DE68909254T2

DE68909254T2 - Heparinbindende Gehirnmitogene.

Info

Publication number: DE68909254T2
Application number: DE89101187T
Authority: DE
Inventors: Peter Bohlen; Peter Gautschi-Sova
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1988-01-25
Filing date: 1989-01-24
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2009-01-25
Also published as: EP0326075A2; FI890342A; AU624803B2; DK29889D0; EP0326075A3; DK29889A; EP0326075B1; DE68909254D1; ES2058350T3; NO890295D0; NO175594B; AU2873789A; JPH01308300A; NO890295L; NO175594C; ATE94882T1; FI890342A0

Description

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft eine Gruppe neuer Protein- Wachstumsfaktoren, von denen man glaubt, daß sie die Angiogenese fördern und deshalb bei der Wundheilung, Knochenheilung und der Behandlung von Brandwunden nützlich sein sollten. Die Proteine induzieren die Mitogenese in Endothelzellen und können als solche als Wachstumsfaktoren für diese Zellen betrachtet werden. Man ist auch der Meinung, daß die Proteinen die Bildung, Aufrechterhaltung und Reparatur von Gewebe, insbesondere neuralem Gewebe, fördern.
Die Proteine werden aus Gehirnzellen isoliert und können jeweils als Heparin-bindendes Gehirnmitogen (HBBM) bezeichnet werden. Die Proteine weisen eine Einzelkette auf und sind stark basisch. Drei derartige Proteine sind aus Rinderhirn isoliert und als HBBM-1, HBBM-2 und HBBM-3 mit Molekulargewichten von 18, 16 bzw. 15 kD bezeichnet worden. Die Proteine besitzen eine gemeinsame N-terminale Sequenz von 19 Aminosäuren, die sich von derjenigen anderer bekannter Proteine unterscheidet.
Die gleichen drei HBBMs sind auch aus menschlichem Gehirngewebe isoliert worden und weisen die gleiche N-terminale Sequenz und den gleichen Typ von Mitogenaktivität wie Rinder-HBBMs auf. Ebenso ist gefunden worden, daß Ratten- und Hühnerhirne HBBMs enthalten.
Die Proteine werden durch eine Kombination von Schritten, die Extraktion aus dem Gewebe, Heparin-Affinitätschromatographie und Kationenaustauschchromatographie einschließen, aus Gehirngewebe isoliert und gereinigt. Hydrophobe Chromatographie kann als Hilfsverfahren für die Reinigung verwendet werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Zahlreiche Protein-Wachstumsfaktoren sind in den letzten Jahren isoliert und charakterisiert worden. Diese Wachstumsfaktoren schließen Epidermis-Wachstumsfaktor, Fibroblasten- Wachstumsfaktoren, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren, von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor und Interleukine ein. Zum Beispiel wurde Fibroblasten-Wachstumsfaktor ("FGF") zuerst von Gospodarowicz im Jahr 1975 aus Rinder-Hypophyse gereinigt und wies ein geschätztes Molekulargewicht von 13300 Dalton auf (Literaturstelle 1).
FGF wurde später aus Rinderhirn gereinigt (2). FGF kann entweder in saurer ("aFGF") oder basischer ("bFGF") Form isoliert werden, abhängig von den verwendeten Isolierungsverfahren (3,4). Eine vollständige Aminosäuresequenz für Rinder-Hypophysen-bFGF (5) und aFGF aus Rinder- und menschlichem Gehirn (6,7) ist publiziert worden, zusammen mit den N-terminalen Sequenzen für bFGF aus Rinder- und menschlichem Gehirn (5). Die N-terminalen Sequenzen für Rinder- Hypophysen- und Rinder-Hirn-bFGF sind identisch (5,8).
Es ist nun gefunden worden, daß, wenn die FGFs unter Verwendung von Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie aus Rinderhirn gereinigt werden (9,10), auch eine signifikante Menge an unbekannten Proteinen anwesend sein kann. Da Proteine, die sich mit besonders hoher Affinität an Heparin binden, selten sind, wurde eine weitere Untersuchung dieser unbekannten Proteine vorgenommen. Diese Untersuchung enthüllte, daß diese Proteine die HBBMs sind, welche sich von den FGFs in ihrer N-terminalen Sequenz und ihren Aminosäure-Zusammensetzungen unterscheiden.
Demgemäß ist es ein Ziel dieser Erfindung, die HBBMs aus Gehirngewebe zu isolieren, zu reinigen und zu charakterisieren. Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, die physiologische Aktivität der HBBMs festzustellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 stellt die Fraktionierung von 400 ml des 0,6 M NaCl- Eluats aus einer Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie dar. Der horizontale Balken A zeigt die Fraktionen an, die die HBBMs enthalten, welche danach zur weiteren Reinigung nochmals chromatographiert wurden. Der horizontale Balken B zeigt die Fraktionen an, die aFGF enthalten, wie durch Umkehrphasen-HPLC- Analyse bestimmt.
Figur 2 stellt die Ergebnisse von Mono-S- Kationenaustauschchromatographie mit 20 ml des Materials dar, das aus der Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie eluierte (wie durch den horizontalen Balken A, Fig. 1, angezeigt). Pfeile zeigen die Elutionspositionen von aFGF- und bFGF-Standards an. Die Zahlen im Chromatogramm beziehen sich auf HBBM-1, -2 und -3. Der horizontale Balken zeigt die Fraktionen an, die die HBBMs enthalten, welche als Pool oder einzeln für eine weitere Reinigung/Charakterisierung verwendet wurden.
Figur 3 stellt die Umkehrphasen-HPLC von HBBMs dar. Eine Aliquote des Pools von Mono-S-gereinigten HBBMs (Peaks 1-3, wie durch den horizontalen Balken in Fig. 2 angezeigt) wurde einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen. Einzelne Peaks wurden identifiziert und durch Analysieren von Aliquoten von Mono-S- Chromatographiefraktionen (wie durch die Abschnitte des horizontalen Balkens in Fig. 2 angezeigt) in unabhängigen Umkehrphasen-HPLC-Testläufen speziellen Mono-S-Fraktionen zugeordnet. Die Peaks 1-3 beziehen sich auf HBBM-1, HBBM-2 bzw. HBBM-3.
Figur 4 stellt die Analyse der HBBMs auf SDS-PAGE wie folgt dar: Bahn 1: Proteinstandards (Lysozym, 14,4 kD; Trypsin- Inhibitor, 21,5 kD; Carbonatdehydrase, 31 kD; Ovalbumin, 45 kD; Serumalbumin, 66,2 kD); Bahn 2: HBBM-1; Bahn 3: HBBM-2; Bahn 4: HBBM-3.
Figur 5 stellt die erneute Chromatographie von HBBM-3 auf einer Mono-S-Kationenaustauschsäule dar. Die Fraktionen, die HBBM-3 aus der in Figur 2 dargestellten Chromatographie enthalten, wurden zusammengegeben, dreimal mit Ausgangspuffer verdünnt, und die verdünnten Proben wurden auf einer Mono-S-Säule unter Bedingungen, die identisch mit den in Figur 2 gezeigten waren, chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das Wachstum von Rinder-Aortenbogen- Endothelzellen zu stimulieren (Histogramm). Die Retentionszeiten von aFGF und bFGF sind mit Pfeilen dargestellt. Ein horizontaler Balken kennzeichnet die Fraktionen, die danach zum Konzentrieren von HBBM-3 verwendet wurden.
Figur 6 stellt die biologische Aktivität von HBBM-3 und HBBM-1 mittels Dosis-Antwort-Analyse und Vergleich mit der FGF- Aktivität dar. Die Fähigkeit von HBBM-3 und HBBM-1, das Wachstum von Rinder-Aortenbogen-Endothelzellen zu stimulieren, wurde getestet. Oberes Feld: HBBM-3; unteres Feld: HBBM-1. In jedem Feld, feste Linie: HBBM; gestrichelte Linie: aFGF; gepunktete Linie: bFGF.
Figur 7 stellt die Chromatographie von HBBM-3 auf einer hydrophoben Säule dar. Eine Aliquote von Mono-S-konzentriertem HBBM-3 wurde einer HIC[hydrophobic interaction column/hydrophobe Säulen]-Chromatographie unterzogen. Pfeile zeigen die Retentionszeiten von aFGF und bFGF unter identischen Chromatographiebedingungen an. Aliquoten von Säulenfraktionen wurden auf ihre Fähigkeit, Rinder-Aortenbogen-Endothelzellen- Proliferation zu stimulieren, getestet. Die Ergebnisse sind durch die Zahl von gewachsenen Zellen in jeder Testvertiefung angegeben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die neuen Wachstumsfaktoren dieser Erfindung sind basische, Heparin-bindende Gehirnmitogene mit einer Einzelkette. HBBMs sind in den Gehirngeweben aller getesteter Arten, die Mensch, Rind, Ratte und Huhn einschließen, identifiziert worden. Aufgrund dieser Verteilung wird erwartet, daß andere Arten ebenso HBBMs enthalten.
Die N-terminalen Sequenzen der HBBMs unterscheiden sich markant von denjenigen, die für aFGF und bFGF aus Rinder- oder menschlichem Gehirn publiziert wurden (5,6,7). Es wurde gefunden, daß die N-terminalen Sequenzen der ersten 19 Aminosäuren für menschliche und Rinder-HBBMs identisch sind. Die N-terminalen Sequenzen sind wie folgt: Gly-Lys-Lys-Glu-Lys- Pro-Glu-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Ser-Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln. Die Rattensequenz ist identisch, mit Ausnahme des Cysteinrestes an Position 15, da eine Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Cystein nicht durchgeführt wurde. Jedoch ist die Tatsache, daß keine andere Aminosäure an Position 15 identifiziert wurde, konsistent mit der angenommenen Anwesenheit von Cystein. Bis heute sind die ersten zehn N- terminalen Reste von Hühner-HBBMs sequenziert worden; sie sind identisch mit denjenigen von menschlichen, Rinder- und Ratten- HBBMs.
Die HBBMs sind in drei Formen in Gewebe aus Rinderhirn gefunden worden. HBBM-1, HBBM-2 und HBBM-3 weisen Molekulargewichte von 18, 16 bzw. 15 kD auf. Ihre Aminosäure-Zusammensetzungen (bestimmt wie nachfolgend beschrieben) sind in Tabelle I unten dargestellt und unterscheiden sich ebenso von den Aminosäure- Zusammensetzungen der FGFs aus Rinderhirn (5,6,7).
Aufgrund der Molekulargewichte und der identischen N-terminalen Sequenzen wird geschlossen, daß die drei HBBMs wahrscheinlich an ihren C-Enden verschieden sind. Die erhältlichen Daten lassen stark vermuten, daß HBBM-2 und HBBM-3 C-terminal verkürzte Formen von HBBM-1 sind, welchen ungefähr 13 bzw. 29 Aminosäuren fehlen.
Es wurde gefunden, daß die Verhältnisse der drei Formen zwischen verschiedenen Isolierungsansätzen variierten. Jedoch wurde die Gesamtisolierungs-Ausbeute an HBBMs, basierend auf einer quantitativen Aminosäureanalyse, durchschnittlich zu ungefähr 30, 10 und 40 ug/kg Gehirngewebe für HBBM-1, HBBM-2 bzw. HBBM-3 abgeschätzt. Die Verhältnisse können von Variablen während der Gewebelagerung und -extraktion, insbesondere Proteolyse, abhängen. Proteolyse während der Gewebeextraktion kann eine Carboxy-terminale Verkürzung von HBBM-1, der größten der HBBM-Formen, verursachen, was HBBM-2 und HBBM-3 in variierenden Mengen liefern würde.
Das Verfahren zur Isolierung der neuen HBBMs dieser Erfindung in im wesentlich reiner Form aus einer Gehirngewebe-Quelle umfaßt die Schrittfolge von:
(a) Extraktion aus der Gewebequelle;
(b) Kationenaustauschchromatographie;
(c) Heparin-Affinitätschromatographie;
(d) Kationenaustauschchromatographie; und gegebenenfalls
(e) hydrophobe Chromatographie.
Die Extraktion wird durch aufeinanderfolgendes Behandeln des Gewebes mit 0,15 M Ammoniumsulfat, wobei mit Salzsäure auf pH 4,5 eingestellt wird, Rühren und Zentrifugieren, Behandeln mit Ammoniumsulfat, nachdem der pH mit Natriumhydroxid auf 6-6,5 eingestellt worden ist, Rühren und Zentrifugieren, gefolgt von Dialyse und Zentrifugieren, bewerkstelligt.
Der erste Kationenaustauschchromatographie-Schritt umfaßt die Adsorption des Ansatzes auf einer Carboxymethyl-Sephadex-Säule, gefolgt vom Waschen mit 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6 und der Elution mit 100 mM Natriumphosphat, ph 6,0/0,6 M NaCl.
Die Heparin-Affinitätschromatographie wird auf einer Heparin- Sepharose (Pharmacia)-Säule durch Waschen mit einem Puffer, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/0,6 M NaCl enthält, gefolgt von der Elution mit einem linearen Gradienten von 0,6 bis 2,0 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, durchgeführt.
Der zweite Kationenaustauschchromatographie-Schritt wird auf einer Mono-S (Pharmacia) -Säule durchgeführt, welche mit 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, äquilibriert und nach Auftragen der Probe gewaschen wird, gefolgt von der Elution von HBBMs mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8.
Der Schritt der hydrophoben Chromatographie umfaßt das Voräquilibrieren einer HIC-Säule (LKB Ultropac-TSK-Phenyl-5PW) mit einem Puffer von 100 mM Natriumphosphat, pH 7,0, und 1,5 M Natriumsulfat, gefolgt von der Elution mit einem linearen Gradienten von 1,5 bis 0,6 M Natriumsulfat.
Obwohl die HBBMs durch Umkehrphasen-HPLC leicht und quantitativ von den FGFs getrennt werden können, verringert dieses Verfahren aufgrund der Bedingungen, die bei der Umkehrphasen- HPLC verwendet werden, die biologische Aktivität der FGFs. Deshalb wurde das oben aufgeführte Verfahren entwickelt, um die HBBMs und die FGFs in biologisch aktiver Form für Vergleichstests aufzutrennen und zu isolieren. Die Verwendung von Umkehrphasen-HPLC wurde auf das Testen von kleinen Aliquoten von Fraktionen aus der Heparin-Sepharose- Affinitätschromatographie und Kationenaustauschchromatographie auf die Anwesenheit von HBBMs und FGFs beschränkt. Die Umkehrphasen-HPLC-Schritte wurden auf einer C4-Säule (The Separations Group) durchgeführt, die mit einem flachen Gradienten von Acetonitril in 0,1%-iger Trifluoressigsäure eluiert wurde.
Die biologische Aktivität der HBBMs ist durch Tests festgestellt worden, die die Induktion von Mitogenese in Endothelzellen nachweisen. Obwohl HBBM-2 nicht getestet wurde, legt die Aktivität, die für HBBM-1 und HBBM-3 gezeigt wurde, nahe, daß HBBM-2 auch diese Aktivität besitzen wird. Das Testen wurde an Rinder-Aortenbogen-Endothelzellen durchgeführt.
Drei gesonderte Tests wurden durchgeführt, sowohl um die Existenz von Mitogen-Aktivität zu bestätigen als auch um zu zeigen, daß die Aktivität auf den HBBMs und nicht auf den FGFs beruhte.
Als erstes wurden die Eluensfraktionen aus der Mono-S- Chromatographie, die HBBM-3 enthielten, zusammengegeben, nochmals auf einer Mono-S-Säule chromatographiert und dann auf ihre Fähigkeit, das Wachstum von Rinder-Gefäßendothelzellen zu stimulieren, getestet. Zum Vergleich wurden auch Proben von aFGF und bFGF getestet. Figur 5 stellt die Ergebnisse dieses Tests dar.
Als nächstes wurden die erhältlichen HBBM-3-Fraktionen zur Probenkonzentration unter Verwendung eines steileren Gradienten und einer geringeren Durchflußgeschwindigkeit nochmals auf einer Mono-S-Säule chromatographiert. Das HBBM-3 wurde dann mit aFGF und bFGF in Dosis-Antwort-Analysen verglichen. Das obere Feld von Figur 6 stellt die Ergebnisse dieses Tests dar. Dieses Verfahren wurde dann für HBBM-1 wiederholt. Diese Ergebnisse sind im unteren Feld von Figur 6 dargestellt.
Schließlich wurden durch Mono-S-Chromatographie konzentrierte HBBM-3-Fraktionen auf eine hydrophobe Säule gegeben, welche Selektivitäten aufweist, die von einer Mono-S-Säule verschieden sind. Figur 7 stellt die Ergebnisse dieses Tests dar.
Diese Tests weisen auf, daß die HBBMs die Proliferation von kultivierten Rinder-Gefäßendothelzellen auf dosisabhängige Weise stimulieren. Die ED&sub5;&sub0; betrug ungefähr 20 ng/ml für HBBM-3 und 180 ng/ml für HBBM-1. Die ED&sub5;&sub0; wurde wie folgt berechnet: ED&sub5;&sub0; = Konz [Zellzahl (Dosis = 0) + Zellzahl (Dosis = max)/2].
Diese Mitogene wurden bezüglich biologischer Aktivität und hoher Affinität zu Heparin mit den FGFs verglichen. HBBM-1 und HBBM-3 sind jeweils gleich potent wie aFGF. Die EP&sub5;&sub0; liegen im Bereich von 50-150 ng/ml.
Die Testergebnisse machen auch klar, daß die biologische Aktivität, die mit HBBM-3 verknüpft ist, genuin und nicht das Ergebnis einer Kontamination mit einem FGF war. HBBM-3 und die FGFs werden durch hochauflösende Mono-S-Chromatographie klar getrennt, wie in Figur 5 gezeigt, und auch durch eine zweite Hochauflösungstechnik mit verschiedenen Selektivitäten, die hydrophobe Chromatographie, klar aufgetrennt, wie in Figur 7 gezeigt.
Darüberhinaus enthielten die HBBMs keine meßbaren Mengen an aFGF, wie durch quantitative Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Als weiterer Beweis dafür, daß die Aktivität auf den HBBMs beruhte, gingen die HBBMs in einem Immunodot-Assay unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern, die gegen synthetische Peptide gezüchtet worden waren, welche den N-terminalen 15 Resten von aFGF (1-15) und bFGF (30-50) entsprechen, keine Kreuzreaktion ein, wobei die letztgenannten einen Antikörper liefern, der mit aFGF eine Kreuzreaktion eingeht (Antikörper wurden von A. Baird, Salk Institute, bereitgestellt; Wachstumsfaktor- Nomenklatur gemäß den Literaturstellen 5,7). Schließlich wurden die Konzentrationen von HBBM- und aFGF-Präparaten sorgfältig durch quantitative Aminosäureanalyse als Grundlage für Potenz- Vergleiche bestimmt (Figur 6). Aufgrund dieser Messungen hätte ein inhärent inaktives HBBM-3 mit einer gleichen Menge an aFGF kontaminiert sein müssen, um die beobachtet biologische Antwort zu erzeugen. Die Ergebnisse schließen eine derartige Kontaminierung aus. Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchungen klar, daß die Aktivität von HBBM-3 nicht eine Folge einer aFGF-Kontaminierung ist.
Mehrere Beweisanzeichen bekegen weiterhin, daß die HBBM-3- Aktivität nicht auf einer bFGF-Kontaminierung beruht. Theoretisch würden wenige Prozent Kontaminierung von HBBM-3 mit bFGF ausreichen, um die beobachteten Aktivitäten zu erzeugen. Jedoch deutet nichts auf eine derartige Kontaminierung hin, da HBBMs und bFGF auf Heparin-Sepharose-Chromatographie weit aufgetrennt werden. Darüberhinaus werden HBBM-3 und bFGF auch bei der Mono-S-Chromatographie gut aufgetrennt (Fig. 5). Schließlich war es, als HBBM-3 einer Chromatographie auf einem dritten hochauflösenden System, einer hydrophoben Chromatographie, unterzogen wurde, offensichtlich, daß die biologische Aktivität immer noch mit HBBM-3 und nicht mit den gut abgetrennten bFGFs einherging (Fig. 7). Es gibt kein Anzeichen, daß die beiden Einheiten selbst in Spurenmengen in drei sehr ungleichartigen und auftrennenden chromatographischen Systemen zusammen als Verunreinigung auftreten würden.
Aufgrund dieser Ergebnissen wird geschlossen, daß die Aktivität von HBBM-3 genuin und nicht das Ergebnis einer Kontaminierung mit den bekannten Heparin-bindenden FGFs ist.
Die HBBMs unterscheiden sich weiter von den FGFs durch einen Mangel an Aminosäure-Sequenzhomologie zwischen den beiden Gruppen von Proteinen. Zusätzlich zum Unterschied in den vorher beschriebenen N-terminalen Sequenzen zeigt die derzeit erhältliche Sequenzinformation (ungefähr 75 von 130 Resten von HBBM-3) keine Sequenzhomologie mit der publizierten Sequenz von 146 Resten der FGFs (5).
Es wurde allgemein gefunden, daß die Mitogenaktivität von menschlichen HBBMs von derjenigen von Rinder-HBBM ununterscheidbar war, obwohl die menschlichen Mitogene aufgrund der beschränkten Mengen an erhältlichem Material weniger ausführlich charakterisiert wurden. Dies ist mit anderen Befunden konsistent: identische Amino-terminale Sequenz, Anwesenheit von drei Formen und Retentionsverhalten auf Ionenaustausch-, Heparin-Sepharose- und Umkehrphasen- Chromatographie.
Die Identität von N-terminalen Sequenzen zwischen den verschiedenen Quellen der HBBMs legt nahe, daß ein Evolutionsdruck Mutationen verhindert haben kann, zumindest während der Evolution von Vögeln zu Säugetieren. Eine Sequenzkonservierung als Ergebnis von Evolutionsdruck wird bei vielen wohlbekannten biologisch aktiven Proteinen, die zwischen den Arten hoch homolog sind, stark vermutet.
Die HBBMs waren in Rinder-Nierengewebe, das unter Verwendung des Verfahrens für Gehirngewebe extrahiert wurde, nicht vorhanden. Deshalb sind die HBBMs neue Proteine, die auch eine Rolle bei der Bildung, Aufrechterhaltung und/oder Reparatur von Gewebe, insbesondere neuralem Gewebe, spielen können.
Die Gründe für diese Aussage über die Rolle von HBBMs sind die folgenden: (1) die HBBMs weisen die gleichen biologischen und Heparin-bindenden Aktivitäten wie aFGF auf; (2) die HBBMs sind Gehirn-spezifisch; (3) größere Mengen der HBBMs als vom aFGF werden im Gehirn gefunden; und (4) es ist bekannt, daß aFGF und bFGF sehr hervorstechende neurale Aktivitäten aufweisen, wie zum Beispiel eine neurotrophe (Neuronen-Überleben-) Aktivität in vivo und in vitro; sie sind Mitogene für Neuroblasten und Gliazellen, sie fördern einen Neuriten-Auswuchs und induzieren eine Gehirn-spezifische Proteinsynthese.
Obwohl die Proteinstrukturen der HBBMs und der FGFs unähnlich sind, legt ihre Ähnlichkeit bezüglich Heparin-Bindung und biologischer Aktivität nahe, daß beide Gruppen von Mitogenen über einen ähnlichen Mechanismus wirken. Zum Beispiel könnten sich die Mitogene an Zelloberlächen- oder extrazelluläre, Matrix-assoziierte heparinähnliche Strukturen binden.
Therapeutische Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung schließen HBBMs, entweder einzeln oder in Mischungen, in einer (einem) herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeit oder festem Träger dispergiert ein. Die therapeutischen Zusammensetzungen können topisch in Form von Cremes, Lotionen usw. oder oral in solchen Formen wie Tabletten, Kapseln, dispersionfähigen Pulvern, Granula oder Suspensionen oder parenteral in Form von sterilen injizierbaren Lösungen oder Suspensionen verabreicht werden. Diese therapeutischen Zusammensetzungen können bei menschlichen oder Veterinär- Patienten verabreicht werden, um eine Angiogenese und die Reparatur und Aufrechterhaltung von neuralem Gewebe zu fördern.

BEISPIEL

In diesem Beispiel werden die Isolierung und Charakterisierung von Rinder-HBBM in Einzelheit dargelegt. Ergebnisse unter Verwendung von menschlichem Material waren sehr ähnlich und werden nicht in Einzelheit beschrieben, es sei denn, daß Unterschiede zu Rinder-Material gefunden wurden.

1) Gewebeextraktion

Menschliche Gehirne wurden weniger als 24 Stunden nach dem Tod von der Abteilung für Pathologie, Universität Zürich, erhalten. Rinderhirne wurden von einem Schlachthaus erhalten. Die Gewebe wurden unmittelbar nach dem Empfang eingefroren, bei -80ºC aufbewahrt und innerhalb von zwei Wochen nach Empfang verarbeitet. Ansätze von 3-5 kg Gehirngewebe wurden auf einmal extrahiert.
Das Gehirngewebe wurde gemäß dem Verfahren, das von Gospodarowicz und Mitarbeitern entwickelt wurde (2), wie beschrieben (6,10) extrahiert: gefrorene Gehirne wurden mit einem Hammer zerkleinert. 600 g-Portionen Gewebe wurden in 1,2 l 0,15 M Ammoniumsulfat 3 Minuten in einem Waring-Mischer homogenisiert. Der pH des Homogenisats wurde sofort mit konzentrierter HCl auf pH 4,5 eingestellt, und die Mischung wurde weiter unter Verwendung eines Polyton-Homogenisators homogenisiert, bis das Gewebe fein dispergiert war. Das Homogenisat wurde dann durch 2-stündiges Rühren der Suspension bei 4ºC, gefolgt von 60minütigem Zentrifugieren bei 4ºC entweder bei 11500 U/min (GSA-Rotor) oder bei 9000 U/min (GS-3- Rotor) zur Entfernung von Zellen und Trümmern, extrahiert. Der Überstand wurde mit NaOH auf pH 6-6,5 eingestellt, Ammoniumsulfat (230 g/l) wurde langsam dazugegeben, und die resultierende Suspension wurde mindestens 30 Minuten bei 4ºC gerührt und wieder wie oben beschrieben zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen. Mehr Ammoniumsulfat (300 g/l) wurde langsam zum Überstand gegeben, die Suspension wurde mindestens 30 Minuten bei 4ºC gerührt und wie oben zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in kaltem Wasser (100 ml pro kg Ausgangsmaterial) gelöst und unter Verwendung einer Spectrapor- Membran (Abschneiden des Molekulargewichts bei 6-8 kD, Durchmesser 31,8 mm) 20 Stunden bei 4ºC gegen 20 l Wasser dialysiert. Das Dialysat wurde zur Entfernung von ausgefallenem Material wieder zentrifugiert, und der Überstand wurde einer chromatographischen Reinigung unterzogen (siehe unten), nachdem seine Leitfähigkeit bestimmt worden war.

2) Kationenaustauschchromatographie

Der aus dem obigen Verfahren resultierende Gewebeextrakt (ungefähr 150 ml für jedes kg Gehirngewebe) wurde einer ansatzweisen Adsorption/Elution durch Kationenaustauschchromatographie wie folgt unterzogen: die Probe wurde wie erforderlich mit Wasser verdünnt, um die Leitfähigkeit unter diejenige einer 0,1 M Natriumphosphat-Puffer(pH 6)-/0,15 M NaCl-Lösung zu bringen. Die Probe wurde dann auf eine Säule von Carboxymethyl-Sephadex (5,5 x 3 cm), die mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6)/0,15 M Cl voräquilibriert war, geladen. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und eine Proteinfraktion wurde mit 100 mM Natriumphosphat, pH 6,0/0,6 M NaCl eluiert und gesammelt. Alle Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur und einer Durchflußgeschwindigkeit von 500 ml/Stunde durchgeführt.

3) Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie

Das 0,6 M NaCl-Eluat aus der Kationenaustauschchromatographie wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia, 5 x 1,5 cm) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 125 ml/Stunde geladen. Die Säule wurde mit 200 ml eines Puffers, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/0,6 M NaCl enthielt, gewaschen, bis die Absorbanz des Säuleneluats bei 280 nm vernachässigbar wurde. An die Säule gebundenes Protein wurde mit einem 120minütigen linearen Gradienten von 0,6 M bis 2 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 35 ml/Stunde eluiert. Die Chromatographie wurde unter Verwendung einer LKB- Peristaltikpumpe und einem programmierbaren Niederdruck-LKB- Gradientenbilder bei Raumtemperatur durchgeführt. Fraktionen von 1,4 ml wurden gesammelt, und Aliquoten wurden einem Bioassay unterzogen.
Die Ergebnisse dieser Heparin-Sepharose-Chromatographie werden in Fig. 1 dargestellt. Die Fraktionen, die unter Verwendung der unten beschriebenen Schritte einer weiteren Reinigung unterzogen wurden, werden durch den horizontalen Balken A angezeigt. Die aFGF enthaltende Fraktionen eluierten zwischen 1,1-1,3 M NaCl (wie durch HPLC-Analyse von einzelnen Heparin- Sepharose-Säulenfraktionen bestimmt; die Daten sind nicht gezeigt) und entsprechen der Schulter des größeren Peaks, der bei 1-1,2 M NaCl eluierte, und dem horizontalen Balken B. Die Umkehrphasen-HPLC-Analyse wurde auf einer C4-Säule (25 x 0,4 cm, 5 µm Teilchengröße, 300 Ångstrom Porengröße, The Separations Group, Hesperia, CA) durchgeführt. Die Proteine wurden in einem flachen Gradienten von Acetonitril (10%/Stunde) in 0,1%-iger Trifluoressigsäure bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,7 ml/Minute eluiert. Die Heparin-Sepharose-Chromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.

4) Mono-S-Kationenaustauschchromatographie

Um das kontaminierende aFGF von dem anderen Proteinmaterial abzutrennen, wurden Fraktionen, die bei 1-1,2 M NaCl eluierten, zusammengegeben, ausreichend mit einem Puffer, der 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, enthielt (um ihre Ionenstärke auf ungefähr diejenige des Verdünnungsmittels zu verringern), verdünnt und einer Kationenaustauschchromatographie auf einer Mono-S-Säule (Pharmacia), die mit 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, äquilibriert war, unterzogen. Dieses Material wurde auf eine Mono-S-Säule (Pharmacia), die mit 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, äquilibriert war, gepumpt. Nach Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer, bis die Absorbanz bei 210 nm einen minimalen Wert erreichte, wurde Protein mit einem Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, eluiert.
Mehrere gut unterscheidbare Peaks wurden unter diesen Bedingungen aus der Mono-S-Säule eluiert, wie in Fig. 2 gezeigt. Jeder Peak wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von LKB-HPLC-Geräten bei Raumtemperatur mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,7 ml/Minute analysiert.
Der erste und quantitativ kleinere Peak, der aus der Mono-S- Säule bei 0,3 M NaCl eluierte, entsprach aFGF, wie durch die Coelution mit einem Bezugsstandard von authentischem aFGF im gleichen System unter identischen Bedingungen (siehe Pfeil in Fig. 2) sowie durch Coelution in Umkehrphasen-HPLC auf einer zuvor beschriebenen C4-Säule, die unter hochauflösenden flachen Gradientenbedingungen eluiert wurde (Daten nicht dargestellt), gezeigt. Die Anwesenheit von aFGF in dieser Mono-S- Säulenfraktion wurde erwartet, da man weiß, daß die aus der Heparin-Sepharose-Chromatographie herstammende Fraktion aFGF enthält. Der Hauptteil des Materials eluierte aus der Mono-S- Säule bei ungefähr 0,45-0,65 M NaCl als ein relativ gut aufgelöstes Triplett von Peaks. Da bestimmt wurde, daß diese Peaks HBBM enthielten, wie anschließend beschrieben, wurden sie in der Reihenfolge ihrer Elution als HBBM-3, HBBM-2 und HBBM-1 bezeichnet (Fig. 2). Das Elutionsverhalten von menschlichem HBBM auf einer Mono-S-Säule ist im allgemeinen ähnlich, ist aber weniger gut untersucht worden als Rinder-HBBM.
Die HBBMs sind mittels chromatographischer Retention nicht nur von aFGF, sondern auch von bFGF klar unterscheidbar (Fig. 2).
Darüberhinaus wurde auch gefunden, daß sich die HBBMs, wenn sie durch Umkehrphasen-HPLC analysiert werden (Fig. 3), klar bezüglich Retentionszeiten (Daten nicht gezeigt) von den FGFs unterscheiden. Schließlich trennte Umkehrphasen-HPLC alle drei HBBMs voneinander (Fig. 3) und stellte demgemäß ein Mittel für ihre Herstellung mit hoher Reinheit (wie für die Strukturcharakterisierung benötigt) und für eine relativ eindeutige Identifizierung bereit.
Menschliches Gehirn lieferte ebenso drei Formen von HBBMs, wobei die Umkehrphasen-HPLC-Elutionsmuster identisch mit denjenigen ihrer Rinder-Gegenstücke waren.

5) Hydrophobe Chromatographie

Fraktionen aus der Mono-S-Chromatographie, die interessierende Proben enthielten, wurden auf 1,5 M bezüglich Natriumsulfat eingestellt und auf eine HIC-Säule (LKB Ultropac TSK-Phenyl- 5PW, 7,5 x 75 mm) aufgetragen, die mit einem Puffer von 100 mM Natriumphosphat, pH 7,0/1,5 M Natriumsulfat voräquilibriert war. Protein wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung eines 30minütigen linearen Gradienten von 1,5 bis 0,6 M Natriumsulfat bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min chromatographiert. Hydrophobe Chromatographie ist ein Auftrennungssystem mit Selektivitäten, die von der Mono-S- Chromatographie ziemlich verschieden sind. Dementsprechend bestärkt die Auftrennung der HBBMs von den FGFs durch HIC (wie in Fig. 7 gezeigt) das Ergebnis der Mono-S-Chromatographie (wie in Fig. 5 gezeigt), daß die HBBMs von den FGFs verschiedene chemische Einheiten sind.

6) N-terminale Aminosäuresequenz-Analyse

Gewöhnlich wurden Sequenzanalysen ohne chemische Modifizierung der Proteine durchgeführt. Jedoch wurden als Vorstufe bei der Durchführung einiger Analysen der N-terminalen Aminosäurensequenz der HBBMs die Cysteinreste der HPLC- gereinigten Proteine gemäß dem Verfahren von Gautschi-Sova et al. (6) behandelt. Kurz gesagt wurden die Cysteinreste mit einem fünffachen molaren Überschuß von Dithiothreitol reduziert und durch Carboxymethylierung unter Verwendung eines dreifachen molaren Überschusses von Iod-[2-¹&sup4;C]-essigsäure alkyliert.
Die N-teminale Aminosäuresequenz-Analyse von Proteinen (100-500 pMol) wurde auf einem Gas-/Flüssigphasen-Proteinmikrosequenzierer von Applied Systems (Foster City, CA), Model 470A, wie von Esch et al. beschrieben (5) durchgeführt. Zusätzlich wurden Phenylthiohydantoin(PTH)-Derivate von Aminosäuren durch Umkehrphasen-HPLC auf einem On-Line-PTH-Aminosäure-Analysator von Applied Biosystems, Model 120A, identifiziert. Beide Verfahren wurden gemäß Protokollen vom Gerätehersteller unter Verwendung von Chemikalien, die von Applied Biosystems geliefert wurden, durchgeführt.
Man fand, daß die N-terminalen Sequenzen von allen drei HBBMs bezüglich der ersten 19 Aminosäuren miteinander identisch waren. Die Sequenzen wurden als Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu- Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Ser-Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln bestimmt. Man fand, daß menschliche HBBMs (wahrscheinlich als Mischung analysiert) die gleiche N-terminale Sequenz wie Rinder-HBBMs besitzen.
Während die Sequenzierungsdaten klar zeigen, daß die drei Rinder-HBBM-Proteine strukturell miteinander verwandt sind, legen die Aminosäurezusammensetzungen und Molekulargewichte weiter nahe, daß diese Proteine bezüglich der Carboxyterminalen Region verschieden sein können. Alle Daten sind mit den Wahlinterpretationen, daß sowohl HBBM-2 als auch HBBM-3 Carboxy-terminal verkürzte Formen von HBBM-1 sind, denen an ihren Carboxy-Enden ungefähr 13 bzw. 29 Aminosäuren fehlen, kompatibel.

7) Molekulargewichte der HBBMs

Proteinproben wurden unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese ("SDS-PAGE"), wie von Gospodarowicz et al. beschrieben (9), analysiert. Kurz gesagt wurden Molekulargewichtsbestimmungen durch SDS-PAGE wie folgt durchgeführt: Aliquoten, die 40-80 ng Protein enthielten, wurden zu dem Probenpuffer, der aus 30% (Vol/Vol) Glycerin, 0,2 M Dithiothreitol, 4% (Gew./Vol) Natriumdodecylsulfat, 4 mM EDTA und 75 mM Tris-HCl, pH 6,8, zusammengesetzt war, gegeben. Die Proben wurden 3 Minuten gekocht und dann auf eine 20%-ige Polyacrylamidgel-Platte (1,5 mm) mit einem 3%-igen Füllgel aufgetragen. Die Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde auf identische Weise durchgeführt, außer daß Dithiothreitol beim Probenpuffer weggelassen wurde. Eine Protein-Standardmischung, die Lysozym (14,4 kD), Trypsin- Inhibitor (21,5 kD), Carbonatdehydrase (31 kD), Ovalbumin (45 kD) und Serumalbumin (66,2 kD) enthielt, wurde ebenfalls auf jedes Gel aufgetragen. SDS-PAGE zeigte, daß die Molekulargewichte von HBBM-1, -2 und -3 18, 16 bzw. 15 kD sind (Fig. 4). Die Molekulargewichte unterschieden sich nicht signifikant, unabhängig davon, ob die Proben in Anwesenheit oder Abwesenheit von Reduktionsmittel der Elektrophorese unterzogen wurden, was zeigt, daß die Proteine Einzelkettenpolymere sind. Die Molekulargewichte der menschlichen HBBMs sind noch nicht durch SDS-PAGE bestimmt worden.

8) Aminosäurezusammensetzung-Analyse

Eine 10-20 pMol-Proteinprobe wurde gemäß dem Hochempfindlichkeitsverfahren von Bohlen und Schroeder (11) hydrolisiert. Kurz gesagt wurde die Proteinprobe in ein Hydrolyseröhrchen gegeben und im Vakuum getrocknet. 50 µl konstant siedende HCl, die 2% (Vol/Vol) Thioglykolsäure enthielt, wurden dazugegeben. Nach Einfrieren der Probe in flüssigem Stickstoff wurde das Röhrchen dann mittels Hochvakuum (weniger als 50 mm Torr) evakuiert. Man ließ die Probe dann unter Vakuum schmelzen, und das Röhrchen wurde mit Hilfe einer Falmme zugeschmolzen.
Das Röhrchen wurde durch Erhitzen auf 110ºC über 20 Stunden hydrolisiert. Nach der Hydrolyse wurde das Röhrchen geöffnet, im Vakuum getrocknet, und der Rückstand wurde vor Auftragen auf die Kationenaustauschchromatographie-Säule in 130 µl Citratpuffer (0,067 Natriumcitrat, pH 2,20) gelöst.
Die Proteinhydrolysate wurden auf einem Chromakon 500 Aminosäure-Analysator (Kontron, Zürich, Schweiz), der mit einer Kationenaustausch-Säule auf Polystyrol-Basis und einem o- Phthalaldehyd-Fluoreszenznachweissystem zum Hochempfindlichkeitsnachweis versehen war (11), chromatographiert.
Die quantitative Bestimmung von Aminosäuren geschah durch das externe Standardverfahren, das eine Aminosäure-Standardmischung verwendet. Basierend auf der quantitativen Aminosäure-Analyse wurde die Gesamt-Isolierungsausbeute an HBBMs zu ungefähr 30, 10 und 40 µg/kg Gehirngewebe für HBBM-1, HBBM-2 bzw. HBBM-3 abgeschätzt.
Die Aminosäurezusammensetzungen der drei HPLC-gereinigten Proteine werden in Tabelle I gezeigt. Tabelle I Aminosäurezusammensetzungen von Heparin-bindenden Gehirnmitogenen Molekulargewicht¹ Elutionsreihenfolge - Umkehrphasen-HPLC - Mono-S Asparagin und Asparaginsäure Threonin Serin Glutamin und Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Cystein Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Histidin Lysin Tryptophan Arginin Aminosäure (Zahl der Reste) ¹ wie durch SDS-PAGE bestimmt ² nb: nicht bestimmt ³ gemäß der Hypothese der C-terminalen Verkürzung wird geglaubt, daß die folgenden die richtigen Werte für HBBM-2 sind: Leucin 8, Tryptophan 3, Arginin 8. Aminosäurezusammensetzungen werden aus 3-5 Bestimmungen berechnet.
Die Aminosäurezusammensetzungsdaten stimmen mit der Elutionsreihenfolge der drei Proteine auf Mono-S überein: das am wenigsten basische Protein (HBBM-3) eluiert zuerst, während das basischste Protein (HBBM-1) als letztes eluiert. Erwartete Molekulargewichte, die aus den Aminosäureanalysen berechnet werden, sind etwas niedriger als diejenigen, die durch SDS-PAGE bestimmt werden. Für die Diskrepanzen können Prolin- und Cysteinreste verantwortlich sein, die durch die Aminosäureanalyse nicht quantitativ bestimmt wurden. Aufgrund der N-terminalen Sequenzanalyse ist jedoch bekannt, daß Prolin und Cystein tatsächlich vorhanden sind. Die Aminosäureanalysen von menschlichen HBBMs sind noch nicht erhältlich.

9) Biologische Aktivität

Die Fähigkeit bestimmter HBBMs, eine Mitogenese in Endothelzellen zu induzieren, wurde durch Messen der Wirkung dieser Proteine auf die Proliferation in vitro von Rinder- Aortenbogen-Endothelzellen, die wie von Bohlen et al. (2,10) beschrieben kultiviert worden waren, getestet. Kurz gesagt wurden die Rinder-Endothelzellen bei niedriger Dichte (10000 bis 20000 Zellen/35 mm-Schale) in Dulbeccoschem modifiziertem Eagle-Medium, das 10% Kälberserum enthielt (Hyclone, Sterile Systems, Logan, UT), mit Säulenfraktionen, die wie unten beschrieben erhalten wurden, geimpft. Kulturen wurden 5 Tage in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Säulenfraktions-Aliquoten (dazugegeben an den Tagen 0 und 2) kultiviert und dann in einem Coulter-Teilchenzähler ausgezählt. Die biologischen Aktivitäten der getesteten Proteine werden als Zahl von vaskulären Endothelzellen, die in jeder Testvertiefung wuchsen, für jede Fraktion in den Figuren 5-7 angegebenen.
Insbesondere wurde die Aktivität der HBBMs mit derjenigen der FGFs verglichen. Unter Verwendung von publizierten Verfahren (9,12) wurden aFGF und bFGF isoliert, und ihre Authentizität wurde durch N-terminale Sequenzanalyse und Molekulargewichtsbestimmung (SDS-PAGE) verifiziert.
Die Eluensfraktionen, die dem Peak für HBBM-3 aus der Mono-S- Chromatographie entsprachen, wie in Figur 2 gezeigt, wurden zusammengegeben, dreimal mit Ausgangspuffer verdünnt und auf dem gleichen System nochmals chromatographiert. Aliquoten dieser Fraktionen wurden wie oben auf ihre Fähigkeit, das Wachstum von vaskulären Rinder-Endothelzellen zu stimulieren, getestet. Vergleichstests wurden mit aFGF und bFGF durchgeführt. Die Ergebnisse, wie in Figur 5 dargestellt, zeigen, daß HBBM-3 die Mitogenaktivität bei Rinder- Endothelzellen stimulierte. Weiter waren das HBBM-3 und seine Aktivität von den FGFs trennbar.
In einem weiteren Aktivitätstest wurden die erhältichen HBBM-3- Fraktionen unter Verwendung des gleichen Puffersystems wie für Figur 2 beschrieben, aber mit einem steileren Gradienten (0-1,0 M NaCl in 20 Minuten) und niedrigerer Durchflußgeschwindigkeit (0,4 ml/Minute), auf einer Mono-S-Säule konzentriert. Vergleichende Dosis-Antwort-Analysen wurden mit aFGF und bFGF durchgeführt.
Das obere Feld der Figur 6 zeigt, daß HBBM-3 Rinder- Aortenendothelzellen auf dosisabhängige Weise stimulierte. Die ED&sub5;&sub0; war in der Größenordnung von 20-50 ng/ml, wobei die minimale stimulierende Dosis ungefähr 3 ng/ml betrug. Die Dosis-Antwort-Kurven von HBBM-3 und aFGF waren unter den verwendeten Assaybedingungen sowohl qualitativ als auch quantitativ ununterscheidbar. Die Antwort von HBBM-3 schien von derjenigen von bFGF unterscheidbar zu sein. In dem verwendeten Assaysystem besaß bFGF eine viel höhere Potenz und offensichtlich höhere intrinsische Aktivität als HBBM-3. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß die Frage der intrinsischen Aktivität von HBBM-3 in diesem Test nicht angemessen angesprochen werden konnte, weil Dosen, die ausreichend hoch waren, um die Beurteilung der intrinsischen Aktivität von HBBM-3 zu beurteilen, aufgrund von Beschränkungen bezüglich der Salzmenge, die ohne nachteilige Wirkungen auf das Zellwachstum zu den Zellen gegeben werden konnte, nicht verwendet werden konnten. Vorläufige Ergebnisse zeigen jedoch, daß unter den verwendeten Assaybedingungen die intrinsische Aktivität von HBBM-3 mit derjenigen von aFGF identisch ist.
Die Dosis-Antwort-Analyse wurde für HBBM-1 wiederholt. Die Ergebnisse, wie sie in dem unteren Feld von Figur 6 dargestellt werden, zeigen, daß HBBM-1 in dem gleichen Testsystem ebenfalls biologisch aktiv war. Menschliches HBBM, umfassend eine Mischung von HBBM-1, -2 und -3, wurde auf die gleiche Weise getestet und war ähnlich aktiv (Daten nicht gezeigt). Jedoch sind noch keine Ergebnisse für einzelne Fraktionen der menschlichen HBBMs erhalten worden. Weiter wurden Rinder-HBBMs auch an menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen getestet, und man fand, daß sie aktiv waren (Daten nicht gezeigt).
Schließlich wurden Aliquoten von HBBM-3, die durch Mono-S- Chromatographie konzentriert worden waren, auf 1,5 M bezüglich Natriumsulfat eingestellt und auf eine hydrophobe Säule gegeben. Die Ergebnisse, wie in Figur 7 dargestellt, zeigen, daß HBBM-3 aktiv war und sowohl von aFGF als auch von bFGF gut abgetrennt war.

LITERATURVERZEICHNIS

1. Gospodarowicz, D., J. Biol. Chem., 250, 2515-2520 (1975).
2. Gospodarowicz, D., Bialecki, H. und Greenburg, G., J. Biol. Chem., 253, 3736-3743 (1978).
3. Bohlen, P., Baird, A., Esch, F., Ling, N. und Gospodarowicz, D., Proc. Nat. Acad. Sci., 81 5364-5368 (1984).
4. Thomas, K., Rios-Candelore, M. und Fitzpatrick, S., Proc. Nat. Acad. Sci., 81, 357-361 (1984).
5. Esch, F., Baird, A., Ling, N., Ueno, N., Hill, F., Denoroy, L., Klepper, R., Gospodarowicz, D., Bohlen, P. und Guillemin, R., Proc. Nat. Acad. Sci., 82, 6507-6511 (1985).
6. Gautschi-Sova, P., Mueller, T. und Bohlen, P. BBRC, 140, 874-880 (1986).
7. Gimenez-Gallego, G., Rodkey, J., Bennett, C., Rios-Candelore, M., DiSalvo, J. und Thomas, K., Science, 230, 1385-1388 (1985).
8. Bohlen, P., Esch, F., Baird, A., Jones, K. und Gospodarowicz, D., FEBS Lett., 185, 177-181 (1985).
9. Gospodarowicz, D., Cheng, J., Lui, G., Baird, A. und Bohlen, P., Proc. Nat. Acad. Sci., 81, 6963- 6967 (1984).
10. Bohlen, P., Esch, F., Baird, A. und Gospodarowicz, D., EMBO J., 4, 1951-1956 (1985).
11. Bohlen, P. und Schroeder, R., Anal. Biochem., 126, 144-152 (1982).
12. Gautschi-Sova, P., Jiang, Z.P., Frater-Schroeder, M. und Bohlen, P., Biochemistry, 26, 5844-5847 (1987).

Claims

1. Heparin-bindendes Hirn-Mitogen in im wesentlichen reiner Form, das die N-terminale Aminosäuresequenz H-Gly-Lys-Lys- Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val- aufweist.

2. Heparin-bindendes Hirn-Mitogen nach Anspruch 1 in im wesentlichen reiner Form, das die N-terminale Aminosäuresequenz H-Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys- Val-Lys-Lys-Ser-Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln- aufweist.

3. Heparin-bindendes Hirn-Mitogen nach Anspruch 2, das aus Rinderhirn isoliert ist.

4. Heparin-bindendes Hirn-Mitogen nach Anspruch 3, das aus der aus HBBM-1, HBBM-2 und HBBM-3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin HBBM-1 ein Molekulargewicht von ungefähr 18000 Dalton aufweist, HBBM-2 ein Molekulargewicht von ungefähr 16000 Dalton aufweist und HBBM-3 ein Molekulargewicht von ungefähr 15000 Dalton aufweist, worin die Molekulargewichte durch SDS-PAGE unter entweder reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt sind, und eine Aminosäurezusammensetzung hat von: Aminosäure (Anzahl der Reste) Aparagin und Asparaginsäure Threonin Serin Glutamin und Glutaminsäure Glycin Alanin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Histidin Lysin Tryptophan Arginin

worin Prolin und Cystein vorhanden waren, basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz, aber ihr Gehalt nicht bestimmt wurde.

5. Verfahren zur Isolierung von Heparin-bindendem Hirn- Mitogen nach Anspruch 1 in im wesentlichen reiner Form, das die folgende Stufensequenz umfaßt:

(a) Extraktion aus der Gewebequelle;

(b) eine erste Kationenaustausch-Chromatographie;

(c) Heparin-Affinitätschromatographie; und

(d) eine zweite Kationenaustausch-Chromatographie.

6. Verfahren nach Anspruch 5, das weiter nach Stufe (d) die Stufe hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin die eluierten Fraktionen der Stufen (c) und (d) durch Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf die Anwesenheit von Heparin-bindendem Hirn-Mitogen analysiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Gewebequelle Rinderhirn ist.

9. Therapeutische Zusammensetzung von Material, das für die Förderung von Angiogenese nützlich ist, umfassend einen pharmazeutischen Träger und eine wirksame Angiogenesefördernde Menge des Heparin-bindenden Hirn-Mitogens nach Anspruch 1.

10. Therapeutische Zusammensetzung von Material, das für die Förderung der Bildung, Aufrechterhaltung und Wiederherstellung von Gewebe nützlich ist, umfassend einen pharmazeutischen Träger und eine wirksame Menge des Heparin-bindenden Hirn-Mitogens nach Anspruch 1.

11. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin das Gewebe neurales Gewebe ist.