JPH01308300A - ヘパリン結合性脳ミトゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、脈管形成を促進すると信しられ、それゆえ、
傷の治癒、骨の治癒および火傷の処置において有用であ
る新規な１群の蛋白質成長因子に関する。これ゛らの蛋
白質は、内皮細胞にお！する有糸分裂生、起を誘発し、
そして、それら自体、内皮ｉ胞のための成長因子である
と考えることがてきる。これらの蛋白質は、また、組織
、とくに神経組織の形成、維持および修復を促進すると
信しられる。　゛ これらの蛋白質は脳細胞から分離され、そして各々ヘパ
リン結合性脳ミトゲン（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉ１
］ｇＩ＋ｒａｉｎ　　＋ｎｉｔｏｇｅｎ）　　（ＨＢＢ
Ｍ）と呼ぶことができる。これらの蛋白質は一本鎖てあ
り、そして高度に塩基性である。３種類のこのような蛋
白質はウシ脳から分離され、そしてＨＢ　Ｂ　Ｍ−，１
、ＨＢＢＭ−２およびＨＢ　Ｂ　Ｍ　−３と表示され、
それぞれ、］８．１６および１５ｋＤの分子量を有する
。これらの蛋白質は、他の既知の蛋白質のそれと異なる
共通の１９アミノ酸の゛Ｎ−末端配列を有する。

同一の３種類のＨＢＢＭは、また、ヒト脳組織から分離
され、そしてウシＨＢ　Ｂ　ｌ■と同一のＮ−末端配列
および同一タイプの有糸分裂生起活性を有する。ラット
およびニワ１〜りの脳は、また、Ｉ−ＩＢＢＭする発見
された。

これらの蛋白質は、脳組織から、組織からの抽出、ヘパ
リン親和クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマ
トグラフィーを包含する工程の組み合わせによって、分
離および精製される。疎水性相互作用クロマトグラフィ
ーを精製の補助方法として使用するこ１とがてきる。

最近、多数の蛋白質成長因子が分離され、そして神徴づ
けられてきている。これらの成長因子は、表皮成長因子
、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、トラン
スフォーミング（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｌｌｇ）成長因
子、血小板誘導成長因子およびインターリューキンを包
含する。例えば、線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦＪ）は
、最初に、ゴスボタロウイス（Ｇ　ｏｓｐｏｄａｒｏａ
＋　ｉ　ｃｚ　）によって１９７５年にウシ下垂体から
精製され、そして１３，３００ダルトンの推定分子量を
有した（参考文献１）。

ＦＧ’Ｆは後にウシ脳から゛精製された（２）。ＦＧＦ
は、用いる分離手順Ｃ３，４）に依存して、酸性の形態
（’ｒａＦＧＦｊ）または塩基性の形態〈「１）ＦＧＦ
」）で分離することができる。ウシ下垂体ウシＩＩＦＧ
Ｆ（５）およびウシおよびヒト脳ａＦＧＦ（６，７）に
ついての完全なアミノ酸配列は、ウシおよびヒト脳ｂＦ
ＧＦ（５）についてのＮ−末端配列と一緒に、発表され
た。ウシ下垂体およびウシ脳ｂＦＧＦについてのＮ−末
端配列は同一である（５．８）。

今回、ＦＧＦを脳組織か゛らへ′パリンーセ゛ファロー
ス（Ｓ’ｅｐｈａｒｏ’ｓｅ　）親和クロマトグラフィ
ー′（９，１０）を使用して精製するとき、有意な量の
未知の蛋白質か、また、存在しうろことが発見された。

ヘパリンに対してとくに高い親和性で結合する蛋白質ζ
Ｊ稀であるので、これらの未知の蛋白質についてさらに
研究した。この研究において、これらの蛋白質はＨＢ　
’Ｂ　Ｍであること明らかになり、これらのＩ−Ｉ　Ｂ
　Ｂ　Ｍ　＋、ｔ　Ｎ−末端配列およびアミノ酸組成に
おいてＦＧＦと異なる。

したがって、本発明の１つの目的は、脳組織からＨＢＢ
Ｍを分離し、精製し、そして特性づけることである。本
発明の他の目的は、ＨＢ　Ｂ　Ｍの生理学的活性を確立
することである。

本発明の新規な成長因子は、−本鎖の塩基性のヘパリン
結合性脳ミトゲンである。ＨＢ　Ｂ　Ｍは、ヒト、ウシ
、ラットおよびニワトリを包含する、試験したすべての
種の脳組織において同定された。

この分布に基づいて、他の′種もＨ１Ｂ”Ｂ’Ｍを含有
することが予測される。

ＨＢ　Ｂ　ＭのＮ−末端配列は、ウシまたはヒト脳ａＦ
ＧＦおよびｂＦＧ’Ｆ’について発表されたもの（５，
６，７）と顕著に異なる。最初の１９アミノ酸のＮ−末
端配列はヒトおよびウシのＨＢＢＭについて同一である
ことが発見された。Ｎ−末端配列は次の通りである：　
Ｇ　Ｉｙ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ”Ｖａｌ−Ｌｙｓ　−
Ｌｙ’ｓ　−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ｔｒｐ−ＧＩｎ。ラットの配列は位置１５におけるシ
スティン残基を除外して同一である。なぜなら、システ
インの存在または不存在の決定は実施しなかったがらで
ある。しかしながら、位置１５において他のアミノ酸が
同定されなかったという事実は、システィンの推測した
存在と一致する。今日まで、ニワトリのＨ１３８，Ｍの
Ｎ−末端残基（」配列決定されている。それらはヒト、
ウシおよびラットの１−（ＢＢ　Ｍと同一である。

Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｂ　Ｍは、ウシ脳がらの組織において３つ
の形態て発見された。ＨＢ　Ｂ　Ｍ　−１、ＨＢＢＭ−
２およびＨＢ　Ｂ　Ｍ　−’　３は、それぞれ、１８．
１６および］５ｋＤの分子量を有する。それらのアミノ
酸組成は下表１に記載されており、そして、またウジ脳
Ｆ　”Ｇ　Ｆのアミノ酸組成（５，６，７）と異なる。

分子量および同一のＮ−末端配列に基づいて、３つのＨ
Ｉ：Ｉ　Ｂ　Ｍは多分それらのＣ−末端において異なる
と結論される。入手可能なテークは、ＨＢＢＭ−２およ
びＨＢ、Ｂ　Ｍ’−３力月（Ｂ　Ｂ　Ｍ　−１のＣ−末
端で切頭された形！ぷであり、それぞれ、はぼ］３およ
び１９のアミノ酸が欠けていることを示唆する。

３つの形態の比は異なる分離バッチにおいて変化するこ
とがわかった。しかしながら、平均すると、定量的アミ
ノ酸分析に基づいて、ＨＢＢＭの全体の分離の収量は、
ＨＢ’ＢＭ＝１、ＨＢＢＭ−２およびＨＢ　Ｂ　’Ｍ　
−３について、それぞれ、はぼ３０．１０および４０μ
ｇ／ｋｇ脳組織であると推定された。組織の抽出の間の
蛋白質分解は、ＨＢ１３Ｍの形態の最大のＴ−（ＢＢＭ
−１のカルボキシ−末端の切頭を生じ、これにより変化
量でＨＢＢＭ−２およびＨＢ’　Ｂ　Ｍ　二３が生成す
るであろう。

本発明の新規なＨ，ＢＢＭを実質的に純粋な形態で脳組
織の源から分離する方法は、工程：（、）源の組織から
の抽出、 （１〕）第１カチオン交換クロマトグラフィー、（、ｅ
）ヘパリン親和クロマトグラフィー、（ｄ）第２カチオ
ン交換クロマ１〜グラフイー、および （ｅ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、の順序・か
らなる。

＝７− 抽出は、組織を順次に０．１５モルの硫酸アンモニウム
で処理し、塩酸でｐＨ４，５に調節し、撹拌および遠心
し、水酸化す１〜リウムでｐＩ−Ｔを６〜６　うに調節
した後、硫酸アンモニウムて処理し、撹拌および遠心し
、次いで透析および遠心することによって達成される。

第１カチオン交換クロマトグラフィーの工程は、カルボ
キシメチル−セファデックスのカラム上にバッチ吸着し
、次いで１．００ミリモル（ｍ　Ｍ　’）のリン酸ナト
リウム緩衝液でｐＨ□において洗浄し、そして゛１００
ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６、０／’０　、６
モルのＮ’ａＣ而溶離面ることからなる。

ム、バリン親和クロマトグラフィーは、ヘパリン−セフ
ァロース［ファーマシア（Ｐ’ｌ＋ａ−ｒｍａｃ　ｉａ
　）　’］カラノ＼て、１０ミリモルあトリス−１ｒ−
＋　’ｃ　ｉ、ｐ’　Ｈ７。

０１０６モルのＮａＣｌｐＨを含有するＭ衝液で洗浄し
、１０ミリモルのトリス”−Ｈ’ｃ　’＋、ｐＨ７。

０中の０６モルから２．０モルのＮａＣｌの直線の勾配
で溶離することによって実施する。

第２カチオン交換クロマトグラフィーの工程は、５０ミ
リモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，’８で平衡化した
モノ−８（ファーマシア）カラムを使用し、そして、試
料の適用後、５０ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６
，’８で洗浄し、次いで５０ミリモルのリン酸ナトリウ
ム、ｐ１Ｍ６．８中の０〜０．６モルのＮａＣｌの直線
の勾配でＨＢＢＭを溶離することによって実施する。

疎水性相互作用クロマトグラフィ゛−の工程は、１００
ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０および１８５
モルの硫酸ナトリウムの緩衝液でＨＩＣカラム［ＬＫＢ
　　ウルトラバク（”Ｕ　ｌ　ｔｒｏｐａｃ　）−’Ｉ
”　Ｓ　Ｋ−フェニル−５’ＰＷコを予備平衡化゛し、
次いで１５〜０．６モルの硫酸ナトリウムの直線の勾配
で溶離することからなる。

Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｂ　Ｍは逆相ＨＰＬＣによって容易かつ定
量的にＦＧＦから分離することができるが、この手順は
、逆相ＨＰＬＣにおいて使用する案件のため、Ｆ　’　
Ｇ’　Ｆの生物学的活性を減少させる。したがって、比
較試験のためＨ’　Ｂ　Ｂ　ＭおよびＦ　ｃｊ　Ｆを生
物学的□に活性な形態て分離および単離するために、上
に記載した方法が開発された。逆相ＨＰＬＣの使用は、
ヘパリン−セファロース親和クロマトグラフィーおよび
カチオン交換クロマトグラフィーからの分画の小さいア
リコートをＨＢＢＭおよびＦＧＦの存在について試験す
ることに限定される。逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃの工、程は、０
４カラム［ザ・セパレイティング、グループ（′ｒＩＩ
（！　　ＳｅｐａｒａｔｉｎｇＧｒｏｕｐ）コて実施し
、０．１％のテトラフルオロ酢酸中のアセトニ１ヘリル
の浅い勾配で溶離した。

ＨＢＢＭの生物学的活性は、内皮細胞中の有糸分裂生起
の誘発を立証する試験によって確立された。Ｉ−Ｉ　Ｂ
　Ｂ　Ｍ　−２は試験しなかったが、ＨＢ　ＢＭ−１お
よびＨＢＢＭ−３について立証された活性はＨＢ　Ｂ　
Ｍ−２か、また、この活性を有することを示唆する。試
験はウシ大動脈弓の内皮細胞について実施した。

有糸分裂生起活性の存在を確証することおよび前記活性
がＨＢＢＭにより、Ｆ　Ｇ　Ｆによらないことを立証す
ることの両者を目的として、３種類の別の試験を実施し
た。

まず、ＨＢＢＭ−３を含有するモノ−Ｓクロマトグラフ
ィーからの溶離分画をプールし、再びモノ−Ｓカラムの
クロマトグラフィーにかけ、次いでウシ脈管内皮細胞の
増殖を刺激する能力について試験した。比較のため、ａ
　Ｆ　Ｇ　Ｆおよびｂ　Ｆ　ＧＦの試料を、また、試験
した。第５図はこの試験の結果を表わす。

次に、得られるＨＢＢＭ−３の分画を、再び、より急な
勾配およびより遅い流速を用いて、試料濃度について、
モノ−Ｓカラムのクロマトグラフィーにかけた。次いで
、Ｈ，ＢＢＭ−３を投与一応答分析においてａ　Ｆ　Ｇ
　ＦおよびｂＦＧＦと比較した。

第６図の上のパネルはこの試験の結果を表わす。

次いで、この手順をＨＢ　Ｂ　Ｍ　−１について反復し
た。これらの結果を第６図の下のパネルに表わす。

最後に、モノ−Ｓクロマトグラフィーによって濃縮した
ＨＢＢＭ−３の分画を、モノ−Ｓカラムと選択性か異な
る疎水性相互作用カラム上に配置した。第７図は、この
試験の結果を表わす。

これらの試験は、ＨＢ　Ｂ　Ｍが投与依存の方法で培養
したウシ脈管内皮細胞の増殖を刺激することを確立した
。ＥＤ５ｏは、ＨＢＢＭ−３についてほぼ２０Ｂ／ｍｌ
およびＨＢＢ−Ｍ−１についてほぼ１０００ｇ／ｎ＋１
であった。ＥＤ５ｏは次のように計算し外：　Ｅ　Ｄ　
ｓ　ｏ−濃度（ｃｏｎｃ　）　　［細胞数（投与量−〇
）」−細胞数（投与量−最大）／２］。これらのミトゲ
ンは生物学的活性においてＦ−ＧＦに匹敵し、そして高
い親和性においてヘパリンに匹敵した。ＨＢＢＭ−１お
よびＨＢＢＭ−３の各々はａＦＧＦと同し効力をもって
いる。Ｅ　Ｄ　ｓ　ｏは５０−１５０ｎｇ／ｍｌの範囲
である。

試験の結果は、また、ＨＢＢＭ〜３に関連する生物学的
活性が固有のものであり、そしてＦＧＦの汚染の結果で
ないことを明白にする。ＨＢＢＭ−３およびＦ　Ｇ　Ｆ
は、第５図に示すように、高度に分割性のモノ−Ｓクロ
マ■・グラフィーによって明瞭に分離され、そして、ま
た、第７図に示ずように、異なる選択性の第２高分割性
の技術、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって明
瞭に分離される。

そのうえ、ＨＢＢＭは、定量的逆相ＨＰＬＣによって決
定して、測定可能な量のａ、、ＦＧＦを含有しなかった
。活性がＨＢＢＭによるものであったというそれ以上の
証拠として、ＨＢＢＭはａＦＧＦ（１−１５＞およびｂ
ｌ”ＧＦ　（３０−５０）のＮ−末端１５残基に相当す
る合成ペプチドに対してレイズ（ｒａｉ　５ｅ）Ｌ、た
ポリクローナル抗体を使用するイムノ−ドツト（ｉｍｍ
ｕｎｏ−ｄ。

ｔ）アッセイにおいて交差反応しなかった。後者の自戒
ペプチドはａＦＧＦと交差反応する抗体を生成する［Ａ
、バイルド（Ｂａｉｒｄ）、ソーク・インスチチュート
（Ｓａｌｋ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）：参考文献５．７
に従う成長因子の命名］。

最後に、ＨＢＢＭおよびａＦＧＦの調製物の濃度は、効
力の比較についての基準として定量的アミノ酸分析によ
って注意して決定した（第６図）。

それらの測定を基づくと、固有に不活性のＨＢＢＭ−３
は見られた生物学的応答を生成するために等しい量のａ
　Ｆ　Ｇ　Ｆで汚染されていなくてはならない。結果は
このような汚染を除外する。要約すると、それらの？１
ｌｌｆ究の結果は、ＨＢ　Ｂ　Ｍ−、３の活性がａ　Ｆ
’　Ｇ　Ｆの汚染の結果てないことを明瞭に示している
。

証拠のいくつかの行が、さらに、示すように、ＨＢＢ　
Ｍ　−３の活性はｂＦＧＦの汚染のためでない。理論的
には、ｌ：ｌ　Ｆ　Ｇ　Ｆによる）（ＢＢＭ−３の数パ
ーセントの汚染は観察される活性を生成するために十分
てあろう。しかしながら、このような汚染は、ＨＢ　Ｂ
　ＭおよびｂＦＧＦがヘパリン−セファロースクロマ１
〜グラフイーで広く分離されるのて、示されない。その
うえ、ＨＢ　Ｂ　Ｍ　−３およびｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆは、ま
た、モノ−Ｓクロマ１へグラフィーにおいてよく分離さ
れる（第５図）。最ｊ麦に、ＨＢ　１３　Ｍ　−３を第
３の高度に分割性の系である疎水性相互作用り１コマト
クラフィーにかけたとき、生物学的活性は、なお、１４
８　Ｂ　Ｍ−３に関連し、そしてよく分離されたｂＦＧ
Ｆに関連しないことが明らかにされたく第７図）。２つ
の実在物が、微量においてさえ、３つの広く本質的に異
なるかつ分割性のクロマトグラフィー系において、同時
に精製されるという証拠は存在しない。

それらの結果に基づいて、・ＨＢＢＭ−３の活性は固有
であり、そして既知のヘパリン結合性Ｆ’　ＧＦによる
汚染の結果でないと結論される。

ＨＢＢＭは、タンパク質の２つの群の間のアミノ酸配列
の相同性の欠如によって、Ｆ　Ｇ、Ｆとさらに区別され
る。前に記載したＮ−末端配列の差に加えて、現在得ら
れる配列の情報（ＨＢ　Ｂ　Ｍ　−３の１３０残基のう
ちのほぼ７５）は、ＦＧＦの発表された１４６残基の配
列（５〉と配列の相同性を示さない。

ヒｌ−ＨＢ　Ｂ　Ｍの有糸分裂起生活性は、一般に、ウ
シＨＢＢＭのそれと区別不可能であることがわかったが
、ヒトミトゲンは入手可能な材料の藍が限定されるため
に、広くは特徴づけられなかった。

これは他の発見と一致する：同一のアミノ末端配列、３
つの形態の存在、およびイオン交換、ヘパリン−セファ
ロース、および逆相クロマトグラフィー上の挙動。

ＨＢ　Ｂ　Ｍの種々の源の間のＮ−末端配列の同−性番
ｊ、少なくとも鳥類から哺乳類への進化の間において、
突然変異を妨害し得ることを示唆している。進化の圧力
（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒ３／　　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）
の結果としての配列保存は、種の間で高度に相同性であ
る、多くのよく知られた、生物学的に活性なタンパク質
で強く示唆される。

ＨＢＢＭは、脳組織についての手順を使用して抽出され
た、ウシ腎組織中に存在しなかっ゛た。したがって、Ｈ
Ｂ　Ｂ　Ｍは、また、組織、とくに神経組織の形成、維
持および／または修復において、ある役割を演する新規
なタンパク質である。

ＨＢ−Ｂ　Ｍのこの役割についてのこの陳述の基礎は次
のとおりてｐ）る−（１）ＨＢＢＭはａＦＧＦと同一の
生物学的活性およびヘパリン結合活性を有する；（２）
Ｈ’ＢＢＭは脳性異的である；　（３）ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ
より多い量のＨＢＢＭが脳中に見いだされる：および（
４’）　’ａ　Ｆ　Ｇ　’ＦおよびｂＦＧＦは非常に顕
著な神経の活性、例え赫、生体内および生体外において
神経親和性（ノイロン生存性）の活性を有することが知
られており、それらは神経芽細胞およびクリア細胞に対
して有糸分裂起生性であり、軸索の成長を促進し、そし
て脳性異的タンパク質の合成を誘発する。

ＨＢ、Ｂ　Ｍのタンパク質およびＦＧＦの構造は類似し
ないが、ヘパリン結合活性および生物学的活性における
それらの類似性はミトゲンの両者の群が同様な機構によ
って作用することを示唆する。

例えば、ミトゲンは細胞表面または細胞外のマトリック
ス関連ヘパリン様構造体に結合できるであろう。

本発明による治療学的組成物は、慣用の製薬学的に許容
されうる液体または固体の担体中に分散した、ＨＢ　Ｂ
　Ｍを、単独であるいは混合物で、含む。治療学的組成
物は、クリーム、ローションなどの形態で局所的に、あ
るいは錠剤、カプゼル剤、分散性粉末、粒剤または懸濁
液ような形態で経口的に、あるいは無菌の注射可能な溶
液または懸濁゛　液の形態で非経口的に投与することが
できる。これらの治療学的組成物は、ヒトまたは獣の患
者に投与して、脈管形成および神経組織の修復および維
持を促進することがてきる。

尺鞭匠 この実施例において、ウシＨＢ　Ｂ　Ｍの分離および特
性っけを詳細に説明する。ヒト材料を使用する結果は非
常に類似したのて、ウシ材料との差が発見されないかぎ
り、詳細に説明しない。

１　）　ｍｌａの抽出 ヒト脳は、チューリッヒ大学の病理学部から、死後２４
時間より短い時間に得た。ウシ脳は屠殺場において得た
。組織は入手直後に凍結し、−８０°Ｃで保存し、そし
て入手後２週間以内に処理した。脳組織の３〜５ｋｇの
ハツチを一度に抽出した。

脳組織は、記載されでいるように（６，１０）にゴスボ
タロウイズおよび共同研究者ら（２）によって開発され
た手順に従って抽出しな：凍結した脳はハンマーで破砕
した。組織の６００ｇの部分を、ワーリングブレンダー
内で１２リツトルの０．１５モルの硫酸アンモニウｌ＼
中で３分間ポモシナイジンクしな。ヒモシネートのｐＨ
は濃塩酸て直ちにｐＨ４，５に調節し、そしてこの混合
物を組織か微細に分散されるまでポリトン（Ｐｏｌｙｔ
ｏｎ　）ホモジナイザーでさらにホモジナイジングした
。次いで、この懸濁液を４℃で２時間撹拌し、次いで４
℃で６０分間１．１　、５００ｒｐｍ　（Ｇ’ＳＡロー
ター）あるいは９００Ｏｒｐｍ’（ＧＳ−３１１−ター
）のいずれかにおいて遠心して細胞および破片を除去す
ることに、よって、ホモジネートを抽出した。この上澄
みをｐＨ６〜６．５にＮ　ａ　ＯＨで調節し、硫酸アン
モニウム（２３０ｇ／Ｉ）を添加し、得られる懸濁液を
４℃において少なくとも３０分間撹拌し、そして前述の
ように再び遠心した。沈殿を廃棄した。さらに硫酸アン
モニウム（３００ｇ／ｌ）を上澄みにゆっくり添加し、
この懸濁液を４℃において少なくとも３０分間撹拌し、
そして前述のように遠心した。生ずる沈殿を冷水（１０
−Ｑ　ｍ　Ｉ　／　ｋｇ出発材料）中に溶解し、そして
スペクトラボア（Ｓ　ｐｅｃｔ、ｒａｐｏｒ　）膜（分
子量のカットオフ、６〜８ｋＤ、直径３１．８＋ｎｍ）
を使用して２０リツトルの水に対して４℃において２０
時間透析した。

透析物を再び遠心して沈殿した物置を除去し、そして上
澄みは、その動電性を決定した後、クロマトグラフィー
の精製（下を参照）にかけた。

２）ノ　−オン・Ｉり１コマトクラフイー上の手順から
得られる組織の抽出物＜Ｓ組織の１　、’ｋｇにつきほ
ぼ］、　５０４ｎｌ、）を、次のようにカチオン交換ク
ロマ■・グラフィーによってバッチ吸着／溶離した。試
料を必要に応して希釈しで１．動電性を０１モルのリン
醇ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）１０．１５モルのＮａＣ
１溶液のそれより低くした。

次いで、１００ミリモルのリン酸ナトリウム（ｐＨ６）
１０．４５モル５のＣＩで前もって平衡化したカルボキ
シメチル−セファデックス（ＳｅｐｌｌａｄｅＸ）、　
＜　５　、５　Ｘ３ｃｍ）のカラム上に適用した。この
カラムを平衡化Ｍｍ液で洗浄し、そして蛋白質分画を１
００ミ、リモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６’、Ｏｌｏ
、６モルのＮμＣＩで溶離し、そして集めた。すべての
作業は室温および５００ｍ１／時間の流速で実施した。

３）〜バリンー乍ファロース　　りロマトグラフィー カチオン交換クロマトグラフィーからの０．６モルのＮ
ａＣｌ溶離液を、１２５ｍ１／時間の流速で、ヘパリン
−セファロースのカラム［ファーマシア（Ｐｂａｒｍａ
ｃｉａ）、５　Ｘ　１　、５ｃｍ］に適用した。２８０
ミｍにおけるカラｌ−の溶離液の吸収が無視できるよう
になるまで、カラムを１０ミリモルの１〜リス−ＨＣｌ
、ｐＨ７，０１０，６モルのＮａＣｌを含有するＭ衝液
の２．００ｍ１−（：洗浄した。カラムに結きした蛋白
質を、３５Ｍ１／時間の流速で、１０ミリモルのトリス
ートＩ　、Ｃ，ｌ、ｐ１１７．０中の０．６モルから２
モルのＮ、ａＣｌの１２０分の直線の勾配で・ｉ容離し
た。クロマトグラフィーは、Ｌ　Ｋ、　Ｂ　蛎動ポンプ
および低圧ＬＫＢプログラミング可能勾配フォーマ−を
使用して、室温において実施した。１゜４論１の分画、
を集め、そしてアリコートをバイオアッセイした。

このヘパリン−セファロース親和クロマトグラフ、イー
の結果を第１図に示す。後述の工程を使用してさらに精
製した分画を、水平の棒Ａで示す。

ａＦＧＦを含有する分画は、１１〜１．３モルのＮａＣ
ｌにおいて溶離され（ここの）＼バリンーセファロース
のカラムのＨＰ　Ｌ　Ｃ分析によって決定した：データ
は示されていない）そして、１〜１゜２モルのＮａＣ１
において溶離されるより大きいピークの肩および水平の
棒Ｂに相当する。逆相ＨＰｌ、　Ｃ分析を０４カラムて
実施した［２５Ｘ０．４６ｃｌＩｌ、５μｍの粒子→ク
ーイズ、３００オングストロームの孔サイズ、カリフォ
ルニア州へスペリア、ザ、セパレイジョン・グループ（
ゴｂｅ　　Ｓ　ｐｅｐａｒａＬｉｏｎ　　Ｇｒｏｕｐ）
　］　。蛋白質は、０．７ｍｌ／分の流速で、０１％の
１ヘリフルオロ酢酸中のアセトニ１ヘリル（１０％／時
間）の浅い勾配で溶離された。

ヘパリン−セファロースのクロマトグラフィーは室温に
おいて実施した。

４）モノ　ＭＯｎｏ　−Ｓカチオン”マ　クロマトグラ
フィー 他の蛋白質材料から汚染性ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆを分離するた
めに、１へ−１，２モルのＮａＣｌにおいて溶離される
分画をプールし、５０ミリモルのリン酸ナトリウムを含
有する緩衝液、ｐＨ６，８、で十分に希釈しくそれらの
イオン強度を希釈剤のほぼそれに減少するため）そして
５０ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８、で平衡
化したモノ−Ｓカラムくファーマシア）のカヂオン交換
りｌコマトゲラフイーにかけた。この材料を５０ミリモ
ルのリン酸ナトリウム、ｌ）Ｈ６８、で平衡化したモノ
−Ｓカラム（ファーマシア）上にボンピングした。

２１０ｎｍにおける吸収が最小値に到達するまで、カラ
ムを同一緩衝液で洗浄した後、蛋白質を５０ミリモルの
リン酸ナトリウム、ｐＨ６，８、中の０〜０６モルのＩ
’Ｊ　ａ　ＣＩの勾配で溶離した。

いくつかのよく判別できるピークが、第２図に示すよう
に、これらの条件下にモノ−Ｓカラムから溶離された。

ピークの各々を、室温において０゜７ｍ１／分の流速で
、Ｌ　Ｋ　Ｂ　　Ｈ））　Ｌ　Ｃ装置を使用する逆相Ｈ
Ｐ、　Ｌ　Ｃによって分析した。

０３モルのＮａｃＩにおいてモノ−Ｓカラムから溶離さ
れる最初の定量的に小さいピークは、同一条件下に同一
系において真正のａ　Ｆ　Ｇ　Ｐの参照標準との同時溶
離によって、ならびに前述の０４カラムの逆相ＨＰＬＣ
における同時溶離によって立証されるように、高度に分
割性の浅い勾配の条件下に溶離されるａ　ＦＧ　Ｆに相
当したくデータは示されていない）。このモノ−Ｓカラ
ムの分画中のａＦＧＦの存在は、ヘパリン−セファロー
スのクロマトグラフィーがａＦＧＦを含有することが知
られているのて、期待された。この材料の主要部分は、
ピークの比較的よく分割された、三重線として、はぼ０
．４５〜０．６５モルのＮ、ａ（？：Ｉにおいてモノ−
Ｓカラムから溶離された。それらのピークは、後述する
ように、］（Ｂ　Ｂ　Ｍを、含有することが決定された
のて、それらを、それらの溶離の順序で、ＨＢ　１３　
Ｍ　−３、ＨＢＢｔ−２、およびＨＢ　、Ｂ　Ｍ−，１
と表示したく第２図）。モノ−Ｓカラム上のヒトＨＢＢ
Ｍの溶離の挙動は、一般に類似するが、ウシＨＢ　Ｂ　
Ｍよりもよく研究されてきていない。

ＨＢ　Ｂ　Ｍは、ａＦＧＦからのみならず、かつよたｂ
ＦＧＦと、クロマトグラフィーの保持によつて明瞭に区
別することがてきる（第・２図）。

その上、逆相ＨＰＬＣによって分析したときく第３図）
、ＨＢＢＭは保持時間に関してＦＧＦと明瞭に異なるこ
とがわかった（データは示されていない）。最後に、逆
相ＨＰ　Ｌ、　Ｃはずべての３種類・のＨＢＢＭを互い
に分離しく第３図）、こうしてそれらを高い純度で調製
する（構造の特性づけに要求される）手段および比較的
明瞭に同定する手段を提供した。

ヒト脳は、また、それらのウシ相手のものに同一の逆相
ＨＰ　Ｌ　、Ｃ溶離パターンをもつＨ１３，ＥｔＭの３
つの形態を生成した。

ら）　水性　互　　クロマトグラフィー問題の試料を含
有するモノ−Ｓカラムからの分画を、１．５モルの硫酸
ナトリウム中でつくり、そして１００ミリモルのリン酸
ナトリウム、ｐＨ７，０／１．５モルの硫酸ナトリウム
の緩衝液で前もって平衡化した疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＩＣ）カラム（Ｌ　Ｋ　Ｂ　　Ｕ　ｌ　
ｔｒｏｐａｃＴ　Ｓ　Ｋ−フェニル−５ＰＷ、７．５Ｘ
７５＋ｎ＋ｎ）に適用した。蛋白質を室温において１５
モルから０６モルの硫酸ナトリウムの３０分の直線の勾
配で１　、０’ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーに
かけた。疎水性相互作用クロマ１〜クラフイーは、モノ
−Ｓクロマトグラフィーの非常に異なる選択性をもつ分
離系である。結局、ＨＩＣによるＦＧＦからのＨＢ　、
Ｂ　Ｍの分Ｎ（第７図）は、Ｉ−（Ｂ　１３　ＭかＦＧ
Ｆと異なる化学的実在物であるというモノ−Ｓクロマト
グラフィーの結果〈第５図）を強化する。　　　　　　
　　　　　　　・ ６）アミノ　Ｎ−一、Ｊ　１皿 通常、配列の分析は蛋白質を化学的に修飾しないて実施
した。しかしながら、ＨＢＢＭのアミノ酸Ｎ−末端配列
のある分析を実施するときの主要な工程として、ＨＰ’
　Ｌ’　ＣＭ製した蛋白質のシスティン残基はカウツジ
ーソバら（６）の手順に従って処理した。簡単に述へる
と、システィン残基は５倍モル過剰量のジチオスレイ■
・−ルて還元し、そして３倍モル過剰量のヨウドー［２
−”Ｃ’］　−酢酸を使用してカルボキシメチル化によ
ってアルキル化した。

蛋白質［１００〜５００ｐｍｏｌ　（ピコモル）］のア
ミノ酸Ｎ−末端配列の分析は、エシュら（５）によって
記載されＣいるように、アプライド・バイオシステムス
（’Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　’
（カリ１オルニア州フオスター市＞４７”ＯＡ型気／液
層蛋白質マイクロシークエネイター（＋ｎ１ｃｒｏｓｅ
ｑｕｅｎａＬｏｒ）で実施した。さらに、アミノ酸のフ
ェニルヒダントイン（Ｐ　Ｔ　Ｈ）誘導体は、アプライ
ド・バイオシステムスの１２０Ａ型オンラインＰ’　Ｔ
　Ｈアミ、ノ酸分析装置を使用する逆相Ｈｊ）Ｌ　Ｃに
よって同定した。両者の手順は、アプライド　バイオシ
ステムスによって供給される化学物質を使用して、計器
の製造業者からのプロトコルに従って実施した。

すべての３つのＨＢ　Ｂ　ＭのＮ−末端配列は、最初の
１９アミノ酸について互いに同一であることかわかった
。配列は、Ｇ　ｌｙ　−Ｌｙｓ’　−Ｌｙｓ”　Ｇ　ｌ
ｕ　−Ｌｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　＝’Ｇ　ｌｕ　−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ　−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−
Ａ　ｓｐ　−”Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ
　ｒｐ’　−Ｇ　Ｉｎとして決定された。ヒトＨ’Ｂ　
Ｂ’　Ｍ（多分混合物として分析された）は、ウシＨＢ
ＢＭと同一のＮ−末端配列を有すること力ｔわか゛った
。

配列決定のデータは３つのウジＨＢ’Ｂ’Ｍ蛋白質１が
互いに構造的に関連することを明瞭に示しているが、ア
ミノ酸の組成および分子量は、さらに、それらの蛋白質
がカルボキシ−末端領域において異なりうろことを示唆
している。１−１　’Ｂ　’Ｂ　’Ｍ　’−２およびＨ
Ｂ　Ｂ　Ｍ　−３か８１３　Ｂ　Ｍ　−１のカルボキシ
−末端で切頭された形態であり、それらのカルボキシ−
末端において、それぞれ、はぼ１３および２つアミノ酸
を欠いているという別の解釈と、すべてのデータは適合
する。

７）比重−ＢＭの分子１ 蛋白質の試料を、ゴスボダロウィスら（９）によって記
載されるように、ドブしル硫酸ナトリウム　ポリアクリ
ルアミドダルの電気泳動（”５ＤＳ−ＰＡＧＥ”′）を
使用して分析した。簡単に述へると、分子量の決定は、
ｓ　Ｄ’ｓ　−Ｌ　Ｐ　Ａ　’ａ　Ｅによっ７よ。よう
０．よ、え、４ｏミ８．１．３ｏ−７ケ。

ム）の蛋白質を含有するアリコートを、３０％（Ｖ／Ｖ
）のグリセロール、０．２モルのジチオスレイ）・−ル
、４％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム、４ミリモ
ルのＥＤＴＡおよび７５ミリモルのトリス−ＨＣｌ、Ｉ
）Ｈ６，８、から構・成された試料のｙ１衝液に添加し
た。試料を３分間沸臆させ、次いで３％の積重ねたゲル
をもつ２０％のポリアクリルアミドゲルのスラブ（Ｌ、
　５ｍ＋ｎ）に適用した。

非還元性条件下の電気泳動を、ジチオスレイトールを試
料の緩衝液から省略した以外、同一の方法で実施した。

リゾチーム（１４，５”ｋＤ）　、ｌ−リプシン阻害剤
（２’ｌ　　５ｋＤ）　、炭酸アンヒドラーゼ（３１ｋ
Ｉ）　）、オバルブミン（４５ｋＤ’）および血清アル
ブミン（’６６　２’ｋＤ　）を含有する蛋白質標゛準
混合物を、またニゲルの各々に適用した。

ＳＤＳ、−ＰＡＧＥは、）］’Ｂ　Ｂ　Ｍ＝　ｉ、ｉ−
ｉ　Ｂ　ＢＭ　−２およびＨＢＢＭ−３の分子量が、そ
れぞれ、１８．１６および１５ｋＤであることを明らか
にした。分子量は、試料を還元剤の不存在下にあるいは
存在下に電気泳動にか（するかともかに無関係に有意に
異ならなかった。このことは、蛋白質が単一の鎖のポリ
マーであることを示ず。ヒｌ−ＨＢ　ＢＭの分子量は、
また、ＳＩ）、５−ＰＡＧＥによって決定されていない
。

８）アミノ１糺或ノヒｒ哲− １０〜２０　ｐｍｏｌの蛋白質試料を、ボーレンおよび
シュレーデル（１１）の高感度の方法に従って加水分解
した。簡単に述べると、蛋白質試料を加水分解管に添加
し、そして真空乾燥した。２％（Ｖ／Ｖ）チオグリコー
ル酸を含有する５μｍの一定沸点のＨＣＩを添加した。

次いて、試料を液体窒素中で凍結した後、この管を高い
真空（５０ｍｍトルより低い）で排気した。次いて、試
料を真空下にある間溶融し、そして管を火炎封止した。

管を１１０℃に２０時間加熱することによって加水分解
しな。加水分解後、管を開き、真空乾燥し、そして残留
物を１３０μｍのクエン酸塩緩衝液（０，，０６７クエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ２。

２０〉中に溶解した後、カチオン交換クロマトグラフィ
ーのカラムに適用した。

蛋白質加水分解物は、高感度の検出のためのタボリスチ
レンに基づくカヂオン交換カラムおよび０−フタルアル
デヒド蛍光検出システムを装備した、クロマコン（ＣＩ
＋ｒｏｎａｋｏｎ　）　５００アミノ酸分析装置［コン
トロン（Ｋ　ｏｎｔｒｏｎ　）　、スイス国チューリッ
ヒ］でクロマｌルブラフィーにかけたく１１）。

アミノ酸の定量は、アミノ酸の標準混合物を使用して、
外部の標準法によって実施した。定量的アミノ酸分析に
基づいて、ＨＢＢＭの全体の分離収量は、ＨＢＢＭ−１
１，ＨＢＢＭ−２およびＨ，ＢＢＭ−３に？いて、それ
ぞれ、はぼ３ｏ、］０および４０μｇ１ｋｇ脳組織であ
ると推定された。

３種類のＨＰＬ、、Ｃ：精製した蛋白質のアミ、ノ酸組
５成を表■に示す。

紅 ヘパリン結合性用ミトゲンのアミノ酸組成１１８ＢＮ−
１’　ｌ（ＢＢＭ−２１（Ｂ１３Ｎ−３分子量’　　　
　　　、　　　　１８，０００　　１６，０００　　１
５，０００溶離の順序 一逆相１１ＰＬＣ’１　　　’　　　２”　　３−モノ
−８３２１ アミノ酸（残基の数） アスパラキンおよび アスパラギン酸　　　　　１０１０９ スレオニン　　　　　　　１４　　．１４　　　　１３
セリン　　　　　　　　９　　　９　　　６グルタミン
および グルタミン酸　　　　　　２３．　　２０　　　　．１
７プロリン　　　　　　　　　ｎｄ２ｎｄ　　　　　ｎ
ｄグリシン　　　　　　　　１６”１５１３アラニン　
　　　　　　　１０８８ システイン　　　　　　　ｎｄ　　　　　ｎｄ　　　　
　ｎｄバリシ　　′　　　　　４　　　４　　　４メチ
オニン　　　　　　　１　　　１　　　１インロイシン
　　　　　　２　　　２　　　２０イシン　　　　　　
　　　　８７３８チロシン・　　　　　　　　２　　　
２　　　１フエニルアラニン　　　　２　　　２　　　
２ヒスチジン　　　　　　　１　　　１　　　１リジン
　　　　　　　　　　３５　　　　２８　　　　２３ト
リプトフアン　　　　　３ｎｄ３３ −３２．− ’　　Ｓり５−ＰＡＧＥによって決定した。

２ｎｄ−決定しなかった。

３　Ｃ−末端の切頭（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ　）の仮説
に従い、次はＩｊＢ　Ｂ　Ｍ７．２について適切な値で
あると信じられる：ロイシン　８、トリプトファン　３
〜アルギニン　８．。

アミノ酸組成は、３〜５回の決定から計算した。

アミノ酸組成のデータは、モノ−Ｓカラム上の３つの一
白質の溶離順序と一致する：最低に塩基性の蛋白質（Ｈ
ＢＢＭ−３）は最初に溶離するが、これに対して最も塩
基性の蛋白質（ＨＢ、ＢＲｌｌ、）は最後に溶、−する
。アミノ酸分析から計算した期、。

待さ些る分子量は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決。

定されたものより多少小さい。不一致は、アミノ酸分析
によって定量されなかったプロリンおよびシスティンの
残基によって説明することができるであろう。しかしな
がら、Ｎ−末端配列の分！ＩｒＬ：。

基づき、プロワくおよびシスティンは事実存在す。

ることが知られている。ヒトＨＢＢＭのアミノ酸分析は
、まだ、入手不可能である。

９）生物学的活性 内皮細胞中で有糸分裂生起を誘発するＨＢＢＭのあるも
のの能力を、ボーレンら（２，１０）によって記載され
ているように、培養したウジ大動脈弓の内皮細胞の生体
外増殖についてのそれらの蛋白質の作用を測定すること
によって試験した。

簡単に述べると、ウシ内皮細胞を、下に記載するように
して得られたカラムの分画で、１０％の仔ウシ血清を含
有するダル／＼ツコ（Ｄ　ｕ　Ｌｂｅｃｃｏ　）変性イ
ーグル培地［ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）　、無菌
系、ユタ州ローカン］中で低い密度（１，０，０００〜
２０，０００細胞／　３５　ｍ’ｍ皿）て接種した。

培養物を種々の濃度のカラム分画のアリコー１へ（第０
日および第２日に添加した）の存在下に５日間増殖させ
、次いてコールタ−（Ｃｏｕｌｔｅｒ）粒子カウンター
で計数した。試験した蛋白質の生物学的活性は、第５図
〜第７図において、各分画について各試験ウェル（ｕ＋
ｅｌｌ）中で増殖した脈管の内皮細胞の数て示ず。

とくに、ＨＢＢＭの活性をＦ　Ｑ　Ｆの活性と比較しな
。発表された手順（９，１２）を用いて、ａＦ　Ｇ　Ｆ
およびｂＦＧＦを分離し、そしてそれらの真正をＮ−末
端配列分析および分子量の決定（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
よって立証した。

第２図に示すように、モノ−Ｓクロマトグラフィーから
のＨＢ　Ｉ３　Ｍ　−３についてのピークに相当する溶
離分画をプールし、出発Ｍ析液で３倍に希釈し、そして
同一系で再びクロマトグラフィーにがけな。これらの分
画のすべてを、上に記載するように、ウシ脈管内皮細胞
の増殖を刺激するそれらの能力について試験した。ａＦ
ＧＦおよびｂＦＧＦを使用して比較試験を実施した。さ
らに、ＨＢＢＭ−３およびその活性をＦＧＦから分離し
た。

活性の他の試験において、得られるＨＢＢＭ−３の分画
を、第２図について記載したのと同一の緩衝液系を使用
するが、より急な勾配（２０分で０〜１．０モルのＮａ
ＣＩ）およびより低い流速（０，’４ｍｌ／分）におい
て、モノ−Ｓカラムで濃縮した。比較の投与一応答の分
析をａＦＧＦおよびｂＦＧＦを使用して実施した。

〜３５− 第６図の上のパネルは、ＨＢＢＭ”３が投与量依存の方
法でウシ大動脈の内皮細胞を刺激したことを示す。ＥＤ
５０は’；２　Ｑ　〜５０　ｎｇ／　ｍ　ｌの程度であ
り、最小の刺激の投与量はほぼ３ｉ＋ｇ／ｍｌてあった
。

ＨＢＢＭ−３およびｎＦＧＦの投与一応答曲線は、用い
たＣツセイの条件下に、定性的および定量的に、区別不
可能であった。ＨＢ’ＢＭ−３の応答は１）　Ｆ　Ｇ　
Ｆの応答と区別できるように見えた。用いてアッセイめ
系において、ｂＦ’Ｇ″Ｆは１１８８Ｍ−３よりも非常
に高い効能および明らかに高い固有の活性を有した。し
□かしながら、細胞増殖に悪影響を与えないで細胞に添
加できる塩の量に関して制限があるために、ＨＢＢ　Ｍ
−３の固有の活性の評価を可能とするために十分に高い
投与量をこのアッセイにおいて使用てきなかったので、
Ｈ１３ＢＭ−３の固有の活性の問題はこの試験において
適切に汲うこ゛とができなかったことに注意ずべきであ
る。しかしなから、予備的結果は、ＨＢ　Ｂ　Ｍ　−３
め固有の活性か使用したアッセイの条件下にａ）’　Ｇ
　Ｆのそれと同一であることを示す。

投与一応答の分析をＨ’ＢＢＭ−１について反復した。

第６図の下のパネルに示すように、結果は、Ｈ８１３Ｍ
−１が、また、同一の試験系において生物学的に活性で
あったことを示す。ＨＢＢＭ−１、ＨＢＢＭ−２および
ＨＢＢＩＶＩ−３の混合物からなるヒトＨＢ　Ｂ　Ｍを
同一の方法で試験し、そしてそれは同様に活性であった
（データは示されていない）。さらに、ウシＨＢＢＭを
、また、ヒトへそ帯の内皮細胞についてと験し、そして
活性であることがわかった（データは示されていない）
。

最後に、モノ−Ｓクロマトグラフィーによって濃縮した
Ｈ　Ｂ　Ｂ　Ｍ−３のアリコートを１５モルの硫酸ナト
リウム中でつくり、そして疎水性相互作用カラム上に配
置した。第７図に示す結果が示すように、ＨＢＢＭ−３
は活性であり、そしてａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両者か
ら良好に分離された。

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イ（Ｌ　ｕｉ’）　、Ｇ　、、バイルド（Ｂ’ａｉｒｄ
）　、Ａ　　およびボーレン（Ｂｏｈｔｅｎ）　、Ｐ、
　、７ｏ＞　　−’＜　＞！ス・　ブ・ナショカル　ア
カデミ−オフ・寸イエンシズ（ｈ匹工Ｎａｔｌｙ　　Ａ
ｃ’ａｄ、　　　Ｓｃｉ、　）　、’８よ、６’９６３
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１０、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）　、Ｐ、　、エシュ（
ＥＳＣ１＋）　、Ｆ、およびゴスボダロウイズ（Ｑｏｓ
ｐ。

ｄａｒｏ＋１Ｉｉｃｚ）　、　Ｄ、　、　ＥＭＢＯジャ
ーナル（影頌胆−Ｌ）、［，１９５１−１９５６（１９
８５）。

１−１、ボーレンＣＢ　ｏｈｌｅ’ｎ　）　、’　Ｐ　
、およびシュレーテル（５ｃｈｒｏｅｄｅｒ）　、Ｒ，
、アナリテイカル・バイオケミスト■−Ｈ（Ａｎａｌ、
　　Ｂ　１ｏｃｈｅ＋ｎ、　）、」じしく、１４４−１
５２　（１９８２）。

１２、ガウツシイーソバ（Ｇａｕｔｓｃｈｉ　　ＳＯＶ
［ｌ）、Ｐｌ、ジアング（Ｊ　ｉａｎｇ）　、Ａ、Ｐ、
、フレイターーシュシーデル（Ｆ　ｒａｔｅｒ　−Ｓ　
ｃｈｒｏｅｄｅｒ）　、Ｍ　。

およびボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）　、Ｐ、　、バイオケ
ミストリー（Ｂ　ｉｏｃｂｅｍ、　）　５．２６．５８
４４−５８４７　（１９８７）。

本発明の主な態様および特徴は、次の通りである。

１、Ｎ−末端アミノ酸配列ＨＧｌｙ　’ＬｙｓＬｙｓ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ′−Ｌｙ
ｓ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−を有する実質的に純粋な形態の
ヘパリン結合性脳ミトゲン。

２、Ｎ−末端アミノ酸配列Ｈ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ−’Ｇ’ｌｕ　−Ｌｙｓ’−’Ｐｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ
−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−’Ｓ
ｅｒ　＝ＡＳ＋３−’Ｃｙｓ−Ｇ−Ｉｙ−Ｇｌｕ’−’
Ｉ”ｒｐ−Ｑｌｌ−を有する実質的に純粋な形態のヘパ
リン結合性脳ミトゲン。

３、ウシ脳から分離された上記第２項記載のへバリン結
合性脳ミドケン。

４、ＨＢＢＭ−１、ＨＢＢＭ−２およびｉ（Ｂ　ＢＭ−
３から成る群より選択され、ここで１−（Ｂ　Ｂ　Ｍ−
１は約１８，０００ダルトンの分子量を有し、ＨＢＢＭ
−２は約１’６，０００ダル■・ンの分子量を有し、そ
してＨＢ　Ｂ　Ｍ　−３は約１５，０００ダルトンの分
子量を有し、そしてアミノ酸組成ニアミノ酸Ｑ斃蒸グ１
σ　　　朋賄ニュ　　興朋」　　胆胆剥アスパラギン酸
　　　　　１０　　　　１０　　　　９スレオニン　　
　　　　　１４　　　　１４　　　　１３セリン　　　
　　　　　９　　　９　　　６グルタミンおよび グルタミン酸　　　　　　２３　　　、　２０．　　　
１７グリシン　　　　　　　′１６１５１３アラニン　
　　　　　　　１０８８ バリン　　　　　　　　４　　４　　　４メチオニン　
　　　　　　１　　　１　　　１イソロイシン　　　　
　　２　　　２　　　２０イシン　　　　　　　　８　
　　８　　　８ヂロシン　　　　　　　　　２　　　　
２　　　　１フエニルアラニン　　　　２　　　２　　
　２ヒスデシン　　　　　　　１］１ リンノ　　　　　　　　　３５　　、、．２８　　　　
２３トリプトフアン　　　　　３　　　３　　　３アル
ギニン　　　　　　　８　　　８　　　８を有し、ここ
でプロリンおよびシスデインは、Ｎ−末端アミノ酸配列
配列に基づいて、存在したが、それらの含量は決定しな
かった、上記第３項記載のヘパリン結６牲脳ミトゲン。

５、工程： （ａ）源の組織からの抽出、 （ｂ）第１カチオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）ヘ
パリン親和クロマトグラフィー、および （ｄ）第２カチオン交換クロマトグラフィー、の順序か
らなる実質的に純粋な形態のヘパリン結合性脳ミトゲン
を分離する方法。

６、工程（ｄ）の後に、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーの工程をさらに含む上記第５項記載の方法。

７、工程（ｃ）および（ｄ）の溶離した分画を、逆相高
性能液体クロマトグラフィーによって、ヘパリン結合性
脳ミトゲンの存在について一分析する上記第５項記載の
方法。

８、源の組織はウシ脳である上記第７項記載の方法。

９、有効脈管形成促進量の上記第１項記載のヘパリン結
合性脳ミトゲンを患者に投与することからなる脈管形成
を促進して傷の治癒、骨の治癒および火傷の処置を助け
る方法。

１０、有効量の上記第１項記載のヘパリン結合性脳ミト
ゲンを患者に投与することからなる組織の形成、維持お
よび修復を促進する方法。

１１、組織は神経組織である上記第１０項記載の方法。

１２、製薬学的担体および有効脈管形成促進量の上記第
１項、記載のヘパリン結合性脳ミトゲンからなる脈管形
成を促進するために有用な治療学的組成物。

１３、製薬学的担体および有効量の上記第１項記載のヘ
パリン結合性脳ミトゲンからなる組織の形成、維持およ
び修復を促進するために有用な治療学的組成物。

１４、組織は神経組織である上記第１３項記載の治療学
的組成物。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヘパリン−セファロース親和クロマトグラフ
ィーを使用するカヂオン交換クロマトグラフィーからの
０．６モル（Ｍ）のＮａＣｌ溶離物の４００＋ｎｌの分
画を示す。水平の棒ＡはＨＢ　Ｂ　Ｍを含有する分画を
示し、それらの分画はその後さらに精製するために再び
クロマトグラフィーにかけた。水平の棒Ｂは、逆相ＨＰ
　Ｌ−Ｃ分析によって決定して、ａＦＧＦを含有する分
画を示す。 第２図は、ヘパリン−セファロース親和クロマトグラフ
ィーによって溶離された物質の２０＋ｎｌ（第１図、水
平の棒Ａて示す）のモノ（”Ｍ　ａｒｒｏ　）　−Ｓカ
チオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。 矢印はａ　ＦＧ　Ｆ”およびｂＦＧＦの標準の溶離位置
を示ず。クロマトグラム中の筋はＨＢＢＭ−１，、ＨＢ
ＢＭ’−２およびＨＢ　１３　Ｍ−３を意味する。水平
の棒はＨＢ　Ｂ　’Ｍを含有、す、る分画を示し、これ
らの分画は、プールとして、あるいは個々にそれ以上の
精製／特性づけのために使用した。 第３図は、）（ＢＢＭの逆相ＨＰＬＣを示す。モノ−８
精製したＨＢＢＭのプールのアリコー１へ（第２図にお
いて水平の棒によって示される、ピーク１〜３）を、逆
相ＨＰＬＣにかけた。個々のピークは、独立の逆相ＨＰ
ＬＣの実験においてモノ−Ｓクロマトグラフィーの分画
のアリコート（第２図において水平の棒て示す）を分析
することによって、同定し、そして特定のモノ−８の分
画に割当てた。ピーク１〜３は、それぞれ、ＨＢ　Ｂ　
Ｍ　−１、ＨＢ　Ｂ　Ｍ　−２およびＨＢＢＭ−３を示
す。 第４図は、次のようなＨＢＢＭの５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の
分析を示ず：レーン１：蛋白質の標準（リゼイト、１４
．４ｋＤ、）リプシン阻害剤、２１゜５ｋｌ）；炭酸ア
ンヒドラーゼ、３’ｌｋＤ、オバルブミン、４５ｋＤ；
血清アルブミン、６６．２ｋＤ）。 レーン２：ＨＢＢＭ−１；レーン３　：　ＨＢＢＭ−２
：レーン４　：　ＨＢＢＭ−３゜ 第５図は、モノ−Ｓカチオン交換クロマトグラフィー−
にのＨＢ’ＢＭ−３の再クロマトグラフィーを示す。第
２図に示すクロマトグラフィーからのＨＢＢＭ−３含有
分画をプールし、出発緩衝液で３倍に希釈し、そして希
釈した試料を、第２図に示す条件と同一の条件下に、モ
ノ−Ｓカラムのクロマトグラフィーにかけた。分画のア
リコートをウシ大動脈弓の内皮細胞の増殖を刺激する能
力について試験した（ヒストグラム）。ａＦＧＦおよび
’ｂＦ　Ｇ　Ｆの保持時間を矢印て示す。水平の棒は、
後にＨＢ　Ｂ　Ｍ　−３を濃縮するために使用した分画
を示す。 第６図は、投与応答分析によるＨＢＢＭ−３およびＨＢ
　Ｂ　Ｍ　−１の生物学的活性およびＦＧＦの　・活性
との比較を示す。ウシ大動脈弓の内皮細胞の３成長を刺
激するＨ　Ｂ　Ｂ　Ｍ　−３およびＨＢＢＭＴＩの能力
を試験した。上のパネル：ＨＢＢＭ”３；下のパネル・
Ｉ−（ＢＢＭ’−１゜各パネルにおいて、実線’：ＨＢ
ＢＭ；破線：　ａＦ　Ｇ　Ｆ　；点線ｂＦＧＦ。　　′
第７図は、疎水性相互作用クロマトグラフィー」二の−
ＨＢＢＭ−３のクロマトグラフィーを示す。 モノ−８濃縮したＨＢＢＭ−３のアリコートを■１１Ｃ
クロマトク′ラフイーにかけた。矢印は、同一のクロマ
トグラフィーの条件下のａ　Ｆ　Ｇ　Ｆおよび１）　Ｆ
　Ｇ　Ｆの保持時間を示ず。カラムの分画のアリコー１
〜を、ウシ大動脈弓の内皮細胞の増殖を刺激する能力に
ついて試験した。結果は、試験ウェルの各々において増
殖した細胞の数で示されている１゜特許出願人　アメリ
カン・ザイアナミド・カンパニー、　　　１、　　　′ Ｉへ１１今 ■ Ｈへ ’７１　　　　　　　　　文 −′寸 ヘー 、ｔ−”　’　＜ｒｘ　４　／　ｍ　Ｈ，、ｏｒ　　ｗ
　　１ｒｘ４／Ｆｉｌｌ　　Ｗ手続補正書彷式） 平成１年７月２１日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 平成１年特許願第１３３３０号 ２、発明の名称 ヘパリン結合性脳ミトゲく ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　アメリカン・サイアナミド・カンパニー４、代理
人　〒１０７ ５、補正命令の日＜−Ｊ　　　平成１年５月３０日（発
送口）６、補正の対象 願書の特許出願人の欄、委任状・法人証明書及びそれら
の訳文並びに図面 ７、補正の内容 トド ； つ　１ ＄賛　め −！ ｃ１１１１＃−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−末端アミノ酸配列Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
   −Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
   Ｖａｌ−を有することを特徴とする実質的に純粋な形態
   のヘパリン結合性脳ミトゲン。 ２、Ｎ−末端アミノ酸配列Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
   −Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
   Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−を有することを特徴と
   する実質的に純粋な形態のヘパリン結合性脳ミトゲン。 ３、工程。 （ａ）源の組織からの抽出、 （ｂ）第１カチオン交換クロマトグラフィー、 （ｃ）ヘパリン親和クロマトグラフィー、および （ｄ）第２カチオン交換クロマトグラフィー、の順序か
   らなることを特徴とする実質的に純粋な形態のヘパリン
   結合性脳ミトゲンを分離する方法。 ４、有効脈管形成促進量の特許請求の範囲第１項記載の
   ヘパリン結合性脳ミトゲンを患者に投与することからな
   ることを特徴とする脈管形成を促進して傷の治癒、骨の
   治癒および火傷の処置を助ける方法。 ５、有効量の特許請求の範囲第１項記載のヘパリン結合
   性脳ミトゲンを患者に投与することからなることを特徴
   とする組織の形成、維持および修復を促進する方法。 ６、製薬学的担体および有効脈管形成促進量の特許請求
   の範囲第１項記載のヘパリン結合性脳ミトゲンからなる
   ことを特徴とする脈管形成を促進するために有用な治療
   学的組成物。 ７、製薬学的担体および有効量の特許請求の範囲第１項
   記載のヘパリン結合性脳ミトゲンからなることを特徴と
   する組織の形成、維持および修復を促進するために有用
   な治療学的組成物。