NO175594B - Fremgangsmåte for isolering av heparin-bindende hjerne-mitogen - Google Patents
Fremgangsmåte for isolering av heparin-bindende hjerne-mitogenInfo
- Publication number
- NO175594B NO175594B NO890295A NO890295A NO175594B NO 175594 B NO175594 B NO 175594B NO 890295 A NO890295 A NO 890295A NO 890295 A NO890295 A NO 890295A NO 175594 B NO175594 B NO 175594B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hbbm
- heparin
- lys
- column
- brain
- Prior art date
Links
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 title claims description 65
- 102100039277 Pleiotrophin Human genes 0.000 title claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 29
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 24
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 16
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 15
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 15
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 14
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 33
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 33
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 24
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 24
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 101001102336 Bos taurus Pleiotrophin Proteins 0.000 description 9
- 101001102334 Homo sapiens Pleiotrophin Proteins 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- -1 21.5 kD Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 2
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical compound S=C1NC(=O)CN1C1=CC=CC=C1 PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101001102335 Gallus gallus Pleiotrophin Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 101001102327 Rattus norvegicus Pleiotrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002403 aortic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012615 high-resolution technique Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102220001789 rs28937889 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Insulated Conductors (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Insulating Materials (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for isolering
av heparinbindende hjernemitogen i hovedsakelig ren form med den N-terminale aminosyresekvens H-Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val-, isolert fra menneske-, hønse- eller storfe-hjernevev, hvori det heparinbindende hjernemitogen er valgt fra gruppen bestående av HBBM-1, HBBM-2 og HBBM-3, hvor HBBM-1 har en molekylvekt på ca. 18.000 dalton, HBBM-2 har en molekylvekt på ca. 16.000 dalton,og HBBM-3 har en molekylvekt på ca. 15.000 dalton, besmten ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser, med aminosyresammensetning:
hvor prolin og cystein var tilstede, basert på den N-terminale aminosyresekvens, men innholdet av dem var ikke bestemt.
Disse proteinvekstfaktorer antas å fremme angiogenesen og å være egnet ved sårtilheling, bentilheling og behandling av brannsår. Proteinene bevirker mitogenese i endotelialceller og kan som sådanne betraktes å være vekstfaktorer for disse celler. Proteinene antas også å fremme dannelse, vedlikehold og reparasjon av vev, spesielt nervevev. Proteinene er enkeltkjedede og sterkt basiske. Proteinene har en felles N-terminalsekvens på 19 aminosyrer som er forskjellig fra
sekvensen hos andre kjente proteiner.
De samme tre HBBM er blitt isolert fra humant hjernevev og har den samme N-terminale sekvens og den samme type mitogene aktivitet som okse-HBBM. Rotte- og kylling-hjerner er også blitt funnet å inneholde HBBM.
Tallrike proteinvekstfaktorer er blitt isolert og karakterisert i de senere år. Disse vekstfaktorer innbefatter epidermal vekstfaktor, fibroblast-vekstfaktorer, insulin-liknende vekstfaktorer, omdannende vekstfaktorer, blodplate-avledet vekstfaktor og interleukiner. F.eks. ble fibroblast-vekstfaktor ("FGF") først renset av Gospodarowicz i 1975 fra okse-hypofyse og hadde en beregnet molekylvekt på 13.300 dalton (referanse 1).
FGF ble senere renset fra oksehjerne (2). FGF kan isoleres enten i sur ("aFGF") eller basisk ("bFGF") form, avhengig av de anvendte isolasjonsfremgangsmåter (3, 4). En fullstendig aminosyresekvens for okse-hypofyse-bFGF (5) og okse- og menneskehjerne-aFGF (6, 7) er blitt publisert, sammen med de N-terminale sekvenser for okse- og menneskehjerne-bFGF (5). De N-terminale sekvenser for oksehypofyse- og oksenjerne-bFGF er identiske (5, 8).
Det er nå funnet at når FGF renses fra hjernevev under anvendelse av heparin-Sepharose-affinitetskromatografi (9, 10), kan det også være tilstede en betydelig mengde ukjente proteiner. På grunn av at proteiner som bindes med spesiell høy affinitet til heparin er sjeldne, ble det foretatt ytterligere undersøkelse av disse ukjente proteiner. Denne undersøkelse viste at disse proteiner var HBBM, som er forskjellig fra FGF ved sin N-terminale sekvens og sine aminosyresammensetninger.
Følgelig er det et formål ved denne oppfinnelse å isolere, rense og karakterisere HBBM fra hjernevev. Det er et ytterligere formål ved denne oppfinnelse å påvise den fysiologiske aktivitet av HBBM.
Fig. 1 viser fraksjoneringen av 400 ml av 0,6 M NaCl-eluatet fra kationebytterkromatografi under anvendelse av heparin-Sepharose-affinitetskromatografi. Det horisontale brede linjestykket A angir de fraksjoner som inneholder HBBM som deretter ble kromatografert på nytt for ytterligere rensning. Det horisontale brede linjestykket B angir de fraksjoner som inneholder aFGF, bestemt ved reversfase-HPLC-analyse.
Fig. 2 angir resultatene av mono-S-kationebytterkromatografi på 20 ml av det eluerte materialet fra heparin-Sepharose-af finitetskromatografien (som angitt ved det horisontale brede linjestykket A, fig. 1). Pilene angir elueringsposisjonene for aFGF- og bFGF-standarder. Tallene i kromatogrammet henviser til HBBM-1, -2 og -3. Det horisontale brede linjestykket angir de fraksjoner som inneholder HBBM som ble anvendt som blanding eller individuelt for ytterligere rensning/karakterisering. Fig. 3 angir reversert-fase-HPIjC av HBBM. En porsjon av blandingen av mono-S-rensede HBBM (toppene 1-3, som angitt ved det horisontale brede linjestykket på fig. 2) ble underkastet reversert-fase-HPLC. Individuelle topper ble identifisert og utpekt som spesifikke mono-S-fraksjoner ved analyse av porsjoner av mono-S-kromatografifraksjoner (som angitt ved seksjoner av det horisontale brede linjestykket på fig. 2) ved uavhengige reversert-fase-HPLC-kjøringer. Toppene 1-3 refererer seg til henholdsvis HBBM-1, HBBM-2 og HBBM-3. Fig. 4 viser analysen på SDS-PAGE av HBBM som følger: Felt 1: proteinstandarder (lysozym, 14,4 kD; trypsininhibitor, 21,5 kD, karbonsyreanhydrase, 31 kD, ovalbumin, 45 kD, serumalbumin, 66,2 kD); felt 2: HBBM-1; felt 3: HBBM-2; felt 4: HBBM-3. Fig. 5 viser re-kromatograferingen av HBBM-3 på en mono-S-kationebytterkolonne. Fraksjonene som inneholdt HBBM-3 fra kromatografien som er angitt på fig. 2, ble blandet, fortynnet tre ganger med utgangsbuffer, og de fortynnede prøver ble kromatografert på en mono-S-kolonne, under betingelser som var identiske med dem som er vist på fig. 2. Porsjoner av fraksjonene ble utprøvd med hensyn til sin evne til stimulering av veksten av okse-aortabue-endotelceller (histogram). Retensjonstider for aFGF og bFGF er vist med piler. Et horisontalt bredt linjestykke markerer fraksjonene som deretter ble anvendt for konsentrering av HBBM-3. Fig. 6 viser den biologiske aktivitet av HBBM-3 og HBBM-1 ved hjelp av doseresponsanalyse og sammenlikning med FGF-aktiviteten. Evnen hos HBBM-3 og HBBM-1 til stimulering av veksten av okse-aortabue-endotelceller ble utprøvd. Øvre diagram: HBBM-3; nedre diagram: HBBM-1. I hvert diagram er heltrukken linje: HBBM; stiplet linje: aFGF; prikket linje: bFGF. Fig. 7 viser kromatografi av HBBM-3 på en hydrofob-interaksjonskolonne. En porsjon mono-S-konsentrert HBBM-3 ble underkastet HIC-kromatografi. Piler angir retensjonstidene for aFGF og bFGF under identiske kromatografiske betingelser. Porsjoner av kolonnefraksjoner ble utprøvd med hensyn til sin evne til stimulering av okse-aortabue-endotelcelleformering. Resultatene er angitt ved antallet celler dyrket i hver forsøksbrønn.
De nye vekstfaktorer som isoleres ifølge denne oppfinnelse er enkeltkjedede, basiske, heparinbindende hjernemitogener. HBBM er blitt identifisert i hjernevevet hos alle de utprøvde arter, som innbefatter mennesker, okse, rotte og kylling. Basert på denne fordeling, er det ventet at andre arter også vil inneholde HBBM.
De N-terminale sekvenser av HBBM er markert forskjellige fra dem som er publisert når det gjelder okse- eller menneskehjerne-aFGF og -bFGF (5, 6, 7). De N-terminale sekvenser av de første nitten aminosyrer er blitt funnet å være identiske for menneske- og okse-HBBM. De N-terminale sekvenser er som følger: Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Ser-Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln. Rottesekvensen er identisk, med unntak av cysteinresten i stilling 15, fordi bestemmelse av tilstedeværelse eller fravær av cystein ikke ble utført. Imidlertid er det faktum at ingen annen aminosyre ble identifisert i stilling 15, i overensstemmelse med den antatte tilstedeværelse av cystein. Inntil idag er de første ti N-terminale rester hos kylling HBBM blitt sekvensbestemt; de er identiske til menneske-, okse- og rotte-HBBM.
HBBM er blitt funnet i tre former i vev fra oksehjerne. HBBM-1, HBBM-2 og HBBM-3 har molekylvekt på henholdsvis 18, 16 og 15 kD. Deres aminosyresammensetninger (bestemt som beskrevet i det følgende) er oppført i tabell I nedenfor og er også forskjellige fra aminosyresammensetningene i oksehjerne-FGF (5,6,7).
Basert på molekylvektene og de identiske N-terminale sekvenser, kan man trekke den slutning at de tre HBBM sannsynligvis er forskjellige i sine C-terminale ender. De tilgjengelige data antyder sterkt at HBBM-2 og HBBM-3 er C-terminalt avkuttede former av HBBM-1, som mangler henholdsvis ca. 13 og 29 aminosyrer.
Det ble funnet at de forholdsmessige andeler av de tre former varierte mellom forskjellige isolerte ladninger. Imidlertid ble det totale isolasjonsutbyttet av HBBM, basert på kvantitativ aminosyreanalyse, gjennomsnittlig beregnet til ca. 30, 10 og 40 /Ltg/kg hjernevev når det gjaldt henholdsvis HBBM-1, HBBM-2 og HBBM-3. Andelene kan avhenge av variabler under oppbevaringen og ekstraksjonen av vevene, spesielt proteolyse. Proteolyse under vevsekstraksjon kan forårsake karboksyterminal avkutting av HBBM-1, den største av HBBM-1-formene, som ville gi HBBM-2 og HBBM-3 i varierende mengder.
Fremgangsmåten for isolering av de nye HBBM ifølge denne oppfinnelse i hovedsakelig ren form fra en hjernevevskilde omfatter følgende sekvens av trinn: (a) ekstraksjon fra vevskilden ved behandling av vevet i rekkefølge med 0,15 M ammoniumsulfat, justering av pH til 4,5 med saltsyre, omrøring og sentrifugering, behandling med ammoniumsulfat etter at pH er justert til 6-6,5 med natriumhydroksyd, omrøring og sentrifugering, fulgt av dialyse og sentrifugering, hvilket gir et ekstrakt inneholdende det ønskede heparinbindende hjernemitogen; (b) en første kationbytterkromatografi av ekstraktet fra trinn (a) omfattende adsorbsjon av ladninger på en karboksymetyl-Sephadex-kolonne, fulgt av vasking med 100 mM natriumfosfatbuffer ved pH 6, og eluering med 100 mM natriumfosfat, pH 6,0/0,6 M NaCl, hvilket gir eluat inneholdende det ønskede heparinbindende hjernemitogen;
(c) heparinaffinitetskromatografi av eluatet fra trinn (b)
ved at dette settes på en heparin-Sepharose-kolonne ved vasking med en buffer som inneholder 10 mM Tris HCl,
pH 7,0/0,6 M NaCl, fulgt av eluering med en lineær
gradient på fra 0,6-2,0 M NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, (d) en andre kationbytterkromatografi av eluateet fra trinn (c) på en ekvilibrert mono-S-kolonne , og etter påføring av prøven, vaskes med 50 mM natriumfosfat, pH 6,8, fulgt av eluering av HBBM med en lineær gradientn på fra 0-0,6 M NaCl i 50 mM natriumfosfat, pH 6,8, hvilket skiller enhver forurensende sur fibroblastvektor fra det ønskede
heparinbindende hjernemitogen;
og om ønsket, foretas en hydrofob interaksjonskromatografi etter trinn (d) på en HIC-kolonne forekvilibrert med en buffer av 100 mM natriumfosfat, pH 7,0 og 1,5 M natriumsulfat, hvorunder elueringen utføres med en lineær gradient på fra 1,5 - 0.6 M natriumsulfat.
Skjønt HBBM kan separeres lett og kvantitativt fra FGF ved reversert-fase-HPLC, reduserer denne fremgangsmåte den biologiske aktivitet hos FGF på grunn av de betingelser som anvendes ved reversert-fase-HPLC. For separering og isolering av HBBM og FGF i biologisk aktiv form for sammenliknings-utprøvning, ble derfor den ovennevnte fremgangsmåte utviklet. Anvendelsen av reversert-fase-HPLC ble begrenset til ut-prøvning av små porsjoner av fraksjoner fra heparin-Sepharose-af f initetskromatograf i og kationebytterkromatografi med hensyn til tilstedeværelse av HBBM og FGF. Reversert-fase-HPLC-trinnene ble utført på en C4-kolonne (The Separations Group), eluert med en svak gradient av acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre.
Den biologiske aktivitet av HBBM er blitt påvist ved forsøk som viser frembringelse av mitogenese i endotelceller. Skjønt HBBM-2 ikke ble utprøvd, antyder den påviste aktivitet for HBBM-1 og HBBM-3 at HBBM-2 også vil ha denne aktivitet. Utprøvningen ble utført på okse-aortabue-endotelceller.
Det ble utført tre adskilte forsøk, både for å bekrefte eksistensen av mitogenaktivitet og for å vise at aktiviteten skyldtes HBBM og ikke FGF.
Først ble de eluerte fraksjoner fra mono-S-kromatografi som inneholdt HBBM-3, blandet, kromatografert på nytt på en mono-S-kolonne og deretter utprøvd med hensyn til sin evne til stimulering av veksten av vaskulære okse-endotelceller. Til sammenlikning ble prøver av aFGF og bFGF også utprøvd. Fig. 5 representerer resultatene av denne utprøvning.
Deretter ble de tilgjengelige HBBM-3-fraksjoner kromatografert på nytt for prøvekonsentrasjon på en mono-S-kolonne under anvendelse av en steilere gradient og lavere strømnings-hastighet. HBBM-3 ble så sammenliknet med aFGF og bFGF i dose-responsanalyser. Det øvre diagram på fig. 6 viser resultatene av denne utprøvning. Denne fremgangsmåte ble så gjentatt når det gjaldt HBBM-1. Disse resultater er vist i det nedre diagram på fig. 6.
Til slutt ble HBBM-3-fraksjoner som var konsentrert ved mono-S-kromatografi, anbragt på en hydrofob-interaksjons-kolonne, som har andre selektiviteter enn en mono-S-kolonne. Fig. 7 viser resultatene fra denne utprøvning. Disse prøver påviser at HBBM stimulerer formeringen av dyrkede vaskulære okse-endotelceller på en dose-avhengig måte. ED50 var ca. 20 ng/ml for HBBM-3 og 180 ng/ml for HBBM-1. ED50 ble beregnet som følger: ED50 = conc [cellenr. (dose = 0) + cellenr. (dose = maks)/2]. Disse mikrogener kunne sammenliknes med FGF når det gjaldt biologisk aktivitet og høy affinitet overfor heparin. HBBM-1 og HBBM-3 er begge ekvipotente med aFGF. ED50 er i området 50-150 ng/ml.
Forsøksresultatene gjør det også klart at den biologiske aktivitet som var forbundet med HBBM-3, var ekte og var ikke resultatet av forurensning med FGF. HBBM-3 og FGF separeres tydelig ved sterkt oppløsende mono-S-kromatografi, som vist på fig. 5, og separeres også tydelig ved en andre høyoppløsning-steknikk med forskjellige selektiviteter, hydrofob-interaksjonskromatografi som vist på fig. 7.
Videre inneholdt HBBM ikke målbare mengder av aFGF, bestemt ved kvantitativ reversert-fase-HPLC. Som et ytterligere bevis for at aktiviteten skyldtes HBBM, var HBBM ikke kryssreaktivt i en immun-punktanalyse ved anvendelse av polyklonale antistoffer frembragt mot syntetiske peptider som svarte til de N-terminale 15 rester hos aFGF (1-15) og bFGF (30-50); sistnevnte gir et antistoff som kryssreagerer med aFGF (antistoffer levert av A. Baird, Salk Institute; vekstfaktornomenklatur i henhold til ref. 5,7). Endelig ble konsentrasjonene av HBBM- og aFGF-preparatene omhyggelig bestemt ved kvantitativ aminosyreanalyse som basis for styrke-sammenlikninger (fig. 6). Basert på disse målinger, ville et i seg selv inaktivt HBBM-3 måtte forurenses med en lik mengde aFGF for frembringelse av den biologiske respons som kunne sees. Resultatene utelukker en slik forurensning. Oppsummert viser resultatene av disse undersøkelser tydelig at aktiviteten av HBBM-3 ikke er en følge av aFGF-forurensning.
Flere rekker av bevis angir videre at HBBM-3-aktiviteten ikke skyldes bFGF-forurensning. I teorien ville noen få prosent forurensning av HBBM-3 med bFGF være nok til frembringelse av de observerte aktiviteter. Ingen ting tyder imidlertid på en slik forurensning, fordi HBBM og bFGF separeres i stor grad på heparin-Sepharose-kromatografi. Videre separeres også HBBM-3 og bFGF godt i mono-S-kroma-tograf i (fig. 5). Endelig var det tydelig, når HBBM-3 ble underkastet kromatografi på et tredje meget godt oppløsende system, hydrofob-interaksjonskromatografi, at den biologiske aktivitet fremdeles var forbundet med HBBM-3 og ikke med de godt separerte bFGF (fig. 7). Det er ingen ting som tyder på at de to enhetene vil ko-renses, selv i spormengder, i tre helt uensartede og resolutive kromatografiske systemer.
Basert på disse resultater kan man slutte den konklusjon at aktiviteten av HBBM-3 er ekte og ikke resultatet av forurensning med de kjente heparin-bindende FGF.
HBBM skilles videre fra FGF ved mangel på aminosyresekvens-homologi mellom de to proteingrupper. I tillegg til den forskjell i N-terminale sekvenser som er beskrevet tidligere, viser den nåværende tilgjengelige sekvens-informasjon (ca. 75 av 130 rester av HBBM-3) ingen sekvens-homologi med den publiserte 146-rest-sekvens hos FGF (5).
Den mitogene aktivitet hos menneske-HBBM ble generelt funnet ikke å kunne sjeldnes fra aktiviteten av okse-HBBM, skjønt menneske-mitogenene var karakterisert i mindre utstrekning på grunn av begrensede mengder tilgjengelig materiale. Dette er i overensstemmelse med andre funn: identisk aminoterminal sekvens, tilstedeværelse av tre former, og retensjonsopptreden ved ionebytter-, heparin-Sepharose- og reversert-fase-kromatografi.
Identiteten av N-terminale sekvenser blant de forskjellige kilder til HBBM antyder at evolusjonstrykk kan ha forhindret mutasjoner, i det minste under utviklingen fra fugler til pattedyr. Det er sterk mistanke om sekvensbevaring som et resultat av evojusjonstrykk når det gjelder mange velkjente, biologisk aktive proteiner som er meget homologe artende i mellom.
HBBM var ikke tilstede i oksenyrevev som ble ekstrahert under anvendelse av fremgangsmåten for hjernevev. HBBM er derfor nye proteiner som også kan spille en rolle ved dannelse, vedlikehold og/eller reparasjon av vev, spesielt nervevev.
Grunnlaget for denne fremstilling av HBBM's rolle er følgende: (1) HBBM har de samme biologiske og heparinbindende aktiviteter som aFGF; (2) HBBM er hjernespesifikke; (3) større mengder av HBBM enn aFGF er funnet i hjernen; og (4) aFGF og bFGF er kjent for å ha meget fremtredende nerveaktiviteter, såsom nevrotropisk (nevron-overlevelses) aktivitet in vivo og in vitro, de er mitogene når det gjelder nevroblaster og gliaceller, de understøtter nevrittutveksten og bevirker hjernespesifikk proteinsyntese.
Skjent proteinstrukturene hos HBBM og FGF er ulike, antyder likheten av dem når det gjelder heparinbindende og biologisk aktivitet, at begge grupper mitogener fungerer ved en likeartet mekanisme. F.eks. kunne mitogenene bindes til celleoverflaten eller ekstracellulære, matriks-tilknyttede heparinliknende strukturer.
Eksempel
I dette eksempel er isolering og karakterisering av okse-HBBM beskrevet detaljert. Resultatene ved anvendelse av humant materiale var meget like og vil ikke bli beskrevet detaljert dersom det ikke ble funnet forskjeller i forhold til bovint materiale.
1) Vevsekstraksi on
Menneskehjernene fikk man mindre enn 24 timer etter døden fra patologisk avdeling, universitetet i Ziirich. Oksehjernene fikk man på et slakteri. Vevene ble frosset like etter mottakelse, lagret ved -80°C og bearbeidet innen to uker etter mottakelse. Mengder på 3-5 kg hjernevev ble ekstrahert om gangen.
Hjernevevet ble ekstrahert ifølge fremgangsmåten som er utviklet av Gospodarowicz og samarbeidspartnere (2) søm beskrevet (6, 10): Frosne hjerner ble knust med en hammer. Porsjoner på 600 g vev ble homogenisert i 1,2 1 0,15 M ammoniumsulfat i 3 minutter i en Waring-blander. Homogenatets pH ble straks justert til pH 4,5 med konsentrert HC1, og blandingen ble ytterligere homogenisert under anvendelse av en Polyton-homogenisator inntil vevet var fint dispergert. Homogenatet ble så ekstrahert ved omrøring av suspensjonen i 2 timer ved 4°C, fulgt av sentrifugering ved 4°C i 60 minutter ved enten 11.500 opm (omdreininger pr. minutt) (GSA-rotor) eller 9.000 opm (GS-3-rotor) for fjerning av celler og cellerester. Supernatanten ble justert til pH 6-6,5 med NaOH. Ammoniumsulfat (23 0 g/l) ble tilsatt langsomt, og den resulterende suspensjon ble omrørt i minst 3 0 minutter ved 4°C og sentrifugert igjen som beskrevet ovenfor. Celleklumpen ble kastet. Mer ammoniumsulfat (300 g/l) ble langsomt tilsatt til supernatanten, suspensjonen ble omrørt i minst 3 0 minutter ved 4°C og sentrifugert som ovenfor. Den resulterende celleklump ble oppløst i kaldt vann (100 ml/kg utgangsmateriale) og dialysert ved 4°C i 20 timer mot 2 0 1 vann under anvendelse av en Spectrapor-membran (molekylvekt-utelukkelse 6-8 kD, dia-meter 31,8 mm). Dialysatet ble sentrifugert igjen under fjerning av utfelt materiale og supernatanten underkastet krornatografisk rensning (se nedenfor) etter bestemmelse av ledningsevnen.
2) Kationebvtterkrornatoqrafi
Vevsekstraktet fra den ovenfor beskrevne fremgangsmåte (ca. 150 ml for hvert kg hjernevev) ble underkastet porsjons-adsorpsjon/eluering ved kationebytterkromatografi som følger: Prøven ble fortynnet med vann som var nødvendig for å bringe ledningsevnen til under ledningsevnen av en 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 6)/0,15 M NaCl-oppløsning. Prøven ble så påsatt på en kolonne av karboksymetyl-Sephadex (5,5 x 3 cm) som var for-ekvilibrert med 100 mM natriumfosfat (pH 6)/0,15 M NaCl. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbufferen, og en proteinfraksjon ble eluert med 100 mM natriumfosfat, pH 6,0/0,6 M NaCl og oppsamlet. Alle operasjoner ble utført ved romtemperatur og en strømningshastighet på 500 ml/time.
3) Heparin- Sepharose- affinitetskromatografi
Eluatet med 0,6 M NaCl fra kationebytterkromatografi ble påsatt på en heparin-Sepharose-kolonne (Pharmacia, 5 x 1,5 cm) ved en strømningshastighet på 125 ml/time. Kolonnen ble vasket med 200 ml av en buffer som inneholdt 10 mM Tris-HCl, pH
7,0/0,6 M NaCl inntil absorbansen av kolonne-eluatet ved 280 nm ble ubetydelig. Protein som var bundet til kolonnen ble eluert med en 120-minutters lineær gradient fra 0,6 M til 1 M NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 ved en strømningshastighet på 35 ml/time. Kromatografi ble utført ved romtemperatur under anvendelse av en peristaltisk LKB-pumpe og en programmerbar lavtrykks-LKB-gradientdanner. Fraksjoner på 1,4 ml ble oppsamlet og porsjoner underkastet bioanalyse.
Resultatene av denne heparin-Sepharose-kromatografi er vist på fig. 1. Fraksjonene som ble underkastet ytterligere rensning, under anvendelse av trinn som er beskrevet nedenfor, er angitt ved det horisontale brede linjestykket A. Fraksjonene som inneholdt aFGF, ble eluert ved mellom 1,1 og 1,3 M NaCl (påvist ved HPLC-analyse av individuelle heparin-Sepharose-kolonnefraksjoner; data ikke vist) og svarer til skulderen på den større topp som ble eluert ved 1-1,2 M NaCl, og til det horisontale brede linjestykket B. Reversert-fase-HPLC-analysen ble utført på en C4-kolonne (25 c 0,46 cm, 5 ura. partikkelstørrelse, 3 00 Ångstrømstørrelse, The Separations Group, Hesperia, CA). Proteinene ble eluert i en svak gradient av acetonitril (10%/time) i 0,1% trifluoreddiksyre ved en strømningshastighet på 0,7 ml/min. Heparin-Sepharose-kromatografien ble utført ved romtemperatur.
4) Mono- S- kationebvtterkromatografi
For fraskillelse av den forurensende aFGF fra det annet proteinmateriale, ble fraksjoner som ble eluert ved 1-1,2 M NaCl, blandet, fortynnet tilstrekkelig med en buffer som inneholdt 50 mM natriumfosfat, pH 6,8 (for reduksjon av deres ionestyrke omtrent til fortynningsmiddelet ionestyrke) og underkastet kationebytterkromatografi på en mono-S-kolonne (Pharmacia) ekvilibrert med 50 mM natriumfosfat, pH 6,8. Dette materialet ble pumpet på en mono-S-kolonne (Pharmacia) ekvilibrert med 50 mM natriumfosfat, pH 6,8. Etter vasking av kolonnen med den samme buffer inntil absorbansen ved 210 nm nådde en minimumsverdi, ble protein eluert med en gradient på fra 0-0,6 M NaCl i 50 mM natriumfosfat, pH 6,8.
Flere topper som var lette å sjeldne fra hverandre, ble eluert fra mono-S-kolonnen under disse betingelser, som vist på fig. 2. Hver topp ble analysert ved reversert-fase-HPLC under anvendelse av LKB-HPLC-utstyr ved romtemperatur med en strømningshastighet på 0,7 ml/min.
Den første og kvantitativt minste topp som ble eluert fra mono-S-kolonnen ved 0,3 M NaCl, svarte til aFGF, som påvist ved ko-eluering med en referansestandard av autentisk aFGF i det samme system under identiske betingelser (se pil på fig. 2), såvel som ved ko-eluering i reversert-fase-HPLC på en tidligere beskrevet C4-kolonne, eluert under meget resolutive svak-gradient-betingelser (data ikke vist). Tilstedeværelsen av aFGF i denne mono-S-kolonnefraksjon var ventet, på grunn av at begynnelsesfraksjonen fra heparin-Sepharose-kromatografi er kjent for å inneholde aFGF. Hovedandelen av materialet ble eluert fra mono-S-kolonnen ved ca. 0,45-0,65 M NaCl som en forholdsvis godt oppløst triplett av topper. Siden disse topper ble påvist å inneholde HBBM, som beskrevet i det følgende, ble de betegnet som HBBM-3, HBBM-2 og HBBM-1, i den rekkefølge de ble eluert (fig. 2). Oppførselen hos humant HBBM ved eluering på en mono-S-kolonne er generelt likeartet, men er blitt mindre undersøkt enn bovint HBBM.
HBBM'ene kan tydelig sjeldnes ved kromatografisk retensjon ikke bare fra aFGF, men også fra bFGF (fig. 2).
Ved analysering ved reversert-fase-HPLC (fig. 3) ble HBBM dessuten også funnet å være tydelig forskjellig fra FGF med hensyn til retensjonstider (data ikke vist). Endelig skilte reversert-fase-HPLC alle de tre HBBM-typene fra hverandre (fig. 3) og tilveiebragte således et hjelpemiddel for fremstilling av dem med høy renhet (som nødvendig for strukturell karakterisering) og for forholdsvis utvetydig identifikasjon.
Menneskehjerne ga også tre former for, HBBM med reversert-fase-HPLC-elueringsmønstre identiske med mønstrene hos sine bovine motstykker.
5) Hvdrofob- interaksions- kromatografi
Fraksjoner fra mono-S-kromatografi som inneholdt prøver av interesse, ble tillaget som 1,5 M oppløsninger i natrium-sulf at og påført på en HIC-kolonne (LKC Ultropac TSK-Fenyl-5PW, 7,5 x 75 mm) som var for-ekvilibrert med en buffer av 100 mM natriumfosfat, pH 7,0/1,5 M natriumsulfat. Protein ble kromatografert ved romtemperatur under anvendelse av en 30-minutters lineær gradient på fra 1,5 til 0,6 M natriumsulfat ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min. Hydrofob-interaksjonskromatografi er et separasjonssystem med selektiviteter som er helt forskjellige fra mono-S-kromatografi. Følgelig underbygger separasjonen av HBBM fra FGF ved HIC (som vist på fig. 7) resultatet av mono-S-kromatografi (som vist på fig. 5) at HBBM er andre kjemiske enheter enn FGF.
6) Aminosvre- N- terminal- sekvensanalyse
Vanligvis ble sekvensanalyser utført uten kjemisk modifikasjon av proteinene. Som et foreløpig trinn ved utførelsen av noen analyser av aminosyre-N-terminalsekvensen hos HBBM, ble imidlertid cysteinrestene hos de HPLC-rensede proteiner behandlet i henhold til fremgangsmåten ifølge Gautschi-Sova et al. (6). Cysteinrestene ble kort og godt redusert med et femdobbelt molart overskudd av detiotreitol og alkylert ved karboksymetylering under anvendelse av et tre-dobbelt molart overskudd av jod-[<1A>C]-eddiksyre.
Aminosyre-N-terminal-sekvensanalysene av proteiner (100-500 pmol) ble utført på et gass/væskefase-proteinmikro-sekvensanalyseapparat av typen Applied Biosystems (Foster City, CA) modell 470A som beskrevet av Esch et al. (5). Dessuten ble fenyltiohydantoin (PTH)-derivater av aminosyrer identifisert ved reversert-fase-HPLC på en "on-line" PTH-aminosyreanalysator av typen Applied Biosystems modell 120A. Begge fremgangsmåtene ble utført ifølge forskriftene fra instrumentfabrikanten under anvendelse av kjemikalier levert fra Applied Biosystems.
De N-terminale sekvenser hos alle de tre HBBM-typer ble funnet å være identiske med hverandre når det gjaldt de første 19 aminosyrer. Sekvensene ble bestemt som Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Ser-Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln. Humant HBBM (sannsynligvis analysert som en blanding) ble funnet å ha den samme N-terminale sekvens som bovint HBBM.
Mens sekvensbestemmelsedata tydelig angir at de tre bovine HBBM-proteiner er strukturelt beslektet med hverandre, antyder aminosyresammensetningene og molekylvektene videre at disse proteiner kan være forskjellige når det gjelder det karboksy-terminale området. Alle data er forenlige med de alternative fortolkninger at både HBBM-2 og HBBM-3 er karboksyterminalt avkuttede former av HBBM-1, som mangler henholdsvis ca. 13 og 29 aminosyrer ved sine karboksyterminale ender.
7) Molekvlvekter for HBBM
Proteinprøver ble analysert under anvendelse av natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese ("SDS-PAGE") som beskrevet av Gospodarowicz et al. (9). Kort beskrevet ble molekylvektsbestemmelsene utført med SDS-PAGE som følger: Porsjoner som inneholdt 40-80 ng protein ble tilsatt til prøvebufferen som besto av 3 0 volumprosent glycerol, 0,2 M ditiotreitol, 4 vekt/volumprosent dodecylsulfat, 4 mM EDTA og 75 mM Tris-HCl, pH 6,8. Prøvene ble kokt i 3 minutter og deretter påført på en 20% polyakrylamidgel-plate (1,5 mm) med en 3% stabelgel. Elektroforese under ikke-reduserende betingelser ble utført på identisk måte, bortsett fra at ditiotrei-tolen ble utelatt fra prøvebufferen. En proteinstandard-blanding som inneholdt lysozym (14,4 kD) , trypsininhibitor (21,5 kD), karbonsyreanhydraze (31 kD), ovalbumin (45 kD) og serumalbumin (66,2 kD) ble også påført på hver gel. SDS-PAGE viste at molekylvektene for HBBM-1, -2 og -3 var henholdsvis 18, 16 og 15 kD (fig. 4). Molekylvektene var ikke forskjellige i noen betydelig grad uansett om prøvene ble kjørt på elektroforese i nærvær eller fravær av reduserende middel, hvilket anga at proteinene er enkeltkjedede polymerer. Molekylvektene for de humane HBBM-typer er ennå ikke blitt bestemt ved SDS-PAGE.
8) Analyse av aminosvresammensetninq
En 10-20 pmol proteinprøve ble hydrolysert i henhold til høysensitivitetsmetoden ifølge Bohlen og Schroeder (11). Kort beskrevet ble proteinprøven fyllt i et hydrolyserør og tørket i vakuum. 50 /il konstant kokende HC1 som inneholdt 2 volumprosent tioglykolsyre ble tilsatt. Røret ble så evakuert med høyvakuum (mindre enn 50 mm torr) etter frysing av prøven i flytende nitrogen. Prøven fikk så smelte mens den var under vakuum, og røret ble flammeforseglet.
Røret ble hydrolysert ved oppvarming ved 110°C i 20 timer. Etter hydrolyse ble røret åpnet, tørket i vakuum, og residuet ble oppløst i 13 0 jul citratbuffer (0,067 natrium-citrat, pH 2,20) før påsetting på kationebytterkromato-graf ikolonnen.
Proteinhydrolysatene ble kromatografert på en aminosyre-analysator av typen Chromakon 500 (Kontron, Ziirich, Sveits) , utstyrt med en polystyren-basert kationebytterkolonne og et o-ftalaldehyd-fluorescenspåvisningssystem for høysensitivitets-påvisning (11).
Kvantifisering av aminosyrene ble utført ved den eksterne standardmetode under anvendelse av en aminosyre-standardblanding. Basert på kvantitativ aminosyreanalyse ble det totale isolasjonsutbyttet av HBBM beregnet til henholdsvis ca. 30, 10 og 40 /xg/kg hjernevev for HBBM-1, HBBM-2 og HBBM-3.
Aminosyresaiiimensetningene av de tre HPLC-rensede proteiner er vist i tabell I.
8, tryptofan 3, Arginin 8.
Aminosyresammensetningene er beregnet fra 3-5 bestem-melser.
Aminosyresammensetniningsdata er i overensstemmelse med elueringsrekkefølgen for de tre proteiner på mono-S: det minst basiske protein (HBBM-3) elueres først, mens det mest basiske protein (HBBM-1) elueres sist. Ventede molekylvekter beregnet ut fra aminosyreanalysene er noe lavere enn molekylvektene bestemt med SDS-PAGE. Avvikene kan tilskrives prolin- og cysteinrester som ikke ble kvantifisert ved aminosyreanalyse. Basert på N-terminal-sekvensanalysen er det imidlertid kjent at prolin og cystein virkelig er tilstede. Aminosyreanalyser av humant HBBM er ennå ikke tilgjengelige.
9) Biologisk aktivitet
Noen av HBBM-typenes .evne til frembringelse av mitogenese i endotelceller ble utprøvd ved måling av effekten av disse proteiner på formeringen in vitro av okse-aortabue-endotelceller som var blitt dyrket som beskrevet av Bohlen et al. (2, 10). Kort beskrevet ble okse-endotelcellene utsådd med kolonnefraksjoner oppnådd som beskrevet nedenfor ved lav densitet (10.000-20.000 celler/35 mm plate) i Dulbeccos modi-fiserte Eagles medium som inneholdt 10% kalveserum (Hyclone, Sterile Systems, Logan, UT). Kulturene ble dyrket i 5 dager i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av kolonnefraksjons-porsjoner (tilsatt dag 0 og 2) og deretter tellet i en Coulter-partikkelteller. De biologiske aktiviteter hos de utprøve proteiner er angitt ved antallet vaskulære endotelceller dyrket i hver testbrønn for hver fraksjon på fig. 5-7.
Spesielt ble aktiviteten av HBBM sammenliknet med aktiviteten av FGF. Under anvendelse av publiserte fremgangsmåter (9, 12) ble aFGF og bFGF isolert og deres autentisitet ble bekreftet ved N-terminal-sekvensanalyse og molekylvekt-bestemmelse (SDS-PAGE).
Elueringsfraksjonene som svarte til toppen for HBBM-3 fra mono-S-kromatografi, som vist på fig. 2, ble blandet, fortynnet tre ganger med utgangsbuffer og kromatografert på nytt på det samme system. Porsjoner av disse fraksjoner ble utprøvd som beskrevet ovenfor med hensyn til deres evne til stimulering av veksten av vaskulære okse-endotelceller. Sammenlikningsforsøk ble kjørt med aFGF og bFGF. Resultatene viste, som vist på fig. 5, at HBBM-3 stimulerte mitogenaktivitet når det gjaldt okse-endotelceller. Videre kunne HBBM-3 og dets aktivitet skilles fra FGF.
Ved ytterligere aktivitetstest ble de tilgjengelige HBBM-3-fraksjoner konsentrert på en mono-S-kolonne under anvendelse av det samme buffersystem som beskrevet for fig. 2, men med en steilere gradient (0-1,0 M NaCl på 20 minutter) og lavere strømningshastighet (0,4 ml/min.). Sammenliknings-doseresponsanalyser ble kjørt med aFGF og bFGF.
Det øvre diagram på fig. 6 angir at HBBM-3 stimulerte okse-aortaendotelceller på en doseavhengig måte. ED50 var i størrelsesordenen 20-50 ng/ml, idet den minimalt stimulerende dose var ca. 3 ng/ml. Doseresponskurvene for HBBM-3 og aFGF kunne ikke sjeldnes fra hverandre, hverken kvalitativt eller kvantitativt, under de anvendte analysebetingelser. Responsen hos HBBM-3 viste seg å kunne sjeldnes fra responsen hos bFGF. I det anvendte analysesystem hadde bFGF mye høyere potens og tilsynelatende høyere iboende akvititen enn HBBM-3. Det skal imidlertid bemerkes at spørsmålet om iboende aktivitet av HBBM-3 ikke er hensiktsmessig ved denne prøve, fordi doser som er tilstrekkelig høye til at vurdering av den iboende aktivitet av HBBM-3 er mulig, ikke kan anvendes i analysen på grunn av begrensninger med hensyn til den mengde salt som kan tilsettes til cellene uten skadelige virkninger på celle-veksten. Foreløpige resultater angir imidlertid at den iboende aktivitet av HBBM-3 er identisk med aktiviteten av aFGF under de anvendte analysebetingelser.
Doseresponsanalysen ble gjentatt for HBBM-1. Resultatene angir, som vist i det nedre diagram på fig. 6, at HBBM-1 også var biologisk aktivt i det samme testsystem. Humant HBBM, som omfattet en blanding av HBBM-1, -2 og -3, ble utprøvd på samme måte og var aktivt på samme måte (data ikke vist). Imidlertid har man ennå ikke fått resultater for individuelle fraksjoner av de humane HBBM-typer. Videre ble bovine HBBM-typer også utprøvd på humane navlestrengsendotelceller og funnet å være aktive (data ikke vist).
Til slutt ble porsjoner av HBBM-3, konsentrert ved mono-S-kromatograf i , laget som 1,5 M oppløsning i natriumsulfat og anbragt på en hydrofob-interaksjons-kolonne. Resultatene anga, som vist på fig. 7, at HBBM-3 var aktivt og var godt separert både fra aFGF og bFGF.
REFERANSER
1. Gospodarowicz, D., J. Biol. Chem., 250, 2515-2520 (1975). 2. Gospodarowicz, D., Bialecki, H., og Greenburg, G., J.
Biol. Chem.. 253. 3736-3743 (1978).
3. Bohlen, P., Baird, A., Esch, F., Ling, N., og Gospodarowicz, D., Proe. Nat. Acad. Sei., 81 5364-5368
(1984) . 4. Thomas, K., Rios-Candelore, M., og Fitzpatrick, S., Proe.
Nat. Acad. Sei., 81, 357-361 (1984).
5. Esch, F., Baird, A., Ling, N., Ueno, N., Hill, F., Denoroy, L., Klepper, R., Gospodarowics, D., Bohlen, P., og Guillemin, R., Proe. Nat. Acad. Sei., 82, 6507-6511
(1985) . 6. Gautschi-Sova, P., Mueller, T., og Bohlen, P. BBRD, 140, 874-880 (1986). 7. Gimenez-Ga 11 ego, G., Rodkey, J., Bennett, C, Rios-Candelore, M., DiSalvo, J. og Thomas, K., Science. 230.
1385-1388 (1985).
8. Bohlen, P., Esch, F., Baird, A., Jones, K. og
Gospodarowicz, D., FEBS Lett., 185, 177-181 (1985).
9. Gospodarowicz, D., Cheng, J., Lui, G., Baird, A., og
Bohlen, P., Proe. Nat. Acad. Sei.. 81, 6963-6967 (1984). 10. Bohlen, P., Esch, F., Baird, A., og Gospodarowicz, D.,
EMBO J.. 4, 1951-1956 (1985). 11. Bohlen, P., og Schroeder, R., Anal. Biochem.. 126, 144-152 (1982) . 12. Gautschi-Sova, P., Jiang, Z.P., Frater-Schroeder, M., og Bohlen, P., Biochemistrv, 26, 5844-5847 (1987).
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for isolering av heparin-bindende hjernemitogen i hovedsakelig ren form med den N-terminale aminosyresekvens H-Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val-, isolert fra menneske-, hønse- eller storfe-hjernevev, hvori det heparinbindende hjernemitogen er valgt fra gruppen bestående av HBBM-1, HBBM-2 og HBBM-3, hvor HBBM-1 har en molekylvekt på ca. 18.000 dalton, HBBM-2 har en molekylvekt på ca. 16.000 dalton,og HBBM-3 har en molekylvekt på ca. 15.000 dalton, besmten ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser, med aminosyresammensetning:
hvor prolin og cystein var tilstede, basert på den N-terminale aminosyresekvens, men innholdet av dem var ikke bestemt, karakterisert ved(a) ekstraksjon fra vevskilden ved behandling av vevet i rekkefølge med 0,15 M ammoniumsulfat, justering av pH til 4,5 med saltsyre, omrøring og sentrifugering, behandling med ammoniumsulfat etter at pH er justert til 6-6,5 med natriumhydroksyd, omrøring og sentrifugering, fulgt av dialyse og sentrifugering, hvilket gir et ekstrakt inneholdende det ønskedeheparinbindende hjernemitogen; (b) en første kationbytterkromatografi av ekstraktet fra trinn (a) omfattende adsorbsjon av ladninger på en karboksymetyl-Sephadex-kolonne, fulgt av vasking med 100 mM natriumfosfatbuffer ved pH 6, og eluering med 100 mM natriumfosfat, pH 6,0/0,6 M NaCl, hvilket gir eluat inneholdende det ønskede heparinbindende hjernemitogen ; (c) heparinaffinitetskromatografi av eluatet fra trinn (b) ved at dette settes på en heparin-Sepharose-kolonne ved vasking med en buffer som inneholder 10 mM Tris HC1,
pH 7,0/0,6 M NaCl, fulgt av eluering med en lineær gradient på fra 0,6-2,0 M NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, (d) en andre kationbytterkromatografi av eluateet fra trinn (c) på en ekvilibrert mono-S-kolonne, og etter påføring av prøven, vaskes med 50 mM natriumfosfat, pH 6,8, fulgt av eluering av HBBM med en lineær gradient på fra 0-0,6 M NaCl i 50 mM natriumfosfat, pH 6,8, hvilket skiller enhver forurensende sur fibroblastvektor fra det ønskede heparinbindende hjernemitogen;
og om ønsket, foretas en hydrofob interaksjonskromatografi etter trinn (d) på en HIC-kolonne forekvilibrert med en buffer av 100 mM natriumfosfat, pH 7,0 og 1,5 M natriumsulfat, hvorunder elueringen utføres med en lineær gradient på fra 1,5 - 0.6 M natriumsulfat.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at de eluerte fraksjoner fra trinnene (c) og (d) analyseres med hensyn til tilstedeværelse av heparinbindende hjernemitogen ved reversfase-HPLC.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,
karakterisert ved at oksehjerne anvendes som vevskilde.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14783588A | 1988-01-25 | 1988-01-25 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO890295D0 NO890295D0 (no) | 1989-01-24 |
| NO890295L NO890295L (no) | 1989-07-26 |
| NO175594B true NO175594B (no) | 1994-07-25 |
| NO175594C NO175594C (no) | 1994-11-02 |
Family
ID=22523098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO890295A NO175594C (no) | 1988-01-25 | 1989-01-24 | Fremgangsmåte for isolering av heparin-bindende hjerne-mitogen |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0326075B1 (no) |
| JP (1) | JPH01308300A (no) |
| AT (1) | ATE94882T1 (no) |
| AU (1) | AU624803B2 (no) |
| DE (1) | DE68909254T2 (no) |
| DK (1) | DK29889A (no) |
| ES (1) | ES2058350T3 (no) |
| FI (1) | FI890342A (no) |
| NO (1) | NO175594C (no) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8801426D0 (sv) * | 1988-04-15 | 1988-04-15 | Ulf Rothman | Forfarande och medel for blodbehandling |
| US5126323A (en) * | 1989-11-16 | 1992-06-30 | Genetics Institute, Inc. | Homogeneous purified k-fgf and compositions containing the same |
| US6448381B1 (en) * | 1990-01-08 | 2002-09-10 | Barnes-Jewish Hospital | DNA encoding heparin-binding growth factor |
| ATE154608T1 (de) * | 1990-04-12 | 1997-07-15 | Ebewe Arzneimittel | Verwendung einer mischung von peptiden and aminosäuren für die prophylaxis oder behandlung von dementia |
| FR2665448A1 (fr) * | 1990-08-01 | 1992-02-07 | Paris Val De Marne Universite | Procede d'obtention d'un peptide ayant une activite facteur de croissance, produit obtenu et son application comme medicament. |
| US5210026A (en) * | 1990-08-20 | 1993-05-11 | American Cyanamid Company | Human mk gene and method of expression |
| US6511823B1 (en) * | 1990-08-20 | 2003-01-28 | American Cyanamid Corporation | Heparin binding neurotrophic factor gene sequence |
| EP0535337A3 (en) * | 1991-09-30 | 1993-05-19 | American Cyanamid Company | Cell growth inhibiting activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor |
| EP0535336A3 (en) * | 1991-09-30 | 1993-05-19 | American Cyanamid Company | Mk protein as cell growth inhibitor |
| FI980032A0 (fi) * | 1998-01-09 | 1998-01-09 | Heikki Matti Eemeli Rauvala | Ny anvaendning av en heparin bindande, med tillvaext foerknippad molekyl |
| US6364912B1 (en) * | 1999-09-17 | 2002-04-02 | Depuy Orthopeaedics, Inc. | Pleiotrophin-based compositions for enhancing connective tissue repair |
| US7888485B2 (en) | 2003-03-26 | 2011-02-15 | Georgetown University | Anti-pleiotrophin antibodies and methods of use thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0248088A4 (en) * | 1985-11-22 | 1988-05-03 | Teijin Ltd | VASCULARIZATION FACTOR AND MANUFACTURING. |
| EP0241136A3 (en) * | 1986-03-07 | 1989-12-27 | The President And Fellows Of Harvard College | Human class 1 heparin-binding growth factor |
| CA2005600A1 (en) * | 1988-12-20 | 1990-06-20 | Cal-Henrik Heldin | Endothelial cell growth factor |
-
1989
- 1989-01-24 JP JP1013330A patent/JPH01308300A/ja active Pending
- 1989-01-24 ES ES89101187T patent/ES2058350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-24 FI FI890342A patent/FI890342A/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-01-24 DK DK029889A patent/DK29889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-01-24 AT AT89101187T patent/ATE94882T1/de active
- 1989-01-24 DE DE89101187T patent/DE68909254T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-24 EP EP89101187A patent/EP0326075B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-24 NO NO890295A patent/NO175594C/no unknown
- 1989-01-24 AU AU28737/89A patent/AU624803B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68909254D1 (de) | 1993-10-28 |
| NO175594C (no) | 1994-11-02 |
| DE68909254T2 (de) | 1994-04-28 |
| NO890295D0 (no) | 1989-01-24 |
| JPH01308300A (ja) | 1989-12-12 |
| DK29889A (da) | 1989-07-26 |
| ES2058350T3 (es) | 1994-11-01 |
| EP0326075B1 (en) | 1993-09-22 |
| AU624803B2 (en) | 1992-06-25 |
| NO890295L (no) | 1989-07-26 |
| FI890342A0 (fi) | 1989-01-24 |
| ATE94882T1 (de) | 1993-10-15 |
| AU2873789A (en) | 1989-07-27 |
| EP0326075A3 (en) | 1989-10-18 |
| DK29889D0 (da) | 1989-01-24 |
| EP0326075A2 (en) | 1989-08-02 |
| FI890342A (fi) | 1989-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schramm et al. | Nucleotide sequence of the colicin B activity gene cba: consensus pentapeptide among TonB-dependent colicins and receptors | |
| Ikeda et al. | Human transforming growth factor type. beta. 2: production by a prostatic adenocarcinoma cell line, purification, and initial characterization | |
| US4785079A (en) | Isolation of fibroblast growth factor | |
| CA1340972C (en) | Follistatin and method of purifying same | |
| Gautschi-Sova et al. | Acidic fibroblast growth factor is present in nonneural tissue: isolation and chemical characterization from bovine kidney | |
| NO175594B (no) | Fremgangsmåte for isolering av heparin-bindende hjerne-mitogen | |
| DK170713B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af humant lymphotoxin | |
| US5136025A (en) | Method to purify basic fibroblast growth factor | |
| Ojika et al. | Purification and structural analysis of hippocampal cholinergic neurostimulating peptide | |
| US5767240A (en) | Activity-dependent neurotrophic factor | |
| JPH02502008A (ja) | 形質転換成長因子‐β | |
| NZ222168A (en) | Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions | |
| EP0232326A4 (en) | INHIBIN AND ITS PURIFICATION PROCESS. | |
| JP2010031055A (ja) | Ｔｆｐｉおよびｔｆｐｉアナログを精製するための改良された方法 | |
| US4902782A (en) | Isolation of fibroblast growth factor | |
| Böhlen et al. | Isolation from bovine brain and structural characterization of HBNF, a heparin-binding neurotrophic factor | |
| US5332669A (en) | Prostate-derived mitogen | |
| US5171842A (en) | Heparin-binding brain mitogens | |
| Mizon et al. | Human pre-α-inhibitor: isolation from a by-product of industrial scale plasma fractionation and structural analysis of its H3 heavy chain | |
| NO864321L (no) | Rensemetode for proteiner. | |
| CZ272895A3 (en) | Method of converting hydrophobic derivative of growth hormone to the growth hormone natural form and detection method of said hydrophobic derivative | |
| Wong et al. | Synthesis of a fully active snake venom cardiotoxin by fragment condensation on solid polymer | |
| GAUTSCHI et al. | Chemical and biological characterization of a truncated form of acidic fibroblast growth factor from bovine brain | |
| Huber et al. | Amino-terminal sequences of a novel heparin-binding protein from human, bovine, rat, and chick brain: high interspecies homology | |
| EP0526883A2 (en) | Chondromodulin-II protein |