KR20010041624A - 말초 단핵구의 증식을 촉진하는 ｃｄ１３７의 용도 - Google Patents

말초 단핵구의 증식을 촉진하는 ｃｄ１３７의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유 동물의 말초 단핵구 증식 촉진용 약제를 생산하기 위한 단핵구 성장 인자 CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상이한 병리학적 상태를 치료하기 위한 상기 성장 인자의 용도에 관한 것이다.

Description

말초 단핵구의 증식을 촉진하는 ＣＤ１３７의 용도{UTILIZATION OF CD137 IN ORDER TO PROMOTE THE PROLIFERATION OF PERIPHERAL MONOCYTES}
혈액의 말초 단핵구와, 체강 및 조직에서 단핵구로부터 생긴 대식 세포는 신체의 단핵 식세포계의 구성성분이다. 특히, 단핵구 및 대식 세포는 신체의 비특이적 면역 방어계의 효과기 세포이다. 단핵구는 골수내 조혈 간세포로부터 다수의 중간 단계를 거쳐 형성된다. 단핵구는 약 20 내지 30 시간 동안 혈액내를 순환한다. 이로부터, 단핵구는 각종 기관 및 조직계로 이동하고, 부위 특이적 대식 세포로 발육된다. 여기서, 주변 조직은 단핵구에 대해 조형적인 영향을 미치고, 추가의 기능을 형성한다. 따라서, 예컨대 폐 대식 세포(폐포 대식 세포), 복강 대식 세포(복막 대식 세포), 비장 대식 세포(비성 대식 세포), 간 대식 세포(쿠퍼 세포), 관절 대식 세포, 뼈 대식 세포(파골 세포), 연결 조직 대식 세포, 뇌 대식 세포 및 신장 대식 세포와 같이 조직형에 따라 분화된다.
단핵구 및 대식 세포는 체내에서 발생하는 염증 반응 상황하에서 중요한 위치를 차지한다. 비염증형 조직에서, 대식 세포의 목적은 노후화된 세포를 제거하는 것이다. 또한, 단핵구 및 대식 세포는 면역계내에서 정보 전달에 중요한 다수의 가용성 인자를 산출한다. 그러나, 세포가 염증 과정에 연루된 경우, 이들은 상당히 변형된 표현형 및 기능 특성을 보유하는 활성화된 상태로 존재한다. 이 경우, 단핵구 및 대식 세포는 질병의 경과에 영향을 주는 중요한 효과기 기능을 발휘한다. 이러한 기능으로는 미생물, 면역 복합체 및 손상된 세포의 식세포 용해 및 세포내 파괴 뿐 아니라, 종양 세포, 기생충 및 바이러스 감염 세포에 대한 항체 의존성 세포 독성 반응 및 항체 독립성 세포 독성 반응이 있다. 나아가, 단핵구 및 대식 세포는 면역 반응의 유도 및 조절에 매우 중요하다. 즉, 단핵구 및 대식 세포는 분비성인 고도의 활성 세포로서, 시토킨의 방출 증가로 면역 반응에 영향을 준다.
CD137은 종양 괴사 인자 수용체 계열의 구성원으로서, ILA 또는 4-1BB(마우스 유래의 상동체)라는 명칭으로 알려져 있다(Kwon B.S. 등, Proc Natl Acad Sci USA 86:1963, 1989; Schwarz H 등, Gene 134:295, 1993; Alderson M.R. 등, Eur J Immunol 24:2219, 1994). CD137은 활성화된 림프구 및 단핵구에 의해 발현되는데, 1차 세포에 의한 발현은 활성화에 좌우된다(Schwarz H. 등, Blood 85:1043, 1995). CD137 발현은, 예컨대 (PHA) 또는 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA) 식물성 적혈구 응집소로 T 림프구를 활성화시켜 신속하게 유도할 수 있다. 단핵구에서, CD137은 리포다당류(LPS), IL-1β 및 PMA로 활성화시켜 유도할 수 있다. B 림프구에서, CD137 발현은 세포 표면 면역글로불린 또는 TMA에 대한 항체로 유도하거나, 또는 EBV(엡스타인 바르 바이러스)를 이용한 형질전환으로 유도한다. 비림프구양 세포(예, 특히 연골 세포)에서, CD137은 염증전 반응성 시토킨 IL-1β로 강력하게 유도할 수 있다. CD137의 가용성 형태는 차등 스플라이싱으로 생성하고, 류마티스양 관절염에 걸린 환자의 혈청에서 상승된 농도로 검출할 수 있다(Michel J. 등, Eur J Immunol 28:290, 1998). 인간 CD137에 대한 유전자는 관련 유전자 클러스터내 염색체 1p36에 위치한다(Schwarz H. 등, Biochem Biophys Res Com 235:699, 1997).
고정된 형태에서 단핵구의 활성화를 유발하는 재조합 CD137 단백질이 알려져 있다. 활성화 결과 염증전 반응성 시토킨의 발현이 증가되고, 소염성 시토킨 IL-10이 억제되며, ICAM과 같은 활성화 마커가 유도된다(Langstein J. 등, J.Immunol 160-2488, 1998). 단핵구에 대한 생명 연장 또는 증식 촉진 작용은 개시되어 있지 않다.
이미 언급한 바와 같이, 단핵구는 면역 반응에서 중요한 기능을 하며, 종양 및 병원체에 대한 이로운 면역 반응 생성에 필수적으로 중요하다. 시그널, 예컨대 시토킨에서 유래한 시그널에 유인되어, 단핵구는 혈액을 순환하다가 염증 부위로 이동한다. 단핵구 및 대식 세포의 축적은 만성 염증의 특징적인 성질이다. 이러한 축적은 시토킨에 의해 추가로 촉진되는데, 예컨대 대식 세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨 3(IL-3)과 같은 시토킨은 염증 부위에서 방출되어, 단핵구 및 대식 세포의 생존에 바람직한 영향을 준다(Young D.A., J Immunol 145:607, 1990; Xing Z. 등, Am J Respir Cell Mol Biol 6:212, 1992; Bratton, D.L. 등, J Clin Invest 95:211, 1995).
지금까지, 말초 단핵구 및 대식 세포는 증식, 즉 복제할 수 없다고 추정되었다(참고, Xing Z. 등, 상기 문헌; van Furth, R. 등, Blood 54-485, 1979).
상기 세부 설명으로부터, 미생물, 면역 복합체 및 손상된 세포의 식세포 용해와 세포내 파괴 뿐 아니라 종양 세포, 미생물 및 이로 인해 감염된 세포에 대한 개선된 항체 의존성 세포독성 반응 또는 항체 독립성 세포독성 반응이 단핵구/대식 세포의 복제에 의해 생성될 수 있다면, 여러 질병, 예컨대 종양, 박테리아, 진균류 또는 바이러스에 의한 감염 치료는 현저히 개선될 수 있음은 명백하다.
또한, 치료의 각종 처치 형태, 예컨대 암환자의 화학 치료 또는 방사선 치료와 면역 억제제 투여는 단핵구 및 대식 세포의 수를 급격히 감소시킨다는 것이 알려져 있다. 이러한 유형의 치료 절차가 종결된 후에, 일반적으로 단핵구/대식 세포의 수가 다시 정상 범위 값으로 증가하여 환자의 면역계를 다시 안정화시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 말초 단핵구의 증식을 촉진하는 단핵구 성장 인자 CD137의 용도와, 특히 CD137의 증식 촉진 작용에 의해 신규 방식으로 치료가능한 각종 질병 상태의 치료용 CD137의 용도에 관한 것이다.
도 1a는 cDNA 서열 및 이로부터 유도된 인간 CD137의 아미노산 서열을 도시한다. 각 경우에 시그널 펩티드(위치 +1 내지 +17) 및 경막 도메인(위치 +187 내지 213)은 밑줄로 표시된다. 유효 글리코실화 부위는 별표로 표시되어 있다. 유효 인산화 부위(단백질 키나아제 C의 경우 위치 +242; 카제인 키나아제 II의 경우 +234 및 +235)가 제시되어 있다. 폴리아데닐화 시그널은 굵은 글씨로 도시되어 있다; 도 1b는 인간 및 쥐 CD137의 아미노산 서열 정렬이다. 동일한 아미노산은 수직선으로 도시되어 있고, 유사성이 높은 아미노산은 콜론으로, 유사성이 낮은 아미노산은 종지점으로, 유사성이 없는 아미노산은 공란으로 도시되어 있다.
도 2는 CD137에 의한 단핵구 고사의 유도를 도시한다.
도 3a는3H-티미딘을 혼입시켜 고정된 CD137-Fc 단백질에 의한 말초 단핵구의 증식 유도를 도시한다; 도 3b는 단핵구의 CD137-유도형 콜로니 형성을 도시한다.
도 4는 CD137로 유도되는 단핵구 증식에 대한 M-CSF 및 GM-CSF의 효과를 도시한다. 도 4a M-CSF, GM-CSF 및/또는 IL-3에 대한 중화 항체의 부재 또는 존재하에 고정된 Fc 또는 CD137-Fc 단백질에서 말초 단핵구 배양; 도 4b 단핵구의 증식이 M-CSF 및 GM-CSF에 의해 유도되지 않는다; 각 경우3H-티미딘 흡수가 도시되어 있다.
도 5는 CD137-Fc 단백질과 함께 배양된 세포 배양물의 조정된 상청액에 의한 (A) 단핵구의 성장 및 (B) 단핵구의 증식 유도를 도시한다.
도 6은 가용성 CD137-Fc(sCD137-Fc) 및 고정된 CD137-Fc에 의한 단핵구 증식 유도를 비교한다; 대조군으로서, 고정된 Fc, 가용성 Fc(sFc) 및 미처리 지지체가 도시되어 있다.
도 7은 Fc, CD137-Fc, TNFR-Fc 및 항CD68을 이용한 단핵구의 증식 유도 실험을 도시한다.
도 8은 LPS 또는 M-CSF와 조합된 Fc(백색 막대) 또는 CD137-Fc(흑색 막대)를 사용한 단핵구 증식 유도 실험을 도시한다.
도 9a는 고정된 Fc 또는 CD137-Fc에서 배양된 말초 단핵구의 사진(400배 확대)이고, 도 9b는 10일 동안 고정된 CD137-Fc에서 배양한 후의 말초 단핵구 사진(500배 확대)을 도시한다.
도 10은 그래프의 좌측 1/2에는 고정된 Fc(백색 막대) 또는 고정된 CD137-Fc(흑색 막대)에서 1 내지 8일 후에 단핵구에 의한 M-CSF의 발현이 도시되어 있고, 그래프의 우측 1/2에는 배양 8일 후 가용성 Fc 또는 가용성 CD137-Fc의 존재하에 M-CSF의 발현이 도시되어 있다.
도 11은 M-CSF의 중화 후에 살아있는 단핵구의 수를 도시한다; 중화 항M-CSF 항체의 첨가 없이(밝은 표시) 또는 중화 항M-CSF 항체 2 ㎍/㎖ 첨가 후에(흑색 표시), Fc(원) 또는 CD137-Fc(사각형) 또는 M-CSF 100 ng/㎖(삼각형)로 처리한 살아있는 단핵구 수가 제시되어 있다.
도 12는 가용성 또는 고정된 Fc 또는 CD137-Fc 단백질(각 경우 1 ㎍/㎖)의 존재하에 배양한 지 8일 후의 300배 확대한 단핵구를 도시한다.
바람직한 양태의 상세한 설명
인간 CD137의 분리, 서열 결정 및 특성 규명은 본원에서 참고로 인용한 Schwarz H 등의 문헌[Gene(1993), 134, 295]에 처음 개시되었다.
언급한 바와 같이 본 발명은 CD137 및 이의 "기능 유사체"의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 범위내에 있는 기능 유사체는, 특히 CD137의 변형체, 유도체, 가용성 형태 및 다량체 형태로서, CD137의 천연 형태와 다름에도 불구하고 본 발명의 소정의 생물학적 활성을 갖고 있어 상기 목적에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 기능 유사체는 표적 세포, 즉 말초 단핵구에 결합하는 능력도 갖고 있어 이러한 방식으로 단핵구 증식을 유도할 수 있다.
CD137 변형체로는 도 1a에 도시된 서열로부터 출발하여, 예컨대 1 이상의 아미노산을 치환, 결실, 첨가, 삽입 및/또는 역위시켜 얻을 수 있는 단백질이 있다.
본 발명의 CD137의 변형체는 도 1a에 도시된 아미노산 서열과 약 60∼100%, 예컨대 약 80∼100% 일치한다. 천연 아미노산 서열의 변형은 공지된 방법, 예컨대 뉴클레오티드 서열에 있어서 해당 뉴클레오티드 돌연변이로 생성할 수 있다. 따라서, 다음은 서로 치환가능하다: 유사한 지방족 라디칼을 갖는 아미노산, 예컨대 이소로이신, 발린, 로이신 및 알라닌; 유사한 극성 측쇄기를 갖는 라디칼, 예컨대 리신 및 아르기닌; 글루타민 및 아스파라긴, 또는 글루탐산 및 아스파르트산.
또한, 기능 유사체는 CD137의 글리코실화되지 않은 형태 또는 상이하게 글리코실화된 형태를 포함한다. 글리코실화 패턴은, 예컨대 CD137의 재조합체 제조시 특정 발현계를 선택하여 영향을 줄 수 있다. 나아가, 유효 N-글리코실화 부위의 영역에서 아미노산 서열이 특이적으로 변형되어 글리코실화가 더 이상 일어나지 않을 가능성이 존재한다.
또한, 기능 유사체로는 CD137의 자연 발생적 변형체를 포함하는데, 이 변형체는 CD137을 단백질 분해로 절단하거나 기존의 방식과 다른 mRNA 스플라이싱으로써 얻을 수 있으며, 동시에 N 말단 또는 C 말단 절두된 아미노산 서열을 보유할 수 있다. 또한, 변형체는 소정의 생물학적 기능에 중요하지 않은 말단 또는 내부 아미노산 또는 아미노산 부분 서열을 특이적으로 결실시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 시스테인 라디칼을 특이적으로 결실 또는 치환시켜 잘못된 분자내 이황화가교의 형성을 피할 수 있다.
CD137의 유도체는 화학적 변형 또는 효소적 변형으로 아미노산 라디칼의 기능적 측쇄기를 통해 결합된 하나 이상의 화학적 라디칼을 포함할 수 있다.
CD137의 유도체는 아미노산 측쇄 또는 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 있는 작용기의 유도체화로 얻는다. 예를 들어, 글리코실기, 아실기, 지질 라디칼, 인산염기, 중합체 라디칼, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 측쇄 등을 당업계에 공지된 방법으로 도입할 수 있다.
유도체의 특정 형태는 또 다른 아미노산 서열과의 N 말단 결합 또는 C 말단 결합 형태이다. 이러한 형태의 융합 단백질은 화학적 방식 및 재조합 방식으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 유사체는 또한 CD137의 가용성 형태를 포함한다. 이들은 완전한 형태 또는 부분 형태로 단백질의 세포외 도메인을 포함하지만, 경막 도메인은 부분적으로 또는 완전히 결실되어 있다. 또한, 이들 형태는 세포질, C 말단 서열 부분을 보유하지 않는다. 본 발명에 따르면, 가용성 형태의 CD137은 생체내 용도로 특히 유용한데, 그 이유는 결과적으로, 예컨대 약학 제제의 정맥내 투여가 현저하게 간단해지기 때문이다. 바람직한 CD137의 가용성 형태는 도 1a에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 +18 내지 +186의 폴리펩티드이다. 가용성 기능 단편 또는 불용성 기능 단편의 형태로 존재하는 기타 유사체, 즉 천연 CD 137의 부분 서열 또는 조합 부분 서열도 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 CD137의 가용성 형태는 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절히 절두된 DNA 단편으로부터 재조합체의 제조가 가능하다. 또한, 특이적 프로테아제 분해로 절두된 CD137 형태를 제조할 가능성이 있다.
또한, 본 발명에 따라 사용할 수 있는 도 1a에 명백하게 도시된 폴리펩티드에 대한 기능 유사체는 기능 등가 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 이들 폴리펩티드는 기타 포유류로부터 또는 동일한 포유류의 다른 세포계로부터 분리할 수 있다. 이러한 의미에서 기능 등가체는, 예컨대 마우스에서 분리되고 미국 특허 명세서 5,674,704호에 개시된 4-1BB라는 명칭의 인자와, 이로부터 유도된 기능 유사체, 예컨대 단편이다.
전술한 CD137 및 이의 기능 유사체는 단량체 형태 및 다량체 형태로 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
단량체 형태로 사용하기 위해서, 단백질의 고정이 특히 편리하다. 이 경우 고정은 공지된 방법으로 담체 매트릭스에서 수행할 수 있다. 담체 매트릭스는, 예컨대 단핵구 함유 세포계를 배양할 수 있는 배양 용기의 표면일 수 있다. 추가의 적절한 담체 매트릭스는, 예컨대 단핵구 함유 세포계에서 현탁가능한 중합체 입자일 수 있다.
단위 면적 당 고정된 분자의 최적 수는 일부 예비 실험으로 당업자들이 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 1cm2당 CD137 분자 또는 이의 기능 유사체 대략 1011내지 1017, 특히 대략 1013내지 1014, 예컨대 대략 6 ×1013일 수 있다.
고정된 CD137 분자의 소정의 생물학적 활성이 역효과를 주지 않거나, 또는 결과적으로 중요하지 않은 역효과만을 제공한다면, 당업자들에게 공지된 임의의 종래 방법으로 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 작용기를 통해 결합된 2작용성 연결기 분자를 사용하여 담체에 공유 결합시키거나, 또는 담체상에 분자를 흡착시켜 고정시킬 수 있다. 이 경우, 예를 들어 아미드, 디아조, 이소티오시아네이트 또는 이황화가교를 연결기 및 CD137 사이에 형성시킬 수 있다(예를 들어, Vitetta 등의 문헌, 1987, Science 238, 1098; Pastan 등, 1986, Cell, 47, 641; 또는 Thorpe 등 1987, Cancer Res. 47, 5924).
고정의 추가 가능성은, 예컨대 CHO 세포와 같이 CD137 암호화 DNA로 형질전환시킨 세포 표면 상에 CD137의 발현에 있다.
고정을 용이하게 하기 위해서 CD137 아미노산 서열을 특이적으로 변형시킬 가능성이 추가로 존재한다. 이러한 유형의 변형체로는, 예컨대 헥사히스티딘 앵커로서 알려진 변형체와 같은 앵커로서 기능하는 소위 말하는 "태그", 또는 항체가 항원으로 인지할 수 있는 에피토프가 있다(예컨대 Harlow E. 및 Lane D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). 이들 앵커는 예컨대 크로마토크래피 컬럼, 미량역가 평판 또는 배양 용기에 존재할 수 있는 중합체 매트릭스와 같은 고체 지지체에 CD137을 부착하는 기능을 할 수 있다.
고정에 적절한 CD137의 기능 유사체의 특히 적절한 양태는 CD137의 세포외 도메인과 IgG 분자의 Fc 부분으로부터의 융합 단백질이다. 이러한 유형의 융합 분자는 단백질 A 또는 항Fc 항체가 결합된 지지체상에 고정시키는 것이 특히 유용할 수 있다. CD137-Fc 제조는 본원에서 참고로 인용한 Schwarz H. 등의 문헌[Blood, 87, 7 (1996), 2839-2845]에 개시되어 있다.
본 발명에 따라 사용할 수 있는 CD137의 다량체 응집체는 2 내지 5개의 CD137 분자 또는 이의 기능 유사체를 포함하는 것이 바람직하다. 개별적인 펩티드 분자의 집합은 단핵구에 대한 각 펩티드의 결합이 방해되지 않도록 발생한다. 바람직하게는, 다량체 CD137 응집체는 CD137의 세포외 도메인과 IgG 분자의 Fc 부분을 포함하는 상기 융합 분자로부터 제조한다. 이량체화는, 예컨대 항Fc 항체와 가교시켜 수행할 수 있다. CD137의 이량체 응집체는 이러한 방식으로 얻는다. 또한, 2개의 융합 단백질 분자의 Fc 부분 사이의 이황화가교의 형성으로 이량체화시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 말단 설프히드릴기, 예컨대 디티오비스(숙신이미딜)프로피오네이트, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 또는 반응성 카르보디이미드, 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드를 보유하는 이작용성 화학적 연결기를 사용하여 이량체화할 수 있다.
5개의 CD137 단위체를 보유하는 분자와 같은 고급 단량체는 5량체 IgM 분자의 Fc 부분과 CD137의 세포외 도메인으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 제1 목적은, 적절한 경우, 포유류의 선조세포 및/또는 전구 세포(하기 참조)의 말초 단핵구의 증식을 촉진하는 약제를 제조하기 위한 활성화된 T 림프구에 의해 생산되는 단핵구 증식 인자라고 명명된 세포 표면 단백질 CD137 또는 이의 기능 유사체의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 단핵구 증식의 "촉진"이란 증식하지 않는 단핵구의 증식을 유도하고 이미 증식하고 있는 단핵구의 증식을 추가로 보조하는 것이다.
말초 단핵구는 말초 혈액계의 구성성분이며, 생리학적 조건하에 혈액 1 ㎕ 당 성인의 경우 80 내지 540 세포의 농도, 어린이의 경우 80 내지 720 세포의 농도로 포함되어 있다.
공지된 바와 같이, 모든 종류의 질병 상태는 단핵구 및/또는 이로부터 유도된 세포, 구체적으로 상이한 조직 특이성의 대식 세포(상기 참조)의 수 감소와 관련이 있다. 단핵구와 이로부터 유도된 세포의 공지된 생리학적 기능 때문에, 더 낮은 생리학적 범위의 값에서 더 높은 생리학적 범위의 값으로 단핵구 수가 증가하면 증식 증가의 결과로서 치료적 측면에서 유리하다는 결론을 내릴 수 있다. 또한, 단핵구의 인공적 유도 결과(혈액내 단핵구 수가 혈액 1 ㎕당 540 세포 이상의 값으로 증가), 체내 단핵구 방어계는 감염에 대한 방어 과정에서 지원을 받는 것으로 생각할 수 있다.
본 발명의 제2목적은 단핵구 및/또는 이로부터 유도된 세포 및/또는 선조, 및/또는 이의 전구체, 특히 단핵구 및/또는 이로부터 유도된 세포, 예컨대 대식 세포를 포함하는 세포계의 장애와 관련되거나; 또는 이의 형성 및/또는 경과가 세포계의 세포의 증식을 촉진하여 치료가능한 증상을 치료하는 약제의 제조에 있어서 CD137 또는 이의 기능 유사체의 용도에 관한 것이다(본원에서 참고로 인용한 유전자 요법의 개념에 있어서 조혈계의 계략도, (1997) Verlag Walter de Gruyter Berlin, Strauss, M., and Barranger, J.A. (Ed.), p236, 표 12.1 참조).
상기 의미에서 장애는, 관련 신체 세포의 하나 이상의 생리학적 기능이 선천적 또는 후천적, 영구적 또는 일시적, 부분적 또는 완전하게 손상된 것을 포함한다.
이러한 세포계의 예로는, 소위 말하는 골수종 세포계로서, 이의 세포는 골수 유래의 선조 세포에서 유도된다. 이러한 계의 전형적인 구성 성분은 과립구 및 단핵구이다.
특히, 본 발명은 언급한 질병이 기능 장애, 또는 혈액 1 ㎕ 당 80 세포 농도 이하의 단핵구 수 감소 및/또는 이로부터 유도된 세포수 감소를 포함하는 경우 이용한다.
CD137의 바람직한 제1 적용 분야는 화학치료 또는 방사선 치료와 관련된 조혈계의 손상으로부터 선택된 본 발명에 따른 증상이다. 화학 치료 및 방사선 치료는 모든 종류의 종양증 치료나, 또는 골수억제 또는 골수제거 치료하에서 골수 또는 기관 이식체 제조를 위해서 종종 수행된다. 백혈구 감소증 및 이와 관련된 단핵구의 수 감소가 종종 결과로서 발생한다. 감염에 대한 감수성 증가로 인하여 환자의 이환율 및 사망율이 상당히 증가한다. 백혈구 감소증은 본 발명에 따라 CD137 또는 CD137 처리된 단핵구를 투여하여 더욱 효과적으로 경감시키거나 또는 제거할 수 있다.
또 다른 응용 분야는 투석 환자 또는 당뇨병 환자 또는 만성 정맥성 기능부전 환자의 경우 관찰되는 상처 치유 장애의 치료에 있어서 CD137 및 이의 기능 유사체의 용도에 관한 것이다. 이 경우, 주로 대식 세포(즉 분화된 단핵구)로 구성되는, 불완전하게 존재하거나 기능하는 과립화 조직으로부터 생긴 상처 치유 장애가 있다.
본 발명의 추가의 목적은 부적당한 면역 반응과 관련된 증상 치료용 약제의 제조에 있어서 CD137 또는 이의 기능 유사체의 용도에 관한 것이다. 언급할 수 있는 이러한 유형의 증상의 예로는 다음과 같은 것들이 있다:
a) 내인성 방어계의 세포독성 활성이 부적당하거나 존재하지 않아 생기는 종양증,
b) 병원체 또는 이로 감염된 신체 세포의 식세포 용해가 부적절하거나 존재하지 않아 생기는 박테리아, 바이러스 및 진균류 감염,
c) 면역계에 대한 선천성 또는 비선천성, 후천성 또는 비후천성 손상 또는 증상; 및
d) 예컨대 만성 다발성 관절염 또는 자가면역 질병이 있는 환자나 이식 환자의 치료시 발생하는 면역 억제제 치료에 의해 유발되는 손상.
이하에서 더욱 명확하게 설명되겠지만, 본 발명에 의한 약제는 생체내(in- vivo) 또는 생체외(ex-vivo)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 구체예에 따르면, CD137 또는 이들의 기능적 유사체(functional analogue)는 예를 들어, 인터루킨, 림포카인, 모노카인, 인터페론, 콜로니-촉진 인자 및 성장 인자로부터 선택되는 하나 이상의 인자와 함께 사용될 수도 있다. 이밖에도 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, EGF, TGF, PDGF, ILGF, MGF, EPO, G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF가 있는데, 특히 G-CSF, GM-CSF 및 특히 M-CSF와 같은 백혈구 촉진 인자들이 바람직하다. 이때 CD137 및 추가의 인자는 동시에 사용되거나 또는 의도하는 시기에 순차적으로 투여될 수 있다.
괴사-억제 인자(apoptosis-inhibiting factors)와 함께 사용하는 것도 고려해 볼 수 있다. M-CSF는 단핵구 괴사 부위상에서 상기 형태의 억제 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 용도에 있어서, 근본적으로 인간 CD137은 그의 원형, 즉 도 1a의 서열내의 잔기 +18 내지 잔기 +255의 아미노산 서열 또는 상기 서열의 기능적 유사체 서열을 갖는 단백질로서 사용되기에 적합하다.
그러나, 바람직하게는 도 1a에 나타낸 아미노산 +18 내지 +186에 대응하는 인간 CD137 세포외 도메인 또는 이들의 기능적 유사체가 사용되는 것이 좋다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, CD137 또는 이의 기능적 유사 서열이 고정 형태 또는 다량체 응집체(multimeric aggregate)로서 사용된다.
바람직한 다량체 CD137 응집체는 2개 내지 5개의 CD137 단백질 분자 또는 이들의 기능적 유사체를 포함한다.
본 발명은 추가로 말초 단핵구, 즉 유리 상태의 CD137 또는 구체적으로 영양 배지에서 고정시킨후 상기 단핵구의 계수(count)가 바람직하게는 이의 최대치까지 증가되어 단핵구내에서 상기 계수의 증가를 관찰할 수 있을 정도까지 배양시킨 CD137과 접촉시킨 포유 동물의 혈액으로부터 수득된 말초 단핵구의 증식을 촉진하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
포유 동물의 혈액으로부터 단핵구를 분리하는 것은 일반적으로 관습화된 표준적인 방법에 따라서 수행될 수 있다. 이와 같이 분리된 세포 분획은 순수 단핵구 분획일 수 있거나 또는 상기 단핵구 치료에 악영향을 끼치지 않으며 자극을 준 단핵구로 포유 동물을 치료하여 수득된 세포를 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어 림프구는 시험관내 배양동안 단핵구와 함께 존재할 수 있다. 단핵구의 분리에 적합한 방법에 관하여는 예를 들어, Meyskens, F.L.외 다수 공저, Exp. Haematol. 1979, 7(8), 401-410 ; Weiner, R.S.외 다수 공저, J. Immunol. Methods, 1980, 36(2), 89-97; 및 Contreras, T.J.외 다수 공저, Cell. Immunol., 1980, 54(1), 215-229에 기술되어 있다.
생체내 또는 생체외 배양에 적합한 영양 배지의 예로서는 5% 소 태아 혈청으로 보강된 RPMI 배지를 들 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 배양을 완료한 후, 처리된 단핵구 분획을 예를 들어, PBS로 세척한후, 치료받는 포유 동물 세포에 다시 투여하는 것이 편리하다.
본 발명의 추가의 목적은
a) 화학 요법 또는 방사선 요법을 수행하기에 앞서서 환자의 혈액으로부터 말초 단핵구 함유 혈액 분획을 분리하고, 이 분획을 유리 CD137 또는 고정시킨 CD137과 함께 상기 단핵구 계수가 증가하거나 또는 상기 계수가 최적인 수준까지 도달되고 및/또는 단핵구 크기의 증가가 관찰되기 시작할 때까지 생체외에서 배양한 뒤, 이와 같이 처리된, 즉 바람직하게는 상기 단핵구로 보강된 혈액 분획을 상기 요법 수행 완료후 환자에 다시 투여하는 단계; 또는
b) 화학 요법 또는 방사성 요법 완료 이전, 상기 요법 수행 기간중 또는 상기 요법 완료후 유효량의 다량체 CD137 응집체를 환자에게 투여하여 내인성 말초 단핵구의 증식을 촉진시키는 단계를 포함하는, 화학 요법 또는 방사선 요법 환자의 재생 치료 과정(regenerative treatment process)에서 사용되는 CD137 또는 이의 기능적 유사체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 내인성 비특이적 면역 방어 체제를 촉진시키는 방법에서 사용되는 CD137 또는 이의 기능적 유사체의 용도에 관한 것으로서, 여기서 CD137 또는 이들의 기능적 유사체, 구체적으로 다량체 CD137 응집체는 말초 단핵구의 증식을 촉진하는 양만큼이 환자에 투여된다. 구체적으로 상기 방법은 종양 환자 및 세균성, 바이러스성 또는 진균성 감염으로 고통을 받고 있는 환자에 적용시키기에 적합하다.
이와 같은 방법에 있어서 유리하게 투여할 수 있는 다량체 CD137 응집체는 2개 내지 5개의 CD137 단백질 분자 또는 이들의 기능적 유사체를 포함한다.
도 1a에 나타낸 단핵구와 결합 가능한 아미노산 +18 내지 +186에 대응하는 인간 CD137의 세포외 구역 또는 이들의 기능적 유사체를 포함하는 유사체 또는 응집체의 투여가 특히 바람직하다.
생체내 투여에 있어서, 인간 CD137 또는 이들로부터 얻어진 유사체를 사용하는 것이 유용하다. CD137이 융합 단백질로서 투여되는 경우, CD137에 융합된 단백질은 인간으로부터 유래된 단백질과 유사하게 작용한다. 예를 들어, 이미 기타의 시토킨에 대해서 성공적으로 실용화되어 있는 PEG화(PEGylation)에 의하여 혈액내 CD137의 체류 시간을 개선시키는 방법도 고려해 볼 수 있다[EP-A-0 335 423에 기술되어 있는, G-CSF의 PEG화].
CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 구체적 투여량의 선택 및 구체적 투여 계획은 치료 담당의의 결정에 따른다. 담당의는 선택된 투여 경로, 특정 약제의 효능, 치료받을 상태의 특성 및 심각성, 환자의 상태 및 환자의 요법에 대한 반응에 의존적인 투여 계획은 적당한 투여량 및 이에 대응하는 투여 계획을 결정하게 될 것이다. 그러나, 적당한 투여량은 일반적으로 1일당 약 1 내지 20㎍/체중㎏ 또는 1일당 약 0.01 내지 1nmol/체중㎏의 범위이다.
혈액 용량에 기초하여, 치료 기간중의 CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 유효 농도는 혈액 1㎖당 약 0.01-10㎍이거나 또는 혈액 1㎖당 약 0.1pmol-0.5nmol의 범위내일 수 있다.
생체내 또는 생체외 투여에 있어서, CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 유효 농도는 배양액 1㎖당 약 0.1㎍이상일 수 있으며, 구체적으로는 배양액 1㎖당 약 1㎍이상, 예를 들어 배양액 1㎖당 약 50㎍이하일 수 있으며, 또는 배양액 1㎖당 약 0.1pmol이상, 구체적으로는 배양액 1㎖당 약 0.01nmol 이상, 예를 들어 배양액 1㎖당 약 2nmol이다.
CD137 및 이들의 기능적 유사체의 생체내 투여는 비경구적 방법, 구체적으로는 정맥내로 투여 가능한 액체 약제 조성물을 사용하여 수행되는 것이 유용하다. 이 경우, 유효량의 CD137 또는 이들의 기능적 유사체는 바람직하게는 용해된 상태로서 약제학상으로 허용 가능한 부형제중에 포함되는 것이 바람직하다. 적합한 약제 부형제의 예로서는, 구체적으로 예를 들어 생리 염 용액, 포스페이트 완충 염 용액, 링거 용액, 락테이트화 시킨 링거 용액등과 같은 수용액이다. 더욱이, 상기 조성물은 항산화제, 킬레이트제 또는 항미생물제와 같은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여 및 흡입에 의한 투여도 가능하다.
전신 치료를 필요로 하는 경우, 정맥내 투여가 특히 유용하다. 예를 들어 국부적으로 제한된 부위의 감염과 같은 국부적 상태의 치료에 있어서, 특정 부위의 피하 투여 또는 피내 투여도 유용할 수 있다. 국부 상처 치료에 있어서, 예를 들어 표면, 즉 피부를 통한 투여도 가능하다. 이는 용액, 현탁액, 연고 또는 겔 상태로 적용시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 약제 조성물내 CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 최적 농도는 사용된 CD137의 특이적 활성에 의해서 결정된다. 그러나, CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 적당한 중량비는 상기 조성물의 총중량을 기준으로 약 0.0001-1중량%, 구체적으로 0.0005-0.01중량%의 범위내이어야 한다. 예를 들어, 몰농도는 사용된 조성물 100g당 약 1nmol-0.1mmol, 구체적으로 약 15-300nmol의 범위내일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 정의한 상태중의 하나를 치료하기 위한 유전자 치료 조성물 생산용 CD137 또는 이들의 기능적 유사체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 용도에 관한 것이다.
상기 형태의 유전자 치료 조성물은 CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 암호화 뉴클레오티드 서열이 적당한 핵산 구성체에 발현 가능한 형태로 포함된 세포성 부형제, 구체적으로 말초 단핵구, 이들로부터 수득된 세포 또는 상기 단핵구의 조상 세포 또는 전구체를 포함한다 [본원에 참고 문헌으로서 포함되어 있는 Concepts of Gene Therapy(1997) Verlag Walter de Gruyter Berlin, Strauss, M., 및 Barranger, J.A.(Ed), p236, 도 12.1의 조혈계 개략도 참조].
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 정의된 상태중의 하나의 치료에 대한 유전자 치료 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 유전자 치료 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
이러한 목적으로, 상기 세포로의 유전자 이전은 예를 들어, 바이러스 구성체, 리포좀과 같은 비바이러스성 구성체 또는 기타 적당한 핵산 구조체의 도움을 받아 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있다 [Gunzburg, W.H.외 다수, Gentransfer in Saugerzellen, "Gene Transfer in Mammalian Cells" (1997) Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin; Baum, C. 외 다수, "Gene Transfer and Transgene Expression in Haematopoietic Cells", Concepts of Gene Therapy (1997), Verlag Walter de Gruyter Berlin, Strauss, M., 및 Barranger, J.A.(Ed), pp233-256 참조].
본 발명에 따라 사용될 수 있는 핵산 구성체는 예를 들어, 아데노 바이러스 벡터 또는 복제 결함 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터와 결합되거나 또는 아데노-관련 바이러스 벡터와 결찰될 수 있다.
추가의 유용한 결합 형태는 리포좀과 핵산 구성체의 복합체(complexation)이다. 리포펙션(Lipofection)시, 리포좀 현탁액을 초음파 처리시킴으로써 양이온성 지질로부터 작은 단일 박막 소포를 수득할 수 있다. DNA는 전체 전하가 양 의 상태를 유지할 정도의 비율로 정밀하게 상기 리포좀 표면에 이온 결합될 수 있으며 상기 DNA는 리포좀에 100% 복합화될 수 있다. DOTMA(1,2-디올레일옥시프로필-3-트리-메틸암모늄 브로마이드) 및 DOPE(디올레오일포스파티딜-에탄올아민)의 지질 혼합물에 더하여, 다수의 신규 지질 제형이 합성되어 이들의 다양한 세포군으로의 트랜스펙션 효능에 대하여 시험되어 오고 있다[Behr, J.P.외 다수(1989), Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 6982-6986; Felgner, J.H.외 다수(1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. ＆ Huang, L.(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285; Zhou, X.＆ Huang, L.(1994) Biochem. Biophys. Acta 1189, 195-203]. 상기 신규 지질 제형의 예로서는 DOTAP N-[1-(2,3-디올레오일-옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트 또는 DOGS(트랜스펙탐; 디옥타데실아미도글리실스퍼민)이 있다.
CD137 또는 이들의 기능적 유사체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 더하여, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 핵산 구성체는 프로모터, 증폭 시그널, 증폭제, 폴리아데닐화 서열, 복제원, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자등과 같은 하나 이상의 조절 서열에 기능적, 작동적으로 연결된 것을 포함한다. 의도하는 적용에 따라서, 상기 연결은 유전자 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
신규하게 도입된 조절 서열에 더하여, 천연 상태의 조절 서열이 실질적 구조 유전자의 앞에 존재할 수도 있다. 유전자 변형에 의하여, 이와 같은 천연 상태의 조절은 임의로 스위치-오프(switch-off)될 수 있으며 상기 유전자 발현이 증가될 수 있다. 그러나, 유전자 구성체는 더욱 간단하게 구성될 수도 있는데, 다시 말해서 구조 유전자 및 이를 조절하는 천연 상태의 프로모터의 앞부분에 부가적인 구조 시그널을 삽입시키지 않고 구성할 수 있는 것이다. 이 대신에, 조절이 더이상 이루어 지지 않고 유전자 발현이 증가되도록 천연 상태의 조절 서열이 돌연 변이된다. 부가의 유용한 조절 인자가 핵산 서열의 3' 말단에 삽입될 수도 있다. 상기 유전자 구성체 내에는 하나 이상의 복사본 형태로서 핵산 서열이 존재할 수 있다.
원칙적으로, 자신들의 조절 서열을 갖는 모든 천연 상태의 프로모터가 사용될 수 있다. 더욱이, 합성 프로모터의 경우일지라도 유용하게 사용될 수 있다. 조절 서열은 바람직하게는 핵산 서열의 특이적 발현을 가능하도록 만들어 준다.
본 발명에 따른 치료 형태의 추가의 변형은 CD137의 증식-촉진 작용을 감소시킴으로써 상기 CD137 요법을 임의로 더욱 최적화시킬 수 있는 CD137-특이적 항체 또는 기타 CD137 길항약에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 또한 이와 같은 목적으로 사용될 수 있으며, 당 업계에 공지된 방법으로 이용 가능하며 따라서 기타 CD137 길항약으로서 적합한 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 예를 들어, 일정 형태의 혈액암과 같은 단핵구 형성의 증가로서 수반되는 상태는 상기 형태의 CD137 길항약에 의해서 임의로 치료 가능하다.
지금부터 본 발명을 이하의 실시예들에 의하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 말초 단핵구 수와 이에 따른 대식 세포의 수를 특이적으로 증가시킬 수 있는 경로를 이용가능하게 하여 활성 단핵구/대식 세포의 부적절한 수와 관련된 질병 상태의 치료를 개선시키는 것이다.
상기 가정과는 대조적으로, 공지되어 있는 세포 표면 단백질 CD137 및 이의 기능 유사체가 조혈 간세포와 무관하게 말초 단핵구의 증식을 유도한다는 발견으로부터 본 발명의 목적을 달성할 수 있게 된 것은 놀라운 일이다. 이는 놀랍게도 CD137에 대한 다수의 신규 치료 용도 가능성을 나타낸다.
본 발명의 특정 양태는 첨부되는 도면과 관련하여 하기에 상세히 예시할 것이다.
시약
R＆D(Wiesbaden, Germany)사 제품 M-CSF 및 M-CSF에 대한 중화 항체, GM-CSF 및 IL-3를 사용하였다.
항-M-CSF: 클론 26730, 11, 마우스 하이브리도마의 복수액으로부터 수득한 단백질 A-분리성 IgG 분획.
항-GM-CSF: 클론 3209.1, 단클론 IgG1마우스 항체.
항-IL3: 마우스 하이브리도마의 복수액으로부터 수득한 단백질 A-분리성 IgG 분획.
인간 CD137의 세포외 도메인 및 인간 면역 글로불린 G1(Fc)의 불변성 도메인으로 구성된 Alexis(Grunberg, Germany)사 제품 재조합 CD137-Fc 단백질을 사용하였다.
인간 IgG2Fc 단백질로서는 Accurate Chemical and Scientific Corporation(Westbury, NY, USA)사 제품을 사용하였다.
참조 실시예 1: CD137-Fc의 고정
폴리스티렌 미세 적정 플레이트(Microtest III Tissue Culture Plates; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 PBS(포스페이트-완충 염 용액)내 CD137-Fc 단백질 용액 1㎍/㎕과 함께 4℃에서 밤새 배양시켰다. 웰(well) 당 상기 용액 50㎕를 사용하였다. 다음날 아침, 상기 단백질 용액을 제거한후 상기 플레이트를 PBS로 세척시켰다. Fc 고정도 이와 유사하게 수행하였다.
참조 실시예 2: ELISA
R＆D(Wiesbaden, Germany)사 제품 ELISA 키트 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 시험을 수행하였다. 시험을 3회 수행하여 시토킨 농도를 측정하였으며 평균치 ±표준 편차 정도로서 표현하였다.
참조 실시예 3: 단핵구 괴사의 측정
제조업자의 지시에 따라서 "세포 사멸 검출 ELISA(Cell Death Detection ELISA)" (Boehringer Mannheim, Germany)를 통하여 DNA 단편화를 측정하였다. 3회에 걸쳐 상기 측정을 수행하였다.
참조 실시예 4: 인간 단핵구의 분리 및 배양
인간의 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 건강한 개체의 연막(軟膜)으로부터 분리하였다. 이 경우, 상기 연막을 동일 2 부피의 PBS로 희석시켰다. 동일 부피의 Histopaque(Sigma, Deisenhofen, Germany)를 막으로 코팅시켰다. 상기 혼합물을 1200g에서 20분 동안 원심 분리시켰다. 백색층의 형태로 Percoll 격리 표면상에 농축 형성된(enriched) PBMC를 분리하였다. pH 7.4의 10mM EDTA, 10mM NaHCO3, 200mM NH4Cl 용액 2ml를 사용하여 2분 동안 실온에서 적혈구를 분해시켰다. 이후 상기 세포들을 PBS로 2회 세척시킨후 250g에서 펠렛화시키고 다시 5% 소 태아 혈청으로 보강된 RPMI 배양액에 재현탁시켰다. 이들로부터 용리 세척법(elutriation)에 의해서 1차 단핵구(primary monocyte)를 분리시켰다 [Andreesen, R.외 다수 공저, J Leukoc Biol 47:490, 1990]. 용리 세척된 단핵구는 순도 95% 정도로 순수하였으며 T 림프구의 함량은 3% 미만이었다 [형태학적 방법 및 항원 표현형 관찰, 즉 DC14, DC3, CD4 및 CD8의 발현 관찰을 통한 방법으로 측정]. 상기 세포들을 5% FCS로 보강된 RPMI 1640 배지가 존재하는 폴리스티렌 배양 접시(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 각각의 세포 농도로 배양시켰다.
참조 실시예 5: 세포 증식 측정
각각의 세포들의 증식을 측정함에 있어서, 독일 Boehringer Mannheim사 제품인 "In Situ Proliferation Kit"를 사용하였다. 8개의 챔버로 이루어진 챔버 캐리어(FALCON, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)에서 챔버당 3 ×105세포로 만든후 이들 세포를 배양시켰는데, 여기서 이들 세포를 Fc 또는 CD137-Fc 단백질로 코팅시킨후 10일 동안 배양시켰다. 60분 경과후 1-μM의 브로모데옥시우리딘(BrdU)을 가하였다. 첨가된 BrdU를 마우스 항-BrdU 및 양의 항-마우스 FITC로 염색시켜 시험 지침에 따라서 눈으로 확인할 수 있었다. 단핵구는 피코에리트린-표지된 항-CD14 항체(2㎍/ml; Immunotech, Marseille, France)를 통하여 동정되었다. 크로마틴을 5㎍/ml의 Hoechst 33342 (Sigma, Deisenhofen, Germany)으로 5분 동안 염색시켰다.
세포 콜로니의 증식은 96-홀의 미세 적정 플레이트에서 측정되었다. 홀당 105단핵구를 0.5μCi3H-티미딘으로 24시간 동안 펄스를 발생시킨후 수득하여 TopCount 마이크로플레이트 신칠레이션 카운터(Packard, Meriden, CT, USA)를 사용하여 결과치를 측정하였다. 각각의 배취를 3회 카운트하여 결과값을 평균값 ± 표준 편차의 방식으로 나타내었다.
실시예 1. CD137-Fc의 단핵세포에서의 괴사 유도
105개의 1차 단핵구를 CD137의 세포외 도메인 및 인간 면역 글로불린 G1(Fc)의 불변 도메인으로 구성된 융합 단백질로 미리 코팅시킨 조직 배양 디쉬에서 배양시켰다. 처리되지 않은 플레이트 및 Fc 단백질로 코팅된 플레이트를 대조구로 사용하였다. CD137-Fc 단백질로 코팅된 웰에서, 배양후 1일, 3일, 5일 및 7일이 경과하였을 때의 생존 단핵구의 수는 월등히 증가하였다(도 2의 절반 하부). 동일 배양액내 괴사 정도는 단편화된 DNA의 양으로 측정되었다(도 2의 절반 상부). 놀랍게도, CD137-Fc 단백질로 처리된 단핵구 배양액의 괴사 정도가 더욱 높았다. 3가지의 독립적인 실험으로부터 필적하는 결과를 얻었다.
실시예 2: CD137-Fc의 말초 단핵구의 증식 유도 및 상기 단핵구의 콜로니 형성
(a) CD137은 단핵구의 증식을 강력히 촉진시켰는데, 유사 유도성 괴사(likewise-induced apoptosis)를 통하여 세포 손실을 과잉 보상시켰다. 105단핵구를 Fc 또는 CD137-Fc 로 코팅시킨 96-홀 플레이트에서 배양시켰다. 0.5μCi3H-티미딘으로 24시간 동안 펄스를 발생시켜 매일 증식 정도를 측정하였다.3H-티미딘 결합 비율이 나타내는 바와 같이, CD137-Fc는 단핵구 증식을 강력히 촉진시켰다(도 3a). 상기 증식 결과는 CD137-Fc 단백질의 존재하에서의 단핵구의 배양 시간과의 양의 상관 관계를 보여 주는 것이다. 상기 증식 유도는3H-티미딘 결합 정도는 대조구 세포에 비하여 30배 이상이 증가하는 7일 내지 10일 경과후에 최대치에 도달하였다. 처리되지 않은 웰 및 Fc 단백질로 코팅시킨 웰의 단핵구 사이에서는 차이점이 발견되지 않았다(결과는 나타내지 않음).
CD137-Fc-유도성 증식이 널리 분포된 방식으로 일어난 것으로 보아3H-티미딘 흡수율은 실질적으로 증가하였음을 알 수 있었다. CD137-처리된 단핵구를 브로모데옥시우리딘(BrdU)으로 1시간 동안 처리하여 라벨링시킨후 플루오레세인-포지된 항-BrdU 항체로 검출하였는데, 특히 상기 세포들의 9.3%(589±43중 55±6)가 그들의 DNA를 복제시킨 반면, Fc 코팅된 캐리어상에서 생장된 말초 단핵구에는 BrdU가 결합되지 않았다(결과는 나타내지 않음).
면역 세포 화학적 연구법에 의하여, 증식하는 세포는 실제로 단핵구가지 기타 다른 혈액 세포는 아니라는 사실을 확인할 수 있었다. 특히, 상술된 바와 같이 증식 정도는 BrdU 결합으로써 측정되었으며 상기 단핵구의 동일성은 단핵구에 특이적인 세포-표면 단백질, CD14의 동시 염색(simultaneous staining)을 통하여 확인할 수 있었다. 핵은 DNA 삽입 염료인 Hoechst 33342로 염색함으로써 눈으로 확인할 수 있었다. 이와 같은 연구법에 있어서, 증식하는 세포들은 통상적인 단핵구의 특징 즉: CD14-양성, 다핵성이며 통상의 단핵구/대식 세포의 형태를 가진다는 것을 확인할 수 있었다(결과는 나타내지 않음).
(b) 도 3b의 현미경 사진에 의하면, 본 발명에 따라 고정된 CD137-Fc로 단핵구를 처리하면, 기타 혈액 형성 성장 인자에서도 볼 수 있는 바와 같이, 다수의 콜로니가 형성됨을 알 수 있었다.
실시예 3: CD137-유도성 단핵구 증식에 필수적인 부가 인자 M-CSF 및 GM-CSF
105말초 단핵구를 고정된 Fc 또는 고정된 CD137-Fc상에서 배양시켰다. 중화 항-M-CSF 항체(2㎍/ml), 항-GM-CSF 항체(2㎍/ml) 및 항-IL-3-항체(2㎍/ml)를 시험 계획에 따라서 첨가하였다.3H-티미딘 결합을 통해서 10일 경과후의 증식 정도를 측정하였다.
중화 항-M-CSF 항체, 항-GM-CSF 항체로써 단핵구의 증식을 억제시킬 수 있었다. 중화 항-GM-CSF 항체는 약 18% 정도 증식이 감소하였다. 항-IL-3 항체는 CD137-유도성 증식에 아무런 영향을 미치지 않았다. 항-GM-CSF 및 항-IL-3 항체를 가하자 원래 수치의 3번째 정도까지 증식이 상조적으로 감소되었다(도 4a 참조).
이와 같은 결과는 곧 M-CSF 및 GM-CSF가 말초 단핵구의 CD137-유도성 증식에 중요 인자로서 작용함을 나타내는 것이다.
(b) 그러나, 추가의 실험에서 M-CSF 및 GM-CSF는 CD137에 의하여 유도되는 농도에서 단핵구를 거의 증식시키지 않았음을 알 수 있었다. 말초 단핵구를 Fc 또는 CD137-Fc 단백질(1㎍/ml)로 코팅시키거나 또는 M-CSF 및 GM-CSF로 코팅시킨 96-홀 플레이트상 명시한 농도(ng/ml)에서 배양시켰다.3H-티미딘 결합을 통해서 10일 경과후의 증식 정도를 측정하였다(도 4b). 예비 실험에서, M-CSF는 10ng/ml이하의 농도에서 CD137에 의하여 유도됨을 알 수 있었다(결과는 나타내지 않음). 생체내에서, M-CSF 및 GM-CSF는 10ng/ml 또는 50pg/ml의 농도로 관찰할 수 있었다(Kawano, Y., Eur J Haenatol 54:147, 1995; Elner, S.G., Curr Eye Res 14:1045, 1995; Saunders, M.A., Br J Pharmacol 120:545, 1997). 도 4b에 나타낸 바와 같이, 일련의 실험에서 M-CSF 및 GM-CSF는 학술 문헌에서의 값에 비하여 더욱 높은 농도로 사용되었는데, 즉 100ng/ml 및 1ng/ml의 농도로 사용되었다. 그러나, CD137에 비하여, M-CSF 및/또는 GM-CSF는 소량의 증식만을 유도할 수 있었다. 이는 곧 단핵구에서 CD137의 작용으로 유도되는 부가적인 인자들이 오토크린(autocrine) 방식으로 CD137-유도성 단핵구 증식에 기여함을 시사하는 것으로 볼 수 있다.
실시예 4 : 하나 이상의 가용성 오토크라인 인자에 의하여 매개되는 CD137-Fc-유도성 단핵구 증식
다음 연구 결과는 이들 인자들, 즉 CD137-유도성 단핵구 증식에 부가적으로 관련될 수 있는 인자들이 가용성 형태 또는 세포 표면에 결합된 형태로 존재하는 지의 여부를 나타내는 것이다. 여기서, 105말초 단핵구를 고정된 Fc 또는 고정된 CD137-Fc 단백질상에서 24시간 동안 배양시켰다. 이후 상기 세포들을 12000g에서 5분 동안 원심 분리시켜 제거하였다. 상기 배양액의 조절된(conditioned) 상청액을 0, 10 및 20㎕를 처리하지 않은 단핵구의 신선한 배양액 100㎕로 옮겼다. 이와 같이 조절된 배지를 상기와 동일한 공여체로부터 처리하지 않은 단핵구로 옮길 경우, 투여량-의존성 방식으로 세포 생장(도 5a) 및 세포 증식(도 5b)을 유도하였다. 세포 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 8일 경과후의 세포를 300배 확대시킨후 사진 촬영을 하였다. 비교 목적으로, 도 5a의 하부에 고정된 CD137-Fc 단백질상에서 8일 동안 배양시킨 단핵구를 나타내었다.
증식 여부를 측정하기 위하여(도 5b), Fc 또는 CD137-Fc를 상술한 바와 동일한 방식으로 배양액 기질상에서 고정시켰다. 이후 단핵구를 명시된 농도의 조절된 상청액과 함께 배양하였다. 상술한 바와 같이, 증식 여부는3H-티미딘 결합을 통해서 측정하였다. 여기서, 8일 경과시 0.5μCi의3H-티미딘으로 24시간 동안 펄스를 발생시켰다. 동일한 실험을 3회 반복 수행하여 필적하는 결과를 얻었다.
실시예 5: 단핵구 증식 유도에 필요한 CD137의 고정
105개의 말초 단핵구를 고정된 Fc 및 고정된 CD137-Fc에서 배양시켰으며, 비교의 목적으로 용해된 형태의 Fc 및 CD137-Fc의 존재하에서도 배양시켰다. 비교용 배취에서의 CD137 및 Fc의 고정은 상기 배양액 용기를 소 혈청 알부민으로써 비특이적으로 블로킹시킴(강도 0.1%의 BSA 200㎕로 30분 동안 실온에서 배양)으로써 방지되었다.
3H-티미딘 결합 여부를 통하여 10일 경과시의 증식 정도를 측정하였다. 도 6에 나타낸 결과에서 보여지는 바와 같이, CD137에 의한 단핵구 증식 유도는 CD137 단백질이 사전에 상기 단백질로 조직 배양 접시를 코팅시킴으로써 고정되었는지 여부로 관찰될 수 있었다. 다시 말해서, 만일 CD137이 가용성 단백질로서 투여되는 경우, 증식 유도 또한 눈에 띄게 감소되었다. 3가지의 독립적인 실험에서, 3가지의 필적하는 결과들을 얻을 수 있었다.
실시예 6: TNFR-Fc 및 항-CD68 존재하에서의 단핵구 증식의 관찰
단핵구 증식 유도의 특징 규명을 위해 Fc 단백질, CD137-Fc 단백질, 종양 괴사 인자 수용기(TNFR)-Fc 단백질 및 항-CD68을 고정시켰다.3H-티미딘 결합은 다으에서 기술된 바와 같이 측정되었다. 도 7을 통하여 CD137-Fc만이 단핵구 증식을 상당량 유도시켰다는 것을 명백히 밝힐 수 있었다. TNFR-Fc 및 항-CD68은 모두 CD137과 유사하게 단핵구의 표면에 결합하는 단백질들이다. 대조구로 사용할 경우, 배양 용기의 표면에 단핵구가 결합되어야 만이 주목할만한 효과를 얻을 수 있다는 사실은 배제되어야 한다.
실시예 7: 단핵구 증식을 부가적으로 유도시키는 CD137 및 M-CSF
96-홀 미세 적정 플레이트로 웰당 105개씩의 단핵구를 도입하였다. 각 웰을 미리 Fc 또는 CD137-Fc로 코팅시켰다(각 경우마다 1㎍/ml). M-CSF(100㎍/ml) 및 LPS(지질 다당류)(50㎍/ml)를 용해된 형태로 가하였다. 8일 동안 배양시킨후 0.5μCi3H-티미딘으로 24시간 동안 펄스를 발생시킨후3H-티미딘 결합 여부로써 증식 정도를 측정하였다.
도 8에 나타낸 실험 결과와 같이, 단핵 세포로의3H-티미딘 결합 정도는 고정된 CD137-Fc 및 M-CSF에 의해서 부가적으로 증가하였다. 다른 한편으로는, LPS는 결합 비율을 상당량 증가시킬 수 없었으므로, CD137-유도성 단핵구 증식에 아무런 영향을 미치지 않았다.
실시예 8: 단핵구에서 형태학적 변화를 유도하는 CD137-Fc
105개의 1차 말초 단핵구를 처리하지 않은 조직 배양 플레이트 또는 고정된 Fc 또는 CD137-Fc 단백질(1㎍/ml)상에서 배양시켰다. 상기 배양액에 대해서 1일, 2일, 4일, 6일 및 10일 경과후의 상태를 400배 확대하여 사진 촬영하였다(도 9a). Fc 단백질만으로 처리된 배양 플레이트만이 소량의 단핵구와 결합하였을 뿐이었다. 뿐만 아니라, 상기 단핵구들은 둥근 형태를 취하고 있었다. 10일이 경과함에 따라, 상기 배취내의 단핵구들은 서서히 사멸되었다(도 9a, 좌측 컬럼). CD137-Fc 융합 단백질이 고정된 조직 배양 플레이트상에서 배양되었을 경우, 완전히 상이한 결과가 얻어졌다. CD137-Fc는 단핵구 부착을 유도시켰다. 상기 세포들은 점차로 부정형(irregula shape)을 취하게 되었다. 이와 같은 효과는 배양후 1일 경과한 때부터 관찰할 수 있었다. 배양 시간을 연장시킴에 따라, 상기 세포들은 넓게 퍼졌으며, 크기도 증가하였고 더욱 복잡한 형태를 취하였다(도 9a, 우측 컬럼).
고정된 CD137-Fc존재하에서 배양한지 10일 경과시, 시험관내에서 분화된 단핵구의 3가지의 기초적 형태를 동정할 수 있었다. 즉: 긴 형태(E), 둥근 형(R) 및 분지형(B) (도 9b 참조)
실시예 9: C-MSF의 형성을 유도하는 CD137-Fc
(a) 105개의 1차 단핵구를 고정된 Fc 또는 CD137-Fc상에서 수행하는 첫번째 실험에서 배양하였다 (각 경우마다 1㎍/㎖). CD137-Fc 단백질(1㎍/㎖)을 용액내에서 유지시키기 위하여, 하나의 배취에서는 소 태아 혈청으로 조직 배양 플레이트를 미리 배양시켜(4℃에서 1시간 동안, 희석시키지 않은 상태로) CD137-Fc 단백질이 고정되는 것을 방지하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다. 배양 상청액을 명시한 시간별로 수득하고 M-CSF의 농도를 ELISA로 측정하였다. 3개의 독립된 실험으로부터 3가지 필적할 결과가 얻어졌다.
도 10에 나타낸 바와 같이, CD137은 M-CSF의 발현을 유도하였다. 배양후 처음 3일 동안은 M-CSF의 함량은 낮았으며 대조구와 CD137-처리된 단핵구 사이에 별 차이점은 없었다. 4일 경과후부터, M-CSF가 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며 M-CSF의 농도는 급속히 지속적으로 증가하였다. 가용성 CD137은 M-CSF 농도를 낮출뿐이므로, CD137 단백질의 고정은 다량의 M-CSF 형성에 필요한 예비 조건이다.
(b) 다음 실험에서, M-CSF의 발현은 CD137에의해서 유도될 수 있을 뿐만 아니라 CD137-유도성 단핵구의 생존에도 필수적이라는 것이 규명되었다. 이를 위하여 단핵구를 고정된 CD137 단백질 및 중화 항-M-CSF 항체의 존재하에서 배양시켰다. 이 경우 Fc 단백질-코팅시킨 경우에 비하여 CD137-Fc-코팅시킨 플레이트상에서의 단핵구의 생존률은 거의 10배 정도라는 것을 알 수 있었다. 중화 된 항-M-CSF 항체를 첨가함으로써 생존 단핵구의 수를 기준치까지 낮췄다(표 1 참조). 시간이 경과함에 따라, 코팅되지 않은 또는 Fc-코팅된 배양 플레이트의 대부분이 6일이 경과하자 벌써 사멸되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 11 참조) 그러나, 고정된 CD137 단백질 또는 M-CSF는 12일 경과시에도 세포 계수를 높은 수준으로 유지시켰다. M-CSF와 중화 항체를 포획시킨후에는 상기와 같은 효과는 더이상 관찰되지 않았다.
M-CSF에 더하여, GM-CSF 및 IL-3도 단핵구의 생존 시간에 양성적인 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 본 발명에 따른 실험 수행시 배양후 8일 동안은 ELISA를 통하여 (대조구 배취 및 CD137-처리된 세포에서) GM-CSF 및 IL-3이 발현되는 것을 확인할 수 없었다(결과는 나타내지 않음). 그러나, 중화된 항-GM-CSF 항체는 CD137-매개 단핵구 생존률을 절반의 수준으로 감소시켰다 (표 1 참조). 항-IL-3 항체는 아무런 효과도 없었다. 그러나, 중화 항-IL-3 항체 및 항-GM-CSF 항체를 결합시키는 경우에는 생존 단핵구의 수를 거의 기준치까지 감소시켰다. 이는 곧 IL-3 역시 단핵구 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 것이다. GM-CSF 및/또는 IL-3 그리고 M-CSF의 중화는 더 이상 세포의 계수를 감소시키지 않았다.
중화 항-M-CSF 항체를 투여함으로써 M-CSF에 대한 양성적 효과를 감소시킬 수 있었으며, 항-GM-CSF 및 항-IL-3 항체를 결합시킴으로써 상기 효과를 거의 기준치까지 감소시킬 수 있었다.
자극 중화 항체2) 생존 세포수1) p 값4)
Fc --- 6.8 ±1.5 ---
CD137-Fc --- 75.5 ± 6.8 ---
CD137-Fc α-M-CSF 9.3 ± 2.0 0.005
CD137-Fc α-IL-3 72.3 ± 8.4 n.s.
CD137-Fc α-GM-CSF 36.0 ± 2.5 0.006
CD137-Fc α-M-CSF + α-IL-3 7.0 ± 1.8 0.005
CD137-Fc α-M-CSF + α-GM-CSF 6.0 ± 3.0 0.007
CD137-Fc α-GM-CSF + α-IL-3 19.0 ± 3.0 0.005
CD137-Fc α-M-CSF + α-GM-CSF + α-IL-3 4.8 ± 3.3 0.008
M-CSF --- 68.3 ± 16.2 --
M-CSF α-M-CSF 5.3 ± 2.6 0.006
M-CSF α-GM-CSF + α-IL-3 20.8 ± 5.0 0.018
1)우선, 말초 단핵구를 고정된 Fc-단백질 또는 CD137-Fc 단백질 (1㎍/㎖)상에서 또는 M-CSF를 최종 농도가 100ng/ml가 되도록 가하여 배양시킴.
2)농도 2㎍/㎖의 중화 항체를 사용하였다 ; 실험의 초반부에 이들을 가함.
3)평균 세포 계수 및 표준 편차. 10일 경과시 4개의 대표적인 플레이트에서 상기 세포들의 계수를 측정하였다.
상기 p값은 SSPS 소프트웨어를 이용하여 Student 테스트로써 측정하였다. n.s = 중요하지 않음(not significant)
실시예 10: 생존 단핵구의 수를 증가시키는 CD137 단백질의 고정
105개의 말초 단핵구를 고정된 Fc 및 CD137-Fc 단백질(각각 1㎍/㎖)상에서 또는 가용성 Fc 또는 가용성 CD137-Fc 단백질(각각 1㎍/㎖)의 존재하에서 배양하였다. 8일 경과시의 배양액을 300배 확대하여 사진 촬영하였다(도 12 참조). 상기 배양액 플레이트를 소 혈청 알부민으로 예비 처리하여 고정시켰다(실온, 30분간, 96-홀 플레이트에서 웰당 200㎕씩). 가용성 단백질 존재시, 단핵구 계수는 눈에 띄게 감소하였다. 이것으로보아, M-CSF는 CD137 단백질이 고정된 형태로 존재할 경우에만 유도된다는 것을 알 수 있었다(실시예 9 참조). 따라서 상기 단핵구에 의해서 발현된 CD137 리간드(즉, CD137에 대한 결합 파트너)가 고정된 CD137 분자들과 결합함으로써 가교 결합될 때 CD137만이 상기 단핵구에 작용을 하는 것으로 보인다.
배양후 8일 경과시에 관찰한 결과, 항-Fc 항체에 의하여 2차 가교 결합된 가용성 CD137-Fc는 유사하게 단핵구의 생존을 연장시킨다(결과는 나타내지 않음). 상기 실험에 있어서, CD137-Fc(2㎍/㎖)는 염소 항-인간 Fc 항체(2㎍/㎖)로 미리 처리하였다.

Claims (21)

  1. 포유 동물의 말초 단핵구 증식을 촉진시키기 위한 약제 생산용 단핵구 성장 인자 CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 용도.
  2. 단핵구 및/또는 이들로부터 유래된 세포 및/또는 선조 세포 및/또는 이들의 전구체를 포함하는 세포계(cell system)의 이상(disorder)과 관련된 상태를 치료하거나 또는 상기 세포계의 세포 증식을 촉진시킴으로써 상기 이상 상태의 형성 및/또는 그의 경로를 치료할 수 있는 약제 생산용 단핵구 성장 인자 CD137 또는 이들의 기능적 유사체의 용도.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포계의 이상이 말초 단핵구 및/또는 그들로부터 유래된 세포들을 감소시키거나 또는 기능적으로 이상을 일으키는 것을 포함하는 용도.
  4. 제2항에 있어서, 부적당한 면역 반응과 관련된 상태를 치료하기 위한 용도.
  5. 제2항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 상태가
    a)조혈계(haematopoietic system)에 대한 화학 요법 관련 또는 방사선 요법 관련 손상;
    b)상처 치료 이상(wound healing disorders);
    c)온코즈(oncoses)
    d)세균, 바이러스 또는 진균성 감염;
    e)면역계의 선천성 또는 비선천성, 후천성 또는 비후천성 손상 또는 상태; 및
    f)면역 억제제 치료에 의하여 유도된 손상
    으로부터 선택되는 것이 특징인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 생체내 또는 생체외 치료가 수행되는 것이 특징인 용도.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 하나의 항에 있어서, CD137 또는 이들의 기능적 유사체가 인터류킨, 림포카인, 모노카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자 및 성장 인자로부터 선택된 하나 이상의 추가 인자와 함께 사용되는 것이 특징인 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추가 인자가 백혈구 자극 인자인 것이 특징인 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인자가 G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF로부터 선택되는 것이 특징인 용도.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항에 있어서, CD137 또는 이의 기능적 유사체가 고정된 형태 또는 다량체 응집체로 사용되는 것이 특징인 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 다량체 CD137 응집체가 2개 내지 5개의 CD137 단백질 분자 또는 이들의 기능적 유사체를 포함하는 용도.
  12. 제 10 항 또는 제11항에 있어서, 단핵구와 결합 가능한 도 1a에 기재된 아미노산 +18 내지 +186잔기에 해당하는 인간 CD137의 세포외 구역 또는 이들의 기능적 유사체가 사용되는 것이 특징인 용도.
  13. 말초 단핵구의 증식을 촉진시키기 위한 시험관내 방법으로서, 포유 동물의 혈액으로부터 얻은 말초 단핵구를 영양 배지중의 CD137과 접촉시킨후 상기 단핵구 수 및/또는 크기가 증가될 때까지 배양시키는 단계를 포함하는 시험관내 방법.
  14. a) 화학 요법 또는 방사선 요법을 수행하기에 앞서서 환자의 혈액으로부터 말초 단핵구를 함유하는 혈액 분획을 분리하고, 이 분획을 단핵구 수 및 크기가 증가할 때까지 CD137과 생체외에서 배양시키고, 이와 같이 처리된 혈액 분획을 상기 요법 수행 완료후 환자에게 다시 투여하는 단계; 또는
    b) 화학 요법 또는 방사성 요법 완료 이전, 상기 요법 수행 기간중 또는 상기 요법 완료후 유효량의 다량체 CD137 응집체를 환자에게 투여하여 내인성 말초 단핵구의 증식을 촉진시키는 단계를 포함하는, 화학 요법 또는 방사선 요법의 재생 치료 방법.
  15. 말초 단핵구 증식을 촉진시키는 양의 CD137 또는 이들의 기능적 유사체를 환자에 투여하여, 내인성 비특이적 면역 방어를 촉진시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 환자가 상처 치료 이상, 세균성, 바이러스성 또는 진균성 감염, 선천성 또는 비선천성, 후천성 또는 비후천성 면역계 손상 또는 이상; 또는 면역 억제제 치료로 유발되는 손상으로 고통받는 종양 환자인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다량체 CD137응집체가 2개 내지 5개의 CD137 단백질 분자들 또는 이들의 기능적 유사체를 포함하는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 단핵구와 결합 가능한 도 1a에 기재된 아미노산 +18 내지 +186잔기에 해당하는 인간 CD137 세포외 구역 또는 이들의 기능적 유사체가 사용되는 것이 특징인 방법.
  19. 제2항 내지 제5항중 어느 하나의 항에서 정의된 이상(disorder) 중 하나의 치료용 유전자 치료 조성물을 제조하기 위한 CD137 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 용도.
  20. CD137 또는 이들의 기능적 유사체에 대한 암호화 뉴클레오티드 서열이 발현 가능한 형태로 결합된 세포 기질을 포함하는 유전자 치료 조성물.
  21. 제2항 내지 제5항중 어느 하나의 항에서 정의된 이상(disorder) 중 하나의 치료용 유전자 치료 방법으로서, 제20항에 기재된 유전자 치료 조성물이 환자에게 투여되는 유전자 치료 방법.
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