WO2001027136A2 - Peptides ayant une activite de stimulation de la reponse immunitaire et de regeneration tissulaire - Google Patents

Peptides ayant une activite de stimulation de la reponse immunitaire et de regeneration tissulaire Download PDF

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Definitions

  • PEPTIDES HAVING AN ACTIVITY OF STIMULATION OF THE IMMUNE RESPONSE AND OF TISSUE REGENERATION.
  • the present invention relates to a new family of peptide molecules having the capacity in particular to stimulate the expression of cytokines of inflammation and to promote tissue regeneration.
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions containing at least one of the peptides.
  • angiogenic growth factors are known in the prior art such as the factors HARP, MK, FGF-1, FGF-2, VEGF, HIVl-tat, HIV2-tat, HGF, HB-EGF or even angiogenin.
  • HARP Heparin Affin Regulatory Peptide
  • PTN Pleiotrophin
  • HB-GAM heparin binding-growth associated molecule
  • the growth factor HARP is a polypeptide of 168 amino acids containing a hydrophobic N-terminal motif of 32 amino acids corresponding to a signal peptide.
  • HARP is a secreted protein of 136 amino acids, in its short form, or 139 amino acids, in its long form, whose apparent molecular weight, determined in SDS-PAGE under reducing conditions, is 18 kDa.
  • HARP was originally isolated from the brains of newborn rats as a molecule inducing neuritic growth in vitro (3) suggesting that this polypeptide is involved in the maturation of neuronal cells (4). Later, studies have shown that this polypeptide is also present in non-neuronal tissues, including the heart (5), the uterus (6), the cartilages (7), and the bone extracts (8), demonstrating that the function of HARP is not limited to an activity promoting neuritic growth as previously reported (3).
  • HARP is able to stimulate the growth of fibroblast, epithelial and endothelial cells in vitro (6, 9). This mitogenic activity has since been confirmed by the use of recombinant proteins produced from eukaryotic expression systems (9, 12). HARP also induces the formation of pseudo-capillaries in vitro (12). In vivo, in different tissue models, the localization of HARP is notably associated with the endothelial cells of the blood capillaries (16). At present, data relating to HARP suggests that this polypeptide plays a role in the complex mechanisms involved in angiogenesis and neoangiogenesis in tumors. A great deal of research has been done in this direction to determine the involvement of HARP in tumor progression, in particular in hormone-dependent tumors such as the breast or the prostate.
  • HARP like MK
  • human purified recombinant proteins from HARP have been shown to be mitogenic to endothelial cells (9,12), and exert in angiogenic activity (12).
  • Numerous studies have shown the involvement of HARP and MK in development methods (10, 13, 14).
  • HARP protein mRNA distribution studies during embryonic and postnatal development suggest important functions in cell growth and differentiation (15). However, little is known about the in vivo physiological functions of these molecules.
  • the presence of HARP transcripts in adult tissues including the meninges, iris, testes and uterus also indicate a physiological role during adulthood.
  • the research carried out in the context of the present invention has focused on numerous angiogenic growth factors, such as FGF-1, FGF-2, VEGF, HIVl-tat, HIV2-tat, HB-EGF, Angiogenin, HARP and MK , and enabled the inventors to identify peptide sequences which are found in several of these factors. From these, the inventors have constructed peptide molecules rich in basic amino acids lysine (K) and arginine (R).
  • K basic amino acids
  • R arginine
  • Table I below reports portions of sequences rich in basic amino acids of several growth factors where the positions of basic amino acids are substantially aligned.
  • n and m are each an integer from 0 to 20 the sum of which n + m is between 0 and 20, preferably between 0 and 15 and most preferably between 0 and 10,
  • Al is a basic amino acid and more particularly lysine (Lys) or arginine (Arg),
  • A2 is an amino acid chosen from: basic amino acids, glutamic acid (Glu), glycine (Gly), aspartic acid (Asp),
  • A3 is an amino acid chosen from: basic amino acids, proline (Pro), glutamic acid (Glu), glutamine (Gin),
  • A4 is an amino acid chosen from: basic amino acids, glutamic acid (Glu), glycine (Gly), serine (Ser), valine (Val).
  • peptides of formula (I) will also be designated “pAHA” for "angiogenic HARP peptide”.
  • the invention more particularly contemplates the peptides of the following formulas:
  • the peptide of formula (II) has been defined more particularly from the sequence of HARP (1-14).
  • the peptide of formula (III) has been defined more particularly from the sequence of HIV tat (70-92).
  • the peptide of formula (IV) has been defined more particularly from the sequence of HB-EGF (85-114).
  • the peptide of formula (V) has been defined more particularly from the sequence of HARP (108-132).
  • the peptide of formula (VI) has been defined more particularly from the sequence of VEGF (145-170).
  • the peptide of formula (VII) has been defined more particularly from the sequence of HIV tat (41-65).
  • the peptide of formula (VIII) has been defined more particularly from the sequence of MK (1-11).
  • the peptides of the invention can be prepared by chemical synthesis or by gene expression techniques from the corresponding polynucleotide sequence by techniques known to those skilled in the art.
  • the inventors have demonstrated that the pAHA peptides have angiogenic and healing properties like HARP and at comparable doses (ED50 # 5-50 ng / ml). They observed the remarkable activity of these peptides on vascular ischemia (angiogenesis) and muscle regeneration and scarring. They have also shown that the peptides of the invention are capable of stimulating the expression of the cytokines of inflammation and are therefore useful for preventing or treating diseases linked to immunosuppression, and in particular AIDS.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical composition containing one or more of the preceding peptides, associated in said composition with one or more pharmaceutically acceptable vehicles.
  • the invention relates more particularly to a composition comprising one or more pAHA peptides, and optionally another compound, useful for promoting cell regeneration and growth, such as muscle growth , and therefore in wound healing.
  • the invention relates very particularly to a composition comprising one or more pAHA peptides, and optionally another compound, useful for preventing or treating vascular ischemia.
  • a composition comprising one or more pAHA peptides, and optionally another compound, useful for preventing or treating vascular ischemia.
  • the research carried out in the context of the invention has made it possible to demonstrate unexpected properties of pAHAs on the proliferation of circulating blood cells, and more particularly of peripheral blood mononuclear cells.
  • This property has made it possible to show the stimulating properties of pAHA on certain cytokines, in particular the cytokines of inflammation.
  • HARP protein mRNA has in fact been observed in cells of blood vessels, both endothelial cells and smooth muscle cells, as well as in the human mammary glands (16). In addition, it has been reported that HARP is an angiogenic growth factor (12) and that it is synthesized and localized in vascular endothelial cells (16).
  • the inventors therefore evaluated the in vi tro activity of this growth factor on PBMCs (human mononuclear cells from peripheral blood) freshly isolated by incubating PBMCs with the HARP factor or with a pAHA peptide.
  • PBMCs human mononuclear cells from peripheral blood
  • the results obtained show that HARP and pAHA are capable of stimulating the incorporation of tritiated thymidine into the nucleus of PBMCs.
  • These results therefore demonstrate that the HARP molecule as well as the pAHA peptide strongly stimulate the proliferation of human mononuclear cells of the peripheral blood, and more particularly after one week an increase in the population of T lymphocytes is observed.
  • HARP is active on the proliferation of lymphocytes at very low concentrations, of the order of 10 ⁇ M. This surprising result has led the inventors to consider that the HARP factor must bind to its receptor on PBMCs with a high affinity.
  • HARP does not act on the production of IL2 interleukins, but that HARP, and pAHA, bind with a strong affinity to a specific receptor present on the lymphocytes, and induce the activation of the interleukin sites, in particular of the IL2 sites.
  • the HARP receptors are very little known.
  • Kd 600 ⁇ M
  • HARP binding sites have also been found in several cell types, including rat kidney cells, human mammary adenocarcinoma cells, human epidermal carcinoma cells, human hepatocarcinoma cells, neuroblasts mouse, and pheochromocytoma cells. It is commonly accepted that no biological response transmitted by HARP has been observed on this type of cells, and therefore that these binding sites cannot be considered as functional receptors.
  • Parallel studies describe interactions between HARP and heparan proteoglycan sulfate, such as syndecan-1 and syndecan-3. Syndecan-3 has been shown to interact with HARP with an apparent Kd of 800pM. This heparan proteoglycan sulfate is involved in the neuritic growth activity of HARP since anti-syndecan-3 antibodies can block this activity (21).
  • MK Midkine
  • HARP binds to different surface receptors, which has also recently been 'demonstrated (24, 25).
  • the two molecules are expressed and isolated using analogous experimental methods, including the same recombinant expression system and the same purification techniques. The fact that the incorporation of tritiated thymidine is observed only with HARP, and not with MK, excludes the presence of a bacterial contaminant exhibiting mitogenic activity with respect to PBMCs.
  • the invention relates more particularly to a pharmaceutical composition comprising one or more pAHA peptides, and optionally another compound, useful for stimulating the proliferation of mononuclear cells of the blood, and in particular T lymphocytes. Stimulation of the proliferation of T lymphocyte cells is very particularly useful in the treatment of immunosuppressed patients.
  • Example 4 Another observation was made on cells from the blood of AIDS patients.
  • the inventors show how the stimulation of the patient's blood cells by the peptides of the invention makes it possible to amplify the replication of the HIV virus in vitro and thus to promote its detection and therefore its typing.
  • Compositions comprising peptides of the invention are therefore also useful for the diagnosis of infection by HIV viruses.
  • the effectiveness of the anti-viral agents will be enhanced by administering them before or simultaneously with one or more peptides of the invention.
  • the peptides of the invention will promote the replication and release of HIV viruses in vivo, in particular residual HIV viruses, which remain present in the body after antiviral treatment.
  • the administration of the peptides according to the invention, by activating these viruses, would thus make them more accessible to antiviral agents, and more easily destructible.
  • cytokines in general play a role in cell proliferation, more particularly in blood cells. The inventors therefore sought to demonstrate the role of HARP and pAHA on the expression of cytokines. Inducing properties of the expression of inflammation cytokines have thus been demonstrated.
  • inflammation cytokines is meant TNFalpha, IL1, IL6, and INFgamma.
  • the inventors therefore tested the induction of the expression of three cytokines of inflammation
  • TNFalpha, IL1 and IL6 by PBMCs cells treated with HARP, and the induction of expression of IL6 by two pAHA peptides in accordance with the present invention, the sequences of which are reported in Example 5 below.
  • the results obtained with the HARP molecule indicate that HARP is capable of inducing in a dose dependent manner the expression of the cytokines TNFalpha, IL1 and IL6.
  • results obtained with the two pAHA peptides show that they are capable of stimulating the expression of IL ⁇ .
  • An increase in the expression of these cytokines is also detected after addition to the cells of other peptides in accordance with the present invention, derived from angiogenin and the tat protein (see Table I). No expression of these inflammatory cytokines is detected when the HARP molecule is denatured.
  • the invention relates very particularly to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more pAHA peptides, and optionally another compound, useful for stimulating the production of cytokines of inflammation.
  • Such a composition according to the invention is therefore particularly indicated in the prevention or treatment of diseases linked to immunosuppression.
  • peptides of the invention or a composition containing them to promote growth and differentiation of cells in culture, in particular of lymphoid cells, such as endothelial cells and T lymphocytes. Indeed, the culture of these cells is often practiced in the context of diagnostic tests.
  • the peptides of the invention can be produced by genetic expression of a polynucleotide sequence encoding said peptides.
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid molecule constituted by or comprising at least one polynucleotide sequence coding for a peptide defined above.
  • nucleic acid molecules are more particularly vectors, such as plasmids which can be used to transform host cells in vitro or in vivo.
  • host cells is meant for example bacteria allowing the production of the peptides of the invention.
  • the invention therefore also relates to compositions comprising as active principle at least one nucleic acid molecule or cells defined above.
  • FIG. 1 shows the stimulation of the incorporation of tritiated thymidine in PBMCs stimulated or not by HARP.
  • White bar cells no stimulated
  • hatched bar cells stimulated with 100 ng / ml of HARP.
  • FIG. 2 represents the dose response effect of HARP tested on PBMCs.
  • A) The cells are cultured in the absence or in the presence of different concentrations ranging from 0.1 to 100 ng / ml of HARP (• - •) or of Midkine (MK) (O-O). Each of the values represents the average of the cpm obtained ⁇ the standard deviation.
  • B) The cells are incubated with tetanus toxin (TT) at 1800 UT / ml, phytohemagglutinin (PHA) at 2.5 ⁇ g / ml, interleukin-2 (IL2) at 50 IU / ml, or untreated ( NT) as internal stimulation controls.
  • TT tetanus toxin
  • PHA phytohemagglutinin
  • IL2 interleukin-2
  • NT untreated
  • FIG. 3 represents the dose response effect of HARP on PBMCs treated with an anti CD3.
  • the cells are cultured as previously described. It should be noted that if the cells are treated with 100 ng / ml of HARP in the presence of CD3, high cell mortality is then observed. Black bar; HARP alone, white bar; HARP + anti CD3.
  • FIG. 4 represents the dose response effect of HARP on PBMCs treated with tetanus toxin.
  • the cells are cultured as previously described. It should be noted that if the cells are treated with 100 ng / ml of HARP in the presence of tetanus toxin (800 IU / ml) a high cell mortality is then observed. Hatched bar: HARP only; white bar: HARP + tetanus toxin.
  • FIG. 5 represents the effect of the HARP protein on the replication of the HIV virus by measuring the immunoreactivity p24.
  • PBMCs from a patient infected with HIV are incubated according to the protocol described in ⁇ 1 for 3 days with variable concentrations of HARP (0.1-100 ng / ml).
  • the viral replication is estimated by measuring the immunoreactivity associated with the p24 protein present in the culture medium. (*) low cell mortality; (**) high cell mortality.
  • the production of the virus is evaluated by the "Abott HIV Ag monoclonal" test which is an immunoenzymatic assay on a solid phase of the sandwich type.
  • the viruses present in the test sample are lysed with Triton X100 and then the lysate is incubated with polystyrene beads coated with anti-p24 monoclonal antibody. After incubation, the beads are washed, and the presence of specific immunoglobulins is revealed by incubation with a second anti-mouse Ig antibody coupled to peroxidase. The revelation is made by adding a substrate of the peroxidase; 1 orthophenylenediamine
  • Figure 6 shows the activation of peripheral blood mononucleotide cells by the HARP peptides.
  • the PBMCs are cultured for 7 days in RPMI culture medium containing 10% fetal calf serum in the absence or in the presence of 1 ng / ml of the HARP protein or of 1 ⁇ g / ml of the peptides 1 or 2.
  • L incorporation of tritiated thymidine is determined as described above.
  • Figure 7 shows the study of the effect of
  • FIG. 8 represents the effect of HARP on the expression of TNF ⁇ after 3 days (white bars) or
  • FIG. 9 represents the effect of HARP on the expression of IL6 after 3 days (white bars) or 7 days of culture (black bars).
  • the assay of these cytokines is carried out using an ELISA test marketed by R&D.
  • FIG. 10 represents the expression of IL6 by peptides 1 and 2 corresponding to the NH 2 parts
  • COOH of the HARP polypeptide COOH of the HARP polypeptide.
  • the assay of these cytokines is carried out using an ELISA test marketed by R&D after 7 days of incubation.
  • Figure 11 shows the effect of HARP peptides on muscle regeneration.
  • the adult rat soleus muscle is crushed, treated or not with the peptides and then removed after 4 days of regeneration: 1: treated with PBS (50 ⁇ l)
  • Figure 12 illustrates the angiogenic effect of peptide 1 tested in the CAM.
  • Figure 13 is a schematic representation of the plasmid used to produce the peptide corresponding to the N-terminal part (residues 1 to 14) of HARP.
  • Human mononuclei cells from different healthy donors are isolated from peripheral blood after centrifugation on a cushion.
  • Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech) as described by the manufacturer.
  • the cells are washed, then cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (56 ° C, 30 min), 100 units / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • the cells seeded at 10 6 cells per ml in a round bottom 96-well culture dish (Costar), are cultured for 7 days in the presence or not of the recombinant human HARP protein produced in Coli, at a concentration of 100 ng / ml.
  • the HARP polypeptide is capable of stimulating the incorporation of tritiated thymidine in the nucleus of PBMCs.
  • the stimulation index defined as the ratio of the radioactivity incorporated in the cells treated with HARP to that of the control cells, not treated with HARP, varies from 2.3 to 51.7 times (see results of experiment N ° 4 and N ° 7).
  • FIG. 1 The histogram presented as an insert in FIG. 1 shows that treatment with 100 ng / ml of HARP induces a 2.9-fold increase in the number of cells compared to the untreated control, demonstrating that the incorporation of thymidine observed is indeed proportional to the number of cells.
  • This cell count was carried out with the cells used for the incorporation of tritiated thymidine from experiment No. 7.
  • the dose response curve of the HARP protein (0.1 to 500 ng / ml) tested on the PBMCs is presented in FIG. 2A.
  • the positive stimulation controls were performed using phytohemagglutinin (PHA) 2.5 ⁇ g / ml and tetanus toxin (TT) 1800 IU / ml (fig. 2B). No stimulation is observed after addition of IL2 showing • an absence of activation of the cells used for these tests.
  • PHA phytohemagglutinin
  • TT tetanus toxin
  • Example 2 Role of the HARP protein as a co-stimulator of the specific immune response.
  • T lymphocytes can be obtained via the activator of the antigen receptor (TCR) associated with the major histocompatibility system (MHC).
  • TCR antigen receptor
  • MHC major histocompatibility system
  • This activation requires, in addition to the specific recognition TCR-MHC / antigen, the action of adhesion molecules playing a role of coactivation and amplification of the response.
  • HARP could amplify cell proliferation either by stimulation of the receptor to T lymphocytes using an anti CD3 or a memory antigen, tetanus toxin.
  • Activation of the T lymphocyte receptor is obtained by treating lymphocytes with a monoclonal anti CD3 antibody (1/100, I munotech).
  • the effect of HARP on the cellular proliferation of PBMCs is tested by adding an optimal concentration of HARP (1 ng / ml, cf. example 1) in the presence or not of anti CD3.
  • the cultures as well as the quantification of the incorporated tritiated thymidine are carried out as described in Example 1. The results obtained are presented in FIG. 3.
  • the anti CD3 antibody (1/100) stimulates, after 7 days of incubation with the cells, the incorporation of tritiated thymidine by 25 times (control; 600 ⁇ 60 cpm, anti CD3; 15000 ⁇ 200 cpm).
  • control; 600 ⁇ 60 cpm, anti CD3; 15000 ⁇ 200 cpm At a dose of 1 ng / ml of HARP and in the absence of anti CD3, an amplification of 5.8 times is observed for this donor compared to the control (control; 600 ⁇ 60 cpm, HARP; 3500 ⁇ 200 cpm).
  • PBMCs cells cultivated under the conditions described in ⁇ 1 are stimulated by tetanus toxin (1800 IU / ml, Mérieux) alone or in combination with the HARP protein used at a concentration ranging from 0.1 to 100 ng / ml.
  • the tetanus toxin will specifically amplify a subpopulation of memory T lymphocytes.
  • Example 3 Determination of the amplified cell population after treatment with HARP in a culture of PBMCs.
  • the cells were isolated from the peripheral blood of normal subjects, blood donors, taken from Vacutainer tube containing EDTA.
  • the mononuclear cells were separated by ficoll gradient, counted and adjusted to 10 6 cells per ml.
  • the cells are incubated for 5 days at 37 ° C. in a humid atmosphere with 5% CO 2 in the presence of HARP or other peptides at concentrations which are mentioned in each of the examples described.
  • Table II presents the effects of the HARP molecule tested at a concentration of 1 ⁇ g / ml on the proliferation of lymphoid cells.
  • Example 4 Action of the HARP molecule on mononuclear cells from peripheral blood from individuals infected with HIV.
  • T lymphocytes and monocytes Activation of T lymphocytes and monocytes by cytokines induces production and / or activation of nuclear factors of the host cell capable of reactivating viral transcription.
  • This viral reactivation induced by IL1 and TNF ⁇ partly depends on the activation of factor NF- ⁇ b.
  • the secretion by circulating monocytes of cytokines IL1, IL6 and in particular TNF ⁇ which are capable of inducing or increasing the replication of HIV in T lymphocytes / monocytes suggests that these cytokines may increase the progression of the disease.
  • CD4 ⁇ 200 / mm 3 activated only by the HARP protein, are capable of producing the HIV virus measured by the production of the viral antigen p24. This production is maximum for a HARP concentration of 1 ng / ml. At a concentration of 100 ng / ml, significant cell death is observed.
  • HARP can make it possible to amplify in expression the expression of P24 and be used for typing of the HIV viral strains, and on the other hand in vivo as 1) inducer of the replication of the virus, thus facilitating the action of antiviral agents on quiescent infected lymphocytes or 2) at large doses (corresponding to the effects observed in in vitro at 100 ng / ml, induce the death of chronically activated T cells (see the previous examples illustrated in FIGS. 3 and 4)
  • Example 5 Activation of lymphocytes by HARP peptides.
  • Peptide 1 NH 2 -AEAGKKEKPEKKVKKSDCGEW-COOH; 21 amino acids.
  • Peptide 2 NH 2 -AESKKKKKEGKKQEKMLD-COOH; 18 amino acids.
  • Example 6 Induction of the expression of TNF ⁇ , IL6 and IL1 by PBMCs cells treated with HARP.
  • the cells were isolated from the peripheral blood of normal subjects, blood donors, taken from a Vacutainer tube containing EDTA. The mononuclear cells were separated by ficoll gradient, counted and adjusted to 10 6 cells per ml. The cells are incubated for 3 or 7 days at 37 ° C. in a humid atmosphere with 5% of CO 2 in the presence of a variable HARP concentration ranging from 1 to 1000 ng / ml or of various peptides which are mentioned in the legends of the figures.
  • FIGS. 7, 8 and 9 The results are represented in FIGS. 7, 8 and 9. The analysis of these results indicates to us that the HARP molecule is capable of inducing in a dose-dependent manner the expression of the cytokines ILl ⁇ (FIG. 7), TNF ⁇ ( fig. 8) and IL6 (fig. 9).
  • peptides 1 and 2 are capable of stimulating the expression of IL6.
  • An increase in the expression of these cytokines is also detected after adding tat peptides or other molecules (angiogenin, tat protein; result not shown) having a homologous protein domain to the cells. No expression of these inflammatory cytokines is detected in this system when the HARP molecule is denatured or when the cells are treated with LPS.
  • Example 7 Effect of HARP peptides in muscle regeneration.
  • FIG. 11 The results are presented in FIG. 11. The analysis of these sections indicates that the muscle treated with 1 ⁇ g of peptide 1 has a much greater number of mononuclear cells (FIG. 11.2) than the muscles treated with peptide 2 (FIG. 11.3) or injected only with 50 ⁇ l of PBS (fig. 11.1). This observation indicates that the injection of peptide 1 into a crushed muscle, induces after 4 days of treatment an increase in the number of mononucleated cells present in the endomysial tubes promoting tissue regeneration.
  • Example 8 Effect of HARP peptides on angiogenesis.
  • the "Chicken allantoic membrane test” (CAM test) was used in this study to evaluate in vivo the effect of the peptides HARP 1 and 2 on the induction of angiogenesis.
  • the structure of these peptides is presented in Example 5. The experimental procedure is as follows:
  • FIG. 12 The effect of peptide 1 on the induction of angiogenesis in CAM is illustrated in the following example (FIG. 12).
  • Example 9 Expression and assay of the mitogenic activity of the peptide corresponding to the N-terminal part of the HARP molecule (residue 1 to 14).
  • N terminal peptide (amino acids 1-14) of human HARP is obtained by recombination in a eukaryotic expression system.
  • This peptide is produced from the cDNA of human HARP under the EcoRI clone in the eukaryotic expression vector PcDNA-3 (InVitroGen) by creation of a stop codon at amino acid number 15 (site-specific mutagenesis kit, QuickChange, Stratagene US).
  • eukaryotic cells are transfected with this construct (FInstitute, Roche, NJ USA). The expression is followed by Western blotting from the culture media conditioned by the cells transfected using the anti N terminal antibody to HARP (residues 1-15, marketed by Santa Cruz, Ca, USA). The cells are cultured for 72 h in the presence of butyrate then the conditioned medium is recovered. After purification of the peptide involving cation chromatography and a reverse phase (Waters, Symmetry®, C18, 5 ⁇ m, 4.6 x 250 mm). Elution from the column is carried out by a linear gradient of acetonitrile. The presence of peptide in the eluted fractions is monitored by measuring the optical density at 220 nm. The assay of the mitogenic activity induced by the peptide thus purified is carried out according to the following protocol:
  • the cells used are HUVEC cells (Clonetics) used between passages 1 to 5.
  • Each of the wells of a 48-well culture dish (Costar) are incubated overnight at 4 ° C. with a solution of HARP (100 ng / ml), purified HARP peptide (100 ng / ml) or only buffer in negative control.
  • HARP 100 ng / ml
  • purified HARP peptide 100 ng / ml
  • the cells are seeded at the rate of 2 ⁇ 10 4 cells per cm 2 in DMEM culture medium containing 2% of fetal vow serum.
  • Each assay is carried out in triplicate.
  • the induction of cell proliferation is estimated by counting the cells after 72 hours of culture.
  • HBNF and MK members of a novel gene fa ily of heparin-binding proteins with potential roles in embryogenesis and brain function. Prog. Growth Factor Res. 3: 143.
  • Pleiotrophin is an abundant protein in dissociative extracts of bovine fetal epiphyseal cartilage and nasal cartilage from newborns. J. Orthop. Res. 11: 479.
  • HB-GAM heparin-binding growth-associated molecule
  • Peng HB Ali AA, Dai Z, Daggett DF, Raulo E and Rauvala H. 1995.
  • Mitsiadis TA Salmivirta M, Muramatsu T, Muramatsu H, Rauvala H, Lehtonen E, Jalkanen M and Thesleff I. 1995.
  • heparin-binding cytokines midkine (MK) and HB-GAM (pleiotrophin) is associated with epitheliai-mesenchymal interactions during fetal development and organogenesis. Development 121: 37.
  • Midkine induces tumor cell proliferation and binds to a hight affinity signaling receptor associated with JAK tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 273: 3654

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Abstract

La présente invention se rapporte à un peptide répondant à la formule (I): (A)n - A1A1 - A2 - A1 - A3 - A4 - A1 - (A)m dans laquelle : A est un acide aminé quelconque, n et m sont chacun des nombres entiers de 0 à 20 dont la somme n + m est comprise entre 0 et 20, de préférence entre 0 et 15 et tout préférentiellement entre 0 et 10, A1 est un acide aminé basique et plus particulièrement la lysine (Lys) ou l'arginine (Arg), A2 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly), l'acide aspartique (Asp), A3 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, la proline (Pro), l'acide glutamique (Glu), la glutamine (Gln), A4 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly), la sérine (Ser), la valine (Val).

Description

PEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE STIMULATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ET DE RÉGÉNÉRATION TISSULAIRE.
La présente invention concerne une nouvelle famille de molécules peptidiques ayant la capacité notamment de stimuler l'expression des cytokines de 1 ' inflammation et de favoriser la régénération des tissus. L'invention se rapporte donc également aux compositions pharmaceutiques contenant au moins un des peptides.
On connaît dans l'art antérieur de nombreux facteurs de croissance angiogéniques comme les facteurs HARP, MK, FGF-1, FGF-2 , VEGF, HIVl-tat, HIV2-tat, HGF, HB-EGF ou encore 1 ' angiogenine . Parmi ceux-ci, HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) , aussi appelé PTN (Pleiotrophin) ou encore HB-GAM (heparin binding-growth associated molécule) , constitue avec MK (Midkine) une famille de ces facteurs de croissance/différenciation structurellement apparentés qui se lient à l'héparine, et présentent 50% d'homologie en acides aminés (1, 2) .
Le facteur de croissance HARP est un polypeptide de 168 acides aminés contenant un motif N- terminal hydrophobe de 32 acides aminés correspondant à un peptide signal. Sous sa forme mature, HARP est une protéine sécrétée de 136 acides aminés, dans sa forme courte, ou 139 acides aminés, dans sa forme longue, dont le poids moléculaire apparent, déterminé en SDS-PAGE en conditions réductrices, est de 18 kDa.
Initialement HARP a été isolé à partir de cerveaux de nouveaux nés de rat comme une molécule induisant in vitro une croissance neuritique (3) suggérant que ce polypeptide est impliqué dans la maturation des cellules neuronales (4) . Plus tard, des études ont montré que ce polypeptide était aussi présent dans des tissus non-neuronaux, dont le cœur (5) , l'utérus (6), les cartilages (7), et les extraits d'os (8), démontrant que la fonction de HARP n'est pas limitée à une activité promotrice d'une croissance neuritique comme précédemment rapporté (3).
HARP est capable de stimuler la croissance de cellules fibroblastiques, épithéliales et endotheliales in vitro (6, 9) . Cette activité mitogène a été depuis confirmée par l'utilisation de protéines recombinantes produites à partir de systèmes d'expression eucaryote (9, 12). HARP induit également in vitro la formation de pseudo-capillaires (12) . In vivo, dans différents modèles tissulaires, la localisation de HARP est notamment associée aux cellules endotheliales des capillaires sanguins (16). A l'heure actuelle, les données concernant HARP suggèrent que ce polypeptide joue un rôle dans les mécanismes complexes impliqués dans 1 'angiogénèse et la néoangiogénèse tumorale. De nombreuses recherches ont été effectuées dans cette voie afin de déterminer l'implication de HARP dans la progression tumorale, notamment dans les tumeurs hormono-dépendantes comme le sein ou la prostate.
Des études relatives aux propriétés biologiques de HARP ont été effectuées par de nombreux laboratoires (2) et en dépit de résultats controversés, il apparaît admis que HARP, tout comme MK, est impliqué dans le contrôle de la prolifération cellulaire (2, 9- 11) . De plus, il a été démontré que les protéines recombinantes purifiées humaines de HARP sont mitogéniques pour les cellules endotheliales (9,12), et exercent in vi tro une activité angiogénique (12) . De nombreuses études ont montré 1 ' implication de HARP et MK dans des procédés de développement (10, 13, 14). Des études de distribution de l'ARNm de la protéine HARP pendant le développement embryonnaire et postnatal suggèrent des fonctions importantes dans la croissance cellulaire et la différenciation (15) . Toutefois, les fonctions physiologiques in vivo de ces molécules ne sont que très peu connues. La présence de transcripts de HARP dans les tissus adultes incluant les méninges, l'iris, les testicules et l'utérus indiquent aussi un rôle physiologique durant 1 ' âge adulte .
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont porté sur de nombreux facteurs de croissance angiogéniques , comme FGF-1, FGF- 2, VEGF, HIVl-tat, HIV2-tat, HB-EGF, Angiogenin, HARP et MK, et ont permis aux inventeurs d'identifier des séquences peptidiques qui se retrouvent dans plusieurs de ces facteurs. A partir de celles-ci, les inventeurs ont construit des molécules peptidiques riches en acide aminés basiques lysine (K) et arginine (R) .
Le tableau I ci-dessous rapporte des portions de séquences riches en acides aminés basiques de plusieurs facteurs de croissance où les positions des acides aminés basiques sont sensiblement alignées.
Tableau I
Figure imgf000004_0001
FGF-1 (115-140! KKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGQK
L'invention a donc pour objet un peptide répondant à la formule (I) suivante :
(A)n - Al - Al - A2 - Al - A3 - A4 - Al - (A)B Dans laquelle :
. A est un acide aminé quelconque, . n et m sont chacun des nombres entier de 0 à 20 dont la somme n + m est comprise entre 0 et 20, de préférence entre 0 et 15 et tout préferentiellement entre 0 et 10,
. Al est un acide aminé basique et plus particulièrement la lysine (Lys) ou 1 ' arginine (Arg),
. A2 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly), l'acide aspartique (Asp),
. A3 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, la proline (Pro), l'acide glutamique (Glu) , la glutamine (Gin) ,
. A4 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly) , la serine (Ser) , la valine (Val) .
Les peptides de formule (I) selon l'invention seront aussi désignés "pAHA" pour "peptide angiogénique de HARP" . L'invention envisage plus particulièrement, les peptides de formules suivantes :
(II) (A)n - Lys - Lys - Glu - Lys - Pro - Glu - Lys
(A)m
(III) (A)n - Arg - Lys - Gly - Arg - Arg - Arg - Arg (A)m
(IV) (A)n - Lys - Arg - Lys - Lys - Lys - Gly - Lys
(A)m
(V) (A)n - Lys - Lys - Lys - Lys - Glu - Gly - Lys
(A)m (VI) (A)n - Arg - Lys - Arg - Lys - Lys - Ser - Arg
(A)m
(VII) (A)n - Lys - Lys - Arg - Arg - Gin - Arg - Arg
(A)m (VIII) (A)n - Lys - Lys - Asp - Lys - Val - Lys - Lys
(A)m dans lesquelles A, n et m ont la même signification que dans la formule (I) .
Le peptide de formule (II) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de HARP (1-14) .
Le peptide de formule (III) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de HIV tat (70-92) .
Le peptide de formule (IV) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de HB-EGF (85- 114) .
Le peptide de formule (V) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de HARP (108- 132) . Le peptide de formule (VI) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de VEGF (145- 170) .
Le peptide de formule (VII) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de HIV tat (41-65) .
Le peptide de formule (VIII) a été défini plus particulièrement à partir de la séquence de MK (1- 11) .
Les peptides de 1 ' invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par des techniques d'expression génétique à partir de la séquence polynucleotidique correspondante par des techniques connues de l'homme du métier. Les inventeurs ont mis en évidence que les peptides pAHA présentent des propriétés angiogeniques et cicatrisantes comme HARP et à des doses comparables (ED50# 5-50 ng/ml) . Ils ont en effet observé l'activité remarquable de ces peptides sur 1 ' ischémie vasculaire (angiogénèse) et la régénération musculaire et la cicatrisation. Ils ont aussi montré que les peptides de 1 ' invention sont capables de stimuler 1 ' expression des cytokines de 1 ' inflammation et sont donc utiles pour prévenir ou traiter les maladies liées à 1 ' immunodépression, et tout particulièrement le sida.
L ' invention se rapporte donc également à une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs des peptides précédents, associés dans ladite composition avec un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables .
Compte tenu des propriétés des peptides décrits ci-dessus sur la régénération tissulaire, 1 ' invention concerne tout particulièrement une composition comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et éventuellement un autre composé, utile pour favoriser la régénération et la croissance cellulaire, comme la croissance musculaire, et donc dans la cicatrisation.
Du fait des propriétés des peptides décrits ci-dessus sur 1 ' angiogénèse, l'invention concerne tout particulièrement une composition comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et éventuellement un autre composé, utile pour prévenir ou traiter l'ischémie vasculaire. Comme indiqué précédemment, les travaux de recherche effectués dans le cadre de l'invention, ont permis de mettre en évidence des propriétés inattendues des pAHA sur la prolifération des cellules circulantes du sang, et tout particulièrement des cellules mononucleees du sang périphérique. Une étude détaillée de cette propriété a permis de montrer les propriétés stimulatrices de pAHA sur certaines cytokines, tout particulièrement les cytokines de l'inflammation.
II a en effet été observé la présence d'ARNm de la protéine HARP dans les cellules des vaisseaux sanguins, à la fois des cellules endotheliales et des cellules des muscles lisses, ainsi que dans les glandes mammaires humaines (16) . En outre, il a été rapporté que HARP est un facteur de croissance angiogénique (12) et qu'il est synthétisé et localisé dans les cellules endotheliales vasculaires (16) .
Les inventeurs ont donc évalué 1 ' activité in vi tro de ce facteur de croissance sur des PBMCs (cellules mononucleees humaines du sang périphérique) fraîchement isolées en incubant des PBMCs avec le facteur HARP ou avec un peptide pAHA. Les résultats obtenus montrent que HARP et pAHA sont capables de stimuler 1 ' incorporation de thymidine tritiée dans le noyau des PBMCs. Ces résultats démontrent donc que la molécule HARP ainsi que le peptide pAHA stimulent fortement la prolifération des cellules mononucleees humaines du sang périphérique, et plus particulièrement après une semaine on observe une augmentation de la population des lymphocytes T.
Les différentes expériences menées par les inventeurs ont montré que HARP est actif sur la prolifération des lymphocytes à des concentrations très faibles, de l'ordre de 10 pM. Ce résultat étonnant a conduit les inventeurs à considérer que le facteur HARP doit se fixer à son récepteur sur les PBMCs avec une forte affinité.
Après incubation des PBMCs avec le facteur HARP, aucune augmentation du taux d'IL2 n'a été observée. Les inventeurs ont donc conclu que HARP n'agit pas sur la production des interleukines IL2 , mais que HARP, et pAHA, se fixent avec une forte affinité à un récepteur spécifique présent sur les lymphocytes, et induisent 1 ' activation des sites des interleukines, tout particulièrement des sites de IL2. A ce jour, les récepteurs de HARP sont très peu connus. La présence de site de liaison de forte affinité (Kd = 600pM) avec HARP dans les cellules NIH 3T3 a déjà été rapporté (20) . Ces sites de liaison de HARP ont aussi été retrouvés dans plusieurs types cellulaires, incluant les cellules de rein de rats, cellules de 1 ' adénocarcinome mammaire d'homme, cellules du carcinome épidermique d'homme, cellules de 1 'hépatocarcinome humain, neuroblastes de souris, et cellules du phéochromocytome . II est communément admis qu'aucune réponse biologique transmise par HARP n'a été observée sur ce type de cellules, et par conséquent que ces sites de fixation ne peuvent pas être considérés comme des récepteurs fonctionnels . Des études parallèles décrivent les interactions entre HARP et les protéoglycane sulfate heparan, comme syndecan-1 et syndecan-3. Il a été montré que Syndecan-3 interagit avec HARP avec un Kd apparent de 800pM. Ce protéoglycane sulfate heparan est impliqué dans l'activité d'excroissance neuritique de HARP puisque les anticorps anti-syndecan-3 peuvent bloquer cette activité (21) .
Plus récemment, un rapport de Maeda et al. décrit la fixation de HARP avec des sites de fixation de faible (Kd=3nM) et de forte (Kd=250pM) affinité au phospacan, un variant extracellulaire d'un récepteur similaire une protéine tyrosine phosphatase β, RPTP β
(22) .
De façon intéressante, bien que MK (Midkine) et HARP appartiennent à la même famille de molécules, et que les deux induisent une excroissance neuritique (17, 23), aucune induction d'incorporation de thymidine tritiée chez les PBMCs n'a été détectée en utilisant MK, suggérant que MK et HARP se fixent sur des récepteurs de surface différents, ce qui a d'ailleurs été récemment ' démontré (24, 25) . De plus, les deux molécules sont exprimées et isolées en utilisant des méthodes expérimentales analogues, incluant le même système recombinant d'expression et les mêmes techniques de purification. Le fait que l'incorporation de thymidine tritiée s'observe uniquement avec HARP, et non avec MK exclut la présence d'un contaminant bactérien présentant une activité mitogène vis à vis des PBMCs.
Selon les donneurs de PBMCs, des indices différents de stimulation ont été observés. L'effet mitogenique induit par HARP le plus signifiant est mieux observé en utilisant des cellules quiescentes, sans activation des PBMCs par des lectines, comme PHA préconisé pour 1 ' activité mitogenique induite par IL2. Ce résultat confirme bien le fait que HARP n'induit pas - une stimulation de la production d'IL2.
Les résultats obtenus montrent donc que le peptide pAHA agit sur la prolifération de cellules immunitaires, et plus spécifiquement sur les lymphocytes T. En conséquence, l'invention se rapporte plus particulièrement à une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et éventuellement un autre composé, utile pour stimuler la prolifération des cellules mononucleees du sang, et tout particulièrement des lymphocytes T. La stimulation de la prolifération des cellules lymphocytaires T est tout particulièrement utile dans le traitement des malades immuno-supprimés .
Une autre observation a été faite sur des cellules provenant de sang de patients atteints de sida. Dans l'exemple 4 ci-après, les inventeurs montrent comment la stimulation des cellules du sang du malade par les peptides de l'invention permet d'amplifier in vitro la réplication du virus HIV et ainsi de favoriser sa détection et donc son typage. Des compositions comprenant des peptides de 1 ' invention sont donc aussi utiles pour le diagnostic d'une infection par les virus HIV.
En matière de traitement d'une infection par les virus HIV, l'efficacité des agents anti-viraux sera renforcée en les administrant préalablement ou simultanément avec un ou plusieurs peptides de l'invention. En effet, les peptides de l'invention vont favoriser la réplication et la libération des virus HIV in vivo, notamment des virus HIV résiduels, qui restent présents dans 1 ' organisme après un traitement antiviral . L'administration des peptides selon l'invention, en activant ces virus, les rendrait ainsi plus accessibles aux agents antiviraux, et plus aisément destructibles . II est par ailleurs connu que, outre IL2 , les cytokines de manière générale jouent un rôle sur la prolifération cellulaire, plus particulièrement des cellules du sang. Les inventeurs ont donc cherché à mettre en évidence le rôle de HARP et de pAHA sur l'expression des cytokines. Il a ainsi été mis en évidence des propriétés inductrices de l'expression des cytokines de l'inflammation. Par cytokines de l'inflammation il faut entendre préferentiellement TNFalpha, ILl, IL6, et INFgamma. Les inventeurs ont donc testé l'induction de l'expression de trois cytokines de l'inflammation
(TNFalpha, ILl et IL6) par les cellules PBMCs traitées par HARP, et l'induction de l'expression d'IL6 par deux peptides pAHA conformes à la présente invention dont les séquences sont rapportées dans l'exemple 5 ci-après. Les résultats obtenus avec la molécule HARP indiquent que HARP est capable d'induire d'une façon dose dépendante l'expression des cytokines TNFalpha, ILl et IL6.
Les résultats obtenus avec les deux peptides pAHA montrent qu'ils sont capables de stimuler l'expression d'ILδ. Une augmentation de l'expression de ces cytokines est également détectée après adjonction aux cellules d'autres peptides conformes à la présente invention, issus de 1 ' angiogenine et de la protéine tat (voir tableau I) . Aucune expression de ces cytokines inflammatoires n'est détectée lorsque la molécule HARP est dénaturée.
Ces résultats montrent que HARP et pAHA ont in vi tro et in vivo la capacité de stimuler plus de 100 fois la production de cytokines de l'inflammation. En conséquence, l'invention se rapporte tout particulièrement à une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et éventuellement un autre composé, utile pour stimuler la production des cytokines de l'inflammation. Une telle composition selon 1 ' invention est donc particulièrement indiquée dans la prévention ou le traitement des maladies liées à 1 ' immunodépression.
Ces travaux ont montré que les tissus traités par HARP ou pAHA présentent un nombre de cellules mononucleees très important favorisant ainsi la régénération musculaire. Ces résultats combinés à ceux décrits précédemment concernant 1 ' effet des peptides pAHA sur la régénération cellulaire et tissulaire, démontrent l'effet de HARP et de pAHA sur le régénération tissulaire, et plus particulièrement des tissus musculaires.
Ces résultats permettent en outre d'utiliser les peptides de 1 ' invention ou une composition les contenant pour favoriser la croissance et la différentiation de cellules en culture, notamment de cellules lymphoïdes, comme des cellules endotheliales et des lymphocytes T. En effet, la culture de ces cellules est souvent pratiquée dans le cadre de tests de diagnostic.
Comme indiqué précédemment les peptides de l'invention peuvent être produit par expression génétique d'une séquence polynucleotidique codant lesdits peptides. L'invention a donc aussi pour objet une molécule d'acide nucléique constituée par ou comprenant au moins une séquence polynucleotidique codant pour un peptide défini précédemment. De telles molécules d'acide nucléique sont plus particulièrement des vecteurs, comme des plasmides qui peuvent être utilisés pour transformer des cellules hôtes in vi tro ou in vivo . On entend par cellules hôtes par exemples des bactéries permettant la production des peptides de l'invention. On entend aussi des cellules de mammifère tout particulièrement humaine, utiles pour des méthodes de thérapies cellulaires ou géniques des pathologies décrites précédemment pour lesquelles les peptides de l'invention sont utiles. L'invention a donc encore pour objet des compositions comprenant comme principe actif au moins une molécule d'acide nucléique ou des cellules définies ci-dessus.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront dans la description qui suit concernant des exemples se référant aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 montre la stimulation de 1 ' incorporation de thymidine tritiée dans les PBMCs stimulées ou non par HARP. Barre blanche; cellules non stimulées ; barre hachurée : cellules stimulées par 100 ng/ml d'HARP.
La figure 2 représente 1 ' effet dose réponse de HARP testé sur les PBMCs. A) Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de différentes concentrations allant de 0,1 à 100 ng/ml d'HARP (•-•) ou de Midkine (MK) (O-O) . Chacune des valeurs représente la moyenne des cpm obtenus ± la déviation standard. B) Les cellules sont incubées avec la toxine tétanique (TT) à 1800 UT/ml, la phytohémagglutinine (PHA) à 2,5 μg/ml, 1 ' interleukine-2 (IL2) à 50 Ul/ml, ou non traitées (NT) comme contrôles internes de stimulation.
La figure 3 représente 1 ' effet dose réponse de HARP sur des PBMCs traitées par un anti CD3. Les cellules sont cultivées comme il a été décrit précédemment. Il est à noter que si l'on traite les cellules avec 100 ng/ml de HARP en présence de CD3 une forte mortalité cellulaire est alors observée. Barre noire; HARP seul, barre blanche; HARP + anti CD3.
La figure 4 représente 1 ' effet dose réponse de HARP sur des PBMCs traités par la toxine tétanique.
Les cellules sont cultivées comme il a été décrit précédemment. Il est à noter que si l'on traite les cellules avec 100 ng/ml de HARP en présence de toxine tétanique (800 Ul/ml) une forte mortalité cellulaire est alors observée. Barre hachurée : HARP seul; barre blanche : HARP + toxine tétanique.
La figure 5 représente 1 ' effet de la protéine HARP sur la réplication du virus HIV par mesure de 1 ' immuno-réactivité p24. Des PBMCs issues d'un patient infecté par HIV sont incubées suivant le protocole décrit dans le §1 pendant 3 jours avec des concentrations variables de HARP (0,1-100 ng/ml). La réplication virale est estimée par mesure de 1 ' immunoréactivité associée à la protéine p24 présente dans le milieu de culture. (*) faible mortalité cellulaire; (**) forte mortalité cellulaire. La production du virus est évaluée par le test "Abott HIV Ag monoclonal" qui est un dosage immunoenzymatique sur phase solide de type sandwich. Les virus présents dans l'échantillon à tester sont lysés par du Triton X100 puis le lysat est incubé avec des billes en polystyrène recouvertes d'anticorps monoclonal anti-p24. Après incubation, les billes sont lavées, et la présence d' immunoglobulines spécifiques est révélée par incubation avec un deuxième anticorps anti-Ig de souris couplé à la peroxydase. La révélation est faite en rajoutant un substrat de la peroxydase; 1 ' ortho- phénylénediamine
La figure 6 représente 1 ' activation des cellules mononucleees du sang périphérique par les peptides HARP. Les PBMCs sont cultivés pendant 7 jours dans du milieu de culture RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal en 1 ' absence ou en présence de 1 ng/ml de la protéine HARP ou de 1 μg/ml des peptides 1 ou 2. L ' incorporation de thymidine tritiée est déterminée comme décrit précédemment . La figure 7 représente l'étude de l'effet de
HARP sur l'expression d'ILl après 3 jours (barres blanches) ou 7 jours de culture (barres noires) . Le dosage de ces cytokines est réalisé à l'aide d'un test ELISA commercialisé par R&D. La figure 8 représente l'effet de HARP sur l'expression de TNFα après 3 jours (barres blanches) ou
7 jours de culture (barres noires) . Le dosage de ces cytokines est réalisé à l'aide d'un test ELISA commercialisé par R&D. La figure 9 représente 1 ' effet de HARP sur l'expression d'IL6 après 3 jours (barres blanches) ou 7 jours de culture (barres noires) . Le dosage de ces cytokines est réalisé à l'aide d'un test ELISA commercialisé par R&D.
La figure 10 représente l'expression de IL6 par les peptide 1 et 2 correspondant aux parties NH2 et
COOH du polypeptide HARP. Le dosage de ces cytokines est réalisé à l'aide d'un test ELISA commercialisé par R&D après 7 jours d'incubation.
La figure 11 représente 1 ' effet des peptides HARP sur la régénération musculaire. Le muscle soléaire de rat adulte est écrasé, traité ou non par les peptides puis prélevé après 4 jours de régénération : 1 : traité par du PBS (50 μl)
2 : traité par le peptide 1 (50 μl, 1 μg)
3 : traité par le peptide 2 (50 μl, 1 μg)
La figure 12 illustre 1 ' effet angiogénique du peptide 1 testé dans la CAM. A : traitement avec le peptide 1
B : témoin traité avec du PBS
La figure 13 est une représentation schématique du plasmide utilisé pour produire le peptide correspondant à la partie N terminale (résidus 1 à 14) de HARP.
Exemple 1 : Effet de la protéine HARP sur la prolifération des cellules mononucleees humaines issues de sanσ périphéricrue .
Les cellules mononucleees humaines provenant de différents donneurs sains, sont isolées à partir du sang périphérique après centrifugation sur coussin de
Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech) comme il est décrit par le fabriquant. Les cellules sont lavées, puis cultivées dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (56°C, 30 min) , 100 unités/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Les cellules, ensemencées à 106 cellules par ml dans une boîte de culture à 96 puits à fond rond (Costar) , sont cultivées pendant 7 jours en présence ou non de la protéine HARP recombinante humaine produite chez Coli, à la concentration de 100 ng/ml. Dans les dernières 18 heures de culture, 1 μCi de thymidine tritiée est ajouté dans chacun des puits. La radioactivité incorporée dans les noyaux des cellules est ensuite mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 1. L ' analyse de ces résultats nous indique que le polypeptide HARP est capable de stimuler 1 ' incorporation de thymidine tritiée dans le noyau des PBMCs. Suivant les donneurs, il est à noter que l'index de stimulation, défini comme le rapport de la radioactivité incorporée dans les cellules traitées par HARP sur celui des cellules témoins, non traités par HARP, varie de 2,3 à 51,7 fois (cf résultats de l'expérience N°4 et N°7) . Cette diversité de réponse peut suggérer qu'il existe une relation entre la réponse des cellules à HARP et l'état d'activation du système immunitaire de l'individu testé. L'histogramme présenté en insert dans la figure 1 montre que le traitement par 100 ng/ml de HARP induit un accroissement du nombre de cellules de 2,9 fois par rapport au témoin non traité, démontrant que l'incorporation de thymidine observée est bien proportionnelle au nombre de cellules. Ce comptage cellulaire a été effectué avec les cellules utilisées pour 1 ' incorporation de thymidine tritiée de l'expérience N° 7. La courbe dose réponse de la protéine HARP (0,1 à 500 ng/ml) testée sur les PBMCs est présentée sur la figure 2A.
L'analyse de cette courbe nous indique qu'un ' effet maximal est obtenu pour une concentration de HARP de 1 ng/ml de milieu de culture induisant une stimulation de l'incorporation de DNA de 4,5 à 7,5 fois par rapport à une culture témoin réalisée sans adjonction de HARP. Il est à noter que l'on peut observer une décroissance de la radioactivité incorporée pour des doses plus élevées de HARP allant de 1 à 500 ng/ml. Aucune stimulation n'est observée en utilisant la protéine Midkine (MK) , protéine présentant 50% d'homologie en acides aminés avec HARP, testée dans une gamme de concentration allant de 0,1 à 500 ng/ml. Les contrôles positifs de stimulation ont été réalisés en utilisant de la phytohemagglutinine (PHA) 2,5 μg/ml et la toxine tétanique (TT) 1800 Ul/ml (fig. 2B) . Aucune stimulation n'est observée après addition d'IL2 montrant • une absence d'activation des cellules utilisées pour ces tests .
Exemple 2 : Rôle de la protéine HARP comme co-stimulateur de la réponse immunitaire spécificrue.
L'activation des lymphocytes T peut être obtenue via 1 ' activateur du récepteur à l'antigène (TCR) associé au système majeur d'histocompatibilité (CMH) . Cette activation nécessite outre la reconnaissance spécifique TCR-CMH/antigène, l'action de molécules d'adhésion jouant un rôle de coactivation et d'amplification de la réponse. Suivant ces données, nous avons étudié si HARP pouvait amplifier la prolifération cellulaire soit par stimulation du récepteur aux lymphocytes T à l'aide d'un anti CD3 ou par un antigène mémoire, la toxine tétanique.
a) Effet de la protéine HARP sur la stimulation induite par le récepteur des lymphocytes T.
L'activation du récepteur des lymphocytes T est obtenue en traitant des lymphocytes par un anticorps monoclonal anti CD3 (1/100, I munotech) . L'effet de HARP sur la prolifération cellulaire des PBMCs, est testé en ajoutant une concentration optimale de HARP (1 ng/ml, cf exemple 1) en présence ou non d'anti CD3. Les cultures ainsi que la quantification de la thymidine tritiée incorporée sont réalisées comme il est décrit dans l'exemple 1. Les résultats obtenus, sont présentés dans la fig. 3.
En absence de HARP, l'anticorps anti CD3 (1/100) stimule, après 7 jours d'incubation avec les cellules, l'incorporation de thymidine tritié de 25 fois (témoin; 600 ± 60 cpm, anti CD3 ; 15000 ± 200 cpm). A la dose de 1 ng/ml de HARP et en absence d'anti CD3 on observe pour ce donneur une .amplification de 5,8 fois par rapport au témoin (témoin; 600 ± 60 cpm, HARP; 3500 ± 200 cpm) . A cette même dose de HARP, une amplification de 33 fois dans la réponse est observée lorsque l'on réalise une costimulation des cellules par HARP/anti CD3 (témoin; 600 ± 60 cpm, HARP/anti CD3 ; 20000 ± 200 cpm) .
Ce résultat nous indique que la protéine HARP exerce une activité de costimulation additive des lymphocytes dont le TCR est activé. A des concentrations plus élevées de HARP (10 et 100 ng/ml) et en présence d'anti CD3 , une incorporation de thymidine plus faible et très faible est observée.
Nous avons observé dans ces cultures une forte mortalité cellulaire qui n'est pas observée quand HARP est utilisé seul à ces mêmes doses. Ces résultats montrent que HARP a un effet costimulateur dose dépendant de la réponse immunitaire associée aux lymphocytes T.
b) Effet de la protéine HARP sur la stimulation induite par un antigène mémoire.
Des cellules PBMCs cultivées dans les conditions décrites dans le §1, sont stimulées par la toxine tétanique (1800 Ul/ml, Mérieux) seule ou en association avec la protéine HARP utilisée à une concentration allant de 0,1 à 100 ng/ml. La toxine tétanique va spécifiquement amplifier une sous population de lymphocytes T mémoires .
L'adjonction de la toxine tétanique à des PBMCs, stimule, après 7 jours d'incubation, l'incorporation de thymidine tritiée de 71 fois (témoin;
600 ± 60 cpm, toxine tétanique; 43000 ± 500 cpm) alors qu'une stimulation de 5,8 fois par rapport au témoin non stimulé est observée lorsque les cellules sont incubées avec HARP à 1 ng/ml (témoin; 600 ± 60 cpm, HARP; 3500 ±
200 cpm). Une stimulation de l'incorporation de thymidine tritiée de 108 fois par rapport au témoin est observée lorsque les cellules sont costimulees par HARP à la dose de 1 ng/ml et la toxine tétanique (témoin; 600± 60 cpm, HARP/toxine tétanique; 65000+ 700 cpm) . Les résultats présentés sur la figure 2 nous montrent une synergie d'action sur la stimulation des PBMCs entre un antigène mémoire et HARP.
Exemple 3 : Détermination de la population cellulaire amplifiée après traitement par HARP dans une culture de PBMCs.
Les cellules ont été isolées du sang périphérique de sujets normaux, donneurs de sang, prélevé sur tube Vacutainer contenant de l'EDTA. Les cellules mononucleees ont été séparées par gradient de ficoll, comptées et ajustées à 106 cellules par ml. Les cellules sont incubées pendant 5 jours à 37°C en atmosphère humide avec 5% de C02 en présence de HARP ou d'autres peptides à des concentrations qui sont mentionnées dans chacun des exemples décrits .
Le tableau II présente les effets de la molécule HARP testée à une concentration de 1 μg/ml sur la prolifération de cellules lymphoïdes .
Tableau II
Figure imgf000021_0001
L ' analyse des résultats présentés dans ce test nous indique qu'après traitement d'une culture de PBMCs par HARP, on retrouve un fort enrichissement soit 45% de la population lymphocytaire CD4+ . Une forte augmentation CD45RO est également observée (+113%) correspondant à une augmentation des CD4 à mémoire CD4+/CD45RO+ (+133%) . Ces résultats nous indiquent que l'on observe une amplification de lymphocytes CD4+ exprimant le CD45RO caractéristique des lymphocytes T mémoire. Cet exemple illustre le rôle adjuvant de HARP dans la réponse immunitaire notamment par amplification et coactivation de la sous population lymphocytaire CD45RO-
Exemple 4 : Action de la molécule HARP sur des cellules mononucleees issues du sang périphéricrue provenant d'individus infectés par le VIH.
L'activation des lymphocytes T et des monocytes par les cytokines induit une production et/ou une activation des facteurs nucléaires de la cellule hôte capables de réactiver la transcription virale. Cette réactivation virale induite par ILl et le TNFα dépend en partie de l'activation du facteur NF-κb. Au cours de l'infection par le VIH, la sécrétion par les monocytes circulants de cytokines ILl, IL6 et en particulier TNFα qui sont capables d'induire ou d'augmenter la réplication du VIH dans les lymphocytes T/monocytes suggère que ces cytokines peuvent augmenter la progression de la maladie. Les résultats de la figure
5, indiquent que les PBMCs provenant d'un malade sidéen
(CD4 < 200/mm3) activés uniquement par la protéine HARP, sont capables de produire du virus VIH mesuré par la production de l'antigène viral p24. Cette production est maximale pour une concentration de HARP de 1 ng/ml . Pour une concentration de 100 ng/ml on observe une mort cellulaire importante. On peut donc par cet exemple, proposer d'une part que HARP peut permettre d'amplifier in vi tro l'expression de la P24 et être utilisée pour le typage des souches virales HIV, et d'autre part in vivo comme 1) inducteur de la réplication du virus, facilitant ainsi l'action d'agents antiviraux sur des lymphocytes infectés quiescents ou 2) à des doses importantes (correspondantes aux effets observés in vitro à 100 ng/ml, induire la mort des cellules T chroniquement activées (voir les exemples précédents illustrés par les fig. 3 et 4)
Exemple 5 : Activation des lymphocytes par des peptides HARP.
Suivant le protocole décrit à l'exemple 1, les inventeurs ont testé la capacité de deux peptides dont les séquences correspondent à la partie NH2 terminale et COOH terminale de HARP à induire une multiplication cellulaire de PBMCs . Les séquences de ces peptides sont les suivantes :
Peptide 1 : NH2-AEAGKKEKPEKKVKKSDCGEW-COOH; 21 acides aminés.
Peptide 2 : NH2-AESKKKKKEGKKQEKMLD-COOH; 18 acides aminés .
Les résultats sont présentés dans la figure 6 et montrent que comparativement à la protéine HARP, le peptide 2 est capable d'induire une réponse d'activation des PBMCs meilleure que HARP, près de deux fois supérieure. Pour des concentrations comparables, le peptide 1 a un effet plus faible, près de moitié moins que HARP, mais nettement supérieur au contrôle (plus de deux fois) .
Exemple 6 : Induction de l'expression de TNFα, IL6 et ILl par des cellules PBMCs traitées par HARP. Les cellules ont été isolées du sang périphérique de sujets normaux, donneurs de sang, prélevé sur tube Vacutainer contenant de l'EDTA. Les cellules mononucleees ont été séparées par gradient de ficoll, comptées et ajustées à 106 cellules par ml. Les cellules sont incubées pendant 3 ou 7 jours à 37°C en atmosphère humide avec 5% de C02 en présence de concentration variable HARP allant de 1 à 1000 ng/ml ou de différents peptides qui sont mentionnés dans les légendes des figures.
Les résultats sont représentés sur les figures 7, 8 et 9. L'analyse de ces résultats nous indique que la molécule HARP est capable d'induire d'une façon dose dépendante 1 ' expression des cytokines ILlβ (fig.7), TNFα (fig.8) et IL6 (fig.9).
Cet exemple montre que les peptides 1 et 2 dont la structure est donnée dans 1 ' exemple 5 sont capables de stimuler l'expression d'IL6. Une augmentation de l'expression de ces cytokines est également détectée après adjonction aux cellules des peptides tat ou d'autres molécules (angiogénine, protéine tat; résultat non montré) présentant un domaine proteique homologue . Aucune expression de ces cytokines inflammatoires n'est détectée dans ce système lorsque la molécule HARP est dénaturée ou lorsque les cellules sont traitées avec du LPS.
Exemple 7 Effet des peptides HARP dans la régénération musculaire.
L'effet des peptides 1 et 2, dont la structure est définie dans l'exemple 5, sur la régénération musculaire a été testé suivant le protocole énoncé ci-dessous et suivant la technique décrite dans la publication de Bassaglia et coll (Bassaglia, Y. , and Gautron, J. (1995) ; Fast and slow rat muscle degenerate and regenerate differently after whole crush injury ; J. Muscle Res. Cell Motil. 16, 420-429) . Après une anesthésie du rat (rat Wistar de 2 à 3 mois) , le muscle soléaire est, après dénervation, soumis à un écrasement à l'aide d'une pince à bout plat. L'échantillon à tester est alors injecté sous un volume de 50 μl de PBS. Après quatre jours de traitement, les animaux sont sacrifiés, les muscles sont prélevés puis congelés dans l'azote liquide. Des coupes de 8 μm sont réalisés au cryostat puis colorées en utilisant le trichrome de Masson.
Les résultats sont présentés sur la figure 11. L'analyse de ces coupes indique que le muscle traité par 1 μg de peptide 1 présente un nombre de cellules mononucleees (fig. 11.2) beaucoup plus important que les muscles traités par le peptide 2 (fig. 11.3) ou injecté seulement par 50 μl de PBS (fig. 11.1). Cette observation indique que l'injection du peptide 1 dans un muscle écrasé, induit après 4 jours de traitement une augmentation du nombre de cellules mononucleees présentes dans les tubes endomysiaux favorisant la régénération tissulaire.
Exemple 8 : Effet des peptides HARP sur 1 ' angiogénèse .
Le "Chicken allantoic membrane test" (CAM test) a été utilisé dans cette étude pour évaluer in vivo l'effet des peptides HARP 1 et 2 sur l'induction d'une angiogénèse. La structure de ces peptides est présentée dans 1 ' exemple 5. La procédure expérimentale est la suivante :
Des œufs de poulet fécondés sont incubés à
37°C pendant 3 jours. Après cette période d'incubation, deux orifices sont pratiqués dans la coquille et 3 à 4 ml d'albumine sont aspirés à la seringue. Les échantillons à tester sont déposés sur des disques de méthyl cellulose de 3 mm de diamètre. Après séchage, chaque disque est déposé au jour 4 dans l'orifice ainsi pratiqué. Après une période allant de 9 à 13 jours, l'observation est effectuée. Chaque point de dosage est réalisé 10 fois et chaque dosage est répété 3 fois. L ' ensemble des ces résultats est présenté dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau III
Figure imgf000026_0001
L'effet du peptide 1 sur l'induction d'une angiogénèse dans la CAM est illustré dans 1 ' exemple suivant (fig. 12) .
Exemple 9 : Expression et dosage de l'activité mitogène du peptide correspondant à la partie N terminale de la molécule HARP (résidu 1 à 14) .
Le peptide N terminal (acides aminés 1-14) de l'HARP humain est obtenu par recombinaison dans un système d'expression eucaryote.
Ce peptide est réalisé à partir du cDNA de l'HARP humain sous clone EcoRI dans le vecteur d'expression eucaryote PcDNA-3 (InVitroGen) par création d'un codon stop au niveau de l'acide aminé numéro 15 (kit mutagénèse dirigée, QuickChange, Stratagene US) .
Une représentation schématique du plasmide utilisée est donnée à la figure 13 en annexe. 2b
Après vérification de la mutation générée par séquençage, des cellules eucaryotes (NIH 3T3) sont transfectées avec cette construction (Fungene, Roche, NJ USA) . L'expression est suivie par Western blot à partir des milieux de culture conditionnés par les cellules transfectées en utilisant l'anticorps anti N terminale de HARP (résidus 1-15, commercialisé par Santa Cruz, Ca, USA) . Les cellules sont cultivées pendant 72 h en présence de butyrate puis le milieu conditionné est récupéré. Après purification du peptide impliquant une chromatographie cationique et une phase réverse (Waters, Symmetry ®, C18, 5 μm, 4,6 x 250 mm). L'élution de la colonne est réalisée par un gradient linéaire d'acétonitrile. La présence de peptide dans les fractions éluées est suivie par mesure de la densité optique à 220 nm. Le dosage de l'activité mitogène induite par le peptide ainsi purifié est réalisé selon le protocole suivant :
Les cellules utilisées sont des cellules HUVEC (Clonetics) utilisées entre les passages 1 à 5. Chacun des puits d'une boite de culture de 48 puits (Costar) sont incubés pendant 1 nuit à 4°C avec une solution d'HARP (100 ng/ml) , de peptide HARP purifié (100 ng/ml) ou seulement du tampon en contrôle négatif. Après rinçage des puits par une solution de PBS, les cellules sont ensemencées à raison de 2 x 104 cellules par cm2 dans du milieu de culture DMEM contenant 2% de sérum de vœu fœtal. Chaque dosage est réalisé en triplicate. L'induction de la prolifération cellulaire est estimée par comptage des cellules après 72 heures de culture.
Les résultats sont présentés dans le tableau IVci-dessous et indiquent que le peptide HARP correspondant à la partie N terminale de HARP et produit par génie génétique induit la prolifération cellulaire des cellules endotheliales.
Tableau IV
Figure imgf000028_0001
A 8
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Claims

REVENDICATIONS
1) Peptide répondant à la formule (I) : (A)n - Al - Al - A2 - Al - A3 - A4 - Al - (A)m dans laquelle :
. A est un acide aminé quelconque, . n et m sont chacun des nombres entier de 0 à 20 dont la somme n + m est comprise entre 0 et 20, de préférence entre 0 et 15 et tout préferentiellement entre 0 et 10,
. Al est un acide aminé basique et plus particulièrement la lysine (Lys) ou 1 ' arginine (Arg),
. A2 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly), l'acide aspartique (Asp),
. A3 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, la proline (Pro), l'acide glutamique (Glu) , la glutamine (Gin) ,
. A4 est un acide aminé choisi parmi : les acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly) , la serine (Ser) , la valine (Val) .
2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes :
(II) (A)n - Lys - Lys - Glu - Lys - Pro - Glu - Lys
(A)m
(III) (A)n - Arg - Lys - Gly - Arg - Arg - Arg - Arg
(A)m (IV) (A)n - Lys - Arg - Lys - Lys - Lys - Gly - Lys
(A)m
(V) (A)n - Lys - Lys - Lys - Lys - Glu - Gly - Lys
(A)m
(VI) (A)n - Arg - Lys - Arg - Lys - Lys - Ser - Arg (A)m (VII) (A)n - Lys - Lys - Arg - Arg - Gin - Arg - Arg
(A)m
(VIII) (A)n - Lys - Lys - Asp - Lys - Val - Lys - Lys
(A)m dans lesquelles A, n et m ont la même signification que dans la formule (I) .
3) Composition notamment pharmaceutique contenant un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
4) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour favoriser la régénération et la croissance cellulaire, comme la croissance musculaire.
5) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour favoriser la cicatrisation.
6) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour prévenir ou traiter l'ischémie vasculaire.
7) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour stimuler la prolifération des cellules mononucleees du sang, et tout particulièrement des Lymphocytes T.
8) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour stimuler la production des cytokines de l'inflammation.
9) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour la prévention ou le traitement des maladies liées à 1 ' immunodépression.
10) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, utile pour favoriser la réplication et la libération des virus HIV in vivo et permettre ainsi une meilleure accessibilité aux agents antiviraux.
11) Composition caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule acceptable, utile pour favoriser la croissance et la différenciation de cellules en culture, notamment de cellules lymphoïdes comme des lymphocytes T ou des cellules endotheliales .
12) Composition caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 , et éventuellement un autre composé, associés dans ladite composition avec un véhicule acceptable, utile pour amplifier in vi tro la réplication du virus HIV et ainsi favoriser sa détection et son typage .
PCT/FR2000/002786 1999-10-12 2000-10-06 Peptides ayant une activite de stimulation de la reponse immunitaire et de regeneration tissulaire WO2001027136A2 (fr)

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