CZ20003238A3 - Pouľití CD137 pro podporu proliferace periferních monocytů - Google Patents

Pouľití CD137 pro podporu proliferace periferních monocytů Download PDF

Info

Publication number
CZ20003238A3
CZ20003238A3 CZ20003238A CZ20003238A CZ20003238A3 CZ 20003238 A3 CZ20003238 A3 CZ 20003238A3 CZ 20003238 A CZ20003238 A CZ 20003238A CZ 20003238 A CZ20003238 A CZ 20003238A CZ 20003238 A3 CZ20003238 A3 CZ 20003238A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
monocytes
csf
functional
proliferation
monocyte
Prior art date
Application number
CZ20003238A
Other languages
English (en)
Inventor
Herbert Schwarz
Joachim Langstein
Original Assignee
Merckle Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merckle Gmbh filed Critical Merckle Gmbh
Publication of CZ20003238A3 publication Critical patent/CZ20003238A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source

Description

POUŽITÍ CDI37 PRO PODPORU PROLIFERACE PERIFERNÍCH MONOCYTŮ
Oblast techniky
Přítomný vynález se vztahuje k použití monocytárního růstového faktoru CDI37 pro podporu proliferace periferních monocytů a zejména použití CD137 pro léčbu rozličných stavů onemocněni, která jsou léčitelná novým způsobem pomocí účinku CD137, podporujícího proliferaci.
Dosavadní stav techniky
Periferní monocyty v krvi a makrofágy vznikající z nich v tělních dutinách a tkáních jsou součástí mononukleárního fagocytárního systému těla. Zejména jsou monocyty a makrofágy efektorovými buňkami nespecifického imunitního obranného systému těla. Monocyty se vyvíjejí přes řadu přechodných stadií z hematopoetických kmenových buněk v kostní dřeni. Obíhají v krvi po dobu přibližně 20 až 30 hodin. Odtud migrují do různých orgánů a tkáňových systémů a zde se vyvíjejí do místně specifických makrofágů. Zde má okolní tkáň vliv na jejich tvorbu a vytvářejí se u nich další funkce. Diferenciace se proto děje podle typu tkáně, například na makrofágy v plicích (alveolární makrofágy), břišní dutině (peritoneální makrofágy), slezině (splenické makrofágy), játrech (Kupferovy buňky), kloubech, kostech (osteoklasty), pojivové tkáni, mozku a ledvinách.
Monocyty a makrofágy mají ústřední pozici v souvislosti se zánětlivými reakcemi, které se objevují v těle. Ve tkáni, u které neprobíhá zánět, je cílem makrofágů eliminace starých buněk. Navíc vytvářejí velký počet rozpustných faktorů, které jsou důležité pro komunikaci v rámci imunitního systému. Pokud se buňky účastní například zánětlivých procesů, jsou v aktivovaném stavu s významně modifikovanými fenotypovými a funkčními vlastnostmi. V tom
případě vykonávají významné efektorové funkce ovlivňující průběh nemoci. Tyto funkce zahrnují fagocytózu a intracelulární destrukci mikroorganizmů, imunitních komplexů a poškozených buněk, ale rovněž na protilátkách závislé i nezávislé cytotoxické reakce proti nádorovým buňkám, parazitům a buňkám infikovaným viry. Navíc mají monocyty a makrofágy ústřední význam při indukci a regulaci imunitní odpovědi. Jsou totiž navíc velmi aktivní sekretoricky, což ovlivňuje imunitní odpověď díky zvýšenému uvolňování cytokinů.
CD137 je členem rodiny receptorů faktoru nekrózy tumoru a je navíc znám (Kwon, B. S. a kol., Proč. Nati.
Acad. Sci. USA, 86, 1963, 1989; Schwarz H. a kol., Gene 134. 295, 1993; Alderson M. R. a kol., Eur. J. Immunol., 24,
2219, 1994) pod jmény ILA nebo 4-1BB (homology z myší). CD0137 je expresován aktivovanými lymfocyty a monocyty, exprese primárními buňkami závisí na jejich aktivaci (Schwarz H. a kol., Blood, 85, 1043, 1995). CD137 je rychle induktabilní například aktivací T lymfocytů fytohemaglutinem (PHA) nebo forbol-12-myristat-13-acetatem (PMA). V monocytech je CD137 induktabilní aktivací lipopolysacharidem (LPS), IL-Ιβ a PMA. V B lymfocytech je exprese CD137 indukována protilátkami proti imunoglobulinu buněčného povrchu nebo TMA a transformací s EBV (virem
Epstein-Barrové). V nelymfoidních buňkách (jako jsou zejména chondrocyty) je CD137 silně induktabilní prozánětlivým cytokinem IL-Ιβ. Rozpustné formy CD137 jsou vytvářeny alternativním sestřihem a lze je detekovat ve zvýšených koncentracích v séru pacientů s revmatoidní arthritidou (Michel J. a kol., Eur. J. Immunol., 28, 290, 1998). Gen pro lidský CD137 se nachází na chromozomu lp36 v klastru souvisejících genů (Schwarz H. a kol., Biochem. Biophys.
Res. Com., 215, 699, 1997).
Kromě toho je o rekombinantním proteinu CD137 známo, • 9 · 9 9999 999
9999 9 » 9 99
99 999 9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 99
99 99 999« .99 9 že v imobilizované formě způsobuje aktivaci monocytů. Výsledkem této aktivace je zvýšená exprese prozánětlivých cytokinů, inhibice protizánětlivého cytokinu IL-10 a indukce aktivace markérů, jako je ICAM (Langstein J. a kol., J. Immunol., 160. 2488, 1998). Život prodlužující nebo proliferaci podporující účinek na monocyty zde není popsán.
Jak již bylo uvedeno výše, monocyty mají klíčovou úlohu v kontextu imunitní odpovědi a mají zásadní význam pro tvorbu benigní imunitní reakce proti tumorům a patogenům. Přitahovány signály jako například z cytokinů, migrují z krevního oběhu do místa zánětu. Nahromadění monocytů a makrofágů je charakteristickým rysem chronického zánětu.
Toto nahromadění je dále podporováno cytokiny, které se uvolňují v místě zánětu, jako je například makrofágový kolonie stimulující faktor (M-CSF), granulocytový makrofágový kolonie stimulující faktor (GM-CSF) a interleukin 3 (IL-3), které mají příznivý účinek na přežívání monocytů a makrofágů (Young D. A., J. Immunol.,
145, 607, 1990; Xing Z. a kol., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6, 212, 1992; Bratton D. L. a kol., J. Clin. Invest., 95, 211, 1995).
Až dosud se předpokládalo, že periferní monocyty a makrofágy nejsou schopny proliferace, tedy replikace (viz Xing Z. a kol., citováno výše; van Furth R. a kol., Blood 54, 485, 1979).
Z výše uvedených podrobností je zřejmé, že léčba řady onemocnění, jako jsou například tumory, bakteriální, mykotické nebo virové infekce, může být významně zlepšena zvýšenou fagocytózou a intracelulární destrukcí mikroorganismů, imunitních komplexů a poškozených buněk a také zlepšená na protilátkách závislá nebo nezávislá cytotoxická reakce proti nádorovým buňkám, mikroorganismům a infikovaným buňkám může být vytvořena replikací ·· ·* » ♦ · <
» · ·· monocytů/makrofágů.
Navíc je známo, že různé způsoby léčby, jako například chemoterapie nebo ozařovací léčba pacientů s rakovinou a podávání imunosupresiv výrazně snižuje počet monocytů a makrofágů. Po dokončení léčebné procedury tohoto typu je pravidelně potřebné zvýšit počet monocytů/makrofágů zpět na hodnoty v obvyklém rozmezí a v důsledku toho opět stabilizovat pacientův imunitní systém.
I *V ./·
Proto je cílem přítomného vynálezu učinit dostupným t , způsob, který umožní specificky zvýšit počet periferních monocytů a v důsledku toho počet makrofágů, aby se umožnila zlepšená léčba stavů nemocí, které jsou spojeny s nepřiměřeným počtem aktivních monocytů/makrofágů.
Podstata vynálezu
Překvapivě bylo možno tohoto cíle dosáhnout tím, že se začalo zjištěním, že protein CD137 buněčného povrchu, který je znám sám o sobě, a jeho funkční analogy, v protikladu k předchozím předpokladům indukuje proliferací periferních monocytů nezávisle na hernatopoetických kmenových buňkách. Toto zjištění překvapivě otevírá velké množství nových možností léčebných uplatnění pro CD137.
Přehled výkresů na obrázcích
Zvláštní ztělesnění přítomného vynálezu jsou ilustrována podrobněji níže s odkazy na průvodní obrázky. V
- nich;
Obr. 1 (A) ukazuje sekvenci cDNA a sekvenci aminokyselin lidské CD137 z ní odvozené. Signální peptid (pozice +1 až +17) a transmembránová doména (pozice +187 až 213) jsou vždy podtrženy. Místa potenciální glykosylace jsou označena hvězdičkami, místa potenciální fosforylace (pozice +242 pro proteinkinázu C; pozice +234 a +235 pro kaseinkinázu II jsou rovněž označena) signál polyadenylace je zvýrazněn; (B) seřazení sekvencí aminokyselin lidské a myší CD137; identické aminokyseliny jsou ukázány vertikálními čarami; aminokyseliny s vysokou, nízkou nebo žádnou podobností jsou označeny dvojtečkou, tečkou nebo prázdným místem.
Obr. 2 ukazuje indukci monocytární apoptózy pomocí CD137.
Obr. 3 (A) ukazuje indukci proliferace periferních monocytů imobilizovaným CD137-Fc proteinem s pomocí inkorporace 3H-thymidinu; (B) tvorbu kolonií monocytů indukovanou CD137.
Obr. 4 ukazuje účinky M-CSF a GM-CSF na proliferací monocytů indukovanou CD137;
(A) Kultivace periferních monocytů na imobilizovaném Fc nebo CD137-Fc proteinu v nepřítomnosti nebo přítomnosti neutralizujících protilátek proti M-CSF, GM-CSF a/nebo IL-3;
(B) proliferace monocytů není indukována M-CSF a GM-CSF; ve všech případech je ukázáno vychytávání 3H-thymidinu.
Obr. 5 ukazuje indukci (A) růstu a (B) proliferace monocytů upraveným supernatantem buněčných kultur, které byly kultivovány s proteinem CD137-Fc.
Obr. 6 ukazuje srovnání indukce proliferace monocytů rozpustným CD137-Fc (sCD137-Fc) a imobilizovaným CD137-Fc; jako kontrola jsou označeny imobilizovaný Fc, rozpustný Fc (sFc) a neošetřená skupina.
Obr. 7 ukazuje pokus o indukci proliferace monocytů pomocí FC, CD137-FC, TNFR-FC a antí-CD68.
Obr. 8 ukazuje pokus o indukci proliferace monocytů pomocí Fc (světlé sloupce) nebo CD137-Fc (černé sloupce) kombinované s LPS nebo M-CSF.
9
Obr. 9 ukazuje fotografické znázornění periferních monocytů (A) kultivovaných na imobilizovaném Fc nebo CD137-Fc, 400-krát zvětšeno; (B) po 10-ti denní kultivaci na imobilizovaném CD137-Fc, 500-krát zvětšeno.
Obr. 10 ukazuje v levé polovině grafu expresi M-CSF monocyty po 1- až 8-denní kultivaci na imobilizovaném Fc (bílé sloupce) nebo imobilizovaném CD137-Fc (černé sloupce), v pravé polovině grafu expresi M-CSF za přítomnosti rozpustného Fc nebo rozpustného CD137-FC po 8-denní kultivaci.
Obr. 11 ukazuje počet živých monocytů po neutralizaci M-CSF; je označen počet živých monocytů ošetřených Fc (kolečka) nebo CD137-FC (čtverečky) nebo roztokem M-CSF o koncentraci 100 ng/ml (trojúhelníky) bez přidání (bílé) nebo po přidání (černé symboly) neutralizující anti-M-CSF protilátky v koncentraci 2 μg/ml.
Obr. 12 ukazuje monocyty po 8-denní kultivaci ve zvětšení 300 krát za přítomnosti rozpustného nebo imobilizovaného Fc nebo CD137-FC proteinu (vždy v koncentraci 1 μg/ml).
Izolace, sekvenování a charakterizace lidské CD137 byla poprvé posána Schwarzem H. a kol., Gene, 134, 295, (1993). Na tuto práci se zde tímto výslovně odkazuje.
Jak již bylo uvedeno, tento vynález se vztahuje k použití CD137 a jeho funkčních analogů. Funkčními analogy jsou dle významu používaném v rámci přítomného vynálezu zejména varianty, deriváty, rozpustné formy a multimerní formy CD137, které přesto, že se liší od přírodní formy CD137 mají požadovanou biologickou aktivitu podle tohoto vynálezu a proto mohou být využity k účelům zde uvedeným. Zejména musí fukční analogy podle tohoto vynálezu
dále mít schopnost vázat se na cílové buňky, to znamená na periferní monocyty, aby byly schopny tímto způsobem indukovat proliferaci monocytů.
Varianty CD137 zahrnují například proteiny, které lze získat substitucí, vyjmutím, adicí, vložením a/nebo záměnou jedné nebo více aminokyselin s počátkem od sekvence ukázané v obr. IA.
Varianty CD137 podle tohoto vynálezu mají vykazovat přibližně 60 až 100%, například 80 až 100% shodu se sekvencí aminokyselin, kterou ukazuje obr. IA. Modifikace přírodní sekvence aminokyselin lze vytvořit způsobem který je znám sám o sobě, jako je například mutace příslušných nukleotidů v sekvenci nukleotidů. Takto lze například substituovat jednu za druhou: aminokyseliny podobnými alifatickými zbytky, jako je isoleucin, valin, leucin a alanin;
zbytky pomocí stejné polární postranní skupiny, jako je lysin a arginin; jako je glutamin a asparagin, nebo glutamová kyselina a asparagová kyselina.
Funkční analogy navíc zahrnují neglykosylované nebo odlišně glykosylované formy CD137. Způsob glykosylace může být ovlivněn například specifickou volbou expresního systému rekombinantní přípravy CD137. Navíc existuje možnost specifické modifikace sekvence aminokyselin v oblasti míst potenciální N-glykosylace, takže dále ke glykosylaci nedochází.
Funkční analogy navíc zahrnují přirozeně se vyskytující varianty CD137, které lze získat například alternativním sestřihem mRNA nebo proteolytickým štěpením CD137 a zároveň lze odštěpit sekvence aminokyselin N- nebo C-konce. Navíc lze varianty získat specifickým vynětím těchto konců nebo aminokyselin uvnitř řetězce nebo subsekvencí aminokyselin, které nejsou důležité pro • · • · požadované biologické funkce. Cysteinové zbytky lze například specificky vyjmout nebo substituovat, aby se zabránilo tvorbě nesprávných intramolekulárních disulfidových můstků.
Deriváty CD137 mohou obsahovat jeden nebo více chemických zbytků, které jsou spojeny v místech postranních funkčních skupin aminokyselinových zbytků chemickou nebo enzymatickou modifikací.
Deriváty CD137 se získají derivatizací funkčních skupin aminokyselin postranních řetězců nebo na N-konci nebo C-konci proteinu. Například glykosylové skupiny, acylové skupiny, lipidové zbytky, fosfátové skupiny, polymerní zbytky, jako jsou například polyethylenglykolové postranní řetězce mohou být zavedeny způsobem, který je známý sám o sobě.
Speciální formou derivatizace je spojení N- nebo C-konce s jinou sekvencí aminokyselin. Fuzní proteiny tohoto typu lze připravit jak chemicky, tak rekombinací.
Analogy podle tohoto vynálezu navíc zahrnují rozpustné formy CD137. Ty zahrnují extracelulární doménu proteinu v úplné nebo částečné formě, zatímco transmembránová doména je částečně nebo úplně vyjmuta. Navíc nemají tyto formy cytoplasmatickou část sekvence C-konce. Podle tohoto vynálezu jsou rozpustné formy CD137 zvláště výhodné při podáních in vivo, protože výsledně je například intravenózní podání farmaceutického přípravku významně zjednodušeno. Výhodnou rozpustnou formou CD137 je polypeptid s aminokyselinovými zbytky +18 až +186, jak ukazuje obr.
1A. Jiné analogy ve formě rozpustných nebo nerozpustných funkčních fragmentů, tedy parciálních sekvencí nebo kombinovaných parciálních sekvencí přírodní formy CD137 jsou rovněž zahrnuty v tomto vynálezu.
• · ·· · · . : : ······· · · · i • · · · ··· · · ·· ·· ·· ···· ··
Rozpustné formy CD137 podle tohoto vynálezu mohou být připraveny způsobem který je znám sám o sobě. Například je možná příprava pomocí rekombinace, začínající z přibližně odříznutého fragmentu DNA. Navíc existuje možnost přípravy odříznutých forem CD137 pomocí vyluhování specifickou proteázou.
Funkční analogy k polypeptidům výslovně popsaným v obr. 1A, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, navíc zahrnují funkční ekvivalentní polypeptidy, jaké mohou být izolovány z jiných savců nebo jiných buněčných systémů stejného savce. Funkčním ekvivalentem v tomto smyslu je například faktor izolovaný z myší a popsaný v US Patent Specification 5674704, který se jmenuje 4-1BB a funkční analogy po sobě z něj odvozené, jako například fragmenty.
CD137 a jeho funkční analogy uvedené výše mohou být využity podle tohoto vynálezu jak v monomerní formě, tak v multimerní formě.
Pro použití v monomerní formě je zvláště výhodná imobilizace proteinu. Imobilizace v tomto případě může být provedena na podpůrném nosiči způsobem, který je znám sám o sobě. Tímto podpůrným nosičem matrix může být například povrch kultivační nádoby, ve které lze kultivovat buněčný systém obsahující monocyty. Dalšími vhodnými podpůrnými nosiči mohou být například polymerové částice, které lz:e suspendovat v buněčném systému obsahujícím monocyty.
Optimální počet imobilizovaných molekul na jednotku plochy může snadno určit odborník zkušený v oboru pomocí předběžných pokusů. Může být například přibližně 1011 až 1017 molekul CD137 nebo jeho funkčních analogů na čtvereční centimetr, zejmena přibližné 10 az 10x , jako je například přibližně 6 x 1013.
·· • · · ·· ·· • · · · • · ·· • » · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · * • · · • · · • · · « » · • · • · ·· ·
Imobilizace může být provedena jakýmkoli obvyklým způsobem, který je známý odborníkovi v oboru, pokud není výsledně nežádoucím způsobem ovlivněna požadovaná biologická aktivita imobilizované CD137 nebo je ovlivněna jen nevýznamně. Imobilizací lze provést například adsorpcí molekuly na nosič nebo kovalentní vazbou na nosič, to znamená za použití difunkčních vazebných molekul, které se vážou například funkčními skupinami aminokyselinových zbytků. V tomto případě se mohou vytvořit mezi linkerem a CD137 amidové, diazové, isothiokyanátové nebo disulfidové můstky (viz například Vitetta a kol., Science 238, 1098, 1987; Pastan a kol., Cell, 47, 641, 1986; nebo Thorpe a kol., Cancer Res. , 47., 5924, 1987).
Další možnost imobilizace spočívá v expresi CD137 na buněčném povrchu buněk transformovaných DNA kódující pro CD137, jako například buněk CHO.
Dále existuje možnost specificky modifikovat sekvenci aminokyselin CD137, aby se usnadnila imobilizace. Modifikace tohoto typu, například takzvané smyčky fungující jako ukotvení, jako je například modifikace známá jako hexahistidinové ukotvení, nebo epitopy, které mohou být protilátkami rozpoznány jako antigeny (popsány například v práci Harlow E., Lané D., Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (N.Y.) Press, 1988). Tato ukotvení mohou sloužit pro přivěšení CD137 k pevnému podkladu, jako je například polymerová matrix, která může být přítomna například v chromatografickém sloupci, mikrotitrační destičce nebo kultivační nádobě.
Zvláště vhodné ztělesnění funkčního analogu CD137 vhodné pro imobilizací je fuzní protein z extracelulární domény CD137 a Fc část molekuly IgG. Fuzní molekuly toh-oto typu lze zvláště výhodně imobilizovat na podklad, na který • · fcfc fcfc · ·· fc· » fcfc fc • fc fcfc • · · · • · · · ·« «· • fc · • · • · * • · • ·· fcfc je navázán buď protein A nebo protilátka anti-Fc. Příprava CD137-Fc je popsána v práci Schwarz H. a kol., Blood, 87,
7, 2839 - 22845, 1996. Na tuto práci se zde tímto výslovně odkazuje.
Multimerní agregáty CD137, které lze použít podle tohoto vynálezu, výhodně zahrnují 2 až 5 molekul CD137 nebo jejich funkčních analogů. Agregace jednotlivých molekul peptidu se musí provést tak, aby se nebránilo jejich vazbě na monocyty. Výhodně se multimerní agregáty CD137 připraví z fuzních molekul, které jsou popsány výše a které zahrnují extracelulární doménu CD137 a Fc část molekuly IgG. Dimerizace může být provedena například spojením s protilátkou anti-Fc. Tímto způsobem se získá dimerní agregát CD137. Dimerizace lze navíc dosáhnout vytvořením disulfidových můstků mezi Fc částí dvou molekul fuzního proteinu. Dimerizace je rovněž možná použitím difuknčních chemických linkerů, jako jsou například ty, které mají koncové sulfhydrylové skupiny, jako je dithiobis(sukcinimidyl)propionat, N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat nebo reaktivní karbodiimidy, jako je například hydrochlorid l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu.
Vyšší multimery, jako jsou například molekuly, které mají pět jednotek CD137, lze získat, začne-li se od Fc části pentamerních molekul IgM a extracelulární domény CD137.
První předmět tohoto vynálezu se vztahuje k použití proteinu buněčného povrchu CD137 označeného jako monocytární růstový faktor, který je tvořen aktivovanými T lymfocyty, nebo jeho funkčního analoga, k přípravě léku pro podporu proliferace periferních monocytů a je-li to vhodné, rovněž jejich progenitorových a/nebo prekursořových buněk (viz níže) u savců.
Podpora proliferace monocytů ve významu, používaném • · • ·
v tomto vynálezu, zahrnuje jak proliferací neproliferujících monocytů, tak doplňkově i pomoc již proliferujícím monocytům.
Periferní monocyty jsou složkou periferního krevního systému a u dospělých jsou obsaženy za fyziologických podmínek v koncentraci 80 až 540 a u dětí v koncentraci 80 až 720 buněk v μΐ krve.
Jak je známo, všechny druhy stavů nemocí jsou spojeny s poklesem počtu monocytů a/nebo buněk od nich odvozených, zvláště makrofágů odlišné tkáňové specificity (viz výše). Kvůli známým biologickým funkcím monocytů a buněk z nich odvozených lze navíc usuzovat, že vzestup počtu monocytů, to znamená z hodnoty nižší ve fyziologickém rozmezí na fyziologickou hodnotu vyšší by mohl pravděpodobně přinést léčebný užitek jako výsledek zvýšené proliferace. Navíc je možné, že výsledkem umělé indukce monocytózy (vzestupu počtu monocytů v krvi na hodnoty vyšší než 540 buněk v μΐ krve) je to, že monoCytární obranný systém těla pomáhá během obrany proti infekcím.
Další předmět přítomného vynálezu se proto vztahuje k použití CD137 nebo jeho funkčních analogů pro přípravu léčiva k léčbě stavů, spojených s poruchou buněčného systému, které zahrnují monocyty a/nebo buňky z nich odvozené a/nebo jejich progenitory a /nebo jejich prekursory, zvláště monocytů a/nebo buněk z nich odvozených, jako jsou makrofágy (viz schematické znázornění hernatopoetického systému v Concepts of Gene Therapy, Verlag Walter de Gruyter Berlin, 1997, Strauss M. a Barranger J.A. (vyd.), str. 236, Tab. 12.1, na tuto práci se zde tímto výslovně odkazuje); nebo jejichž vznik a životnost jsou léčebně ovlivnitelné podporou proliferace buněk tohoto buněčného systému.
Porucha ve výše uvedeném smyslu může v tomto případě zahrnovat vrozené nebo získané, trvalé nebo dočasné, částečné nebo úplné poškození jedné nebo více fyziologických funkcí tělesných buněk, kterých se to týká.
Takovým systémem je například takzvaný myeloidní buněčný systém, jehož buňky jsou odvozeny z progenitorových buněk kostní dřeně. Obvyklými složkami tohoto systému jsou granulocyty a monocyty.
Zejména je použití podle tohoto vynálezu indikováno, když zmíněná porucha zahrnuje funkční poruchu nebo pokles počtu monocytů pod koncentraci 80 buněk v μΐ krve a/nebo pokles buněk z nich odvozených.
První výhodnou oblastí použití CD137 jsou stavy podle tohoto vynálezu, které jsou zvoleny z poškození hematopoetického systému, spojené s chemoterapií nebo radioterapií. Chemoterapie a radioterapie se často používají pro léčbu všech druhů onkologických nemocí nebo v souvislosti s myelosupresivní nebo myeloblativní léčbou pro přípravu kostní dřeně nebo orgánových transplantátů.
Častým výsledkem je zde leukopenie a pokles počtu monocytů spojený s touto léčbou. Morbidita a mortalita pacientů v důsledku zvýšené citlivosti k infekci se výrazně zvyšuje. Leukopenii lze účinněji mírnit nebo odstranit podáváním CD137 nebo monocytů ošetřených CD137 podle tohoto vynálezu.
Další oblast použití se vztahuje k použití CD137 nebo funkčních analogů pro léčbu poruch hojení ran, jako lze pozorovat například u dialyzovaných pacientů nebo diabetiků nebo pacientů s chronickou žilní nedostatečností. V tomto případě jde o poruchy hojení ran, které jsou výsledkem nedostatečné přítomnosti nebo funkce granulační tkáně, která se skládá především z makrofágů (tedy diferencovaných monocytů).
♦ · ···· · · · *· ·· ·« ·· ···· ··
Další předmět tohoto vynálezu se vztahuje k použití CD137 nebo jeho funkčních analogů pro přípravu léčiva pro léčbu stavů, které jsou spojeny s nedostatečnou imunitní odpovědí. Příklady stavů tohoto typu, které lze zmínit, jsou:
a) Onkózy které jsou podporovány nedostatečnou nebo chybějící cytotoxickou aktivitou endogenního obranného systému.
b) Bakteriální a virové infekce a mykózy, které jsou podporovány nedostatečnou nebo chybějící fagocytózou patogenu nebo tělních buněk jím infikovaných.
Dále léčba
c) vrozeného nebo nevrozeného, získaného nebo nezískaného poškození nebo stavů imunitního systému; a
d) poškození vyvolaného léčbou imunosupresivy, jaké se může objevit například při léčbě pacientů s chronickou polyarthritidou nebo autoimunními chorobami nebo u transplantovaných pacientů.
Jak bude vysvětleno ještě přesněji v následující části, léčbu podle tohoto vynálezu lze provést v souvislosti s léčbou in vivo nebo ex vivo.
Podle dalšího ztělesnění tohoto vynálezu lze použít CD137 nebo jeho funkčního analoga v kombinaci s nejméně jedním dalším faktorem, který lze zvolit z interleukinů, lymfokinů, monokinů, interferonů, kolonie stimulujících. faktorů a růstových faktorů. Zde je možno uvést tyto příklady, ale vynález není tímto výčtem omezen: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFN-alfa, -beta, -gama, TNF-alfa, EGF, TGF, PDGF, ILGF, MGF, EPO, G-CSF, GM-CSF a M-CSF, leukocyty stimulující faktory, jako je G-CSF, GM-CSF a zejména M-CSF jsou výhodné. CD137 a další faktor lze zde podat současně nebo po sobě v jakémkoli požadovaném pořadí.
·· ·· ·· ···· ·· ···
Je možné kombinované použití s faktory inhibujícími apoptózu. Je možné, že M-CSF má na monocytární apoptózu inhibiční účinek tohoto typu.
Pro použití v souvislosti s přítomným vynálezem je lidský CD137 zásadně vhodný ve své přírodní formě, to je jako protein mající sekvenci aminokyselin od zbytku +18 do zbytku +255 v sekvenci podle obr. 1A nebo funkční analog této sekvence.
Výhodně je nicméně použita extracelulární doména lidského CD137 odpovídající aminokyselinám +18 až +186, jak ukazuje obr. 1A nebo její funkční analog.
Ve výhodném ztělesnění tohoto vynálezu se použije CD137 nebo funkční analog v imobilizované formě nebo jako multimerní agregát.
Výhodný multimerní agregát CD137 obsahuje 2 až 5 molekul proteinu CD137 nebo jejich funkčních analogů.
Tento vynález se dále vztahuje k postupům in vitro nebo ex vivo pro podporu proliferace periferních monocytů, periferní monocyty ze savčí krve se uvedou do kontaktu s volným nebo imobilizovaným, zejména imobilizovaným CD137 v nutričním mediu a inkubují, dokud se nezvýší počet monocytů, výhodně na maximální hodnotu a/nebo lze pozorovat nárůst monocytů.
Izolace monocytů ze savčí krve se může provést obvyklými standardními postupy. Frakce izolovaných buněk může být buď čistá frakce monocytů nebo může obsahovat buňky, které neovlivňují nežádoucím způsobem léčbu monocytů a následnou léčbu savce stimulovanými monocyty. Tak například lymfocyty mohou být přítomny během fáze inkubace
in vitro vedle monocytů. Vhodné způsoby izolace popisuji například v Meyskens F. L. a kol., Exp. Haematol., 7(8) , 401 - 410, 1979; Weiner R. S. a kol., J. Immunol. Methods,
36(2). 89 - 97, 1980; Contreras T. J. a kol., Cell.
Immunol., 54(1), 215 - 229, 1980.
Příkladem nutričního media pro kultivaci in vivo nebo ex vivo, na který však není tento vznález omezen, je například RPMI medium doplněné o 5% telecí plodové sérum. Po skončení kultivace je výhodné promytí frakce ošetřených monocytů, například PBS předtím, než je podána savci, který má být léčen.
Další předmět tohoto vynálezu se vztahuje k použití CD137 nebo funkčního analoga v postupu regenerační léčby pacientů po chemoterapii nebo radioterapii, kde
a) frakce krve obsahující periferní monocyty je izolována z krve pacientů předtím, než se provádí chemoterapie nebo radioterapie, inkubována ex vivo s volným nebo imobilizovaným, zejména imobilizovaným, CD137 dokud se nezvýší počet monocytů nebo se nedosáhne jeho optima a/nebo je pozorovatelné zvětšení velikosti monocytů a frakce krve ošetřená tímto způsobem a výhodně obohacená monocyty se podá zpět pacientovi po skončení léčby; nebo
b) se podá účinné množství multimerniho agregátu CD137 pacientovi před, v průběhu, nebo po skončení chemoterapie nebo radioterapie k podpoře proliferace endogenních periferních monocytů.
Další předmět tohoto vynálezu se vztahuje k použití CD137 nebo funkčního analoga v postupu pro podporu endogenní nespecifické imunitní obrany, kde je pacientovi podáno množství CD137 nebo jeho funkčního analoga, podporující proliferaci periferních monocytů, zvláště množství multimerniho agregátu CD137, podporující proliferaci periferních monocytů. Tento postup je zvláště výhodný pro • · · · · · ·· ·· • ·· · · · · · · ·· ·· · · · · · • · · · · · · · ·· · • · · · · · · ·· • · ·· ·· ···· · · · použití u pacientů s tumory a pacientů trpících bakteriální nebo virovou infekcí nebo mykózou.
Multimerní agregáty CD137, které jsou s výhodou podávány v souvislosti s tímto postupem, zahrnují 2 až 5 molekul proteinu CD137 nebo jejich funkčních analogů.
Zvláště vhodné je podání takových analogů nebo agregátů, které zahrnují extracelulární oblast lidského CD137 odpovídající aminokyselinám +18 až +186, jak ukazuje obr. 1A nebo jejich funkčních analogů, schopných vazby na monocyty.
Pro podání in vivo je výhodné použití lidského CD137 nebo analoga z něj odvozeného. Pokud se podává CD137 jako fuzní protein, fuzní protein s CD137 by taktéž měl být lidského původu. Jsou možné rovněž další způsoby pro zlepšení doby cirkulace CD137 v krvi, jako je například PEGylace, která byla již úspěšně použita například u jiných cytokinů (viz PEGylace G-CSF, popsaná v EP-A-0 335 423).
Konkrétní volba dávky CD137 nebo jeho funkčního analoga a konkrétní dávkovači schéma záleží na rozhodnutí ošetřujícího lékaře. Ten zvolí vhodnou dávku a odpovídající dávkovači schéma v závislosti na zvoleném způsobu podání, účinnosti konkrétního léčiva, podstatě a závažnosti stavu, který se má léčit a na stavu pacienta a jeho odpovědi na léčbu. Vhodná dávka by nicméně měla být v rozmezí přibližně od 1 do 20 μg/kg tělesné hmotnosti a den nebo v rozmezí od 0,01 do 1 nmol/kg tělesné hmotnosti a den.
Vztaženo na objem krve, účinné koncentrace CD137 nebo jeho funkčního analoga v průběhu léčby mohou být v rozmezí přibližně od 0,01 μg do 10 μg na mililitr krve nebo v rozmezí přibližně od 0,1 pmol do 0,5 nmol na mililitr krve.
4« 44 ·· 44 ·· • 444 4 4 4 4 · · • · ·· ·· 4 4 4 • ·· 4 4 4 4 4 44 4
4444 444 44
44 44 4444 44
Při podání in vitro nebo ex vivo se účinné koncentrace CD137 nebo jeho funkčního analoga mohou pohybovat v rozmezí od ne více než přibližně 0,1 μ9/ιη1 media, zejména ne více než přibližně 1 μg/ml media až do přibližně 50 μg/ml media nebo v rozmezí od více než přibližně 1 pmol/ml media, zejména více než 0,01 nmol/ml media, jako například přibližně 2 nmol/ml media.
Podání in vivo CD137 a jeho funkčních analogů se výhodně provede za použití tekutého farmaceutického přípravku, který lze podat parenterálně, zejména intravenózně. Ten výhodně obsahuje účinné množství CD137 nebo jeho funkčního analogu, výhodně v rozpuštěné formě, ve farmaceuticky přijatelném nosiči, který je vhodný pro tento účel. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou zejména vodné roztoky, jako je například fyziologický roztok, fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok, Ringerův roztok, Ringerův roztok s laktátem a podobně. Navíc může přípravek obsahovat další aditiva, jako jsou antioxidanty, chelátotvorné látky nebo antimikrobiální látky. Je rovněž možné podání orální nebo inhalační.
Intravenózní podání je zvláště výhodné, pokud je nezbytná systémová léčba. Pro léčbu místních stavů, jako jsou například místně omezené infekce, může být rovněž výhodné specifické subkutánní nebo intradermální podáni. Pro léčbu místních ran, například superficiálních, je možné podání kožní. To je možné provést podáním roztoku, suspenze, masti nebo gelu.
Optimální koncentrace CD137 nebo jeho funkčního analoga ve farmaceutických přípravkách podle tohoto vynálezu je určeno kromě jiného specifickou aktivitou použité formy CD137. Vhodné hmotnostní podíly CD137 nebo jeho funkčniho analoga by se nicméně měly pohybovat v rozmezí od přibLižně • · · · ·· · · • · · · · · · · · · · ···· · · · · · • ·· · · · · · ·· · ···· ··· · · ·· ·· ·· ···· ·· ·
0,0001 do 1 % hmotnostního, zejména od 0,0005 do 0,01 % hmotnostního vztaženo k celkové hmotnosti přípravku. Molární koncentrace například mohou být v rozmezí od přibližně 1 nmol do 0,1 mmol, zejména přibližně od 15 do 300 nmol na 100 g použitého přípravku.
Tento vynález se navíc vztahuje k použití sekvence nukleotidů, kódující pro CD137 nebo jeho funkčního analoga pro přípravu přípravku pro genovou terapii pro léčbu jednoho ze stavů popsaných výše.
Přípravky pro genovou terapii tohoto typu zahrnují buněčný nosič, zejména periferní monocyty, buňky z nich odvozené, progenitorové buňky nebo prekurzory monocytů (viz schematické znázornění hematopoetického systému v Concepts of Gene Therapy, Verlag Walter de Gruyter Berlin, 1997, Strauss M. a Barranger J.A. (vyd.), str. 236, obr.
12.1, na tuto práci se zde tímto výslovně odkazuje), v nichž sekvence nukleotidů kódující pro CD137 nebo pro jeho funkční analog je inkorporována do formy schopné exprese ve vhodném konstruktu nukleových kyselin.
Dále se tento vynález vztahuje ke způsobu genové terapie pro léčbu některého ze stavů popsaných výše, ve kterém je pacientovi podáván přípravek pro genovou terapii podle tohoto vynálezu.
Aby se toho dosáhlo, přenos genu do zmíněných buněk lze provést způsobem, který je znám sám o sobě, jako je například za pomoci virových konstruktů, nevirových nosičů, jako jsou liposomy nebo jiných vhodných konstruktů nukleových kyselin (Gunzburg W. H. a kol., Gentransfer in Sáugerzellen, [Genový přenos u savčích buněk], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1997; Baum C. a kol., Gene transfer and Transgene Expression in Haematopoietic Cells, in Concepts of Gene Therapy, VerLag ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · • · r« · · · · · • · « ··· · · ·· · • · « · · · · · ·
Walter de Gruyter Berlin, 1997, Strauss M. a Barranger J.A. (vyd.), str. 233 - 256).
Konstrukt nukleových kyselin, který lze použít podle tohoto vynálezu, je kombinován například s virovým vektorem, jako je například vektor adenoviru nebo vektor replikačně deficientního adenoviru, nebo spojen s vektorem adenoasociovaného viru.
Další výhodnou kombinací je spojení konstruktu nukleových kyselin s liposomy. V průběhu lipofekce se připraví malé jednolamelární vezikuly z kationových lipidů působením ultrazvuku na suspenzi liposomů. DNA se ionově váže na povrch liposomů přesně v takovém poměru že zůstává pozitivní sítový náboj a DNA je navázána 100% na liposomy. Vedle lipidových směsí DOTMA (1,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylamoniumbromidu) a DOPE (dioleylfosfatidylethanolaminu) byla mezitím syntetizována řada nových lipidových přípravků a testována na jejich účinnost při transfekci různých buněčných linií (Behr J. P. a kol., Proč. Nati.
Acad. Sci. USA 86, 6982 - 6986, 1989; Felgner J. H. a kol., J. Biol. Chem., 269, 2550 - 2561, 1994? Gao X., Huang L. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 179. 280 - 285, 1991; Zhou X, Huang L., Biochem. Biophys. Acta, 1189, 195 - 203, 1994). Příklady nových lipidových přípravků jsou DOTAP N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamoniummethylsulfat nebo DOGS (TRANSFECTAM; dioktadecylamidoglycylspermin).
Vedle sekvence nukleotidů kódující pro CD137 nebo jeho funkční analog, zahrnují konstrukty nukleových kyselin, které lze použít podle tohoto vynálezu, ve funkčním, účinném spojení jednu nebo více regulačních sekvencí, jako jsou promotory, signály pro amplifikaci, enhancery, sekvence pro polyadenylaci, předlohy pro replikaci, reportérové geny, volitelné markerové geny a podobně. V závislosti na
·
• ·
požadovaném použití může toto spojení vést ke zvýšení nebo snížení exprese.
Kromě nově zavedených regulačních sekvencí mohou být stále přítomny přirozeně se vyskytující regulační sekvence před skutečnými strukturními geny. Způsoby genetické modifikace může být tato přirozená regulace vypnuta a exprese genu zvýšena. Genový konstrukt může být nicméně rovněž jednodušší, takže se před strukturní geny nevkládají žádné další regulační signály a není odstraněn přírodní promotor se svojí regulací. Místo toho je mutována přírodní regulační sekvence tak, že nadále nedochází k regulaci a je zvýšena exprese genu. Doplňkové výhodné regulační prvky mohou být rovněž vloženy na 3' konci sekvence nukleových kyselin. Sekvence nukleových kyselin mohou být v genovém konstruktu přítomny v jedné nebo více kopiích.
V principu lze použít všechny přírodní promotory s jejich regulačními sekvencemi. Navíc mohou být výhodně použity dokonce syntetické promotory. Regulační sekvence by měly výhodně umožnit specifickou expresi sekvencí nukleových kyselin.
Další varianta způsobu léčení podle tohoto vynálezu se vztahuje k použití specifických protilátek proti CD137 nebo jiných antagonistů CD137, které inhibují nebo snižují proliferaci zvyšující účinky CD137, čímž lze dále volitelně optimalizovat léčbu CD137.
Proto se tento vynález rovněž vztahuje k protilátkám nebo jejich fragmentům, které lze použít k tomuto účelu, které jsou přístupné způsobem, který je znám sám o sobě a odpovídajícím vhodným jiným antagonistům CD137. Stavy, které jsou doprovázeny zvýšenou tvorbou monocytů, jako jsou například určité formy rakoviny krve, by mohly být volitelně léčeny antagonisty CD137 tohoto typu.
• · • ·
• · · · • to ·· • · • · • to ···<
Poskytnutý vynález je nyní detailněji vysvětlen za pomoci následujících příkladů, na které není vynález omezen.
Příklady provedení vynálezu
Pracovní příklady
Reagencia
M-CSF a neutralizující protilátky proti M-CSF, GM-CSF a IL3 se získají od R a D (Wiesbaden, Německo).
Anti-M-CSF: klon 26730,11, na protein A čištěná frakce IgG z ascitární tekutiny myšího hybridomu. Anti-GM-CSF: klon
3209,1, monoklonální IgG-^ myší protilátka; anti-IL3: na protein A čištěná frakce IgG z ascitární tekutiny myšího hybridomu. Rekombinantní protein CD137-Fc, sestávající z extracelulární domény lidského CD137 konstantní domény lidského imunoglobulinu G^ (Fc), se získá od Alexis (Grůnberg, Německo).
Lidský IgGT Fc protein se získá od Accurate Chemical and Scientific Corporation (Wesbury, NY, USA).
Srovnávací příklad 1: Imobilizace CD137-Fc
Polystyrénové mikrotitrační destičky (Microtest III Tissue Culture Plates; Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ, USA) se inkubují přes noc při teplotě 4 °C s roztokem CD137-Fc o koncentraci 1 μg/ml v PBS (fosforečnanem pufrovaném fyziologickém roztoku). Na jamku se použije 50 μΐ roztoku. Následující ráno se odstraní roztok proteinu a destičky se promyjí PBS. Imobilizace Fc se provede analogicky.
Srovnávací příklad 2: ELISA
Kity ELISA se získají od R a D Systems (Wiesbaden, Německo). Test se provede podle pokynů výrobce. Koncentrace • · ·· ···» cytokinů se určí trojím měřením za použití testu a vyjádří jako průměrná hodnota ± směrodatná odchylka.
Srovnávací příklad 3: Určení apoptózy monocytů
Fragmentace DNA se určí pomocí Cell Death Detection
ELISA (Boehringer Mannheim, Německo) podle pokynů výrobce. Měření se provedou třikrát.
Srovnávací příklad 4: Izolace a kultivace lidských monocytů
Lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMC) se izolují z vrstvy buněk na rozhraní lymfocytů a plasmy (buffy coatu) zdravých jedinců. Pro tento účel buffy coaty se zředí dvojnásobným objemem PBS. Na stejný objem Histopaque (Sigma, Deisenhofen, Německo) se nanese vrstva. Tato směs se centrifuguje při 1200 g po dobu 20minut. Izolují se PBMCs, které se zachytí na separaóním povrchu Percoll ve formě bílé vrstvy. Erythrocyty se lyžují při teplotě místnosti po dobu 2 minut za použití 2 ml roztoku 200 mM chloridu amonného, mM hydrogenuhličitanu sodného, 10 mM EDTA (ethylendiamintetraoctové kyseliny) o pH 7,4. Buňky se promyjí dvakrát PBS, peletují při 250 g a resuspendují v mediu RPMI, doplněném o 5 % telecí plodové sérum.
Primární monocyty se odtud izolují elutriací (Andreesen R. a kol., J. Lekoc. Biol., 47, 490, 1990). Elutriované monocyty jsou čisté na 95 % a obsah T lymfocytů je menší než 3 % (odhadnuto morfologicky a antigenovým fenotypem, to znamená expresí DC14, DC3, CD4 a CD8). Buňky se kultivují v polystyrénových kultivačních nádobách (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) v mediu RPMI 1640, doplněném o 5% telecí plodové sérum, při koncentraci buněk, která je označena u každého příkladu.
Srovnávací příklad 5: Určení proliferace buněk
Pro měření proliferace jednotlivých buněk se použije
In Sítu Proliferation Kit od Boehringer Mannheim, Německo.
• · x 105 buněk se inokuluje na komůrku 8-komůrkového nosiče (FALCON, Becton Dickinson, Heildeberg, Německo), který byl potažen Fc nebo proteinem CD137-Fc a kultivuje se po dobu 10 dnů. 10 μΜ bromodeoxyuridinu (Brdu) se přidá během 60 minut. Inkorporovaný Brdu se zviditelní podle návodu k testu obarvením myší anti-BrdU a ovčím protimyším FITC. Monocyty se identifikují obarvením anti-CD14 protilátkou značenou fykoerythrinem (2 μg/ml; Immunotech, Marseille, Francie). Chromatin se obarvuje po dobu 5 minut s 5 μg/ml Hoechst 33342 (Sigma, Deisenhofen, Německo).
Proliferace buněčných populací se určí na mikrotitrační destičce s 96 jamkami. 105 monocytů na jamku se třepá s 18,5 kBq 3H-thymidinu po dobu 24 hodin, sesbírá se a měří za použití mikrodestičkového počítače scintilace TopCount (Packard, Meriden, CT, USA). Každá série se počítá «třikrát a výsledky se vyjádří jako průměrné hodnoty ± směrodatné odchylky.
Příklad 1: Apoptóza monocytů indukovaná CD137-Fc
105 primárních monocytů se kultivuje na tkáňové kultuře v nádobě, která byla předtím potažena fuzním proteinem, který se skládá z extracelulární domény CD137 a konstantní domény lidského imunoglobulinu Gj (Fc).
Neošetřené destičky a destičky potažené proteinem Fc se použijí jako kontroly. V jamkách potažených proteinem CD137-Fc významně vzrostl počet živých monocytů ve dnech 1,
3, 5 a 7 kultivace (obr. 2, dolní polovina). Stupeň apoptózy ve stejných kulturách byl určen množstvím fragmentované DNA (obr. 2, horní polovina). Překvapivě byl nalezen vyšší stupeň apoptózy v kulturách monocytů, které byly vystaveny působení proteinu CD137-Fc. Srovnatelné výsledky byly získány ve třech nezávislých pokusech.
Příklad 2: CD137-FC indukuje proliferaci periferních monocytů a způsobuje vznik kolonie monocytů.
• · • 9
• 9 (a) CD137 indukuje silnou proliferaci monocytů, která vykompenzuje ztrátu buněk vzniklou stejným způsobem navozenou apoptózou. 105 monocytů se kultivuje na destičkách s 96 jamkami potaženými Fc nebo CD137-FC. Proliferace se určí denně třepáním s 18,5 kBq 3H-thymidinu po dobu 24 hodin. Jak ukázaly poměry inkorporovaného 3H-thymidinu, ve skutečnosti CD137-Fc indukoval silnou proliferaci monocytů (obr. 3A). Proliferace vykázala pozitivní korelaci s dobou kultivace monocytů za přítomnosti proteinu CD137-FC. Indukce proliferace dosáhla maxima po 7 až 10 dnech, inkorporace 3H-thymidinu vzrostla třicetinásobně nebo více ve srovnání s kontrolními buňkami. Nebyl nalezen žádný rozdíl mezi monocyty v neošetřených jamkách a jamkách potažených proteinem Fc (výsledky nejsou zobrazeny).
χ , O
Významný vzestup vychytáváni H-thymidmu je v souladu se zjištěním, že k proliferaci indukované CD137-Fc docházelo v kultuře široce rozšířeným způsobem. Při značení monocytů ošetřených CD137 tím způsobem, že se vystaví působení bromodeoxyuridinu (BrdU) po dobu jedné hodiny a následně detekují anti-BrdU protilátkou značenou fluoresceinem bylo specificky zjištěno, že 9,3 % buněk (55 ± 6 z 589 ± 43) replikovalo svoji DNA, zatímco periferní monocyty, vyrostlé na nosiči potaženém Fc nevykázaly žádnou inkorporaci BrdU (výsledky nejsou zobrazeny).
Způsoby imunocytochemických zkoumání bylo navíc možno potvrdit, že proliferující buňky byly skutečně monocyty a ne jiné krevní buňky. Specificky byla určena proliferace, jak je popsáno výše, inkorporaci BrdU a totožnost monocytů byla ověřena simultánním barvením CD14, proteinu buněčného povrchu specifického pro monocyty. Jádra byla zviditelněna barvením tím, že do DNA se vložilo barvivo Hoechst 33342.
V těchto výzkumech bylo zjištěno, že proliferující buňky měly typické rysy monocytů: byly CD14 pozitivní, • · polynukleáry a vykazovaly typickou morfologii monocytů/makrofágů (výsledky nejsou zobrazeny).
(b) Jak ukazuje mikrograf na obr. 3B, léčba monocytů imobilizovaným CD137-Fc podle vynálezu vede k významné tvorbě kolonie, jak již bylo ukázáno pro jiné hematopoetické růstové faktory.
Příklad 3 doplňkové
CD137.
M-CSF a GM-CSF jsou základní (nezbytné) faktory pro proliferaci monocytů indukovanou (a) 105 periferních monocytů se kultivuje na imobilizovaném Fc nebo imobilizovaném CD137-Fc. Podle plánu pokusu se přidají neutralizující protilátky anti-M-CSF (2 μg/ml), anti-GM-CSF (2 μg/ml) a anti-IL3 (2 μg/ml). Proliferace se určí 10. den pomocí inkorporace 3H-thymidinu.
Bylo možno dosáhnou úplné inhibice proliferace monocytů použitím neutralizujících protilátek anti-M-CSF a anti-GM-CSF. Neutralizující protilátka anti-GM-CSF sama způsobila pouze asi 18% pokles proliferace. Protilátka anti-IL3 neměla žádný účinek na proliferaci indukovanou CD137. Přidání protilátek anti-GM-CSF a anti-IL3 vedlo k synergickému poklesu proliferace na třetinu původní hodnoty (viz obr. 4A).
Tyto výsledky ilustrují, že M-CSF a GM-CSF byly významnými faktory pro proliferaci periferních monocytů. indukovanou CD137.
(b) V dalším pokusu bylo nicméně zjištěno, že M-CSF a GM-CSF způsobily jen zanedbatelnou proliferaci v koncentracích stejných, jako to indukuje CD137. Periferní monocyty se kultivují na destičkách s 96 jamkami, potažených Fc nebo proteinem CD137-Fc (1 μg/ml) nebo M-CSF a GM-CSF v
·· ···♦ označených koncentracích (ng/ml). Proliferace se určí 10. den pomocí inkorporace 3H-thymidinu (obr. 4B). V předběžných pokusech bylo zjištěno, že M-CSF byl indukován CD137 v koncentracích do 10 ng/ml. Nebylo možno měřit indukci GM-CSF (výsledky nejsou zobrazeny). In vivo jsou M-CSF a GM-CSF detekovatelné v koncentracích 10 ng/ml nebo 50 pg/ml (Kawano Y., Eur. J. Haematol., 54, 147, 1995; Elner S. G., Curr. Eye Res. , 14, 1045, 1995; Saunders M.A. , Br. J. Pharmacol., 120. 545, 1997). V testových sériích, ukázaných na obr. 4B, se použily M-CSF a GM-CSF v signifikantně vyšších koncentracích ve srovnání s hodnotami, uváděnými v literatuře, konkrétně 100 a 1 ng/ml podle pořadí. Ve srovnání s CD137 bylo nicméně možno pouze indukovat frakci proliferace způsobenou M-CSF a/nebo GM-CSF. To lze mít jako indikátor, že doplňkové faktory, které jsou indukovány účinkem CD137 na monocyty přispívají autokrinním způsobem k proliferací monocytů indukovanou CD137.
Příklad 4: Proliferace monocytů indukovaná CD137-Fc je zprostředkována jedním nebo více autokrinními faktory.
Další zkoumanou věcí bylo, zda tyto faktory, které se možná doplňkově účastnily proliferace monocytů indukované CD137, jsou přítomny v rozpustné formě nebo vázány na buněčný povrch. Pro tento účel se kultivuje 10$ periferních monocytů na imobilizovaném Fc nebo imobilizovaném proteinu CD137-Fc po dobu 24 hodin. Buňky se odstraní centrifugací při 12000 g po dobu 5 minut. 0, 10 a 20 μΐ upraveného supernatantu těchto kultur se přenese do 100 μΐ čerstvých kultur neošetřených monocytů. Přenos tohoto upraveného media do neošetřených monocytů od stejného dárce indukoval růst buněk (obr. 5A) a proliferací buněk (obr. 5B) v závislosti na dávce. Po 8 dnech byly buňky fotografovány ve zvětšení 300-krát, aby se ilustroval účinek na růst buněk. Pro srovnání dolní zobrazení na obr. 5A ukazuje monocyty, které byly kultivovány po dobu 8 dnů na imobilizovaném proteinu CD137-FC.
Pro určení proliferace (obr. 5B) se Fc nebo CD137-FC imobilizuje na substráty kultury způsobem, který byl popsán výše. Monocyty se potom kultivují s upraveným supernatantem v označených koncentracích. Jak je popsáno výše, proliferace se určí pomocí inkorporace 3H-thymidinu. Pro tento účel se provádí třepání s 18,5 kBq 3H-thymidinu po dobu 24 hodin 8.den. Opakování pokusu třikrát vedlo k srovnatelným výsledkům.
Příklad 5: Imobilizace proteinu CD137 je nutná k indukci proliferace monocytů.
105 periferních monocytů se kultivuje na imobilizovaném Fc a imobilizovaném CD137-FC a pro srovnání s nimi za přítomnosti Fc a CD137-Fc v rozpuštěné formě. Ve srovnávací skupině se zabrání imobilizací CD137 a FC blokováním kultivačních nádob nespecificky hovězím sérovým albuminem (inkubace s 200 μ,Ι BSA o síle 0,1 % po dobu 30 minut při teplotě místnosti).
Proliferace se určí 10. den pomocí inkorporace 3H-thymidinu. Jak ukazují výsledky na obr. 6, indukci proliferace monocytů pomocí CD137 lze pozorovat jen, byl-li protein CD137 imobilizován předem potažením nádob na tkáňové kultury proteinem. Na druhé straně pokud se CD137 podal ve formě rozpustného proteinu, indukce proliferace se rovněž výrazně snížila. Ve třech nezávislých pokusech byly získány srovnatelné výsledky.
Příklad 6; Zkoumání proliferace monocytů za přítomnosti TNFR-Fc a anti-CD68
Fc protein, CD137-Fc protein, protein (TNFR)-Fc receptoru faktoru nekrózy tumoru a anti-CD68 se imobilizovaly pro další charakterizaci indukce proliferace monocytů. Inkorporace 3H-thymidinu se určila způsobem popsaným výše. Z obr. 7 je zřejmé, že pouze CD137-Fc významně indukuje
I · · · > · · * ·· ·· proliferaci monocytů.
TNFR-Fc a anti-CD68 jsou oba proteiny, které se váží na povrch nonocytů podobně jako CD137. Za jejich použití jako kontroly lze vyloučit, že by pouhá vazba monocytů na povrch kultivační nádoby způsobovala pozorované účinky.
Příklad 7 : CD137 a M-CSF doplňkově indukují proliferaci monocytů.
10monocytů na jamku se zavede na mikrotitrační destičku s 96 jamkami. Každá jamka byla předtím potažena Fc nebo CD137-FC (vždy 1 μ9/Ίη1). Přidají se M-CSF (100 μg/ml) a LPS (lipopolysacharid) (50 μg/ml) v rozpuštěné formě. Měření proliferace po kultivaci 8 dnů se provede pomocí inkorporace 3H-thymidinu po třepání po dobu 24 hodin s 18,5 kBq 3H-thymidinu.
Jak ukazují výsledky pokusu na obr. 8, inkorporace 3H-thymidinu v monocytech se přídavně zvýšila imobilizovaným CĎ137-Fc a M-CSF. Na druhé straně nevedl LPS k žádnému významnému nárůstu v podílu inkorporace a tak neměl žádný účinek na proliferaci monocytů indukovanou CD137.
Příklad 8 : CD137-FC indukuje morfologické změny monocytů.
105 primárních periferních monocytů se kultivuje na neošetřených destičkách s tkáňovými kulturami nebo na imobilizovaném proteinu Fc nebo proteinu CD137-Fc (1 μ9/ιη1). Kultury se fotografují ve dnech 1, 2, 4, 6 a 10 ve zvětšení 400-krát (obr. 9A). Destičky s kulturami, které byly ošetřeny pouze proteinem Fc vykázaly jen slabou adhezi monocytů. Navíc si monocyty podržely svoji kulatou morfologii. Během 10 dnů monocyty z této skupiny postupně odumřely (obr. 9A, levý sloupec). Zcela odlišný výsledek se nicméně získá, byly-li buňky kultivovány na destičkách, tkáňových kultur, na kterých byl imobilizován CD137-Fc fuzní protein. CD137-FC indukuje adhezi monocytů. Tyto buňky fcfc ·· • fc · · « • · · fc · · · · • fc · * fc · fcfcfcfc postupně získaly nepravidelný tvar. Tento účinek bylo možno pozorovat již 1. den. Se vzrůstající dobou kultivace se buňky šířily, zvětšovaly a vykazovaly komplexnější morfologii (obr. 9A, pravý sloupec).
10. den kultivace za přítomnosti imobilizovaného CD137-Fc bylo možno identifikovat tři základní morfologie monocytů diferencovaných in vitro: protáhlou formu (E), kulatou formu (R) a rozvětvenou formu (B) (viz obr. 9B).
Příklad 9 : CD137-Fc indukuje tvorbu M-CSF.
(a) 105 primárních monocytů se kultivuje v prvním pokusu na imobilizovaném Fc nebo CD137-Fc (vždy 1 μg/ml).
Aby se udržel protein CD137-Fc (1 μg/ml) v roztoku, v jedné skupině se zabrání imobilizaci proteinu CD137-Fc preinkubací destiček s tkáňovými kulturami telecím plodovým sérem (po dobu 1 hodiny při teplotě 4 °C, nezředěným).
Výsledky ukazuje obr. 10. Supernatanty kultur byly sbírány v označených časech a koncentrace M-CSF se určovaly pomocí metody ELISA. Srovnatelné výsledky se získaly ve třech oddělených pokusech.
Jak ukazuje obr. 10, CD137 indukuje expresi M-CSF. V průběhu prvních tří dnů kultivace byl obsah M-CSF nízký a nebyl pozorován žádný rozdíl mezi kontrolními monocyty a monocyty ošetřenými CD137. Od 4. dne byla tvorba M-CSF detekovatelná a koncentrace M-CSF rychle a nepřetržitě rostla. Imobilizace proteinu CD137 byla nezbytným předpokladem pro významnou tvorbu M-CSF, protože rozpustný CD137 indukoval pouze nízké koncentrace M-CSF.
(b) V dalším pokusu se ukázalo, že exprese M-CSF je nejen indukována CD137, ale že je rovněž nezbytná pro přežití monocytů indukovaných CD137. Pro tento účel se toto • · • · · ··
·· ·· • to · ·# ··· monocyty kultivují za přítomnosti imobilizovaného proteinu CD137 a neutralizujících anti-M-CSF protilátek. Bylo zjištěno, že přibližně desetkrát více monocytů přežilo na destckách potažených CD137 v porovnání s destičkami potaženými Fc proteinem. Přidání neutralizujících anti-M-CSF protilátek snížilo počet přežívajících monocytů na základní hodnotu (viz tab. 1). Při sledování doby kultivace bylo zjištěno, že většina buněk kultivovaných na destičkách nepotažených nebo potažených Fc proteinem byla mrtvá již 6. den (viz obr. 11). Nicméně imobilizovaný protein CD137 nebo M-CSF stabilizovaly počet buněk na vysoké úrovni dokonce 12. den. Po zachycení M-CSF za pomoci neutralizujících protilátek nebylo dále možno tento účinek pozorovat.
Je známo, že kromě M-CSF u člověka rovněž GM-CSF a IL-3 příznivě ovlivňují délku života monocytů. Nebylo možno zjistit žádnou expresi GM-CSF ani IL-3 v testu ELISA po kultivaci po dobu 8 dnů (u kontroly a buněk ošetřených CD137) v pokusu podle tohoto vynálezu (výsledky nejsou ukázány). Nicméně neutralizující anti-GM-CSF protilátky snížily dobu přežití monocytů, zprostředkovanou CD137, o polovinu (viz tab. 1). Protilátky anti-IL-3 neměly žádný účinek. Kombinace neutralizujících protilátek anti-IL-3 a anti-GM-CSF nicméně snížila počet přežívajících monocytů na hodnotu blízkou základní. To ukazuje, že také IL-3 hraje důležitou roli při přežívání monocytů. Neutralizace GM-CSF a/nebo IL-3 doplňkově k neutralizaci M-CSF nevedla k žádnému dalšímu snížení počtu buněk.
Příznivý účinek M-CSF bylo možno snížit úplně podáním neutralizujících anti M-CSF protilátek a téměř úplně na základní hodnotu kombinací protilátek anti-GM-CSF a anti
-IL-3.
• · • · · • fc
Tabulka č. 1
1- |Stimul 1 |Neutralizuj ící | protilátka2^ 1 I 1-i Počet přežívajících |hodnota p4)| buněk1) | | 1 1 _1_1
| Fc 1 6,8 ± 1,5 1 I I
|CD137-FC 1 I 75,5 ± 6,8 1 1 I I
|CD137-FC 1 | alfa-M-CSF 1 9,3 ± 2,0 1 1 | 0,005 I
|CD137-Fc 1 | alfa-IL-3 72,3 ± 8,4 1 ns 1 |J
|CD137-Fc 1 | alfa-GM-CSF J 36,0 ± 2,5 1 1 | 0,006 I
|CD137-FC 1 | alfa-M-CSF | + alfa-IL-3 I 7,0 ± 1,8 | 0,005 I
|CD137-Fc 1 | alfa-M-CSF | + alfa-GM-CSF I 6,0 ± 3,0 | 0,007 I I I
|CD137-Fc 1 | alfa-GM-CSF | + alfa-IL-3 19,0 ± 3,0 1 1 | 0,005 I 1 1 | I
|CD137-FC 1 | alfa-M-CSF | + alfa-GM-CSF | + alfa-IL-3 I 4,8 ± 3,3 1 1 | 0,008 I 1 1 I_1
|M-CSF 1 I 68,3 ±16,2 1 1 |1
|M-CSF 1 | alfa-M-CSF I 5,3 ± 2,6 1 1 | 0,006 I
|M-CSF 1 1 | alfa-M-CSF | + alfa-IL-3 J 20,8 ± 5,0 J 1 1 | 0,018 I 1 1
Primární periferní monocyty se kultivovaly na imobilizovaném proteinu CD137-Fc (1 μg/ml) nebo se přidal M-CSF v konečné koncentraci 100 ng/ml.
2) Neutralizující protilátky se použily v koncentraci 2 μg/ml; jejich přidání se uskutečnilo na začátku pokusu.
3) Průměrný počet buněk a standardní odchylka. 10. den byly počítány buňky ve čtyřech reprezentativních políčkách destičky.
4) Hodnoty p se určily Studentovým t-testem za pomoci software SSPS, ns = nesignifikantní.
Příklad 10 : Imobilizace proteinu CD137 zvyšuje počet živých monocytů.
105 periferních monocytů se kultivují na imobilizovaném Fc nebo CD137-Fc proteinu (v obou případech 1 μg/ml) nebo za přítomnosti rozpustného Fc nebo CD137-Fc proteinu (v obou případech 1 μg/ml). Tyto kultury se 8.den fotografují při 300-násobném zvětšení (viz obr. 12). Imobilizace se provede předběžným ošetřením kultivačních destiček hovězím sérovým albuminem (30 minut při teplotě místnosti, 200 μΐ na jamku destičky s 96 jamkami). Za přítomnosti rozpuštěného proteinu se počet monocytů výrazně snížil. V souladu s tímto zjištěním je M-CSF indukován pouze v případě, že protein CD137 je přítomen v imobilizované formě (viz příklad 9). Proto je pravděpodobné, že CD137 působí na monocyty pouze tehdy, je-li ligand CD137 expresovaný monocyty (to je vazebný protein pro CD137) spojený pomocí vazby na imobilizované molekuly CD137.
Rozpustný CD137-Fc, který je druhotně spojen pomocí protilátek anti-Fc rovněž prodlužuje dobu přežití monocytů, jak bylo pozorováno po kultivaci po dobu 8 dnů (výsledky nejsou ukázány). Pro tento pokus byl CD137-Fc (2 μg/ml) předem ošetřen kozí protilidskou Fc protilátkou (2 μ9/πι1).

Claims (21)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Použití monocytárního růstového faktoru CD137 nebo jeho funkčního analoga k přípravě léčiva pro podporu proliferace periferních monocytů u savců.
2. Použití monocytárního růstového faktoru CD137 nebo jeho funkčního analoga k přípravě léčiva pro léčení stavu, který je spojen s poruchou buněčného systému, zahrnujícího monocyty a/nebo buňky z nich odvozené a/nebo jejich progenitory a/nebo prekursory; nebo jejichž vznik a/nebo průběh je léčitelný podporou proliferace buněk tohoto buněčného systému.
3. Použití podle nároku 2, kde porucha buněčného systému zahrnuje pokles počtu nebo funkční poruchu periferních monocytů a/nebo buněk z nich odvozených.
4. Použití podle nároku 2 pro léčbu stavů spojených s nedostatečnou imunitní odpovědí.
5. Použití podle nároků 2 až 4, kde stav je vybrán z
a) poškození hematopoetického systému v důsledku chemoterapie nebo radioterapie;
b) poruchy hojení ran;
c) onkóz;
d) bakteriálních nebo virových infekcí nebo mykóz;
e) dědičné nebo nedědičné, získané nebo nezískané poruchy nebo stavu imunitního systému;
f) poškození způsobeného léčbou imunosupresivy.
6. Použití podle jednoho z předchozích nároků, kde je prováděna léčba in vivo nebo ex vivo.
7. Použití podle jednoho z předchozích nároků, kde je CD137 nebo jeho funkční analog využit v kombinaci s nejméně jedním ·· » · ·· ·· ·· dalším faktorem, který je zvolen z interleukinů, lymfokinů, monokinů, interferonů, faktorů stimulujích kolonie a růstových faktorů.
8. Použití podle nároku 7, kde dalším faktorem je leukocyty stimulující faktor.
9· * « · · · • · · ·· ···· analog v expresovatelné formě.
9. Použití podle nároku 8, kde faktor je zvolen z G-CSF, GM-CSF a M-CSF.
10. Použití podle jednoho z předchozích nároků, kde je CD137 nebo jeho funkční analog využit v imobilizované formě nebo jako multimerní agregát.
11. Použití podle nároku 10, kde multimerní agregát CD137 zahrnuje dvě až pět molekul proteinu CD137 nebo jejich funkčního analoga.
<L2. Použití podle nároků 10 nebo 11, kde je použita extracelulární část lidského CD137 odpovídající aminokyselinám +18 až +186 podle obr.
IA nebo jeho funkčního analoga schopného vazby na monocyty.
13. Způsob in vitro pro podporu proliferace periferních monocytů, vyznačující se tím, že periferní monocyty z krve savce se uvádějí do kontaktu s CD137 v nutričním mediu a inkubují až se zvýši počet a/nebo velikost monocytů.
14. Způsob pro regenerační léčbu pacientů léčených chemoterapií nebo radioterapií, vyznačující se t i m, že
a) frakce krve obsahující periferní monocyty se izoluje z krve pacienta předtím, než se uskuteční chemoterapie nebo radioterapie, tato je inkubována ex vivo s CD137 až se zvýší počet a/nebo velikost monocytů a takto ošetřená frakce krve se podá pacientovi po skončení léčby; nebo
b) účinné množství multimerního agregátu CD137 se podá pacientovi před, v průběhu nebo po skončení chemoterapie nebo radioterapie, aby se podpořila proliferace endogenních periferních monocytů.
15. Způsob pro podporu endogenní nespecifické imunitní obrany, vyznačuj ícíse tím, že se pacientovi podá množství CD137 nebo jeho funkčního analoga podporující proliferací periferních monocytů.
16. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že pacientem je pacient s tumorem, trpící poruchou hojení ran, bakteriální nebo virovou nebo mykotickou infekcí, dědičnou nebo nedědičnou, získanou nebo nezískanou poruchou imunitního systému nebo poškozením způsobeným léčbou imunosupresivy.
17. Způsob podle jednoho z nároků 14 až 16, vyznačuj ící se tím, že multimerní agregát CD137 zahrnuje dvě až pět molekul proteinu CD137 nebo jejich funkčního analoga.
18. Způsob podle jednoho z nároků 14 až 17, v y z n a č u jící se tím, že se použije extrácelulární část lidského CD137 odpovídající aminokyselinám +18 až +186 podle obr. IA nebo jeho funkčního analoga schopného vazby na monocyty.
19. Použití sekvence nukleotidů kódující pro CD137 nebo jeho funkční analog pro přípravu přípravku genové terapie pro léčbu jedné z poruch definovaných v jednom z nároků 2 až 5.
20. Přípravek genové terapie, vyznačující se tím, že zahrnuje buněčný substrát, do kterého je včleněna sekvence nukleotidů kódující pro CD137 nebo pro jeho funkční i
·» «ο
21. Způsob genové terapie pro léčbu jedné z poruch definova ných v jednom z nároků 2 až 5,vyznačuj ící se tím, že přípravek genové terapie podle nároku 20 se podává pacientovi.
CZ20003238A 1998-07-15 1999-03-05 Pouľití CD137 pro podporu proliferace periferních monocytů CZ20003238A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98103859 1998-07-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20003238A3 true CZ20003238A3 (cs) 2001-10-17

Family

ID=8231533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003238A CZ20003238A3 (cs) 1998-07-15 1999-03-05 Pouľití CD137 pro podporu proliferace periferních monocytů

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6627200B1 (cs)
EP (1) EP1059931B1 (cs)
JP (1) JP2003521439A (cs)
KR (1) KR20010041624A (cs)
AT (1) ATE228371T1 (cs)
AU (1) AU747063B2 (cs)
BR (1) BR9908518A (cs)
CA (1) CA2322684A1 (cs)
CZ (1) CZ20003238A3 (cs)
DE (1) DE59903541D1 (cs)
DK (1) DK1059931T3 (cs)
EE (1) EE200000510A (cs)
ES (1) ES2188140T3 (cs)
HU (1) HUP0102046A3 (cs)
IS (1) IS1986B (cs)
NO (1) NO20004393L (cs)
NZ (1) NZ506695A (cs)
PL (1) PL343427A1 (cs)
PT (1) PT1059931E (cs)
SI (1) SI1059931T1 (cs)
WO (1) WO1999044629A2 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050232896A1 (en) * 2001-10-04 2005-10-20 Herbert Schwarz Cd137 as a proliferation factor for hematopoietic stem cells
PL376536A1 (pl) * 2002-08-28 2006-01-09 Immunex Corporation Kompozycje i sposoby leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego
AU2003290059A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-09 Herbert Schwarz Use of cd137 antagonists for the treatment of tumors
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
WO2012043651A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 国立大学法人 熊本大学 ミエロイド系血液細胞の製造方法
EP2981334A4 (en) * 2013-04-03 2016-11-23 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING VIRAL ACTIVITY

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03145499A (ja) * 1989-10-31 1991-06-20 Nippon Kosei Butsushitsu Gakujiyutsu Kiyougikai ヒト単球成長因子
DE4222980A1 (de) 1992-07-13 1994-01-20 Cassella Ag Verwendung von 2-(N-(2-Aminoethyl)amino)-essigsäure-derivaten
US5674704A (en) * 1993-05-07 1997-10-07 Immunex Corporation Cytokine designated 4-IBB ligand
CA2172165C (en) * 1993-09-16 2003-12-02 Byoung S. Kwon Human receptor h4-1bb
CA2108401A1 (en) * 1993-09-27 1995-03-28 Martin Lotz Receptor induced by lymphocyte activation in imflammatory response

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0102046A3 (en) 2006-02-28
HUP0102046A2 (hu) 2001-10-28
ATE228371T1 (de) 2002-12-15
WO1999044629A2 (de) 1999-09-10
EP1059931B1 (de) 2002-11-27
NO20004393L (no) 2000-10-31
DE59903541D1 (de) 2003-01-09
DK1059931T3 (da) 2003-03-24
EE200000510A (et) 2002-02-15
SI1059931T1 (en) 2003-04-30
IS1986B (is) 2005-02-15
KR20010041624A (ko) 2001-05-25
EP1059931A2 (de) 2000-12-20
JP2003521439A (ja) 2003-07-15
NZ506695A (en) 2005-01-28
AU747063B2 (en) 2002-05-09
PT1059931E (pt) 2003-04-30
CA2322684A1 (en) 1999-09-10
PL343427A1 (en) 2001-08-13
ES2188140T3 (es) 2003-06-16
NO20004393D0 (no) 2000-09-04
WO1999044629A3 (de) 2000-01-06
AU2932499A (en) 1999-09-20
IS5613A (is) 2000-08-30
US6627200B1 (en) 2003-09-30
BR9908518A (pt) 2000-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11492384B2 (en) Fusion protein comprising IL-2 protein and CD80 protein, and use thereof
EP0760602B1 (en) Use of fas ligand to suppress lymphocyte-mediated immune responses
KR101554056B1 (ko) 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방 및 조절 ｔ세포의 형성을 위한 수단
EP0584558B1 (en) A composition for suppressing infection and growth of human immunodeficiency virus using an iron-binding protein
JPH10508853A (ja) Ｂｄｎｆ及びｎｔ−３と水溶性ポリマーの結合体
US8071716B2 (en) Thymus-specific protein
JP2010509181A (ja) 融合ポリペプチドを細胞へ輸送する方法
JP2002512006A (ja) ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である成熟ＦＬＩＮＴ（ｍＦＬＩＮＴ）ポリペプチド、または、ＯＰＧ３の治療上の適用
KR20110014142A (ko) 단구로부터 수상 세포양 분화를 유도하여, 항암 면역 활성을 높이는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물
CZ20003238A3 (cs) Pouľití CD137 pro podporu proliferace periferních monocytů
KR20010043088A (ko) 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도
MXPA00008633A (en) Utilization of cd137 in order to promote the proliferation of peripheral monocytes
Youn The immunomodulatory effects of metallothionein on mammalian cellular immunity
JPH11349488A (ja) クラスタリンを含有する免疫抑制剤
US20050096272A1 (en) Therapeutic method for solid tumors using M161Ag