JPS5984827A - ヒトリンホトキシン - Google Patents
ヒトリンホトキシンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、最初吠リン・ダ球から不純形で抽出され抗n
a活性を有すると考えられている1種のタンノ臂りたる
リンホカインに係る。より鮮細には本発明はヒトリンホ
カインの均質調製物たるリンホトキシン及びその製法に
係る。
a活性を有すると考えられている1種のタンノ臂りたる
リンホカインに係る。より鮮細には本発明はヒトリンホ
カインの均質調製物たるリンホトキシン及びその製法に
係る。
リンホカインは、刺激リンパ球から産生される生物学的
に活性のホルモン楳イプチド又はタンノヤクである。こ
のようなリンホカインの特性及び機能については細胞傷
害活性を示すJ特性及び機能をも含めて種々に研究され
てきた。リンホトキシンは、マイトジェン又は抗原によ
シ刺激されたリン/4’球から産生されるのみでなく該
リンパ球由来の組織カルチャー(組織培養)中で増殖す
る細胞系(セルライン)からも産生される1種のリンホ
カインである。
に活性のホルモン楳イプチド又はタンノヤクである。こ
のようなリンホカインの特性及び機能については細胞傷
害活性を示すJ特性及び機能をも含めて種々に研究され
てきた。リンホトキシンは、マイトジェン又は抗原によ
シ刺激されたリン/4’球から産生されるのみでなく該
リンパ球由来の組織カルチャー(組織培養)中で増殖す
る細胞系(セルライン)からも産生される1種のリンホ
カインである。
リンホトキシンは免疫系の調節に開力しており(1)、
腫売細胞の増殖をin viVo(2−7)及びIn
vltho(8−10)の双方に於いて抑制すると報告
されている。in vltro条件では同一種から得ら
れた細胞に対し正常細胞よシも+pt4細胞をより強力
に抑制する(11−15)。また、リンホトキシンIi
+、′SR物はUV又は化学的発陥物質によシ誘発され
る細胞形質転換を抑制することが判明した(16−17
)。リンホトキシンのln vitr。
腫売細胞の増殖をin viVo(2−7)及びIn
vltho(8−10)の双方に於いて抑制すると報告
されている。in vltro条件では同一種から得ら
れた細胞に対し正常細胞よシも+pt4細胞をより強力
に抑制する(11−15)。また、リンホトキシンIi
+、′SR物はUV又は化学的発陥物質によシ誘発され
る細胞形質転換を抑制することが判明した(16−17
)。リンホトキシンのln vitr。
活性は後述する如き多数の方法により検定され得る。こ
れらの方法を適宜利用して粗抽出物からリンホトキシン
をffI製する方法を探求し得る。人間に於けるin
vivoテストでも粗リンホトキシン調製物が11弔捲
減縮に有効であることが知見された(5,7)。
れらの方法を適宜利用して粗抽出物からリンホトキシン
をffI製する方法を探求し得る。人間に於けるin
vivoテストでも粗リンホトキシン調製物が11弔捲
減縮に有効であることが知見された(5,7)。
従来の研究では、リンAI球又はリンパ球由来の細胞系
から調製された比較的不純な細胞上清の両分が使用され
ていた。多数の研究所が精製形のリンホトキシンの製造
に着手したが顕著な成功は得られなかった(18−24
)。本発明によって初めて都乳類の抗種偽剤として有用
なヒトリンホトキシンタンノ臂りの均質調製物が提供さ
れる。
から調製された比較的不純な細胞上清の両分が使用され
ていた。多数の研究所が精製形のリンホトキシンの製造
に着手したが顕著な成功は得られなかった(18−24
)。本発明によって初めて都乳類の抗種偽剤として有用
なヒトリンホトキシンタンノ臂りの均質調製物が提供さ
れる。
1つの角度から見た本発明の目的は、ヒドリンホトキシ
ン自体並びにリンホトキシンの天然及び天然に等しい薬
剤的に許容し得る塩及び薬剤的に許容し得る誘導体を実
質的に均質な形状で提供することである。均質性なる用
語は、従来の定義で使用されておりヒト由来の他のタン
/’Pりが実質的に存在しないという意味をも含む。更
にN−未1鮪のアミノ酸配列によってヒドリンホトキシ
ンの特性決定が行なわれる。
ン自体並びにリンホトキシンの天然及び天然に等しい薬
剤的に許容し得る塩及び薬剤的に許容し得る誘導体を実
質的に均質な形状で提供することである。均質性なる用
語は、従来の定義で使用されておりヒト由来の他のタン
/’Pりが実質的に存在しないという意味をも含む。更
にN−未1鮪のアミノ酸配列によってヒドリンホトキシ
ンの特性決定が行なわれる。
本発明は更に、前記リンホトキシンを含有する薬剤組成
物及び該薬剤組成物を抗腫痙剤として投与するために使
用する方法に係る。
物及び該薬剤組成物を抗腫痙剤として投与するために使
用する方法に係る。
別の角度から見た本発明の目的は均質なヒドリンホトキ
シンの製法を提供することである。
シンの製法を提供することである。
A 定義及び略号
リンホトキシン中のアミノ酸の配列は、標準IUPAC
によるアミノ酸1残基”″を示す3文字略号によって示
される。′残基”はアミノ酸配列内での機能的意味を有
する。配列の本体部では残基及びその略号は1つのN−
水素及びカル〆キシルの一01iが除去されたアミノ酸
を示す。末端位置では残基i、J:適尚な水素又は水酸
基を含むと理解される。Vlつて、Al a 1−Al
a 2−Al a s fxる配列に於いてCI(5 l13 を示す。
によるアミノ酸1残基”″を示す3文字略号によって示
される。′残基”はアミノ酸配列内での機能的意味を有
する。配列の本体部では残基及びその略号は1つのN−
水素及びカル〆キシルの一01iが除去されたアミノ酸
を示す。末端位置では残基i、J:適尚な水素又は水酸
基を含むと理解される。Vlつて、Al a 1−Al
a 2−Al a s fxる配列に於いてCI(5 l13 を示す。
本文中のキラルなアミノ酸残基は全て、特に注釈が無け
れば天然配置又社り形装置である。
れば天然配置又社り形装置である。
ペグチド配列は全て従来通り左側にN−末端、右側にC
−末端を有するように示される。
−末端を有するように示される。
1リンホトキシ7#は単離ペプチド配列の形状又は複数
個の該にプチド鎖の集合体として存在し得ると考えられ
る。本発明により得られた結果から三量体の存在も推定
さ水る。更に成る種の条件下では別の集合体も存在する
かも知れない。本文中の1リンホトキシン#なる用語は
、ペプチド単炉及び生物学的に活性の該即鎖集合体の双
方を包含する。
個の該にプチド鎖の集合体として存在し得ると考えられ
る。本発明により得られた結果から三量体の存在も推定
さ水る。更に成る種の条件下では別の集合体も存在する
かも知れない。本文中の1リンホトキシン#なる用語は
、ペプチド単炉及び生物学的に活性の該即鎖集合体の双
方を包含する。
本文中の6ペグチド”及び1タン/やり”なる用語は互
換的に使用されておυ、いずれもアミノ酸重合体を意味
する。タンノダクが大きく一1!グチドが小さいという
従来のサイズによる区別は採用しなかった。理由は、両
者間の境界に関する定説が十分に確立していないためで
ある。
換的に使用されておυ、いずれもアミノ酸重合体を意味
する。タンノダクが大きく一1!グチドが小さいという
従来のサイズによる区別は採用しなかった。理由は、両
者間の境界に関する定説が十分に確立していないためで
ある。
“アミノ酸残基”とは通常、タンノ4り中の20種のコ
ードアミノ酸の1種から誘導された前記に定義の残基を
意味する。しかし乍ら該残基は、後述の如き誘導体を形
成すべく修飾され得る。
ードアミノ酸の1種から誘導された前記に定義の残基を
意味する。しかし乍ら該残基は、後述の如き誘導体を形
成すべく修飾され得る。
本文中の1塩#なる用語は、イリペプチド鎖のカルブキ
シル基の塩及びポリー!!ゾチド鎖のアミノ基の酸付加
塩の双方を意味する。
シル基の塩及びポリー!!ゾチド鎖のアミノ基の酸付加
塩の双方を意味する。
カルブキシル基の塩はそれ自体公知の手段によシ無機又
は有機の塩基と共に形成され得る。無機塩は例えばナト
リウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛等の塩
を含む。有機塩基との塩は例えばアミン類例えばトリエ
タノールアミン、ア醒伺加塩は例えば、塩酸もしくは硫
酸の如き無tF、J pfgとの塩又は酢酸もしくはシ
ュウ酸の如き有機酸との垣を含む。
は有機の塩基と共に形成され得る。無機塩は例えばナト
リウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛等の塩
を含む。有機塩基との塩は例えばアミン類例えばトリエ
タノールアミン、ア醒伺加塩は例えば、塩酸もしくは硫
酸の如き無tF、J pfgとの塩又は酢酸もしくはシ
ュウ酸の如き有機酸との垣を含む。
′ 残基上にII!l鎖として生じる官能基又はN−も
しくはC−末端基から公知手段によシ誘導体を製造する
ことも可能であシこれらの誘導体は(後述の如く)薬剤
的に許容され得るものである限シ本発明に包含される。
しくはC−末端基から公知手段によシ誘導体を製造する
ことも可能であシこれらの誘導体は(後述の如く)薬剤
的に許容され得るものである限シ本発明に包含される。
これらの誘導体は例えば、カルがキシル基の脂肪族エス
テル頚、アンモニア又は第一もしくは紀ニアミン類との
反応によるカルブキシル基のアミド類、アシル基(例え
ばアルカノ諺1boxyk to−o31) イル基又はカルゼキシルアロイル基)と共に形成された
ぼりイプチドのアミノ基の誘導体たるN−アシル誘導体
、又は、アシル基と共に形成された、ヒドロキシル基の
誘導体(例えばセリル又はトレオニル残基の誘導体)た
る0−アシル誘導体を含むO 本発明に包含される塩及び誘導体の条件は1薬剤的に許
容され得る”ことである。即ち、リンホトキシンの活性
を破壊せず同時に該塩及び誘導体を含有する組成物を有
青性にしないことが必要である。
テル頚、アンモニア又は第一もしくは紀ニアミン類との
反応によるカルブキシル基のアミド類、アシル基(例え
ばアルカノ諺1boxyk to−o31) イル基又はカルゼキシルアロイル基)と共に形成された
ぼりイプチドのアミノ基の誘導体たるN−アシル誘導体
、又は、アシル基と共に形成された、ヒドロキシル基の
誘導体(例えばセリル又はトレオニル残基の誘導体)た
る0−アシル誘導体を含むO 本発明に包含される塩及び誘導体の条件は1薬剤的に許
容され得る”ことである。即ち、リンホトキシンの活性
を破壊せず同時に該塩及び誘導体を含有する組成物を有
青性にしないことが必要である。
使用技術に関して多数の略号が使用されるであろうが、
これらはいずれも当秦者に公知である。
これらはいずれも当秦者に公知である。
詳細には、”DEAEセルロースクロマトグラフィー”
は、クロマトグラフィーカラムに充填するためのイオン
交換担体としてジエチルアミノエチルセルロースを使用
したクロマトグラフィーを意味する。
は、クロマトグラフィーカラムに充填するためのイオン
交換担体としてジエチルアミノエチルセルロースを使用
したクロマトグラフィーを意味する。
高いpH値のときカラムは陰イオン交換体であシマイナ
スの残基がカラムに付着する。pHを下げるか又はより
好ましくはpHを一定にして塩勾配を用いることによっ
て溶出を達成し得る。
スの残基がカラムに付着する。pHを下げるか又はより
好ましくはpHを一定にして塩勾配を用いることによっ
て溶出を達成し得る。
” r’AGE”はポリアクリルアミドゲル上で行なわ
れる電気泳動であシタンパク又はベグチドを電荷に基い
て分離する。ドデシル硫酸ナトリウム(SO8)をグル
に添加すると(5DS−PAGE ) 、SDSの表面
活性の結果ペプチド又祉タンパク上にサイズの+4+a
数として均一な負電荷が得られる。その結果、分子サイ
ズに基いた分離が行なわれる。自然PAGF (nat
ive−I’AGE )は808を使用しないPAGE
の使用を意味しておシこの場合タンパクは電荷に基いて
分離される。
れる電気泳動であシタンパク又はベグチドを電荷に基い
て分離する。ドデシル硫酸ナトリウム(SO8)をグル
に添加すると(5DS−PAGE ) 、SDSの表面
活性の結果ペプチド又祉タンパク上にサイズの+4+a
数として均一な負電荷が得られる。その結果、分子サイ
ズに基いた分離が行なわれる。自然PAGF (nat
ive−I’AGE )は808を使用しないPAGE
の使用を意味しておシこの場合タンパクは電荷に基いて
分離される。
″′等電点謂、気泳動”は、電極間でpH勾配が維持さ
れ各タンノ臂りを等電点に停止即ち「フォーカス」せし
める自然PA(Jの形状で行なわれる。しかし乍ら他の
担体好ましくは例えばデキストラン、典型的にはウルト
ロデクス1.l1trodex−LKBも使用し得る。
れ各タンノ臂りを等電点に停止即ち「フォーカス」せし
める自然PA(Jの形状で行なわれる。しかし乍ら他の
担体好ましくは例えばデキストラン、典型的にはウルト
ロデクス1.l1trodex−LKBも使用し得る。
更に本発明にとって特に重要な別のクロマトグラフィー
担体が使用される。レンズ豆から単離されたレクチンた
る”レンズ豆レクチン”は、ガラクトシ/I/残基とマ
ンノシル残基とを有する糖タンノ臂りを選択的に保持し
得る。糖溶液を与えて溶出が達成され得るがこの特定担
体の場合、溶液はガラクトース又はマンノースの溶液で
なければならない。
担体が使用される。レンズ豆から単離されたレクチンた
る”レンズ豆レクチン”は、ガラクトシ/I/残基とマ
ンノシル残基とを有する糖タンノ臂りを選択的に保持し
得る。糖溶液を与えて溶出が達成され得るがこの特定担
体の場合、溶液はガラクトース又はマンノースの溶液で
なければならない。
適当な条件下で好゛ましくけ微粒樹脂を収納した細孔(
narrow bor・)カラムを使用し分離効率を良
くするために加圧下で処理して、即ち高圧液体クロマト
グラフィー(HPLC)によってクロマトグラフプロセ
スを実施し得る。
narrow bor・)カラムを使用し分離効率を良
くするために加圧下で処理して、即ち高圧液体クロマト
グラフィー(HPLC)によってクロマトグラフプロセ
スを実施し得る。
濃縮及び塩除去は本発明で使用されるクロマトグラフ即
ち分離技術を確実にするための常用の予処理である。塩
除去は例えば透析もしくはグル濾過、又は比較的、發近
開発された技術たる調節多孔ガラス(CPG)によって
行なわれ得る。
ち分離技術を確実にするための常用の予処理である。塩
除去は例えば透析もしくはグル濾過、又は比較的、發近
開発された技術たる調節多孔ガラス(CPG)によって
行なわれ得る。
多数のグル濾過及び濃縮技術が使用され得る。
ある柚の市販材料が特に有用である。″IペリコンPa
1lieon ”膜はミリポアに#l’1illipa
re Inc。
1lieon ”膜はミリポアに#l’1illipa
re Inc。
ペッドフォードにより製嘉されたポリスルホンから成る
シート状材料である。”アミコンAm1con”膜はア
ミコンAm i c o nによシ製造された同じくポ
リスルポンから成る同様の材料である。これらの材料は
小分子を透過し大分子を保持し得る。従って、大分子を
’J易に通過せしめるが小分子の通過を1511止する
モレキュラーシーブと逆の作用を行なう。ベリコン及び
アミコンはいずれも所望の巨大分子っd、V造から小分
子をp除”し得る濃縮手段として有用である。
シート状材料である。”アミコンAm1con”膜はア
ミコンAm i c o nによシ製造された同じくポ
リスルポンから成る同様の材料である。これらの材料は
小分子を透過し大分子を保持し得る。従って、大分子を
’J易に通過せしめるが小分子の通過を1511止する
モレキュラーシーブと逆の作用を行なう。ベリコン及び
アミコンはいずれも所望の巨大分子っd、V造から小分
子をp除”し得る濃縮手段として有用である。
クラマドグラフで処理するための溶液の濃縮の望ましい
程度は主として処理実施適性に従屈する。
程度は主として処理実施適性に従屈する。
イオン交換又は他の総イオン強度に依存する技術が使用
されるときは塩除去が必要である。これらの準備方法及
び特定の分離プロセスに於ける該準備の必要度は当業界
で十分に公知である。
されるときは塩除去が必要である。これらの準備方法及
び特定の分離プロセスに於ける該準備の必要度は当業界
で十分に公知である。
本発明に於いてリンホトキシンのソースとして使用され
る細胞はリンパ球又はそのトランスホーマントである。
る細胞はリンパ球又はそのトランスホーマントである。
文献によればリンホトキシンは、鉱油銹導により転化さ
れた”パツフイコート白面球”の調節物、即ち、ゴール
デンノ・ムスター又はモルモットの腹膜白血球(17)
並びにヒトリンパ球帰(lymphold )細胞系R
PM11788.B−21及びMOLT (25)の如
きリンノ臂芽球の調製物中に存在する。
れた”パツフイコート白面球”の調節物、即ち、ゴール
デンノ・ムスター又はモルモットの腹膜白血球(17)
並びにヒトリンパ球帰(lymphold )細胞系R
PM11788.B−21及びMOLT (25)の如
きリンノ臂芽球の調製物中に存在する。
1特異的活性”とは、サンプル中のタン/’Pり重重に
関スる標準リンホトキシンアッセイに於けるタンパクの
活性を意味する。公知の開示に説明さ[している如くリ
ンホトキシン活性は、後述のアッセイプロセスによって
目標、l1llffldの50チ溶解を生起するのに必
要なリンホトキシンの量を示す”ユニット”に換算して
測定される。いくつかの標準アッセイゾロセスの使用が
可能である。本文中に詳細に説明するアッセイプロセス
はマウス線維芽細胞の溶解を媒介する能力に゛基づく検
定であり該能力は染色能力として測定される。
関スる標準リンホトキシンアッセイに於けるタンパクの
活性を意味する。公知の開示に説明さ[している如くリ
ンホトキシン活性は、後述のアッセイプロセスによって
目標、l1llffldの50チ溶解を生起するのに必
要なリンホトキシンの量を示す”ユニット”に換算して
測定される。いくつかの標準アッセイゾロセスの使用が
可能である。本文中に詳細に説明するアッセイプロセス
はマウス線維芽細胞の溶解を媒介する能力に゛基づく検
定であり該能力は染色能力として測定される。
付加的プロセスは、主重水素化チミジンで標識されたネ
ズミのアルファーL −929−線維芽細胞、リンホト
キシン感受性細胞株(26)からトリチウムを数、私さ
せる処理を含む。特異的活性を定義すべく使用される6
ユニツト”は、測定されるキシン・臂りと同じくアッセ
イプロセス次第で変化するかも知れない。本文中で定義
される″特異的活性”eまユニット/〜タンノやりであ
り、この場合1ユニツト”Fi後述のアッセイにより測
定されηタン/ぐり+jブランドフォードBradfo
rdの方法(後出)により測定される。
ズミのアルファーL −929−線維芽細胞、リンホト
キシン感受性細胞株(26)からトリチウムを数、私さ
せる処理を含む。特異的活性を定義すべく使用される6
ユニツト”は、測定されるキシン・臂りと同じくアッセ
イプロセス次第で変化するかも知れない。本文中で定義
される″特異的活性”eまユニット/〜タンノやりであ
り、この場合1ユニツト”Fi後述のアッセイにより測
定されηタン/ぐり+jブランドフォードBradfo
rdの方法(後出)により測定される。
本発明方法により製造されたリンホトキシンに関する6
不純物”は、正常細胞環境中又は粗抽出物、濾過物もし
くは遠心物中でリンホトキシンに混雑した物質を意味す
る。
不純物”は、正常細胞環境中又は粗抽出物、濾過物もし
くは遠心物中でリンホトキシンに混雑した物質を意味す
る。
B、精!、!!グロセスの好ましい実施態様均質リンホ
トキシンの全製造プロセスが第1図に要約されており、
該プロセスの好ましい実施態様の1例を以下に説明する
。
トキシンの全製造プロセスが第1図に要約されており、
該プロセスの好ましい実施態様の1例を以下に説明する
。
(1)組織培養及び採取
ヒトリンノ臂芽球様(ly+nphoblastold
)細胞系RPMI 1788をATCC(罵CCL 1
56 )から入手し、アービン・サイエンティフィック
Irvine 5clen−tific、サンタアナ、
カリフォルニアから得た400m1のRPMI−104
0培地に於いて種(seed)カルチャーを増殖させた
。該培地をま10 mM HEPESど5%の仔牛脂児
血清とを含んでおり、培地Lml当り6×104細胞/
mlの濃度で細胞が接種されていた。培地400m1
の増殖に2tのローラ、j?)ルを使用した。37℃で
5日間維持しカルチャーの細胞濃度が2 X 106/
fhJに到達したとき細胞を採取し血清を含まないRP
MI−1640培地で2回洗浄した。
)細胞系RPMI 1788をATCC(罵CCL 1
56 )から入手し、アービン・サイエンティフィック
Irvine 5clen−tific、サンタアナ、
カリフォルニアから得た400m1のRPMI−104
0培地に於いて種(seed)カルチャーを増殖させた
。該培地をま10 mM HEPESど5%の仔牛脂児
血清とを含んでおり、培地Lml当り6×104細胞/
mlの濃度で細胞が接種されていた。培地400m1
の増殖に2tのローラ、j?)ルを使用した。37℃で
5日間維持しカルチャーの細胞濃度が2 X 106/
fhJに到達したとき細胞を採取し血清を含まないRP
MI−1640培地で2回洗浄した。
次に、10mMのugpgsと1%のペニシリンースト
レグトマイシンとを含んでおLa清を含まないRPMI
−1640培地に5 X 105細胞/mlの濃度で細
胞を移植した。(該培地は血清を含まないので汚染タン
i4り量が減少しリンホトキシンの精製を助ける)。4
00m1の細胞懸濁液を2tのローラゲトル並びに各々
15及び10tのスピナーフラスコ(ベルコグラス社B
e1eo Glass Co、、グアインランド、 N
、J、 )に入れた。いくつかの例では該フラスコに代
えて2tのローラぎトルを使用した。
レグトマイシンとを含んでおLa清を含まないRPMI
−1640培地に5 X 105細胞/mlの濃度で細
胞を移植した。(該培地は血清を含まないので汚染タン
i4り量が減少しリンホトキシンの精製を助ける)。4
00m1の細胞懸濁液を2tのローラゲトル並びに各々
15及び10tのスピナーフラスコ(ベルコグラス社B
e1eo Glass Co、、グアインランド、 N
、J、 )に入れた。いくつかの例では該フラスコに代
えて2tのローラぎトルを使用した。
65時間後、リンホトキシン活性を有する培地を採取し
た。
た。
ローラdrトルとスピナーフラスコとの双方から74)
た却I Jliu Em濁液全グールした。ポール・ト
リニティー’?イクロ社Pa1l Trlnlty M
icro Corp、 。
た却I Jliu Em濁液全グールした。ポール・ト
リニティー’?イクロ社Pa1l Trlnlty M
icro Corp、 。
コートランド、ニューヨーク、製の3μMのシールクリ
ーン’S”aAll(le@nフィルタに通して該ゾー
ルから細胞菌体を除去したく第1図のステツ7’l)。
ーン’S”aAll(le@nフィルタに通して該ゾー
ルから細胞菌体を除去したく第1図のステツ7’l)。
透明P液を更に以下の如く濃縮し透析した(ステップ2
)。
)。
限界分子:11.(molecular wsllh七
cut−Off)10.000のペリコンPe1lic
onllu (ミリボア社Ml 111pore Qo
mpnnyljJ )で4℃にてp液を約20倍に濃縮
した。濃縮サンゾルを更に、透析用に設定した同じにリ
コンを使用し、pH7,8の5mMのリン酸塩バッファ
に対して透析した。サンプルの導電率が透析バッファの
導電率に達したとき4リコン膜をバッファで完全に洗浄
しタン・やり全部を回収した。
cut−Off)10.000のペリコンPe1lic
onllu (ミリボア社Ml 111pore Qo
mpnnyljJ )で4℃にてp液を約20倍に濃縮
した。濃縮サンゾルを更に、透析用に設定した同じにリ
コンを使用し、pH7,8の5mMのリン酸塩バッファ
に対して透析した。サンプルの導電率が透析バッファの
導電率に達したとき4リコン膜をバッファで完全に洗浄
しタン・やり全部を回収した。
特異的活性を定量するために得られた濃縮物をステップ
3乃至6に従って処理しリンホトキシン活性を検定した
。
3乃至6に従って処理しリンホトキシン活性を検定した
。
典型的なテストによれば第1図の需縮物(1)の特異的
活性はタンパクダ当!72,000−3,000 ユニ
ットのオーダであることが知見された。分子サイズを測
定するためのセファクリル5ephaaryl S =
300カラムクロマトグラフィーは、約70,000ダ
ルトンに単一活性ピークを生じた。
活性はタンパクダ当!72,000−3,000 ユニ
ットのオーダであることが知見された。分子サイズを測
定するためのセファクリル5ephaaryl S =
300カラムクロマトグラフィーは、約70,000ダ
ルトンに単一活性ピークを生じた。
(3) I)EA、IDセルロースクロマトクラフィ
ー濃縮物(1)をPH7,8の5 mMのりン酸塩バッ
ファで平衡させたDBAE−52セルロースカラムヲ用
いるDgAEセルロースクロマトグラフィ〜で処理した
(ステップ3)。サングルの充填後カラムを平衡バッフ
ァで洗浄し次にO−0,3Mの直線塩化ナトリウム勾配
で溶出した。
ー濃縮物(1)をPH7,8の5 mMのりン酸塩バッ
ファで平衡させたDBAE−52セルロースカラムヲ用
いるDgAEセルロースクロマトグラフィ〜で処理した
(ステップ3)。サングルの充填後カラムを平衡バッフ
ァで洗浄し次にO−0,3Mの直線塩化ナトリウム勾配
で溶出した。
前記に定義したような特異的活性を最も多く有する両分
を選択することによって活性両分を同定した・急峻な単
一活性ピークが第2図に示す如く約0.IMのNa C
Lで溶出した。典型的には第1図の活性画分中tまタン
/J?クダ当り20,000−30.000ユニツトの
オーダの特異的活性を有していた。これは10倍の精製
に相当する。
を選択することによって活性両分を同定した・急峻な単
一活性ピークが第2図に示す如く約0.IMのNa C
Lで溶出した。典型的には第1図の活性画分中tまタン
/J?クダ当り20,000−30.000ユニツトの
オーダの特異的活性を有していた。これは10倍の精製
に相当する。
次に限界分子量10,000(PM−10)の膜を備え
たアミコンAm1con攪拌槽を使用して活性画分を濃
縮した(@1図のステツf4)。
たアミコンAm1con攪拌槽を使用して活性画分を濃
縮した(@1図のステツf4)。
濃縮物(U)を2.5 mMのトリスTrig及び20
mMのグリシン% p Hs、 2−に対して透析し
pI(5−8の範囲の両性電解質担体アンフォリンAm
pholineを含むデキストラン平坦層(Ul tr
odex−LKB)に流した(ステップ5)。グレノ臂
うテイプ(調製用)等電点電気泳動に使用した基本装置
はLKB (2117Multiphor)の製品であ
った。pH勾配を形成する前にサンプルをグル層全体と
混合した。グル層の両側に電極片を配置し8Wの一定電
力を用い8℃で15−20時間に亘シグル層の長手方向
に沿った電気泳動を継続した。分割グリッドでダル層を
分割し各部分をス・9−チルで取出すことによって集束
シーy (focu@ed zone)を収集した。5
0rr+Mの炭酸水素°アンモニウムを使用するイ(J
数の小型使い捨てカラムに於いて各ダル部分からのタン
・ぐりのたf出を行なった。溶出画分について280ハ
mでの吸光度、リンホトキシン活性及びpHを測定した
。
mMのグリシン% p Hs、 2−に対して透析し
pI(5−8の範囲の両性電解質担体アンフォリンAm
pholineを含むデキストラン平坦層(Ul tr
odex−LKB)に流した(ステップ5)。グレノ臂
うテイプ(調製用)等電点電気泳動に使用した基本装置
はLKB (2117Multiphor)の製品であ
った。pH勾配を形成する前にサンプルをグル層全体と
混合した。グル層の両側に電極片を配置し8Wの一定電
力を用い8℃で15−20時間に亘シグル層の長手方向
に沿った電気泳動を継続した。分割グリッドでダル層を
分割し各部分をス・9−チルで取出すことによって集束
シーy (focu@ed zone)を収集した。5
0rr+Mの炭酸水素°アンモニウムを使用するイ(J
数の小型使い捨てカラムに於いて各ダル部分からのタン
・ぐりのたf出を行なった。溶出画分について280ハ
mでの吸光度、リンホトキシン活性及びpHを測定した
。
第3図は、得られた活性、タン・譬り及びpHの変化曲
線(fロフイル)を示す。タンパク11”ル層全体に拡
散しているが堪基性pH領戟に比較して酸性pH領賊に
よシ多くのタン・千り汚染物が観察される。リンホトキ
シン活性はpH5,5乃芋6.5の範囲に拡散していた
。アンフォリンが存在するので活性両分のタン・4り濃
度の正確な定厨は離しく、従って、等電点帆気泳動ステ
ップで得られた精製の程度を算定することはできなかっ
た。しかし乍らこのステツブで得られた活性の回収はか
なシ定量的であった。
線(fロフイル)を示す。タンパク11”ル層全体に拡
散しているが堪基性pH領戟に比較して酸性pH領賊に
よシ多くのタン・千り汚染物が観察される。リンホトキ
シン活性はpH5,5乃芋6.5の範囲に拡散していた
。アンフォリンが存在するので活性両分のタン・4り濃
度の正確な定厨は離しく、従って、等電点帆気泳動ステ
ップで得られた精製の程度を算定することはできなかっ
た。しかし乍らこのステツブで得られた活性の回収はか
なシ定量的であった。
リンホトキシン活性を含む等雷1点屯気泳動溶出液のゾ
ールをpf(7,8の10mMのリン酸塩バッファで平
衡させたレンズ豆レクチン(Pharmaeja)カラ
ムで処理した(ステツ706)。ザングルの充1M後カ
ラムを平衡バッファで洗浄し次に10mMのた。得られ
た結果を第4図に示す。リンホトキシン活性が無いタン
パクの95チより多くが最初にカラムで濾過され、カラ
ム平衡バッファ(10mMのリン酸塩バッファ、pn7
.8)で洗浄しても活性が溶出しなかった。カラムを5
(1−100mMのアルファーメチルマンノシドにt
g: =hさせると殆んどタンノやりをα1ない^い活
性I4−りが溶出した。
ールをpf(7,8の10mMのリン酸塩バッファで平
衡させたレンズ豆レクチン(Pharmaeja)カラ
ムで処理した(ステツ706)。ザングルの充1M後カ
ラムを平衡バッファで洗浄し次に10mMのた。得られ
た結果を第4図に示す。リンホトキシン活性が無いタン
パクの95チより多くが最初にカラムで濾過され、カラ
ム平衡バッファ(10mMのリン酸塩バッファ、pn7
.8)で洗浄しても活性が溶出しなかった。カラムを5
(1−100mMのアルファーメチルマンノシドにt
g: =hさせると殆んどタンノやりをα1ない^い活
性I4−りが溶出した。
このステツブで90%より多い活ス゛[ユニットが回収
された。活性画分はlO乃至100 ミIJオンユニツ
I−/119のオーダの特異的活性を有していた。
された。活性画分はlO乃至100 ミIJオンユニツ
I−/119のオーダの特異的活性を有していた。
レンズ豆しクチンカ2ムから溶出した活性画分を更に以
下の技術で分析し以下の如く特性を決定した。
下の技術で分析し以下の如く特性を決定した。
(1)rルfp過
ダル透過クロマトグラフィー・tま(1番5図に示す如
< )64,000ダルトンに単一ピークを示した。
< )64,000ダルトンに単一ピークを示した。
レンズ豆レクチンカラムから得た活性画分を、NaCL
O,5Mを含有する10m1VIのリン酸3漏”ソフ
ァを溶出溶媒として予め平衡させたセファデツクス5a
phadex G−100カラム(ファルマシア・ファ
インIIケミカ/l/ Pharmacia Fine
Chemicalg 。
O,5Mを含有する10m1VIのリン酸3漏”ソフ
ァを溶出溶媒として予め平衡させたセファデツクス5a
phadex G−100カラム(ファルマシア・ファ
インIIケミカ/l/ Pharmacia Fine
Chemicalg 。
ビスキャタウエー、 N、J、)で処理した。溶出ノ9
ターンを牛血清アルプミy(BSA)、卵アルブミン(
OA)、炭酸脱水酵素(CA)及びグイズトリゾシン阻
害剤(S’I’ I )と比較した。64.(! OO
ダルトンの範囲のリンポトギシン(IiL’r)の溶出
は、以下の結果から明らかな如< l+、’J々のペプ
チドの集合を示す。
ターンを牛血清アルプミy(BSA)、卵アルブミン(
OA)、炭酸脱水酵素(CA)及びグイズトリゾシン阻
害剤(S’I’ I )と比較した。64.(! OO
ダルトンの範囲のリンポトギシン(IiL’r)の溶出
は、以下の結果から明らかな如< l+、’J々のペプ
チドの集合を示す。
HPLCクロマトグラフィーは第6図に示す如く実質的
に均質な調製物を示した。
に均質な調製物を示した。
レンズ豆しクチンカ2ムからの活性画分をPM−10膜
を使用したアミコン攪拌槽で濃縮し、シンクロツクツク
5ynahropak RP−Pカラム(25cILX
4、1 ms、ジンクロム社Synchrom Inc
、 、りンデン、インディアナ)にかけた。ス4クトラ
フイジクス5pectra Physie@SP 80
00高圧液体クロマトグラフィーを使用し210 nm
及び280 nmの吸光度で流出液をモニタした。溶出
榮件としては251υで0.1%トリフルオロ酢酸から
701のア七ト二トリルを含む0.1%トリフルオロ酢
酸までの直線勾配及び1m11分の+Hfl速を使用し
た。
を使用したアミコン攪拌槽で濃縮し、シンクロツクツク
5ynahropak RP−Pカラム(25cILX
4、1 ms、ジンクロム社Synchrom Inc
、 、りンデン、インディアナ)にかけた。ス4クトラ
フイジクス5pectra Physie@SP 80
00高圧液体クロマトグラフィーを使用し210 nm
及び280 nmの吸光度で流出液をモニタした。溶出
榮件としては251υで0.1%トリフルオロ酢酸から
701のア七ト二トリルを含む0.1%トリフルオロ酢
酸までの直線勾配及び1m11分の+Hfl速を使用し
た。
約50チのア七トニトリルワ゛島度で溶出する主タン・
々り一一りが得られる(第6図)。更に12.5チsD
s−pAGgで処理すると、該両分は分子量20,00
0のタンパクを含有している。■IP I、Cのこの2
0にピーク以外に、43%及び51fiのアセトニトリ
ルで溶出する各々分子i 1.5 K及び70にの副次
的ビークが存在していた。f(PLO溶媒はリンホトキ
シン分子を失活させると考えられるので20,000分
子1.1バンドの活性を定トtすることはできなかった
。
々り一一りが得られる(第6図)。更に12.5チsD
s−pAGgで処理すると、該両分は分子量20,00
0のタンパクを含有している。■IP I、Cのこの2
0にピーク以外に、43%及び51fiのアセトニトリ
ルで溶出する各々分子i 1.5 K及び70にの副次
的ビークが存在していた。f(PLO溶媒はリンホトキ
シン分子を失活させると考えられるので20,000分
子1.1バンドの活性を定トtすることはできなかった
。
C() 5DR−Ph(ンE
Sl)S−PAGgによればタンノ等りの大部分をま約
zo;oooダルトンの推定サイズに適合していた(第
7図)。第8図に示す如くリンホトキシン活性はこの2
0,000ダルトンの両分に対応していた。
zo;oooダルトンの推定サイズに適合していた(第
7図)。第8図に示す如くリンホトキシン活性はこの2
0,000ダルトンの両分に対応していた。
レムリLaemml 1 等の方法(27)により濃度
12.5乃W15%の分析用アクリルアミドグルを使用
してS O8−PA(Jを実施した。該方法は引用によ
って本文中に包含される。
12.5乃W15%の分析用アクリルアミドグルを使用
してS O8−PA(Jを実施した。該方法は引用によ
って本文中に包含される。
(4) 自然PA、GIIC
自然PAGgの場合にも、以後5O3−PAGEによシ
定jNすると約20.OOOMWのピークが生じた。
定jNすると約20.OOOMWのピークが生じた。
レンズ豆レクチンカラムからの活性画分をレムリ1゛1
の自然PAGF’7’ロセス(27)に少し変更を加え
たクロセスで処理した。(厚み1.5乃至4間の)調製
用グルと(厚み0.75朋の)分析用グルとは、グル分
析用の7.5チのアクリルアミドとグル重層(スクッキ
ング)用の4俤のアクリルアミドとから構成された。双
方の場合に使用された流動バッファはpH6,8の25
mMのトリスであった。分析用グルeま22m人の定
ii、流で処理され調製用ケ9ルeよ定温度下で100
mAで処理された。
の自然PAGF’7’ロセス(27)に少し変更を加え
たクロセスで処理した。(厚み1.5乃至4間の)調製
用グルと(厚み0.75朋の)分析用グルとは、グル分
析用の7.5チのアクリルアミドとグル重層(スクッキ
ング)用の4俤のアクリルアミドとから構成された。双
方の場合に使用された流動バッファはpH6,8の25
mMのトリスであった。分析用グルeま22m人の定
ii、流で処理され調製用ケ9ルeよ定温度下で100
mAで処理された。
電気泳動テストの終了時に、引用によって本文中に包含
される銀染色(28)でグル上のタン・9りを可視化し
RfO,33の拡散バンドをイ()た。第9図はこれら
の結果をより詳細に説明する。この図では、ケ9ルをス
ライスしこれらのスライスを自然PAGEからの50
mMの炭酸アンモニウノ・バッファ中で4υに一晩維持
して酢出を行なうとリンホトキシン活性がRfo、33
のグルスライスに対応するという別の実施によってタン
パクを定1片シた結果が示されている。該グルスライス
からの溶出液を5DS−PAGF;カラムで処理すると
、リンホトキシン活性を有する溶出液のみが20,00
0−MWの/4ンドを生じた。
される銀染色(28)でグル上のタン・9りを可視化し
RfO,33の拡散バンドをイ()た。第9図はこれら
の結果をより詳細に説明する。この図では、ケ9ルをス
ライスしこれらのスライスを自然PAGEからの50
mMの炭酸アンモニウノ・バッファ中で4υに一晩維持
して酢出を行なうとリンホトキシン活性がRfo、33
のグルスライスに対応するという別の実施によってタン
パクを定1片シた結果が示されている。該グルスライス
からの溶出液を5DS−PAGF;カラムで処理すると
、リンホトキシン活性を有する溶出液のみが20,00
0−MWの/4ンドを生じた。
(5)トリグシン消化及びペグチドの午離による分析
λif 4jllされたリンホトキシン;p、liI製
物をトリグシンTPCK (ウオーシントンWorth
ington)で消化した。即ち、pusの50mMの
炭酸水温アンモニウムバッファ中で1部のトリフシンと
20部のタンノ?りとを使用し室温で24時間処哩した
。断片は約15,000及び5.(100の分子月、を
有していた。
物をトリグシンTPCK (ウオーシントンWorth
ington)で消化した。即ち、pusの50mMの
炭酸水温アンモニウムバッファ中で1部のトリフシンと
20部のタンノ?りとを使用し室温で24時間処哩した
。断片は約15,000及び5.(100の分子月、を
有していた。
力■水分角了糸冬了1々、スペクトラ・フィックス5p
ectra PhyIIics 5P−8000クロマ
トグラフを使用し25℃のりクロソーブLlchros
orb ILP−18カラム(25clXX4.6mm
、EM reagents 、シンシブティ、オフ1イ
オ)でIIPLCクロマトグラフにかけた。0.1チの
トリフルオロ酢酸から50%のアセトニトリルを含む0
.1チのトリフルオロl¥1!酸までの直線勾配と7.
ml 7分の流速とを用いた溶出後に21 Or+m
と281) nmとに於いてピークをイ・奢出した。・
(以後のアミノ酸配列解析のために各−一りを収集し凍
結乾;・■して一20℃で保存した)。
ectra PhyIIics 5P−8000クロマ
トグラフを使用し25℃のりクロソーブLlchros
orb ILP−18カラム(25clXX4.6mm
、EM reagents 、シンシブティ、オフ1イ
オ)でIIPLCクロマトグラフにかけた。0.1チの
トリフルオロ酢酸から50%のアセトニトリルを含む0
.1チのトリフルオロl¥1!酸までの直線勾配と7.
ml 7分の流速とを用いた溶出後に21 Or+m
と281) nmとに於いてピークをイ・奢出した。・
(以後のアミノ酸配列解析のために各−一りを収集し凍
結乾;・■して一20℃で保存した)。
第10図に示す如く、アセ) = 1−リルI^度42
.3チ及び48,4チに於いて夫々溶出する2つのピー
ク゛r−1及びT−2が観察された。これらの2つのピ
ークの各りの分子サイズをS l)S −PAGE (
第111”/l )で定邦するとT−1では15,1)
00、T−2では5,000であった。210 nm及
び280 nmのヌ方に於いてMWが小さいピークT−
2の方がピーク゛r−1よりも高い吸光度を示した。
.3チ及び48,4チに於いて夫々溶出する2つのピー
ク゛r−1及びT−2が観察された。これらの2つのピ
ークの各りの分子サイズをS l)S −PAGE (
第111”/l )で定邦するとT−1では15,1)
00、T−2では5,000であった。210 nm及
び280 nmのヌ方に於いてMWが小さいピークT−
2の方がピーク゛r−1よりも高い吸光度を示した。
トリフシン加水分解の完了を1.M 認するために、加
水分解調製物の少星のサンプルを5DS−PAGEにか
け20,000ダルトン・々ンドが検出されず15,0
00及び5,000ダルトンのバンドに代替されたこと
を確認した。
水分解調製物の少星のサンプルを5DS−PAGEにか
け20,000ダルトン・々ンドが検出されず15,0
00及び5,000ダルトンのバンドに代替されたこと
を確認した。
更に、前記の如くトリグシン消化によって形成された白
質はリンホトキシン活性を示す。
質はリンホトキシン活性を示す。
(6) 自動アミノ酸配列解析
トリグシンで処理しないインタクトな断片とトリノ°シ
ン消化断片との双方の配列を決定するために自動アミノ
酸配列決定技術を使用した。即ちサンプ9ル^: 0.
(i meの0.2M酢酸に懸濁させ、4ダの、JP
リブレンと1000Mのノルロイシンを予め塗布してお
いたベックマンBeckman 890Cシーケア サ
の)Jソデに懸濁液を移した。ダブリュ・コールW。
ン消化断片との双方の配列を決定するために自動アミノ
酸配列決定技術を使用した。即ちサンプ9ル^: 0.
(i meの0.2M酢酸に懸濁させ、4ダの、JP
リブレンと1000Mのノルロイシンを予め塗布してお
いたベックマンBeckman 890Cシーケア サ
の)Jソデに懸濁液を移した。ダブリュ・コールW。
T(ohr等(29)に記載のプログラムに孕じて1r
nl/9のi;:CJjでiU fit 71%球(u
ltrasphere)ODS(25「xX4、67’
1m 、 5μM)カラムを使用しフェニルチオヒダネ
ーショ7(pltenyl thiohydanatl
on、PTH)アミノ贋を同定した。核、o r1グラ
ムは引用により本文中に包含される。
nl/9のi;:CJjでiU fit 71%球(u
ltrasphere)ODS(25「xX4、67’
1m 、 5μM)カラムを使用しフェニルチオヒダネ
ーショ7(pltenyl thiohydanatl
on、PTH)アミノ贋を同定した。核、o r1グラ
ムは引用により本文中に包含される。
インタクトなタンA’りとトリグシン消化断片との双方
について得られた結果を@12図に示す。
について得られた結果を@12図に示す。
第12図の如く、配列中のいくつかの位1j7を確実に
同定することはできなかった。しかし乍ら15に断片(
T−1)がインタクトなリンホトキシンのN−末端部分
に対応することを示すための十分な同定が達成された。
同定することはできなかった。しかし乍ら15に断片(
T−1)がインタクトなリンホトキシンのN−末端部分
に対応することを示すための十分な同定が達成された。
前記の例は、本発明を限定するものではなく本発明を説
明するためのものである。出発肉質として別の紹1胞系
を使用すること及び等価のクロマトグラフ方法を使用す
ることはい1°れもrtJ能である。
明するためのものである。出発肉質として別の紹1胞系
を使用すること及び等価のクロマトグラフ方法を使用す
ることはい1°れもrtJ能である。
レンズ豆レクチンクロマトグラフィーの使用によって最
高度のfff製が達成される七判断される。従って当該
ステツノをなんでさえいれば、準1禰ステツノはかなシ
任意に違択することができる。リンホトキシンの単離グ
ロセスに於いてレンズ豆レクチンtよこれまで使用され
ていなかった。しかし乍ら、前記の如き一ロデロセスの
結果、実質的に純粋なタンノ愛り〃脣すられる。
高度のfff製が達成される七判断される。従って当該
ステツノをなんでさえいれば、準1禰ステツノはかなシ
任意に違択することができる。リンホトキシンの単離グ
ロセスに於いてレンズ豆レクチンtよこれまで使用され
ていなかった。しかし乍ら、前記の如き一ロデロセスの
結果、実質的に純粋なタンノ愛り〃脣すられる。
D、 リンホトキシン活性の検定プロセススj?フォー
ド5pofford(30)の1lll胞溶解17セイ
に変更を加えた方法を用い411 ’M中のリンホトキ
シン活性をモニタした。該アッセイは引用によって本文
中に包含される。要約すればマイトマイシンCを存在さ
せたマイクロタイターグレートでマレスI、−929線
維芽細胞を増殖させた。12−18時間後に、順次希釈
したリンホトキシン検定用ザンデル0.125m/を各
ウェルに添加した。48時間後、プレートを洗浄し、リ
ンホトキシンにより誘発された細I]fiの溶解をグレ
ートに付着し7だ細胞として検出するために、1チのク
リスタルバイメレントを含むメタノール:水溶液(容量
化l:4)でプレートを染色し、た。染色の濃さを肉眼
及び分光1111九により観察した。後者を・Jl ダ
イナテンク1)ynatachスイクトロホトメータを
1吏用し7450nm及びS 7 On+n透過の吸光
度にて行なわれた。
ド5pofford(30)の1lll胞溶解17セイ
に変更を加えた方法を用い411 ’M中のリンホトキ
シン活性をモニタした。該アッセイは引用によって本文
中に包含される。要約すればマイトマイシンCを存在さ
せたマイクロタイターグレートでマレスI、−929線
維芽細胞を増殖させた。12−18時間後に、順次希釈
したリンホトキシン検定用ザンデル0.125m/を各
ウェルに添加した。48時間後、プレートを洗浄し、リ
ンホトキシンにより誘発された細I]fiの溶解をグレ
ートに付着し7だ細胞として検出するために、1チのク
リスタルバイメレントを含むメタノール:水溶液(容量
化l:4)でプレートを染色し、た。染色の濃さを肉眼
及び分光1111九により観察した。後者を・Jl ダ
イナテンク1)ynatachスイクトロホトメータを
1吏用し7450nm及びS 7 On+n透過の吸光
度にて行なわれた。
培Jl!1.のみを含むマイクロタイターウェルに塗抹
された細胞を溶解Oチに膜室し、3 Mの1稿酸ダアニ
ジン溶液が含まれた場合を溶解100%の終点としlζ
。各ウェルに塗抹された12,000の細胞の50ts
を溶解させるに必要なリンホトキシンのpを1ユニント
と定義する。
された細胞を溶解Oチに膜室し、3 Mの1稿酸ダアニ
ジン溶液が含まれた場合を溶解100%の終点としlζ
。各ウェルに塗抹された12,000の細胞の50ts
を溶解させるに必要なリンホトキシンのpを1ユニント
と定義する。
E、 タン/9りの定量
ff JM 中のタンパク濃度をブランドフォードBr
adford(31)の方法によって測定した。該方法
は引用によって本文中に包含される。要約すれば0.8
mlの被検定ザングルを旧o−Rad Labs 。
adford(31)の方法によって測定した。該方法
は引用によって本文中に包含される。要約すれば0.8
mlの被検定ザングルを旧o−Rad Labs 。
リッチモンド、カリフォルニアの試薬濃縮溶液0、2
mlと混合した。パーギンエルマーPerking1m
orスペクトロホトメータMod@155Bを使用し反
応混合物を595 nmで測定した。該アッセイは牛血
清アルブミン2−20μgの間で直線状であった。更に
最終精製段階中には、280 nm及び206 nmに
於ける吸光度から又QまSDS −、f?リアクリルア
ミドrグル銀染色からタン/やりのおよその推定量を得
た。該推定量は最終的罠タン・臂り配列決定サイクルの
各々に於いて現われた種々のアミノ酸残基のナノモルに
よって確認された。
mlと混合した。パーギンエルマーPerking1m
orスペクトロホトメータMod@155Bを使用し反
応混合物を595 nmで測定した。該アッセイは牛血
清アルブミン2−20μgの間で直線状であった。更に
最終精製段階中には、280 nm及び206 nmに
於ける吸光度から又QまSDS −、f?リアクリルア
ミドrグル銀染色からタン/やりのおよその推定量を得
た。該推定量は最終的罠タン・臂り配列決定サイクルの
各々に於いて現われた種々のアミノ酸残基のナノモルに
よって確認された。
F、効用及び用量用法
リンホトキシン又はその塩又はその誘導体又はその活性
成分は、抗腫高活性を示す薬剤に許容されたいかなる用
法で投与されてもよい。これらの用法として経口膜力、
非経口投与もしくは局所投与及びその他の全身性用法が
ある。局所注射又は静脈注射がIQ−ましい。活性成分
は例えば活性であることが判明しているリンホトキシン
のトリグシン消化物をも含む。このような消化物がこの
種のこの目的の薬剤組成物の活性成分として使用できな
い理由は存在しない。
成分は、抗腫高活性を示す薬剤に許容されたいかなる用
法で投与されてもよい。これらの用法として経口膜力、
非経口投与もしくは局所投与及びその他の全身性用法が
ある。局所注射又は静脈注射がIQ−ましい。活性成分
は例えば活性であることが判明しているリンホトキシン
のトリグシン消化物をも含む。このような消化物がこの
種のこの目的の薬剤組成物の活性成分として使用できな
い理由は存在しない。
所望の用法次第で組成物は固体、半固体又は液体の削形
、例えば錠剤、丸剤、カブセル削、散薬、液典、懸霞液
等の形状で使用され得る。好ましくは毎回正確な用量を
投与ヂるのに適した単位用量の削形で使用され得る。組
成物は従来の薬剤担体又は賦形剤とリンホトキシン又は
薬剤的に許容されイ(するその塩もしくは誘導体とを含
有しておシ更に別の詰物、薬剤、担体、アゾユパント等
を含有し得る。前ICの如き賦形剤は、別のタン・々り
例えばヒト血清アルブミン又は血漿製剤を含み得る。
、例えば錠剤、丸剤、カブセル削、散薬、液典、懸霞液
等の形状で使用され得る。好ましくは毎回正確な用量を
投与ヂるのに適した単位用量の削形で使用され得る。組
成物は従来の薬剤担体又は賦形剤とリンホトキシン又は
薬剤的に許容されイ(するその塩もしくは誘導体とを含
有しておシ更に別の詰物、薬剤、担体、アゾユパント等
を含有し得る。前ICの如き賦形剤は、別のタン・々り
例えばヒト血清アルブミン又は血漿製剤を含み得る。
活性化合物の投与景は勿論、治療される患者、病状の程
度、投与方式及び担当医師の判断等に左右されるであろ
う。しかし乍ら有効用量は0.007乃¥7 ng/k
g1日の範囲であり、好ましくは0.07乃至0.7
ng/kfl/日である。
度、投与方式及び担当医師の判断等に左右されるであろ
う。しかし乍ら有効用量は0.007乃¥7 ng/k
g1日の範囲であり、好ましくは0.07乃至0.7
ng/kfl/日である。
同体組成物用の従来の無毒性固体担体としては例えば、
薬剤グレードのマンニトール、乳糖デンプン又はステア
リン酸マグネシウムがある。薬剤として投与可能な液体
組成物は、例えば、前記の如きリンホトキシンと任意の
薬剤アジュ・々ントとを例えば水、生理食塩水、水性デ
ギストロース、グリセロール、エタノール等の如き担体
に例えば溶解又は分散させ溶液又Iri懸ffJ液を得
ることによってv4製され得る。投与される薬iIIわ
]酸物は所望に応じて更に、少曖の無毒性補助物質例え
ば湿憫削、乳化””L pli緩衝剤等、例えば酢酸
ナトリウム又はモノラウリン酸ンルビタンを含有し得る
。前記の如き削形の実際の調製方法は、例えばレミント
ンツク・パブリッシング1カンノぐニーMack Pu
bli−811管1g Companys イースト
ン、ペンシルヴアニア、15版、1975年、の参照に
より当業者に公知又は明白であろう。いずれにしても、
投与される。311成物即ち配合物は、治療される患者
の症状を軽減すべく有効h÷のリンホトキシンを含有す
るであろう。
薬剤グレードのマンニトール、乳糖デンプン又はステア
リン酸マグネシウムがある。薬剤として投与可能な液体
組成物は、例えば、前記の如きリンホトキシンと任意の
薬剤アジュ・々ントとを例えば水、生理食塩水、水性デ
ギストロース、グリセロール、エタノール等の如き担体
に例えば溶解又は分散させ溶液又Iri懸ffJ液を得
ることによってv4製され得る。投与される薬iIIわ
]酸物は所望に応じて更に、少曖の無毒性補助物質例え
ば湿憫削、乳化””L pli緩衝剤等、例えば酢酸
ナトリウム又はモノラウリン酸ンルビタンを含有し得る
。前記の如き削形の実際の調製方法は、例えばレミント
ンツク・パブリッシング1カンノぐニーMack Pu
bli−811管1g Companys イースト
ン、ペンシルヴアニア、15版、1975年、の参照に
より当業者に公知又は明白であろう。いずれにしても、
投与される。311成物即ち配合物は、治療される患者
の症状を軽減すべく有効h÷のリンホトキシンを含有す
るであろう。
G、参考文献
添付の又献目録及び本文中の参考文献は、本発明の叩解
を助けるために引用されたものである。
を助けるために引用されたものである。
従って引用事項は本文中に包含される。
文市に目録
1、 F2vans、Cancer lnununo
logy an4 Immuno −therap71
2.181 (1982)。
logy an4 Immuno −therap71
2.181 (1982)。
2、 Ho1t@rman、O,A、、et al、
5tudi@s onlocal admin
istation of materials
withlymphokine aetiマity t
o neop、1aIlIms lnvo−1vin
g the gkln、” In M、A、Fink
(ad) Themacorphase in no
oplAsia、pp 259−261゜Wsch、
102:1188(1972)4、 Pap@rma
stor、B、W、、at al、Rps、Comm
。
5tudi@s onlocal admin
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Chem、Pah、Pharmaeol、8:413(
1974)5、 Papermaster、B、W、、
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451(1979) 7、 Khan、A、、at al、Hemato
logy and Oneo−1ogy、11:1
28A(1981)8、 Gat@ly、M、に、、
et al、In+mnno1,27:B2(1976
)9、 Rosenbarg’、S、A、、et a
l、 J、Imm+u+ol。
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981) 48:556(1973) 16、 Evans、C,11,、st al、 C
ancer Res、。
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nol。
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n hamster Jymphotoxlnls
olated in hlgh yield on
a WatersI−125Protein HPLC
column、”(1982)In Internat
lonal symptons on HPLCofP
roteins and peptldes h
eld InWashington、D、C,−No
vember 16−17th、198124、 K
lostergaard、J、、at al、 Mo1
.Immunol。
Rlologleallyactive 5yria
n hamster Jymphotoxlnls
olated in hlgh yield on
a WatersI−125Protein HPLC
column、”(1982)In Internat
lonal symptons on HPLCofP
roteins and peptldes h
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、J、Immunol。
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112:2111(1974〕
31、 nradford、N、M、、at R
1,A、nal Brochem。
1,A、nal Brochem。
72:248(197G)
21N1図は本発明に従って行なわれるリンホトヤシン
JTl利の好ましい具体例のイ;χ略説明図、第2図F
iO−0,3M NaCt勾配を使用したDE人Eセル
ロース(DE−52)精製ステツブで得られた溶出ノ9
ターンの説明図であり、活性が約0.1Mで溶出し多量
のタンパクは保持されていることを示す図、第3図は典
型的FA製物に於いて得られた等電点電気泳動・臂ター
ン図、 R4゛図はレンズ豆しクチン精Jl、+4ステソゲで得
られた溶出・でターン図であり、リンホトキシン溶出以
前にリンホトキシン活性を持たない全タン・臂りの96
係より多くがカラムにより濾過されることを示す図、 第5図は5ephadex G−1(10からのリンホ
トキシン活性生の溶出グロフィルを示−)図であり、挿
入図は分子型既知のタンノククたるjイス゛トリプシン
阻害剤と炭酸脱水酵素と卵白アルブミンと牛血清アルブ
ミンとを使用した較正曲線を示しておシ、最大サイズの
決定にはプループヤス1ランが使用された図、 第6図は、レンズ豆レークチンカラムから得られた’l
’l’f IIJ IJンポトキシン画分の分析に使用
されたIIPLCの結果を示す図、 第7図は5J)S−PAGEにより決定されたレンズ豆
レクチン活性画分のサイズ分布の図であり、第5図のグ
ルfi過ステッグから得た20に画分を用いた451孕
も含まれている図、 P■8図は第7図の8DS−PAGEからのリンホトギ
シン活性の溶出プロフィルであり上部画面は第7図のカ
ラムCのケ9ルを使用した結果を示しており、下部画面
はバッファのみを使用した対照(ffi7図のカラムK
)を示しておりグイフロント(dyefront)に
対応するアーチファクトであると考えより?<)らシま
たltf O,33画分の活性定量及び5DS−PAG
Eによる分析を示す図であり、宇Q、triata精製
リンホトキシンの自然PAGE処理後のグルスライスの
オyジン方示しれており、$Q4rrsnスライスの活
性、俸q・hoeスライスのサイズ之示しれた図、第1
0図は、均質リンホトキシンのトリプシン消化物のHP
LC溶出パターン図、 第11図は、第10図の両分の5DS−PAGE分子量
分析を示す図、 )も12図は、精製リンホトキシンのトリプシン消化物
から得た断片のアミノ酸配列決定の結果を示すヒドリン
ホトキシンの部分的アミノ酸配列の図である。 代理人tFIJ士今 村 元 Fig、8 リゝルスラ丁ス沓号Ala −
Thr −Ser −Ser −−Glu −
Val −Gln −Leu −5 −Phe −X −Val −X −X −−I
le −Gly −Asp −Pro −−Leu −
Trp −Arg −Ala −−Leu −Glu
−(Ser) −Gly5 − Val −Leu −X −X −X
−(Asn) (Val) Phe −Cys −Cys −Gln −Tyr −
Pro −Fig、12 手続?ff1.:il三書(方式) 昭和58年12月160 1、事件の表示 昭和58り「特許願第13668
1号2、発明の名称 ヒトリンホ1−キシン3、補
正をする者 事f1との関係 特許出願人 名 称 ジ1ネンテツク・インコーホレイテッド
4、代 理 人 東京都新宿区新宿1丁目1番14
号 山田ビル5、補正指令の日付 昭和58年11
月8日(11添付図面中、第9a図を別紙の通多補正し
、riQb図」及びr第9a図」を別紙のとおシ、一つ
の図面に表わし、「第9b図」と補出願と同時に上申書
を提出してお#)ます。 (2)明If4JJ書図面の簡単な説明の欄中第43頁
下から第4行目乃至第44頁上から第2行目までを次の
とおシ補正する。 「第9a図及び第9b図は、精製リンホトキシンの自然
PAGEによυ得られたRfo、33画分の活性定量及
び5L)S−PAGEによる分析を示す図であシ、第9
a図は、¥7を製リンホトキシンの自然PAGE処理後
のゲルスライスの活性を示す図であシ、第9b図上段は
スライスのサイズを示しておフ、第9b図下段はオリジ
ンを示している図、」と補正する。 + 2345678 9 1o u1分−11
JTl利の好ましい具体例のイ;χ略説明図、第2図F
iO−0,3M NaCt勾配を使用したDE人Eセル
ロース(DE−52)精製ステツブで得られた溶出ノ9
ターンの説明図であり、活性が約0.1Mで溶出し多量
のタンパクは保持されていることを示す図、第3図は典
型的FA製物に於いて得られた等電点電気泳動・臂ター
ン図、 R4゛図はレンズ豆しクチン精Jl、+4ステソゲで得
られた溶出・でターン図であり、リンホトキシン溶出以
前にリンホトキシン活性を持たない全タン・臂りの96
係より多くがカラムにより濾過されることを示す図、 第5図は5ephadex G−1(10からのリンホ
トキシン活性生の溶出グロフィルを示−)図であり、挿
入図は分子型既知のタンノククたるjイス゛トリプシン
阻害剤と炭酸脱水酵素と卵白アルブミンと牛血清アルブ
ミンとを使用した較正曲線を示しておシ、最大サイズの
決定にはプループヤス1ランが使用された図、 第6図は、レンズ豆レークチンカラムから得られた’l
’l’f IIJ IJンポトキシン画分の分析に使用
されたIIPLCの結果を示す図、 第7図は5J)S−PAGEにより決定されたレンズ豆
レクチン活性画分のサイズ分布の図であり、第5図のグ
ルfi過ステッグから得た20に画分を用いた451孕
も含まれている図、 P■8図は第7図の8DS−PAGEからのリンホトギ
シン活性の溶出プロフィルであり上部画面は第7図のカ
ラムCのケ9ルを使用した結果を示しており、下部画面
はバッファのみを使用した対照(ffi7図のカラムK
)を示しておりグイフロント(dyefront)に
対応するアーチファクトであると考えより?<)らシま
たltf O,33画分の活性定量及び5DS−PAG
Eによる分析を示す図であり、宇Q、triata精製
リンホトキシンの自然PAGE処理後のグルスライスの
オyジン方示しれており、$Q4rrsnスライスの活
性、俸q・hoeスライスのサイズ之示しれた図、第1
0図は、均質リンホトキシンのトリプシン消化物のHP
LC溶出パターン図、 第11図は、第10図の両分の5DS−PAGE分子量
分析を示す図、 )も12図は、精製リンホトキシンのトリプシン消化物
から得た断片のアミノ酸配列決定の結果を示すヒドリン
ホトキシンの部分的アミノ酸配列の図である。 代理人tFIJ士今 村 元 Fig、8 リゝルスラ丁ス沓号Ala −
Thr −Ser −Ser −−Glu −
Val −Gln −Leu −5 −Phe −X −Val −X −X −−I
le −Gly −Asp −Pro −−Leu −
Trp −Arg −Ala −−Leu −Glu
−(Ser) −Gly5 − Val −Leu −X −X −X
−(Asn) (Val) Phe −Cys −Cys −Gln −Tyr −
Pro −Fig、12 手続?ff1.:il三書(方式) 昭和58年12月160 1、事件の表示 昭和58り「特許願第13668
1号2、発明の名称 ヒトリンホ1−キシン3、補
正をする者 事f1との関係 特許出願人 名 称 ジ1ネンテツク・インコーホレイテッド
4、代 理 人 東京都新宿区新宿1丁目1番14
号 山田ビル5、補正指令の日付 昭和58年11
月8日(11添付図面中、第9a図を別紙の通多補正し
、riQb図」及びr第9a図」を別紙のとおシ、一つ
の図面に表わし、「第9b図」と補出願と同時に上申書
を提出してお#)ます。 (2)明If4JJ書図面の簡単な説明の欄中第43頁
下から第4行目乃至第44頁上から第2行目までを次の
とおシ補正する。 「第9a図及び第9b図は、精製リンホトキシンの自然
PAGEによυ得られたRfo、33画分の活性定量及
び5L)S−PAGEによる分析を示す図であシ、第9
a図は、¥7を製リンホトキシンの自然PAGE処理後
のゲルスライスの活性を示す図であシ、第9b図上段は
スライスのサイズを示しておフ、第9b図下段はオリジ
ンを示している図、」と補正する。 + 2345678 9 1o u1分−11
Claims (9)
- (1) (、) リンホトキシンを産生ずるセルカルチャーか
ら抽出物、上清又はF液を生成し、 (b) 前記抽出物、上清又はp液をレンズ豆レクチ
ン吸収剤で処理し、 (c) 吸収剤からリンホトキシンを選択的に溶出さ
せるステップを含むヒドリンホトキシンの製法へ - (2)ステップ(b)以前に付加的等電点電気泳動ステ
ップが含まれる特許請求の範囲@1項に記載の方法。 - (3)ステップ(b)以前に付加的DEAE−セルロー
スクロマトグラフイーステッグが含まれる特許請求の範
囲第1項に記載の方法。 - (4)等電点電気泳動ステップ以前又は以後に付加的D
EAE−セルロースクロマトグラフイーステツゾが含ま
れる特許請求の範囲第2項に記載の方法0 - (5)セルカルチャーがヒトリンパ芽球様細胞系のセル
カルチャーである特許請求の範囲第1項に記載の方法。 - (6)細胞系がRPM11788である特許請求の範囲
第5項に記載の方法。 - (7)セルカルチャーが血清を含まない培地に於いて増
殖される特許請求の範囲第1項乃至第6項のいずれかに
記載の方法。 - (8) (、) リンホトキシンを産生ずるセルカルチャーか
らの抽出物、上清又はろ液を濃縮し濃縮物を透析して透
析物を生成し、 (b)透析物ヲDgAE−セルロースクロマトグラフィ
ー処理し、 (C) ステップ(b)で得られたリンホトキシン含
有画分を@線処理し、 (d)ステップ(C)で得られた濃縮物を等電点電気泳
動処理してリンホトキシン含有画分を生成し、(、)
ステップ(d)で得られたリンホトキシン含有画分を
レンズ豆レクチンクロマトグラフィー処理し、 (fl ステップ(e)からリンホトキシンを回収す
るステップを含むリンホトキシンの製法。 - (9)セルカルチャーがヒトリンパ芽球様細胞系のセル
カルチャーである特許請求の範囲第8項に記載の方法〇 (In all胞系がRPMI 1788である特許
請求の範囲2r99項に記載の方法。 (ロ) セルカルチャーが血清を含まない培地中で増殖
される特許iv#求の範囲第8項に記載の方法。 θ→ ステップ(b)に於ける攬析がベリコンを使用し
て行なわれる特許請求の範囲第8項乃至第11項のいず
れかに記載の方法。 α→ ステップ(f)に於いてリンホトキシンがマンノ
ース又はガラクF−ス含有溶液を用いる選択的溶出によ
シ得られる特許請求の範囲第8項乃至第11項のいずれ
かにj1己載の方γL0a→ 実質的に不純物を含まな
いヒドリンホトキシン並びにその塩及び誘導体。 θ910 X 10’ユニツト/■より大きい特異活性
を有するヒドリンホトキシン並びにその塩及び該導体。 α* 100 X 10’ユニット/myより大きい
特異活性を有するヒドリンホトキシン並びにその塩及び
誘導体。 aカ 標準リンホトキシンアッセイに於いて活性であ
り本文中に記載の如〈実施されたHPLCKllして実
質的に均質であるタンノヤク並びにその塩及び誘導体。 0榎 標準リンホトキシンアッセイに於いて活性であシ
本文中に記載の如〈実施されたSDS −PAGEに関
して実質的に均質であるタンパク並びにその塩及び誘導
体。 但夛 特i’l′l’ iiiν求の範囲第14項乃至
第18項のいずれかに記載のタンノ々りのトリプシン消
化物を含む物IJす。 倣−薬剤的に許容され得る賦形剤と共に特許請求の範囲
第14項乃至第19項のいずれかに記載の化合物又は薬
剤的に許容され得るその塩もしくは誘導体を治療に有効
な量で含むヒトの腫穐治療に有用な薬剤組成物。 (ハ) 要治療思者に対し特許請求の範囲w、14項乃
至第19項のいずれかに記載の化合物又は薬剤的に許容
され得るその塩もしくは誘導体を治療的に有効な鼠、で
投与するかあるいは治療的に有効な量を含有する薬剤組
成物として投与するヒト1珀熾の治療方法0
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---|---|---|---|
US40367182A | 1982-07-30 | 1982-07-30 | |
US403671 | 1982-07-30 |
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JP6157631A Division JP2524969B2 (ja) | 1982-07-30 | 1994-07-08 | ヒトリンホトキシン |
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---|---|
JPS5984827A true JPS5984827A (ja) | 1984-05-16 |
JPH0716435B2 JPH0716435B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=23596593
Family Applications (2)
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---|---|---|---|
JP58136681A Expired - Lifetime JPH0716435B2 (ja) | 1982-07-30 | 1983-07-26 | ヒトリンホトキシン |
JP6157631A Expired - Lifetime JP2524969B2 (ja) | 1982-07-30 | 1994-07-08 | ヒトリンホトキシン |
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JP6157631A Expired - Lifetime JP2524969B2 (ja) | 1982-07-30 | 1994-07-08 | ヒトリンホトキシン |
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JP (2) | JPH0716435B2 (ja) |
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CA (1) | CA1241597A (ja) |
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IE (1) | IE55553B1 (ja) |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6124520A (ja) * | 1984-07-12 | 1986-02-03 | Takeshi Makitsubo | 腫瘍壊死因子様物質を抽出する方法 |
JPS6156131A (ja) * | 1984-07-17 | 1986-03-20 | Takeshi Makitsubo | 腫瘍壊死因子様物質 |
JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
JPS62298536A (ja) * | 1986-06-17 | 1987-12-25 | Green Cross Corp:The | 生理活性物質の自動精製方法および自動精製装置 |
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GB8330969D0 (en) * | 1983-11-21 | 1983-12-29 | Wellcome Found | Promoting healing |
DE3574710D1 (de) * | 1984-04-13 | 1990-01-18 | Litton Bionetics Inc | Leukoregulin, ein antitumor-lymphokin und dessen verwendung als heilmittel. |
US4708948A (en) * | 1984-04-20 | 1987-11-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Substantially purified tumor growth inhibitory factor |
JPS60243018A (ja) * | 1984-05-17 | 1985-12-03 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | ヒト内来性癌制御因子 |
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US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
US6686455B1 (en) | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
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US5840522A (en) * | 1984-09-20 | 1998-11-24 | Chiron Corporation | Recombinant lectins |
US4677064A (en) * | 1984-11-09 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
US4677063A (en) * | 1985-05-02 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
US4708937A (en) * | 1984-10-15 | 1987-11-24 | Brigham & Women's Hospital | Purified migration inhibitory factor also having colony stimulating factor activity |
US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
PT81823B (pt) * | 1985-01-14 | 1987-11-30 | Yamanouchi Pharma Co Ltd | Metodo de preparacao de factores endogenos humanos reguladores de cancro |
US6084073A (en) * | 1985-03-25 | 2000-07-04 | Chiron Corporation | Recombinant ricin toxin |
EP0205038A1 (en) * | 1985-05-29 | 1986-12-17 | Suntory Limited | Polypeptide, process for preparing it, microorganism and pharmaceutical use |
JPH0631318B2 (ja) * | 1985-09-18 | 1994-04-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | 新リンホカインiiiとその製法 |
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- 1983-07-25 AU AU17239/83A patent/AU573531B2/en not_active Expired
- 1983-07-25 CA CA000433066A patent/CA1241597A/en not_active Expired
- 1983-07-26 DE DE8383304310T patent/DE3377421D1/de not_active Expired
- 1983-07-26 EP EP83304310A patent/EP0100641B1/en not_active Expired
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- 1983-07-26 AT AT83304310T patent/ATE35827T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-07-28 IE IE1786/83A patent/IE55553B1/en not_active IP Right Cessation
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-
1994
- 1994-07-08 JP JP6157631A patent/JP2524969B2/ja not_active Expired - Lifetime
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JPS62298536A (ja) * | 1986-06-17 | 1987-12-25 | Green Cross Corp:The | 生理活性物質の自動精製方法および自動精製装置 |
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