FR2665448A1 - Procede d'obtention d'un peptide ayant une activite facteur de croissance, produit obtenu et son application comme medicament. - Google Patents

Abstract

Procédé pour l'obtention à partir d'un fluide biologique, de tissus ou de cellules, d'un peptide différent des FGFs et ayant une activité de facteur de croissance, ledit procédé comprenant: - une extraction protéique, - une ou plusieurs chromatographies sur colonnes échangeuses de cations et/ou - une ou plusieurs chromatographies d'affinité sur une colonne portant des résidus polysaccharidiques. Toutes les étapes sont effectuées à un pH proche de la neutralité, et l'extraction protéïque est effectuée dans un milieu ne contenant pas de détergent, ce qui permet d'obtenir un rendement d'extraction très élevé. Le peptide obtenu peut être utilisé comme agent mitogène, neurotrophique, angiogénique, ou comme agent favorisant la cicatrisation.

Description

La présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'un facteur de croissance et les produits obtenus par ce procédé
La présente invention a d'autre part pour objet l'utilisation de ce facteur pour l'activation de divers phénomènes biologiques.

La première publication décrivant la purification partielle à partir d'un extrait de cerveau de boeuf d'une molécule ayant une activité facteur de croissance a été faite par Gospodarowicz et al.,en 1978 (J. Biol. Chem. 253, 3736- 3743) . Plus récemment Esch et al ((1985) Biochem.

Biophys.Res. Commun ., 133, 554-562) , ont montré la présence d'un polypeptide appelé "Fibroblast Growth Factor basic" (FGFb) ou Heparin Binding Growth Factor II (HBGF II) possédant une activité mitogène sur un grand nombre de types cellulaires
Par ailleurs, Thomas et al.((1985) Proc. Natl. Acad
Sci. USA. 82, 6409-6413) ont pu isoler à partir du cerveau de boeuf , en utilisant un autre protocole de purification un facteur de croissance appelé Fibroblast Growth Factor acide (FGFa) ou Heparin Binding Growth Factor I (HBGF I).

Parallèment à ces recherches, le brevet US 4477435 décrit une activité similaire dans la rétine de boeuf et revendique des applications thérapeutiques dans l'utilisation de ces principes actifs comme agent de cicatrisation de l'épiderme ainsi que de l'épithélium cornéen.

Les principes actifs responsables de ces activités ont été purifiés de la rétine de boeuf par Courty et al., (1986, Biochem.Biophys. Res. Commun, 136, 102 -106) et sont identiques aux facteurs appelés FGFa et FGFb purifiés du cerveau.

Une des propriétés physico-chimiques importantes de ces deux molécules qui présentent une homologie de séquence de plus de 50%, (Gimenez-Gallego et al., (1985) Science, 230, 1385-1388 et Strydom et al., (1986) Biochemistry 25, 945-951) est leur grande affinité pour l'héparine permettant leur purification par chromatographie sur ce polysaccharide immobilisé (Shing et al., (1984)Science 223, 1296-1299).

Cette propriété a permis la mise en évidence du FGFb dans de nombreux tissus , (Baird et al., (1986) Rec. Prog.

Horm. Res. 42 , 142-205).

Ces protéines dont le gêne a été clôné par Abraham et al.( (1986) Science 233, 545-548) et par Jaye et al., ((1986) Science 233,541-545), regroupent plusieurs types moléculaires possèdant des analogies dans leur structure primaire . Elles possèdent des activités mitogènes in vitro sur des cellules dérivées du mésoderme ainsi que du neuroectoderme et sont actives à des doses de l'ordre du picomolaire.

In vivo, le rôle de ces molécules n'est pas clairement établi . I1 semble cependant qu'elles aient un rôle dans le développement embryonnaire ainsi que dans des processus physiologiques ou physiopathologiques relatifs aux phénomènes de néoangiogénèse intervenant notamment dans la cicatrisation ou le développement d'une tumeur, (Baird et al. , 1986 , Rec. Prog. Horm. Res., 42, 143-205) . Plusieurs travaux illustrent les propriétés cicatrisantes et angiogéniques de ces facteurs.

I1 est apparu lors de la purification de ces facteurs de croissance que d'autres facteurs ayant des structures différentes existaient dans le cerveau , notamment, ces facteurs étant mis en évidence du fait de leur activité mitogène . On citera ci-après, à titre illustratif, des références bibliographiques ayant trait à des facteurs de ce type.

La demande de brevet européen EP-O 326 075 a pour objet un groupe de facteurs appelés HBBM (Heparin-Binding
Brain Mitogens)isolés à partir de tissus cervicaux par un procédé de purification comprenant une extraction à pH acide suivie d'une première chromatographie par échange de cations , d'une chromatographie d'affinité sur héparine sépharose ,puis d'une deuxième chromatographie par échange de cations,la purification étant achevée par une chromatographie en phase hydrophobe.

Trois formes d'HBBM sont isolées dans les tissus cervicaux humains et bovins , les HBBM 1 ,HBBM 2 , HBBM 3 ayant respectivement des poids moléculaires de 18 kD, 16 kD et 15 kD.Ces trois facteurs possèdent une extrémité N terminale commune sur 19 acides aminés . Cette séquence est la suivante : NH2- Gly- Lys- Lys- Glu- Lys- Pro- Glu- Lys-Lys
Val - Lys - Lys - Ser - Asp- Cys- Gly- Glu - Trp-Gln
La demande EP 326 075 décrit aussi une activité mitogène de ces trois formes d'HBBM et mentionne des activités angiogénique et neurotrophique.

Une publication de Milner et al. parue en 1989 (Biochem . Biophys. Res. Commun, 165, n"3, 1096-1103)décrit un peptide appelé dans cette publication HBGF-8 de 17 KD extrait à partir d'utérus bovin et ayant une activité mitogène . Le procédé de purification consiste en une extraction en présence de détergent suivie de chromatographies sur colonnes d'héparine , puis sur colonne d'échange de cations.

Les 19 acides aminés N-terminaux du peptide HBGF-8 sont identiques à ceux des peptides HBBM tels que décrits précédemment
Un autre article publié la même année par RAUVALA et al.(The EMBO Journal vol.8, ne10, 2933-2941, 1989)décrit l'obtention d'un peptide appelé p18 extrait du cerveau de rat . Le procédé d'obtention est comparable au procédé décrit dans l'article de Milner et al. Une étape d'extraction à l'aide de détergents est suivie de passages sur colonnes d'héparine-Sépharose et sur colonne d'échange de cations.La séquence des 14 acides aminés N-terminaux est identique aux séquences des peptides HBBM correspondantes.De plus, le p 18 à un point isoélectrique proche de la neutralité et possède des propriétés neurotrophiques
Selon la présente invention, on s'est attaché à mettre au point un procédé d'isolement d'un peptide différent des FGFs et présentant une activité mitogène,ledit procédé étant plus facile à mettre en oeuvre, procurant un rendement d'extraction très élevé et n'utilisant pas de détergent.

De manière surprenante, la demanderesse a montré que les peptides extraits par ce procédé possédaient une activité mitogène 100 fois supérieure à doses égales aux peptides décrits dans l'art antérieur.

La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention à partir d'un fluide biologique , d'un extrait biologique, ou de cellules d'un peptide ayant une activité facteur de croissance , ledit procédé comprenant:
- une extraction protéique
- une ou plusieurs chromatographies sur colonnes échangeuses de cations et/ou
- une ou plusieursrchromatographies d'affinité sur une colonne portant des résidus polysaccharidiques et étant caractérisé en ce que l'extraction protéique est effectuée à un pH proche de la neutralité et dans un milieu sans détergent.

L'extraction protéique inclue préférentiellement des étapes de broyage et d'homogénéisation des tissus à un pH compris entre 6,5 et 7,suivies d'une centrifugation et d'un ajustement du surnageant à pH 6.

Les chromatographies peuvent être :
- une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions par exemple de type Sépharose Fast Flow, lavée par un tampon phosphate 50 mM, 0,15 M NaCl, pH 6 et éluée par un tampon phosphate 50 mM, 0,6 M NaCI pH 6 suivie:
- d'une chromatographie d'affinité sur une colonne portant des résidus polysaccharidiques, par exemple de type héparine-Sépharose équilibrée par un tampon phosphate 50mM, NaCl 0,65 M pH 7,4 et éluée par un tampon phosphate 50mM, NaCl 1,15 M, pH 7,4, elle-même suivie:
- d'une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions, par exemple de type Mono-S équilibrée par un tampon phosphate 50mM, pH 6,8 et éluée par un gradient de NaCI dans un tampon phosphate 50mM, pH 6,8.

Les conditions de purification décrites ci-dessus sont donc non dénaturantes du fait de l'absence de détergents et des pH des diverses solutions qui se situent autour de la neutralité et préférentiellement entre environ 6 et 7,4.

Ces conditions se différencient donc de la purification à pH acide décrite dans la demande EP 0326 075 et de la purification par extraction à l'aide de détergents décrite par Milner et al. et Rauvala et al.précédemment cités.

Ce procédé peut être mis en oeuvre notamment sur des extraits de cerveau de bovin et en particulier de bovin adulte.

Préférentiellement ce peptide a un poids moléculaire d'environ 18 kDa, un point isoélectrique d'environ 7,3 et présente la séquence N-terminale en amino-acides suivante
NH2- Gly- Lys - Lys - Glu- Lys- Pro-Glu-Lys -Lys -Val-Lys-
Lys- Ser-Asp-Cys-Gly- Glu - Trp-Gln- Trp - Ser- Val
Cys- Val- Pro.

D'autre part, il peut donner naissance par digestion trypsique ménagée à un ou deux des peptides suivants:
Ser-Lys-Pro-Gln-Ala-Glu-Ser-Trp-Gly-Ser-Leu-Lys et Ser-Cys-Asp-Gly-Glu-Trp.

I1 permet d'obtenir une concentration du peptide 170 000 fois supérieure à celle de l'extrait initial et un rendement d'extraction plus important que les rendements obtenus dans l'art antérieur,par exemple 20 fois plus importants que le rendement obtenu par le procédé décrit dans la demande EP 326.075.

Le procédé selon l'invention est d'autre part beaucoup plus rapide que les procédés de l'art antérieur et est plus facile à mettre en oeuvre du fait du nombre limité d'étapes
La présente invention a encore pour objet l'utilisation du peptide, obtenu par le procédé tel que décrit précédemment, comme agent mitogène, c'est-a'-dire comme agent favorisant la multiplication des cellules. Ce peptide a notamment une action in vitro sur des cellules dérivées du mésoderme ainsi que de l'ectoderme à des doses de l'ordre du picomolaire.

Ce peptide peut être aussi utilisé comme agent neurotrophique . En effet, il possède une action sur la croissance dendritique in vitro notamment de cellules de rats et sur une lignée de neuroblastomes humains. De plus il stimule l'activité tyrosine hydroxylase.

Le peptide peut aussi être utilisé comme agent angiogénique . Il induit une néoangiogénèse , c'est-à-dire la formation de vaisseaux,in vivo.

La présente invention a encore pour objet l'utilisation de ce peptide pour favoriser la cicatrisation.

L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques contenant ces peptides en vue de leur utilisation comme composition mitogène , angiogénique, neurotrophique , cicatrisante ou pour stimuler l'activité tyrosinehydroxylase. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être mises sous la forme de compositions pouvant être administrées sous la forme entérale ou parentérale .

L'invention a en outre pour objet des médicaments contenant ces peptides en vue de leur utilisation comme agents angiogéniques, mitogènes , neurotrophiques ou cicatrisants
L'invention sera encore illustrée sans être aucunement limitée par les exemples qui suivent ,en référence aux dessins annexés sur lesquels:
La figure 1 représente 1'élution sur colonne cationique MonoS de l'extrait issu de cerveau bovin.

La figure 2 représente le profil chromatographique obtenu par élution d'une préparation issue de l'extrait de cerveau bovin par passage sur colonne en phase inverse.

La figure 3 représente l'analyse par électrophorèse de la fraction résultante de la chromatographie sur colonne
Mono S
La figure 4 est un diagramme représentant l'influence de la concentration en peptide extrait par le procédé selon l'invention,en nanogramme par millilitre,(en ordonnée) sur la croissance de cellules in vitro (nombre de cellules en abscisse).

L'activité neurotrophique du peptide extrait par le procédé selon l'invention est illustrée sur la figure 5 dans laquelle la croissance dendritique est observée en présence (figure 5a) ou en l'absence (figure 5b) de peptide.

La figure 6 illustre l'action du peptide extrait par le procédé selon l'invention sur l'angiogénèse
La figure 6a représentant un test effectué en présence de peptide extrait par le procédé selon l'invention et la figure 6b représentant le témoin sans peptide.

La figure 7a.b.c. représente l'effet cicatrisant induit par HARP dans un modèle de cicatrisation de plaies profondes chez le rat.

La figure 7.a représente le témoin de cicatrication après deux jours
Les figures 7b et 7c représentent le résultat obtenu après respectivement deux jours (figure 7b) et trois jours (figure 7c) de traitement.

EXEMPLE 1: Procédé d'obtention du peptide
a- Etapes du procédé
Etape 1: Extraction protéique.

Après dissection macroscopique des méninges et des caillots sanguins visibles, les cerveaux prélevés au maximum 4 heures après l'abattage sont séparés en deux parties au niveau des hémisphères puis immédiatement congelés à -20 C
Après congélation, les cervelles de boeufs sont utilisées dans un délai de conservation à - 200C qui est inférieur à 2 semaines . L'eau entrant dans la composition des tampons est de l'eau distillée pour les premières étapes constituant la purification, puis de l'eau Milli Q (Waters) pour les étapes finales incluant la chromatographie d'affinité pour l'héparine ainsi que la dernière chromatographie cationique sur colonne Mono S.Des lots constitués de 8 cerveaux de boeuf congelés (environ 3,2 kg de cervelle) sont directement broyés puis homogénéisés dans un volume double du poids de cerveau d'une solution de 0,15 M sulfate d'ammonium , à un pH compris entre 6,5 et 7,0 . Après 1 heure d'incubation à + 40C sous agitation, l'homogénat est centrifugé à 14 400 g à + 40C pendant 1 heure. Le surnageant obtenu est alors filtré sur un coussin de laine de verre de façon à éliminer la fraction lipidique surnageante. Après l'obtention de cette solution grossièrement délipidée, le pH est alors ajusté à 6,00 avec une solution de Na2HP04 0,5 M.

L'extrait ainsi obtenu - environ 9 litres- est appelé "Extrait brut".

Etape 2:Chromatographie sur colonne échangeuse d'ions de l'extrait brut.

L'extrait brut correspondant à l'extraction de 3,2 kg de cervelle de boeuf est incubé pendant 4 heures à 40C sous agitation modérée, avec 200 ml de gel S Sépharose-Fast Flow, préalablement lavé par 10 volumes de colonne avec de l'eau distillée puis équilibré dans un tampon phosphate 50 mM pH 6,00
Cette solution de gel cationique est alors versée dans une colonne, lavée au moins 10 fois son volume avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,00 contenant 0,15 M NaCl sous un débit de 2 litres par heure.

Après lavage de la colonne jusqu'à une densité optique lue à 280 nm inférieure ou égale à 0,1 unité de D.O,le gel est ensuite élué par 500 ml de tampon phosphate 50 mM pH 6,00 contenant 0,6 M Nazi.

L'éluat ainsi obtenu est appelé "Eluat 0,6 M NaCl".

Etape 3: Chromatographie sur colonne héparine
Sépharose de "l'éluat 0,6 M NaCI".

500 ml de la fraction appelée "Eluat 0,6 M NaCl" sont incubés avec 2 grammes d'héparine Sépharose (Pharmacia) préalablement lavés puis gonflés et équilibrés par un tampon phosphate 50 mM pH 7,4 contenant 0,65 M NaCl pendant 4 heures à 40C.

Après rinçage du gel sur verre fritté par 1 litre de tampon d'équilibration, le gel est versé dans une colonne en verre borosilicaté de 16 mm de diamètre puis élué à la température ambiante par un tampon phosphate 50 mM pH 7,4 contenant 1,15 M NaC1 sous un débit de 30 ml/heure.

La fraction ainsi obtenue est appelée "HS 1,15 M".

Une alternative à ce protocole de purification peut être proposée en remplaçant la chromatographie sur héparine-Sépharose par une chromatographie utilisant des supports solides (type polystyrène ou silice) sur lesquels sont greffés des dextranes sulfates ou substitués chimiquement par des groupements carboxylique, benzylamine ou benzylamine-sulfate selon les protocoles décrits dans les brevets français n02.613.936 et 82 01641.

Etape 4:Chromatographie sur colonne Mono S. de la fraction "HS 1,15 M".

L'éluat dénommé "HS 1,15 M " correspondant à l'extraction faite à partir de 8 cerveaux de boeuf, est, après dilution d'un facteur 10 par un tampon phosphate 50 mM pH 6,8, chromatographié sous un volume de 120 ml/h sur une colonne Mono S HR 5/5 (Pharmacia) préalablement équilibrée par le tampon de dilution.

Après lavage de la colonne, le gel est élué par un gradient linéaire de concentration en NaC1 d'un volume total de 40 ml allant de O à 1 M dans un tampon phosphate 50 mM pH 6,8 sous un débit de 30 ml/h. La figure 1 illustre le chromatogramme obtenu après élution de la colonne.

La fraction éluée contenant une concentration de 0,6 à 0,8 M NaCl correspond à la protéine purifiée appelée "HARP" (figure 1).

b) Bilan de purification l)Détermination de la quantité de protéines.

La quantité de protéines obtenue après chaque étape de purification est mesurée par BCA (Pierce) (Smith et au.(1985) Anal. Biochem. 150, 76-85) en utilisant la sérum albumine bovine (SAB) comme étalon de mesure. La solution standard de SAB possède une densité optique de 0,73 unité de
D.O lue à 280 nm pour une concentration de 1 mg/ml dans un tampon phosphate.

2)Détermination de l'activité biologique.

L'activité biologique de chacune des fractions obtenues au cours de la purification est testée pour sa capacité à induire in vitro une prolifération cellulaire.

L'induction de la prolifération est testée sur des cellules endothéliales capillaires de cerveau de boeuf (Bovine Brain Capillary : BBC), cultivées dans un milieu de culture modifié par Dubelcco (DMEM Gibco) contenant 20% de sérum de veau foetal (Boehringer).

Après ensemencement cellulaire à une densité d'environ 1250 cellules par cm2 dans des boites de culture 12 puits (Costar) en présence ou non d'une concentration variable de l'échantillon à tester puis nouvelle adjonction de cette même quantité d'échantillon au jour 2, le nombre total de cellules est alors déterminé au jour 5.

Afin de pouvoir évaluer un rendement d'activité biologique de la purification, une unité de stimulation (US) a été définie. Cette valeur correspond à la quantité de protéines nécessaire pour induire 50% de la prolifération cellulaire maximale induite par ce même échantillon après soustraction à cette valeur du nombre de cellules obtenu après 5 jours de sous culture sans adjonction d'échantillon.

Le rendement de purification du procédé selon l'invention est de 500 g de peptide par kg de tissu frais alors qu'il n'est que de 40-50 tg/kg de tissu frais par le procédé décrit dans la demande EP 326.075.Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

TABLEAU 1
Rendement de purification de 1'HARP(a)
Etapes de Quantité de Rendement US (b) Facteur de purification protéines (c) protéique purifica
(mg) tion(d)
Fraction brute 18.000 100 2,5x104 1
Eluat 0,6M 175 0,1 400 62,5
HS 1,15 M 0,450 0,0025 0,2 125.000
Mono S 0,6 M 0,420 0,0023 0,15 170.000 (a) les valeurs indiquées dans le tableau correspondent à la moyenne des résultats obtenus à partir de 3 purifications indépendantes et sont rapportées par kg de cerveau traité.

(b) l'activité biologique est déterminée par comptage du nombre de cellules endothéliales capillaires après 5 jours de sous-culture en présence de l'échantillon testé, chaque point de dosage est réalisé en double. L'unité de stimulation est définie comme la quantité de protéines nécessaire pour induire 50% de la prolifération cellulaire maximale induite par ce même échantillon.

(c) la concentration protéique est déterminée par BCA.

(d) le facteur de purification est calculé en formulant l'hypothèse que l'activité de chaque fraction issue de chacune des étapes de la purification est due principalement à 1'HARP
EXEMPLE 2
Etude de la séquence
500 pmoles de la fraction nommée HS 1,15 M sont chromatographiées sur une colonne de phase réverse C4 Vydac cat n" 214TP54. Après injection puis lavage de la colonne par de l'eau pyrodistillée contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique (qualité HPLC ) , le gel est élué par un gradient linéaire de concentration d'acétonitrile contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique.

La figure 2 t dans laquelle le temps d'élution est porté en abscisses et l'adsorbance en ordonnées,représente le profil chromatographique obtenu et montre la présence d'un pic protéique majoritaire biologiquement actif élué à un pourcentage d'acétonitrile centré sur une valeur de 32t correspondant au pourcentage d'élution de 1'HARP.

Approximativement 200 moles d'HARP chromatographiées sur phase réverse sur C4 sont directement injectés dans un microséquenceur Applied Biosystem 477A.

Après programmation de 19 cycles de dégradation d'Edman et identification des acides aminés phénylthiohydantoines par phase réverse (modèle 120A; Applied Biosystem), l'analyse des résultats obtenus permet de définir la séquence N-terminale suivante
Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val- Lys-Lys-Ser-Asp-Asp Gly-Glu-Trp-Gln-Trp-Ser-Val-Cys-Val-Pro.

Le rendement protéique de l'analyse est égal à 80% et montre un seul acide aminé N-terminal attestant l'homogénéité de la protéine purifiée nommée "HARP".

D'autre part la digestion trypsique ménagée de la protéine HARP donne naissance à deux peptides: Ser-Lys-Pro-Gîn-Ala-Glu-Ser-Trp-Gly-Ser-Leu-Lys
et
Ser-Cys-Asp-Gly-Glu-Trp.

EXEMPLE 3: Activité mitogène
La molécule purifiée possède une activité mitogène testée in vitro sur des cellules endothéliales capillaires de bovin à des doses de l'ordre du ng/ml de milieu de culture . L'unité de stimulation définie comme la quantité de protéine nécessaire pour induire 50% de l'activité maximale est comprise entre 100 et 500 pg/ml de milieu de culture pour la molécule purifiée.

Par comparaison, l'unité de stimulation du peptide obtenu par le procédé décrit dans la demande EP 326.075 est d'environ 10 ng/ml de milieu de culture,soit 100 fois moindre
EXEMPLE 4 : Activité neurotrophique
L'activité neurotrophique de 1'HARP est testée sur des cellules Pheochromocytoma clone PC12 ( Schubert et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 2579-2583)
Les cellules sont cultivées à 370C dans une atmosphère à de C02 dans un milieu de culture modifié par Dulbelcco (DMEM; 4,5 g de glucose/litre)additionné de 10% de sérum de veau foetal (Gibco), 5% de sérum de cheval décomplémenté par chauffage (30 minutes à 600C) (Gibco) , 100 ug/ml de streptomycine, 100 unité/ml de pénicilline et 0,25 mg/ml de
Fungizone (Gibco ).

25.000 cellules sont ensemencées dans une bote de 35 mm de diamètre contenant 2 ml de milieu de culture. Après 24 heures d'incubation à 370C les cellules sont transférées dans des milieux avec ou sans HARP. L'analyse de la croissance dendritique est alors effectuée 24 heures après ce transfert .La figure 5 représente les résultats obtenus après adjonction (figure 5a) ou non (figure 5b) de 1 ng/ml de milieu de culture d'HARP.L'activité neurotrophique de 1'HARP est clairement démontrée sur ces figures.

Cette activité de différenciation neuronale est également mise en évidence in vitro sur une lignée de neuroblastomes humain. Ce dosage démontre que cette protéine ayant une origine bovine , possède une activité biologique in vitro sur des cellules d'origine humaine.

EXEMPLE 5
Activité d'induction de la tyrosine hydroxylase.

Les cellules de la lignée PC12 sont cultivées dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 4 en présence d'une concentration variable de FGF, HARP ou de
NGF. Après 48 heures de traitement les cellules sont lavées trois fois par un tampon PBS puis récupérées par grattage
Le dosage de l'activité tyrosine hydroxylase dans chaque échantillon est alors directement effectué par mesure de la quantité de DOPA formé par heure et par mg de protéine(Tableau 2).

TABLEAU 2
Activation de la tyrosine hydroxylase par différents
facteurs de croissance
facteurs de croissance
Agent Unité d'activité *
Contrôle
Contrôle
a 28
b 30 bFGF
a 84
b 98
HARP
a 54
b 70
NGF
a 140
b 122
b 122 concentration: 50 ng/ml, a et b représentent les valeurs obtenues à partir de deux expériences différentes * en nanomoles de DOPA formées/heure/mg.

EXEMPLE 6 - Activité angiogénique in vivo
Le test angiogénique in vivo est réalisé par l'induction de la néoangiogénése par un composé à tester dans la cornée de lapin. Les animaux utilisés sont des lapins femelles New Zeland de 2,5 à 3 kg d'environ 3 mois.

L'échantillon à tester est adsorbé sous un volume de 2 1 sur des fragments de lentille de contact de 2 mm2 (lentille
Essilor degré d'hydratation 70%) après déshydratation partielle des fragments.

Sous anesthésie générale (Nembutal 6%) , on réalise des poches cornéales dans le tissu conjonctif au nombre de deux par oeil positionnées perpendiculairement au plus grand axe de la pupille.

Les fragments de lentille sur lequel l'échantillon a été déposé sont alors insérés dans les fentes.

Sept jours après le dépôt des lentilles, la croissance des néovaisseaux est observée par examen de l'oeil au niveau du limbus en face de chaque poche cornéale pratiquée dans la cornée.

La figure 6a représente l'angiogénèse induite dans la cornée de lapin par 100 ng d'HARP, la figure 6b étant le témoin de la manipulation où 100 ng d'HARP inactivé par acidification sont déposés.

Les résultats obtenus qui peuvent être quantifiables par mesure planimétrique de la surface des capillaires néoformés sont en accord avec les doses d'HARP utilisées en comparaison avec d'autres facteurs angiogéniques, et montrent une activité angiogénique in vivo de 1'HARP.

EXEMPLE 7 : Activité cicatricielle in vivo.

L'estimation des effets cicatriciels de 1'HARP est appréciée en déposant dans des tampons de collagène fibrillaire de type 1 des solutions de HARP à des concentrations variant de 100 ng/ml à 100 tg/ml.

Sur la face dorsale de rat Hairless sont pratiquées par des emportes pièces des excisions de l'ensemble du plan cher cutané en situation dorsale par rapport au plan de symétrie bilatéral de l'animal. Les blessures sont comblées par du collagène pré-découpé aux mêmes dimensions que les plaies. Chacun des champs expérimentaux reçoit 50 ul d'une solution titrée de HARP dissoute en sérum physiologique stérile . A chaque condition expérimentale , est associée, en position contro-latérale, une expérimentation témoin obtenue par imbibition du tampon de collagène avec du sérum physiologique dépourvu du peptide bio-actif.

Ces expérimentations sont réalisées sur des lots de 6 animaux et suivies en fonction du temps pour des gammes de concentrations définies ci-dessus . Les zones cicatricielles sont prélevées à des temps définis et observées par analyse histologique
I1 ressort que par rapport aux cicatrisations témoins - figure 7a-, les collagènes traités par HARP sont d'une part colonisés rapidement par les cellules environnantes de la plaie et d'autre part provoquent de la part des tissus sains des réactions de comblement intenses -figure 7non observables chez les témoins.HARP entraîne de plus une réépidermisation très nettement accélérée -figure 7c) par rapport à celle de la cicatrisation témoin.

La figure 7a présente un témoin de cicatrisation 2 jours après le traitement . Par rapport aux berges dermiques de la plaie (A), le collagène (B) s'organise en une couche dense, peu cellulaire, imprégnée d'exsudats sériques et de polynucléaires . L'hypoderme sous-jacent (C) ne présente aucune modification structurale apparente . La cavité correspondant aux tissus excisés (D) n'est pas comblée et la plaie présente une dépression importante par rapport à la ligne originelle définie par la continuité superficielle de l'épiderme
La figure 7b présente le traitement expérimental en position contro latérale de la cicatrisation présentée en figure 7a. La zone dermique (A) est turgescente et recouver te d'un épiderme (E) qui en 48 heures a entraîné une prolifération conduisant à la couverture du tissu cicatriciel après 4 jours. Cette réépidermisation n'est observée chez le témoin qu'après 6 jours environ. Le collagène (B) est intensément colonisé par les cellules de l'hotte et a induit une réaction de comblement intense émanant des cellules hypodermiques . On peut noter la délimitation de cette progression cellulaire en F.

La figure 7c illustre l'accélération de l'épidermisation de la plaie sous l'action de HARP . El et
E2 représentent les fronts d'avancée des épidermes périphériques à la plaie qui s'étalent sur le collagène intensément colonisé (B). L'hypoderme sous-jacent (C)réagit à la présence de HARP dans le collagène en élaborant de nouveaux vaisseaux sanguins (VS), ce qui confirme l'action néoangiogénique de ce peptide dans un autre modèle in vivo.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS

   - une ou plusieurs chromatographies d'affinité sur une colonne portant des résidus polysaccharidiques et étant caractérisé en ce que les étapes sont effectuées à un pH proche de la neutralité et l'extraction protéique est effectuée dans un milieu ne contenant pas de détergent.

   - une ou plusieurs chromatographies sur colonne échangeuses de cations, et/ou

   - une extraction protéique,

   l.Procédé pour l'obtention, à partir d'un fluide biologique de tissus ou de cellules, d'un peptide ayant une activité facteur de croissance , ledit procédé comprenant:
2. 2.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu il comprend les étapes suivantes:

   - une extraction protéique à un pH compris entre environ 6,5 et 7,

   - une première chromatographie sur colonne échangeuse d'ions dans un tampon à une valeur de pH d'environ 6,

   - une chromatographie sur colonne portant des résidus héparine à une valeur de pH d'environ 7,4, et

   - une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions à une valeur de pH d'environ 6,8.
3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2,caractérisé en ce que les tissus sont extraits de cerveaux et en particulier de cerveaux de bovins.
4. 4.Peptide obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3.
5. 5.Peptide selon la revendication 4 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kD, un point isoélectrique d'environ 7,3 et présentant la séquence N-terminale en amino-acides suivante NH2-Gly-Lys -Lys -Glu-Lys-Pro-Glu-Lys -Lys- Val-Lys-Lys

   Ser-Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln-Trp-Ser-Val-Cys-Val-Pro
6. 6. Peptide selon la revendication 4 , caractérisé en ce qu'il donne naissance par digestion trypsique ménagée à un ou deux des peptides suivants Ser-Lys-Pro-Gln-Ala-Glu-Ser-Trp-Gly-Ser-Leu-Lys

   et

   Ser-Cys-Asp-Gly-Glu-Trp.
7. 7. Utilisation du peptide selon l'une des revendications 4 à 6 comme agent mitogène, neurotrophique ou comme agent stimulant l'activité tyrosine hydroxylase
8. 8. Peptide selon l'une des revendications 4 à 6 pour utilisation pour la cicatrisation de la peau ou comme agent angiogénique
9. 9. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'un peptide selon l'une des revendications 4 à 6 en association avec un ou plusieurs diluants compatibles ou pharmaceutiquement acceptables
10. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour l'angiogénêse
11. 11. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour induire la croissance des cellules nerveuses ou pour stimuler l'activité tyrosine hydroxylase.
12. 12. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour induire le développement de cellules
13. 13. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour favoriser la cicatrisation
14. 14. Composition selon l'une des revendications 9 à 13 présentée en vue de l'administration entérale ou parentérale
15. 15. Médicament contenant au moins un peptide selon l'une des revendications 4 à 6 et 8.