JP2524969B2 - ヒトリンホトキシン - Google Patents

ヒトリンホトキシン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、最初リンパ球から不純
形で抽出され抗腫瘍活性を有すると考えられている１種
のタンパクたるリンホカインに係る。より詳細には本発
明はヒトリンホカインの均質調製物たるリンホトキシン
に係る。
【０００２】
【従来の技術】リンホカインは、刺激リンパ球から産生
される生物学的に活性のホルモン様ペプチド又はタンパ
クである。このようなリンホカインの特性及び機能につ
いては細胞障害活性を示す特性及び機能をも含めて種々
に研究されてきた。リンホトキシンは、マイトジエン又
は抗原により刺激されたリンパ球から産生されるのみで
なく該リンパ球由来の組織カルチャー（組織培養）中で
増殖する細胞系（セルライン）からも産生される１種の
リンホカインである。
【０００３】リンホトキシンは免疫系の調節に関与して
おり(1) 、腫瘍細胞の増殖をin vivo (2-7) 及びin vit
ro (8-10) の双方に於いて抑制すると報告されている。
invitro 条件では同一種から得られた細胞に対し正常
細胞よりも腫瘍細胞をより強力に抑制する(11-15) 。ま
た、リンホトキシン調製物はＵＶ又は化学的発癌物質に
より誘発される細胞形質転換を抑制することが判明した
(16-17) 。リンホトキシンのin vitro活性は後述する如
き多数の方法により検定され得る。これらの方法を適宜
利用して粗抽出物からリンホトキシンを精製する方法を
探求し得る。人間に於けるin vivo テストでも粗リンホ
トキシン調製物が腫瘍減縮に有効であることが知見され
た(5,7) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来の研究では、リン
パ球又はリンパ球由来の細胞系から調整された比較的不
純な細胞上清の画分が使用されていた。多数の研究所が
精製形のリンホトキシンの製造に着手したが顕著な成功
は得られなかった(18-24) 。本発明によって初めて哺乳
類の抗腫瘍剤として有用なヒトリンホトキシンタンパク
の均質調製物が提供される。
【０００５】１つの角度から見た本発明の目的は、ヒト
リンホトキシン自体並びにリンホトキシンの天然及び天
然に等しい薬剤的に許容し得る塩及び薬剤的に許容し得
る誘導体を実質的に均質な形状で提供することである。
均質性なる用語は、従来の定義で使用されておりヒト由
来の他のタンパクが実質的に存在しないという意味をも
含む。更にＮ−末端のアミノ酸配列によってヒトリンホ
トキシンの特性決定が行なわれる。
【０００６】本発明は更に、前記リンホトキシンを含有
する薬剤組成物及び該薬剤組成物を抗腫瘍剤として投与
するために使用する方法に係る。
【０００７】別の角度から見た本発明の目的は均質なヒ
トリンホトキシンの製法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
Ａ．定義及び略号 リンホトキシン中のアミノ酸の配列は、標準ＩＵＰＡＣ
によるアミノ酸“残基”を示す３文字略号によって示さ
れる。“残基”はアミノ酸配列内での機能的意味を有す
る。配列の本体部では残基及びその略号は１つのＮ−水
素及びカルボキシルの−ＯＨが除去されたアミノ酸を示
す。末端位置では残基は適当な水素又は水酸基を含むと
理解される。従って、Ａｌａ1 −Ａｌａ2 −Ａｌａ3 な
る配列に於いてＡｌａ1 は
【０００９】
【化１】
【００１０】Ａｌａ2 は
【００１１】
【化２】
【００１２】Ａｌａ3 は
【００１３】
【化３】
【００１４】を示す。
【００１５】本文中のキラルなアミノ酸残基は全て、特
に注釈が無ければ天然配置又はＬ形配置である。ペブチ
ド配列は全て従来通り左側にＮ−末端、右側にＣ−末端
を有するように示される。
【００１６】“リンホトキシン”は単離ペプチド配列の
形状または複数個の該ペプチド鎖の集合体として存在し
得ると考えられる。本発明により得られた結果から三量
体の存在も推定される。更に或る種の条件下では別の集
合体も存在するかも知れない。本文中の“リンホトキシ
ン”なる用語は、ペプチド単鎖及び生物学的に活性の該
単鎖集合体の双方を包含する。
【００１７】本文中の“ペプチド”及び“タンパク”な
る用語は互換的に使用されており、いずれもアミノ酸重
合体を意味する。タンパクが大きくペプチドが小さいと
いう従来のサイズによる区別は採用しなかった。理由
は、両者間の境界に関する定説が十分に確立していない
ためである。
【００１８】“アミノ酸残基”とは通常、タンパク中の
20種のコードアミノ酸の１種から誘導された前記に定義
の残基を意味する。しかしながら該残基は、後述の如き
誘導体を形成すべく修飾され得る。
【００１９】本文中の“塩”なる用語は、ポリペプチド
鎖のカルボキシル基の塩及びポリペプチド鎖のアミノ基
の酸付加塩の双方を意味する。
【００２０】カルボキシル基の塩はそれ自体公知の手段
により無機又は有機の塩基と共に形成され得る。無機塩
は例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又
は亜鉛等の塩を含む。有機塩基との塩は例えばアミン類
例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリジン、
ピペリジン、カフェイン、プロカイン（procaine）等と
共に形成された塩を含む。
【００２１】酸付加塩は例えば、塩酸もしくは硫酸の如
き無機酸との塩又は酢酸もしくはシュウ酸の如き有機酸
との塩を含む。
【００２２】残基上に側鎖として生じる官能基又はＮ−
もしくはＣ−末端基から公知手段により誘導体を製造す
ることも可能でありこれらの誘導体は（後述の如く）薬
剤的に許容され得るものである限り本発明に包含され
る。これら誘導体は例えば、カルボキシル基の脂肪族エ
ステル類、アンモニア又は第一もしくは第二アミン類と
の反応によるカルボキシル基のアミド類、アシル基（例
えばアルカノイル基又はカルボキシルアロイル(carboxy
lic aroyl)基）と共に形成されたポリペプチドのアミノ
基の誘導体たるＮ−アシル誘導体、又は、アシル基と共
に形成されたヒドロキシル基の誘導体（例えばセリル又
はトレオニル残基の誘導体）たるＯ−アシル誘導体を含
む。
【００２３】本発明に包含される塩及び誘導体の条件は
“薬剤的に許容され得る”ことである。即ち、リンホト
キシンの活性を破壊せず同時に該塩及び誘導体を含有す
る組成物を有毒性にしないことが必要である。
【００２４】使用技術に関して多数の略号が使用される
であろうが、これらはいずれも当業者に公知である。詳
細には、“ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー”
は、クロマトグラフィーカラムに充填するためのイオン
交換担体としてジエチルアミノエチルセルロースを使用
したクロマトグラフィーを意味する。高いｐＨ値のとき
カラムは陰イオン交換体でありマイナスの残基がカラム
に付着する。ｐＨを下げるか又はより好ましくはｐＨを
一定にして塩勾配を用いることによって溶出を達成し得
る。
【００２５】“ＰＡＧＥ”はポリアクリルアミドゲル上
で行なわれる電気泳動でありタンパク又はペプチドを電
荷に基いて分離する。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）をゲルに添加すると（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＳＤＳ
の表面活性の結果ペプチド又はタンパク上にサイズの関
数として均一な負電荷が得られる。その結果、分子サイ
ズに基いた分離が行なわれる。自然ＰＡＧＥ（native-P
AGE ）はＳＤＳを使用しないＰＡＧＥの使用を意味して
おりこの場合タンパクは電荷に基いて分離される。
【００２６】“等電点電気泳動”は、電極間でｐＨ勾配
が維持され各タンパクを等電点に停止即ち「フォーカ
ス」せしめる自然ＰＡＧＥの形状で行なわれる。しかし
ながら他の担体好ましくは例えばデキストラン、典型的
にはウルトロデクス Ultrodex-LKB も使用し得る。
【００２７】更に本発明にとって特に重要な別のクロマ
トグラフィー担体が使用される。レンズ豆から単離され
たレクチンたる“レンズ豆レクチン”は、ガラクトシル
残基とマンノシル残基とを有する糖タンパクを選択的に
保持し得る。糖溶液を与えて溶出が達成され得るがこの
特定担体の場合、溶液はガラクトース又はマンノースの
溶液でなければならない。
【００２８】適当な条件下で好ましくは微粒樹脂を収納
した細孔（narrow bore ）カラムを使用し分離効率を良
くするために加圧下で処理して、即ち高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によってクロマトグラフプロセ
スを実施し得る。
【００２９】濃縮及び塩除去は本発明で使用されるクロ
マトグラフ即ち分離技術を確実にするための常用の予処
理である。塩除去は例えば透析もしくはゲル濾過、又は
比較的最近開発された技術たる調節多孔ガラス（ＣＰ
Ｇ）によって行なわれ得る。
【００３０】多数のゲル濾過及び濃縮技術が使用され得
る。ある種の市販材料が特に有用である。“ペリコンPe
llicon”膜はミリポア社 Millipore Inc. ベッドフォー
ドにより製造されたポリスルホンから成るシール状材料
である。“アミコンAmicon”膜はアミコンAmiconにより
製造された同じくポリスルホンから成る同様の材料であ
る。これらの材料は小分子を透過し大分子を保持し得
る。従って、大分子を容易に通過せしめるが小分子の通
過を阻止するモレキュラーシーブと逆の作用を行なう。
ペリコン及びアミコンはいずれも所望の巨大分子構造か
ら小分子を“濾除”し得る濃縮手段として有用である。
【００３１】クロマトグラフで処理するための溶液の濃
縮の望ましい程度は主として処理実施適性に従属する。
イオン交換又は他の総イオン強度に依存する技術が使用
されるときは塩除去が必要である。これらの準備方法及
び特定の分離プロセスに於ける該準備の必要度は当業界
で十分に公知である。
【００３２】本発明に於いてリンホトキシンのソースと
して使用される細胞はリンパ球又はそのトランスホーマ
ントである。文献によればリンホトキシンは、鉱油誘導
により転化された“バッフィコート白血球”の調節物、
即ち、ゴールデンハムスター又はモルモットの腹膜白血
球（17）並びにヒトリンパ球様（lymphoid）細胞系ＲＰ
ＭＩ1788，Ｂ−21及びＭＯＬＴ（25）の如きリンパ芽球
の調製物中に存在する。
【００３３】“特異的活性”とは、サンプル中のタンパ
ク重量に関する標準リンホトキシンアッセイに於けるタ
ンパクの活性を意味する。公知の開示に説明されている
如くリンホトキシン活性は、後述のアッセイプロセスに
よって目標細胞の50％溶解を生起するのに必要なリンホ
トキシンの量を示す“ユニット”に換算して測定され
る。いくつかの標準アッセイプロセスの使用が可能であ
る。本文中に詳細に説明するアッセイプロセスはマウス
線維芽細胞の溶解を媒介する能力に基づく検定であり該
能力は染色能力として測定される。
【００３４】付加的プロセスは、三重水素化チミジンで
標識されたネズミのアルファ−Ｌ−929 −線維芽細胞、
リンホトキシン感受性細胞株（26）からトリチウムを放
出させる処理を含む。特異的活性を定義すべく使用され
る“ユニット”は、測定されるmgタンパクと同じくアッ
セイプロセス次第で変化するかも知れない。本文中で定
義される“特異的活性”はユニット／mgタンパクであ
り、この場合“ユニット”は後述のアッセイにより測定
されmgタンパクはブラッドフォードBradfordの方法（後
出）により測定される。
【００３５】本発明方法により製造されたリンホトキシ
ンに関する“不純物”は、正常組織細胞環境中又は粗抽
出物、濾過物もしくは遠心物中でリンホトキシンに混雑
した物質を意味する。
【００３６】Ｂ．精製プロセスの好ましい実施態様 均質リンホトキシンの全製造プロセスが図１に要約され
ており、該プロセスの好ましい実施態様の１例を以下に
説明する。
【００３７】(1) 組織培養及び採取 ヒトリンパ芽球様（lymphoblastoid）細胞系ＲＰＭＩ17
88をＡＴＣＣ（No.CCL156）から入手し、アービン・サ
イエンティフィック Irvine Scientific、サンタアナ、
カリフォルニアから得た 400mlのＲＰＭＩ−1640培地に
於いて種(seed)カルチャーを増殖させた。該培地は10mM
HEPESと５％の仔牛胎児血清とを含んでおり、培地１ml
当り 6×104 細胞／mlの濃度で細胞が接種されていた。
培地 400mlの増殖に２ｌのローラボトルを使用した。37
℃で５日間維持しカルチャーの細胞濃度が 2×106 /ml
に到達したとき細胞を採取し血清を含まないＲＰＭＩ−
1640培地で２回洗浄した。次に、10mMのHEPES と１％の
ペニシリン−ストレプトマイシンとを含んでおり血清を
含まないＲＰＭＩ−1640培地に 5×105 細胞／mlの濃度
で細胞を移植した（該培地は血清を含まないので汚染タ
ンパク量が減少しリンホトキシンの精製を助ける）。40
0ml の細胞懸濁液を２ｌのローラボトル並びに各々15お
よび10ｌのスピナーフラスコ（ベルコグラス社Belco Gl
ass Co.,ヴァインランド，N. J. ）に入れた。いくつか
の例では該フラスコに代えて２ｌのローラボトルを使用
した。65時間後、リンホトキシン活性を有する培地を採
取した。
【００３８】ローラボトルとスピナーフラスコとの双方
から得た細胞懸濁液をプールした。ポール・トリニティ
・マイクロ社 Pall Trinity Micro Corp.,コートラン
ド、ニューヨーク、製の３μＭのシールクリーン Sealk
leenフィルタに通して該プールから細胞菌体を除去した
（図１のステップ１）。透明濾液を更に以下の如く濃縮
し透析した（ステップ２）。
【００３９】(2) 濾液の濃縮及び透析 限界分子量（molecular weight cut-off）10,000のペリ
コンPellicon膜（ミリポア社Millipore Company 製）で
４℃にて濾液を約20倍に濃縮した。濃縮サンプルを更
に、透析用に設定した同じペリコンを使用し、ｐＨ7.8
の５mMのリン酸塩バッファに対して透析した。サンプル
の導電率が透析バッファの導電率に達したときペリコン
膜をバッファで完全に洗浄しタンパク全部を回収した。
【００４０】特異的活性を定量するために得られた濃縮
物をステップ３乃至６に従って処理しリンホトキシン活
性を検定した。
【００４１】典型的なテストによれば図１の濃縮物(1)
の特異的活性はタンパクmg当り2,000-3,000 ユニットの
オーダであることが知見された。分子サイズを測定する
ためのセファクリルSephacryl S-300 カラムクロマトグ
ラフィーは、約70,000ダルトンに単一活性ピークを生じ
た。
【００４２】(3) ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフ
ィー 濃縮物(1) をｐＨ7.8 の５mMのリン酸塩バッファで平衡
させたＤＥＡＥ−52セルロースカラムを用いるＤＥＡＥ
セルロースクロマトグラフィーで処理した（ステップ
３）。サンプルの充填後カラムを平衡バッファで洗浄し
次に 0〜0.3 Ｍの直線塩化ナトリウム勾配で溶出した。
【００４３】前記に定義したような特異的活性を最も多
く有する画分を選択することによって活性画分を同定し
た。急峻な単一活性ピークが図２に示す如く約 0.1Ｍの
ＮａＣｌで溶出した。典型的には図１の活性画分(1) は
タンパクmg当り 20,000-30,000ユニットのオーダの特異
的活性を有していた。これは10倍の精製に相当する。
【００４４】(4) 等電点電気泳動 次に限界分子量10,000(PM-10) の膜を備えたアミコンAm
icon撹拌槽を使用して活性画分を濃縮した（図１のステ
ップ４）。
【００４５】濃縮物(II)を2.5mM のトリスTris及び20mM
のグリシン、ｐＨ8.2 、に対して透析しｐＨ５−８の範
囲の両性電界質担体アンフォリンAmpholine を含むデキ
ストラン平坦層(Ultrodex-LKB)に流した（ステップ
５）。プレパラティブ（調製用）等電点電気泳動に使用
した基本装置はＬＫＢ（2117 Multiphor) の製品であっ
た。ｐＨ勾配を形成する前にサンプルをゲル層全体と混
同した。ゲル層の両側に電極片を配置し８Ｗの一定電力
を用い８℃で15-20 時間に亘りゲル層の長手方向に沿っ
た電気泳動を継続した。分割グリッドでゲル層を分割し
各部分をスパーテルで取出すことによって集束ゾーン(f
ocused zone)を収集した。50mMの炭酸水素アンモニウム
を使用する複数の小型使い捨てカラムに於いて各ゲル部
分からのタンパクの溶出を行なった。溶出画分について
280nm での吸光度、リンホトキシン活性及びｐＨを測定
した。
【００４６】図３は、得られた活性、タンパク及びｐＨ
の変化曲線（プロフィル）を示す。タンパクはゲル層全
体に拡散しているが塩基性ｐＨ領域に比較して酸性ｐＨ
領域により多くのタンパク汚染物が観察される。リンホ
トキシン活性はｐＨ5.5 乃至6.5 の範囲に拡散してい
た。アンフォリンが存在するので活性画分のタンパク濃
度の正確な定量は難しく、従って、等電点電気泳動ステ
ップで得られた精製の程度を算定することはできなかっ
た。しかしながらこのステップで得られた活性の回収は
かなり定量的であった。
【００４７】(5) レンズ豆レクチンクロマトグラフィ
ー リンホトキシン活性を含む等電点電気泳動溶出液のプー
ルをｐＨ7.8 の10mMのリン酸塩バッファで平衡させたレ
ンズ豆レクチン(Pharmacia) カラムで処理した（ステッ
プ６）。サンプルの充填後カラムを平衡バッファで洗浄
し次に10mMのリン酸塩バッファを溶媒とする50mM又は10
0mM のアルファーメチルマンノシド（αＭＭ）の溶液で
溶出した。得られた結果を図４に示す。リンホトキシン
活性が無いタンパクの95％より多くが最初にカラムで濾
過され、カラム平衡バッファ（10mMのリン酸塩バッフ
ァ、ｐＨ7.8 ）で洗浄しても活性が溶出しなかった。カ
ラムを50-100mMのアルファーメチルマンノシドに接触さ
せると殆どタンパクを含まない高い活性ピークが溶出し
た。このステップで90％より多い活性ユニットが回収さ
れた。活性画分は10乃至100 ミリオンユニット／mgのオ
ーダの特異的活性を有していた。
【００４８】Ｃ. 精製リンホトキシンの特性決定 レンズ豆レクチンカラムから溶出した活性画分を更に以
下の技術で分析し以下の如く特性を決定した。
【００４９】(1) ゲル透過 ゲル透過クロマトグラフィーは（図５に示す如く）64,0
00ダルトンに単一ピークを示した。レンズ豆レクチンカ
ラムから得た活性画分を、ＮａＣｌ 0.5Ｍを含有する10
mMのリン酸塩バッファを溶出溶媒として予め平衡させた
セファデックスSephadex Ｇ-100カラム（ファルマシア
・ファイン・ケミカルPharmacia Fine Chemicals, ピス
キャタウェー、Ｎ．Ｊ．）で処理した。溶出パターンを
牛血清アルブミン（BSA)、卵アルブミン(OA)、炭酸脱水
酵素(CA)及びダイズトリプシン阻害剤(STI）と比較し
た。64,000ダルトンの範囲のリンホトキシン(HLT) の溶
出は、以下の結果から明らかな如く個々のペプチドの集
合を示す。
【００５０】(2) ＨＰＬＣクロマトグラフィー ＨＰＬＣクロマトグラフィーは図６に示す如く実質的に
均質な調製物を示した。
【００５１】レンズ豆レクチンカラムからの活性画分を
PM-10 膜を使用したアミコン撹拌槽で濃縮し、シンクロ
パックSynchropak RP-P カラム（25cm×4.1mm 、シンク
ロム社Synchrom Inc.,リンデン、インディアナ）にかけ
た。スペクトラフィジクスSpectra Physics SP8000高圧
液体クロマトグラフィーを使用し210nm 及び280nm の吸
光度で流出液をモニタした。溶出条件としては25℃で
0.1％トリフルオロ酢酸から70％のアセトニトリルを含
む 0.1％トリフルオロ酢酸までの直線勾配及び１ml／分
の流速を使用した。約50％のアセトニトリル濃度で溶出
する主タンパクピークが得られる（図６）。更に12.5％
SDS-PAGE で処理すると、該画分は分子量20,000のタン
パクを含有している。ＨＰＬＣのこの20K ピーク以外
に、43％及び51％のアセトニトリルで溶出する各々分子
量15K 及び70K の副次的ピークが存在していた。ＨＰＬ
Ｃ溶媒はリンホトキシン分子を失活させると考えられる
ので20,000分子量バンドの活性を定量することはできな
かった。
【００５２】(3) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによればタンパクの大部分は約20,000
ダルトンの推定サイズに適合していた（図７）。図８に
示す如くリンホトキシン活性はこの20,000ダルトンの画
分に対応していた。レムリLaemmli 等の方法(27)により
濃度12.5乃至15％の分析用アクリルアミドゲルを使用し
てＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。該方法は引用によって
本文中に包含される。
【００５３】(4) 自然ＰＡＧＥ 自然ＰＡＧＥの場合にも、以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
定量すると約20,000ＭＷのピークが生じた。
【００５４】レンズ豆レクチンカラムからの活性画分を
レムリ等の自然ＰＡＧＥプロセス(27)に少し変更を加え
たプロセスで処理した。（厚み 1.5乃至4mm の）調製用
ゲルと（厚み0.75mmの）分析用ゲルとは、ゲル分析用の
7.5％のアクリルアミドとゲル重層（スタッキング）用
の４％のアクリルアミドとから構成された。双方の場合
に使用された流動バッファはｐＨ6.8 の25mMのトリスで
あった。分析用ゲルは22mAの定電流で処理され調製用ゲ
ルは定温度下で100mA で処理された。
【００５５】電気泳動テストの終了時に、引用によって
本文中に包含される銀染色(28)でゲル状のタンパクを可
視化しＲｆ0.33の拡散バンドを得た。図９はこれらの結
果をより詳細に説明する。この図では、ゲルをスライス
しこれらのスライスを自然ＰＡＧＥからの50mMの炭酸ア
ンモニウムバッファ中で４℃に一晩維持して溶出を行な
うとリンホトキシン活性がＲｆ0.33のゲルスライスに対
応するという別の実験によってタンパクを定量した結果
が示されている。該ゲルスライスからの溶出液をＳＤＳ
−ＰＡＧＥカラムで処理すると、リンホトキシン活性を
有する溶出液のみが20,000ＭＷのバンドを生じた。
【００５６】(5) トリプシン消化及びペプチドの単離
による分析 精製されたリンホトキシン調製物をトリプシンＴＰＣＫ
（ウォーシントンWorthington ）で消化した。即ち、ｐ
Ｈ８の50mMの炭酸水素アンモニウムバッファ中で１部の
トリプシンと20部のタンパクとを使用し室温で24時間処
理した。断片は約15,000及び5,000 の分子量を有してい
た。
【００５７】加水分解終了後、スペクトリ・フィジクス
Spectra Physics SP-8000 クロマトグラフを使用し25℃
のリクロソープ Lichrosorb RP-18 カラム（25cm×4.6m
m 、EM reagents 、シンシナティ、オハイオ）でＨＰＬ
Ｃクロマトグラフにかけた。0.1 ％のトリフルオロ酢酸
から50％のアセトニトリルを含む 0.1％のトリフルオロ
酢酸までの直線勾配と２ml／分の流速とを用いた溶出後
に 210nmと280nm とに於いてピークを検出した。（以後
のアミノ酸配列解析のために各ピークを収集し凍結乾燥
して-20 ℃で保存した）。図10に示す如く、アセトニト
リル濃度42.3％及び48.4％に於いて夫々溶出する２つの
ピークＴ−１及びＴ−２が観察された。これらの２つの
ピークの各々の分子サイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図11）
で定量するとＴ−１では15,000、Ｔ−２では5,000 であ
った。 210nm及び280nm の双方に於いてＭＷが小さいピ
ークＴ−２の方がピークＴ−１よりも高い吸光度を示し
た。
【００５８】トリプシン加水分解の完了を確認するため
に、加水分解調製物の少量のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ20,000ダルトンバンドが検出されず15,000及び
5,000 ダルトンのバンドに代替されたことを確認した。
【００５９】更に、前記の如くトリプシン消化によって
形成された物質はリンホトキシン活性を示す。
【００６０】(6) 自動アミノ酸配列解析 トリプシンで処理しないインタクトな断片とトリプシン
消化断片との双方の配列を決定するために自動アミノ酸
配列決定技術を使用した。即ちサンプルを 0.6mlの 0.2
Ｍ酢酸に懸濁させ、４mgのポリプレンと100nM のノルロ
イシンを予め塗布しておいたベックマンBeckman 890Cシ
ーケンサのカップに懸濁液を移した。ダブリュ・コール
Ｗ．Ｋｏｈｒ等(29)に記載のプログラムに準じて１ml／
分の流速で超微小球(ultrasphere)ODS（25cm×4.6mm 、
５μＭ）カラムを使用しフェニルチオヒダネーション
（phenyl thiohydanation, PTH）アミノ酸を同定した。
該プログラムは引用により本文中に包含される。
【００６１】インタクトなタンパクとトリプシン消化断
片との双方について得られた結果を図12に示す。図12の
如く、配列中のいくつかの位置を確実に同定することは
できなかった。しかしながら15K 断片（Ｔ−１）がイン
タクトなリンホトキシンのＮ−末端部分に対応すること
を示すための十分な同定が達成された。
【００６２】前記の例は、本発明を限定するものではな
く本発明を説明するためのものである。出発物質として
別の細胞系を使用すること及び透過のクロマトグラフ方
法を使用することはいずれも可能である。レンズ豆レク
チンクロマトグラフィーの使用によって最高度の精製が
達成されると判断される。従って当該ステップを含んで
さえいれば、準備ステップはかなり任意に選択すること
ができる。リンホトキシンの単離プロセスに於いてレン
ズ豆レクチンはこれまで使用されていなかった。しかし
ながら、前記の如き一貫プロセスの結果、実質的に純粋
なタンパクが得られる。
【００６３】Ｄ．リンホトキシン活性の決定プロセス スポフォードSpofford(30)の細胞溶解アッセイに変更を
加えた方法を用い精製中のリンホトキシン活性をモニタ
した。該アッセイは引用によって本文中に包含される。
要約すればマイトマイシンＣを存在させたマイクロタイ
タープレートでマウスＬ−929 線維芽細胞を増殖させ
た。12-18 時間後に、順次希釈したリンホトキシン検定
用サンプル0.125ml を各ウエルに添加した。48時間後、
プレートを洗浄し、リンホトキシンにより誘発された細
胞の溶解をプレートに付着した細胞として検出するため
に、１％のクリスタルバイオレットを含むメタノール：
水溶液（容量比１：４）でプレートを染色した。染色の
濃さを肉眼及び分光側光により観察した。後者は、ダイ
ナテックDynatechスペクトロホトメータを使用し450nm
及び570nm 透過の吸光度にて行なわれた。培地のみを含
むマイクロタイターウエルに塗抹された細胞を溶解０％
に設定し、３Ｍの塩酸グアニジン溶液が含まれた場合を
溶解 100％の終点とした。各ウエルに塗抹された12,000
の細胞の50％を溶解させるに必要なリンホトキシンの量
を１ユニットと定義する。
【００６４】Ｅ．タンパクの定量 精製中のタンパク濃度をブラッドフォードBradford(31)
の方法によって測定した。該方法は引用によって本文中
に包含される。要約すれば0.8ml の被検定サンプルをBi
o-Rad Labs、リッチモンド、カリフォルニアの試薬濃縮
溶液0.2ml と混合した。パーキンエルマーPerkin Elmer
スペクトロホトメータModel55Bを使用し反応混合物を59
5nm で測定した。該アッセイは牛血清アルブミン2-20μ
ｇの間で直線状であった。更に最終精製段階中には、28
0nm 及び206nm に於ける吸光度から又はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルの銀染色からタンパクのおよその推定
量を得た。該推定量は最終的にタンパク配列決定サイク
ルの各々に於いて現われた種々のアミノ酸残基のナノモ
ルによって確認された。
【００６５】Ｆ．効用及び用量用法 リンホトキシン又はその塩又はその誘導体又はその活性
成分は、抗腫瘍活性を示す薬剤に許容されたいかなる用
法で投与されてもよい。これらの用法として経口投与、
非経口投与もしくは局所投与及びその他の全身性用法が
ある。局所注射又は静脈注射が好ましい。活性成分は例
えば活性であることが判明しているリンホトキシンのト
リプシン消化物をも含む。このような消化物がこの種の
この目的の薬剤組成物の活性成分として使用できない理
由は存在しない。
【００６６】所望の用法次第で組成物は個体、半個体又
は液体の剤形、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散薬、
液薬、懸濁液等の形状で使用され得る。好ましくは毎回
正確な用量を投与するのに適した単位用量の剤形で使用
され得る。組成物は従来の薬剤担体又は賦形剤とリンホ
トキシン又は薬剤的に許容され得るその塩もしくは誘導
体とを含有しており更に別の薬物、薬剤、担体、アジュ
バント等を含有し得る。前記の如き賦形剤は、別のタン
パク例えばヒト血清アルブミン又は血漿製剤を含み得
る。
【００６７】活性化合物の投与量は勿論、治療される患
者、病状の程度、投与方式及び担当医師の判断等に左右
されるであろう。しかしながら有効用量は 0.007乃至７
ng／kg／日の範囲であり、好ましくは0.07乃至 0.7ng／
kg／日である。
【００６８】固体組成物用の従来の無毒性固体担体とし
ては例えば、薬剤グレードのマンニトール、乳糖デンプ
ン又はステアリン酸マグネシウムがある。薬剤として投
与可能な液体組成物は、例えば、前記の如きリンホトキ
シンと任意の薬剤アジュバントとを例えば水、生理食塩
水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等
の如き担体に例えば溶解又は分散させ溶液又は懸濁液を
得ることによって調製され得る。投与される薬剤組成物
は所望に応じて更に、少量の無毒性補助物質例えば湿潤
剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウム又は
モノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。前記の如き剤
形の実際の調製方法は、例えばレミントンズ・ファーマ
シューティカル・サイエンス Remington′s Pharmaceu
tical Sciences，マック・パプリッシング・カンパニー
Mack Publishing Company, イーストン，ペンシルヴァ
ニア，15版，1975年，の参照により当業者に公知又は明
白であろう。いずれにしても、投与される組成物即ち配
合物は、治療される患者の症状を軽減すべく有効量のリ
ンホトキシンを含有するであろう。
【００６９】Ｇ．参考文献 添付の文献目録及び本文中の参考文献は、本発明の理解
を助けるために引用されたものである。従って引用事項
は本文中に包含される。
【００７０】文献目録 １．Evans,Cancer Immunology and Immunotherapy 12,
181 (1982)。
【００７１】２．Holterman, O.A., et al. “Studies
on local administration of materials with lymphoki
ne activity to neoplasms involving the skin.” In
M.A. Fink (ed) The macorphase in neoplasia. pp 259
-261, Academic Press, New York (1976) 。
【００７２】３．May-Levin, F., et al. Schweiz.Med.
Wsch, 102:1188 (1972)。
【００７３】４．Papermaster, B.W., et al. Res.Com
m. Chem. Pah. Pharmacol, 8:413 (1974)。
【００７４】５．Papermaster, B.W., et al. Clin.Imm
unol Immunopathol, 5:31 (1976)。
【００７５】６．Papermaster, B.W., et al. Ann. N.
Y. Acad. Sci, 332:451 (1979) 。
【００７６】７．Khan, A., et al. Hematology and On
cology, 11:128A (1981)。
【００７７】８．Gately, M.K., et al. Immunol, 27:B
2 (1976)。
【００７８】９．Rosenberg, S.A., et al. J.Immunol,
110:1623 (1973)。
【００７９】10．Swada, J.I., et al. Jap. J. Med.,
46:263 (1976) 。
【００８０】11．Williams, T.W., et al. Cell Immuno
l, 6:171 (1973) 。
【００８１】12．Evans, C.H., et al. Cancer Res., 3
5:1035 (1975) 。
【００８２】13．Meltzer, M.S., et al. J. Nat. Canc
er Inst., 49:1439 (1972)。
【００８３】14．Rundell, J.O., et al. Immunopharma
cology, 3:9 (1981)。
【００８４】15．Weedon, D.D., et al. Mayo Clinic P
ro., 48:556 (1973)。
【００８５】16．Evans, C.H., et al. Cancer Res., 3
7:898 (1977)。
【００８６】17．Evans, C.H., et al. Int. J.Cancer,
27:45 (1981) 。
【００８７】18．Klostergaard, J., et al. Immunol,
18:1049 (1981)。
【００８８】19．Klostergaard, J., et al. Mol. Immu
nol, 18:455 (1981)。
【００８９】20．Pitchyangkil, et al. J. of Clinic
al Hematology and Oncology 11, 19A(1981)。
【００９０】21．Amino, N., et al. J.Immunol, 113:1
334 (1974)。
【００９１】22．Russell, S.W., et al. J. Immunol,
109:784 (1972)。
【００９２】23．Fuhrer, J.P., et al. “Biological
ly active Syrian hamster lymphotoxin isolated in h
igh yield on a Waters I-125 Protein HPLC column.”
(1982)In International symptons on HPLC of Protein
s and peptides held in Washington, D.C. -November
16-17th, 1981 。
【００９３】24．Klostergaard, J., et al. Mol. Immu
nol, 17:613 (1980)。
【００９４】25．Lisafeld, et al. Int.Archs. Allerg
y Appl. Immun., 62:59 (1980)。
【００９５】26．Heffes, et al. J. Immunol, 14:64
(1975) 。
【００９６】27．Laemmli U.K., et al. Nature, 227:
680 (1970)。
【００９７】28．Merril, C.R., et al. Anal Biochem,
110:201 (1981) 。
【００９８】29．Kohr, W., et al. Anal Biochem (in
press)。
【００９９】30．Spofford, B., et al. J. Immunol, 1
12:2111 (1974)。
【０１００】31．Bradford, N.M., et al. Anal Broche
m, 72:248 (1976)。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従って行なわれるリンホトキシン精製
の好ましい具体例の概略説明図である。
【図２】０〜0.3 Ｍ ＮａＣｌ勾配を使用したＤＥＡＥ
セルロース（ＤＥ−52）精製ステップで得られた溶出パ
ターンの説明図であり、活性が約 0.1Ｍで溶出し多量の
タンパクは保持されていることを示す図である。
【図３】典型的調製物に於いて得られた等電点電気泳動
パターン図である。
【図４】レンズ豆レクチン精製ステップで得られた溶出
パターン図であり、リンホトキシン溶出以前にリンホト
キシン活性を持たない全タンパクの95％より多くがカラ
ムにより濾過されることを示す図である。
【図５】Sephadex G-100からのリンホトキシン活性の溶
出プロフィルを示す図であり、挿入図は分子量既知のタ
ンパクたるダイズトリプシン阻害剤と炭酸脱水酵素と卵
白アルブミンと牛血清アルブミンとを使用した較正曲線
を示しており、最大サイズの決定にはブルーデキストラ
ンが使用された図である。
【図６】レンズ豆レクチンカラムから得られた精製リン
ホトキシン画分の分析に使用されたＨＰＬＣの結果を示
す図である。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたレンズ豆レ
クチン活性画分のサイズ分布の図であり、図５のゲル濾
過ステップから得た20Ｋ画分を用いた標準も含まれてい
る図である。
【図８】図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥからのリンホトキシン
活性の溶出プロフィルであり上部画面は図７のカラムＣ
のゲルを使用した結果を示しており、下部画面はバッフ
ァのみを使用した対照（図７のカラムＥ）を示しており
ダイフロント(dye front) に対応するアーチファクトで
あると考えられる僅かな活性が示された図である。
【図９ａ】精製リンホトキシニンの自然ＰＡＧＥにより
得られたＲｆ0.33画分の活性を示した図である。
【図９ｂ】精製リンホトキシニンの自然ＰＡＧＥにより
得られたＲｆ0.33画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を
示す図であり、上部画面は、スライスのサイズを示し、
下部画面は、精製リンホトキシンの自然ＰＡＧＥ処理後
のゲルスライスのオリジンを示した図である。
【図１０】均質リンホトキシンのトリプシン消化物のＨ
ＰＬＣ溶出パターン図である。
【図１１】図１０の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量分析
を示す図である。
【図１２】精製リンホトキシンのトリプシン消化物から
得た断片のアミノ酸配列決定の結果を示すヒトリンホト
キシンの部分的アミノ酸配列の図である。

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲ
    ル上で１つのバンドとして、分子量約２０，０００の位
    置に泳動し、 ｂ）実質的に不純物を含まず、 ｃ）ポリペプチド中の１つを超える部位で、トリプシン
    加水分解に感受性であり、 ｄ）部分アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
    −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
    Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇ
    ｌｎ−Ａｓｎ−及びＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
    Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−を含むこと
    を特徴とするポリペプチドであるヒトリンホトキシン。
  2. 【請求項２】 １０×１０6 ユニット／ｍｇより大きい
    比活性を有することを特徴とする請求項１に記載のヒト
    リンホトキシン。
  3. 【請求項３】 １００×１０6 ユニット／ｍｇより大き
    い比活性を有することを特徴とする請求項２に記載のヒ
    トリンホトキシン。
  4. 【請求項４】 ヒトリンホトキシンの標準アッセイに於
    いて活性を有することを特徴とする請求項１に記載のヒ
    トリンホトキシン。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59141519A (ja) * 1983-01-31 1984-08-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 制ガン作用を有する蛋白質
GB8330969D0 (en) * 1983-11-21 1983-12-29 Wellcome Found Promoting healing
DE3574710D1 (de) * 1984-04-13 1990-01-18 Litton Bionetics Inc Leukoregulin, ein antitumor-lymphokin und dessen verwendung als heilmittel.
US4708948A (en) * 1984-04-20 1987-11-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substantially purified tumor growth inhibitory factor
JPS60243018A (ja) * 1984-05-17 1985-12-03 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd ヒト内来性癌制御因子
US5683688A (en) 1984-05-31 1997-11-04 Genentech, Inc. Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions
NZ212207A (en) * 1984-05-31 1991-07-26 Genentech Inc Recombinant lymphotoxin
US5672347A (en) * 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US6686455B1 (en) 1984-07-05 2004-02-03 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor
JPS6124520A (ja) * 1984-07-12 1986-02-03 Takeshi Makitsubo 腫瘍壊死因子様物質を抽出する方法
JPS6156131A (ja) * 1984-07-17 1986-03-20 Takeshi Makitsubo 腫瘍壊死因子様物質
EP0178050A1 (en) * 1984-08-13 1986-04-16 The Wellcome Foundation Limited Proteinaceous substance
US5840522A (en) * 1984-09-20 1998-11-24 Chiron Corporation Recombinant lectins
US4708937A (en) * 1984-10-15 1987-11-24 Brigham & Women's Hospital Purified migration inhibitory factor also having colony stimulating factor activity
US4677064A (en) * 1984-11-09 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US5019385A (en) * 1984-11-09 1991-05-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same
PT81823B (pt) * 1985-01-14 1987-11-30 Yamanouchi Pharma Co Ltd Metodo de preparacao de factores endogenos humanos reguladores de cancro
US6084073A (en) * 1985-03-25 2000-07-04 Chiron Corporation Recombinant ricin toxin
EP0205038A1 (en) * 1985-05-29 1986-12-17 Suntory Limited Polypeptide, process for preparing it, microorganism and pharmaceutical use
JPH0631318B2 (ja) * 1985-09-18 1994-04-27 株式会社林原生物化学研究所 新リンホカインｉｉｉとその製法
JPS62298536A (ja) * 1986-06-17 1987-12-25 Green Cross Corp:The 生理活性物質の自動精製方法および自動精製装置
DE3907244A1 (de) * 1989-03-07 1990-09-13 Knoll Ag Erzeugnisse, enthaltend ein lithiumsalz und einen tumor-nekrose-faktor

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Publication number Publication date
JPH0716435B2 (ja) 1995-03-01
EP0100641B1 (en) 1988-07-20
CA1241597A (en) 1988-09-06
ATE35827T1 (de) 1988-08-15
DK348083A (da) 1984-01-31
AU573531B2 (en) 1988-06-16
DK348083D0 (da) 1983-07-29
IE55553B1 (en) 1990-10-24
DE3377421D1 (en) 1988-08-25
AU1723983A (en) 1984-02-02
DK170713B1 (da) 1995-12-18
EP0100641A3 (en) 1984-05-02
IE831786L (en) 1984-01-30
JPS5984827A (ja) 1984-05-16
ZA834976B (en) 1984-08-29
JPH07188295A (ja) 1995-07-25
EP0100641A2 (en) 1984-02-15

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