提供することである。本発明のもう一つの目的は、相乗効果を示す組成物、治療方法、またはキットを提供することである。

本発明さらなる目的は、凝固系の全身的な高レベルの活性化などの、実質的な副作用を示さない組成物、治療方法、またはキットを提供することである。

本発明のその他の目的は、本明細書を読むことによって明らかとなるであろう。

第１の側面において、本発明は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。

第２の側面において、本発明は、出血の発症のための治療剤を含むパーツのキット（ａｋｉｔｏｆｐａｒｔｓ）であって、

ａ）第１の単位剤形の、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の有効な量、および薬学的に許容されるキャリア；
ｂ）第２の単位剤形の、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の有効な量、および薬学的に許容されるキャリア；および
ｃ）前記第１および第２の単位剤形を含むための容器手段、を含むキットを提供する。

第３の側面において、本発明は、被検者の出血の発症を治療するための薬物の製造のための、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドと組み合わせたＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの使用を提供する。さらなる側面において、本発明は、被検者の出血の発症を治療するための薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物の使用を提供する。

その異なる態様において、薬物は、完全な止血を得るために必要な時間を減少するため、止血を維持するために必要な時間を減少するため、凝固時間を減少するため、血餅溶解時間（ｃｌｏｔｌｙｓｉｓｔｉｍｅ）を延長するため、および血餅強度（ｃｌｏｔｓｔｒｅｎｇｔｈ）を増大するためのものである。

異なる態様において、薬物は、手術、外傷、または組織損傷のその他の形態；多回輸血された被検者における凝固障害を含む凝固障害；肝機能の減少（「肝疾患」）を含む、先天性または後天性の凝固または出血の障害；血小板機能の欠陥または血小板数の減少；必須凝固「化合物」（たとえば、血小板またはフォンビルブラント因子タンパク質）の欠乏または異常；線維素溶解の増大；抗凝固療法または血栓溶解療法；または幹細胞移植による出血の発症を受けている被検者を治療するためのものである。一連の態様において、出血は、脳、内耳領域、目、肝臓、肺、腫瘍組織、消化管などの器官において生じ；一連のもう一つの態様において、これは、出血性胃炎およびおびただしい子宮出血におけるものなどの、びまん性出血（ｄｉｆｆｕｓｅｂｌｅｅｄｉｎｇ）である。一連のもう一つの態様において、出血の発症は、急性の関節出血（ｈａｅｍａｒｔｈｒｏｓｅｓ）（関節の出血）、慢性血友病の関節症、血腫（たとえば筋肉、後腹膜（ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、舌下、および咽頭後方（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）のもの）、その他の組織における出血、血尿（腎尿管（ｒｅｎａｌｔｒａｃｔ）からの出血）、大脳出血、手術（たとえば、肝切除）、抜歯、および胃腸出血（たとえば、ＵＧＩの出血）を有する被験者における手術または外傷と関連した出血である。１つの態様において、薬物は、被検者における、外傷、または手術、または血小板の数もしくは活性の低下による出血の発症を治療するためのものである。

さらなる側面において、本発明は、被検者における出血の発症を治療するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に出血を治療するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、被検者における凝固時間を減少するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に凝固時間を減少するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は被検者における止血を増強する方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に止血を増強するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、被検者における血餅溶解時間を延長するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に血餅溶解時間を延長するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、被検者における血餅強度を増大するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に血餅強度を増大するために有効である方法を提供する。

本方法の１つの一連の態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、単一の単位剤形で投与される。

もう一つの一連の態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を含む第１の単位剤形およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む第２の単位剤形の形態で投与される。その一連の態様において、第１の単位剤形および前記第２の単位剤形は、１５分を超えて時間を離して投与されない。

さらなる側面において、本発明は、出血の発症のための治療剤を含むキットであって、

ｄ）ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの有効な量およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの有効な量並びに薬剤的に許容されるキャリアの単一の単位剤形；および、
ｅ）前記単一の単位剤形を含むための容器手段、を含むキットを提供する。

本発明の１つの一連の態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである。本発明の１つの一連の態様において、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子アミノ酸配列変異体である。１つの態様において、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と天然のヒトＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比は、本明細書に記載されたとおりの「インビトロ加水分解アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１．２５である。

本発明の１つの一連の態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子である。１つの態様において前記ＶＩＩ因子は、ヒトＶＩＩ因子である。１つの態様において、前記ＶＩＩ因子は、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、マウスまたはサケのＶＩＩ因子である。もう一つの態様において、前記ＶＩＩ因子は、組換えによって作製される。もう１つの態様において、前記ＶＩＩ因子は、血漿に由来する。好ましい態様において、前記ＶＩＩ因子は、組換えヒトＶＩＩ因子である。本発明の１つの一連の態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、その活性型である。本発明の１つの好ましい態様において、前記ＶＩＩ因子は、組換えヒトＶＩＩａ因子である。

一連の態様において、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、トロンボモジュリン関連ポリペプチドである。１つの態様において、前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドは、トロンボモジュリンアミノ酸配列の変異体である。１つの態様において、前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドの活性と天然のヒト血漿トロンボモジュリン（野生型トロンボモジュリン）の活性との間の比は、本発明に記載されたとおりの「トロンボモジュリンアッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１．２５である。１つの態様において、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、トロンボモジュリンポリペプチドである。１つの態様において、トロンボモジュリンは、ヒトトロンボモジュリンである。１つの態様において、トロンボモジュリンは、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、マウスまたはサケのトロンボモジュリンである。好ましい態様において、前記トロンボモジュリンは、組換えによって作製される。もう１つの態様において、トロンボモジュリンは、血漿に由来する。好ましい態様において、トロンボモジュリンは、組換えヒトトロンボモジュリンである。１つの態様において、前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドは、トロンボモジュリンの断片である。１つの態様において、前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドは、ハイブリッドトロンボモジュリンポリペプチド、たとえばブタ／ヒトのハイブリッドである。

１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、約１００：１および約１：１００（ｗ／ｗＶＩＩ因子：トロンボモジュリン）の間の質量比で存在する。

１つの態様において、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型ＶＩＩ因子と比較して、２０アミノ酸以下が、置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸配列変異体である（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）。もう一つの態様において、ＶＩＩ因子変異体は、１５アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入され；その他の態様において、ＶＩＩ因子変異体は、野生型のＶＩＩ因子と比較して８、６、５、または３アミノ酸など、１０アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入されている。１つの態様において、ＶＩＩ因子変異体は、以下の一覧から選択される：Ｌ３０５Ｖ− ＦＶｌｌａ，Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶｌｌａ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶｌｌａ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶｌｌａ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶｌｌａ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶｌｌａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶｌｌａ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶｌｌａ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶｌｌａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶｌｌａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶｌｌａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶｌｌａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶｌｌａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶｌｌａ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、およびＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ。

さらなる態様において、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、天然のヒト凝固ＶＩＩａ因子と比較して、組織因子非依存的な活性が増大されている。もう１つの態様において、増大された活性は、基質特異性の変化を伴わない。本発明のもう１つの態様において、組織因子に対するＶＩＩ因子関連ポリペプチドの結合は損なわれず、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは組織因子に結合したときに、少なくとも野生型のＶＩＩａ因子の活性を有する。

好ましい態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、組換えヒトＶＩＩａ因子および組換えヒトトロンボモジュリンである。

１つの態様において、哺乳類の血液において凝固時間が減少される。もう１つの態様において、哺乳類の血液において止血が増強される。もう１つの態様において、哺乳類の血液において血餅溶解時間が延長される。もう１つの態様において、哺乳類の血液において血餅強度が増大される。１つの態様において、哺乳類の血液は、ヒト血液である。もう１つの態様において、哺乳類の血液は、正常なヒト血液であり；１つの態様において、血液は、トロンビン生成が損なわれている被検者からの血液である。１つの態様において、血液は、１つまたは複数の凝固因子の欠損を有する被検者からの血液であり；もう１つの態様において、血液は、１つまたは複数の凝固因子に対する阻害剤を有する被検者からの血液であり；１つの態様において、血液は、フィブリノーゲンの濃度が低下された被検者からのものであり；１つの態様において、血液は、トロンボモジュリンを欠損したヒトの血液である。１つの一連の態様において、血液は、血漿（ｐｌａｓｍａ）である。

本発明の１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、組成物に含まれる唯一の止血性薬剤である。もう１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、組成物に含まれる唯一の活性な止血性薬剤である。もう１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、被検者に投与される唯一の凝固因子である。本発明の１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、患者に投与される唯一の活性薬剤である。１つの態様において、組成物は、実質的にトロンビンまたはプロトロンビンを含まない；もう１つの態様において、組成物は、実質的にＦＸを含まない；もう１つの態様において、組成物は、実質的にＦＸａを含まない。

もう１つの態様において、薬学的組成物は、静脈内投与、好ましくは注射または注入、特に注射のために処方される。１つの態様において、組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤またはキャリアを含む。

本発明の１つの態様において、組成物は単一の単位剤形であり、該単一の単位剤形は両方の凝固因子を含む。本発明の１つの態様において、組成物は、第１の単位剤形としてＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を、および第２の単位剤形としてトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含み、かつ前記第１および第２の単位剤形を含むための容器手段を含むパーツのキットの形態である。１つの態様において、組成物またはキットは、適用できるものとして（ａｓａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）、組成物または分離した成分のそれぞれを投与するための説明書をさらに含む。

本発明の１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、単一剤形で投与される。本発明の１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を含む第１の単位剤形およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む第２の単位剤形の形態で投与される。

本発明の１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、同時に投与される。もう１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、逐次に投与される。１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、１５分、好ましくは１０分、より好ましくは５分、より好ましくは２分を超えて時間を離して投与されない。１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、２時間まで、好ましくは１〜２時間、より好ましくは１時間まで、より好ましくは３０分〜１時間、より好ましくは３０分まで、より好ましくは１５〜３０分まで時間を離して投与される。

１つの態様において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの有効な量は、約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日量（７０ｋｇの被験者）である。１つの態様において、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の有効な量は、約０．０１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日（７０ｋｇの被験者）である。

本発明の１つの態様において、薬学的組成物は、単一の単位剤形であり、かつ本質的にＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、並びにトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品、並びに薬学的に許容されるキャリア、安定剤、界面活性剤、中性塩、抗酸化剤、保存剤、およびプロテアーゼ阻害剤のリストから選択される１つまたは複数の成分からなる。

本発明のもう１つの態様において、薬学的組成物は、本質的にＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品並びに薬学的に許容されるキャリア、安定剤、界面活性剤、中性塩、抗酸化剤、保存剤、およびプロテアーゼ阻害剤のリストから選択される１つまたは複数の成分からなる第１の単位剤形と、本質的にトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品並びに薬学的に許容されるキャリア、安定剤、界面活性剤、中性塩、抗酸化剤、保存剤、およびプロテアーゼ阻害剤のリストから選択される１つまたは複数の成分からなる第２の単位剤形と、を有するパーツのキットの形態である。

さらなる態様において、被検者はヒトであり；もう１つの態様において、被検者は、トロンビン生成が損なわれており；１つの態様において、被検者は、フィブリノーゲンの血漿濃度が低下しており（たとえば、多回輸血された被検者）；１つの態様において、被検者は、ＶＩＩＩ因子またはＦＩＸの血漿濃度が低下している。

もう一つの側面において、本発明は、唯一の凝固タンパク質としてＶＩＩ因子で被検者を治療したときと比較して、ＶＩＩ因子応答性症候群をわずらっている被検者における止血を増強する方法に関し、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に止血を増強するために有効な方法である。

もう一つの側面において、本発明は、被検者のトロンビン形成を増強するための方法に関し、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共にトロンビン形成を増強するために有効な方法である。

もう一つの側面において、本発明は、唯一の凝固タンパク質としてＶＩＩ因子で被検者を治療したときと比較して、ＶＩＩ因子応答性症候群をわずらっている被検者におけるトロンビン形成を増強する方法に関し、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共にトロンビン形成を増強するために有効な方法である。

もう一つの側面において、本発明は、唯一の凝固因子タンパク質としてＶＩＩ因子を被検者に投与したときに必要な投与数と比較して、ＶＩＩ因子応答性症候群をわずらっている被検者における止血を達成するために必要な凝固因子タンパク質の投与数を減少するための方法に関し、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に凝固因子タンパク質の投与数を減少するために有効な方法である。

もう一つの側面において、本発明は、ＶＩＩ因子応答性症候群をわずらっている被検者における出血を治療する方法に関し、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に出血の治療に有効な方法である。

１つの態様において、ＶＩＩ因子は、ヒト組換えＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）である。もう一つの態様において、ｒＦＶＩＩａは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）である。
もう一つの側面において、本発明は、哺乳類の血漿においてフィブリン血餅形成を増強するための薬物の製造のための、トロンボモジュリンと組み合わせたＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの使用に関する。

もう一つの側面において、本発明は、被検者におけるフィブリン血餅形成を増強する方法に関し、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に出血の治療に有効な方法である。

発明の詳細な記載

手術または重大な外傷に関連して過度に出血し、輸血の必要がある被検者では、いかなる出血も経験していない人々よりも多くの合併症を発病する。しかし、彼らが人血または血液製剤（凝固欠陥の治療のための血小板、白血球、血漿に由来する濃縮物、その他）の投与を必要とする場合は、これによりヒト・ウイルス（例えば、肝炎、ＨＩＶ、パルボウイルス、または他の現在未知のウイルス）並びに非ウイルス病原を伝達するリスクがあるので、中等度の出血でも合併症を引き起こすかもしれない。大量の輸血を必要とする大量の出血は、肺および腎機能の障害を含む多臓器不全の発症を引き起こすかもしれない。一旦被検者がこれらの深刻な合併症を発病すると、多くのサイトカインおよび炎症反応に関与するイベントのカスケードが開始され、どのような治療も極めて困難となり、残念なことにうまくいかないことが多い。大部分の血液の損失を経験している患者は、臨床的に不安定になる。このような患者は、心房細動（ａｔｒｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）を受けるリスクがあり、これにより心臓活動の致命的な停止；腎機能障害；または、肺において流体血管外遊走（いわゆる「湿性肺（ｗｅｔｌｕｎｇｓ）」またはＡＲＤＳ）を生じる可能性もある。したがって、手術における、並びに主要な組織損傷の治療における主な目標は、出血を避けること、または最小にすることである。このような望まれない出血を避けるため、または最小にするために、線維素溶解酵素によって容易に溶解されない安定な、および固体の止血栓の形成を確実にすることが重要である。さらに、このような栓または血餅の迅速かつ効率的な形成を確実にすることは、重要である。

また、血小板減少症（血小板の数または活性が低下された）の被検者は、トロンビン生成が損なわれており、並びにフィブリン栓の安定化が不完全であることにより、中途で溶解されやすい止血栓を生じる。さらに、重大な外傷または器官損傷を受けた被検者は、結果として、頻繁に輸血が行われ、血小板数の低下、並びにフィブリノーゲン、ＶＩＩＩ因子、およびその他の凝固タンパク質のレベルが低下することが多い。これらの被検者は、トロンビン生成の障害（または、低下）を経験する。したがって、これらの被検者では、止血に欠陥があるか、またはほとんど効果がなく、タンパク質分解酵素によって容易に、および中途で溶解されるフィブリン栓を形成することになり、そのうえこのような酵素は、広範な外傷および器官損傷によって特徴づけられる局面で広範囲に放出される。

また、組織の出血により、血腫（ｈａｅｍａｔｏｍａｓ）を形成する可能性もある。血腫の大きさ（特に、頭蓋内および脊髄内における）は、神経機能の損失の程度、リハビリの困難さ、および／またはリハビリ後の神経機能の永久的な減失（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ）の重篤さおよび程度と密接に関連がある。最も重篤な血腫の結果は、これらが脳に位置するときに見られ、これらにより、患者の死亡さえも引き起こすであろう。

したがって、出血の治療における主要な目的は、最短時間で止血を行い、従って、失血を最小にしておくことである。

したがって、本発明は、このような治療を必要とする被検者における出血の発症の治療のための治療の、有益な組成物、使用、および方法を提供する。前記組成物、使用、および方法は、止血が行われる前に失血を少なくすること、手術の際に必要とされる血液を少なくすること、止血が行われるまで血圧を許容されるレベルに保持すること、血圧のより迅速な安定化、治療された患者の回復時間を短縮すること、治療された患者のリハビリ時間を短くすること、脳血腫を含む血腫の形成の減少または血腫の形成を小さくすること、迅速な出血の抑止、出血の停止および止血の維持のために必要な投与数の減少などの有益な効果に関与し得る。

トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品と組み合わせて、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、たとえばＶＩＩａ因子の標品を投与することにより、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンのいずれかが単独で投与されるときの凝固時間、血餅の堅固さ、および耐性と比較して、凝固時間の短縮、堅固な血餅、および線維素溶解に対する耐性の増大がもたらされる。

また、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品と組み合わせて、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、たとえばＶＩＩａ因子の標品を投与することにより、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンのいずれかが単独で投与されるときの状況と比較して、出血の抑止を行うための時間の減少および止血を維持するための投与数の減少がもたらされる。本発明は、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品およびＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の同時または逐次の投薬における有益な効果を提供する。本発明に従った薬学的組成物は、単一の組成物の形態であってもよく、または多成分性のキット（パーツのキット）の形態であってもよい。本発明に従った組成物は、ヒトなどの霊長類を含む哺乳類において、治療的および予防的な凝血原として有用である。本発明は、ヒトを含む被検者における出血の発症を治療する（予防的に治療することまたは防止することを含む）ための方法をさらに提供する。

第１または第２または第３の、その他の単位用量がこの明細書の全体にわたって言及されるが、これは、投与の好ましい順序を示すのではなく、単に便宜上の目的でなされるだけである。

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の組み合わせは、短い凝固時間、止血栓の迅速な形成、および安定な止血栓の形成を確実にする有利な製品である。ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの組み合わせは、堅固な、安定な、かつ迅速に形成される止血栓の形成を確実にする有利な製品であることが、本発明の発明者によって見いだされた。

本発明の発明者は、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンの組み合わせが、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンのいずれか単独よりも効率的に血餅の堅固さを増大することができることを示した。また、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンの組み合わせが、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンのいずれか単独よりも効率的に正常なヒト血漿におけるインビトロでの血餅溶解時間を引き延ばすことができることが示された。また、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンの組み合わせが、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンのいずれか単独よりも効率的に正常なヒト血漿における半分の血餅溶解時間（ｈａｌｆ−ｃｌｏｔｌｙｓｉｓｔｉｍｅ）を引き延ばすことができることが示された。また、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンの組み合わせが、ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリンのいずれか単独よりも効率的に正常なヒト血漿における線維素溶解、特にｔＰＡを媒介した線維素溶解から血餅を保護できることが示された。したがって、凝固を増強することにより、被験者の出血のより有効な治療を得ることができる。

理論によって義務づけられることは望まないが、完全なトロンビン生成は、堅固で安定な止血栓を形成するために、またその結果、止血の維持のために必要であると考えられている。このような栓のフィブリン構造は、形成されるトロンビンの量および初期のトロンビン生成速度の両方に依存的である。障害性のトロンビン生成の存在下では、非常に浸透性の多孔性フィブリン栓が形成されている。フィブリン表面に存在する線維素溶解性酵素は、通常容易にこのようなフィブリン栓を溶解する。また、安定なフィブリン栓の形成は、トロンビンによって活性化されるＸＩＩＩａ因子の存在に依存的であり、したがって完全なトロンビン生成にも依存的である。さらに、最近記載されたトロンビンで活性化可能な線維素溶解阻害剤のＴＡＦＩは、その活性化のためにむしろ多量のトロンビンを必要とする。したがって、完全に十分ではないトロンビン形成の存在下では、ＴＡＦＩは活性化されず、通常の繊維素溶解活性により通常の分解されるものよりも簡易な止血栓の形成を生じる。血小板数が低下した状況において（血小板減少症）、外因性の余分（ｅｘｔｒａ）のＶＩＩａ因子の投与によって、より迅速なトロンビン生成が開始される。しかし、総トロンビン生成は、高濃度のＶＩＩａ因子によってさえ正常化されない。

フィブリノーゲンの血漿濃度が低下した被検者（多くの外傷または広範な手術の結果として多回輸血された被検者）では、完全なトロンビン活性化は起こらない。次いで、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンの組み合わせの投与によって、より有効な止血が達成される。

血小板減少症の被検者は、障害性トロンビン生成並びにフィブリン栓の安定化の欠陥がもたらされ、中途で溶解されやすい止血栓を生じる。さらに、主要な外傷または組織損傷を受けた被検者は、結果として、頻繁に輸血が行われており、血小板数が低下し、同様にフィブリノーゲン、ＶＩＩＩ因子、およびその他の凝固タンパク質のレベルも低下してしまう。これらの被検者は、トロンビン生成の障害（または、低下）を経験する。加えて、これらのフィブリノーゲン・レベルの低下は、ネガティブにＸＩＩＩ因子の活性化に干渉する。したがって、これらの被検者は、止血に欠損があるか、またはあまり効率的でなく、タンパク質分解酵素によって、加えてこのような酵素は、広範な外傷および器官損傷によって特徴づけられる状況で広範囲に放出されることによって、容易にかつ中途で溶解されるフィブリン栓の形成を引き起こす。

被検者の止血を維持するための完全な能力を有する完全に安定化された栓の形成を容易にするために、本発明の組成物が投与される。この組成物は、特に血小板数が低下した被検者において、並びにフィブリノーゲンおよび／またはその他の凝固タンパク質の血漿レベルが低下した被検者において、有益である。

ＶＩＩ因子ポリペプチド：
本発明を実施する際に、出血を防止または治療するために有効なる任意のＶＩＩ因子ポリペプチドを使用してもよい。これは、血液もしくは血漿に由来するか、または組換え手段によって産生されたＶＩＩ因子ポリペプチドを含む。

本発明は、たとえば米国特許第４，７８４，９５０号（野生型ヒトＶＩＩ因子）に開示されたアミノ酸配列を有するものなどのＶＩＩ因子ポリペプチドを含む。一部の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、たとえば米国特許第４，７８４，９５０号（野生型ＶＩＩ因子）に開示されたとおりのヒトＶＩＩａ因子である。一連の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、および最も好ましくは少なくとも約７０％のヒトＶＩＩａ因子の生物比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ）を示すポリペプチドを含む。一連の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも約１２０％、より好ましくは少なくとも約１４０％、および最も好ましくは少なくとも約１６０％のヒトＶＩＩａ因子の特異的な生物活性を示すポリペプチドを含む。一連の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されたとおりの野生型ＶＩＩ因子の配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％の一致性を示すポリペプチドを含む。

本明細書において使用される、「ＶＩＩ因子ポリペプチド」は、ＶＩＩ因子、並びにＶＩＩ因子関連ポリペプチドを含むが、限定されない。「ＶＩＩ因子」の用語は、野生型ヒトＶＩＩ因子（米国特許第４，７８４，９５０号に開示されたもの）、並びに例えばウシ、ブタ、イヌ、マウス、およびサケＶＩＩ因子などのその他の種に由来する野生型ＶＩＩ因子のアミノ酸配列１−４０６を有するポリペプチドを含むことが企図されるが、限定されず、前記ＶＩＩ因子は、血液もしくは血漿に由来するか、または組換手段によって産生される。これは、１つの個体から別の個体へと存続し且つ出現するであろう、ＶＩＩ因子の天然の対立形質の変異をさらに含む。また、糖鎖形成またはその他のポスト−翻訳修飾の程度および部位は、選ばれた宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して異なってもよい。また、「ＶＩＩ因子」の用語は、ＶＩＩ因子ポリペプチドの未切断（酵素前駆体）の形態、並びにタンパク質分解性にプロセスされてこれらのそれぞれの生理活性の形態に産生された、ＶＩＩａ因子と称されるものを含むことが企図される。典型的には、ＶＩＩ因子は、残基１５２および１５３の間で切断されてＶＩＩａ因子を産生する。

「ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」は、ヒトＶＩＩ因子と比較して化学的に修飾されたか、および／またはヒトＶＩＩ因子と比較して１つまたは複数のアミノ酸配列の変化を含む（すなわちＶＩＩ因子変異体）か、および／またはヒトＶＩＩ因子と比較して切断されたアミノ酸配列を含む（すなわちＶＩＩ因子断片）、いずれかのＶＩＩ因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。このようなＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ヒトＶＩＩ因子と比較して、安定度、リン脂質結合、変更された比活性などを含む異なる特性を示してもよい。「ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」の用語は、未切断（酵素前駆体）形態のポリペプチド、並びにタンパク質分解性にプロセスされてこれらのそれぞれの生理活性の形態に産生された「ＶＩＩａ関連ポリペプチド」または「活性化されたＶＩＩ因子関連ポリペプチド」と称されるものを含むことが企図される。

本明細書に使用されるものとして、「ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」は、野生型のヒトＶＩＩ因子と比較して、実質的に同等または改善された生物活性を示すポリペプチド、並びに野生型ヒトＶＩＩａ因子の活性と比較して、ＶＩＩａ因子生物活性が実質的に修飾され、または減少したポリペプチドを含むが、限定されない。これらのポリペプチドは、化学的に修飾されたＶＩＩ因子またはＶＩＩａ因子および特定のアミノ酸配列の変化が導入されて、ポリペプチドの生理活性が修飾されまたは崩壊されたＶＩＩ因子変異体を含むが、これらに限定されない。

更に、わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、たとえばＮ末端アミノ酸の欠失もしくは付加を含む修飾されたＮ末端を有するポリペプチド、および／またはヒトＶＩＩａ因子と比較して化学的に修飾されたポリペプチドを含む。

ＶＩＩ因子の変異体を含むＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、実質的に野生型ＶＩＩ因子と同等もしくは優れた生理活性を示すか、または代わりに、野生型ＶＩＩ因子と比較して実質的に修飾され、もしくは減少した生理活性を示すかどうかにかかわらず、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型ＶＩＩ因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

変異体を含むＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはＴＦ結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１３０％を示すものを含む。

変異体を含むＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同等または改善された生物活性を有し、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはＴＦ結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１１０％、より好ましくは少なくとも約１２０％、およびもっとも好ましくは少なくとも約１３０％を示すものを含む。

変異体を含むＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型ＶＩＩａ因子と比較して実質的に減少した生物活性を有し、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはＴＦ結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、および最も好ましくは約１％未満を示すものである。野生型ＶＩＩ因子と比較して実質的に修飾された生物活性を有するＶＩＩ因子変異体は、ＴＦ非依存性のＸ因子タンパク分解活性を示すＶＩＩ因子変異体、およびＴＦに結合するが、Ｘ因子を切断しないものを含むが、これらに限定されない。

一部の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、特に変異体であって、ここで「インビトロ加水分解アッセイ法」（下記の「アッセイ法」を参照されたい）で試験したときに、前記ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然のヒトＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比は少なくとも約１．２５であり；その他の態様において、比は、少なくとも約２．０であり；さらなる態様において、比は、少なくとも約４．０である。本発明の一部の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、特に変異体であって、ここで「インビトロタンパク質分解アッセイ法」（下記の「アッセイ法」を参照されたい）で試験したときに、前記ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然のヒトＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比が少なくとも約１．２５であり；その他の態様において、比は、少なくとも約２．０であり；さらなる態様において、比は、少なくとも約４．０であり；さらなる態様において、比は、少なくとも約８．０である。

一部の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、たとえば米国特許第４，７８４，９５０号（野生型ＶＩＩ因子）に開示されたとおりのヒトＶＩＩ因子である。いくつかの態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒトＶＩＩａ因子である。一連の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒトＶＩＩａ因子の生物比活性の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、および最も好ましくは少なくとも約７０％を示すＶＩＩ因子関連ポリペプチドである。一部の態様において、ＶＩＩ因子ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型ＶＩＩ因子の配列と異なるアミノ酸配列を有する。

野性型ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同等または優れた生物活性を有するＶＩＩ因子の変異体の非限定の例は、デンマーク特許出願番号第ＰＡ２０００００７３４およびＰＡ２００００１３６０（ＷＯ０１／８３７２５に対応する）およびＰＡ２００００１３６１（ＷＯ０２／２２７７６に対応する）号に記載されているものを含むが、これらに限定されない。野性型ＶＩＩ因子と実質的に同等または改善された生物活性を有するＶＩＩ因子変異体の非限定の例は、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩ（ｌｉｎｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１８２−１９２，１９９８）；Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ，Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、およびＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ；米国特許第５，５８０，５６０号に開示したとおりの、増大されたタンパク質分解性の安定度を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０および２９１の間または残基３１５および３１６の間でタンパク質分解性に切断されたＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：５０１−５０５，１９９５）；並びにＶＩＩａ因子の酸化型（Ｋｏｒｎｆｅｌｔら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６３：４３−５４，１９９９）を含む。野生型ＶＩＩ因子と比較して、実質的に減少したまたは修飾された生物活性を有するＶＩＩ因子変異体の非限定の例は、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６６−７２，１９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：５１５−５２０，１９９８）、およびＧｌａドメインを欠いているＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｓ．３１７：２４５−２４９，１９９３）を含む。化学的に修飾されたＶＩＩ因子ポリペプチドおよび配列変異体の非限定の例は、たとえば米国特許第５，９９７，８６４号に記載されている。

血液凝固におけるＶＩＩａ因子の生物活性は、（ｉ）これが組織因子（ＴＦ）に結合する能力、および（ｉｉ）ＩＸ因子またはＸ因子のタンパク質分解性の切断を触媒して活性化されたＩＸ因子またはＸ因子（それぞれＩＸａ因子またはＸａ因子）を産生する能力に由来する。

本発明の目的のために、ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性（「ＶＩＩ因子生物活性」）は、たとえば米国特許第５，９９７，８６４号に記載されているとおり、ＶＩＩ因子が欠損した血漿およびトロンボプラスチンを使用して、標品が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量してもよいこのアッセイ法において、生物活性は、対象試料と比較した凝固時間の減少として現され、１単位／ｍｌのＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準的と比べることにより「ＶＩＩ因子単位」に換算される。あるいは、ＶＩＩａ因子生物活性は、

（ｉ）脂質膜およびＸ因子に包埋されたＴＦを含む系において、ＶＩＩａ因子またはＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが活性化されたＸ因子（Ｘａ因子）を産生する能力を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；
（ｉｉ）水性系におけるＸ因子の加水分解を測定すること（「インビトロ・タンパク質分解アッセイ法」、下記を参照されたい）；
（ｉｉｉ）表面プラスモン共振に基づいた機器を使用して、ＶＩＩａ因子またはＶＩＩａ因子関連ポリペプチドのＴＦに対する物理的な結合を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳＬｅｔｔｓ．４１３：３５９−３６３，１９９７）；および、
（ｉｖ）ＶＩＩａ因子および／またはＶＩＩａ因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水を分解測定すること（「インビトロ加水分解アッセイ法」、下記を参照されたい）；および、
（ｖ）ＴＦ非依存的なインビトロ系におけるトロンビン生成の測定、によって定量してもよい。

「ＶＩＩ因子の生物活性」または「ＶＩＩ因子の活性」の用語は、トロンビンを生成する能力を含むことが企図され；該用語は、組織因子の非存在下で活性化された血小板の表面においてトロンビンを生成する能力も含む。

本発明に従って使用し得るＶＩＩａ因子標品は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡＩＳ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）であるが、限定されない。

トロンボモジュリンポリペプチド：
本発明は、たとえばＳｕｚｕｋｉ等のＥＭＢＯＪ６：１８９１−１８９７，１９８７（野生型ヒトトロンボモジュリン）に開示されたアミノ酸配列を有するものなどのトロンボモジュリンポリペプチドの使用を含む。

本発明を実施する中で、出血を妨げる又は治療することにおいて有効である任意のトロンボモジュリンポリペプチドを使用し得る。これは、血液または血漿に由来する、または組換え手段によって産生されたトロンボモジュリンポリペプチドを含む。

本明細書において使用される、「トロンボモジュリンポリペプチド」は、トロンボモジュリン、並びにトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含むが、限定されない。「トロンボモジュリン」の用語は、Ｓｕｚｕｋｉｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ６：１８９１−１８９７，１９８７に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（野生型ヒトトロンボモジュリン）、並びに他の種（例えばウシ、ブタ、イヌ、マウス、およびサケのトロンボモジュリンなど）に由来する野生型トロンボモジュリンを含むことが企図されるが、限定されない。

それは、１つの個体から他へと存続および出現するであろうトロンボモジュリンの天然の対立形質の変異を更に含む。また、糖鎖形成またはその他のポスト翻訳修飾の程度および部位は、選ばれた宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して異なってもよい。また、「トロンボモジュリン」の用語は、酵素前駆体形態のトロンボモジュリンポリペプチド、並びにプロセスされて、これらのそれぞれの生理活性の形態に産生されたものを含むことが企図される。

「トロンボモジュリン関連ポリペプチド」は、トロンボモジュリンポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない、該トロンボモジュリンポリペプチドは、ヒトトロンボモジュリンと比較して化学的に修飾されたか、および／またはヒトトロンボモジュリンと比較して１つまたは複数のアミノ酸配列の変化を含む（すなわちトロンボモジュリン変異体）か、および／またはヒトトロンボモジュリンと比較して切断されたアミノ酸配列を含む（すなわちトロンボモジュリン断片）かのいずれかである。このようなトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、ヒトトロンボモジュリンと比較して、安定度、リン脂質結合、変えられた比活性、などを含む異なる特性を示してもよい。

「トロンボモジュリン関連ポリペプチド」の用語は、酵素前駆体形態のポリペプチド、並びにプロセスされて、これらのそれぞれの生理活性の形態に産生されたポリペプチドを含むことが企図される。

本明細書に使用される、「トロンボモジュリン関連ポリペプチド」は、野生型のヒトトロンボモジュリンと比較して、実質的に同等または改善された生物活性を示すポリペプチド、並びに野生型ヒトトロンボモジュリンの活性と比較して、トロンボモジュリン生物活性が実質的に修飾され、または減少したポリペプチドを含むが、限定されない。これらのポリペプチドは、化学的に修飾されたトロンボモジュリン並びに特定のアミノ酸配列の変化が導入されて、ポリペプチドの生理活性が修飾され又は崩壊されたトロンボモジュリン変異体を含むが、限定されない。

それは、さらにわずかに修飾されたアミノ酸配列（たとえばＮ末端のアミノ酸欠失または付加を含む修飾されたＮ末端の末端を有するポリペプチド、および／またはヒトトロンボモジュリンと関連して化学的に修飾されたポリペプチド）を有するポリペプチドを含む。

トロンボモジュリンの変異体を含むトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、実質的に野生型トロンボモジュリンと同等もしくは優れた生理活性を示すか、または、代わりに、野生型トロンボモジュリンと比較して実質的に修飾され、もしくは減少した生理活性を示すかどうかにかかわらず、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型トロンボモジュリンの配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、限定されない。

変異体を含むトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、本明細書に記載されたようなトロンボモジュリン活性アッセイにおいて試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型トロンボモジュリンの比活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、および少なくとも約１３０％を示すものを含む。

変異体を含むトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、野生型トロンボモジュリンと比較して実質的に同等または改善された生物活性を有し、上記の通りに特異的トロンボモジュリン活性アッセイ（ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ）の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ヒトトロンボモジュリンの生物比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１１０％、より好ましくは少なくとも約１２０％、および最も好ましくは少なくとも約１３０％を示すものを含む。本発明の目的のために、トロンボモジュリンの生物活性は、Ｎａｋａｓｈｉｍａ等（ＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ３８：５４０，１９９８）により記載されたとおり定量してもよい（本明細書の「アッセイのパート」を参照されたい）。

変異体を含むトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、野生型トロンボモジュリンに比べて実質的に減少した生物活性を有し、上記のような１つまたは複数の特異的なトロンボモジュリン活性アッセイにおいて試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型トロンボモジュリンの比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、および最も好ましくは約１％未満を示すものである。

トロンボモジュリン均等物の制限されない例は、例えば国際公開番号ＷＯ８７／０００５０に記載されている肺組織由来ヒトトロンボモジュリン；例えば、国際公開番号ＷＯ８８／０９８１１に又は欧州特許第（ＥｕｒｏｐｅａｎＰａｔｅｎｔＮｏ．）２９０４１９号に記載されている組換え型ヒトトロンボモジュリン；例えば、国際公開番号ＷＯ９０／１００８１、ＷＯ９１／０５８０３、ＷＯ９１／１５５１４、ＷＯ９２／００３２５、ＷＯ９２／０３１４９、ＷＯ９３／２５６７５、ＷＯ９３／１５７５５、米国特許番号（ＵＳＰａｔｅｎｔＮｏ．）５８６３７６０および日本国特許出願番号（ＪａｐａｎｅｓｅＰａｔｅｎｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＮｏｓ．）ＪＰ１１３４１９９０、ＪＰ０８２３１４１３、ＪＰ０７２２４１００、ＪＰ０４２１０７００に記載されているアナログ（均等物）；例えば、日本国特許出願番号ＪＰ０９２６８２００に記載されているラットトロンボモジュリンである。

いくつかの態様において、トロンボモジュリンは、「トロンボモジュリンアッセイ法」（Ｎａｋａｓｈｉｍａ等、ＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ３８：５４０，１９９８、上記を参照されたい）において試験されるときに、前記トロンボモジュリンポリペプチドの活性および天然のヒトトロンボモジュリン（野生型トロンボモジュリン）の活性間の比が少なくとも約１．２５であるトロンボモジュリン均等物である；他の態様において、比は少なくとも約２．０である；さらなる態様において、比は少なくとも約４．０である。

また、トロンボモジュリン関連ポリペプチドは、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの断片（これらに特徴的な止血に関連した活性を保持する）を含む。トロンボモジュリンポリペプチドの止血に関連した活性は、例えば、本願明細書において記載されたトロンボモジュリン−活性アッセイ法を使用して測定されてもよい。

定義
本発明において、アミノ酸の３文字または１文字の表示は、表１に示したとおり、これらの従来の意味で使用した。明示的に示されない限り、本明細書において言及されるアミノ酸は、Ｌアミノ酸である。例えば、Ｋ３３７における最初の文字は、野生型ＶＩＩ因子の示された位置において天然に存在するアミノ酸を表すこと、そして、たとえば、［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩａは、示された位置において天然に存在する１文字コードＫによって表されるアミノ酸が、１文字コードＡによって表されるアミノ酸で置換されたＦＶＩＩ−変異体を示すことが理解される。

「ＶＩＩａ因子」または「ＦＶｌｌａ」の用語は、相互変換可能に使用し得る。

この文脈において、「トロンビン生成の障害を有する被検者」は、活性化された血小板表面において完全なトロンビンのバーストを生成することができない被験者を意味し、正常な量および機能の凝固因子、血小板、およびフィブリノーゲン（たとえば、プールされた、正常ヒト血漿のもの）を含む、完全に機能する、正常な止血系を有する被験者におけるトロンビン生成よりも少ないトロンビンの生成を有する被検者を含み、そしてＶＩＩｌ因子を欠いた被験者；血小板数の低下または機能に欠陥のある血小板を有する被験者（たとえば、血小板減少症またはグランツマン血小板無力症または多量に出血した被験者）；プロトロンビン、ＦＸまたはＦＶＩＩのレベルが低下した被検者；いくつかの凝固因子のレベルが低下した被験者（たとえば、外傷または広範な手術の結果の過剰な出血によるもの）；および、フィブリノーゲンの血漿濃度が低下した被検者（たとえば、多回輸血された被検者）を含むが、限定されない。

「トロンビン生成のレベル」または「正常なトロンビン生成」は、健康な被験者のレベルと比較した患者のトロンビン生成のレベルのレベルを意味する。該レベルは、正常レベルの割合として表される。本用語は、適切な場合には、交換可能に使用される。

「止血系の増強」の用語は、トロンビンを生成する能力の増強を意味する。「止血を増強する」の用語は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む試験試料について測定されたトロンビン生成が、同じトロンビン生成アッセイ法で試験したときの、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドまたはトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々のトロンビン生成と比較して延長される状況を含むことを企図する用語である。トロンビン生成は、本記述のトロンビン生成アッセイ法に記載したようにアッセイしてもよい（「アッセイ法の部」を参照されたい）。

本明細書において使用される「唯一の（Ｓｏｌｅ）」薬剤または因子は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドが、共に、薬学的組成物またはキットに含まれる唯一の止血剤もしくは活性な止血薬剤もしくは凝固因子であるか、或いは特定の治療の過程において、たとえば特定の出血の発症の過程などにおいて、患者に投与した唯一の止血剤もしくは活性な止血剤もしくは凝固因子である状況をいう。これらの状況は、その他の止血剤または凝固因子が、１つまたは複数の凝固パラメータに有意に影響するように、適用可能なものとして、十分な量または活性で存在しないものを含むことが理解される。

血餅溶解時間、血餅強度、フィブリン血餅形成、および凝固時間は、患者の止血系の状態を検定するために使用される臨床的パラメータである。血液試料は、適切な間隔で患者から吸い出し、たとえばＭｅｈら、ＢｌｏｏｄＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ＆Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ２００１；１２：６２７６３７；Ｖｉｇら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６（３）ｐｐ．２０５−２１３（２００１）；Ｖｉｇら、Ｂｌｏｏｄｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ＆ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．１２（７）ｐｐ．５５５−５６１（２００１）Ｏｃｔ；Ｇｌｉｄｄｅｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄａｐｐｌｉｅｄｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．６（４）ｐｐ．２２６−２３３（２０００）Ｏｃｔ；ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９２（４）ｐｐ．２４０−２４７（１９９９）Ａｐｒ；ｏｒＤａｖｉｓら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６（４）ｐｐ．１２５０−１２５５（１９９５）に記載されているように、トロンボエラストグラフィによって１つまたは複数のパラメータがアッセイされる。

「血餅溶解時間を延長すること」の用語は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む試験試料について測定された血餅溶解時間が、同じ血餅溶解アッセイ法で試験したときの、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドまたはトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々の血餅溶解時間と比較して延長される状況を含むことを企図する用語である。血餅溶解時間は、上記の通りにアッセイしてもよい。

「血餅強度を増大すること」の用語は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む試験試料について測定された血餅強度（たとえば機械強度）が、同じ血餅強度アッセイ法で試験したときの、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドまたはトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々の血餅溶解時間と比較して増大される状況を含むことを企図する用語である。血餅強度は、たとえばＣａｒｒら（ＣａｒｒＭＥ，ＺｅｋｅｒｔＳＬ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｐｌａｔｅｌｅｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄｆｏｒｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇｐｌａｓｍａｃｌｏｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＡＭＪＭＥＤＳＣＩ１９９１；３０２：１３−８）に記載されたように、または上記の通りにトロンボエラストグラフィによってアッセイしてもよい。

「フィブリン血餅形成を増強すること」の用語は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む試験試料について測定されたフィブリン血餅形成の速度または程度が、同じ凝固アッセイ法で試験したときの、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドまたはトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々のフィブリン血餅形成の速度または程度と比較して増大される状況を含むことを企図する用語である。フィブリン血餅形成は、上記の通りにアッセイしてもよい。

「凝固時間を短縮すること」の用語は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む試験試料について測定された血餅形成の時間（凝固時間）が、同じ凝固アッセイ法で試験したときの、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドまたはトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々の凝固時間と比較して増大される状況を含むことを企図する用語である。凝固時間は、当業者に既知の標準的なＰｔまたはａＰＴＴアッセイの手段によってアッセイしてもよい。

「血小板の数または活性の低下」の用語は、被検者の血漿中に存在する血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）（血小板：ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）の数、およびこのような血小板の生物学的な凝固に関連した活性をいう。数の低下は、たとえば血小板破壊の増大、血小板産生の減少、および脾臓における血小板の通常割合（ｎｏｒｍａｌｆｒａｃｔｉｏｎ）より多い貯留によるものであってもよい。血小板減少症は、たとえば、１５０，０００血小板／マイクロリットルよりも少ない血小板数として定義され；一般に、正常な血小板数の上限は、３５０，０００および４５０，０００血小板／マイクロリットルの間であると考えられる。血小板数は、自動化された血小板計数器によって計数されてもよく；これは、当業者に周知の方法である。血小板数の低下による症候群としては、血小板減少症、凝固障害（ｃｏａｇｕｌｏｐｈａｔｈｙ）を含むが、これらに限定されない。「活性」は、血小板の凝集、接着、および血液凝固活性を含むが、これらに限定されない。活性の減少は、たとえば糖タンパク質異常、異常な膜−細胞骨格相互作用、血小板顆粒の異常、血小板血液凝固活性の異常、シグナル伝達および分泌の異常によるものを含む。凝集、接着、および血液凝固活性を含む血小板活性は、当業者既知の標準的な方法によって測定され、たとえば、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｓ．Ｐ．Ｗａｔｓｏｎ＆Ｋ．Ｓ．Ａｕｔｈｉ：ＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓｏｆＰｌａｔｅｌｅｔＤｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｋ．Ｊ．Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ）１５：２９９−３１８，１９９６，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；ＷｉｌｌｉａｍｓＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ＳｉｘｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｃｏｌｌｅｒ，Ｋｉｐｐｓ＆Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ，２００１，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌを参照されたい。血小板活性の低下による症候群は、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群、抗凝血薬療法（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、および血栓溶解治療（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を含むが、限定されない。「低下」は、同じアッセイ法において測定したときの、正常なプールされた血漿の試料の数または活性と比較した、試験血漿の試料の数または活性をいう。

本明細書において使用される、「出血障害」の用語は、出血の発症の際に現れる、先天性の、後天性の、または誘導される、細胞または分子起源のいずれかの欠陥を表す。出血障害の例は、凝固因子欠損（たとえば、凝固因子ＶＩＩｌ、ＩＸ、ＸＩまたはＶＩＩの欠損）、凝固因子阻害剤、血小板機能の欠陥（たとえば、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群）、血小板減少症、フォンウィルブランド病、並びに出血および／または輸液による凝固タンパク質の希釈、線維素溶解の増大および血小板数の低下（たとえば、手術または外傷を受けた多回輸血された被験者における）によって生じるものなどの凝固障害を含むが、これらに限定されない。

出血は、循環系の任意の部分から血液が血管外遊走することをいう。「出血の発症（ｂｌｅｅｄｉｎｇｅｐｉｓｏｄｅｓ）」の用語は、手術、外傷、その他の形態の組織の損害と関連して、望まれず、制御できず、およびしばしば過剰である出血、並びに出血障害を有する被検者における望まれない出血を含むことを意味する。出血の発症は、基本的には正常な凝固系を有するが、（一時的な）凝固障害を受けている被験者において、並びに先天性のまたは後天性の凝固障害または出血障害を有する被検者において、生じるであろう。血友病における止血系では、必須の凝固「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」（たとえば、血小板またはフォンビルブラント因子タンパク質）を欠いているか、または異常であるので、血小板機能の欠陥を有する被検者における出血は、血友病によって引き起こされる出血に関連づけられるであろう。たとえば手術または莫大な外傷に関連して、広範な組織損傷を受けている被検者では、正常な止血機構による即時性の止血の要求によっては手に負えず、彼らは、基本的には（外傷前または手術前には）正常な止血機構であるにもかかわらず過剰の出血を発生してしまうであろう。さらに、このようなしばしば多回輸血された被検者は、出血および／または輸液の結果として、（一時的な）凝固障害（すなわち、出血および／または輸液による、凝固タンパク質の希釈、線維素溶解の増大、および血小板数の低下）を発病する。出血は、また、脳、内耳領域、および目などの器官においても生じるであろうし；これらにおいては、外科的な止血の可能性が制限されており、従って、満足な止血を達成するのに問題がある領域である。同様の問題は、種々の器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）からの生検を行うプロセスにおいて、並びに腹腔鏡検査手術および根治的な恥骨後前立腺摘除術においても起こるであろう。これら全ての状況において共通することは、出血がびまん性（ｄｉｆｆｕｓｅ）である場合（たとえば出血性胃炎および大量の子宮出血）にも、手術の技術（縫合、クリップ、その他）によって止血を実現することが困難なことである。また、出血は、与えられた治療によって止血の欠陥が誘導される抗凝固療法の被検者において生じるであろうし；これらの出血は、急性および大量であることが多い。抗凝固療法は、血栓塞栓性疾患を防止するために行われることが多い。このような治療は、ヘパリン、その他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたはその他の形態のビタミンＫ−アンタゴニスト、並びにアスピリンおよび例えば抗体などのその他の血小板凝集阻害剤またはその他のＧＰｌｌｂ／Ｉｌｌａ活性阻害剤を含むであろう。また、出血は、抗血小板剤（たとえば、アセチルサリチル酸）、抗凝固薬（たとえば、ヘパリン）、および線維素溶解素（たとえば、組織プラスミノゲンアクチベータ、ｔＰＡ）と組み合わせた治療を含む、いわゆる血栓溶解療法によるものであってもよい。また、出血の発症は、急性の関節出血（ｈａｅｍａｒｔｈｒｏｓｅｓ）（関節の出血）、慢性血友病の関節症、血腫（たとえば筋肉、後腹膜、舌下、および咽頭後方のもの）、その他の組織における出血、血尿（腎尿管（ｒｅｎａｌｔｒａｃｔ）からの出血）、大脳出血、手術（たとえば、肝切除）、抜歯、および胃腸出血（たとえば、ＵＧＩの出血）を有する被験者における手術または外傷と関連した、制御できない過剰な出血を含むことが意図されるが、これらに限定されない。出血の発症は、ＶＩＩＩ因子に対する阻害剤；血友病Ａ；血友病Ａと阻害剤；血友病Ｂ；ＶＩＩ因子の欠損；トロンボモジュリンの欠損；血小板減少症；フォンウィルブランド因子の欠損（フォンウィルブランド病）；重篤な組織損傷；重篤な外傷；手術；腹腔鏡検査手術；出血性胃炎；生検採取；抗凝固剤療法；上胃腸出血（ｕｐｐｅｒｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｓｔｉｎａｌｂｌｅｅｄｉｎｇｓ：ＵＧＩ）；または幹細胞移植に関連していてもよい。出血の発症は、大量の子宮出血；機械的な止血の可能性が制限されている器官において生じるもの；脳において生じるもの；内耳領域において生じるもの；または、目元において生じるものであってもよい。「出血の発症」および「出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇｓ）」の用語は、適切な場合には、交換可能に使用される。

この文脈において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」の用語は、たとえば手術におけるものなどの予想される出血を防止すること、およびたとえば外傷におけるものなどのすでに起こっている出血を、出血を阻害するか、または最小にする目的で、調節することの両者を含むことが意図される。上述した「予想される出血（ｅｘｐｅｃｔｅｄｂｌｅｅｄｉｎｇ）」は、特定の組織または器官において起こると思われる出血であってもよく、または詳細不明の出血であってもよい。したがって、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の予防的投与は、「治療」の用語に含まれる。

本明細書に使用されるものとして、「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」の用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳類を意味することが企図され、適切な場合は、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」の用語と交換可能に使用されてもよい。また、本発明は、獣医学の手順の範囲内におけるＶＩＩ因子またはＦＶＩＩ関連ポリペプチド、およびｔＰＡ阻害剤の使用を含む。

本明細書において定義されたＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、同時に、または逐次に投与されてもよい。本因子は、単一の剤形に両方の凝固因子を含む単一の剤形において、または第１の単位剤形としてＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を、第２の単位剤形としてトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含むパーツのキットの形態で供給されてもよい。第１または第２または第３の、その他の単位用量は、この明細書の全体にわたって言及されるが、これは、投与の好ましい順序を示すのではなく、単に便宜上の目的でなされるだけである。

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の「同時」投薬は、単一の単位剤形での凝固因子の投与を、または第１の凝固因子タンパク質の投与に続き、第２の凝固因子タンパク質の投与が、１５分、好ましくは１０分、より好ましくは５分、より好ましくは２分を超えて時間を離されていないことを意味する。何れの因子が最初に投与されてもよい。

「逐次の投薬」は、第１の凝固因子タンパク質の投与に続き、第２の凝固因子タンパク質の投与が、２時間まで、好ましくは１〜２時間、より好ましくは１時間まで、より好ましくは３０分〜１時間、より好ましくは３０分まで、より好ましくは１５〜３０分まで時間を離して投与されることを意味する。２つの単位剤形、または凝固因子タンパク質のいずれかが最初に投与される。好ましくは、両製品が同じ静脈通路（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓａｃｃｅｓｓ）を通じて注射される。

「トロンボモジュリンのレベル」または「トロンボモジュリンレベル」は、健康な被験者におけるレベルと比較した、患者のトロンボモジュリン活性のレベルを意味する。該レベルは、正常レベルの割合として表される。本用語は、適切な場合には、交換可能に使用される。

「トロンボモジュリンのレベルの減少」または「トロンボモジュリンレベルの減少」は、トロンボモジュリンの欠損またはトロンボモジュリンの阻害剤を有さない被検者集団における平均トロンボモジュリンレベルと比較した、血流におけるトロンボモジュリンの存在もしくは活性の減少を意味する。循環しているトロンボモジュリンのレベルは、凝固剤または免疫アッセイ法のいずれかによって測定することができる。トロンボモジュリンの凝血促進性の活性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ）は、患者の血漿がトロンボモジュリンを欠損する血漿における凝固時間を修正する能力によって決定される（たとえばＡＰＴＴアッセイ法、下記参照されたい；また、本明細書の「アッセイ法の部分」を参照されたい）。

１単位のトロンボモジュリンは、１ミリリットルの正常な（プールされた）ヒト血漿に存在するトロンボモジュリンの量（１００％のトロンボモジュリンレベルに対応する）として定義した。

１単位のＶＩＩ因子は、１ｍｌの正常血漿に存在するＶＩＩ因子の量として定義され、約０．５μｇタンパク質に相当する。活性化された後では、５０単位は、約１ｇのタンパク質に対応する。

「欠損」は、たとえば正常な健康な個々のものと比較して、血漿中の例えばトロンボモジュリンの存在または活性が減少することを意味する。本用語は、適切な場合には、「減少したトロンボモジュリンレベル」と交換可能に使用されてもよい。

「ＡＰＴＴ」または「ａＰＴＴ」は、活性化された部分的トロンボプラスチン時間を意味する（たとえば、ＰｒｏｃｔｏｒＲＲ，ＲａｐａｐｏｒｔＳＩ：Ｔｈｅｐａｒｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｔｉｍｅｗｉｔｈｋａｏｌｉｎ；ａｓｉｍｐｌｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔｆｏｒｆｉｒｓｔ−ｓｔａｇｅｐｌａｓｍａｃｌｏｔｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ．ＡｍＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ３６：２１２，１９６１に記載されている）。

「トロンボモジュリン応答性の症候群」は、その必要がある被検者に投与された外因性のトロンボモジュリンにより、該症候群によって引き起こされる、予測され、もしくは存在する、いずれかの徴候、症状、または疾病を防止、治癒、または寛解するであろう症候群を意味する。トロンボモジュリンのレベルの減少によって引き起こされる症候群、たとえばトロンボモジュリンに対する阻害剤によって引き起こされる出血障害を含むが、限定されない。トロンボモジュリン応答性の症候群は、本発明に従った組成物で治療してもよい。

「ＶＩＩ因子応答性の症候群」は、その必要がある被検者に投与された外因性のＶＩＩ因子、好ましくはＶＩＩａ因子により、該症候群によって引き起こされる、予測され、もしくは存在する、いずれかの徴候、症状、または疾病を防止、治癒、または寛解するであろう症候群を意味する。凝固因子ＶＩＩｌ、ＩＸ、ＸＩまたはＶＩＩレベルの減少、凝固因子阻害剤、血小板機能の欠陥（たとえば、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群）、血小板減少症、フォンウィルブランド病、並びに出血および／または輸液による凝固タンパク質の希釈、線維素溶解の増大および血小板数の低下（たとえば、手術または外傷を受けた多回輸血された被験者のもの）によって生じるものなどの凝固障害によって引き起こされる症候群が含まれるが、これらに限定されない。

「半減期」は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、またはトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの血漿濃度が、特定の値からその値の半分まで減少するために必要とされる時間をいう。

「一次止血」は、ＦＸａおよびＴＦ：ＶＩＩａ因子によるトロンビンの初期の生成、その後の血小板の活性化および活性化されて、接着された血小板による初期のゆるい栓の形成であって、フィブリンによって、最終的に架橋されたフィブリンによってまだ安定化されていないものを意味する。止血工程の第二工程の間に形成されるフィブリンによって安定化されない場合、前記栓は線溶系によって容易に溶解される。

「二次止血」または「止血の維持」は、二次的な、完全かつ主要な、トロンビンのバーストまたは生成であって、活性化された血小板表面において生じ、かつＶＩＩＩａ因子およびＶＩＩＩａ因子によって触媒され、その後のフィブリンの形成および初期の血小板栓の安定化を意味する。フィブリンによる栓の安定化によって、完全な止血がなされる。

「完全な止血」は、傷害の部位における安定かつ堅固なフィブリンの血餅または栓の形成であって、有効に出血を止め、線溶系によって容易に溶かされないものを意味する。この文脈において、止血の用語は、上記の通りに完全な止血を表すために使用される。

標品中の総タンパク質量は、一般に既知の方法によって、たとえば光学濃度を測定することによって測定してもよい。トロンボモジュリンまたはＶＩＩ因子タンパク質（「抗原」）の量は、標準的なＥｌｉｓａ免疫アッセイ法などの一般に既知の方法によって測定してもよい。一般な用語として、このようなアッセイ法は、たとえばトロンボモジュリンタンパク質を含有する標品の溶液を、ｅｌｉｓａプレート上に固定化された抗トロンボモジュリン抗体と接触させて、その後に固定された抗体−トロンボモジュリン複合体を、マーカーを有する抗トロンボモジュリン二次抗体と接触させ、その量を第３の工程において測定することによって行われる。それぞれの凝固因子の量は、同様の方法において適切な抗体を使用して測定してもよい。標品中に存在する凝固因子タンパク質の総量は、個々の凝固因子タンパク質の量を加えることによって決定される。１つの態様において、標品は、単離された凝固因子を含む。もう１つの態様において、標品は、基本的に凝固因子ＩＩおよび凝固因子ＩＩａ（プロトロンビンおよびトロンビン）および／またはＸもしくはＸａ因子を含まない。

本明細書において使用されるものとして、「単離された」の用語は、凝固因子、たとえばトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドであって、これらが合成された細胞又はこれらが天然において見出される媒体（例えば、血漿もしくは血液）から分離されたものをいう。これらの起源細胞からのポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知のいずれの方法によって達成され、所望の産物を含む細胞培養培地を接着細胞培養物から除去すること；遠心分離または濾過して非接着細胞を除去すること；などを含むが、これらに限定されない。これらが天然に存在する媒体からのポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知の任意の方法によって達成されてもよく、たとえば、抗ＶＩＩ因子または抗トロンボモジュリン抗体のそれぞれのカラムなどにおける、アフィニティークロマトグラフィ；疎水性相互作用クロマトグラフィ；イオン交換クロマトグラフィ；サイズ排除クロマトグラフィ；電気泳動的な手順（たとえば調製用の等電点電気泳動（ＩＥＦ））、溶解度の差（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出などを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の範囲内において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの「有効な量」は、共に、疾患およびその合併症を治癒する、軽減する、または部分的に抑えるために、出血もしくは失血を防止または減少するために十分な、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド（たとえばＦＶＩＩａ）、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの量として定義される。

「ＶＩＩａ因子の活性」または「ＶＩＩａ因子活性」の用語は、トロンビンを生成する能力を含み；本用語には、組織因子の非存在下で活性化された血小板の表面においてトロンビンを生成する能力も含む。

略語：
ＴＦ組織因子
ＦＶＩＩＶＩＩ因子の単鎖、不活性化型
ＦＶＩＩａＶＩＩ因子の活性化型
ｒＦＶＩＩａ組換えＶＩＩ因子の活性化型
ＴＡＦＩＴＡＦＩの酵素前駆体、不活性化型
ＰＣプロテインＣ
ＡＰＣプロテインＣの活性化型
ＰＳプロテインＳ
ＡＰＳプロテインＳの活性化型
ＴＭトロンボモジュリン

化合物の調製：
本発明に使用するために適したヒト精製ＶＩＩａ因子は、たとえばＨａｇｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：２４１２−２４１６，１９８６に記載されているように、または欧州特許番号第２００．４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に記載されているように、好ましくはＤＮＡ組換技術によって作出される。

ＶＩＩ因子は、ＢｒｏｚｅおよびＭａｊｅｒｕｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（４）：１２４２−１２４７，１９８０ａｎｄＨｅｄｎｅｒａｎｄＫｉｓｉｅｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６−１８４１，１９８３）並びにＨｅｄｎｅｒおよびＫｉｓｉｅｌ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．ｌｎｖｅｓｔ．７１：１８３６−１８４１，１９８３）により記載された方法で産生してもよい。これらの方法は、検出可能な量のその他の血液凝固因子を伴わずにＶＩＩ因子を産生する。なおさらに精製されたＶＩＩ因子標品を、最終的な精製工程として付加的なゲル濾過を含むことによって得てもよい。次いで、既知の手段（たとえば、トロンボモジュリンｌａ、ＩＸ、またはＸａなどの異なるいくつかの血漿タンパク質）によって、ＶＩＩ因子を活性化ＶＩＩａ因子に変換してもよい。あるいは、Ｂｊｏｅｒｎら（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，２６９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１９８６，ｐｐ．５６４− ５６５）によって記載されているように、ＶＩＩ因子をＭｏｎｏＱ（登録商標）（ＰｈａｒｍａｃｉａｆｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことにより、活性化してもよい。

ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型ＶＩＩ因子の修飾によって、または組換技術によって産生してもよい。野生型ＶＩＩ因子と比較したときにアミノ酸が変更されているＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、天然のＶＩＩ因子をコードする核酸においてアミノ酸コドンを変更すること、またはいくつかのアミノ酸コドンを除去することのいずれかにより、周知の手段（たとえば部位特異的突然変異）を用いて、野生型ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。

ＶＩＩａ因子またはトロンボモジュリン分子の機能に重要な領域の外側に置換を作成し、なおも活性なポリペプチドを生じさせることができることは当業者には明らかであろう。ＶＩＩ因子もしくはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、またはトロンボモジュリンもしくはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの活性に必須であり、従って、好ましくは、置換を受けないアミノ酸残基は、部位特異的突然変異生成またはアラニン走査変異生成（たとえば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）などの当該技術分野において既知の手順に従って同定し得る。後者の技術では、分子において正に荷電したすべての残基に変異が導入され、そして生じる変異体分子を、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために、凝固剤について、架橋性活性をそれぞれ試験する。また、基質−酵素の相互作用部位は、核磁気共鳴解析、結晶学、または光親和性標識化（たとえば、ｄｅＶｏｓら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈｅｔａ／．，１９９２，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒら、１９９２，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３０９：５９−６４を参照されたい）などの技術によって決定される、三次元構造解析によって決定することもできる。

１つのヌクレオチドをもう一つのヌクレオチドに交換するための、核酸配列への突然変異の導入は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用した、部位特異的変異誘発によって達成されてもよい。関心対象のインサートを有するスーパーコイル二重鎖ＤＮＡベクターおよび所望の変異を含む２つの合成プライマーを利用する手順が、特に有用である。前記ベクターの反対の鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによって温度サイクリングの間に伸長した。プライマの取り込みにおいて、ねじれ型のニック（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｎｉｃｋｓ）を含む変異プラスミドが産生される。温度サイクリングの後、メチル化およびヘミメチル化されたＤＮＡに特異的であるＤｐｎｌで産物を処理して、親のＤＮＡ鋳型を消化し、変異を含有する合成ＤＮＡを選択する。遺伝子混合技術またはファージディスプレイ技術などの、変異体を作成、同定、および単離するための当該技術分野において既知のその他の手順を使用してもよい。

これらの起源細胞からのポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知のいずれの方法によって達成され、所望の産物を含む細胞培養培地を接着細胞培養物から除去すること；遠心分離または濾過して非接着細胞を除去すること；などを含むが、これらに限定されない。

任意に、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドをさらに精製してもよい。精製は、たとえば抗ＶＩＩ因子抗体カラム（たとえば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１０９７，１９８６；およびＴｈｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７７８５，１９８８を参照）などのアフィニティークロマトグラフィ；疎水性相互作用クロマトグラフィ；イオン交換クロマトグラフィ；サイズ排除クロマトグラフィ；電気泳動的な手順（たとえば調製用の等電点電気泳動（ＩＥＦ）、溶解度の差（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出などを含む、これに限定されない、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して達成されてもよい。一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２；およびＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃ．ＪａｎｓｏｎａｎｄＬａｒｓＲｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照されたい。精製に続いて、本標品は、宿主細胞に由来する非ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドを約１０重量％未満、より好ましくは約５％未満、および最も好ましくは約１％未満で含む。

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ＸＩａ因子またはたとえば、ＩＸａ因子、カリクレイン、Ｘａ因子、およびトロンビンなどのトリプシン様の特異性を有するその他のプロテアーゼを使用するタンパク分解性の切断によって活性化されてもよい。たとえばＯｓｔｅｒｕｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ米国特許第４，４５６，５９１号；およびＨｅｄｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６（１９８３）を参照されたい。あるいは、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、それをＭｏｎｏＱ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことにより、活性化し得る。次いで、生じる活性化されたＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドを、後述するように処方し、および投与してもよい。

本発明内で使用するためのトロンボモジュリンは、既知の方法により、例えば胎盤または肺から分離し得る；しかし、組換え型トロンボモジュリンを使用することが好ましい（疾患の伝播のリスクがある血液または組織に由来する産物の使用を避けるため）。トロンボモジュリンを分離するための及び組換えトロンボモジュリンを調製するための方法は、当該技術分野において既知であり；たとえば、Ｇｏｍｉ等（Ｂｌｏｏｄ７５：１３９６，１９９０）；Ｏｇａｔａ等（ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：５２０，１９９３）を参照されたい。トロンボモジュリン変異体は、上記の通りに部位特異的突然変異誘発によって作製されてもよい。

トロンボモジュリン関連ポリペプチドは、野生型トロンボモジュリンの修飾によって、または組換技術によって産生されてもよい。野生型トロンボモジュリンと比較したときにアミノ酸が変更されているトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、周知の手段、上記で詳細に説明したように、たとえば部位特異的突然変異などの既知の手段により、天然のトロンボモジュリンをコードする核酸のアミノ酸コドンを変更することによって、またはいくつかのアミノ酸コドンを除去することによってのいずれかにより、野生型トロンボモジュリンをコードする核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。これらの起源細胞からのポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知のいずれの方法によって達成され、所望の産物を含む細胞培養培地を接着細胞培養物から除去すること；遠心分離または濾過して非接着細胞を除去すること；などを含むが、これらに限定されない。任意には、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、さらに精製されてもよい。精製は、上記で詳細を記載したように、たとえば抗トロンボモジュリン抗体カラムなどのアフィニティークロマトグラフィ；疎水性相互作用クロマトグラフィ；イオン交換クロマトグラフィ；サイズ排除クロマトグラフィ；電気泳動的な手順（たとえば調製用の等電点電気泳動（ＩＥＦ））、溶解度の差（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出などを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して達成されてもよい。精製に続いて、好ましくは本標品は、宿主細胞に由来する非トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを約１０重量％未満、より好ましくは約５％未満、および最も好ましくは約１％未満で含む。次いで、生じる活性化されたトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを後述するように処方し、および投与してもよい。

当業者には理解されるであろうが、免疫応答を誘導するリスクを減少するために、被検者と同質遺伝子的なトロンボモジュリンポリペプチドおよびＶＩＩ因子ポリペプチドを使用することが好ましい。非ヒトトロンボモジュリンの調製および特徴付けは、例えば日本国特許出願番号０９２６８２００号およびＥｓｍｏｎ等（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２５７：８５９，１９８２）、Ｓｕｚｕｋｉ等（ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ８８２：３４３，１９８６）に開示されている。また、本発明は、獣医学の手順の範囲内における、このようなトロンボモジュリンポリペプチドおよびＶＩＩ因子ポリペプチドの使用を含む。

薬学的組成物および使用方法
本発明の標品は、たとえば凝固因子ＶＩＩｌ、ＩＸ、ＸＩまたはＶＩＩレベルの減少、凝固因子阻害剤、血小板機能の欠陥（たとえば、グランツマン血小板無力症およびベルナール‐スリエ症候群）、血小板減少症、フォンウィルブランド病、並びに出血および／または輸液による凝固タンパク質の希釈、線維素溶解の増大および血小板数の低下（たとえば、手術または外傷を受けた多回輸血された被験者のもの）によって生じるものなどの凝固障害によって引き起こされる症候群を含む（これらに限定されない）、出血障害などの、いずれのＶＩＩ因子応答性の症候群を治療するために使用してもよい。
本発明に従ったＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む薬学的組成物は、主に予防的および／または治療的な治療のための非経口投与が企図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的、すなわち静脈内に、皮下に、または筋肉内に投与され；静脈内が最も好ましい。また、これらは、持続的またはパルス状（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ）の輸液によって投与されてもよい。

本発明に従った薬学的組成物または製剤は、単一の単位剤形に、またはキットのパーツの形態の何れかに処方され、薬学的に許容されるキャリアに、好ましくは水性キャリアまたは希釈液に好ましくは溶解された、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む。簡単には、本発明に従って使用するために適した薬学的組成物は、ＶＩＩ因子もしくはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、またはトロンボモジュリン、またはトロンボモジュリンと組み合わせたＶＩＩ因子もしくはＶＩＩ因子関連ポリペプチドを、好ましくは精製した形態で、適切なアジュバントおよび適切なキャリアまたは希釈液と混合して作出される。水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどの種々の水溶性キャリアを使用してもよい。また、本発明の標品は、傷害の部位に対してデリバリーまたはターゲティングするために、たとえばゲルの形態で、またはリポソーム標品としてなどの非水系のキャリアを使用して処方することもできる。リポソーム標品は、たとえば米国特許第４，８３７，０２８号，４，５０１，７２８号、および４，９７５，２８２号において一般に記載されている。本組成物は、従来のよく知られた滅菌法技術によって殺菌されていてもよい。生じる水溶液は、使用のためにパックされ、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥されていてもよく、凍結乾燥された標品は、投与の前に滅菌水溶液と混合される。

本組成物は、たとえば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、その他などの、ｐＨ調整して、かつ緩衝化した薬剤および／または緊張度（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）を調整した薬剤を含む（これらに限定されるものではない）、薬剤的に許容される補助物質またはアジュバントを含んでいてもよい。

製剤は、１つまたは複数の希釈液、乳化剤、保存剤、緩衝液、賦形剤、その他を更に含んでもよく、液体、粉末、エマルジョン、徐放性（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｌｅａｓｅ）、その他などの形態で提供されてもよい。この技術分野の当業者であれば、本発明の組成物を適切な方法で、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に開示されたものなどの是認された実務に従って処方してもよい。
このようにして、静脈内輸液のための典型的な薬学的組成物は、２５０ｍｌの無菌のリンゲル液および１０ｍｇの本標品を含むように作出することができるであろう。

本発明の標品を含む組成物は、予防的および／または治療的な治療のために投与することができる。治療的な適用において、組成物は、すでに疾患に罹患している被検者に対して、疾患およびその合併症の臨床症状を治癒する、軽減する、または部分的に抑えるために十分な量で、上記の通りに投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｏｕｎｔ）」として定義される。それぞれの目的のための有効な量は、疾患または傷害の重篤さ、並びに被検者の重量および一般的な状態に依存する。適切な用量の決定が、値からマトリックス（ａｍａｔｒｉｘ）を構築すること、および前記マトリックスの異なる点を試験することによるルーチン試験を使用して達成し得ることが理解される。

本発明の標品の局所的デリバリー、たとえば局所的適用は、たとえば噴霧、灌流、二重バルーンカテーテル、ステント、血管グラフトまたはステントに組み込むこと、バルーンカテーテルを被覆するために使用されるヒドロゲル、またはその他のよくは確立された方法によって行ってもよい。いずれにしても、薬学的組成物は、症状を有効に治療するために十分な標品の量を提供するべきである。

これらの製剤中の、ＶＩＩ因子もしくはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、トロンボモジュリンもしくはトロンボモジュリン関連ポリペプチド、またはトロンボモジュリンもしくはトロンボモジュリン関連ポリペプチドと組み合わせたＶＩＩ因子もしくはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの濃度は、広く、すなわち、約０．５重量％未満、通常少なくとも約１重量％以上から、１５または２０重量％程度にまで変更することができ、選択される特定の投与方法に従って、主に液体体積、粘性、その他によって選択される。
注射または輸液、特に注射による投与が好ましい。このようにして、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの両方を含む溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の１つの剤形のもの、或いはＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドを含む溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の１つの剤形のもの及びトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤のもう１つの剤形のもの、のいずれかの標品などの静脈内投与に適した形態で調製される。

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの量、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの量は、共に、出血の発症を治療するために有効な量の集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を含むことが理解される。

本発明の材料が、一般に重篤な疾病または傷害の状態において、すなわち生命に脅威となる、または潜在的に生命に脅威となる状況において使用されことを考慮に入れておかなければならない。そのような場合、外来物質の極小化およびヒトにおけるＶＩＩａ因子およびトロンボモジュリンの免疫原性の一般的な欠如の点からみて、治療医師によって、これらの組成物を実質的に過剰に投与することが可能であり、および望ましいと感じられるであろう。

予防的適用において、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む組成物は、疾病状態もしくは傷害に感受性があるか、またはさもなければリスクのある被験者に投与されて、被検者自身の凝固能力を増強する。このような量は、「予防的に有効な用量」であると定義される。ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの量、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの量は、共に、出血の発症を防止するために有効な量の集合体を含むことが理解される。

本組成物の一回または複数回の投与は、治療者により選択される用量レベル及びパターンで実施される。本組成物は、日または週につき、１回または複数回で投与されてもよい。このような薬学的組成物の有効な量は、出血の発症に対して臨床的に有意な効果を提供する量である。
このような量は、一つには治療される特定の症状、被検者の年齢、重量、および一般的な健康、並びに当業者に明らかなその他の因子に依存する。

本発明の組成物は、予想される出血の前に、または出血の開始時に、単一用量で一般に投与される。しかし、好ましくは、与えられる用量および被検者の症状に依存して、２−４−６−１２時間の間隔で繰り返し（多回投与において）与えられてもよい。

慎重な処置に関連した治療のためには、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、典型的には処置を行う前の約２４時間以内に、およびその後に７日以上の間投与される。凝固剤としての投与は、本明細書に記載されているような種々の経路によるものであってもよい。

本組成物は、適切な濃度のＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の両方を含む単一の標品（単一の剤形）の形態であってもよい。また、本組成物は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を含む第１の単位剤形およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む第２の単位剤形からなるパーツのキットの形態であってもよい。この場合、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、一方の後に他方が、好ましくは、互いに約１５分以内、たとえば互いに１０分以内、または好ましくは５分以内、または、より好ましくは互いに２分以内に、投与されるべきである。２つの単位剤型のいずれも、最初に投与することができる。

本キットは、少なくとも２つの別々の薬学的組成物を含む。本キットは、別々の瓶または別々の箔パケット（ｆｏｉｌｐａｃｋｅｔ）などの別々の組成物を含むための容器手段を含む。典型的には、本キットは、別々の成分の投与のための説明書を含む。別々の成分が好ましくは異なる剤形で、異なる投与間隔（ｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｓ）で投与されるときに、または個々の成分の組み合わせの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）が処方する医師によって要求されているときに、本キット形態は特に有利である。

本発明に従って投与されるＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの量、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの量は、約１：１００〜約１００：１（ｗ／ｗ）の間で比を変化してもよい。したがって、トロンボモジュリンに対するＶＩＩ因子の比は、たとえば約１：１００、または１：９０、または１：８０、または１：７０、または１：６０、または１：５０、または１：４０、または１：３０、または１：２０、または１：１０、または１：５、または１：２、または１：１、または２：１、または５：１、または１０：１、または２０：１、または３０：１、または４０：１、または５０：１、または６０：１、または７０：１、または８０：１、または９０：１、または１００：１；または、約１：９０〜約１：１の間、または、約１：８０〜約１：２の間、または、約１：７０〜約１：５の間、または、約１：６０〜約１：１０の間、約１：５０〜約１：２５の間、約１：４０〜約１：３０の間、または約９０：１〜約１：１の間、または、約８０：１〜約２：１の間、または、約７０：１〜約５：１の間、または約６０：１〜約１０：１の間、または約５０：１〜約２５：１の間、または約４０：１〜約３０：１の間であってもよい。

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの用量は、被検者の重量、症状、および症状の重篤さに依存して、負荷投与量および維持量として、７０ｋｇの被検者について約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ／日の野生型トロンボモジュリン、たとえば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ／日、またはたとえば約５ｍｇ〜約１７５ｍｇ／日に対応する範囲で変動する。

トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの用量は、被検者の重量、症状、および症状の重篤さに依存して、負荷投与量および維持量として、７０ｋｇの被検者について約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ／日の野生型トロンボモジュリン、たとえば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ／日、またはたとえば約１ｍｇ〜約１７５ｍｇ／日に対応する範囲で変動する。

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの組み合わせにより、インビトロにおける血餅堅固性アッセイ法および線維素溶解時間アッセイ法において相乗効果を示す。さらに、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの組み合わせにより、安定なフィブリン凝塊の形成、半分血餅溶解時間の増大、血餅強度の増大、および線維素溶解に対する耐性の増大において相乗効果を示す。

本組成物は、適切な濃度のＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの両方を含む単一の標品の形態であってもよい。また、本組成物は、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドを含む第１の単位剤形およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む第２の単位剤形からなるキットの形態であってもよい。この場合、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドおよびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、好ましくは、互いに約１〜２時間以内、たとえば、互いに３０分以内、または好ましくは１０分以内、またはより好ましくは互いに５分以内に、逐次投与されるべきである。２つの単位剤型のいずれも、最初に投与することができる。

本発明は、別々に投与されてもよい活性成分を組み合わせて治療することによる出血の発症の、または凝固治療の、防止または治療に関するので、本発明は、キット形態で別々の薬学的組成物を組み合わせることにも関する。本キットは、少なくとも２つの別々の薬学的組成物を含む。本キットは、別々の瓶または別々の箔パケット（ｆｏｉｌｐａｃｋｅｔ）などの別々の組成物を含むための容器手段を含む。典型的には、本キットは、別々の成分の投与のための説明書を含む。別々の成分が好ましくは異なる剤形で、異なる投与間隔で投与されるときに、または個々の成分の組み合わせの滴定が処方する医師によって要求されているときに、本キット形態は特に有利である。

アッセイ法：
ＶＩＩａ因子活性の試験：
ＶＩＩａ因子活性を試験することにより、適切なＶＩＩａ因子変異体を選択することに適したアッセイ法は、単一の予備的なインビトロ試験として行うことができる：

インビトロ加水分解アッセイ法
天然の（野生型）ＶＩＩａ因子およびＶＩＩａ因子変異体（両者とも、これ以降「ＶＩＩａ因子」と称する）で比活性をアッセイしもよい。また、これらは、平行して、直接これらの比活性を比較するためにアッセイしてもよい。アッセイ法は、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において行う。終濃度１ｍＭの色素生産性基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、ＶＩＩａ因子（終濃度１００ｎＭ）の０．１ＭＮａＣＩ、５ｍＭＣａＣｌ_２、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４溶液に添加する。４０５ｎｍの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）３４０プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）において連続的に測定する。２０分のインキュベーションの間に発生した吸光度を、酵素を含んでいない空のウェルの吸光度を減算した後に、変異体および野生型のＶＩＩａ因子活性の間の比を算出するために使用する：

比＝（Ａ_４０５ｎｍＶＩＩａ因子変異体）／（Ａ_４０５ｎｍＶＩＩａ因子野生型）。

その結果に基づいて、天然のＶＩＩａ因子に匹敵するか、それよりも高い活性を有するＶＩＩａ因子変異体は、たとえば変異体の活性および天然のＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性の間の比が、１．０を超える数値の周辺（ａｒｏｕｎｄ，ｖｅｒｓｕｓａｂｏｖｅ１．０）である変異体などとして同定されてもよい。

また、ＶＩＩａ因子またはＶＩＩａ因子変異体の活性は、Ｘ因子などの生理学的な基質を、適切には１００〜１０００ｎＭの濃度で使用して測定してもよく、この場合、Ｘａ因子の生成は、適切な色素生産性基質（例えば、Ｓ−２７６５）を添加した後に測定される。加えて、活性アッセイ法は、生理学的な温度で行ってもよい。

インビトロ・タンパク質分解アッセイ法
天然の（野生型）ＶＩＩａ因子およびＶＩＩａ因子変異体（両者とも、これ以降「ＶＩＩａ因子」と称する）を、平行して、直接これらの比活性を比較するためにアッセイする。アッセイ法は、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において行う。ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）およびＸ因子（０．８μＭ）の０．１ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４の１００μｌの溶液を１５分間インキュベートする。次いで、０．１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４を５０μｌ添加することにより、Ｘ因子の切断を停止する。生成したＸａ因子の量は、色素生産性基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）（終濃度０．５ｍＭ）の添加によって測定する。４０５ｎｍの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）３４０プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）において連続的に測定する。１０分の間に発生した吸光度を、ＦＶＩＩａを含んでいない空のウェルの吸光度を減算した後に、変異体および野生型のＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性間の比を算出するために使用する：

その結果に基づいて、天然のＶＩＩａ因子に匹敵するか、それよりも高い活性を有するＶＩＩａ因子変異体は、たとえば変異体の活性および天然のＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性の間の比が、１．０を超える数値の周辺である変異体などとして同定されてもよい。

トロンビン生成アッセイ法：
ＶＩＩ因子もしくはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、またはトロンボモジュリンもしくはトロンボモジュリン関連ポリペプチド（たとえば、変異体）がトロンビンを生成する能力は、生理的濃度での全ての関連した凝固因子および阻害剤および活性化された血小板を含むアッセイ法において測定することができる（Ｍｏｎｒｏｅｅｔａｌ．（１９９７）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９９，５４２−５４７の５４３ページに記載されている、これは本明細書に参照として援用される）。

トロンボモジュリン活性の試験：
トロンボモジュリン活性を試験することにより、本発明に使用する適切なトロンボモジュリンポリペプチドを選択するための手段を提供するのに適したアッセイ法は、たとえば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ等，ＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ３８：５４０，１９９８（「トロンボモジュリンアッセイ法」）に記載されたとおりの簡単なインビトロ試験として行うことができる。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。これまでの記載において、および以下の実施例において、開示された特徴は、別々に、およびその任意の組み合わせの両方ともが、本発明のその多様な形態に具現化するための材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）である。

ＴＭは、販売者（例えばＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）から購入し得る。
実施例１
ＶＩＩａ凝固因子および可溶性トロンボモジュリンを組み合わせることによって、止血性の血餅の安定度を改善する。

方法：
血餅溶解アッセイ法：イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ，２０００倍希釈）、ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／ＳＢａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ、種々の濃度）、およびｔ−ＰＡ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、８ｎＭ）を含む緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０倍に希釈した正常ヒト血漿を、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加して、６５０ｎｍの濁度を室温において時間とともに測定した。示した場合には、ヒトトロンボモジュリン（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、種々の濃度）を含めた。

結果：
血餅溶解アッセイ法：ＦＶＩＩａ添加により、血餅溶解時間（図１）の用量依存的な延長を生じる。この効果は、１０ｎＭのＦＶＩＩａで最適であった。１０ｎｍのＦＶＩＩａの存在下において、トロンボモジュリンを添加することにより、血餅溶解時間（図２）のさらなる延長を生じた。効果は、用量依存的であり、１０ｎＭのトロンボモジュリンで最適であった。

結論：
これらの結果は、血漿にＦＶＩＩａおよびトロンボモジュリンを添加することにより、血餅の線維素溶解に対する耐性を改善することを実証する。

図１は、血餅溶解アッセイ法において、ＦＶＩＩａの添加により、血餅溶解時間の用量依存的な延長が生じることを示す。この効果は、１０ｎＭのＦＶＩＩａで最適であった。図２は、１０ｎＭのＦＶＩＩａの存在下において、トロンボモジュリンを添加することにより、血餅溶解時間のさらなる延長を生じたことを示す。効果は、用量依存的であり、１０ｎＭのトロンボモジュリンで最適であった。

Claims

ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドを含む薬学的組成物。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
前記ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、ＶＩＩ因子アミノ酸配列変異体である、請求項２に記載の組成物。
請求項２または請求項３に記載の組成物であって、前記ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と天然のヒトＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比は、本明細書に記載されたとおりの「インビトロ加水分解アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１．２５である組成物。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、ＶＩＩ因子である、請求項１に記載の組成物。
前記ＶＩＩ因子が、ヒトＶＩＩ因子である、請求項５に記載の組成物。
前記ＶＩＩ因子が、組換えヒト因子ＶＩＩである、請求項６に記載の組成物。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、その活性型である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
前記ＶＩＩ因子が、組換えヒトＶＩＩａ因子である、請求項８に記載の組成物。
前記トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドが、トロンボモジュリン関連ポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドが、トロンボモジュリンアミノ酸配列変異体である、請求項１０に記載の組成物。
前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドの活性と天然のヒトトロンボモジュリン（野生型トロンボモジュリン）の活性との間の比は、本明細書に記載したとおりの「トロンボモジュリン色素生産性基質アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１．２５である、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
前記トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドが、トロンボモジュリンポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
前記トロンボモジュリンが、ヒトトロンボモジュリンである、請求項１３に記載の組成物。
前記トロンボモジュリンが、組換えヒトトロンボモジュリンである、請求項１４に記載の組成物。
前記トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリンである、請求項１５に記載の組成物。
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、および前記トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、約１００：１および約１：１００（ｗ／ｗＶＩＩ因子：トロンボモジュリン）の間の質量比で存在する組成物。
前記組成物は、注射または注入、特に注射のために適切な薬学的に許容される賦形剤を更に含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
出血の発症のための治療剤を含むパーツのキットであって、
ｆ）第１の単位剤形の、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の有効な量、および薬学的に許容されるキャリア；
ｇ）第２の単位剤形の、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の有効な量、および薬学的に許容されるキャリア；および
ｈ）前記第１および第２の剤形を含むための容器手段、を含むキット。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである、請求項１９に記載のキット。
前記ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、ＶＩＩ因子アミノ酸配列変異体である、請求項２０に記載のキット。
請求項２０または請求項２１に記載のキットであって、前記ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と天然のヒトＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比は、本明細書に記載されたとおりの「インビトロ加水分解アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１．２５であるキット。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、ＶＩＩ因子である、請求項１９に記載のキット。
前記ＶＩＩ因子が、ヒトＶＩＩ因子である、請求項２３に記載のキット。
請求項２４に記載のキットであって、前記ＶＩＩ因子ポリペプチドは、組換えヒトＶＩＩ因子であるキット。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、その活性型である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のキット。
前記ＶＩＩ因子が、組換えヒトＶＩＩａ因子である、請求項２６に記載のキット。
前記トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドが、トロンボモジュリン関連ポリペプチドである、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のキット。
前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドが、トロンボモジュリンアミノ酸配列変異体である、請求項２８に記載のキット。
前記トロンボモジュリン関連ポリペプチドの活性と天然のヒトトロンボモジュリン（野生型トロンボモジュリン）の活性との間の比は、本明細書に記載したとおりの「トロンボモジュリンアッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１．２５である、請求項２８または請求項２９に記載のキット。
前記トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドが、トロンボモジュリンである、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のキット。
前記トロンボモジュリンが、ヒトトロンボモジュリンである、請求項３１に記載のキット。
前記トロンボモジュリンが、組換えヒトトロンボモジュリンである、請求項３２に記載のキット。
前記トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリンである、請求項３３に記載のキット。
請求項１９〜３４のいずれか１項に記載のキットであって、前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、約１００：１および約１：１００（ｗ／ｗＶＩＩ因子：トロンボモジュリン）の間の質量比で存在するキット。
被験者における出血の発症を治療するための薬物の製造のための、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドと組み合わせたＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの使用。
被験者における出血の発症を治療するための薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
前記薬物が、凝固時間を減少するためのものである、請求項３６または請求項３７に記載の使用。
前記薬物が、血餅溶解時間を延長するためのものである、請求項３６または請求項３７に記載の使用。
前記薬物が、血餅強度を増大するためのものである、請求項３６または請求項３７に記載の使用。
前記薬物が、注射または注入、特に注射のために処方される、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の使用。
前記出血の発症が、外傷、または手術、または血小板の計数もしくは活性の低下による、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の使用。
前記薬物が、単一剤形である、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の使用。
前記薬物が、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を含む第１の単位剤形およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む第２の単位剤形の形態で調製される、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の使用。
被検者における出血の発症を治療するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に出血を治療するために有効である方法。
被検者における凝固時間を減少するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に凝固時間を減少するために有効である方法。
被検者における止血を増強するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に止血を増強するために有効である方法。
被検者における血餅溶解時間を延長するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に血餅溶解時間を延長するために有効である方法。
被検者における血餅強度を増大するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品の第１の量と、トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品の第２の量とを投与することを含み、前記第１および第２の量は、共に血餅強度を増大するために有効である方法。
前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドが、単一の剤形で投与される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチド、およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドは、ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの標品を含む第１の剤形およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの標品を含む第２の剤形の形態で投与される方法。
前記第１の単位剤形および前記第２の単位剤形が、１５分を超えない時間を離して投与される、請求項５１に記載の方法。
出血の発症のための治療剤を含むキットであって、
ａ）ＶＩＩ因子またはＶＩＩ因子関連ポリペプチドの有効な量およびトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリン関連ポリペプチドの有効な量並びに薬剤的に許容されるキャリアの単一の単位剤形；および、
ｂ）前記単一の単位剤形を含むための容器手段、を含むキット。