JPS6156197A - リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

技術的背景 本発明はリンホカイン類に関するものである。 更に詳しくは、本発明はリンホトキシンおよびその誘導
体に関するものである。 リンホトキシンは当初、新生細胞系統（ネオプラスチッ
ク・セルライン）に対して抗細胞活性を有する生物学的
因子として確認された。ミトゲン刺激−リンパ細胞から
得られ、リンホトキシンと命名された活性体は、ある種
の１１瘍細胞系統に対する細胞抑制作用から、他の形質
転換細胞に対する著しい細胞溶解活性番こ至る範囲の細
胞毒活性スペクトルを有する。しかしながら、リンホト
キシン活性は、−次細胞培養および正常な細胞系統に関
する試験では、殆んどまたは全く、抗細胞活性を示さな
いという特徴を有する。この様に、リンホトキシンは識
別性のある抗細胞特性を有すると予測されることから、
リンホトキシンが強力な抗腫瘍活性を有しているかも知
れないことを示唆するインビボ実験が行われる様になっ
た。 リンホトキシンという語句は一連の分子の呼称１こ用い
られてきた。リンホトキシン分子は、分子量に基いて５
つのクラスに分けられる糖蛋白質類であり、各クラスは
その電荷に関してヘテロジーニアス（異質）である。ヒ
ト−アルファ（ＭＷ７Ｑ−９０，０００）およびベータ
（ＭＷ２５−５０，０００）クラスのものは、はとんど
のリンパ球上澄液中に優勢に存在している様である。こ
のアルファＭＷクラスは電荷に基いで少くとも７つのサ
ブクラスに分けることができるが、ベータクラスは２つ
の明確に区別し得るサブクラスに分けられている〔Ｇ、
グー７７ガー（Ｇｒａｎｇｅｒ　）ら、モーゼ（Ｍｏｚ
ｃｓ　）ら編、１９８１、セルラー・レスポンスイズ・
トウ・モレキュラー・モジュレーターズ（ｃｅｌ　ｌ　
１１１　ｃｒＲｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌｅｒ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ　）　ｐｐ２８７−３１
０　）。更に、コンプレックス（ＭＷ＞　２００，００
０　）およびガンマ（ＭＷＩＱ−２０，０００）　リン
ホトキシン形も確認されている。様々なリンホトキシン
形やクラスは、安定性や培養中の出現動力学において互
い；こ異っている。 さらに、それらは低イオン強度条件下でコンプレックス
・クラスのものと凝集することもある。リンホトキシン
の内、低分子量クラスのものは高分子量クラスのものに
比べて比較的不安定であり、細胞溶解作用が弱いとされ
ている〔ヒセロット（Ｈｉ　ｓ　ｅｒｏｄ　ｔ　）ら、
１９７６．１セルラー・イムノロシイ（ｃｅ１ｌ　、　
Ｉｒｒｍｕｎ、　）”２６：２１１：グランガ−（Ｇｒ
ａｎｇｅｒ　）　　ら、ドウニック（Ｄｅ　Ｗｃｃｋ　
）ら編、１，９８０．バイオケミカル・キャラクタリゼ
イション・オブ・リンホカイン類（Ｒｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏ［Ｌｙｍｐ
ｈｏｋｉｎｅｓ　）　　ｐｐ２７９−２８３　］。ガン
マ・クラスは不安定なので、その活性について広範な研
究はなされていない（Ｇ、グランガーら、１９７８”セ
ルラー・イムノロシイ−３８：３８８−４０２）。ベー
タ・クラスも不安定であると報告されている〔ウォーカ
ー（ｗａｌｋｅｒ　）ら、１ジヤーナル・オブ・イム／
ロンイー（Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎ、　）１１６　［３］
　：　８０７−８１５　［１９７６，３月］〕。 リンホカイン１こ関する用語は一定でないことを理解し
ておく必要がある。今日では、細胞培養産物に対する命
名は、この産物を生成すると思われる細胞、および生物
学的分析における該産物の示す性質に基いてなされてい
る。しかしながら、大多数の研究が部分的に純粋な標品
を使用しており、また、産物を特徴づけるために採用さ
れた分析法が分）特異的でないために、十分な特徴っけ
がなされているとは言えず、いずれにしてもかなり変−
動しやすい。種々の細胞毒性因子類の真の同定は、アミ
ノ酸配列や免疫エピトープ（抗原決定基）の如き明確に
分析し得る識別可能な特性に基づいた標準的な用１府が
ないと、わからないままにおかれることになるであろう
。細胞毒性を有する細胞培養産物に付されたその他の名
称としては、例えば、腫瘍壊死因子、ＮＫ細胞細胞毒性
因子、出血性壊死因子およびマクロファージ細胞毒素ま
たはマクロファージ細胞毒性因子を挙げることができる
。 同時係属出願のＵ、Ｓ、Ｎ、　６０８　、３１６　（１
９８４年５月７日出願）、およびＥＰ　１．００．６４
１．　Ａ　（１９８４年２月１５日公開）には、ヒト−
リンパ芽球（様）細胞系統（セルライン）ＲＰＭＩ　−
１７８８から単離されたヒト−リンホトキシンのアミノ
酸配列が示されている。 ハヤシらは、ウサギの細網内皮系を刺激した後、該ウサ
ギから単離されるタンパク質について述へている（　Ｅ
Ｐ　１３２．１２５Ａ、　１９８５年１月２３目公開）
。このタンパク質は抗腫瘍活性を有し、そのＮ−末端ア
ミノ酸配列は、式：　　５ｅｔ−Ａ、Ｉａ　−３ｅｔ−
Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ　−Ｌｃｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｔ−Ｖａ
ｌ　−八ｌａ　−Ａｓｎ　−Ｐｒ。 −Ｇｌｎ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ−Ｃ；ｌｙ　−Ｇｌｎ−３
ｃｕ　−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ　　で示されることを報告し
ている。 また、同時係属出願のＵ、　Ｓ、Ｓ、Ｎ、　６２８　、
０５９（１９８４年７月５日出願）には、腫瘍壊死因子
として確認され、式：　　Ｖａｌ　−Ａｒｇ−５ｅｒ−
５ｅｒ　−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ
　−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−Δ１ａ−
１１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒ。 で示されるＮ末端アミノ酸配列を有する細胞毒性活性を
持ったヒト−ポリペプチドの精製およびその組換え合成
法が開示されている。 オオニシらは、ＢＡＬＬ−１細胞培養から、ヒト−腫瘍
細胞の増殖を抑制し、Ａｌ　ａ　−Ａｌ　ａ　　Ｎ末端
を有する７−７−９ｌ０００　　の物質（ｃＢｘ３と命
名）を得たことを開示している（アメリカ特許第４，４
８１，１３７号）。 トスおよびグランガ−（Ｔｏｔｈ　ａｎｄ　Ｇｒａｎｇ
ｅｒ　）ビモレキュラー・イムノロシイ（Ｍｏｌ　、　
Ｉｍｍｕｎ、）”１６　　：　　６７＋６７９　（１９
７９）］によると、ノイラミノダーゼ処理によってリン
ホトキシン含有リンパ球上澄液からシリアル酸を除去し
ても、あるいは該上澄液にＮ−アセチル−グルコサミン
、ガラクトース、ラクトース、マンノース、α−メチル
マンノジッドまたはフコースを加えても、インビトロで
の細胞溶解活性になんら影響を及はさないことが報告さ
れている。従って、トスらは、単糖類がこれらのリンホ
トキシン活性に寄与しているとは思われないと結論して
いる。しかしながら、トスらはまた、他のリンホカイン
類の作用には糖類が重要な役割を果していることを観察
しており、従って、それら糖類がリンホトキシンの細胞
毒性１こおいて、より複雑なオリゴ糖の形で関与してい
る、という説を排除し得ない、と結論している。 次いで、ブロクター（Ｐｒｏｃｔｏｒ　）、　クロスタ
ーガード（Ｋｌｏｓｔｅｒｇａａｒｄ　）　　およびグ
ランガ−（Ｇｒａｎｇｅｒ　）は、ツニカマイシン（ｔ
ｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の存在下（Ｎ−結合炭水化物部
分がリンホトキシン分子番こ付加されるのを避けるため
）、Ｉ’ｆｌＡてヒト−リンパ球を刺激すると、生物学
的に不活性なリンホトキシンが放出される、ということ
を報告している（ｌ′クリニカル・リサーチ（ｃ１ｉｎ
ｉｃａｌＲｅ５ｅａｒｃｈ　）”、　１９８２．３０　
ｆｉｌ　：　５５　Ａ　）。 彼らはまた、免疫化学的研究により、リンホトキシンの
炭水化物部分は、活性化されたリンパ細胞からその上澄
液中へのリンホトキシンの移送および放出、にとって必
須の部分ではないが、該炭水化物部分は、リンホトキシ
ン分子（類）が適切な立体配座をとるのに寄与している
ことから、標的細胞を効果的に破壊する一Ｌでは必須の
部分である、ということを明らかにした。 本発明との関係において検討されるべき他の文献には、
エバンス（Ｅｖａｎｓ　）、”カンサー・イムノロシイ
・アンド・イムノセラビイ’　１２　：　１８＋１９０
　（１９８２）；リー（Ｌｅｅ）ら、”４ｚｋ・イムノ
ロシイ”４８　　：　　１６６−１８１　（１，９７９
）：　トウＩツク（ＤｅＷｅｃｋ）　　ら編（１９８０
）、バイオケミカル・キャラクタリゼーション・オブ・
リンホカインズＰＰ　２７９−３１２　：カーノ（’　
　　　　　　Ｋｈａｎ）　　ら編（１９８２年６月３０
　「ｌ　＞ヒューマ７−リンホカインズ（Ｉｌｕｍａｎ
　　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　）ｐｐ４５９−４７７　
：　　アガーワＪｌ／　（Ａｇｇａｒｗａｌ　）ら、第
３回国際リンホカイン学会〔（ハバーフオード（ｌ１ａ
ｖｃｒｒｏｒｄ　）、　ＰＡ、にて、　１９８２年８月
１０〜５０）〕における発表；ランソノ、（Ｒａｎｓｏ
ｍ　）ら、。カンサー・リサーブ−”４３：５２２２−
５２２７（１９８３年１１月）；カル（Ｋｔ＋ｌＩ）　
　ら、１ジヤーナル・オブ・イムノロシイ−”１２６　
　＋４１　＋　１２７９−１２８３　（１９８１年４月
）；Ｊ、サワダら“ジャパン・ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メデイソン（Ｊｐｎ。 Ｊ　、　Ｆ、ｘｐ、　Ｍｅｄ、　）４６　　：　２６３
−２６７　（１９７６）：Ｇ、　　グランガーら、６セ
ルラー・イムノロシイ−”３８　　：３８８−４０２（
１９７８）：Ｊ。 ランゾル（Ｊ、　Ｒｕｎｄｅｌ　Ｉ　）ら、”　’（ム
／　７７−７コロジイ（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ　）３：９−１８（１９８１）：Ｇ、　グラン
ガ−ら１ジヤーナル・オブ・リンホカイン・リサーチ（
、Ｉ。 Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　）”　１　：　４５
−４９（１，９８２）：Ｎ、ラップ／ｌ／　（Ｎ、　Ｒ
ｕｄｄｌ　ｅ　）ら、“リンホカイ７　、　ｌリサーチ
（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　）”２：２３−３
１　（１９８３）：Ｍ、　　ミツハシら（イギリス特許
出願第２，１０６，１１７号）；■■、エノモト（ヨー
ロッパ特許出願第８７，０８７Ａ号）；Ｂ、ウィリアム
７７　（ｎ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　）”ら、”Ｐ、Ｎ
、Ａ。 Ｓ、ＵＳＡ”８０　　：　　５３９７−５４０１　　（
１９８３）およびＳ、ライト（Ｓ、Ｗｒｉｇｈｔ　）ら
、“ジャーナル・オブ・イムノロシイ−”１２６　　：
　　１５１６−１５２１　（１９８１）　　が含まれる
。 これまでにリンパ球培養物から得られたリンホトキシン
（またはリンホトキシンであると同定された物質）は、
ＲＰＭＩ　−１７８８細胞または一次リンパ細胞の上澄
液中に０．０５−２　ｘ　１０６　　単位／ｌ程度の低
濃度で含まれているにすぎない。 収穫計にはかなりの開きがあり、また−次リンパ細胞は
高価である。従って、リンホトキシンの経済的な製造方
法が求められている（ヤマモトら、１ジヤーナル・オブ
・バイオロジカル・レスポンス−モチイア　フイ’Ｖ−
ス（Ｊ、　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｐｏｎｓ
ｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ　）３　：　［１］　７６−８
７（１９８４））。 また、先行技術は、薬物の有用性にとって重要な点であ
る、アミノ酸配列に関してホモジーニアス（均質）なリ
ンホトキシンを得ること１こ成功を収めていない。細胞
系統（セルライン）の培養物から回収されたリンホトキ
シンは、多分タンパク質分解的なプロセッシングに起因
して、そのアミノ末端が不均質である（前記Ｕ、　Ｓ、
Ｓ、Ｎ、　５　Ｑ　８゜３１６参照）。−次リンパ細胞
（例、アデノイドまたは末梢血液から得たもの）の培養
物は、経済上の理由から、必然的に様々な供給源の細胞
を含有することになる。しかしながら、これらの細胞の
産物は供給源間の遺伝的な変動を反映しているので、得
られた１リンホトキシン”は事実」二、アレイツク（対
立遺伝Ｔ−）性の種（５ｐｅｃｉｅｓ　）の混合物とな
る。その様なアレル（対立遺伝Ｔ−）の比率を知り、同
定することは、ロットごとに異なるので、明らかに不可
能である。従って、アミノ酸配列に関して均質なリンホ
トキシンを製造する方法が求められている。 先行技術の方法は、天然ｆこ見出される物質の、−次ア
ミノ酸配列１こ相当する配列を有するリンホトキシンの
生産に限定されている。これらの配列中のアミノ酸を置
換または欠失させ、あるいは別のアミノ酸をその中に挿
入することは、それがかり；こ達成された１こしても、
広範囲１こ及ぶ、高価な化学的修飾を必要とする。従っ
て、リンホトキシンのアミノ酸配列中に、容易に変異を
導入する方法が求められている。 リンホトキシン活性の抗腫瘍効果、およびその明白な治
療的価値は１９６８年から文献中に報告されているにも
かかわらず、従宋法で得られたリンホトキシンが少量で
あることと、ヘテロジーニアス性を有していることから
、広範囲１こ及ぶ臨床的なプロトコールにおいて研究が
なされておらず、また商業化もされていない。従って、
臨床研究に適切な量のリンホトキシンを経済的に製造す
る方法が求められている。 リンホトキシンとして同定された物質をも含めＣて、種
々の細胞毒の細胞溶解活性を中和し得るウサギの抗血清
が文献に記載されている（ヤマモトら“セルラー・イム
ノロシイ−”３８：４０３−４１６（１９７８）：ゲイ
トシイ（Ｇａｔｃｌ　ｙ　）　　ら。 “セルラー・イムノロシイ−２７：８２−９３（＋９７
６）：ヒセロット（Ｉｌｉ　５ｃｒｏｄｔ　）ら、“ジ
ャーナル・オブ・イムノロシイ−”　１．１９　（２）
：３７４−３８０（１９７７）：ザカルチャック（Ｚａ
ｃｈａｒｃｈｕｋ　）ら、”　　Ｉ’、Ｎ、Ａ、Ｓ、（
ＩｓＡ”　８０：６３４］、−６３４５（１９８３年）
；ラッドルら“リンホカイン・リサーチ”　２　（］）
　２３−３１（１９８３）：マンネル（ＭＸｌｎｎｅｌ
　）ら、ゞインフエクション中アンド・イムニテイ−（
Ｉｎｆｅｃｔ　１ｎｎａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　）
”３３（１）：１５６−１６４　　（１９８１）：　　
ワラツク（ｗａｌｌａｃｈ　）　　ら、Ｅ、ドウメイヤ
ー（Ｅ、Ｔ）ｃ　Ｍａｃｙｃｒ　）ら編（ザ＋　ハイオ
ロジイー・オブ・ザ・インターフェロン・システム（Ｔ
ｈｅ　ＩＳｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎＳｙｓｔｅｍ）　ＰＰ２９３−３０２　（１，
９８３年９月発行）；およびストンーウオルフ（５ｈｏ
ｎｅ−Ｗｏｌ　ｆｆ　）ら、′ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メデイソン”　１５９　　：　８２８
−８４３　（１９８４年３月））。この抗血清はポリク
ローナルであるので、免疫原であるリンホトキシンに対
する多種多様の抗体を含有している。これらの抗体のど
れか１つまたはそれ以」〕が”リンホトキシン”活性を
中和するのに働いている。また、一般的に、これらの文
献報告は、免疫原として用いられたリンホトキシン活性
に係る物質の分子としての同定が不明確である。診断お
よび免疫親和性（イムノロシイニテイ）精製法において
は、明確かつ明瞭に同定されたリンホトキシン分子に対
する単一特異性抗体が必要とされる。本発明の目的は、
その様な抗体を提供することにある。 本発明の他の目的は、実質的に全てのリンホトキシン分
子の一次アミノ酸配列が同じである様なリンホトキシン
形の組成物の経済的な製造方法を提供することにある。 さらにまた本発明は、リンホトキシン形のアミノ酸配列
中に所定の変化をもたらす方法、特１こ、アミノ酸の欠
失、挿入、置換またはそれらを組合わせて行う方法を提
供せんとするものである。 発明の要約 本発明者らは、組換え法によってリンホトキシン活性を
有するタンパク質を発現させることに成功し、上記の目
的を達成した。本明細町において、その活性および天然
のあるいは安置型のアミノ酸配列によって示されるリン
ホトキシン種は、以降リンホトキシンと称する。驚くべ
きことに、ホモローガスな細胞内では微少レベルのリン
ホトキシンしか発現されず、また、どの時点てリンホト
キシンを暗号化したメツセンジャーＲＮＡがホモローガ
ス細胞中に現れるかが不確かであるにもかかわらず、リ
ンホトキシンを暗号化しているＩ）Ｎ　Ａが同定された
。さら１こ驚くへきことに、リンホトキシンをグリコシ
ル化しない組換え細胞（ある・ハは、ホモローガス細胞
と同様にその様な作用を持たないだろうと考えられる組
換え細胞）内で、生物学的に活性なリンホトキシンを発
現させると１（に、この様にして発現された、実質的に
均一なアミノ酸配列を有するリンホトキシンを、Ｎ末端
の酵素的加水分解を伴なうことなく、回収することがで
きた。リンホトキシを暗号化しているＤＮＡは、細胞培
養内で、培養ＩＪゼイト（溶菌液）１／中に０．１〜１
．　ｘ　１０”　　単位以上というおびただしい掛で発
現される。 組換え宿主細胞によるリンホトキシンの発現は、リンホ
トキシンまたはその前駆体を暗号化するのに用いたＴ）
ＮＡ、並びＩこ選択した宿主細胞によって左右される。 本発明においてリンホトキシンの合成に用いた核酸配列
は新規である。それらのヌクレオチド配列は、固有の、
または天然の配列から、以下に示す相違点の１またはそ
れ以」二において異ることを特徴としている：　ｒ）Ｎ
Ａ中にイントロンが含まれていない（ヒト−リンホトキ
シンの場合、ヌクレオチド２８４と２８５の間にイント
ロンが存在する（第２ａ図））；ＤＮＡ中に、該ｒ）Ｎ
Ａの起源である生物の他のタンパク質を暗号化している
核酸が含まれていないニリンホトキシンを暗号化してい
る核酸がベクター内にライゲー′　　　　　　トされて
いる；そして／またはこの核酸は、リンホトキシンを暗
号化している核酸と雑種形成（ハイブリダイズ）するこ
とができる（ただしこのハイブリダイズする核酸は、リ
ンホトキシンを暗シ、Ｈ−化している天然のＤＮＡまた
はＲＮＡのヌクレオチド配列を持ってはいない。）。 リンホトキシンを暗号化している核酸突然変異体は組換
え操作によって生産される。リンホトキシンの５′非翻
訳または翻訳核酸に於けるサイレント突然変異を行なう
。例えばｍ　ＲＮ　Ａの核酸の５′領域にステム・アン
ド・ループ構造が生じる可能性を減少させたり、天然の
核酸単離体中に見出されるコドンを宿主にとって好まし
いコドンで置換したりすることにより、選択した宿主内
での発現を促進することができる。 サイレントではなくて、発現される核酸の突然・変異に
より、固有のリンホトキシンのアミノ酸配列を持つリン
ホトキシン種、または固有のリンホトキシンと異なるア
ミノ酸配列を有する、その−次配列変異体を生成させる
ことができる。突然変異体リンホトキシンはそのまま回
収するが、または宿主細胞内でさらに加工され、所望の
リンホトキシンを得る。 これらの核酸またはそれとハイブリダイズする核酸、あ
るいはそれらのフラグメントを標識化し、リンホトキシ
ンを暗号化している遺伝的物質の同定または確認のため
のハイブリダイゼーション・アッセイに用いる。 リンホトキシンの合成法は、リンホトキシンを暗号化し
ているＤＮＡをベクターにライゲートし、このベクター
を用いて宿主細胞を形質転換し、この宿主細胞を培養し
、その培養からリンホトキシンを回収することからなる
。この一般的な方法を用い、ベクターの組立ておよび形
質転換のための宿主の選択に応じて、固有のリンホトキ
シンのアミノ酸配列を有するリンホトキシンを合成する
が、あるいは、新規なリンホトキシン変異体を組立てる
。本発明に従って得ることができるリンホトキシン種に
は、ロイシル（ロイシン）−アミノ末端リンホトキシン
、ヒスチジル（ヒスチジン）−アミノ末端リンホトキシ
ン、プレーリンホトキシン、並びに以下に示す種々のリ
ンホトキシン変異体が含まれる：（ａ）ヘテロローガス
なタンパク質またはポリペプチドがペプチド結合によっ
てリンホトキシンのアミノ末端および／またはカルボキ
シ末端に結合してなる融合タンパク質、（ｂ）リンホト
キシンフラグメントであって、特に、そのフラグメント
のアミノ末端アミノ酸がプレリンホトキシンの−３４か
ら＋２３までのアミノ酸のいずれかである様な、プレリ
ンホトキシンのフラグメント、（ｃ）１または１以上の
アミノ酸残基がｉｆ換、挿入または欠失しているリンホ
トキシン突然変異体、（ｄ）メチオニルアミノ末端誘導
体、または修飾されたメチオニル（ホルミルメチオニル
、その他の保護されたメチオニル基）アミノ末端誘導体
、および／または（ｅ）以上全て（ごついて、グリコシ
ル化されていないものおよび様々にグリコシル化された
もの。 真核性の分泌型リーダー配列（リンホトキシン固有の分
泌型リーダーを含む）に機能的にライゲート（結合）し
たリンホトキシン暗号化核酸によって哺乳類細胞を形質
転換するが、あるいはリンホトキシンを暗号化している
核酸を、ベクター内の原核性または酵母性の分泌リーダ
ー配列であって形質転換しようとしている宿主細胞が認
識し得るリーダー配列（通常、宿主細胞は、リーダー配
列の供給源微生物である）に機能的にライゲートし、こ
のベクターで形質転換した宿主を培養すると、その培養
物からアミノ末端がメチオニル化されていないリンホト
キシン種を常法通り回収することができる。 また、リンホトキシンを暗号化しているＤＮＡを分泌リ
ーダー配列を含んでいないベクターに機能的にライゲー
トさせ、これを用いて宿主細胞を形質転換する場合は、
通常合成されるリンホトキシン種は、アミノ末端メチオ
ニル残基またはホルミルメチオニルの如き修飾されたメ
チオニル残基で言換される。 本発明は、これまでは入手することができなかったリン
ホトキシン変異体を発現させる様、イン−ビトロにおい
てリンホトキシンを暗号化している核酸に突然変異を起
こす方法を提供するものである。第一の方法は、リンホ
トキシンを暗号化しており、直接的に発現される（即ち
、分泌リーダー配列と機能的に結合していない）核酸で
形質転換した宿ＪＥ細胞により、Ｎ末端メチオニル、ま
たは修飾メチオニルリンホトキシンを発現させる方θζ
である。 第二の方法は、インビトロにおいて、部位特異的に、所
定のまたはランダムな突然変異を誘発し、リンホトキシ
ンを暗号化している核酸に、欠失、置換および／または
挿入を行なう。この様１こしてリンホトキシン融合物を
生成させる。突然変異した核酸の発現によって得られる
リンホトキシンは、改良された特徴を示す。 最後の方法では、新規なリンホトキシン種である、グリ
コシル化されていないまたは異様にグリコシル化された
リンホトキシンを得る。非−グリコシル化リンホトキシ
ンは、リンホトキシンを暗号化しているＤＮＡの原核生
物内での発現によって生産される。異様にグリコシル化
されたリンホトキシン種は、より高等な真核細胞（通常
、哺乳類の細胞）の形質転換体の組換え培養により、生
産される。 本発明方法で生産されたリンホトキシンは、培養物の上
澄みまたはリゼイト（溶解物）から、不溶化されたリン
ホカイン中和抗体を使用したイムノアフイニテイ吸着法
により精製することができる。モノクローナル細胞培養
中で最も効率良く生産されるこの抗体は、明ばん（アル
ム）に吸着させたリンホトキシンで免疫化したマウスで
生成させる。 本発明に係るリンホトキシンは、生理学的に無毒な安定
剤や賦形剤と混合し、投薬ビン内で凍結乾燥して滅菌投
与剤形にするが、安定化した水剤の形で保存し、治療に
用いることができる。あるいは、このリンホトキシンを
ポリマー・マトリックスの中に組込ませ、腫瘍部位また
は腫瘍切除番こ係る術後部位１こ埋め込むこと１こより
、リンホトキシンが局所同番こ高い濃度勾配で、好機ｌ
こ放出される様にすることもできる。 本発明に係る治療用組成物は、その治療有効険を、悪性
腫瘍を有する動物、特ｌこ人間の患者に、埋め込み、注
射または注入すること１こより、投与し得る。 図面の解説 第１ａ図はリンホトキシンフラグメントを暗号化してい
るＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列の模式図である
。 第１ｂ図は第１ａ図に示したフラグメントを暗号化して
いる合成りＮＡの組立て模式図である。 第２ａ図はプレリンホトキシンの全アミノ酸配列、並び
１こ、５′および３′非翻訳領域をも含めた、その暗号
ＤＮＡの模式図である、 第２１）図はメチオニル・ロイシル−アミノ末端リンホ
トキシンおよびそのアミ／末端メチオニル誘導体のため
の発現ベクターの組立て方法を示Ｖ模式図である。 第３図はメチオニル・ヒスチジル−アミノ末端リンホト
キシンのための発現ベクターの組立て方法を示す模式図
である。 第４図はヒト、ネヅミおよびウシのリンホトキシンアミ
ノ酸配列、並び１ここれらの哺乳類におけるリンホトキ
シン共通（コンセンサス）塩基配列を示す模式図である
。 第５３および５ｂ図はリンホトキシンと細菌性シグナル
配列の融合物を暗合化しているプラスミドの組立て模式
図である。 詳細な説明 本明細書中では、リンホトキシンを、実質上、第２　ａ
図に示したリンホトキシンのアミノ酸配列の少くとも１
部分とホモロジイ（相同）な構造アミノ酸頭域を有する
、生物学的に活性なポリペプチドと定義する。生物学的
活性は以下に述べる選択的な細胞毒活性、細胞毒リンホ
トキシンとの免疫交差反応活性、あるいは細胞表面のリ
ンホトキシン受容体１こ対する細胞毒リンホトキシンと
の競合能力に基づいて定められる。後二者の場合におい
ては、リンホトキシンがそれ自体、細胞毒性であること
を要しない。免疫学的交差反応性を有す′　　　　　　
る突然変異体は動物の体内に抗リンホトキシンを生成さ
せるための免疫原として有用であり、例えばイムノアッ
セイ用試薬を製造する上で有用であ（ト） す、一方非一細胞毒性の競合的突然変異体は、生物学的
に活性なリンホトキシンの競合的なイムノアッセイ１こ
おいて、標識化した試薬として用いることができる。 選択的細胞毒活性とは、インビボまたはインビトロにお
いて、同じ条件下にある正常細胞と比較した場合に、腫
瘍細胞を優先的に破壊するかまたはその増殖を阻害する
様な活性である、と定義する。活性の測定においては、
インビトロでは溶解、インビボでは壊死による腫瘍細胞
の破壊を終末点に用いるのが好ましいが、細胞性塞栓活
性または増殖阻害活性を利用してもよい。 リンホトキシンの抗細胞活性を検出するのに好適な測定
法はＢ５　　アガーワル（Ｒ，Ａｇｇａｒｗａｌ　）ら
１ジヤーナル・オブ・バイオロジカルケミストリイ”　
２５９（＋）、６８９−６９１およびＥ、カースウニｋ
　（Ｅ、Ｃａｒｓｗａ目）ら、１９７５、′プロシーデ
ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンスイズ・オブ・ザ・ＵＳＡ”７２．３６６６−
３６７０によって示されている。 本明細書中では、リンホトキシンの特異活性を、細胞塞
栓活性ではなく標的細胞の溶解に基ついて定義する。リ
ンホトキシン１ｆ１１位は、実施例１に記載する如く、
各ウェル１こプレートした標的細胞の５０％を溶解させ
るのに必要な量である、と定義する。しかしながら、他
の細胞毒活性の測定方法も可能である。 実質的に構造上ホモロジイ（相同）である、とは、通常
、そのポリペプチド中のアミノ酸残基の内約６０％以」
−１一般的には約７０％以−Ｌが第２３図Ｉこ示した対
応する残基と同じであるかまたは保存的置換であること
を意味する。 リンホトキシンポリペプチドの全配列が第２ａ図に示し
た配列とホモローガスである必要はない。 そのものが所望の生物学的活性を示す限り、一部分だけ
が第２ａ図の配列中のどこかとホモローガスであっても
よい。通常、ホモロジイ領域は、ホモロジイを浪人にす
るために時折ギャップを導入する必要があるということ
をふまえた上で、約２０〜１００アミノ酸残基の領域に
ついて証明されることが必要である。 第２ａ図１こ示した配列とホモロジイである領域がリン
ホトキシンの鍵（ｋｅｙ）領域（即ち、細胞毒活性Ｉこ
とって重要な領域）の１つでない場合は、この定義の範
囲に入るポリペプチドに要求されるホモロジイはもつと
少なくてよい。第２ａ図の配列中の鍵鎮域は残基約１６
２〜１７１．５２〜８３および１２７〜１４８の領域で
あると思われる。 リンホトキシンは、具体的１こヒトの１）ＴＴ傷の壊死
因子、または天然の動物におけるその類似体を除くと定
義されている（Ｄ、ペニカ（＋）、　Ｉ’ｅｎｎｉｃａ
　）ら、′ネイチャ−”　３１２　　＋　２０／２７　
１９８４年１２月号、ＰＰ、　７２４−７２９　、およ
び＋３　、　　アガーワルら”ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリイ　″　２６０　［４］　：　
　２３４５−２３５４（１９８５］　）。 構造−にの類似性とは、アミノ酸側鎖の主要な特性、例
えば塩基性、中性または酸性、親水性または疎水性、あ
るいは立体的な大きさがあるか無いか等の性質について
の類似性をいう。構造−に類似であるアミノ酸の一方を
他方と置換することは、当該技術分野で通常、保存的置
換として知られている。 あるポリペプチドがリンホトキシンであると同定するＬ
で重要なファクターは、実質的にホモジーニアスなリン
パ芽球様（または天然の）リンホトキシンを実質上中和
し得る抗血清が、該ポリペプチドの細胞毒活性をも実質
に中和することができる、ということである。しかしな
がら、免疫学的な同定と細胞毒に基く同定とは必ずしも
同じ幅を持っている訳ではないことは理解されよう。例
えば、第２ａ図のリンホトキシンに対する中和抗体は、
該中和抗体がたまたまりンホトキシンの細胞毒活性にと
って必要な領域に隣接した領域に結合するものである、
という理由で（ただしこの中和抗体はリンホトキシン活
性部位に対する立体障害作用を介して中和作用を奏する
）、リンホトキｐ　　　　　　シン候補のタンパク質と
は結合しないかもしれない。この様な無関係な領域に突
然変異を生じた候補タンパク質はもはや中和抗体とは結
合しないが実質的なホモロジイ−および生物学的活性、
という観点からは依然、リンホトキシン゛Ｃある。 リンパ芽球様細胞系統（セルライン）の咄徨１こよって
得られたリンホトキシンは次の特徴を白゛する：分子−
量はグリコシル化およびＮ末端の変化の程度に応じて、
２０，０００または２５，０００　である：・Ａｓｎ＋
６２　（’５２　ａ図参照）がグリコシル化されている
：凝集し易く、特にマルチマー（重合体）を形成し易い
；等電点は約５．８である：　ｐＨ変化に不安定である
（重炭酸アンモニウム緩衝液（ａ度ＩＯμｇ／ｍｌ）中
、ｐｌ＋レベル約５以ドまたは約１０以」二で２４時間
保つと、細胞上活性が５０％以上失われる）；水溶液中
で、８０℃において５分間インキュベートすると実質的
に活性か消失する。２種類の分子−ｉのリンパ芽球様リ
ンホトキシン種が同定されている。それらリンパ芽球様
リンホトキシンの内、２５　、　ｏｏｏｃｌａ種はアミ
ノ末端にロイシン残基を有している。この２５，０００
ｄａ種の一次アミノ酸配列を有するポリペプチドはロイ
シル（ロイシン）−アミノ末端リンホトキシンと呼ばれ
る。リンパ芽球様リンホトキシンの内、２０，０００ｄ
ａ　　種はアミノ末端にヒスチジンを打することが特徴
であり、相当する配列をヒスチジル（ヒスチジン）−ア
ミノ末端リンホトキシンと称する。これらの特徴がリン
パ芽球様細胞培養から得られた天然の、あるいは野生型
のヒ）−リンホトキシンを友わしているということを認
識することは重要なことである。本明細書で定義したリ
ンホトキシンには天然の、グリコシル化されたリンホト
キシンが含まれるが、その他の関連の細胞心性ポリペプ
チドも定義の範囲内に含まれる。 例えば、動物のリンホトキシンに一般に付随しているグ
リコシル化部分は、ヘテロローがスな真核性の組換え宿
主細胞内で発現される場合には修飾されるかもしれず、
その結果、ヒト−リンパ芽球様リンホトキシンについて
鑞立されている分子社あるいは等重点と異なる性質の、
修飾されたリンホトキシンが生成されること１こなる。 組換え細菌ｊ＆養中では、それ用応の修飾を受けた分Ｐ
−１、等１点、およびその他の特性を持った、全くグリ
コシル化されていないリンホトキシンが生産される、。 さらに、ある動物種（第１番目の動物）から得られた細
胞系統内で他種動物（第２番目の動物）のプレリンホト
キシンが翻訳後プロセッシングを受けると、その第２番
目の動物種の場合において通常であるものとは異るアミ
ノ末端残基が７５られるかもしれない。同様に、本発明
の突然安置誘発方法によって、例えばリンホトキシンの
アミノ酸配列やＮ末端を変化させ、そうすることにより
、ｐＨ安定性や等電点を改良することができる。 翻訳されたヒト−リンホトキシンのアミノ酸配列を第２
ａ図に示した。この配列中には３４残基からなるプレー
配列が含まれており（その突然変異体を含めて、ここで
は０プレーリンホトキンン”と称する）、これはヒト−
細胞内での翻訳された転写体の正常なプロセッシング過
程で除去さｒし、その結果ロイシル（ロイシン）−アミ
ノ末瑞挿か得られる、という点に留意Ｃへきである。ヒ
スチジル（ヒスチジン）−アミノ末端種は、このロイシ
ル−′ｒミノ木端種の最功の２３個のアミノ酸を有しな
いことを除いて、該ロイシルーアミノ末端種とホモロー
ガスである。これらの３種、即ち、プレーリンホトキシ
ン、ロイシル−アミノ末端リンホトキシン、およびヒス
チジル−アミノ末端リンホトキシンは全て、そのメチオ
ニル突然変異体、修飾されたメチオニル突然変異体、お
よび非−グリコシル化体と共に、本発明のリンホトキシ
ンの範囲内に包含される。非−グリコシル化体およびヒ
スチジル−アミノ末端種は、前記のリンパ芽球様細胞か
らのホモローガスな種よりも低分子量であろう。 プレーリンホトキシンは前述の定義の範囲内に含まれる
リンホトキシンの一種である。その特徴は、分子のアミ
ノ末端にシグナル（またはリーダー）ポリペプチドが存
在することにある。一般に、リンホトキシンの天然のシ
グナル（信号）ポリペプチドは、このタンパク質が細胞
から分泌される′　　　　　際の分泌プロセスの一プロ
セスとして、リンホトキシンからタンパク分解的に開裂
される。この信号ペプチドは微生物あるいは哺乳動物（
天然の、この３４残基からなるプレー配列をも含む）の
いずれのものであってもよいが、病上細胞にとってホモ
ローガスな信号であることが好ましい。ある種の信号−
リンホトキシン融合物は宿主細胞によって認識されず、
Ｎ−末端のメチオニン不含リンホトキシンｌこ加工”プ
ロセス”されない。微生物性の信号を含有する融合物は
、例えばリンホトキシン免疫源として用いることができ
る。 “細胞毒活性を有する”という語句は、例えば酵素的加
水分解を受けて、酵素原に似た不活性な状態から、所望
の生物学的活性を現わすポリペプチドフラグメントへと
変換され得るポリペプチドを含むリンホトキシンを示す
ことに注目されたい。 インビトロまたはインビボで′細胞毒性活性を有する”
という語句は、例えば酵素的加水分解により、酵素原に
似た不活性な状態から明確な生物学的活性を現わすポリ
ペプチドフラグメントに変換され得る、非−細胞毒性ポ
リペプチドを包含する。 一般に、不活性な前駆体は、リンホトキシンのカルボキ
シ末端に他のタンパク質またはポリペプチドがペプチド
結合を介して結合している融合タンパク質である。イン
ビボで、あるいはまたインビトロにおける製造工程の一
段階として、タンパク分解的加水分解を受は易くしてリ
ンホトキシンを放出させるために、このポリペプチド結
合またはその近くの配列を選択する。代表的な結合配列
はｌｙｓ−ｌｙｓまたはａｒｇ−１７ｓ　である。その
様なプロリンホトキシン中の非リンホトキシン成分は、
該融合物の免疫原性を最少限度にするため、ホモローガ
スなタンパク質であることが好ましい。このホモローガ
スなタンパク質は無毒であり、かつ細胞表面と結合しな
いものであることを要する。 この様ｌこして生成したリンホトキシンは、明確な、所
望の細胞毒活性を現わす。 通常、リンホトキシンとはヒト−リンホトキシンを表わ
すが、ネズミ、ブタ、ウマまたはウシの様な他の供給源
から得られたリンホトキシンも、それが、ホモローガス
領域および生物学的活性］こ関して述べた前の基準に合
致する限り、リンホトキシンの定義内Ｉこ含まれる。例
えば、ウシおよびネズミのリンホトキシンはヒト−リン
ホトキシンと高度（約８０％）のホモローガス性を有す
る。 リンホトキシンは種特異的でなく、例えばヒト−リンホ
トキシンはマウスの腫瘍および新生細胞系統に対して活
性である。従って、ある種から得たリンホトキシンを他
の種の治療）こ用いることができる。 リンホトキシン−とはｍ台形も含まれる。リンホトキシ
ンは自然に凝集し、通常、二重体またはそれ以上のマル
チマーに重合する。マルチマーは細胞毒性を有するので
インビボでの治療に用い得る。 組換え宿主内で発現されるリンホトキシンはモノマーで
ある。しかしながら、その後、リンホトキシンは自然に
マルチマーを形成する傾向がある。 均質なマルチマー、あるいは種々のマルチマーの混合物
は治療−Ｌ有用である。 変異型リンホトキシンには、第２ａ図に示した分子の予
め定められた、または標的をしはった変異体、即ち、部
位特異的突然変異体またはそのフラグメントが含まれる
。変異型リンホトキシンとは、そのアミノ酸配列が、残
基の欠損、置換または挿入のいずれかによって第２ａ図
に示した配列と異っていることを特徴とする、という点
を除けば、リンホトキシンについて定義した特性を有す
るポリペプチドを意味する。本明細書中に述べる非−ヒ
トリンホトキシン、およびヒト−リンホトキシンのアレ
ル体は、天然の対応物を持たない部位指定性突然変異リ
ンホトキシンであるといえる。 突然変異変異型誘発の目的は、上１こ定義したリンホト
キシンをコードしており、かつ、天然のリンホトキシン
の生物学的活性を改良し、あるいは、リンホトキシンの
製造を容易ならしめるという特性を示すＤＮＡを組立て
ることにある。例えば、リジン残基の代りＩこヒスチジ
ン残基を発現させるためにりジン＋８９コドンを突然変
異させる。このヒスジン＋８９はもはやトリプシンで加
水分解されない（トリプシンは、通常、ａｒｇ　−Ｘま
たはｆ　　　　　　　ｌｙｓ−Ｘ結合の位置でタンパク
質を開裂する）。 かくしてプロテアーゼ耐性を得たこの突然変異体は、第
２ａ図の配列を有するリンホトキシン（またはそのフラ
グメント）よりも長い生物学的活性明を有することにな
る。その他のリンホトキシン内のリジンまたはアルギニ
ン残基（例、リジン−１２８、リジン＋１９またはアル
ギニン＋１５）もヒスチジン１こ変異させることができ
る。 前記の如く、リンホトキシン分子のある領域は腫瘍壊死
因子と呼ばれる類似した活性を有するタンパク質と実質
上ホモロジイである。この様な、実質的Ｅこホモロジイ
な領域またはそのすぐ両隣りの領域のアミノ酸残覗は、
様々な生物活性、および細胞毒活性を示すリンホトキシ
ン突然変異体を同定することを目的として突然変異を誘
発するのに好都合である。その様な突然変異体は自体既
知の方法で生成させることができ、所望の生物学的活性
、例えば治療すべき特定の新生物に対して増強された細
胞毒性、あるいは動物の免疫化を目的とするリンホトキ
シン種の場合ならば、より強力な免疫応答を若起させる
能力等に関してスクリーニングする。その様なリンホト
キシン変種の例を吹下に示す：Δｌａ＋１．６８を分枝
鎖アミノ酸（ｖａｌ、ｉｌｅ　　またはｌｅｕ　）に変
異させる；ｔｂｒ＋１６３とｖａｌ＋１６４の間に疎水
性アミノ酸（例、ｐｈｅ、　　ｖａｌ、ｉｌｅまたはＩ
ｅｕ）を挿入するＨｔｈｒ＋１６３をチロシンで置換す
る；ＳＣｒ＋８２　をリジンで置換する：　　ｓｅｒ　
＋４２をイソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、
バリンまたはヒスチジンで置換する；　ｌｙｓ　＋８４
　をグルタミン、トリプトファン、セリンまたはヒスチ
ジンで置換する；ＳＣｒ＋８２を欠失させるＨ　ｌｅｕ
＋１７１　　に疎水性のジーまたはトリペプチドを融合
させる；ｔｈｒ＋１６３　　をアスパラギン酸またはリ
ジンで置換する；　ｇｌｕ＋１２７と　ＰｒＯ＋１２８
　との間にａｌａ−１７ｓを挿入する：ｓｅｒ＋７Ｑを
リジンまたはグリシンで置換する；ｔｈｒ＋６９をチロ
シンで置換する：　　Ｉｙｓ＋２ｓをアルギニンまたは
ヒスチジンで置換するＨｈｉＳ＋３２をアルギニンまた
はリジンで置換する：　ａ　ｓ　ｐ　＋３５　　をプロ
リン、セリン、スレオニン、チロシンまたはグルタミン
酸で置換する：ｓｅｒ＋３８をチロシン、メチオニンま
たはグルタミン酸で置換する；Ｓｅｒ”５１をスレオニ
ン、チロシン、ヒスチジンまたはリジンで置換する：　
ｇｌｙ　”−１２４をアスパラギン酸、セリンまたはチ
ロシンで置換する：　ｈｉｓ　’　３３５をアルギニン
、リジン、チロシン、トリプトファンまたはプロリンで
置換する；　ｔｈｒ　＋１４２をアスパラギン酸で置換
する；そしてｇｌｎ’１４６をリジンまたはスレオニン
で置換する。 ヒト−リンホトキシン残基の＋２０　、　　＋ｔ　２゜
および＋１３３１こおけるメチオニン残基が欠失してい
る突然変異体が特ｌこ望ましく、あるいは、更に好まし
くは、それらが本明細書中に記載した他の種のリンホト
キシン中１こ見出される、対応する残基で置換されてい
る突然変異体が特に好ましい。 例えば、ｍｅＬ＋２０、＋１２０および」月３３をそれ
ぞれスレオニン、セリンおよびバリンで置換する。これ
らはウシ−リンホトキシン中の対応残基である。置換は
、自体既知の方法に従い、史ζこＭ１３Ｍｐ８ファージ
を用いた突然変異誘発■稈を経てｍｅｔ＋１３３をｖａ
ｌに変異させることを除けば、実施例９１こ示＋た方法
番こよって行うことがてきる。この突然変異体である、
動物種ハイブリッドリンホトキシンＤＮＡを実施例７に
おけるロイシルーアミノ末端ＤＮＡの代りに用い、融合
物として発現させる。既知の方法Ｉこ従い、臭化シアン
を用いてこのハイブリッドリンホトキシンからＳ−ｒｌ
ｌ　　シグナ）Ｌ／　（信号）を開裂させ、成熟ロイシ
ルーアミノ末端リンホトキシン変種を回収する．、その
他の有用なリンホトキシン変種は、腫瘍壊死因子中の残
基対応するリンホトキシン残基が置換されで形成された
ハイブリッド・腫瘍壊死因子−リンホトキシン変異体で
ある。その代表例は、成熟腫瘍壊死因子の最初の８、９
または１０個の残基（例、ｖａｔ　−　ａｒｇ−ｓｅｒ
　−　ｓｅｒ−ｓｅｒ　−ａｒｇ　−ｔｈｒ−ｐｒｏ−
ｓｅｔ−ａｓｐ　−　）　　でロイシル・アミノ末端リ
ンホトキシンの最初の２７残基が置換されたものである
。この変種は大ｔｌＪ％菌（　Ｅ，　ｃｏｌ　ｉ　）内
での直接発現に際して、Ｎ末端の脱メチオニル化を一 より起こし易いと思われる。 突然変異誘発部位は予め定めておくが、突然変異そのも
のを予め定めておく必要はない。例えばヒスチジン＋８
９での適切なリンホトキンン突然変異体を得るためには
、リジン＋８９１こ関するコドン１こ無作為な変異誘発
を行い、発現されたリンホトキシン突然変異体を、細胞
毒活性とタンパク分解酵素耐性の適当な組合わせにつ，
）てスクリーニングする。 リンホトキシンには、通常、アミノ酸残基数約１〜】０
程度の挿入、または約１〜３０残基の欠失も含まれる。 置換、欠失、挿入、またはそれらの併用、等を組合わせ
て最終的な組立てを行う，，挿入番こけ、アミノ末端ま
たはカルボキシ末端の融合、例えばカルボキシ末端１こ
疎水性の延長部分を付加すること、も含まれる。しかし
ながら、置換的突然変異誘発だけを行うことが好ましい
。言うまでもなく、暗号ＤＮＡ内における突然変寮は、
その配列をリーディングフレーム外Ｉこ位置せしめるよ
うなものであってはならず、また、ｍＲＮＡの二次構造
を形成させる可能性のある…補領域をつくらないことが
好ましい。ロイシルーアミノ末端リンホトキシンの後部
１６個のカルボキシ末端アミノ酸、または前部約３３個
のアミノ末端残基が欠失されたリンホトキシン突然変異
体を暗号化しているＤＮＡを含有するベクターで形質転
換された太陽閑の抽出液は細胞毒活性を示さない。しか
しながら、この活性の欠如の原因は不明であり、後述の
実施例１に示した理由のいづれかによるものであろう。 リンホトキシンを暗号化しているＤＮＡｌこ於ける突然
変異の全てが組換え細胞培養内で最終的な生産物として
発現されるわけではない。例えば、置換型のｒ）ＮＡ突
然変異体の主なものは、第２ａ図の分泌リーダーが、そ
の３４個のリーダー残基内での欠失、または置換のいず
れかにより、固有のリーダー配列の全部または大部分を
所望の宿主ｌとよって一層認識され易いリーダーに置き
換え、別のリーダー配列６こ変えたものである。例えば
、原核件の発現ベクターを組立てるには、第２ａ図の分
ｗＩＪ−ダーを細菌性のアルカリ性ホスファターゼまた
は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーに有利吟な様
に欠失さゼ、酵母のための発現ベクターを組立てる１こ
は、第２ａ図のリーダー配列を酵母インバターゼ、アル
ファ因子、または酸ホスファターゼ・リーダーに好都合
な様に置換する。 しかしながら、このことはヒト分泌リーグがヒト細胞系
統以外の宿主では認識されない、ということを意味する
ものではない。宿主によって分ｂｌ　ＩＪ−グーが１認
識”されると、通常、リンホ１・キシンとリーダーから
なる融合タンパク質はリーダー−リンホトキシン間のペ
プチド結合の位置で切り開かれ、通常リンホトキシンが
分泌される。この皺に、宿主の形質転換に突然変異１’
）ＮＡを用いても、得られるリンホトキシン生産物は、
融合物のプロセツシングに関する宿主の機能に応じて、
融合型、または固有のリンホトキシンのいずれかとなる
。 リンホトキシン変貰体として発現されないもう一つの主
要なＤＮＡ突然変賓体は、発現を促進ずる様にヌクレ詞
チド置換を行なうものであり、（それは、主として転写
されたｍＲＮＡ内でステム・アンド・ループ構造が生じ
るこきを避ける（同時出願係属中のｔＪ、ｓ、ｓ、Ｎ、
　３０３　、６８７号参照）ことにより行なう）、かも
う１つは選択した宿主内で、より転写され易いコドンを
与える（例えば、大腸菌内で発現させるには、よく知ら
れている大腸菌１ことって好ましいコドンがある）ため
にヌクレオチド置換を行なうものである。 突然変異した核酸は、自体周知の方法によって製造され
る（Ａ、フイ（Ａ、　ｌ１ｕｉ　）ら、■９８４、”Ｅ
ＭＢＯジャーナル（ＴｈｅＥ〜イＢＯＪｏｕｒｎａｌ　
）３（３）・　６２３−６２９　：　、１．アデルマン
（Ｊ。 Ａｄｃｌ＋ｎａｎ　）　　ら、１９８３”ＤＮＡ”２　
（３）　　：１８３−１９３　：イギリス特許出願第２
，１３０，２１９Ａ；Ｇ、ウィンター（Ｇ、Ｗｉｎｔｅ
ｒ　）　　ら、１９８２．９ネイチヤー”　２９９　：
　　７５６−７５８　：　およびＲ，’７　ラス（Ｒｏ
Ｗａｌ　１ａｃｅ　）ら、１．９８１、”　ヌクレイ・
ヌク・アシ・ンズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）”９　（１５）：　３６４７
−３６５６′　　　　　　〕。これらの方法には、Ｍ１
３ファージ突然変異誘発、実施例１およびそれ以降に述
べ、突然変異体リンホトキシン遺伝子の合成、あるいは
その他の、当該技術分野で既知の、または既知となるで
あろう方法が含まれている。 リンホトキシンを暗号化しでいる核酸：こは、そのヌク
レオチド配列が天然に見い出される配列１こ相当するか
否かに係らず、本発明のリンホトキシンの定義内に含ま
れるポリペプチドを暗号化しているあらゆるＤＮＡまた
はＲＮＡ配列が含まれる。 更１こ、少くとも低いストリッジエンシイ（ｓｔｒｉｎ
ｇｃｎｃγ）条件下に、リンホトキシンを暗す化してい
る核酸とハイブリダイズし得る核酸は、例えそのハイブ
リダイズし得る核酸が、それ以外の点ではリンホトキシ
ンの明確な定義にかなうタンパク質をコード（暗号化）
していなくても、本発明の範囲内に含むものとする。後
者の例としてプローブがある。何故ならば、それが暗冒
化している短いポリペプチドは、生物学的に活性なリン
ホトキシンを発現しないからである。リンホトキシンを
暗号化している核酸、またはそれとハイブリダイズし得
るものは、実質！−１実施例１に示した有機合成法に従
って製造するが、あるいは本明細書中の実施例に示した
如く、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリィをプローブす
ること１こより、天然起源のものから得ることができる
。 本発明のリンホトキシンは、一般に、所望のリンホトキ
シンを暗号化している、核酸を担ったベクターによる宿
主細胞の形質転換を必要とする方法によって得られる。 ベクターとは、複製可能なりＮＡ組立で物である。本発
明薔こおいては、リンホトキシンを暗号化しているＤＮ
Ａの増幅、あるいは発現のためにベクターを用いる。発
現ベクターとは、その内部で、リンホトキシンを暗号化
しているＤＮＡ配列が、適当な宿主内でリンホトキシン
を発現さぜ得る適当なコントロール配列と機能的に結合
している、ＤＮＡ組立て物である。その様なコントロー
ル配列には転写プロモーター、転写をコントロールする
ための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡＩＪボ
ゾーム結合部位をコードしている配列、および転写およ
び翻訳の終車をコントロールするための配列が含まれる
。 ベクターはプラスミド、ウィルス（ファージを含む）、
または組込み可能なりＮＡフラグメント（即ち、組換え
によって宿主のｒ゛ツム内こ組」Δまれ得るもの）であ
ってよい。適当な宿−１：、Ｉこ導入（トランスフオー
ム）されると、ベクターは宿）ミゲノムとは独立に複製
、機能！７、または、ある場合にはゲノムそのものの中
に組込まれる。プラスミドは、今日最も普通に用いられ
るベクターであるため、本明細書中では、時に、”プラ
スミドと６ベクター”とを相互変換可能な用語として用
いることとする。しかしながら、同等の（幾能を有し、
当該技術分野で知られており、またはいずれ知られるで
あろう、その他の形のベクターも全て、本発明方法１こ
用いるのに好適である。 好適なベクターは、発現させようとする宿りと適合し得
る種から導かれたレプリコンおよびコントロール配列を
含んでいる。形質転換された宿＋細胞とは、組換えｒ）
ＮＡ技術を用いて組１γてられたリンホトキシンベクタ
ーで形質転換され、もしくはトランスフェクトされた細
胞である。形質転換された宿主細胞は、通常、リンホト
キシンを発現する。発現されたリンホトキシンは、選択
された宿主細胞により、細胞内薔こ止まるが、あるいは
べりプラスミッタ空間、または培養液の上澄に分泌され
る。 ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的１こ関連してい
る場合は、機能的に結合している。例えば、プレ配列ま
たは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチ
ドの分泌に与るプレタンパク質として発現されるならば
、該ポリペプチドに関するＤＮＡと機能的に結合してい
る；プロモーターは、それが結合している暗号配列の転
写をコントロールするならば、該配列と機能的に結合し
ている；リボゾーム結合部位は、それが結合している暗
号配列を翻訳され得る位置に置くならば、該配列と機能
的に結合している。一般に、機能的に結合している、と
いうことは近接（コンテイギュアス）していることを意
味し、特に分泌リーダー配置　　　　　　列の場合Ｉζ
は、近接し、かつ解読相内１こあることを意味する。 適当な宿七細胞は、原核細胞、酵母細胞およびより高等
な真核細胞である。原核生物にはプラス・陽性またはダ
ラム陰性の微生物、例えば、大腸菌やバチルス（桿菌、
ｒｓａｃｉｌｌｉ）　　が含まれる。より高等な真核細
胞には、以下に述べる如く咄乳類動物起源から得られた
細胞系統（セルライン）が含まれる。好適な宿主細胞は
実施例１こ記載した、ファージ耐性のＥ、　ｃｏｌ　ｉ
　Ｗ　３１１０　（ＡＴＣＣ２７，３２５）　　株であ
るが、他の原核生物、例えばＥ、　ｃｏｌｉ　Ｂ、　Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７５（ＡＴＣＣ３］、、５３７）
、　　Ｆ、、　　ｃｏｌｉ　　２９４　　（ＡＴＣＣ３
１，４４６）　　、　シコーードモーナス（ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　）種、あるいはセラシア・マーセナンス
（５ｅｒｒａｔｉａ　Ｍａｒｃｅｓａｎｓ。 霊菌）等も適する。 リンホトキシンの発現には原核性宿主−ベクター系が好
ましい。適当な微生物系ベクターは、多数子に入れるこ
とができる。一般に、微生物顔のベクターは所望の宿主
が認識し得る複製起源、宿主内で機能し得るプロモータ
ー、並び；こ表現型の選択性遺伝′Ｐ（例えば抗生物質
耐性を付与、する遺伝子、または栄養要求変異種の要求
をり−える様な遺伝子）を含む。他の宿主に関しても、
同様な組立で物を作ることができる。大腸菌は、通常、
Ｅ。 ｃｏｌ　ｉ種から得られるプラスミドｐＲＲ３２２を用
いて形質転換される（ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖａｒ　）
う、１．９７７、”ジーン（Ｇｅｎｅ）”２：９５）。 ｐ　ＲＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性のための遺伝子を含有しており、これらは形質転換
細胞を容易に同定し得る手段となる。 発現ベクターは宿主微生物によって認識され得るプロモ
ーターを含有する必要があるが、クローニングベクター
１こはその必要がない。一般にプロモーターは所望の宿
主にとってホモローガスである。組換えＤＮＡの組立て
に最も普通に用いられるプロモータ一番こは、β−ラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモー
ター系（チャフ　（ｃｈａｎｇ　）　　ら、１９７Ｂ”
ネイチャー”、２７５　：　６１５　：およびゲラデル
（Ｇｏｅｄｄｅｌ　）ら、１９７９”ネイチャー”２８
１５４４）、トリプトファン（ｔｒｐ）フロモーター系
（ケラデル（Ｇｏｃｄｄｅｌ　）ら、１９８０　　”ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ″３：４０５７および
ＥＰＯ出願公開番号第３６，７７６　）、並び１こｓａ
ｃプロモーター　（＋ｒ、　　ドウボｘ　／ｌ／　（＋
１．　Ｄｅ　ｌ５ｏｅｒ　）ら、”プロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ、Ｕ、Ｓ、Δ、″８０：２］、−２５（１，９８
３）］　が含まれる。これらが最も普通に用いられてい
るが、その他の微生物プロモーターも使用し得る。それ
らの詳しいヌクレオチド配列は公開されており、それに
よって当業者は、それらをプラスミドベクター内のリン
ホトキシン暗号化ＤＮＡ（シーベンリスト（Ｓｉｃｂｃ
ｎｌ　ｉｓ＋）ら、１９８０　、”セル”２０：２６９
）、およびリンホトキシンを暗号化しているＤＮＡと、
機能的にライゲート（結合）させることができる。 現在のところ好ましいベクターは、大腸菌アルカリ性ホ
スファターゼプロモーターとｔｒｐシＶイン−ダルガノ
配列を有するｐＲＲ３２２誘導体である。このプロモー
ターおよびシャインーグルガノ配列を、リンホトキシン
を暗号化している１１　Ｎ　Ａと機能的に結合させる（
即ち、ＤＮＡからのリンホトキシンｍＲＮＡの転写を促
進する様１こ位置せしめる）。 この原核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物も
リンホトキシン−暗号ベクターにより、形質転換される
。下等な真核性微生物宿主の内、サッカロミケス・セレ
ビシｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｃ
ｉａｅ　）または通常のパン酵母が最も一般的に用いら
れるが、その他多数の菌株も普通に用い得る。酵母ベク
ターは、通常、２ミクロン酵母プラスミドからの複製起
源または自律的複製配列（ＡＲ５）、プロモーター、リ
ンホトキシン（特にヒト−プレリンホトキシンを含む）
を暗号化しているＤＮＡ、並びｌとポリアデニル化、転
写終止、および選択遺伝子のための配列を含有している
。 酵母内でリンホトキシンを発現させるのに好適なプラス
ミドはＹＲＰ７　である（ステインチコム（Ｓｔ　ｉｎ
ｃｈｃｎｍｌ））ら、１９７９、′ネイチャー”１　　
　　　　２８２：３９；　　キンゲス？　７　（Ｋｉｎ
ｇｓｍａｎ　）ら、１９７９、”ジーン”、７：１４１
：チェンバー（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　）　　ら、１９８
０″ジーン″１０：１５７）。このプラスミドは既にじ
ｐ】遺伝子を含有しているので、トリプトファン中で増
殖する能力を持たない、酸１寸の突然変異株（例えばＡ
′ＦＣＣ，弦４４０７６またはｒ’Ｅｒ’４−１．（ジ
ョーンズ（ＪＯｎＣ５）、１９７７、“ジエネテツクス
”８５：１２）に選択マーカーを与える。この酵母病１
已細胞ゲノムにｔｒｐ　１　　障害があるので、形質転
換体をトリプトファンの非存在下で増殖させること番こ
よって、形質転換体を検出する際の有効な環境を提供す
ることになる、。 酵母用ベクターの好適なプロモーティング配列］こは、
以下のものに対するプロモーターが含まれる：メタロチ
オナイン（ｍｅｃａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　）、３−
ホスホグリセレート・キナーゼ（ヒララマン（＋１＋１
ｉｔｚｅ　）ら、１９８０　”ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリイ″２５５　：　２０７３）ま
たはエノラーゼ、グリセルアルデ゛ヒトー３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ、へ＋ソキナーゼ、ピルベート
・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、クル
コース−６−ホスフェート、イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセレート・ムターゼ、ピルヘ＋・キナーゼ、トリオ
セホスフエート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イ
ソメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類（ヘス
（Ｈｅｓｓ）ら、１９６８、”ジャーナル・オブ・アド
バンスイス◆イン―エンザイム・レグ（Ｊ、Ａｄｖ、Ｅ
ｎｚｙｍｅＲｅｇ、）”７　：　１４９　：およびホラ
ンド（）Ｉｏｌ　１ａｎｄ）ら、　１９７８、′バイオ
ケミストリイ″１７　：４９００　）。更に、酵母内で
発現させる上で好適なベクターおよびプロモーターはに
、ヒララマン（ＲｏＩｌｉｔｚｅｍａｎ　）により、Ｅ
ＰＯ公開番号第７３．６５７号の中に記述されている。 その他、増殖条件によって転写がコントロールされると
いう利点をさらに有するプロモーターとして、アルコー
ル・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホス
フアターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記メタロ
チオナイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・
デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびラクトース
の利用に与る酵素類等に関するプロモーター領域が含ま
れる。適当な発現プラスミドを組立てる１こは、これら
の遺伝）に伴なった終車配列を、発現ベクター内の、リ
ンホトキシン暗号配列の３′側１こライゲートし、ｍ　
Ｒ，ＮΔのポリアデニル化および終市を提供する、。 微生物１こ加えて、多核生物からの（１１胞ｊΔ養を宿
主として用いることもできる。しかしながら、リンホト
キシン発現は、これまで微生物によって申越した成果が
得られているので、それが好ましいとは言えない。原則
として、を椎動物であるか無を椎動物であるかに拘らず
、あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。しかしな
がら、最近ではを椎動物細胞１こ大きい関心が寄せられ
ており、槁養（組織培養）でを惟動物細胞を増殖させる
ことは日常的な操作となっている〔ティッシュ・カルチ
ャー（Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）　アカデミツ
ク・プレス、クルスおよびパターソン（Ｋｒｕｓ　ａｎ
ｄＰａｔｔｅｒｓｏｎ　）編、（１，９７３））。有用
な宿−１已細胞系統の例１こは、Ｖ　Ｆ、　ＲＯおよび
ｔｌｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卯１（ｃＨＯ
）細胞系、並びにＷ１３８、旧ｆＫ、ＣＯ３−７および
　ＭＩ）Ｇ　Ｋ細胞系等が含まれる。その様な細胞のた
めの発現ベクターには、通常（必要ならば）複製起源お
よび発現されるべき遺伝子の前方ｌこ位置しているプロ
モーターが、リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部
位（イントロン含有ゲノムＩ）ＮＡを用いる場合）、ポ
リアデニル化部位および転写路上配列と共に含有されて
いる。 形質転換されるを椎動物細胞内で使用するための発現ベ
クター用の転写およびコントロール配列は、しばしばウ
ィルス性起源によって供給される。 例えば、旨通用いられているプロモーターはポリオーマ
、アデノウィルス２、および最も頻繁にはシミアンウィ
ルス４０（ＳＶ４０）から導かれる。 このさきのおよびあとのプロモーターは、いずれも該ウ
ィルスから、５Ｖ４Ｑの１クイルス性複製起源含有フラ
グメントとして容易に得られるので特’　　　　　　　
ＩＣ有用テアル（７フイ＋　−；Ｚ：　（Ｆｉｅｒｓ　
）　ラ、１９７Ｂ”　＊イｆ　？−”　２７３　：　１
１３）。５ｖ４０のより小さい、またはより大きいフラ
グメントも、それらがウィルス性？Ｕ製起源内に位置す
る目１ｒ１ｄ　ｌ１１部位からＲｇｌ　’Ｉ部位に至る
約２５０１）ｐの配９１ｊを含有している限り用いるこ
とができる。、史に、１１二常４Ｃ状態でリンホトキシ
ンと関連しているヒト−ゲノムプロモーター、コントロ
ールお、及び／またｉ；を信号配列ｈ１　その様なコン
トロール配列が宿１：、系に適合し得ることを条件とし
て用いることができ、またしばしば好ましいことである
。 複製起源は、例えば５ｖ４０その他のウィルス性起源（
例えばポリオーマ、アデノウィルスＶＳＶ。 ｎｐｖ等）から得られるものの様に、外水性の起源を含
む様にベクターを組立てるが、あるいは宿ト細胞の染色
体性複製機構ｆこよって１ｊ、えられる。 もしもベクターが宿主細胞染色体に組込まれるのなら、
その様な染色体でもよい。リンホトキシンは、高等動物
の真核細胞をヒト−プレリンホトキシンＤＮＡで形質転
換することζこより、アミノ末端のメチオニル化なしに
つくられる１、リンホトキシンとデヒドロ葉酸還元酵素
（＋）ＩＩＦＲ）の両者を暗号化しているＤＮＡ配列を
含むベクターでトランスフェクトするのに好適な呻乳類
宿４已細胞を選択するに際しては、用いるＤＨＦＲタン
パク質のタイプに従って宿主を選択するのが適当である
。野生型ＤＩ−ＩＦＲタンパク質を用いる場合１こは、
ｒ）ＩＩＦＲ欠損宿−Ｌ細胞を選択するのが好ましく、
そうすることにより、ヒボキサンチン、グリシンおよび
チミジンを欠く選択用培地内で、満足のいくトランスフ
ェクションを選択するためのマーカーとしてＤ　Ｉ−Ｉ
　Ｆ　Ｒ暗号配列を用いることができる。この場合、好
ましい宿主細胞はＤＴＩＦＲ活性を欠くチャイニーズハ
ムスターの卵巣＜　Ｃｌｌ０　）細胞系統であり、これ
は、ウーラウブおよびチャツシン（Ｕｒｌａｕｂ　ａｎ
ｄ　Ｃｈａｓｉｎ　）　（１９８０、“プロシーディン
ゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンスイズ”（ＵＳＡ）７７：４２１６）の述べた如く
にして調製し、増殖させることができる。 他方、メトトレキセート（ＭＴＸ）Ｈこ対する結合親和
性の低いＩ）　ＩＩ　Ｆ　Ｒタンパク質をコードしてい
るＤＮＡをコントロール配列ｆこ用いる場合Ｉこは、Ｄ
ＩＩＦ［耐性細胞を用Ｇ）る必要はない３、何故ならば
突然変冗ｒ）ＩＩＦＩζはＭ′、ｒ’Ｘ耐性であるので
、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性であるならば、Ｍ　Ｔ　
Ｘ含有培地を選択の手段として用いることができるから
である。ＭＴＸを吸符することのできる真核細胞の大多
数は、メトトレキセート感受性であると思われる。その
様す、有用な細胞系統の１つはＣｌｌ０系、ＣＩＩ　Ｏ
Ｋ　１　（Ａ’Ｔ’ＣＣＡ　Ｃ（−Ｌ　６　Ｊ　）　テ
ある。 形質転換された宿主細胞とは、組換えＩ）　Ｎ　Ａ技術
を用いて組立てられたリンホトキシンベクターで形質転
換またはトランスフェクトされた細胞である。形質転換
された細胞は通常、リンホトキシンを発現する。発現さ
れたリンホトキシンは、一般に細胞内に保持される。 リンホトキシンは、非分泌細胞での組換え１１〜産物か
ら、これを溶解し、次いで遠心分雛する等番こよって顆
粒成分を除火することにより回収される。 リンホトキシン分泌細胞の場合は、遠心１こよつ−Ｃ培
養ｌ−澄液からこれを分灘Ｃる１、不統物を含むす／ホ
トキシン溶液を、上で示した方法、または後述こり実施
例４に示すイムノアフイニテイ法により、精製す゛る。 薬学的な使用ｊこ適する稈度に精製した後、リンホトキ
シンを通常の使用形態、例えば投薬ビンや注射器に入れ
る。リンホトキシンの混合物、例えば一連の細胞毒性を
示すリンホトキシン突然変異体を用いる。リンホトキシ
ンの長期保存には凍結乾燥が適しており、あるいは安定
剤や賦形剤を入れた水溶液（例えば等張な塩水）に入れ
、１）、アガーワル（Ｉｓ、Ａｇｇａｒｗａｌ　）　　
らがヨーロッパ特許出願第１００６４１号で開示してい
る様に患者に対して投与することができる。 リンホトキシン組成物は、腫瘍を有する動物に投与する
ことができる。投与経路は、静脈内、腹［内向、皮Ｆ、
筋肉自段ｔテ、滅菌リンホトキシン溶液の病用内注入ま
たは注射の如き既知の方法により、あるいは１ＪＪｉこ
述へる如き放出時間調節系に、　　　　　　より投写、
することもできる。リンホトキシンは病巣内没Ｉｊ４（
即ち、固状の腫瘍内に直接注射する）し得る。白血病の
様な播種性腫瘍の局舎には、静脈内またはリンパ系への
投Ｉｊ、が好ましい。卵！Ｊ！ｊ；［１瘍の様な腹部器
官「ハ１庫瘍は、腹１莫１ｈ折器を使Ｊ１］シ、腹ｌｌ
り適合性の溶液−Ｃ腹腔内をこ注入することにより、有
効に治療できる。ポーラスｔ１ニ人も１ｊＪ　止である
が、通常、リンホトキシンは連続６１人７Ｊ６で段５．
する。 リンホトキシンは、埋め込み可能な、時間調節製品を介
して投り・することができる。リンホトキシンの二弔体
または三甲体の分子４ｉｔを有するタンパク質に対する
適当な系の例には、■４グルタミン酸とｒ−エチル−Ｉ
４−グルタマートとのコポリマ＝（Ｕ、シト７７　（Ｕ
、Ｓｉｄｍａｎ　）　　ら、１９８３、難バイオポリマ
ーズ（Ｂｉｏｐｏｌ　ｙｒｎｃｒｓ　）２２　（１）：
５４７−５５６　）、ポリ　（２−ヒドロキシエチル−
メタクリレート）〔ｋ、ランガ−（ｌ（。 Ｌａｎｇｅｒ　）ら、１９８１″　ジャー犬ル・オブ・
バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ（１゜Ｒｉ
ｏｍｃ（１，Ｍａｔｃｒ、　　Ｒｃｓ、）”１５　：　
１６７　２７７、およびＲ，ランガー、１９８２”ケミ
カル・チクノロシイ（ｃｈｃｍ、　Ｔｅｃｈ、　）”１
２　：　９８−１０５　Ｊまたはエチレングリコール（
Ｒ，ランガーら、同）が含まれる。リンホトキシン含有
製品は腫瘍が切除された後の外科的部位に埋め込まれる
。別法として、リンホトキシンを半透膜のマイクロカプ
セルまたはりポゾーム内に封入し、ＩＩ瘍内部へ注射し
でもよい。この方法は、脳ｔａｇの如き外科的な切除術
を適用できない腫瘍に対して特１こ有用である。 リンホトキシンの投与計は、例えば、投与経路、問題と
なっている腫瘍、および患者の症状等１こよって左右さ
れる。治療を施す者は、標的Ｉｌｌこ対しで適切な細胞
毒性を奏す様に、例えばＷｌｉ瘍の生検、または胎生期
がん抗原の如き推定の腫瘍や一カーの診断学的測定、等
により、用量の増加に伴なう組換え体の毒性を考慮しな
がら用量を検討しで定め、投与経路を改ｐする必要があ
る。通常、マウス番こ対しでは、組換えリンホトキシン
約５０〜２００μｇ／ｋｇ体重／日の静注投与が実質−
ヒ、非毒性であり、インビボで有効であることが分って
いる。もちろん、この投与計画は動物が異なれば変化す
る。 本発明はまた、リンホトキシン中和抗体の製造法をも提
供するものである。本明細、Ｉ！ｌ中ては中ｆ１１抗体
を、ここで定義したリンホトキシンと免疫学的に結合し
、その活性を、後に述べるネズミト９２９アッセイの様
す細胞抑制または細胞溶解性リンホトキシン活性の測定
法において、実質−に減・しさせることができる抗体で
ある、と定義する。この抗体がリンホトキシンの活性を
中和し得るということは、必ずしも該抗体がリンホトキ
シンの活性部位または受容体結合部位に結合しなければ
ならない、という意味ではない。抗体は、その様す臨界
的な部位に隣接した領域（即ち、これは立体配座の上で
隣接していることを意味し、アミノ酸配列という観点か
ら、隣接していることは必須でない月こ立体的（ステリ
カリ−９に結合している場合にも、実質、＋、リンホト
キシン活性を中和し得る。 リンホトキシンに対する中和モノクローナル抗体を調製
する試み番こおいて、マウスの体内でリンホトキシン中
和抗体を生成させ、あるいは高めるように該動物を免疫
することが困難であるということが分った。リンパ芽球
様リンホトキシン、あるいはグルタルアルデヒドと交差
結合したリンホトキシンのいずれで免疫した場合にも、
免疫化されたマウス中に酵素免疫法で検出可能な非中和
性の抗−リンホトキシン抗体は生成しているにも拘らず
、該動物の血清中には、検出可能な中和抗体は生成され
なかった。しかしながら、リンホトキシン−明ばん（ａ
ｌｕｍ　、水酸化アルミニウムまたはアルミナ、Ａ１２
ｏ３．３■−Ｉ２ｏ爪着コンプレックスで免疫Ｔれば、
この明ばんコンプレックスで免疫する前には活性な抗体
を生成し得なかった動物においても中和抗体を若起させ
得る。明ばんの製造方法および抗血清製造のためのその
使用についテハｃ　、　＋フイリ７ムス（ｃ，Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ）らが開示している（ｃ，ウィリアムス編、１
９６７、メソツズ・イン・イムノロシイ・アンド・イム
ノケミスー　　　　　　　トリイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｒｒｍｕ　−
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ）＋）Ｉ＋　　１９７　２２９）
。 ｐ 中和抗体を産生ずる動物の胛細胞とネズミ骨髄腫細胞と
の融合物を調製する。中和抗体を合成する１個のクロー
ンを同定するため１こは、平均、約５０〜１００個のク
ローンをスクリーニングする必要がある。所望の活性を
有するクローンのスクリーニング法は当該技術分野にお
いて日常的に、容易１こ行なわれており、極く僅がな実
験作業て再現することができる。 免疫された動物から得た血清、血漿、またはＩｇＧフラ
クションは、免疫動物の胛臓またはリンパ細胞から得ら
れたハイブリドーマによって分泌される免疫グロブリン
と同様５本発明ζこおいて使用することができる。本発
明の好ましい態様では、中和抗体は実質」二、ハイブリ
ドーマ培養物中の他の抗−リンホトキシン抗体を含まな
い状態で得られる。 中和抗体を、ポリスチレンの様な熱プラスチック等の表
面に吸着させるが、臭化シアン活性化セファロースの如
きマトリックス構造と共有結合的に結合させることによ
り、固定化する。次いで、これをイムノアッセイまたは
イムノアフイニテイ精製法に用いる。この抗体は中和抗
体なので、生物学的に活性なリンホトキシンまたはその
フラグメントのみを吸着しやすく、それらを検出しやす
い。この抗体は、非中和性の抗−リンホトキシン・モノ
クローナル抗体または非中和性の抗−リンホトキシンを
含有するポリクローナル抗血清に関するイムノラジオメ
トリック・イムノアッセイＣサンドインチ法“）に用い
るのに、特に有用である。 この免疫検定（イムノアッセイ月よ、螢光、化学発光、
または放射性同位元素等の検出可能な物質により、当業
者周知の標識化法で有効に標識した中和抗体または非中
和抗体を、標識化成分として用いて行なう。リンホトキ
シンのための競合型のイムノアッセイにおいては、同様
にしてリンホトキシンを標識する。リンホトキシンおよ
びリンホトキシン抗体トレーサーの製造にはクロラミン
−Ｔラジオアイオデイネーション（放射性沃素化）が好
適であり、あるいはＪ、クロスターガード（Ｊ　、ＫＩ
ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ）らの方法（１モレキユラー・イ
ムノロシイ（Ｍｏｌ　、　ＩｒｙｙｎｕｎＪ’１８　：
　４５５（１９８０月も採用することができる。 実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
を短い熟語に略して示す。 プラスミドは小文字のＰを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによって表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドは市販されてい
るが、または非制限的な施設から一般に入手可能であり
、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから、公
知の方法に従って組立てることができる。更に、その他
の同等なプラスミドも当業者には知られており、通常の
技術者にとっては自明であろう。 ＤＮＡ（７）’消化〃とは、ｒｌＮＡを、該ＤＮＡのあ
る位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂するこ
とを指す。その様な酵素を制限酵素と称し。 該酵素にとって特異的な部位を制限部位（サイト）と称
する。１部分消化とは、制限酵素による不完全な消１ヒ
てあり、与えられたエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ
基質中の部位の全てでなく、そのうちのいくつかを開裂
する様な条件を選ぶことをいう。本発明において用いる
様々な制限酵素は市販品されており、その反応条件、コ
ファクター、およびその他必要なものは、酵素の供給業
者の指示に従って使用した。制限酵素類は、各制限酵素
が最初に得られた微生物を表示する大文字、次いで他の
文字、更に、通常、数字からなる略号で表わされる。一
般に、約１μｇのプラスミドまたは１）　Ｎ　Ａフラグ
メントは、約２０μｌの緩衝液中、約１単位の酵素と共
に使用する。特定の酵素について適当な緩衝液および基
質の量は、製造業者によって明示されている。通常、イ
ンキュベーション時間は３７℃で１時間とするが、供給
者の指示に従ってかえてもよい。インキュベーションし
た後、フェノールおよびクロロホルムでタンパク質を抽
出して回収し、水性のフラクションからエタノール沈殿
によって消化された核酸を回収する。 制限酵素による消化の後、５′末端のホスフェート′ヲ
細菌性アルカリホスファターゼで加水分解することが多
い。これは、ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂末
端が゛閉環（サーキュライデイング）“　したり、閉じ
たループを形成することにより、該制限部位に他のＤＮ
Ａフラグメントが挿入されにくくなるのを防止するため
である。明示しない限り、プラスミドの消化には、５′
末端の脱りん反応は伴なわないものとする。脱りんの方
法および試薬は常法に従う（Ｔ、マニアナイス（Ｔ。 ＭａｎｉａｔｉＳ）ら、１９８２、モレキュラー・クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ｐ
Ｐ、１３３−１３４）。 制限酵素による消化によって得られたＩ）　Ｎ　Ａフラ
グメントの１回収“または１単離″とは、この消化物を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フラ
グメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグ
メントのそれと比較して所望のフラグメントを同定し、
該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲルか
らｌ）　Ｎ　Ａを分離することを意味する。この方法は
一般的に知られてイル。例、ＲＪ）　−７（Ｒ，Ｌａｗ
ｎ　）ら、１９８１　。 １ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ”９：６１０３−
６１１．４および１）、ゲッタ／ｌ／　（Ｄ、Ｇｏｅｄ
ｄｅＩ）ら、１９８０’ヌクレイツク・アシツズ・リサ
ーチ“８：４０５７参照。 １サザ一ン分析９とは、消（ヒ物またはＩ）　Ｎ　Ａ含
有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識したオ
リゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハイブ
リダイゼーションによって確認する方法である。不明、
細書中では、特番こ断らない限り、サザーン分析という
時は、Ｅ、サザーン（Ｅ、５ｏｕ−ｔｈｅｒｒ＋Ｊ、１
９７５　’ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ、）“９８：５０３−５
１７、の方法に従って消化物を１％アガロース上で分離
し、変性し、そしてニトロセルロース上に移し、Ｔ、マ
ニアナイスらの方法（１９７８、ゝセル’　１５　：６
８７−７０１月こ従ってハイブリダイゼーションを行な
うことを意味する。 １形質転換′とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組込まれて複製されることを意味する。特に
明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法に
はマンデル（Ｍａｎｄｅ＋）らノＣａ　Ｃｌ　２法（１
９７０，’ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ＃Σ３：１５４）を採用した。 １ライゲーシヨン（結合）′とは２２個の二重鎖核酸フ
ラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程
を言う（Ｔ、マニアナイスら、前掲、１４６）。特に明
示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条件を
使用し、略等モルｍのライゲートすべきＩ）　Ｎ　Ａ　
Ｏ，５μｇ当たりＴ”　４１）　ＮＡ　ＩＪガーゼ（″
リガーゼ’　）１０単位を用いて行う。 形質転換体からＤＮＡを１調製する″とは、プラスミド
ＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する。 明示しない限り、マニアナイスらのアルカリ性／　Ｓ　
Ｉ）　Ｓ法（同上〕を採用する。 １オリゴヌクレオチド“とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、実施例１に記載
の引用文献の方法１こよって化学的に合成され、次いて
ポリアクリルアミドゲル」−で精製されたものである。 引用した文献は全て参照例として示した。 実施例１　リンホトキシンの精製および配列決決 ヒトのリンパ芽球様セルラインＲＰＭＩ−１７８８（Ａ
ＴＣＣＮ００ＣＣＩ、−１５６）を、１５■、のスピナ
ー（撹拌）フラスコ中、血清不含培養培地（ＲＩ’ＭＩ
−１６４０）を使って、４×１０５細胞／ｍｅの細胞密
度になるまで増殖させた。血清不含ＲＰ　Ｍ　ｌ　−１
６４０培地中にフォルボール（ｐｈｏｒｂｏｌ　）　ミ
ＩＪ　ステートアセテート２０　ｎ！／ｍｅを含ませる
ことによって、リンホトキシンを基礎レベルの１０〜２
０倍生成させた（下記の方法で測定した場合、５００〜
１０００リンホトキシン単位／　ｍｅ　）。培養６５時
間後１こ細胞を沖取回収し、５ｍＭりん酸緩衝液（ＰＩ
Ｉ７．４）で平衡化した、５ａ＋ｌＸ２０ｃｍのカラム
中の、孔径を調節したカラスビーズ（Ｆ、１ｅｃｔｒｏ
ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）に、Ｐ液中のりンホトキシン活
性物を吸収させ、５ｍＭりん酸緩１ｉｉｆｆｌ　（ｐ　
１１７．４　）中の５０％エチレングリコールで溶出し
た。この精製中、微生物の増殖を阻止するために、全て
の緩衝液に０．１．　ｍ　Ｍフェニルメチルスルホニル
フルオライド（Ｔ’ＭＳＪ、プロテアーゼ阻害剤および
１ｍＭのアジ化ナトリウムを含マせた。ガラスピーズか
らの溶出液は８４，０００単位のリンホトキシン／ηタ
ンパク質を含んでいた。次いで、アガルウオール（Ｉｓ
　、　Ａｇｇａｒｗａｌ　）らの方法〔ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミスト’）　−（Ｊ、Ｒｉｏｌ
　、Ｃｈｅｍ、と２５９　（１１：６８６−６９１．：
］に従い＋Ｉ）　Ｆ　Ａ　Ｉ’：セルロースクロマトグ
ラフィー、レンチル（Ｌｅｎｔｉｌ）レクチンセファロ
ースクロマトグラフィーおよびプレパラテイブ天然Ｐ　
Ａ　Ｇ　Ｆ、を行なった。細胞滑性活性に関ｔｊシてい
るタンパク質であるかどうかは、Ｓ　Ｄ　Ｓ−Ｐ　Ａ　
にＥ、’）　クロア　／ｌ／ブ（ＬｉｃｈｒｏｓｏｒＪ
Ｒｌ’−］　８カラムでの逆相１ｒ　ｐ　ｘ−ｃおよび
アミノ末端配列決定により調べた。 このリンホトキシン標本ハ、５ｌ）Ｓ−ｒ’ＡＧＩ“・
において約２５，０００の分子量を示すロイシンアミノ
末端リンホトキシンを９５重量％以」−含んでいた。こ
のＮ−末端ロイシン種のタンパク成分の理論分子量は１
．８，６６４タルトンであり、残りの約６．５００ダル
トンはＡＳｎ＋６２のグリコシル側鎖と、７分、その他
の〇−結合糖残基によるものである。組織培養の、ｌ−
清は、この種類の推定上のマルチマー（多量体）を含ん
でいた（ＴＳＫ−ＨＰｉ−ｃにより６０，０ＯＯ１１ａ
、あるいはセファデックスＧ−１００クロマトグラフイ
ーにより６４，０００１）ａ）。 このリンホトキシン混合物の残りの５係は、分子ｆＩｉ
約２０，０００のＮ末端ヒスチジン種であった。 この両種の物質は、少なくとも、下に述べるネズミ線維
芽細胞溶解分析法に由来する偏差の限度内で、実質的に
同じ細胞溶解活性を示す。 無傷のリンホトキシン分子をトリプシン消化すると、は
んの少数のフラグメントが得られた。ヒスチジン・アミ
ノ末端リンホトキシンは、８９位および９０位のアミノ
酸間で２個のフラグメントに消化され、−万、ロイシン
・アミノ末端体は、トリプシン消化により、１５位と１
６位、１９位と２０位、および８９位と９０位間で切断
された４個のフラグメントを生成した。 エドマンＣＦ、ｄｍａ　ｎ　）の分解法によってミクロ
配列決定を行なうことにより、無傷の分子およびトリプ
シン開裂により生成したフラグメントについての配列情
報が得られた。 カルボキシペプチダーゼＰおよびキモｌ−ＩＪプンン消
Ｉｌｌ、、酢峻消（ヒおよＯ・臭ＩＬシアン開裂により
生成したリンホトキシンフラグメントにより、更に配列
情報を得た。この方法により、ヒドリンホトキシンのほ
とんど全配列を決定した。１５６個の隣接残基群はアミ
ノ末端から決定した。この配列情報により、２つのリン
ホトキシン種間の違いは、ヒスデシンアミノ末端種１こ
は存在しない２３個のアミノ末端残基がロイシンアミノ
末端種には４ｒ　’（＋−するという事実であることが
明らかになった。最初の３個の残基の先のカルボキシ末
端配列は３この領域に、ある種のペプチド結合か存在す
ること、およびその残基が疎水性であることから、決定
するのが困難であることがわかった。 ミクロ配列決定により測定したタンパク質の配列をコー
ドする様に合成遺伝子を設計した。この遺伝子設計には
、一般的な大腸菌のコドンバイアス（性癖）を採用した
。即ち、めったに使われない大腸菌コドンは、この配列
に使用しなかった。 大腸菌コドンバイアスが明らかでない場合は、ヒトｔこ
とって女子ましいコドンで代用した。このバイアスは、
大腸菌に於ける発現１こ役立つ様に、そしてまた、この
合成遺伝子がヒトｃｌ）ＮＡまたはゲノムライブラリー
からの天然のＩ）　Ｎ　Ａ配列を同定するためのプロー
ブとして役立つ様１こ選択した。フラグメントの組立て
に役立つ様に、そしてその後の遺伝子操作を可能にする
ために、特異な制限部位Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｒａｍ１ｌｌ
　、　ｌ１ｉｎｄ　１１およびＲｑｌｌｌを配列内にデ
ザインした。 マチラン（Ｍ６ＭａｔｔｅｕｃｃｊＪ　　らの方法〔シ
ャック７、（Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）−１
０３：３１．８５−３１９０．１９８１．］およびボイ
カーゲ（Ｓ、Ｂｅａｔｉ−ｃａｇりらの方法〔テトラヘ
ドロンレタース（Ｔｅｔ。 ’　　　　　　　ｘ−ｃｔｔｅｒｓ）、２２：１８５９
−１８６２，１９８１　：ｌｌｌ　　である固相ホスフ
ァイト法により、合成リンホトキシン遺伝子のために設
計された５８オリジナルオリゴマーを合成した。１６塩
基から２０塩基０川・）囲のこれらのオリゴマーの寸法
を第１２１図に小す、。 オリゴマー間の重複は長さか６塩基てあり、特５１．１
的である様に設泪した。全遺伝子を第１　ｂ図に小した
様に組立でた。 この遺伝子は３個の断片にして組立てた。最初の断片、
セグメントＡは、長さ１１７の塩基対てあり、ロイシン
アミノ末端種のアミノ末端の５　’［＋ｉ″１吋領域全
領域している。セグメント１匁はリンホトキシン分子の
中央部をコードしている長さ１４５塩基対のＤＮＡであ
る。長さ２１７塩基対のセグメントＣは、リンホトキシ
ンカルボキシ末端の、１６アミノ酸残基を除く全てをコ
ードしていると考えられるものである。各セグメントを
合成するのに必要なオリゴマーは、電気泳動；こより精
製してプールした。合成の誤りを減らすために、比較的
寸法の小さいオリゴマー（即ち、１６〜２０塩基９を選
んだっ ５０／ｌＣ中Ｉｎ　２Ｑ　ｍ　Ｎｉ　トリス−ＩＩ　Ｃ
ｌ　（ｐ’７．５　）、１０　ｍＭ　ＭｆｌＣ：１２．
　２０ｍＭ　　シチオトレイット、９．５ｍＭＡＴＰ、
および１５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含ん
でいる反応系で、各グループのオリゴマーをりん酸化し
た。この反応系１こは約５０ピコモルの各オリゴマーヲ
含マぜた。３７℃で３０分間反応させた後、反応物を６
５℃に加熱してキナーゼ活性を失活させ、１時間かけて
２０℃まで徐々に冷却した。りん酸化したオリゴマーに
１０単位のＴ４１１ＮＡリガーゼを添加し、２０℃で２
時間反応させて結合させた。Ｉ）　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ
を加熱して失活させ、連結したオリゴマーを、設計した
末端部位を認識する制限酵素（エンドヌクレアーゼ）例
えばセグメント八についてはＸｈａＴおよびＢａｍｆｌ
ｌ）によって３７℃で３時間消化した。各セグメントの
フラグメントを、７％ポリアクリルアミドゲル上の電気
泳動により分離した。 正しい移動率のフラグメントを、各セグメントについて
、エチジウムプロミド染色法で同定し、ゲルから電気溶
出した。ｐＦＩＦ　ｔｒｐ６９［ゲラデル（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ　）らのネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）＋２８７　
：４１１、−４１６（１９８０）、またはりＬ／　７　
（ｃｒｅａ）らのヨーロッパ特許出願第ｏｏ４ｓ９７ｏ
′ｉ；不１＋＋＋−１をＸｌ）ａｌおよＱｒＲａｍｌｌ
ｌて消（シシ、大きイヘクターフラグメントを６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により分離した。セグメ
ントＡ約５０　ｎ　ｇをｐｒ’１ＦＬｒｐ６９フラグメ
ントに結合させた。同様にして、セグメントＢをＩＩ　
ａ　ｍ　ＩＩ　ｌおよびＩｌｉｎｒｌｍ　消ｆｔ、ｐＲ
１＜３２２ｔこ、そしてセグメント０を１１ｉｎｄｌｌ
ｌおよびＱｆＩＩ消化ｐＬｅｌｌ′Ａ−１２５１に結合
したしゲラデル（＋）、　Ｇｎｃ（！ｄｃｌ　）ら、ヌ
ク・アシッド・レス（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、）
、８：４０５７−４０７３．１９８０参照〕。 このライゲーション（結合、連結）混合物を使って大腸
菌ＡＴＣＣ：３１４４６を形質転換し、得られた組換え
プラスミドの特性を、制限酵素分析およびマキサムおよ
びギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇｉ　Ｉ一定 ｂｅｒりの化学分解法によ６　＋）　Ｉ’Ｊ　Ａの配列
／枢法により決定した。６個のセグメントムクローンの
内５個が正しい配列を含んでいた。４個のセグメントＢ
および４個のセグメントＣプラスミドを分離した。これ
らの全ての挿入物は正しい配列を持っていた。各セグメ
ントを、末端部位を認識する制限エンドヌクレアーゼで
消化して分離し、Ｘｂａｌおよびｎ９１１１で消１ヒし
たプラスミドベクターｐＦＩＦｔｒＰ６９に結合させた
。得られた組換えプラスミド、ｐＬＴＸＢ］　　を、挿
入しりＸｂａ　Ｉ−Ｒｆ／ｌ　ＩＩ　７　ラグメントを
配列化することにより特性化した。これは第１ａ図に示
された配列を含んでいた。 この合成遺伝子が生物学的に活性ナリンホトキシンを実
際に生産するかどうかを調べるために、大腸菌ｐ　Ｉ−
ＴＸ　Ｂ　１形質転換体を、ｔｒｐ　　プロモーターを
脱抑制し合成リンホトキシン遺伝子を発現し得る条件下
、最小培地中で増殖させた。５５０１ｍにおける光学密
度が１．０になるまで培養し。 遠心分離により回収した。細胞ペレットを１／１．０容
に懸濁し、音波破壊により溶菌した。 リンホトキシン活性は、スボフオード（Ｂ、５ｐｏ−［
ｆｏｒｄ、）の改良細胞溶解法〔ジャーナル・イミュー
　　　　　　ノロジー（Ｊ　、　Ｉ＋ｖｗｎｕｎｏｌ　
、）υ２：２１１１．１９８４　〕に従って測定した。 簡単に説明すると、マウスのＬ−９２９線維芽細胞を、
アクチクマイシン１）の存在下、マイクロタイター平板
で増殖させる。 １２−１８時間後、リンホトキシンを分析しようとする
順次希釈した試料を各ウェルに加える。１８時間後、平
板を洗浄し、リンホトキシンによって惹起された細胞の
溶解（菌〕性を、メタノール＝７［１：　４　Ｖ／Ｖ）
中の１％クリスタル・バイオレット溶液で平板を染色し
、平板に付着したものを検出することにより検出した。 染色の強さを肉眼およびダイナチク（＋）ｙｎａ　ｃ　
ｅｃｈ　）分光器を使って４５０　ｎｍおよび５７０　
ｎｍ透過率の吸収により、分光光度学的に測定した。培
地のみと一緒にマイクロタイターウェルに入れた細胞を
０チ溶菌と定め、３Ｍグアニジン塩酸塩溶液を入れたも
のを１００％溶菌の終末点とした。各ウェルに入れた１
　２．０００細胞の内の５０％の細胞を溶菌するのに必
要な量をリンホトキシン１単位と定義する。 細胞毒性活性を分析するためのその他の方法も使用し得
ることに留意すべきである〔アガルウオル（Ｂ、Δｇｇ
ａ　ｒｗａ　ｌ　Ｉ　）らの［チミツクホルモンとリン
ホキ７　（Ｔｈｙｍｉｃ　Ｉｌｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ
　Ｌｙｍｐｈｏｋｉ　−ｎｅｓ月、１，９８３．編者、
ゴールドシュタイン（ＡＧｏｌｄｓｔｅｉｎ）、スプリ
ング・シンポジウム・オン・ヘルス・サイエンス、ジョ
ージ・ワシントン・ユニバーシティ・メディカル・セン
ター（ＳｐｒｉｎｇＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｌ−１
ｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｅｏｒｇｅＷａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ
ｅｒ）］にこでＡ３４９セルライトと呼ばれているもの
は、ＡＴＣＣから、ＣＣＩ−１８５として入手可能）。 培養溶菌液は、上記のネズミの細胞分析に於いて、検出
不能の細胞溶解活性を示した。ガンマ−インターフェロ
ンを発現する培養物からの対照溶菌液は、ガンマ−イン
ターフェロン活性を含んでいた。 この結果は、合成遺伝子が活性リンホトキシンをコード
づけていなかったことを示唆していた。これにはいくつ
かの説明が成り立つ。例えば（１）大腸菌がリンホトキ
シンを分解した、（２）リンホトキシン遺伝子は大腸菌
では転写されなかった、（３）リンホトキシンの情報（
メツセージ）が大腸菌内で翻訳されなかった、（４）タ
ンパク質配列決定の誤りにより、タンパク質が適切な配
列を持っていなかつた、または（５）リンホトキシン分
子の活性または適切な立体配置には、１６の残基カルボ
キシ末端配列またはその一部が実際に必要である。 実施例２　リンホトキシンをコードしているｃＤＮＡの
入手法 ホルボールミリステートアセテート（１，Ｏｎ　ｇ／ｍ
ｅ〕、スタフイロコツ力ルエンテロトキシンＢ　（１μ
Ｅｌ／ｍｌ）　オよびチモシンα−１〔ベルが−（Ｓ。 Ｂｅｒｇｅりらのバイオケミスト＋）　−（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、１旦：５１４３−５１４９．１９７
９〕で誘導した４８時間後に、ヒトの末梢血液リンパ球
の非粘着（付着）細胞フラクションの培養物は４００単
位のリンホトキシン活性／上清１ｍ／を生産していた。 このｍ　ＲＮ　Ａを固定化オリゴｄＴに吸着させて濃縮
し、溶出し、逆転写〔グレイ（Ｐ、Ｇｒａｙ）らのネー
チャー　（Ｎａｔｕｒす、２９５：５０３−５０８．１
９８２参照〕によりｃＤＮＡを調製した。メツセンジャ
ーＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作成するために逆転写酵素
を使用し、第２の鎖をクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）処理に
より常法通り調製し、そのｃＤＮＡをｓ−１ヌクレアー
ゼで処理してヘアピンループを除去した。 このｃＤＮＡをベクターに挿入するために、その末端を
アダプターまたはリンカ−と結合させ、予定の制限酵素
部位のための５′および３′制限酵素部位、または好ま
しくは粘着末端を作成した。この目的番こ式　： ％式％ のオリゴヌクレオチドを使用した。このオリゴヌクレオ
チドをｃｌ）ＮＡに結合させ、そのｃｌ）ＮＡをポリア
クリルアミドゲル電気泳動法によって再び分離した。一
般に入手可能なファージλｇＬ１０（またはその実質的
な等価物、λｇｔｌｌ、これハＡＴｃ’ｃ：から入手で
きるつをＦ、　ｃ　ｏ　ＲＩで消化し、線状フラグメン
トを回収した〔ウイツケンズ（Ｍ、Ｗｉ　ｃｋｅｎｓ）
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス　）　
　ＩＪ　　イ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ　　、　　Ｃｈｅｍ、）
　２５３　　：２４８３−２４９５　、ｔ　　　　　　
　１９７８：］。リンカ−を付けた逆転写体とこのλｇ

【１０　消化物をライゲート（結合りさせ、このライゲ
ーション混合物を使って、大腸菌Ｃ−６００またはその
他のλフアージ感染に感受性のある既知の宿主をトラン
スフェクト（１）ＮＡ感染ジした。 約１．０．０００の組換えファージを１５−のプレート
にまき、低ストリンジエンシーのプラーク・ハイブリダ
イゼーンヨン法〔マニアティス（Ｔ、Ｍａｎ−ｉａｔｉ
Ｊら、セル（ｃｅｌＪ、１５：６８７−７０１．１９７
８、およびグレイ（Ｐ、Ｇｒａｙ）ら、プナス（ＰＮＡ
Ｓバ旦伏：５８４２−５８４６）　により、第１ａ図の
セグメントＡから調製した３２ｐ　　−標識プローブを
使ってスクリーニングした〔この標識プローブは、ティ
ラー（Ｊ、Ｔａｙｌｏりらの方法（バイオケミツク、バ
イオフイジク、アクタ（ｒｓｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ＡＣＬａ）４４２：３２４−３３０
　、１９７６＞に従って調製した。ここで牛胸腺１）　
Ｎ　Ａブライマーを使用した（ｐｒ、Ｒｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）］。２２０％ホルムアミドの５Ｘ１０７ｃｐ
ｍ　のプローブを使用し、低ストリンジエンシー法１こ
より２重のニトロセルロースフィルターをハイブリダイ
ズさせた。 フィルターを、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍク
エン酸ナトリウムおよび０．１チドデンル硫酸ナトリウ
ム（Ｓｌ）Ｓ、１中３７℃で２回洗浄した。 ２個のファージがこのプローブとハイブリダイズし、プ
ラーク精製を行なった。精製したファージは、セグメン
トＡプローブとセグメントＢがら調製したプローブの両
者とハイブリダイズした。 ２個のハイブリダイズファージ、λＬＴ１　およびλｒ
、Ｔ２　（Ｄ　ｃ　ＤＮＡ挿入物をＭ１３ｍｐ８　にサ
ブクローンし、ジデオキシ鎖ターミネーション法〔スミ
ス（Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ）、メソッド・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）＋１９８０＋６５：５６０−５８０〕により配列決定
した。λＬＴ２の挿入体は僅か６００　ｂｐであり、り
ンホトキシンのための全３′暗号領域を含んでいなかっ
た。λＬＴＩの挿入体はロイシンアミノ−末端リンホト
キシンのための全暗号領域および６５０ｂｐ３’非翻訳
領域（一致したポリアデニル化信号を含む〕およびロイ
シン末端への１８アミノ酸アミノ末端のためのコドンを
含んでいた。これは全リンホトキシン暗号領域を構成し
ていなかったので、λＬＴ１のｃｌ）ＮＡ挿入体から、
更に３２Ｐ−標識プローブを調製し、非常に厳密に追加
の２５，０００組換えλｇＬ１０ファージのスクリーニ
ングに使用した〔ツイーン（Ｔ、　ｆ（ｕｙｎｈ　）ら
、プラクチカル・アプローチ・イン・バイオケミストリ
イ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ　−ｈｅｓ　
ｉｎ　ＲｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙバＩＲＬプレス、オッ
クスホード〕。１２の追加のハイブリダイズファージを
分離し、最も長い挿入体の配列を（λｌ−Ｔ１１から）
、第２ａ図に示した。最も長いオーブン・リーディング
・フレームは、最初に観察されたＡＴＧから出発して翻
訳された。各列の」−の番号はアミノ酸の位置、各列の
下の番号はヌクレオチドの位置を表している。１の記号
を付したロイシン末端は、ロイシンアミノ末端リンホト
キシン（第１ａ図）の配列決定された最初の残基であり
、多分、成熟リンホトキシン種の最初のアミノ末端残基
である。最初の３４残基はシグナル配列である。 １５６−１．７　］残基はリンホトキシンのタンパク配
列決定法により決定できなかったのでヌクレオチド配列
から転用した。 実施例３　ロイシンアミノ末端リンホトキシンのための
ハイブリッド合成遺伝子／天然のｃ＋’）Ｎへ発現ベク
ターの組立て この組立では第２１〕図に示した。ｐ　ｒ、、ＴＸ旧（
非情＋１合成遺伝了を含む〕をＩ’：ｃｏＲＩとＰｓｔ
ｌて部分消化し、リンホトキシンの１２５Ｎ＝末端残基
をコードしているＩ）ＮＡを含んている６８５１１ｐフ
ラグメントを回収した。部分的ｒ’ｓｔ＋消化を行った
理由は、残基１０にもう１つのＰｓｔ１部位が存在する
からである（第１ａ図つ。リンホトキシン（７）Ｃ−末
端の５１個のアミノ酸をコードしている１）　ＮＡを含
んでいる３０１ｂＰフラグメントを、λｌ−Ｔｌのサブ
クローンしたＣＤＮＡをＥ　ｃ　ｏ　ＲｌとＰ　ｓ　Ｌ
　１で消化することにより分離したにれらの部位は、第
２ａ図に於いて、５５４および８５５ヌクレオチド位に
示されているり。これらのフラグメントを、５チポリア
クリルアミド上の電気泳動および電気溶出により分離し
た。このフラグメ′　　　　　　ントを、バッククラン
ド形質転換体を減らすために、Ｆ、　ｃ　ｏ　ＲＩで消
化し細胞性アルカリホスファターゼで脱りん酸化したｐ
ＢＲ３２２に結合させた。 得られた発現プラスミド、ｐＬＴＬｒｐｌの適切な方向
性および配列を、制限エンドヌクレアーゼ消１ヒおよび
ＤＮＡ配列決定法により特徴づけた。ロイシンアミノ末
端リンホトキシンは、大腸菌３１４４６をｐＴ、’ｌ’
ｔｒｐｌて形質転換し、その形質転換体をテトラサイク
リン含有培地中、０１）か１．０になるまで３７でて４
〜６時間培養することにより発現させた。細胞溶Ｍ液は
細胞毒性活性を持−〕でいた。 発現されたリンホトキシン種のロイシンアミノ末端は、
保護されたメチオニン残基て置換されることがわかった
。この合成の生成物はメチオニン残基ではなくホルミル
メチオニンであると考えられる。 実施例４　リンホトキシンの免疫アフィニティーｔこよ
る精製 抗すンホトキンンを分泌するネズミのモノクローナルセ
ルラインをマウス中で増殖させ、イオン交換クロマトグ
ラフィーにより、腹水かうｆｆｆ製した。イオン交換溶
出物を、臭１ヒンアン話性化セファローズに、２■／ｍ
ｅ（樹脂〕の濃度でカップリングさせた。２０ｍ１のカ
ラムをＴ”Ｂ　Ｓ　（０，０５Ｍトリス−１１Ｃ／　（
ｐＨ７，０）、０．１．５　Ｍ塩化ナトリウムおよび２
ｍＭ　Ｅ　Ｉ）Ｔ　Ａを含有している〕、次いて溶出緩
衝液（０，１Ｍ酢酸（ｐ　ｕ　４．５　）、１５０ｍＰ
ｖｉ塩化すＩ−ＩＪウム）、および最後にＴＢＳで順次
平衡１ヒさせた。ｐｌ−、Ｔｔｒｐｌ−形質転換大腸菌
の音波処理溶菌液（先に遠心分離により清澄化したもの
〕の４０％飽和硫酸アンモニウム沈殿物を０、１　Ｍ　
トＩＪ　ス塩酸（ＰＩＴ　７．４　）および５　ｍＭ　
Ｆ、　Ｉ）ＴＡに懸濁させ２１時間当たり１カラム容量
の割合てカラムに入れた。０．０５％のツウィーン２０
を含んでいるＴＢＳでよく洗かした後、溶出用緩衝液で
特異的に結合した物質を溶離し、直ちにｐｆＴを、０．
１容量（７）１．ＭトＩＪスー＋ＴＣＩ！（Ｐ’　８．
５）で７．８に調節し、４℃で保存した。この精製した
リンホトキシンの比活性は、−１１記のネズミ１４−９
２９分析法で測定したところ、２−１０　Ｘｌ０７単位
／ηであった。 この溶出液は、カラムに入れた活性の大部分を含んでい
た。全溶出タンパクの大部分は、Ｓ　Ｉ）　５ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法においで、還元条件下でも、
非還元条件下でも、午−のバンド（帯）として泳動した
。このバンドの移動率は、約１．８，０００　Ｍ〜■に
相当し、これは、推定したアミノ酸配列に基づくグリコ
シル化さイアていないロイシン−アミ／末端リンホトキ
シンの予想ｆ１ｒｃ、　１．８゜６６４ＭＷ　　に合致
している。その生物活性を更に特性１ヒするために、精
製した組換えリンホトキシンを、インビトロに於ける細
胞溶解活性、およびインビボに於ける抗腫瘍活性につい
て試験した１、実施例５　組換えリンホトキシンのイン
ビボに於ける生物活性 組換えのおよびリンパ芽球のリンホトキシンをインビボ
における腫１９壊死分析法で試験した。 ＭｅｔｈＡ（リ　肉腫を感受性−、／　ｒ７　ス［ＨＡ
　ＬＲ／ＣＸＣ５７Ｒ１／６ｒｌ　ｔた＋−１ｃＩｓ６
ｆｌ］中で７〜１０日間増殖させ、その腫瘍に、実験例
４のリンホトキシン、リンパ芽球のリンホトキシン（既
述の方法で調製し、精製う、または対照試料を直接注射
した。 ２０〜２４時間後にマウスを殺し、腫瘍を摘出し。 壊恒（ネクローゼ）の程度を組織学的に評価した。 表１に示した様に、組換えおよびリンパ芽球のリンホト
キシンは、共に、インビボに於けるＭｅｔｈＡ（ａ）肉
腫に著しいネクローゼを生せしめた。対照試料は、Ｍｅ
ｕｌＡ（ａ）　　肉腫のネクローゼを惹起しなかった。 表１　組換えおよび天然のりンホトキシンによるインビ
ボでのＭｅｔｈＡ（ａ）肉腫のネタローゼ十十士土十十
− 緩衝液１対照　　　　−−−３ 緩衝液２対照　　　　−−一９ ｘ■−＝リンホトキシン リンパ芽球のリンホトキシンは緩衝液１．（０，０１Ｍ
トリス−■−ＩＣで、０．０５Ｍ（ＮＩＩ４）２１１Ｃ
Ｏ３、ｐＨ８，０）に溶解して注射し、組換えリンホト
キシンは緩衝液２　（０，１５Ｍ　ＮａＣＪ、　０．１
　Ｍ酢酸ナトリウム、および０．１　Ｍ　ｌ−ＩＪス−
１１ｃ／？、　ＰＩＩ７．８　）ニ溶かして注射した。 組換工体ノ培養物（２−１０×１０７単位／Ｔｒｌ？）
によって調製されたリンホトキシン活性は、リンパ芽球
のリンホトキシン（４Ｘ１０７単位／〜）について報告
されているものと同じであったので２組換えリンホトキ
シンに炭水１ヒ合が存在しないことは生物活性に影響を
与えない様である。 組換えリンホトキシン活性は天然のリンホトキシンに似
た非耐熱性を示した。即ち、水溶液中、８０℃で１時間
加熱すると不活性化する。 実施例６　メチオニン・ヒスチジンアミノ末端リンホト
キシンのための発現ベクターの組立てメチオニン・ヒス
チジンアミノ末端リンホトキシンを大腸菌で発現するプ
ラスミドの組立てを第３図に示す。ヒスチジンアミノ末
端リンホトキシンのヒスチジンコドン（第２ａ図の残基
２４）に隣接して開始メチオニンコドンをコードする様
１こ、発現プラスミドに合成オリゴヌクレオチドを挿入
した。これは、ｐｌ−ＴＬｒｐｌ　　からＸｂａＩおよ
びＣｅａＩ消化によって４６３０　ｂｐベクターフラグ
メル 刈・を分離し、プレパラテイブ１％アガロースケ＾電気
泳動および電気溶出により行なった。リンホトキシン暗
号配列の大部分を含んでいる５　７０１）　ＰＢａｍｆ
ｌｌ　−Ｃｅａ　Ｉ　　フラグメントを、同様にしてｐ
ＬＴｔｒｐ＋１から分離した。先番こ述べた方法で２個
の合成オリゴヌクレオチドを合成し、第１ａ図のオリゴ
ヌクレオチド６．７．５２および５３と混合した。各オ
リゴヌクレオチド約５０ピコモルを、実施例１に記載し
た様にポリヌクレオチドキナーゼで処理した。このオリ
ゴヌクレオチドをアニーリングし、５７ＱｂｐＢａｍｌ
ｌｌ−Ｃ１ａＩ　　７　ラ’）−Ｊ　ントオヨひ４６３
０１）Ｐ　Ｘｌ）ａ　ｌ−Ｃ１ａ　Ｉ　　ベクターフラ
グメントの混合物と結合させた。この結合混合物で大腸
菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換し、組換え体を、テト
ラサイクリン耐性に基いて選択した。１個の形質転換体
からプラスミドＰ　２０　Ｋ　Ｉ−、”Ｆ　　を回収し
た。 プラスミドＰ２０ＫＬＴ　は制限酵素およびＩ）　Ｎ　
Ａ配の調製 リンホトキシンと細菌タンパク質との融合物をコードし
ているＤＮＡを含有しているプラスミドを、リンホトキ
シンの構造遺伝子に隣接した細菌性シグナル配列をコー
ドしている配列をクローニングすることにより組立てた
。大腸菌の熱安定性エンテロトキシン１１（ＳＴＩＩ）
のための遺伝子配列は特性化されており〔ピッケン（ｒ
ζ、Ｎ、　ｐｉ　ｃｋｃｎ）う、１９８３．インフエク
ション・アンド・イミュニイテイ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
　ａｎｄ　Ｉｍｍ＋＋ｎ１ｔｙ）。 ±２：２６９　２７５）、大腸菌のベリブラスム間隙へ
Ｓ　Ｔ　１１を排泄させる２３個のアミノ酸ノグナル配
列をコードしている。 プラスミドＰＷＭ５０１．［：ピッケン（Ｐｉｃｋｃｎ
）ら２１９８３、インフエクション・アンド・イミュニ
イティ、１ｇ〔１〕二２６９−２７５〕は熱安定性エン
テロトキシン（ＳＴＩＩ）遺伝子を含んでいる。このＳ
ＴＨフラグメントを分離した。この遺伝子フラグメント
を、予めＳｍａＩで消化したファージＭ１３ｍｐ８〔メ
ツシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、′巨大分子につい
ての第３回クリーブランド・シンポジウム″、：組換え
ＤＮＡ、ｍ者：ワルトン（Ａ、　Ｗａｌ　ｔｏｎ　）、
エルスビール、アムステルダム［１，９８１］、１１４
３１１５３頁に結合させた。結合したＩ）　Ｎ　Ａを便
って大腸菌ＪＭ１．０１（Ｍ１３ファージと共に使用す
るための市販株〕を形質転換した。澄明なプラークを回
収した。標準的な方法〔メツシングら、」二記〕を使い
、このファージで感染させた大腸菌ＪＭ】０１から、２
本鎖Ｍ１３ｍｐ８ＳＴＩＩＲｓａ誘導体を分離した。今
述べたＭ１３ｍｐ８　サブクローン′　　　　　　フグ
法を使うこと番こより、５ＴＩＩ　　リーダー遺伝子を
含んでいる約５５０塩基対フラグメントは今や、ファー
ジによって提供された一連の異なった制限エンドヌクレ
アーゼで囲まれている。次いで、このＭｌ　３ｍｐ８Ｓ
ＴＩＩ　Ｒｓ　ａ誘導体を１７．ｃｏＲＩおヨヒＰｓｔ
ｌで消化し、５５０ｂｐｌ）ＮＡ７ラグメントより少し
大きいＩ）　Ｎ　Ａフラグメントを分離した。 こノＦ、ｃ　ｏＲＩ　−Ｐ　ｓ　Ｌ　Ｉ　　フラグメン
トをｌ’）ＢＲ３２２にサブクローンした。これは、ｐ
ＲＲ３２２をＥｃ。 ＲＩとｌ’ｓｔＩで消化し、このベクターを単離するこ
キｔこより行なった。単離したベクターをＦ、ｃｏＲｌ
　−Ｐ　ｓ　ＬＩＤＮＡ　　フラグメントに結合させた
。この１）　Ｎ　Ａ混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１
４４６を形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーを
選択した。耐性大腸菌コロニーからプラスミドを分離し
、ｐｓＴＩＩ　　一部分体と命名した。 ｐｓＴＩＩ一部分体をＭｎ１ＩおよびＢＨｍＨＩで消化
し、ＳＴＴ■シャイン−ダルｌｆル／　（Ｓｈｉｎｅ−
１）ａｌｇ　−ａｒｎｏ）配列、５ＴＩＩシグナル配列
、および成熟５ＴＴＩ遺伝子の最初の３ｏコドンを含ん
でいる１８０１１　ｐフラグメントを分離した。］　８
Ｑ　＋）　ｐＨＮＡフラグメントを、Ｌｒｐ　　プロモ
ーターを含んでいるプラスミドに結合させた。この様な
プラスミドの１っ、ｐＨＧＩ（２０７−１１；！既ｉｃ
記載すレ”’ＣイルＣボイ７−　（ＩＩ、　ｄｅ　Ｂｏ
ｅｒ　）　　ら、１９８２．’プロモーター：構造およ
び機能“、編者二口ドレゲッッ（Ｒ，Ｒｏｄｒｅｇｕｅ
Ｚ）ら、Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｉ　ｉｎ　、　Ｐｒａｅｇｅ
ｒ出版、ニューヨーク、ＮＹ、４６２−４８１頁〕本実
施例では、このプラスミドの誘導体、ｐＨＧｆ−１２０
７−１’　　［これはｔｒｐプロモータの５′へのＥｃ
。 ＲＩ部位が、１）　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（ＤＮＡ　
ｐａｌＩ月こよる充填および平滑末端のライゲーション
による結合によりＥｃｏＲＩ’　に変換されている（＋
ヤヒ！Ｊ　イ（Ｓ、　Ｃａｂｉｌｌｙ　）ら、１９８４
．プロナス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ＋ｊ　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、）、ＵＳＡ、３↓：３２７３−３２７７）〕を使用
した。このｔｒｐプロモーター含有プラスミドをＸｂａ
Ｉで消１ヒし、Ｉ）ＮＡｐｏｌ■および全ての４個のｄ
ＮＴＰで処理して突出配列を満たした。このＩ）　Ｎ　
Ａ標品をＢａｍｆ（Ｉで消化し、ヘクター含有フラグメ
ントを分離した。このペクト ターフラグメ７ＡＧ、上で分離した１８０ｂｐＳＴＩＩ
シグナル−含有ＤＮＡフラグメントと結合させた。 この結合混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形
質転換してアンピシリン耐性とした。５−ｒｌＴ　−リ
ーダーと命名したプラスミドを、アンピシリン耐性コロ
ニーから分離した。 ＳＴ　ＩＩ暗号領域を含んでいるＭｌ、３フアージを、
ｐｓＴＨ−リーダーの１．８０１）ｐＸｂａＩ−Ｒａｍ
Ｊ目フラグメントを、ＸｂａｌおよびＢａｍ＋ＩＴ消化
Ｍ１３ｍＰ１０に結合させることにより、先づ組立てた
。 得られたファージＩ）ＮＡ、ｐｓＴＩＩ−シャトル、を
制限エンドヌクレアーゼ分析およびヌクレオチド配列決
定多こより特性１ヒした。次いでｐＬＴｔｒｐｌのＩ−
ＴｐａＩ　−ＥｃｏＲＩ７ＱＱｂｐ　　フラグメントを
Ｓｍａｌ−ＥｃｏＲ１消化ＰＳＴ■■−ツヤトル複製可
能形（ＲＦ、２本鎖）　Ｉ）　Ｎ　Ａに結合させること
により、■・Ｔ暗号配列をこのベクターに導入した；Ｓ
ｍａｌおよびｌ−１ｐａＴ　　部位を両者共に平滑末端
１ヒし、互いに結合させた（両部位を失なうことになる
）。 得られたファージＤＮＡ、Ｍｌ３−５ＴＩＩ　−ＬＴを
特性化し、以下の如くして突然変異誘発に使用しり：　
７”　５　イア　−５’　ｐ　ＣＡＡＡＴＧＣＣＴＡ″
′ｒＣＩＣＡＣｒＧＣＣＡＧＧＣＧＴＡＧＧをキナーゼ
処理し、リガーゼ緩衝液およ（１］の びＸｂａｌ−Ｆ、ｃｏＲＩ消化Ｍｌ　３ｍｐ　ｌ　Ｑ　
ＲＦ　Ｉ）ＮＡ　（１）ＮＡのプライム化を促進するた
め、アデルマン（Ｊ　、　Ｐ　、Ａｄｅ　Ｉｍａｎ　）
ら、１９８３、［ＤＮ４Ｊ２　二１８３−１９３頁参照
）の存在下で鋳型（Ｍ１３−３ＴＩＩ−ＬＴ）と混合し
た：この混合物を９５℃に加熱し、室温で３０分間アニ
ーニングさせ、氷上に３０分間放置した。ＡＴＰ、Ｔ４
　１）ＮＡ　　リガーゼ、および大腸菌１）　Ｎ　Ａポ
リメラーゼＩの大きいフラグメンｉ　（Ｋ＋ｅｎｏｗ）
と共に２全ての４個のデオキシヌクレオチド・トリホス
フェートを添加した。この混合物を１４℃で１時間イン
キュベートし、これを使って市販株であるコンピテント
な大腸菌ＪＭ１０１、またはその他のＭ１３ファージ宿
主をトランスフェクトした。プローブとして３２ｐ−標
識プライマーを使って、正しく突然変異したファージを
ハイブリダイゼーション・スクリーニング法で同定した
。得られたファージＳＴ−′　　　　　　■・Ｔ−ｍｕ
ｔ　　を、ＤＮＡ配列分析により特性（ヒした。 このファージから複製ｑ　Ｉ）　Ｎ　Ａを調製し、ロイ
シン−アミノ末端リンホトキシンの暗号配列番こ隣接し
たＳＴＨシグナル配列のためのＩ）ＮＡを含んている７
６１．ＩＩＰＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントの分離
に使用した。こ（７）　Ｉ）　Ｎ　Ａを、Ｘｂａ　Ｉ−
４３ｌ−４３ａ　　消ｆｔ、ｐ２ｏＫｔ−ｒ　　（大き
い４２８５１）　Ｐ　ベクターフラグメント）およびＰ
ＢＲ３２２の３７５１）Ｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＩＳａｍｌ
−１１フラグメントと結合させた。得られたプラスミド
、ｐＳＴ１８ＬＴ　　を制限地図およびｌ）　Ｎ　Ａ配
列決定により特性づけた。同様１こして、５ＴＩＴシグ
ナルアミノ末端とヒスチジンアミノ末端リンホトキシン
のヒスチジン残基の融合物をコードしている組立て物を
調製した。得られたプラスミドで大腸菌３１４４５を形
質転換した。プラスミドｐｓＴｔＴＩＢとｐＳＴＬＴ１
６を回収した。制限簿素分析およびジデオキシ配列決定
法により、それらが５ＴＩＩ融合物をコードしているこ
とを確認した。 プラスミドｐｓＴＬ”ｒ１８またはＰＳＴＬＴ１６　で
形質転換した大腸菌は、ゲル電気泳動により計算された
分子■と一致することにより決定される様に。 ロイシンアミノ−末端およびヒスチジンアミノ−末端リ
ンホトキシンとの５ＴＩＩシグナル配列融合体を合成す
る。これらの融合タンパク質を含んでいるこの大腸菌溶
解物は細胞毒性活性を示した。 実施例８　リンホトキシン中和能を有するモノクローナ
ルネズミ抗体の調製法 実施例１で得た、純化したリンパ芽球リンホトキシンを
、りん酸緩衝食塩水（Ｐｕｓ）に対して透析した。透析
物には２００μｇのリンホトキシン／ｍｅが含まれてい
た。グルタルアルデヒドを、７ＱｍＭグルタルアルデヒ
ドの濃度になるまで透析物蚤こ加え、この混合物を室温
で２時間インキュベートし、更にグルタルアルデヒドを
加えてその全添加濃度を１４０　ｍＭとし、更に６時間
インキュベートを続け、この混合物をＰＢＳに対して再
び透析した。グルタルアルデヒドで交叉結合したリンホ
トキシン（以降、「ポリリンホトキシン」といつ）　５
０　ｔｔ９と７０インドの完全アジュバント０．５　ｍ
ｌをマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ，株）　Ｂ−皮下Ｉ　した。 １週間後、このマウスに、ポリリンホトキシン５０μダ
およびフロイントの不完全アジュバント０．５を、半分
は筋肉内に２そして半分は腹腔内に注射してブースター
（促進つ免疫した。７日後に血清をとり、ＥＬＩＳＡ分
析により抗−リンホトキシン活性を調べた。 Ｆ、　Ｌ　ｔ　Ｓ　Ａ分析は次の様にして行なった：純
１１１ＪＩＪンホトキシンの緩衝溶液をマイクロタイタ
ー・ウェルｌこ入れ、約１００　ｎ！のリンホトキシン
で各ウェルが覆われる様にした。吸着しなかったリンホ
トキシン溶液を、アスピレターでウェルから除去した。 適当に希釈した被験試料５ｏｔｔｅを、５ｍ９／　ｍｅ
の牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１００μｅ（Ｉ’ＢＳ
−ＢＳＡ　　緩衝液）と混合し、各ウェルに加え、室温
で２時間インキュベートし、０．０５％のツウィーン２
０を含んでいるＰＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ−標識化山羊抗−マウスＩ　ｙＧ　（Ｉ’ＢＳ−
ＢＳＡ　緩衝ｉ中）　１００　ｔｔｌ　ヲ各’ｙエルに
加え、１時間インキュベートした。各ウェルを０．０５
％のツウイーン２０を含んでいるＰＢＳ、次いで０．１
ηのオルトフェニレンジアミノ／ｍｅ（基質溶液つを含
んでいるクエン酸りん酸緩衝液（Ｐ■−１５）　テ洗Ｒ
’　シ、　３０　％　”２０２水溶ｏ、（基質溶液１０
ｍ１当たり３０％（ｖ　／　ｖ　月１２０２溶液４μｆ
の割合）を各ウェルに加えた。ウェルを３０分間インキ
ュベートし、２．５Ｍ硫酸５０μｆで反応を停止させ、
４９２　ｎｍに於ける吸光度を測定した。１０．０以−
Ｌの吸光度を示したウェルを抗−リンホトキシン陽性と
みなした。 ネズミＬ９２９に於ける、リンホトキシンの訓胞溶解活
性の中和能についても被験試料を分析した。免疫動物か
ら採取した血清またはハイブリドーマ」−澄液を、１０
％の牛胎児血清および約１００リンホトキシン単位／ｍ
ｅを含むＲＰＭＴ−１６４０培地に入れて任意に希釈し
、その仙は細胞溶解分析の常法に従い、培養したＬ　９
２９細胞を含んでいるマイクロタイターウェルに入れた
。対照では、全ての細胞が溶解した。リンホトキシンが
Ｌ９２９細胞を溶解しないことをもって中和抗体を検出
した。 グルタルアルデヒドーポリメリ化リンホトキシンで免疫
した動物は、Ｆ、ｌ−ｌ５Ａ分析で活性を示す抗体を生
成したが、血清中和活性（活性中和血清つは検出されな
かった。 １００μｇのリンホトキシンおよび水酸１ｈアルミニウ
ム［ＩＡｌ（０１１）３］の１．６４％（Ｗ／Ｖ）懸濁
ｇ　１　ｍｌを含む懸濁液を調製し、同じマウスを免疫
するのに使用した。マウスには、この竪濁液の１、　Ｏ
Ｏｔｔｌを筋肉内注射し、４００μｅを腹腔内投与した
。１週間後、ｒ’ｎ５ｉｏｏμｆ１こ入れた、ポリメリ
比していない、吸着しなかったリンパ芽球リンホトキシ
ン１０μｇを静脈内注射した。３日後、この動物の血清
の】／８０希釈液を試験すると、リンホトキシン中和抗
体の存在することがわかった。 この動物の胛臓を摘出した。３　Ｘ　１０７の胛臓細胞
ヲ５×１０７のネズミミエローマ細胞と融合させ、ファ
ゼカス（Ｓ、Ｆａｚｃｋａｓ　）らの方法１こ従って、
ＨＡＴ培地および約３０００個の腹膜マクロファージ／
マイクロタイターウェルを含んでいるマイクロタイタウ
エルに入れた〔ファゼカスおよびグロｙ、　（Ｓｔ、　
Ｇｒｏｔｈ　）、１９８０、ジャーナル・オブ・イミュ
ノロジカ／ｌｚ−メソッド（Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　
０Ｍｅｔｈ　。 ）、…：＋２１１゜」１記のＥＬＩＳＡ分析で陽性であ
った」−澄液を含んでいるウェルからのハイブリドーマ
を、２０％の牛胎児血清、１０％のＮＣＴＣ−１３５培
地、５Ｘ１．０−５Ｍのβ−メルカプトエタノールおよ
びＩＩＡＴを含んでいる１）Ｍ　Ｆ、Ｍ培地１ｍｅ中で
増殖させ、統計学的にウェル当たり平均細胞数が１とな
る様に、マイクロタイターウェルに分配し、同じ培地１
ｍ／またはｓｍｅ中で培養した。次いで上澄液を中和抗
体について分析した。統計学的に、水酸１１′、アルミ
ニウム免疫法からのＦ、ＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマの
約２％が中和抗体を合成した。高親和性リンホトキシン
抗体は、所望により、このグループのハイブリドーマか
ら選択した。 実施例９　リンホトキシンの部位特異的突然変異誘発 合成オリゴヌクレオチドのセグメント６が、配夕１じ５
１口゛いＮゴ゛ロＵＣＡＣＣＣＡ　３’　　を持つ様に
修飾し、その相補鎖（セグメント５３）が配夕１ド３′
ＡＧＡＣＧＴＧｑＪＣＧＴＣＧＴ　５’を持つ様に修飾
するほかは実施例３と全く同様の操作を行なった。 修飾したオリゴヌクレオチドを残りのオリゴヌクレオチ
ドとアニーリングさせ、実施例６に述へた如く発現ベク
ターに結合させた。このベクターは２１）ｐ置換を含ん
でおり、これがリシン＋２８コドンをリシンからヒスチ
ジンに変換した。このヒスチジン突然変異体は、大腸菌
ＡＴＣＣ３１４４６の形質転換により発現される。 その池の部位指向的突然変異体も、同様の方法で調製さ
れる。この場合、Ｆ、　ｃ　ｏ　ＲＩ制限部位を導入し
ない様にコドンを選択するのが好ましい。さもないと、
実施例３で必要となるｐＴ、ＴＸ８１　の消（ヒに於い
て、部分的Ｆ、　ｃ　ｏ　ＲＴ制限消化を用いなければ
ならなくなる。この突然変異は、フラグメントＡ（第１
ｈ図月こ更寥こＸｂａｌまたは１１ａｍｌｌＴ部位を導
入しない様に、フラグメントＢにＢ　ａ　ｍｆｌ　Ｔま
たはＨｉ　ｎ　ｄ　Ｈ１部位を導入しない様に、そして
フラグメントＣにｌｌ１ｎｄ　ＩｎまたはＱ／Ｔ１部位
を導入しない様にしなければならない。さもないと、ｐ
Ｉ−ＴＸｏｌ　突然変異体を適切に組合せるのに部分消
（ヒが必要となる。完全に消化してしまうと、このケー
スにおいて目的とする置換変異体よりも欠落変異体が生
成すること１こなる。 実施例１０　ネズミおよびウシのリンホトキシンをコー
ドしているゲノムｌ）　Ｎ　Ａの同定：ネズミおよびウ
シのリンホトキシンのアミノ酸配列ネズミおよびウソの
リンホトキシン遺伝子をゲノム−λライブラリーから分
離した。ヒトのリンホトキ’ｉ　７　ｃｌ）ＮＡ７ラグ
メ７　ト（１’ｖｕ−Ｆ、ｃｏＲＩ、６００ｂＰ）を、
ニツクトランスレーソヨンにより３２ｐ　　を用いて放
射標識し、ネズミのゲノムＤＮＡ−λライブラリー（λ
シャロン４Ａ中のＭ６００株ネズミゲノムＩ）　Ｎ　Ａ
　、マニアナイス（Ｔ、Ｍａｎｉ−ａＬｉｓＪら、モレ
キュラー−クローニング（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ入３１頁、１９８２）および、別々に、ウシ
ゲノムＤＮＡライブラリー（Ｆ、Ｉ’８８６２２Ａ）を
スクリーニングするためのプローブとして使用した。ハ
イブリダイゼーションは、２０％ホー　　　　　ルムア
ミド中、低いストリンジエンシーで行ないしグレイ（Ｇ
ｒａｙ）およびゲ７５ｉ　／ｌ／　（Ｇｏｅｄｄｅｌ　
）、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳ倶興：５８４２−５８４６
（１９８３，）：］、０、３　”　塩化ナトリウム、０
．０３　Ｍクエン酸ナトリウム、および０１％Ｓ　Ｌ’
）　Ｓの水溶ｌ中で２回１？した。ヒトのリンホトキシ
ンプローブとハイブリダイズした数個のファージをプラ
ーク精製したしマニアナイス（ＴｏＭａｎｉａｔｉＳ）
ら、細胞（ｃｅｌｌ）、１５：６８７−７旧、１９７８
　）。ファージＩ）Ｎ　Ａをつくすしマニアナイスら、
細胞、１儒６８７　７０１（１９７８，ｌ　　］　　、
制限エンドヌクレアーゼで消化し、サウザン・ハイブリ
ダイゼーション法で分析した。 ３５００１）ｐのＦ、　ｃ　ｏ　Ｒ１ネズミＩ）　Ｎ　
Ａフラグメン］・および２２００１）Ｐ　　Ｆ、ｃｏＲ
ＩウンＩ）　Ｎ　Ａフラグメントが、それぞれヒトのリ
ンホトキシンプローブとハイブリダイズした。これらの
ＤＮＡフラグメントをプラスミドＰＢＲ３２２１こナブ
クローンし、ジデオキシ鎖−末端法〔スミス（Ａ、Ｊ　
、ｆｌ、Ｓｍ１ｔｈ）＋メソッドψイン９エンザイモロ
ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、
　６ト５６０−５８０．１９８（’ＩＪて配列決定した
。この推論されたネズミおよび牛リンホトキシンのタン
パク質配列を、比較のためのヒトリンホトキシンの配列
と共１こ第４図に示＋３゜実施例１１　　Ａｌ）Ｉ＋プ
ロモータのコントロール下にある酵母に於けるリンホト
キシンの発現。 プラスミドｐＬＴｔｒｐｌを、リンホトキシンの開始コ
ドンにすぐ近接しているＸ　ｂ　ａ　１部位でプラスミ
ドを開裂するために、Ｘ　ｂ　ａ　１で消（ヒした。こ
のＸｂａ　Ｉ粘着末端を大腸菌１）　Ｖ　Ａポリメラー
ゼＩのタレナラフラグメントにより、４個のｄＮＴＰを
用いて平滑比した。以下の式： ％式％ で示されるＦ、　ｃ　ｏ　Ｒ１アダプターを平滑（Ｂし
たプラスミドフラグメントと結合させ、突出している５
′ヒドロキシ末端をポリヌクレオチドキナーゼを使って
燐酸化し、この結合混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１
４４６を形質転換し、リンホトキシン開始コドンに近接
した追加のＦ、　ｃ　ｏ　Ｒ１部位を持っているプラス
ミドｐＬＴ＋ｒｐｌＲ１を同定した。プラスミドｐＬＴ
ｔｒｐｌＲ１を分離し、Ｆ、ｃｏＲＩで消化し、リンホ
トキシンＩ）ＮＡ含有フラグメント５Ｐを回収した。 フ７　スミトｐＦＲＰｎ（１’：Ｐ２Ｏ，０５７Ａ）を
ｉ’、　（（ｌ旧で消化し、再環ＩＬを妨ぐためにナル
カリホスファターゼで処理し、′Ｔ’　４１）Ｎ　Ａ　
　＋）ガーゼを使ってＳＰ＋Ｊンホトキンンフラグメン
トに結合さぜ、その結合混合物を使って大腸菌Ａ　Ｔ　
ＣＣ３１、４４６を形質転換した。アガロース電気泳動
ゲルｌ−で制限分析によって決定したところ、アンピノ
リン耐性コロニーから、ＳＰ挿入物を互いに反対方向１
こ持っている２種のプラスミドが得られた。プラスミド
を大腸菌形質転換体から純化し、これを１・Ｉｊ　−）
てｔ　ｒｐｌ突然変異を持った酵母（例えは酊ｆｒ）　
Ｉ’１１．：Ｔ１１２１８、非制限的ＡＴＣＣ寄託＆４
４０７６）を形質転換し、ｔｒｐ＋表現型にした。セグ
メントＳＰの開始コドンかアルコールデヒドロゲナーゼ
・プロモーターフラグメントに隣接して存在する様に配
向しているプラスミドは、リンホトキシンを発現する様
に酵母を形質転換することかわか−）だ。 酵母形質転換体の抽出物からりンホ１キンンを［【１１
収する。ｐＦＲＩ’ｎ染色体複製起源（思１）の代り（
１，２２） に２ミクロン複製起源を含有している発現プラスミド、
および適合し得る宿主株〔ベッグス（Ｊ。 １３ｅｇｇＳ）、１９７８．ネーチャ−（Ｎａｔｕｒｅ
、）、２７５：１０４−１０９）を用いること；こより
、大規模な発酵に於けるプラスミドの安定性を改良する
ことかできる。 実施例１２　＠乳動物細胞内でのリンホトキシンの発現 λｌ−Ｔｌ１（実施例２）をＥｃｏＲＩで消化し、リン
ホトキシン含有１）　Ｎ　Ａフラグメント（逆転写体つ
を回収する。プラスミドｐＦ、Ｉ−［Ｒ（ＥＴ’ｌ１７
，０６０Ａ）をＥｃｏＲｌで消化し、牛腸内性アルカリ
ホスファターゼで処理し、λｒ−Ｔ１１のＥ　ｃ　ｏ　
Ｒｌ　−リンカ−処理逆転写体と結合させた。得られた
プラスミドを大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６（Ｅｌ’　１１
７，０６０Ａ）を使って増殖させ、ｐＥ）ＩＥＲＬＴＩ
およびｐＥＩＩＥＲＬＴ　ＩＩと命名した。ポリアクリ
ルアミドゲル上で制限分析した結果、これらは互いに逆
方向のリンホトキシンＩ）　Ｎ　Ａを含有していた。こ
れらのプラスミドを使ってトランスフェクトを行ない、
ＣＩ−Ｔ。 １）ＩＩＦＲ−１）ＵＸ　−８１］　、　Ｃｌｌ０Ｉお
よび１．、　ｔ　Ｋ−細胞を選択する。 」−で調製したｐＥｆｌＦ、ＲＴ−Ｔ　　Ｉ　　または
ｐＦ、ｆｌＦ、旧、１゛ＩＩ　ｌμｇを１０１１ｇ　の
ラットのキャリアー１）Ｎ八（２５０μｌの容伍中、０
．２５　Ｍ　ＣａＣｒ２）と混合し、次いで２’５０１
＋Ｊの１．−Ｔ　Ｅ　Ｐ　Ｆ、　Ｓ緩衝食塩水（２８Ｑ
　ｍＭ　ＮａＣ４，１，５ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４，５０ｍ
Ｍｌ−ＩＥＰＥＳ　、　ｐｉ−１７，１）を滴加するこ
とにより組織培養細胞をトランスフェクトした。室温で
３０分間放置した後、６０ＩＩＩＩＩ＋のプラスチック
製組織培養皿中で増殖している組織培養細胞にこの溶液
を加える。ＣＨＯｌ、　、　Ｃｆ−Ｔｏ　Ｉ）ＩＩＦＲ
−１）ＵＸ−，８１］およびｉ−ｔ　Ｋ−細胞を使用す
る。皿は宿主細胞に適した３ｍｌの培養培地を含んでい
る。 Ｃｌ−１０１およびＣＨＯＩ）ｆＩＦＲ−１）ＵＸ　−
４Ｓ　１．１細胞番こついての培地は、１０％の牛血清
、１００μ／ｍｅのペニシリン、１００μｇ／ｍｅのス
トレプトマイシンおよび２Ｉ１ｍＭのし一グルタミンを
補光したＩＩａｍ　Ｆ−１２培地（Ｇｉｌ）ｃｏ）であ
り、Ｉ、ｔＫ−セルラインについての培地は１．Ｌと同
様の補光を行なつたドルベツコ（１）ｕｌｂｅｃｃりの
改良イーグル（Ｆ、ａｇｌｃ）培地である。 ３−１６時間後、培地を除去し、りん酸緩衝食塩水中の
２０％グリセロールで洗浄する。各プレートに新しい培
地を加え、更に２日間細胞をインキュベートする。 ２日間増殖させた後細胞をトリプシン処理しくこれは、
０．２　Ｑ　／　ｍｌのＥＤＴＡを含有している滅菌ト
リフシン０．５　ａｉ／　ｍｅで細胞を処理することか
らなる）、約３　Ｘ　１０”’細胞を、選択性培地を有
する１０＃Ｉ＃Ｉの組織培養プレートに加えることによ
りトランスフェクトした宿主細胞を選択する。ｄｈｆｒ
−″細胞のための培地は、グリシン、ヒポキサンチンお
よびチミジンを含まない＜、　Ｆ−１２ｃＩｎｃｏ）培
地（ＧＩＩＴ−培地）の系統である。Ｄ　ｆ−Ｉ　Ｆ　
Ｒ＋宿主細胞については、正常な増殖培地にメトトレキ
セート（１０１００−１０００ｎを添加する。プラスミ
ドを使用しないが、正常なＩ）　ＨＦ　Ｒを含有してい
るプラスミドＰＦＤ−１１（ＥＰ　１１７，０６ＯＡ）
を使って、トランスフェクションの条件下で対照実験を
ｆｌすｃ＋Ａ 行なう。Ｉ）１１　Ｆ　Ｒを取り込み、これを発現する
細胞から生じるコロニーは１〜２週間以内に観察される
。成熟リンホトキシンを発現する形質転換体を同定する
。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はリンホトキシンを暗号化している１）ＮＡ配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図、第１ｂ図は
組換えプラスミドｐＬＴＸＢ］の組立てを示す模式図、
第２ａ図はプレリンホトキシンの全アミノ酸配列並びに
５′および３′非翻訳領域をも含めた暗号１）ＮＡ配列
を示す模式図、第２１）図は発現ベクターｐＬＴじＰｌ
の組立てを示す模式図、第３図は発現ベクターｐ２ｏＫ
ｒ−Ｔの組立てを示す模式図、第４図はヒト、ネズミ、
ウシのリンホトキシン、および鋪乳類に共通したリンホ
トキシンの塩基配列を示す模式図２第５ａ図および第５
ｈ図はプラスミドｐ　Ｓ　Ｔ　ｌ　８Ｌ　Ｔの組立てを
示す模式図である。 （１，２６） 特開昭６ｌ−５６１９７（３４） ＝　　　　（ ８′Ｑ。 １　　　さ く −３４，３０ ど　）、　　ｔｈｒ　ｔｈｒ　　ｌｅｕ　ｈｉｓ　　ｌ
ｅｕ　　ｌｅｕ　ｌｅｕ　　ｌｅｕウシＡＬＡ　ＧＬＮ
　ＰＲＯＡＬＡ　ＨＩＳ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　ＬＥＵイト
９ｊ主　　ＡＬＡ　　　　　　　　　　　　ＡＬＡ−１
０゛□゛□ ＧＬＹ　ＬＥＬＩ　ＴＨＲＰＲＯＳＥＲＡＬＡＡＲＧ　
ＰＨＥ　　　　　　　ＳＥＲＡＬＡＧＬＹ　ＬＥＵ　Ｔ
ＨＲＰＲＯＳＥＲＡＬＡＳＥＲＡＬＡ ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＨＩＳ　Ｓ
ＥＲＴＨＲＧＬＮ　ＬＹＳ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＴＨＲＨ
ＩＳ　ＧＬＹ　ＩＬＥＰＲＯＴＨＲＰＲＯＰＨＥ　ＴＨ
ＲＡＲＧ　ＧＬＹ　ＴＨＲ本ス゛ミ　　ＡＳＮ　　ＳＥ
ＲＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＴＲＰ　　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　
　ＡＳＮ　　ＡＬＡ　　ＡＳＰウンＡＲＧ　ＴＨＲＬＥ
Ｕ　ＴＨＲＬＥＵ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＴＨＲＡ
ＳＰ−＠′数社　　　　　　ＬＥＬＩ　　　　　　　Ａ
ＲＧ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　　　　ＡＳＰヒ　　ト　　　Ｇ
ＬＹ　　ＰＨＥ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＳＥＲＡＳＮ　　
ＡＳＮ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵキ又゛ミ　　　ＧＬ
Ｙ　　ＰＨＥ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＳＥＲＡＳＮ　　Ａ
ＳＮ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵ／’Ｒａ　　ＧＬＹ　
　　　ＴＹＲＰＨＥ　ＶＡＬ　ＴＹＲＳＥＲＧＬＮ　Ｖ
ＡＬ　ＶＡＬＰＲＯＳＥＲＬＹＳ　ＧＬＮ ＰＲＯＳＥＲＬＹＳ　ＧＬＮ ＰＲＯＳＥＲＡＳＮ　ＰＲＯ ＰＲＯ５ＥＲ ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＰＨＥ　ＬＥＤ　ＧＬＮ　ＡＳＰＡＲ
Ｇ　ＡＬＡ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＨＩＳＡＲＧ　
ＡＬＡ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＰＲＯＴＨＲＡＲＧ　ＡＬＡ
　ＰＨＥ　ＬＥＵ ＶＡＬ　ＰＲＯＴＨＲ５ＥＲ ＩＬＥ　ＰＲＯＴ）ＩＲ５ＥＲ ＶＡＬ　ＰＲＯＴＨＲ５ＥＲ ＰＲＯＴＨＲ５ＥＲ ＰＨＥ　ＳＥＲＧＬＹ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＴＹＲＰＨＥ
　ＳＥＲＧＬＹ　ＧＬＵ　ＳＥＲＣＹＳＰＨＥ　ＳＥＲ
ＧＬＹ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＣＹＳＰＨＥ　ＳＥＲＧＬＹ ヒト　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＰＨＥ　ＳＥ’ＲＳＥ
龜ＧＬＮネズミ　　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＰＨＥ　
ＳＥＲＳＥＲＧＬＮつ”ｙ　　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＬＥＵ
　ＰＨＥ　ＳＥＲＰＲＯＧＬＮ＋ｔｒａ　　ＶＡＬ　Ｇ
ＬＮ　ＬＥＵ　ＰＨＥ　ＳＥＲＧＬＮビ　　）　　　　
ＳＥＲＧＬＮ　　ＬＹＳ　　ＭＥＴ　　ＶＡＬ　　ＴＹ
ＲＰＲＯネズミＡＬＡ　ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲＶＡＬ
　ＴＹＲＰＲＯ分骸杖　　　ＧＬＮ　ＬＹＳ　　　　Ｖ
ＡＬ　　　　ＰＲＯヒ　　ト　　　ＨＩＳ　　ＳＥＲＭ
ＥＴ　　ＴＹＲＨＩＳ　　ＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＡＬＡ
ネス”ミ　　ＡＲＧ　　ＳＥＲＭＥＴ　　ＴＹＲＧＬＮ
　　ＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＶＡＬＲＬＥＵ　ＡＬＡ　Ｈ
ＩＳ　ＧＬＵ ＴＹＲＰＲＯＰＨＥ　ＨＩＳ　ＶＡＬ　ＰＲＯＬＥＵ　
ＬＥＵ　５ＥＲＴＹＲＰＲＯＰＨＥ　ＨＩＳ　ＶＡＬ　
ＰＲＯＬＥＵ　ＬＥＵ　５ＥＲＴＹＲＰＲＯＰＨＥ　Ｈ
ＩＳ　ＶＡＬ　ＰＲＯＬＥＵ　ＬＥＬＩ　５ＥＲＴＹＲ
ＰＲＯＰＨＥ　ＨＩＳ　ＶＡＬ　ＰＲＯＬＥＵ　ＬＥＵ
　ＳＥＲＧＬＹ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＰＲＯＴＲ
Ｐ　ＬＥＬＩＧＬＹ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＧＬＹ　
　ＰＲＯＴＲＰ　　ＶＡＬＧＬＹ　　　ＧＬ。 ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＴＨＲＧＬＮ　ＧＬＹ　ＡＳ
Ｐ　ＧＬＮｐＨＥ　ＬＥＵ　ＬＥＤ　ＳＥＲＬＹＳ　Ｇ
ＬＹ　ＡＳＰ　ＧＬＮＵ　ＴＨＲＡＲＧ　ＧＬＹ　ＡＳ
Ｐ　ＧＬＮＬＩ　　　　　　　ＧＬＹ　ＡＳＰ　ＧＬＮ
ｒ ｔ：　トＰＲＯＳＥＲＴＨＲＶＡＬ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　
ＧＬＹ８府ＰＲＯＳＥＲＳＥＲＶＡＬ　ＰＨＥ　ＰＨＥ
　ＧＬＹウ　　ＰＲＯＳＥＲＳＥＲＶＡＬ　ＰＨＥ　Ｐ
ＨＥ　ＧＬＹａ性ＰＲＯＳＥＲＶＡＬ　ＰＨＥ　ＰＨＥ
　ＧＬＹ比Ｅ　ＰＲＯＨＩＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＥＵ
　５ＥＲＩＬＥ　ＳＥＲＨＩＳ　ＬＥＵ　ＨＩＳ　ＰＨ
Ｅ　５ＥＲＩＬＥ　ＳＥＲＨＩＳ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　Ｌ
ＥＤ　５ＥＲＩＬＥ　　　ＨＩＳ　ＬＥＵ　　　　　Ｓ
ＥＲＡＬＡ　ＰＨＥ　ＡＬＡ　ＬＥＵ ＡＬＡ　ＰＨＥ　ＡＬＡ　ＬＥＵ ＡＬＡ　ＰＨＥ　ＡＬＡ　ＬＥＤ ＡＬＡ　ＰＨＥ　ＡＬＡ　ＬＥＵ ２／３２４８Ｍ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、同定されていない、または存在量不明のホモローガ
   スなタンパク質を全く含有していないリンホトキシン。 ２、約２〜１０×１０＾７単位／タンパク質（ｍｇ）の
   比活性を有する第１項に記載のリンホトキシン。 ３、プレリンホトキシである第１項に記載のリンホトキ
   シン。 ４、グリコシル化されていないリンホトキシン。 ５、第２ａの図に示されているリンホトキシンの配列に
   おいて、アミノ酸残基が（ａ）欠失または（ｂ）他の残
   基で置換され、あるいは（ｃ）該配列中に他の残基が挿
   入されている変異型リンホトキシン（ただし、Ｌｅｕ＋
   １またはＨｉｓ＋２３にアミノ末端を有する第２ａ図の
   配列のリンホトキシンを除く）。 ６、第２ａ図の配列のヒト−アレルである第５項に記載
   の変異型リンホトキシン。 ７、動物のリンホトキシンである第５項に記載の変異型
   リンホトキシン。 ８、動物のリンホトキシンがウシのものである第７項に
   記載の変異型リンホトキシン。 ９、残基−３４〜−１が欠失しており、少なくとも１個
   の挿入されたアミノ酸残基を含有する第５項に記載の変
   異型リンホトキシン。 １０、挿入が、リンホトキシンのカルボキシ末端にポリ
   ペプチが融合することにより行なわれている第９項に記
   載の変異型リンホトキシン。 １１、ポリペプチドが、タンパク分解酵素による加水分
   解部位を介してリンホトキシンと融合している第１０項
   に記載の変異型リンホトキシン。 １２、加水分解部位がｌｙｓ−ｌｙｓまたはｌｙｓ−ａ
   ｒｇである第１１項に記載の変異型リンホトキシン。 １３、タンパク分解酵素による加水分解を受けるまでは
   細胞溶解活性が不活性である第１１項に記載の変異型リ
   ンホトキシン。 １４、疎水性のジペプチドまたはトリペプチドがｌｅｕ
   ＾＋１７１に融合している第９項に記載のリンホトキシ
   ン。 １５、ｇｌｕ＾＋１２７とｐｒｏ＾＋１２８との間にａ
   ｌａ−ｌｙｓが挿入されている第９項に記載の変異型リ
   ンホトキシン。 １６、ｔｈｒ＾＋１６３とｖａｌ＾＋１６４との間に疎
   水性のアミノ酸残基が挿入されている第９項に記載の変
   異型リンホトキシン。 １７、第２ａ図のリンホトキシン配列の少なくとも１個
   のアミノ酸残基が他の残基で置換されている第５項に記
   載の変異型リンホトキシン。 １８、第２ａ図の配列中、残基−３４から−１まで（そ
   れらを含む）がメチオニル残基またはホルミルメチオニ
   ル残基で置換されている第１７項に記載の変異型リンホ
   トキシン。 １９、残基−３４から＋２２まで（それらを含む）がメ
   チオニル残基またはホルミルメチオニル残基で置換され
   ている第１７項に記載の変異型リンホトキシン。 ２０、残基−３４〜−１を欠失し、かつ、 （ａ）リシル＋８９をヒスチジルで置換する；（ｂ）ア
   ラニル＋１６３をバリル、イソロイシルまたはロイシル
   で置換する； （ｃ）スレオニル＋１６３をチロシルで置換する；（ｄ
   ）セリル＋８２をリシルで置換する； （ｅ）セリル＋４２をイソロイシル、ロイシル、フェニ
   ルアラニル、バリルまたはヒスチジルで置換する； （ｆ）リシル＋８４をグルタミル、トリプトファニル、
   セリルまたはヒスチジルで置換する；（ｇ）スレオニル
   ＋１６３をアスパルチルまたはリシルで置換する； （１１）セリル＋７０をリシルまたはグリシルで置換す
   る； （ｉ）スレオニル＾＋６９をチロシルで置換する；（ｊ
   ）リシル＾＋２８をアルギニルまたはヒスチジルで置換
   する； （ｋ）ヒスチジル＾＋３２をアルギニルまたはリシルで
   置換する； （ｌ）アスパルチル＋３６をプロリル、セリル、スレオ
   ニル、チロシルまたはグルタニルで置換する； （ｍ）セリル＾＋３８をチロシル、メチオニルまたはグ
   ルタミルで置換する； （ｎ）セリル＾＋６１をスレオニル、チロシル、ヒスチ
   ジルまたはリシルで置換する； （ｏ）グリシル＾＋１２４をアスパルチル、セリルまた
   はチロシルで置換する； （ｐ）ヒスチジル＾＋１３５をアルギニル、リシル、チ
   ロシル、トリプトファニルまたはプロリルで置換する； （ｑ）スレオニル＾＋１４２をアスパルチルで置換する
   ；または、 （ｒ）グルタミル＾＋１４６をリシルまたはスレオニル
   で置換する、 ことにより、得られる第１７項に記載の変異型リンホト
   キシン。 ２１、動物のリンホトキシンとヒト−リンホトキシンの
   ハイブリッドである第５項に記載の変異型リンホトキシ
   ン。 ２２、メチオニル残基、＾＋２０、＾＋１２０および＾
   ＋１３３がそれぞれスレオニル、セリルおよびバリル残
   基で置換されている第２１項に記載の変異型リンホトキ
   シン。 ２３、腫瘍壊死因子フラグメントを含有する第５項に記
   載の変異型リンホトキシン。 ２４、ロイシル−アミノ末端リンホトキシンの最初の２
   ７、２６または２５個のアミノ末端残基が、式： ｖａｌ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ａｒｇ−ｔ
   ｈｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ａｓｐｖａｌ−ａｒｇ−ｓｅｒ
   −ｓｅｒ−ｓｅｒ−ａｒｇ−ｔｈｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ；
   またはｖａｌ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ａｒ
   ｇ−ｔｈｒ−ｐｒｏで示されるポリペプチド群から選択
   されたポリペプチドで置換されたものである、第２３項
   に記載の変異型リンホトキシン。 ２５、１個のアミノ酸残基の置換を含む第５項に記載の
   変異型リンホトキシン。 ２６、１〜約３０のアミノ酸残基による単一の欠失を含
   む第５項に記載の変異型リンホトキシン。 ２７、１個のアミノ酸残基の挿入を含む第５項に記載の
   変異型リンホトキシン。 ２８、ロイシル＾＋１から約３０残基の間で置換、欠失
   または挿入がなされている第５項に記載の変異型リンホ
   トキシン。 ２９、カルボキシ末端アミノ酸の２５残基の中で、予定
   されたアミノ酸残基の置換がなされている第５項に記載
   の変異型リンホトキシン。 ３０、中性、酸性または塩基性のいずれかのクラスのア
   ミノ酸残基で、その置換に用いるアミノ酸とは別のクラ
   スの残基を置換することによって置換が行なわれている
   第５項に記載の変異型リンホトキシン。 ３１、細胞毒性を有する第５項に記載の変異型リンホト
   キシン。 ３２、（ａ）リンホトキシンを暗号化しているＤＮＡで
   あって、非−翻訳介在配列を含まないもの；（ｂ）リン
   ホトキシンを暗号化しているＤＮＡであって、該ＤＮＡ
   の供給源である生物の他のタンパク質を暗号化している
   ＤＮＡを含まないもの；および（ｃ）リンホトキシンを
   暗号化している核酸とハイブリダイズし得る核酸である
   が、リンホトキシンを暗号化している天然のＤＮＡまた
   はＲＮＡのヌクレオチド配列を持たない核酸、からなる
   群から選択される、リンホトキシンを暗号化している核
   酸。 ３３、ヒト−リンホトキシンを暗号化した第３２項に記
   載の核酸。 ３４、ヌクレオチド２８４と２８５との間に介在配列を
   含有していないＤＮＡである第３３項に記載の核酸。 ３５、ｃＤＮＡである第３４項に記載の核酸。 ３６、検出可能な物質によって共有結合的に標識されて
   いる第３２項に記載の核酸。 ３７、変異型リンホトキシンを暗号化している第３２項
   に記載の核酸。 ３８、第３２項に記載のＤＮＡを含有する複製可能なベ
   クター。 ３９、原核生物内で複製可能な第３８項に記載のベクタ
   ー。 ４０、真核生物内で複製可能な第３８項に記載のベクタ
   ー。 ４１、リンホトキシンを暗号化している核酸と機能的に
   結合した細菌性プロモーターを含有する第３９項に記載
   のベクター。 ４２、ＤＮＡが細菌性分泌リーダーとリンホトキシンと
   の融合物を暗号化しているものである第３９項に記載の
   ベクター。 ４３、ｐＬＴ＿ｔ＿ｒ＿ｐ１。 ４４、ｐ２０ＫＬＴ。 ４５、第３２項に記載の核酸で形質転換されたヘテロロ
   ーガス細胞。 ４６、第３８項に記載のベクターで形質転換された細胞
   。 ４７、原核性細胞である第４６項に記載の細胞。 ４８、第４６項に記載の細胞を培養し、培養物中にリン
   ホトキシンを蓄積させ、このリンホトキシンを培養物か
   ら回収する方法。 ４９、細胞が酵母またはヒト以外の哺乳類の細胞であり
   、核酸がヒト−プレリンホトキシンを暗号化したもので
   あって、培養物から異種グリコシル化リンホトキシンを
   回収することからなる第４８項に記載の方法。 ５０、細胞が原核細胞である第４８項に記載の方法。 ５１、リンホトキシンが変異型リンホトキシンである第
   ５０項に記載の方法。 ５２、第４９項に記載の方法で得られる生産物。 ５３、ロイシル−アミノ末端リンホトキシンを含有する
   組換え細胞培養。 ５４、変異型リンホトキシン、非グリコシル化リンホト
   キシン、および第５２項に記載の生産物からなる群から
   選択されるリンホトキシンを含有する組成物を動物に投
   与する方法。 ５５、リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体で
   あって、非−中和抗体を含有しないもの。 ５６、検出可能な物質で標識した第５５項に記載の抗体
   。 ５７、固定化されている第５５項に記載の抗体。 ５８、組成物中のリンホトキシンを分離する方法であっ
   て、該組成物と第５５項に記載の抗体とを、リンホトキ
   シンが該抗体に吸着される条件下で接触させ、組成物か
   ら抗体に吸着されたリンホトキシンを分離し、次いで抗
   体とリンホトキシンを分離することからなる方法。 ５９、モノクローナル抗体である第５５項に記載の抗体
   。 ６０、リンホトキシンが、（１）インビトロでの腫瘍細
   胞に対する細胞毒性活性、またはインビボでの腫痕壊死
   活性のいずれかの活性を有し、かつ（２）第２ａ図に示
   したリンホトキシンのアミノ酸配列またはそのフラグメ
   ントとホモロージーな機能的なアミノ酸を示す領域を含
   有するポリペプチドである第５５項に記載の抗体。 ６１、ヒト−リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する
   第５５項に記載の抗体。 ６２、検出可能な物質が螢光、化学発光または、放射性
   同位元素標識である第５６項に記載の抗体。 ６３、表面またはマトリックスに、吸着または共有結合
   を介して固定化されている第５７項に記載の抗体。 ６４、グルタルアルデヒド−重合化リンホトキシンに対
   して動物を免疫した後、該動物をリンホトキシン−明ば
   ん吸着コンプレックスに対して免疫する方法。 ６５、グルタルアルデヒド−重合化リンホトキシン。 ６６、リンホトキシンと明ばんの吸着コンプレックス。