JPS5984827A - ヒトリンホトキシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、最初吠リン・ダ球から不純形で抽出され抗ｎ
ａ活性を有すると考えられている１種のタンノ臂りたる
リンホカインに係る。より鮮細には本発明はヒトリンホ
カインの均質調製物たるリンホトキシン及びその製法に
係る。

リンホカインは、刺激リンパ球から産生される生物学的
に活性のホルモン楳イプチド又はタンノヤクである。こ
のようなリンホカインの特性及び機能については細胞傷
害活性を示すＪ特性及び機能をも含めて種々に研究され
てきた。リンホトキシンは、マイトジェン又は抗原によ
シ刺激されたリン／４’球から産生されるのみでなく該
リンパ球由来の組織カルチャー（組織培養）中で増殖す
る細胞系（セルライン）からも産生される１種のリンホ
カインである。

リンホトキシンは免疫系の調節に開力しており（１）、
腫売細胞の増殖をｉｎ　ｖｉＶｏ（２−７）及びＩｎ　
ｖｌｔｈｏ（８−１０）の双方に於いて抑制すると報告
されている。ｉｎ　ｖｌｔｒｏ条件では同一種から得ら
れた細胞に対し正常細胞よシも＋ｐｔ４細胞をより強力
に抑制する（１１−１５）。また、リンホトキシンＩｉ
＋、′ＳＲ物はＵＶ又は化学的発陥物質によシ誘発され
る細胞形質転換を抑制することが判明した（１６−１７
）。リンホトキシンのｌｎ　ｖｉｔｒ。

活性は後述する如き多数の方法により検定され得る。こ
れらの方法を適宜利用して粗抽出物からリンホトキシン
をｆｆＩ製する方法を探求し得る。人間に於けるｉｎ　
ｖｉｖｏテストでも粗リンホトキシン調製物が１１弔捲
減縮に有効であることが知見された（５，７）。

従来の研究では、リンＡＩ球又はリンパ球由来の細胞系
から調製された比較的不純な細胞上清の両分が使用され
ていた。多数の研究所が精製形のリンホトキシンの製造
に着手したが顕著な成功は得られなかった（１８−２４
）。本発明によって初めて都乳類の抗種偽剤として有用
なヒトリンホトキシンタンノ臂りの均質調製物が提供さ
れる。

１つの角度から見た本発明の目的は、ヒドリンホトキシ
ン自体並びにリンホトキシンの天然及び天然に等しい薬
剤的に許容し得る塩及び薬剤的に許容し得る誘導体を実
質的に均質な形状で提供することである。均質性なる用
語は、従来の定義で使用されておりヒト由来の他のタン
／’Ｐりが実質的に存在しないという意味をも含む。更
にＮ−未１鮪のアミノ酸配列によってヒドリンホトキシ
ンの特性決定が行なわれる。

本発明は更に、前記リンホトキシンを含有する薬剤組成
物及び該薬剤組成物を抗腫痙剤として投与するために使
用する方法に係る。

別の角度から見た本発明の目的は均質なヒドリンホトキ
シンの製法を提供することである。

Ａ　定義及び略号 リンホトキシン中のアミノ酸の配列は、標準ＩＵＰＡＣ
によるアミノ酸１残基”″を示す３文字略号によって示
される。′残基”はアミノ酸配列内での機能的意味を有
する。配列の本体部では残基及びその略号は１つのＮ−
水素及びカル〆キシルの一０１ｉが除去されたアミノ酸
を示す。末端位置では残基ｉ、Ｊ：適尚な水素又は水酸
基を含むと理解される。Ｖｌつて、Ａｌ　ａ　１−Ａｌ
　ａ　２−Ａｌ　ａ　ｓ　ｆｘる配列に於いてＣＩ（５ ｌ１３ を示す。

本文中のキラルなアミノ酸残基は全て、特に注釈が無け
れば天然配置又社り形装置である。

ペグチド配列は全て従来通り左側にＮ−末端、右側にＣ
−末端を有するように示される。

１リンホトキシ７＃は単離ペプチド配列の形状又は複数
個の該にプチド鎖の集合体として存在し得ると考えられ
る。本発明により得られた結果から三量体の存在も推定
さ水る。更に成る種の条件下では別の集合体も存在する
かも知れない。本文中の１リンホトキシン＃なる用語は
、ペプチド単炉及び生物学的に活性の該即鎖集合体の双
方を包含する。

本文中の６ペグチド”及び１タン／やり”なる用語は互
換的に使用されておυ、いずれもアミノ酸重合体を意味
する。タンノダクが大きく一１！グチドが小さいという
従来のサイズによる区別は採用しなかった。理由は、両
者間の境界に関する定説が十分に確立していないためで
ある。

“アミノ酸残基”とは通常、タンノ４り中の２０種のコ
ードアミノ酸の１種から誘導された前記に定義の残基を
意味する。しかし乍ら該残基は、後述の如き誘導体を形
成すべく修飾され得る。

本文中の１塩＃なる用語は、イリペプチド鎖のカルブキ
シル基の塩及びポリー！！ゾチド鎖のアミノ基の酸付加
塩の双方を意味する。

カルブキシル基の塩はそれ自体公知の手段によシ無機又
は有機の塩基と共に形成され得る。無機塩は例えばナト
リウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛等の塩
を含む。有機塩基との塩は例えばアミン類例えばトリエ
タノールアミン、ア醒伺加塩は例えば、塩酸もしくは硫
酸の如き無ｔＦ、Ｊ　ｐｆｇとの塩又は酢酸もしくはシ
ュウ酸の如き有機酸との垣を含む。

′　残基上にＩＩ！ｌ鎖として生じる官能基又はＮ−も
しくはＣ−末端基から公知手段によシ誘導体を製造する
ことも可能であシこれらの誘導体は（後述の如く）薬剤
的に許容され得るものである限シ本発明に包含される。

これらの誘導体は例えば、カルがキシル基の脂肪族エス
テル頚、アンモニア又は第一もしくは紀ニアミン類との
反応によるカルブキシル基のアミド類、アシル基（例え
ばアルカノ諺１ｂｏｘｙｋ　ｔｏ−ｏ３１） イル基又はカルゼキシルアロイル基）と共に形成された
ぼりイプチドのアミノ基の誘導体たるＮ−アシル誘導体
、又は、アシル基と共に形成された、ヒドロキシル基の
誘導体（例えばセリル又はトレオニル残基の誘導体）た
る０−アシル誘導体を含むＯ 本発明に包含される塩及び誘導体の条件は１薬剤的に許
容され得る”ことである。即ち、リンホトキシンの活性
を破壊せず同時に該塩及び誘導体を含有する組成物を有
青性にしないことが必要である。

使用技術に関して多数の略号が使用されるであろうが、
これらはいずれも当秦者に公知である。

詳細には、”ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー”
は、クロマトグラフィーカラムに充填するためのイオン
交換担体としてジエチルアミノエチルセルロースを使用
したクロマトグラフィーを意味する。

高いｐＨ値のときカラムは陰イオン交換体であシマイナ
スの残基がカラムに付着する。ｐＨを下げるか又はより
好ましくはｐＨを一定にして塩勾配を用いることによっ
て溶出を達成し得る。

”　ｒ’ＡＧＥ”はポリアクリルアミドゲル上で行なわ
れる電気泳動であシタンパク又はベグチドを電荷に基い
て分離する。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ８）をグル
に添加すると（５ＤＳ−ＰＡＧＥ　）　、ＳＤＳの表面
活性の結果ペプチド又祉タンパク上にサイズの＋４＋ａ
数として均一な負電荷が得られる。その結果、分子サイ
ズに基いた分離が行なわれる。自然ＰＡＧＦ　（ｎａｔ
ｉｖｅ−Ｉ’ＡＧＥ　）は８０８を使用しないＰＡＧＥ
の使用を意味しておシこの場合タンパクは電荷に基いて
分離される。

″′等電点謂、気泳動”は、電極間でｐＨ勾配が維持さ
れ各タンノ臂りを等電点に停止即ち「フォーカス」せし
める自然ＰＡ（Ｊの形状で行なわれる。しかし乍ら他の
担体好ましくは例えばデキストラン、典型的にはウルト
ロデクス１．ｌ１ｔｒｏｄｅｘ−ＬＫＢも使用し得る。

更に本発明にとって特に重要な別のクロマトグラフィー
担体が使用される。レンズ豆から単離されたレクチンた
る”レンズ豆レクチン”は、ガラクトシ／Ｉ／残基とマ
ンノシル残基とを有する糖タンノ臂りを選択的に保持し
得る。糖溶液を与えて溶出が達成され得るがこの特定担
体の場合、溶液はガラクトース又はマンノースの溶液で
なければならない。

適当な条件下で好゛ましくけ微粒樹脂を収納した細孔（
ｎａｒｒｏｗ　ｂｏｒ・）カラムを使用し分離効率を良
くするために加圧下で処理して、即ち高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によってクロマトグラフプロセ
スを実施し得る。

濃縮及び塩除去は本発明で使用されるクロマトグラフ即
ち分離技術を確実にするための常用の予処理である。塩
除去は例えば透析もしくはグル濾過、又は比較的、發近
開発された技術たる調節多孔ガラス（ＣＰＧ）によって
行なわれ得る。

多数のグル濾過及び濃縮技術が使用され得る。

ある柚の市販材料が特に有用である。″ＩペリコンＰａ
１ｌｉｅｏｎ　”膜はミリポアに＃ｌ’１ｉｌｌｉｐａ
ｒｅ　Ｉｎｃ。

ペッドフォードにより製嘉されたポリスルホンから成る
シート状材料である。”アミコンＡｍ１ｃｏｎ”膜はア
ミコンＡｍ　ｉ　ｃ　ｏ　ｎによシ製造された同じくポ
リスルポンから成る同様の材料である。これらの材料は
小分子を透過し大分子を保持し得る。従って、大分子を
’Ｊ易に通過せしめるが小分子の通過を１５１１止する
モレキュラーシーブと逆の作用を行なう。ベリコン及び
アミコンはいずれも所望の巨大分子っｄ、Ｖ造から小分
子をｐ除”し得る濃縮手段として有用である。

クラマドグラフで処理するための溶液の濃縮の望ましい
程度は主として処理実施適性に従屈する。

イオン交換又は他の総イオン強度に依存する技術が使用
されるときは塩除去が必要である。これらの準備方法及
び特定の分離プロセスに於ける該準備の必要度は当業界
で十分に公知である。

本発明に於いてリンホトキシンのソースとして使用され
る細胞はリンパ球又はそのトランスホーマントである。

文献によればリンホトキシンは、鉱油銹導により転化さ
れた”パツフイコート白面球”の調節物、即ち、ゴール
デンノ・ムスター又はモルモットの腹膜白血球（１７）
並びにヒトリンパ球帰（ｌｙｍｐｈｏｌｄ　）細胞系Ｒ
ＰＭ１１７８８．Ｂ−２１及びＭＯＬＴ　（２５）の如
きリンノ臂芽球の調製物中に存在する。

１特異的活性”とは、サンプル中のタン／’Ｐり重重に
関スる標準リンホトキシンアッセイに於けるタンパクの
活性を意味する。公知の開示に説明さ［している如くリ
ンホトキシン活性は、後述のアッセイプロセスによって
目標、ｌ１ｌｌｆｆｌｄの５０チ溶解を生起するのに必
要なリンホトキシンの量を示す”ユニット”に換算して
測定される。いくつかの標準アッセイゾロセスの使用が
可能である。本文中に詳細に説明するアッセイプロセス
はマウス線維芽細胞の溶解を媒介する能力に゛基づく検
定であり該能力は染色能力として測定される。

付加的プロセスは、主重水素化チミジンで標識されたネ
ズミのアルファーＬ　−９２９−線維芽細胞、リンホト
キシン感受性細胞株（２６）からトリチウムを数、私さ
せる処理を含む。特異的活性を定義すべく使用される６
ユニツト”は、測定されるキシン・臂りと同じくアッセ
イプロセス次第で変化するかも知れない。本文中で定義
される″特異的活性”ｅまユニット／〜タンノやりであ
り、この場合１ユニツト”Ｆｉ後述のアッセイにより測
定されηタン／ぐり＋ｊブランドフォードＢｒａｄｆｏ
ｒｄの方法（後出）により測定される。

本発明方法により製造されたリンホトキシンに関する６
不純物”は、正常細胞環境中又は粗抽出物、濾過物もし
くは遠心物中でリンホトキシンに混雑した物質を意味す
る。

Ｂ、精！、！！グロセスの好ましい実施態様均質リンホ
トキシンの全製造プロセスが第１図に要約されており、
該プロセスの好ましい実施態様の１例を以下に説明する
。

（１）組織培養及び採取 ヒトリンノ臂芽球様（ｌｙ＋ｎｐｈｏｂｌａｓｔｏｌｄ
）細胞系ＲＰＭＩ　１７８８をＡＴＣＣ（罵ＣＣＬ　１
５６　）から入手し、アービン・サイエンティフィック
Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｌｅｎ−ｔｉｆｉｃ、サンタアナ、
カリフォルニアから得た４００ｍ１のＲＰＭＩ−１０４
０培地に於いて種（ｓｅｅｄ）カルチャーを増殖させた
。該培地をま１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳど５％の仔牛脂児
血清とを含んでおり、培地Ｌｍｌ当り６×１０４細胞／
　ｍｌの濃度で細胞が接種されていた。培地４００ｍ１
の増殖に２ｔのローラ、ｊ？）ルを使用した。３７℃で
５日間維持しカルチャーの細胞濃度が２　Ｘ　１０６／
ｆｈＪに到達したとき細胞を採取し血清を含まないＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。

次に、１０ｍＭのｕｇｐｇｓと１％のペニシリンースト
レグトマイシンとを含んでおＬａ清を含まないＲＰＭＩ
−１６４０培地に５　Ｘ　１０５細胞／ｍｌの濃度で細
胞を移植した。（該培地は血清を含まないので汚染タン
ｉ４り量が減少しリンホトキシンの精製を助ける）。４
００ｍ１の細胞懸濁液を２ｔのローラゲトル並びに各々
１５及び１０ｔのスピナーフラスコ（ベルコグラス社Ｂ
ｅ１ｅｏ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ、、グアインランド、　Ｎ
、Ｊ、　）に入れた。いくつかの例では該フラスコに代
えて２ｔのローラぎトルを使用した。

６５時間後、リンホトキシン活性を有する培地を採取し
た。

ローラｄｒトルとスピナーフラスコとの双方から７４）
た却Ｉ　Ｊｌｉｕ　Ｅｍ濁液全グールした。ポール・ト
リニティー’？イクロ社Ｐａ１ｌ　Ｔｒｌｎｌｔｙ　Ｍ
ｉｃｒｏ　Ｃｏｒｐ、　。

コートランド、ニューヨーク、製の３μＭのシールクリ
ーン’Ｓ”ａＡｌｌ（ｌｅ＠ｎフィルタに通して該ゾー
ルから細胞菌体を除去したく第１図のステツ７’ｌ）。

透明Ｐ液を更に以下の如く濃縮し透析した（ステップ２
）。

限界分子：１１．（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｓｌｌｈ七
ｃｕｔ−Ｏｆｆ）１０．０００のペリコンＰｅ１ｌｉｃ
ｏｎｌｌｕ　（ミリボア社Ｍｌ　１１１ｐｏｒｅ　Ｑｏ
ｍｐｎｎｙｌｊＪ　）で４℃にてｐ液を約２０倍に濃縮
した。濃縮サンゾルを更に、透析用に設定した同じにリ
コンを使用し、ｐＨ７，８の５ｍＭのリン酸塩バッファ
に対して透析した。サンプルの導電率が透析バッファの
導電率に達したとき４リコン膜をバッファで完全に洗浄
しタン・やり全部を回収した。

特異的活性を定量するために得られた濃縮物をステップ
３乃至６に従って処理しリンホトキシン活性を検定した
。

典型的なテストによれば第１図の需縮物（１）の特異的
活性はタンパクダ当！７２，０００−３，０００　ユニ
ットのオーダであることが知見された。分子サイズを測
定するためのセファクリル５ｅｐｈａａｒｙｌ　Ｓ　＝
３００カラムクロマトグラフィーは、約７０，０００ダ
ルトンに単一活性ピークを生じた。

（３）　　Ｉ）ＥＡ、ＩＤセルロースクロマトクラフィ
ー濃縮物（１）をＰＨ７，８の５　ｍＭのりン酸塩バッ
ファで平衡させたＤＢＡＥ−５２セルロースカラムヲ用
いるＤｇＡＥセルロースクロマトグラフィ〜で処理した
（ステップ３）。サングルの充填後カラムを平衡バッフ
ァで洗浄し次にＯ−０，３Ｍの直線塩化ナトリウム勾配
で溶出した。

前記に定義したような特異的活性を最も多く有する両分
を選択することによって活性両分を同定した・急峻な単
一活性ピークが第２図に示す如く約０．ＩＭのＮａ　Ｃ
Ｌで溶出した。典型的には第１図の活性画分中ｔまタン
／Ｊ？クダ当り２０，０００−３０．０００ユニツトの
オーダの特異的活性を有していた。これは１０倍の精製
に相当する。

次に限界分子量１０，０００（ＰＭ−１０）の膜を備え
たアミコンＡｍ１ｃｏｎ攪拌槽を使用して活性画分を濃
縮した（＠１図のステツｆ４）。

濃縮物（Ｕ）を２．５　ｍＭのトリスＴｒｉｇ及び２０
　ｍＭのグリシン％　ｐ　Ｈｓ、　２−に対して透析し
ｐＩ（５−８の範囲の両性電解質担体アンフォリンＡｍ
ｐｈｏｌｉｎｅを含むデキストラン平坦層（Ｕｌ　ｔｒ
ｏｄｅｘ−ＬＫＢ）に流した（ステップ５）。グレノ臂
うテイプ（調製用）等電点電気泳動に使用した基本装置
はＬＫＢ　（２１１７Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）の製品であ
った。ｐＨ勾配を形成する前にサンプルをグル層全体と
混合した。グル層の両側に電極片を配置し８Ｗの一定電
力を用い８℃で１５−２０時間に亘シグル層の長手方向
に沿った電気泳動を継続した。分割グリッドでダル層を
分割し各部分をス・９−チルで取出すことによって集束
シーｙ　（ｆｏｃｕ＠ｅｄ　ｚｏｎｅ）を収集した。５
０ｒｒ＋Ｍの炭酸水素°アンモニウムを使用するイ（Ｊ
数の小型使い捨てカラムに於いて各ダル部分からのタン
・ぐりのたｆ出を行なった。溶出画分について２８０ハ
ｍでの吸光度、リンホトキシン活性及びｐＨを測定した
。

第３図は、得られた活性、タン・譬り及びｐＨの変化曲
線（ｆロフイル）を示す。タンパク１１”ル層全体に拡
散しているが堪基性ｐＨ領戟に比較して酸性ｐＨ領賊に
よシ多くのタン・千り汚染物が観察される。リンホトキ
シン活性はｐＨ５，５乃芋６．５の範囲に拡散していた
。アンフォリンが存在するので活性両分のタン・４り濃
度の正確な定厨は離しく、従って、等電点帆気泳動ステ
ップで得られた精製の程度を算定することはできなかっ
た。しかし乍らこのステツブで得られた活性の回収はか
なシ定量的であった。

リンホトキシン活性を含む等雷１点屯気泳動溶出液のゾ
ールをｐｆ（７，８の１０ｍＭのリン酸塩バッファで平
衡させたレンズ豆レクチン（Ｐｈａｒｍａｅｊａ）カラ
ムで処理した（ステツ７０６）。ザングルの充１Ｍ後カ
ラムを平衡バッファで洗浄し次に１０ｍＭのた。得られ
た結果を第４図に示す。リンホトキシン活性が無いタン
パクの９５チより多くが最初にカラムで濾過され、カラ
ム平衡バッファ（１０ｍＭのリン酸塩バッファ、ｐｎ７
．８）で洗浄しても活性が溶出しなかった。カラムを５
　（１−１００ｍＭのアルファーメチルマンノシドにｔ
ｇ：　＝ｈさせると殆んどタンノやりをα１ない＾い活
性Ｉ４−りが溶出した。

このステツブで９０％より多い活ス゛［ユニットが回収
された。活性画分はｌＯ乃至１００　ミＩＪオンユニツ
Ｉ−／１１９のオーダの特異的活性を有していた。

レンズ豆しクチンカ２ムから溶出した活性画分を更に以
下の技術で分析し以下の如く特性を決定した。

（１）ｒルｆｐ過 ダル透過クロマトグラフィー・ｔま（１番５図に示す如
＜　）６４，０００ダルトンに単一ピークを示した。

レンズ豆レクチンカラムから得た活性画分を、ＮａＣＬ
　Ｏ，５Ｍを含有する１０ｍ１ＶＩのリン酸３漏”ソフ
ァを溶出溶媒として予め平衡させたセファデツクス５ａ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラム（ファルマシア・ファ
インＩＩケミカ／ｌ／　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌｇ　。

ビスキャタウエー、　Ｎ、Ｊ、）で処理した。溶出ノ９
ターンを牛血清アルプミｙ（ＢＳＡ）、卵アルブミン（
ＯＡ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）及びグイズトリゾシン阻
害剤（Ｓ’Ｉ’　Ｉ　）と比較した。６４．（！　ＯＯ
ダルトンの範囲のリンポトギシン（ＩｉＬ’ｒ）の溶出
は、以下の結果から明らかな如＜　ｌ＋、’Ｊ々のペプ
チドの集合を示す。

ＨＰＬＣクロマトグラフィーは第６図に示す如く実質的
に均質な調製物を示した。

レンズ豆しクチンカ２ムからの活性画分をＰＭ−１０膜
を使用したアミコン攪拌槽で濃縮し、シンクロツクツク
５ｙｎａｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−Ｐカラム（２５ｃＩＬＸ
４、１　ｍｓ、ジンクロム社Ｓｙｎｃｈｒｏｍ　Ｉｎｃ
、　、りンデン、インディアナ）にかけた。ス４クトラ
フイジクス５ｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｅ＠ＳＰ　８０
００高圧液体クロマトグラフィーを使用し２１０　ｎｍ
及び２８０　ｎｍの吸光度で流出液をモニタした。溶出
榮件としては２５１υで０．１％トリフルオロ酢酸から
７０１のア七ト二トリルを含む０．１％トリフルオロ酢
酸までの直線勾配及び１ｍ１１分の＋Ｈｆｌ速を使用し
た。

約５０チのア七トニトリルワ゛島度で溶出する主タン・
々り一一りが得られる（第６図）。更に１２．５チｓＤ
ｓ−ｐＡＧｇで処理すると、該両分は分子量２０，００
０のタンパクを含有している。■ＩＰ　Ｉ、Ｃのこの２
０にピーク以外に、４３％及び５１ｆｉのアセトニトリ
ルで溶出する各々分子ｉ　１．５　Ｋ及び７０にの副次
的ビークが存在していた。ｆ（ＰＬＯ溶媒はリンホトキ
シン分子を失活させると考えられるので２０，０００分
子１．１バンドの活性を定トｔすることはできなかった
。

Ｃ（）　　５ＤＲ−Ｐｈ（ンＥ Ｓｌ）Ｓ−ＰＡＧｇによればタンノ等りの大部分をま約
ｚｏ；ｏｏｏダルトンの推定サイズに適合していた（第
７図）。第８図に示す如くリンホトキシン活性はこの２
０，０００ダルトンの両分に対応していた。

レムリＬａｅｍｍｌ　１　等の方法（２７）により濃度
１２．５乃Ｗ１５％の分析用アクリルアミドグルを使用
してＳ　Ｏ８−ＰＡ（Ｊを実施した。該方法は引用によ
って本文中に包含される。

（４）　　自然ＰＡ、ＧＩＩＣ 自然ＰＡＧｇの場合にも、以後５Ｏ３−ＰＡＧＥによシ
定ｊＮすると約２０．ＯＯＯＭＷのピークが生じた。

レンズ豆レクチンカラムからの活性画分をレムリ１゛１
の自然ＰＡＧＦ’７’ロセス（２７）に少し変更を加え
たクロセスで処理した。（厚み１．５乃至４間の）調製
用グルと（厚み０．７５朋の）分析用グルとは、グル分
析用の７．５チのアクリルアミドとグル重層（スクッキ
ング）用の４俤のアクリルアミドとから構成された。双
方の場合に使用された流動バッファはｐＨ６，８の２５
　ｍＭのトリスであった。分析用グルｅま２２ｍ人の定
ｉｉ、流で処理され調製用ケ９ルｅよ定温度下で１００
ｍＡで処理された。

電気泳動テストの終了時に、引用によって本文中に包含
される銀染色（２８）でグル上のタン・９りを可視化し
ＲｆＯ，３３の拡散バンドをイ（）た。第９図はこれら
の結果をより詳細に説明する。この図では、ケ９ルをス
ライスしこれらのスライスを自然ＰＡＧＥからの５０　
ｍＭの炭酸アンモニウノ・バッファ中で４υに一晩維持
して酢出を行なうとリンホトキシン活性がＲｆｏ、３３
のグルスライスに対応するという別の実施によってタン
パクを定１片シた結果が示されている。該グルスライス
からの溶出液を５ＤＳ−ＰＡＧＦ；カラムで処理すると
、リンホトキシン活性を有する溶出液のみが２０，００
０−ＭＷの／４ンドを生じた。

（５）トリグシン消化及びペグチドの午離による分析 λｉｆ　４ｊｌｌされたリンホトキシン；ｐ、ｌｉＩ製
物をトリグシンＴＰＣＫ　（ウオーシントンＷｏｒｔｈ
ｉｎｇｔｏｎ）で消化した。即ち、ｐｕｓの５０ｍＭの
炭酸水温アンモニウムバッファ中で１部のトリフシンと
２０部のタンノ？りとを使用し室温で２４時間処哩した
。断片は約１５，０００及び５．（１００の分子月、を
有していた。

力■水分角了糸冬了１々、スペクトラ・フィックス５ｐ
ｅｃｔｒａ　ＰｈｙＩＩｉｃｓ　５Ｐ−８０００クロマ
トグラフを使用し２５℃のりクロソーブＬｌｃｈｒｏｓ
ｏｒｂ　ＩＬＰ−１８カラム（２５ｃｌＸＸ４．６ｍｍ
、ＥＭ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　、シンシブティ、オフ１イ
オ）でＩＩＰＬＣクロマトグラフにかけた。０．１チの
トリフルオロ酢酸から５０％のアセトニトリルを含む０
．１チのトリフルオロｌ￥１！酸までの直線勾配と７．
　ｍｌ　７分の流速とを用いた溶出後に２１　Ｏｒ＋ｍ
と２８１）　ｎｍとに於いてピークをイ・奢出した。・
（以後のアミノ酸配列解析のために各−一りを収集し凍
結乾；・■して一２０℃で保存した）。

第１０図に示す如く、アセ）　＝　１−リルＩ＾度４２
．３チ及び４８，４チに於いて夫々溶出する２つのピー
ク゛ｒ−１及びＴ−２が観察された。これらの２つのピ
ークの各りの分子サイズをＳ　ｌ）Ｓ　−ＰＡＧＥ　（
第１１１”／ｌ　）で定邦するとＴ−１では１５，１）
００、Ｔ−２では５，０００であった。２１０　ｎｍ及
び２８０　ｎｍのヌ方に於いてＭＷが小さいピークＴ−
２の方がピーク゛ｒ−１よりも高い吸光度を示した。

トリフシン加水分解の完了を１．Ｍ　認するために、加
水分解調製物の少星のサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥにか
け２０，０００ダルトン・々ンドが検出されず１５，０
００及び５，０００ダルトンのバンドに代替されたこと
を確認した。

更に、前記の如くトリグシン消化によって形成された白
質はリンホトキシン活性を示す。

（６）　　自動アミノ酸配列解析 トリグシンで処理しないインタクトな断片とトリノ°シ
ン消化断片との双方の配列を決定するために自動アミノ
酸配列決定技術を使用した。即ちサンプ９ル＾：　０．
　（ｉ　ｍｅの０．２Ｍ酢酸に懸濁させ、４ダの、ＪＰ
リブレンと１０００Ｍのノルロイシンを予め塗布してお
いたベックマンＢｅｃｋｍａｎ　８９０Ｃシーケア　サ
の）Ｊソデに懸濁液を移した。ダブリュ・コールＷ。

Ｔ（ｏｈｒ等（２９）に記載のプログラムに孕じて１ｒ
ｎｌ／９のｉ；：ＣＪｊでｉＵ　ｆｉｔ　７１％球（ｕ
ｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）ＯＤＳ（２５「ｘＸ４、６７’
１ｍ　、　５μＭ）カラムを使用しフェニルチオヒダネ
ーショ７（ｐｌｔｅｎｙｌ　ｔｈｉｏｈｙｄａｎａｔｌ
ｏｎ、ＰＴＨ）アミノ贋を同定した。核、ｏ　ｒ１グラ
ムは引用により本文中に包含される。

インタクトなタンＡ’りとトリグシン消化断片との双方
について得られた結果を＠１２図に示す。

第１２図の如く、配列中のいくつかの位１ｊ７を確実に
同定することはできなかった。しかし乍ら１５に断片（
Ｔ−１）がインタクトなリンホトキシンのＮ−末端部分
に対応することを示すための十分な同定が達成された。

前記の例は、本発明を限定するものではなく本発明を説
明するためのものである。出発肉質として別の紹１胞系
を使用すること及び等価のクロマトグラフ方法を使用す
ることはい１°れもｒｔＪ能である。

レンズ豆レクチンクロマトグラフィーの使用によって最
高度のｆｆｆ製が達成される七判断される。従って当該
ステツノをなんでさえいれば、準１禰ステツノはかなシ
任意に違択することができる。リンホトキシンの単離グ
ロセスに於いてレンズ豆レクチンｔよこれまで使用され
ていなかった。しかし乍ら、前記の如き一ロデロセスの
結果、実質的に純粋なタンノ愛り〃脣すられる。

Ｄ、　リンホトキシン活性の検定プロセススｊ？フォー
ド５ｐｏｆｆｏｒｄ（３０）の１ｌｌｌ胞溶解１７セイ
に変更を加えた方法を用い４１１　’Ｍ中のリンホトキ
シン活性をモニタした。該アッセイは引用によって本文
中に包含される。要約すればマイトマイシンＣを存在さ
せたマイクロタイターグレートでマレスＩ、−９２９線
維芽細胞を増殖させた。１２−１８時間後に、順次希釈
したリンホトキシン検定用ザンデル０．１２５ｍ／を各
ウェルに添加した。４８時間後、プレートを洗浄し、リ
ンホトキシンにより誘発された細Ｉ］ｆｉの溶解をグレ
ートに付着し７だ細胞として検出するために、１チのク
リスタルバイメレントを含むメタノール：水溶液（容量
化ｌ：４）でプレートを染色し、た。染色の濃さを肉眼
及び分光１１１１九により観察した。後者を・Ｊｌ　ダ
イナテンク１）ｙｎａｔａｃｈスイクトロホトメータを
１吏用し７４５０ｎｍ及びＳ　７　Ｏｎ＋ｎ透過の吸光
度にて行なわれた。

培Ｊｌ！１．のみを含むマイクロタイターウェルに塗抹
された細胞を溶解Ｏチに膜室し、３　Ｍの１稿酸ダアニ
ジン溶液が含まれた場合を溶解１００％の終点としｌζ
。各ウェルに塗抹された１２，０００の細胞の５０ｔｓ
を溶解させるに必要なリンホトキシンのｐを１ユニント
と定義する。

Ｅ、　タン／９りの定量 ｆｆ　ＪＭ　中のタンパク濃度をブランドフォードＢｒ
ａｄｆｏｒｄ（３１）の方法によって測定した。該方法
は引用によって本文中に包含される。要約すれば０．８
　ｍｌの被検定ザングルを旧ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ　。

リッチモンド、カリフォルニアの試薬濃縮溶液０、２　
ｍｌと混合した。パーギンエルマーＰｅｒｋｉｎｇ１ｍ
ｏｒスペクトロホトメータＭｏｄ＠１５５Ｂを使用し反
応混合物を５９５　ｎｍで測定した。該アッセイは牛血
清アルブミン２−２０μｇの間で直線状であった。更に
最終精製段階中には、２８０　ｎｍ及び２０６　ｎｍに
於ける吸光度から又ＱまＳＤＳ　−、ｆ？リアクリルア
ミドｒグル銀染色からタン／やりのおよその推定量を得
た。該推定量は最終的罠タン・臂り配列決定サイクルの
各々に於いて現われた種々のアミノ酸残基のナノモルに
よって確認された。

Ｆ、効用及び用量用法 リンホトキシン又はその塩又はその誘導体又はその活性
成分は、抗腫高活性を示す薬剤に許容されたいかなる用
法で投与されてもよい。これらの用法として経口膜力、
非経口投与もしくは局所投与及びその他の全身性用法が
ある。局所注射又は静脈注射がＩＱ−ましい。活性成分
は例えば活性であることが判明しているリンホトキシン
のトリグシン消化物をも含む。このような消化物がこの
種のこの目的の薬剤組成物の活性成分として使用できな
い理由は存在しない。

所望の用法次第で組成物は固体、半固体又は液体の削形
、例えば錠剤、丸剤、カブセル削、散薬、液典、懸霞液
等の形状で使用され得る。好ましくは毎回正確な用量を
投与ヂるのに適した単位用量の削形で使用され得る。組
成物は従来の薬剤担体又は賦形剤とリンホトキシン又は
薬剤的に許容されイ（するその塩もしくは誘導体とを含
有しておシ更に別の詰物、薬剤、担体、アゾユパント等
を含有し得る。前ＩＣの如き賦形剤は、別のタン・々り
例えばヒト血清アルブミン又は血漿製剤を含み得る。

活性化合物の投与景は勿論、治療される患者、病状の程
度、投与方式及び担当医師の判断等に左右されるであろ
う。しかし乍ら有効用量は０．００７乃￥７　ｎｇ／ｋ
ｇ１日の範囲であり、好ましくは０．０７乃至０．７　
ｎｇ／ｋｆｌ／日である。

同体組成物用の従来の無毒性固体担体としては例えば、
薬剤グレードのマンニトール、乳糖デンプン又はステア
リン酸マグネシウムがある。薬剤として投与可能な液体
組成物は、例えば、前記の如きリンホトキシンと任意の
薬剤アジュ・々ントとを例えば水、生理食塩水、水性デ
ギストロース、グリセロール、エタノール等の如き担体
に例えば溶解又は分散させ溶液又Ｉｒｉ懸ｆｆＪ液を得
ることによってｖ４製され得る。投与される薬ｉＩＩわ
］酸物は所望に応じて更に、少曖の無毒性補助物質例え
ば湿憫削、乳化””Ｌ　　ｐｌｉ緩衝剤等、例えば酢酸
ナトリウム又はモノラウリン酸ンルビタンを含有し得る
。前記の如き削形の実際の調製方法は、例えばレミント
ンツク・パブリッシング１カンノぐニーＭａｃｋ　Ｐｕ
ｂｌｉ−８１１管１ｇ　Ｃｏｍｐａｎｙｓ　　イースト
ン、ペンシルヴアニア、１５版、１９７５年、の参照に
より当業者に公知又は明白であろう。いずれにしても、
投与される。３１１成物即ち配合物は、治療される患者
の症状を軽減すべく有効ｈ÷のリンホトキシンを含有す
るであろう。

Ｇ、参考文献 添付の又献目録及び本文中の参考文献は、本発明の叩解
を助けるために引用されたものである。

従って引用事項は本文中に包含される。

文市に目録 １、　　Ｆ２ｖａｎｓ、Ｃａｎｃｅｒ　ｌｎｕｎｕｎｏ
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ｇ　ｔｈｅ　　ｇｋｌｎ、”　Ｉｎ　Ｍ、Ａ、Ｆｉｎｋ
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ｄ　Ｏｎｅｏｌｏｇｙ　１１，１９Ａ（１９８１）２１
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Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１１３：１３３４（１９７４） ２２、　　Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｓ、Ｗ、、ｅｔ　ａｌ、　
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

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Ｒｌｏｌｏｇｌｅａｌｌｙａｃｔｉｖｅ　　５ｙｒｉａ
ｎ　　ｈａｍｓｔｅｒ　　Ｊｙｍｐｈｏｔｏｘｌｎｌｓ
ｏｌａｔｅｄ　　ｉｎ　ｈｌｇｈ　ｙｉｅｌｄ　ｏｎ　
ａ　ＷａｔｅｒｓＩ−１２５Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＨＰＬＣ
ｃｏｌｕｍｎ、”（１９８２）Ｉｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｌｏｎａｌ　ｓｙｍｐｔｏｎｓ　ｏｎ　ＨＰＬＣｏｆＰ
ｒｏｔｅｉｎｓ　　ａｎｄ　　ｐｅｐｔｌｄｅｓ　　ｈ
ｅｌｄ　　ＩｎＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，−Ｎｏ
ｖｅｍｂｅｒ　１６−１７ｔｈ、１９８１２４、　　Ｋ
ｌｏｓｔｅｒｇａａｒｄ、Ｊ、、ａｔ　ａｌ、　Ｍｏ１
．Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１７：６１３（１９８１）） ２５、　　Ｌｉ５ａｆｅｌｄ、、ｅｔ　　ａｌ、Ｉｎｔ
、Ａｒｃｈｓ、Ａｌｌｅｒｇｙ２６、　　　Ｔ（ｅｆｆ
ａｎ、ｅｔ　　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４：６４（１９７５） ２７、　　Ｌａｅｍｒｎ目Ｕ、に、　、ｅｔ　ｉｆ　、
　Ｎａｔｕｒｅ　。

２２７：６８０（１９７０） ２Ｂ、　　Ｍｏｒｒｉｌ、　Ｃ，Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　
Ａｎａｌ旧ｏｅｈｅｍ。

１１０：２（１１（１９８１） ２９、　　　ｒ（ｏｂｒ、Ｗ、、ｅｔ　　ａｌ、Ａｎａ
ｌ　　Ｂｉｏｅｈ＠ｍ（ｉｎ　　ｐｒｅｓｓ） ３０、　　５ｐｏｆｆｏｒｄ、１１．、ｅｔ　　Ｆｉｌ
、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１１２：２１１１（１９７４〕 ３１、　　　ｎｒａｄｆｏｒｄ、Ｎ、Ｍ、、ａｔ　　Ｒ
１，Ａ、ｎａｌ　　Ｂｒｏｃｈｅｍ。

７２：２４８（１９７Ｇ）

【図面の簡単な説明】

２１Ｎ１図は本発明に従って行なわれるリンホトヤシン
ＪＴｌ利の好ましい具体例のイ；χ略説明図、第２図Ｆ
ｉＯ−０，３Ｍ　ＮａＣｔ勾配を使用したＤＥ人Ｅセル
ロース（ＤＥ−５２）精製ステツブで得られた溶出ノ９
ターンの説明図であり、活性が約０．１Ｍで溶出し多量
のタンパクは保持されていることを示す図、第３図は典
型的ＦＡ製物に於いて得られた等電点電気泳動・臂ター
ン図、 Ｒ４゛図はレンズ豆しクチン精Ｊｌ、＋４ステソゲで得
られた溶出・でターン図であり、リンホトキシン溶出以
前にリンホトキシン活性を持たない全タン・臂りの９６
係より多くがカラムにより濾過されることを示す図、 第５図は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１（１０からのリンホ
トキシン活性生の溶出グロフィルを示−）図であり、挿
入図は分子型既知のタンノククたるｊイス゛トリプシン
阻害剤と炭酸脱水酵素と卵白アルブミンと牛血清アルブ
ミンとを使用した較正曲線を示しておシ、最大サイズの
決定にはプループヤス１ランが使用された図、 第６図は、レンズ豆レークチンカラムから得られた’ｌ
’ｌ’ｆ　ＩＩＪ　ＩＪンポトキシン画分の分析に使用
されたＩＩＰＬＣの結果を示す図、 第７図は５Ｊ）Ｓ−ＰＡＧＥにより決定されたレンズ豆
レクチン活性画分のサイズ分布の図であり、第５図のグ
ルｆｉ過ステッグから得た２０に画分を用いた４５１孕
も含まれている図、 Ｐ■８図は第７図の８ＤＳ−ＰＡＧＥからのリンホトギ
シン活性の溶出プロフィルであり上部画面は第７図のカ
ラムＣのケ９ルを使用した結果を示しており、下部画面
はバッファのみを使用した対照（ｆｆｉ７図のカラムＫ
　）を示しておりグイフロント（ｄｙｅｆｒｏｎｔ）に
対応するアーチファクトであると考えより？＜）らシま
たｌｔｆ　Ｏ，３３画分の活性定量及び５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる分析を示す図であり、宇Ｑ、ｔｒｉａｔａ精製
リンホトキシンの自然ＰＡＧＥ処理後のグルスライスの
オｙジン方示しれており、＄Ｑ４ｒｒｓｎスライスの活
性、俸ｑ・ｈｏｅスライスのサイズ之示しれた図、第１
０図は、均質リンホトキシンのトリプシン消化物のＨＰ
ＬＣ溶出パターン図、 第１１図は、第１０図の両分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分子量
分析を示す図、 ）も１２図は、精製リンホトキシンのトリプシン消化物
から得た断片のアミノ酸配列決定の結果を示すヒドリン
ホトキシンの部分的アミノ酸配列の図である。 代理人ｔＦＩＪ士今　　村　　　元 Ｆｉｇ、８　　　　　リゝルスラ丁ス沓号Ａｌａ　　−
Ｔｈｒ　　−Ｓｅｒ　　−Ｓｅｒ　　−−Ｇｌｕ　　−
Ｖａｌ　　−Ｇｌｎ　　−Ｌｅｕ　　−５ −Ｐｈｅ　　−Ｘ　　−Ｖａｌ　−Ｘ　−Ｘ　　−−Ｉ
ｌｅ　−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　−Ｐｒｏ　−−Ｌｅｕ　−
Ｔｒｐ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　
−（Ｓｅｒ）　　−Ｇｌｙ５ −　　Ｖａｌ　　−Ｌｅｕ　　−Ｘ　　−Ｘ　　−Ｘ　
　−（Ａｓｎ）　　（Ｖａｌ） Ｐｈｅ　−Ｃｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ　−Ｔｙｒ　−
Ｐｒｏ　−Ｆｉｇ、１２ 手続？ｆｆ１．：ｉｌ三書（方式） 昭和５８年１２月１６０ １、事件の表示　　　昭和５８り「特許願第１３６６８
１号２、発明の名称　　　ヒトリンホ１−キシン３、補
正をする者 事ｆ１との関係　　特許出願人 名　称　　　　ジ１ネンテツク・インコーホレイテッド
４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ビル５、補正指令の日付　　　昭和５８年１１
月８日（１１添付図面中、第９ａ図を別紙の通多補正し
、ｒｉＱｂ図」及びｒ第９ａ図」を別紙のとおシ、一つ
の図面に表わし、「第９ｂ図」と補出願と同時に上申書
を提出してお＃）ます。 （２）明Ｉｆ４ＪＪ書図面の簡単な説明の欄中第４３頁
下から第４行目乃至第４４頁上から第２行目までを次の
とおシ補正する。 「第９ａ図及び第９ｂ図は、精製リンホトキシンの自然
ＰＡＧＥによυ得られたＲｆｏ、３３画分の活性定量及
び５Ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥによる分析を示す図であシ、第９
ａ図は、￥７を製リンホトキシンの自然ＰＡＧＥ処理後
のゲルスライスの活性を示す図であシ、第９ｂ図上段は
スライスのサイズを示しておフ、第９ｂ図下段はオリジ
ンを示している図、」と補正する。 ＋　　２３４５６７８ ９　１ｏ　　ｕ１分−１１

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１） （、）　　リンホトキシンを産生ずるセルカルチャーか
   ら抽出物、上清又はＦ液を生成し、 （ｂ）　　前記抽出物、上清又はｐ液をレンズ豆レクチ
   ン吸収剤で処理し、 （ｃ）　　吸収剤からリンホトキシンを選択的に溶出さ
   せるステップを含むヒドリンホトキシンの製法へ
2. （２）ステップ（ｂ）以前に付加的等電点電気泳動ステ
   ップが含まれる特許請求の範囲＠１項に記載の方法。
3. （３）ステップ（ｂ）以前に付加的ＤＥＡＥ−セルロー
   スクロマトグラフイーステッグが含まれる特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。
4. （４）等電点電気泳動ステップ以前又は以後に付加的Ｄ
   ＥＡＥ−セルロースクロマトグラフイーステツゾが含ま
   れる特許請求の範囲第２項に記載の方法０
5. （５）セルカルチャーがヒトリンパ芽球様細胞系のセル
   カルチャーである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
6. （６）細胞系がＲＰＭ１１７８８である特許請求の範囲
   第５項に記載の方法。
7. （７）セルカルチャーが血清を含まない培地に於いて増
   殖される特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
   記載の方法。
8. （８） （、）　　リンホトキシンを産生ずるセルカルチャーか
   らの抽出物、上清又はろ液を濃縮し濃縮物を透析して透
   析物を生成し、 （ｂ）透析物ヲＤｇＡＥ−セルロースクロマトグラフィ
   ー処理し、 （Ｃ）　　ステップ（ｂ）で得られたリンホトキシン含
   有画分を＠線処理し、 （ｄ）ステップ（Ｃ）で得られた濃縮物を等電点電気泳
   動処理してリンホトキシン含有画分を生成し、（、）　
   　ステップ（ｄ）で得られたリンホトキシン含有画分を
   レンズ豆レクチンクロマトグラフィー処理し、 （ｆｌ　　ステップ（ｅ）からリンホトキシンを回収す
   るステップを含むリンホトキシンの製法。
9. （９）セルカルチャーがヒトリンパ芽球様細胞系のセル
   カルチャーである特許請求の範囲第８項に記載の方法〇 （Ｉｎ　　ａｌｌ胞系がＲＰＭＩ　１７８８である特許
   請求の範囲２ｒ９９項に記載の方法。 （ロ）　セルカルチャーが血清を含まない培地中で増殖
   される特許ｉｖ＃求の範囲第８項に記載の方法。 θ→　ステップ（ｂ）に於ける攬析がベリコンを使用し
   て行なわれる特許請求の範囲第８項乃至第１１項のいず
   れかに記載の方法。 α→　ステップ（ｆ）に於いてリンホトキシンがマンノ
   ース又はガラクＦ−ス含有溶液を用いる選択的溶出によ
   シ得られる特許請求の範囲第８項乃至第１１項のいずれ
   かにｊ１己載の方γＬ０ａ→　実質的に不純物を含まな
   いヒドリンホトキシン並びにその塩及び誘導体。 θ９１０　Ｘ　１０’ユニツト／■より大きい特異活性
   を有するヒドリンホトキシン並びにその塩及び該導体。 α＊　　１００　Ｘ　１０’ユニット／ｍｙより大きい
   特異活性を有するヒドリンホトキシン並びにその塩及び
   誘導体。 ａカ　　標準リンホトキシンアッセイに於いて活性であ
   り本文中に記載の如〈実施されたＨＰＬＣＫｌｌして実
   質的に均質であるタンノヤク並びにその塩及び誘導体。 ０榎　標準リンホトキシンアッセイに於いて活性であシ
   本文中に記載の如〈実施されたＳＤＳ　−ＰＡＧＥに関
   して実質的に均質であるタンパク並びにその塩及び誘導
   体。 但夛　特ｉ’ｌ′ｌ’　ｉｉｉν求の範囲第１４項乃至
   第１８項のいずれかに記載のタンノ々りのトリプシン消
   化物を含む物ＩＪす。 倣−薬剤的に許容され得る賦形剤と共に特許請求の範囲
   第１４項乃至第１９項のいずれかに記載の化合物又は薬
   剤的に許容され得るその塩もしくは誘導体を治療に有効
   な量で含むヒトの腫穐治療に有用な薬剤組成物。 （ハ）　要治療思者に対し特許請求の範囲ｗ、１４項乃
   至第１９項のいずれかに記載の化合物又は薬剤的に許容
   され得るその塩もしくは誘導体を治療的に有効な鼠、で
   投与するかあるいは治療的に有効な量を含有する薬剤組
   成物として投与するヒト１珀熾の治療方法０