CN104755095A

CN104755095A - 用于伤口治疗的药物

Info

Publication number: CN104755095A
Application number: CN201380048505.9A
Authority: CN
Inventors: R·贝格尔
Original assignee: Lease Of Lyceum Trade Consulting Co Ltd LP
Current assignee: Lease Of Lyceum Trade Consulting Co Ltd LP
Priority date: 2012-07-19
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-07-01
Also published as: WO2014013027A1; EP2687224A1; CA2879472A1; AU2013291972A1; JP2015524402A; US20150202258A1; EP2874644A1

Abstract

本发明涉及stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞，其用于治疗患者中的慢性伤口或者疾病或药物疗法依赖性受损的伤口愈合，或者用于增加或诱导间充质细胞、干细胞的增殖和/或迁移，用于刺激免疫细胞优选天然杀伤细胞，用于刺激成纤维细胞，用于刺激上皮细胞优选表皮的上皮细胞，或用于刺激血管生成。

Description

用于伤口治疗的药物

技术领域

本发明涉及用于再生性治疗特别是伤口愈合的药物领域。

背景技术

伤口愈合构成复杂、动态和精心策划的过程，当皮肤组织破裂出现时，所述过程被激活。贯穿伤口愈合过程，发生一系列事件，包括血小板聚集、凝血级联活化、细胞迁移、细胞增殖、炎性浸润、细胞分化和组织重塑。尽管这些事件的级联看起来良好区分且分成三个时期，即炎症、增殖以及伤口收缩和重塑，但它们实际上彼此重叠，并且继续或更新的组织损伤可以在现有伤口内的受影响部位处再起始所述序列。

皮肤组织损伤和血管破坏之后是纤维蛋白凝块形成，其提供了细胞迁移到伤口内的基底。受一系列分子吸引的嗜中性粒细胞，吞噬异物和细菌，逐步替换为分化为巨噬细胞的单核细胞。巨噬细胞吞噬微生物、细胞外基质的碎片、纤维蛋白、嗜中性粒细胞、红细胞及其他碎片，并且分泌对于有效伤口修复视为关键的多种分子。在慢性伤口中，该时期的一种或多种组分看起来是失调的，导致延迟的伤口愈合。来自角质化细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的生长因子表达在糖尿病伤口中减少，负面影响初始止血栓子的形成。另外，已观察到对细胞因子释放、趋化性、粘连和吞噬活性的高血糖症以及高脂血症相关的损害。

受损的伤口愈合与增加的发病率和死亡率相关。不愈合的伤口通常导致截肢术。然而，尽管深入研究，但确切潜在发病机制仍未完全阐明。它看起来是微血管和大血管疾病的净结果。

伤口愈合通常在糖尿病中是延迟的，并且血管病看起来显著参与。另外，神经病以及支持间充质细胞迁移和活化的生长因子的缺乏已公认为延迟的糖尿病伤口愈合的原因之一。看起来是糖尿病状态自身固有的其他因素，例如细胞形态和功能中的变化已牵涉其发病机理。

Mistry Sucharita J等人(2007)描述了在用抗stathmin核酶处理后减少的HUVEC细胞增殖。据说核酶干扰微管代谢且使微管聚合和解聚之间的平衡朝向聚合微管转变，这干扰细胞生长且具有抗血管生成效应。

WO 2008/039390 A2描述了在癌症治疗中的肿瘤相关抗原和壳聚糖的疫苗缀合物。一种可能的抗原是stathmin。

WO 2007/089151 A1(EP 1815863 A1)将stathmin鉴定为TLR3活化物质且提议在神经变性病症例如阿尔茨海默氏病中的变性炎症过程的治疗。还提及了伤口的治疗。

另一方面，US 6,429,304 B1教导具有抗有丝分裂活性的化合物，其可以用于治疗多种增殖性疾病例如癌症或“异常伤口愈合”。作用模式是阻止细胞生长。化合物的抗有丝分裂活性基于所谓的微管解聚能力。一种此类化合物是stathmin，也称为OP18。

WO 2004/113561 A2是陈述stathmin或癌蛋白18阻止由于微管蛋白减少而不受控制的细胞生长的另外的文件。

这些文件无一研究了stathmin在实际中的伤口愈合中的作用。这些专利文件的作者进一步提及关于在伤口愈合中的可能作用的相反陈述。因此仍有待阐明stathmin是否在伤口愈合中具有任何有益作用。

目前的伤口愈合治疗旨在给伤口清洁且清创，治疗可能的感染以减少伤口的炎症期，并且任选施加迁移或生长因子例如PDGF。另外，目前的伤口治疗制剂并非令人满意，并且存在改良的伤口愈合组合物的当前需要。

发明简述

本发明提供了stathmin、编码stathmin的核酸或表达stathmin的细胞在伤口治疗中或减少伤口结瘢的用途。在相关方面，本发明还涉及用于伤口治疗的stathmin、编码stathmin的核酸或表达stathmin的细胞。进一步地，本发明涉及stathmin、编码stathmin的核酸或表达stathmin的细胞在制备伤口治疗中的药物中的用途。还提供了包含stathmin的药物组合物。本发明进一步提供了增加或诱导间充质细胞、表皮细胞和/或干细胞，特别是基质干细胞和/或造血干细胞的增殖和/或迁移，用于刺激免疫细胞优选天然杀伤细胞，用于刺激成纤维细胞，用于刺激上皮细胞优选表皮的上皮细胞，或用于刺激血管生成，特别是用于刺激所述细胞尤其是间充质细胞和/或成纤维细胞中的IL-8产生，用于刺激单核细胞和/或巨噬细胞的体外或体内方法。可以诱导单核细胞和/或巨噬细胞以产生细胞因子，例如IL-6、IL-8、MIP-1、MIP-2。所有这些方面是等价的，并且所有优选实施方案同样涉及这些方面中的每一个。

本发明人已将stathmin鉴定为非常有力的伤口愈合加速剂，其甚至超过常见药物例如PDGF制剂。特别令人惊讶的是在减少的或受损的伤口愈合的情况下的效果，其中stathmin可以以出乎意料快的速率实现伤口闭合。本发明的主题在权利要求中进一步限定。

发明详述

Stathmin是具有已知序列(NCBI数据库NP_005554和CAD19057或SEQ ID NO:1(stathmin a)或SEQ ID NO:2(stathmin b))的蛋白质。Stathmin及其同工型由上文提及的背景技术进一步已知。它是在哺乳动物中的大多数组织中发现的遍在表达的蛋白质。取决于可以磷酸化的位点的特异性组合，观察到许多不同的磷酸化形式。在Ser-16处的磷酸化看起来是神经元极化所需的。在Ser-63处的磷酸化使微管蛋白结合减少10倍，且抑制MT聚合抑制活性。

SEQ ID NO 1:

SEQ ID NO 2:

本发明人在类似浆细胞样树突状细胞(pDC)的人细胞系中鉴定到分泌的Stathmin。浆细胞样树突状细胞(pDC)在受伤的皮肤中具有独特作用，并且通过其生长因子的产生涉及急性炎症应答和伤口愈合。开发了分泌独特蛋白质组的人树突状细胞系，所述蛋白质有助于组织再生。这些蛋白质之一是stathmin，分子量17.3kD的蛋白质(SEQ ID NO:1)。将来自pDC的stathmin基因克隆且在大肠杆菌中表达，并且纯化至同质。

在体外，stathmin诱导人间充质细胞的增殖和迁移，支持新生血管生成且刺激天然杀伤细胞活性。真皮细胞增殖、新血管和针对细菌感染的第一线防御的缺失是许多慢性伤口中的关键问题。当研究由于代谢综合征而具有延迟的伤口愈合的Zucker大鼠中的伤口愈合时，在体内获得引人注目的结果。当在水凝胶中局部应用时，stathmin表现显著优于PDGF。此外，具有¹²⁴I标记的stathmin的PE断层摄影术显示蛋白质保留在受伤区域中。Stathmin在伤口液体中是显著稳定的(超过8小时)，并且当局部应用时，在血清中是无法检测的，未测量到全身暴露。

基于这些新的体外和体内结果，本发明首次提供了由实验证据支持的stathmin在伤口治疗中的用途。

在关键方面，本发明进一步提供了stathmin在不愈合伤口(如果没有本发明治疗则不愈合)或治疗具有减少的或受损的伤口愈合的伤口中的用途。具有减少的或受损的伤口愈合的伤口是例如慢性伤口或者具有疾病依赖性或药物疗法依赖性受损的伤口愈合的伤口(其还可以是或发展成慢性伤口)。同样，还能够使用核酸，所述核酸编码stathmin，且导致其在细胞中的表达或此类细胞在此类治疗中的用途。

本发明进一步提供了在伤口治疗中的stathmin与胶原的组合。该组合显示由于协同作用而甚至进一步增加的伤口愈合速率。

如本文使用的，Stathmin指任何stathmin同工型或变体或任何翻译后修饰形式，包括磷酸化形式。在优选实施方案中，stathmin包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至126，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1至126的序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO:1的氨基酸1至126还在SEQID NO:2中发现，并且看起来具有同源区域。进一步优选的stathmin变体公开于WO 2007/089151、US 6,429,304 B1、WO 2004/113561 A2和NCBI数据库条目NP_005554和CAD19057(全部通过引用并入本文)。

术语“序列同一性”指两个序列，通常为氨基酸序列之间的同一性，其可以通过序列比对程序如BLAST、PSI-BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)或ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行测定。这些算法计算所选序列的最佳匹配，并且将它们排队，从而使得可见同一性、相似性和差异。

在本发明的优选实施方案中，本发明的stathmin包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1至126的序列具有至少75％，更优选至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至100％序列同一性的序列。在甚至更优选的实施方案中，本发明的stathmin包含与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少70％，更优选至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至100％序列同一性的序列。Stathmin可以是stathmin-1、stathmin-2、stathmin-3或stathmin-4，优选地它是stathmin-1。Stathmin可以是重组stathmin。进一步优选的是它具有与患者相同的来源，但还可以使用来自其他动物的stathmin变体。优选地，患者是哺乳动物，尤其是人或非人动物，特别是驯养动物例如猪、啮齿类或灵长类。优选地，stathmin是人stathmin或来自非人动物的stathmin，所述非人动物特别是驯养动物例如猪、啮齿类或灵长类。

如本文使用的，“包含”以开放含义使用，即本发明的stathmin可以具有另外的氨基酸或蛋白质组分。它可以是融合蛋白。此类延伸的stathmin蛋白质在优选实施方案中可以具有有限大小，例如多达2000个氨基酸、多达1800个氨基酸、多达1600个氨基酸、多达1400个氨基酸、多达1200个氨基酸、多达1000个氨基酸、多达800个氨基酸、多达600个氨基酸、多达400个氨基酸、多达300个氨基酸、多达200个氨基酸或多达160个氨基酸。当然，本发明还涉及由上述实施方案中包含的所述序列中的任一个组成的stathmin蛋白质。“由……组成”以封闭和序列限制性含义使用。

在优选实施方案中，stathmin是磷酸化的。磷酸化是天然转录后过程，并且在重组表达期间发生。可能的磷酸化位点在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸16、25、28、38、63、146的氨基酸处。优选磷酸化在对应于SEQ IDNO:1的氨基酸16和/或63的氨基酸处。本发明的stathmin可以包含1、2、3、4、5或6个氨基酸磷酸化。

在优选实施方案中，stathmin是乙酰化的。乙酰化是天然转录后过程，并且在重组表达期间发生。可能的乙酰化位点在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2、9、80、95、100、119、128的氨基酸处。本发明的stathmin可以包含1、2、3、4、5或6个氨基酸乙酰化。

stathmin可以是糖基化的或不是糖基化的。大肠杆菌产生的stathmin不是糖基化的并且仍是有效的。

对于使用stathmin蛋白质，可替代地(或组合地)还能够使用编码上述stathmin蛋白质的核酸。此类序列例如在SEQ ID NO:3中所示，所述SEQ IDNO:3编码SEQ ID NO:1。

SEQ ID NO 3:

核酸可以用于诱导在伤口附近的细胞中的stathmin产生。用于核酸递送的优选制剂是例如用于控制递送的脂质体、微乳剂、胶束或囊泡。细胞随后可以产生且分泌stathmin，以提供治疗剂的连续产生。

还提供了用于本发明用途的表达stathmin的细胞。此类细胞优选连续分泌stathmin，以提供治疗效果。此类细胞可以是任何细胞。优选地，细胞是pDC，但非pDC也是可能的。在优选实施方案中，细胞对于患者不是免疫原性的，例如它是得自已遗传改造为重组表达stathmin的患者的细胞。这种细胞修饰可以在体外或体内进行。

先前的和进一步的详细描述同等地涉及stathmin蛋白质、核酸和细胞，特别是因为核酸或细胞的直接活性治疗试剂也是所表达的stathmin。

本发明特别提供了stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞用于治疗在患者中的慢性伤口或具有血管生成缺陷的伤口。优选地，治疗的组织是皮肤，或者治疗的组织或区域至少部分包含皮肤。慢性伤口或具有受损的伤口愈合的伤口还可以影响皮下组织，甚至骨骼。治疗优选是局部的，尤其是使用局部制剂例如水凝胶。

Stathmin、核酸或细胞可以用生物相容性基质配制或与生物相容性基质偶联，所述生物相容性基质优选包含胶原、明胶、海藻酸盐、黄原胶、羟乙基纤维素壳聚糖和/或透明质酸，用于治疗患者中的伤口，优选慢性伤口或具有受损的血管生成的伤口。事实上，该制剂提供了令人惊讶的新特性和效果，其相对于任何其他现有制剂是新颖的。因此，本发明还提供了stathmin在用于治疗伤口的此类制剂中的用途，所述伤口包括急性和慢性伤口和具有受损的伤口愈合的伤口。生物相容性基质的制备是本领域众所周知的，并且例如在Tan等人(9)中描述。生物相容性基质优选支持伤口愈合和/或特别是在伤口中的细胞粘附。它们导致再生长的细胞瘢痕组织的强化。优选地，生物相容性基质包括具有透明质酸的支架。

因为stathmin阻遏金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)，金属蛋白酶组织抑制剂是抑制金属蛋白酶(MMP)的一类酶，金属蛋白酶对于伤口愈合期间的瘢痕再吸收和再上皮化是重要的，所以stathmin还可以用于减少在伤口愈合期间的瘢痕形成且在瘢痕已形成后减少结瘢。

在优选实施方案中，stathmin在水凝胶中配制。水凝胶优选包含明胶、海藻酸盐、琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸或其任何组合。有机化学水凝胶可以包含聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和具有大量亲水基团的共聚物。水凝胶包含聚合物链的网络，所述聚合物链是亲水的，有时作为其中水是分散介质的胶态凝胶发现。水凝胶是高度吸收性(它们可以含有超过99.9％水)天然或合成聚合物。由于其显著的含水量，水凝胶还具有非常类似于天然组织的柔性。在局部药物递送中它们提供储库。

在优选实施方案中，待治疗的伤口是慢性伤口。慢性伤口不显示伤口愈合或显示有限的伤口愈合。它是在一组有序的阶段中和可预测的时间量中不愈合的伤口。在具体实施方案中，慢性伤口是在14天、优选18天、尤其优选22天、甚至更优选28天内，在34天、40天、50天或甚至60天内没有伤口愈合或具有减少的伤口愈合(例如仅约20％的伤口区域闭合)的伤口。在优选实施方案中，伤口是缺氧的和/或缺乏足够的氧供应和/或缺乏新近形成的动脉。本发明还刺激血管生成，并且可以帮助恢复在伤口或其他地方的适当或甚至加速的伤口愈合以及血管生成。

可替代地或组合地，伤口是具有疾病依赖性受损的伤口愈合(疾病依赖性受损的伤口愈合还可以是如上定义的慢性的)的伤口。疾病依赖性受损的伤口愈合可以是由于选自下述的疾病：糖尿病或代谢综合征，慢性静脉功能不全(CVI)，外周动脉闭塞性疾病(PAOD)，癌症，自身免疫尤其是选自类风湿性关节炎、狼疮(特别是全身性红斑狼疮)和青斑样血管病变的自身免疫，外科伤口，造口术，长期炎症过程，细胞衰老例如褥疮中的生长因子缺陷或生长因子受体缺陷。根据本发明治疗的患者可以具有这些疾病或状况中的一种或多种。优选地，所述患者患有糖尿病或代谢综合征。

可替代地或组合地，伤口是具有药物疗法依赖性受损的伤口愈合的伤口。药物疗法依赖性受损的伤口愈合可以是由于选自使用以下进行治疗的药物疗法：皮质类固醇、尼古丁、抗生素、免疫抑制剂、抗凝血剂、细胞毒性药剂、抗风湿病药剂尤其是抗类风湿关节炎的药剂、血管收缩剂。根据本发明治疗的患者可以已接受这些药剂中的一种或多种。

因此，本发明还提供了stathmin用于刺激血管生成的的用途。可以治疗具有动脉供应不充足的组织的患者。患者可以具有通过本发明治疗的缺氧组织。动脉供应不充足的组织还可以是慢性的，例如处于这种状态14天，优选18天，尤其优选22天，甚至更优选28天，34天、40天、50天或甚至60天。

慢性疾病可以具有急性原因，例如外科或意外伤口，或具有慢性原因例如糖尿病或其他并存病中，尤其与引起皮肤或其他组织的氧合减少的其他疾病组合。

因此，本发明涉及患者的治疗，所述患者特别是在需要此类疗法的组织中需要用stathmin诱导血管生成。优选地，疗法是局部的(对于本发明的所有实施方案是优选的)。

在优选实施方案中，患者不患有全身变性炎症过程。治疗的伤口可以包含或不包含变性炎症过程。

进一步的治疗是对于这样的患者，其需要刺激先天性免疫应答和/或需要诱导细胞因子/生长因子和/或TIMP用于免疫调节。此类患者可以具有局部或全身免疫缺陷。免疫缺陷可以是所有免疫细胞的不充足供应(局部或全身)或有限的免疫细胞活化或特定免疫细胞的有限供应(局部或全身)，尤其是先天性免疫系统的细胞，例如NK细胞，其优选根据本发明进行刺激。局部优选涉及受伤区域。优选地，免疫缺陷是细胞介导的免疫中的缺陷和/或先天性免疫系统中的缺陷。免疫系统分成更原始的先天性免疫系统、以及获得性或适应性免疫系统，其各自含有体液和细胞组分。

Stathmin、核酸或细胞可以用于治疗患有糖尿病或代谢综合征的患者中的伤口。糖尿病或代谢综合征引起患者增殖和代谢能力中的失调，其导致减少的伤口愈合或伤口不愈合。进一步地，糖尿病引起免疫妥协和对小血管的损害，阻止组织的足够氧合，即使没有急性原因，这也可以引起慢性伤口。

可以用stathmin治疗的伤口或状况的具体例子是选自下述的伤口：糖尿病足伤口，尤其是糖尿病性足溃疡，一般而言的溃疡特别是静脉溃疡、褥疮或压力性溃疡，烧伤优选三度烧伤，外科伤口，意外伤口，坏死伤口，感染伤口。这些伤口和状况可以是慢性的，但在特别情况下，还可以是急性的。在优选实施方案中，所有这些伤口和状况的慢性形式根据本发明进行治疗。

本发明进一步涉及包含stathmin的药物组合物。用于治疗用途的药物组合物或制剂可以包含药学可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。本发明还提供了包含治疗有效量的stathmin的药物组合物。术语“治疗有效量”意指针对指定状况和施用途径提供疗效的量。组合物可以采取液体或冻干形式，并且包含具有不同pH值和离子强度的稀释剂(Tris、乙酸盐或磷酸盐缓冲液、NaCl)，增溶剂例如Tween或聚山梨醇酯，载体例如人血清白蛋白或明胶，防腐剂例如硫柳汞或苯甲醇。具体组合物的选择依赖许多因素，包括待治疗的状况、施用途径和所需药剂代谢动力学参数。

优选制剂是用于局部施用的制剂。尤其优选的是水凝胶。还涵盖的是包含stathmin的组合物，所述stathmin用水溶性聚合物修饰以增加可溶性、稳定剂、血浆半衰期和生物利用度。组合物还可以包含掺入脂质体、微乳剂、胶束、微粒或囊泡内的stathmin用于在延长时间段上的控制递送。

在具体实施方案中，stathmin与载体一起提供。载体优选选自凝胶，优选水凝胶，或伤口敷料或拭子，任选浸透含有stathmin的溶液。进一步的载体包含用于缓慢释放的载体，其作为更久的有效应用延迟或更慢释放活性剂组合。此类具有相应载体的制剂尤其适合于局部和快速施用。作为这些载体中的任一种的替代或组合，载体可以包含生理盐溶液，优选的盐是NaCl，尤其优选以约0.9％的浓度。此类载体可以用于肠胃外施用，例如皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内或输注技术。

在优选实施方案中，stathmin以0.1μg-1000μg stathmin/cm²伤口的量使用。还优选的是至少0.1μg、至少0.2μg、至少0.5μg、至少1μg、至少2μg、至少5μg和/或至多1000μg、至多750μg、至多500μg、至多400μg、至多300μg、至多200μg、至多100μg或至多50μg/cm²伤口或者这些值之间的任何范围的量。

药物组合物可以包含用生物相容性基质配制或与生物相容性基质偶联的stathmin，所述生物相容性基质优选包含如上所述的胶原、明胶、壳聚糖和/或透明质酸。可替代地或组合地，药物组合物还可以包含如上所述具有stathmin的水凝胶，例如具有海藻酸盐的stathmin制剂。

特别地，本发明提供了用作药品的药物组合物。具体用途是如上所述在伤口愈合中和/或刺激血管生成。

在进一步方面，本发明还提供了增加或诱导间充质细胞、表皮细胞和/或干细胞，特别是基质干细胞或造血干细胞的增殖和/或迁移，用于刺激免疫细胞，用于刺激成纤维细胞，用于刺激上皮细胞优选表皮或血管的上皮细胞，或用于刺激巨噬细胞或单核细胞或者用于刺激血管生成的方法，其包括给所述细胞施用stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞的步骤。该方法可以在体外例如对分离的细胞或细胞培养物进行。特别地，本发明的方法可以用于刺激所述细胞尤其是间充质细胞和/或成纤维细胞中的IL-8产生。本发明刺激IL-8产生，其对伤口愈合具有特别有益的作用。单核细胞和/或巨噬细胞可以诱导细胞因子，例如IL-6、IL-8、MIP-1、MIP-2的产生，在伤口愈合中具有进一步的有益效应。

还提供了该方法在体内的用途，特别对具有伤口或需要此类治疗的患者，例如用于刺激血管生成。因此，提供了在患者中增加或诱导间充质细胞、表皮细胞和/或干细胞，特别是基质干细胞或造血干细胞的增殖和/或迁移，刺激免疫细胞，刺激成纤维细胞，刺激上皮细胞优选表皮或血管的上皮细胞，或刺激血管生成的方法，其包括给患者施用stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞的步骤，优选通过在伤口上的局部施用。患者可以需要此类增加、诱导或刺激，例如由于伤口，或者缺氧、坏死或感染(或其组合)的组织。特别地，本发明的方法可以用于刺激所述细胞尤其是间充质细胞和/或成纤维细胞中的IL-8产生。

可以刺激的免疫细胞优选是先天性免疫系统的细胞，特别是天然杀伤细胞。

本发明进一步提供了下表2中给出的生长因子中的任一种的刺激，所述生长因子尤其是IFN-α、IFN-β、PDGF-B、FGF-2、HGF、TGF-β、VEGF和/或KGF、IL-8、IL-6、MIP-1a或MIP-2。该方法可以用于上文描述的体外或体内方法中。

本发明进一步通过下述附图和实施例进行说明，而不限于本发明的这些具体方面。

缩写

DFU，糖尿病性足溃疡

FCS，胎牛血清

FN，纤连蛋白

FPLC，快速蛋白质液相色谱法

HIC，疏水作用色谱法

Hrs，小时

ON，过夜

pDC，浆细胞样树突状细胞

PDGF，血小板衍生的生长因子

R hu Stat1，重组人Stathmin1

TIMP，金属蛋白酶组织抑制剂

TLR，toll样受体

附图说明

图1：人pDC样细胞的hu Stat1分泌。

AB4(人pDC)和PS细胞(原代人皮肤成纤维细胞)在无血清培养基中培养48小时。收获培养上清液或细胞裂解产物，并且通过蛋白质印迹使用兔抗hu Stat1抗血清分析。泳道1-3：作为阳性对照的重组hu Stat1(500ng、50ng和5ng)，泳道4-6:4)AB4裂解产物4x10⁴细胞、AB4 SN 10⁴细胞、AB4 SN 4x10⁴细胞；泳道7-9：PS裂解产物4x10⁴细胞、PS SN 10⁴细胞、PS SN 4x10⁴细胞。

图2：由AB4细胞克隆hu Stat1

在42℃下使用热休克30秒，将在pTriEx4 Neo/TOP10克隆4中的huSTAT1的质粒DNA转化到BL21DE3化学感受态细胞内。转化反应物在具有氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺平板，并且在37℃下温育12小时。菌落PCR和控制消化如上所述进行。在NcoI/Bsu36I控制消化后，在pTriEx4Neo BL21 DE3克隆中的hu STAT1显示在琼脂糖凝胶中在450bp处的各条带。

图3：通过序贯阴离子交换和疏水作用色谱法的hu Stat1纯化。Purifier FPLC System用于DEAE Sepharose和Octyl Sepharose Fast Flow色谱法。

图4：电细胞-基质阻抗传感(ECIS)测试-hu Stat1介导的体外伤口愈合。人上皮细胞(A431)在纤连蛋白涂布的培养容器(8W1E，IBIDI，Munich)中进行培养。在48小时后，采用高磁场脉冲(参见箭头)，其导致阻抗的急剧下降和在由电极覆盖的区域处的细胞死亡。hu Stat1的添加导致细胞以剂量依赖性方式增殖和迁移到受伤区域内。10％FCS：阳性对照，无血清培养基：阴性对照。

图5：用单独的胶原(A)或stathmin与胶原的组合(B)处理Zucker大鼠。显示的是在相同大鼠上的不同处理的受伤点的治疗开始后第9天时的照片。

图6：通过Stat1的管样结构和腔的诱导。人内皮细胞(ECV304)在无血清培养基中的纤连蛋白涂布的培养容器上生长。在添加重组Hu Stat1(0.5ng/ml)或PDGF(1ng/ml)后，在3天后通过透射光显微镜检查(x200)分析培养物。Stat1处理的培养物清楚显示萌芽(参见箭头)，而该现象在无血清培养物中基本上不存在。

图7：重组hu Stat1刺激人NK细胞的活性。人NK细胞通过MACSSeparation(Miltenyi Biotec，#130-092-657)从人外周血单核细胞中分离，获得<97％CD56+NK细胞群体(B)。CD56+细胞分离前百分比为13％(A)。CD56+富集的细胞充当细胞毒性测定法中的效应物，所述细胞毒性测定使用A431细胞作为靶(E:T比：10:1)且使用ECIS测试系统作为读出系统(C)。蓝线指示在hu IL-2(50U/ml)的存在下的NK细胞活性，并且绿线指示NK细胞加上hu Stat1(0.5μg/ml)。仅在培养基的存在下的NK细胞(红色，顶线)从未达到Stat1或IL-2处理的细胞的活性。

图8a：在人原代皮肤成纤维细胞中通过重组Stathmin1的hu IL-8诱导。人原代皮肤成纤维细胞在不含50ng hu Stat1(红色条)的无血清培养基中或在50ng hu Stat1存在下(绿色条)的无血清培养基中培养。细胞在18小时后收获，裂解且通过对于可溶性受体分子特异性的蛋白质阵列(R&D)分析。通过化学发光分析蛋白质阵列。

图8b：在人原代皮肤成纤维细胞中通过重组Stathmin1下调TIMP-1和-2。人原代皮肤成纤维细胞在不含50ng hu Stat1(红色条)的无血清培养基中或在50ng hu Stat1存在下(绿色条)的无血清培养基中培养。细胞如图8b中所述进行分析。

图9：在37℃下在伤口液体中的hu Stat1稳定性。将1.5μg hu重组Sta1与Tris缓冲液、人血浆或衍生自慢性伤口的伤口液体混合，在37℃下温育所示时间，通过SDS-PAGE分离且通过蛋白质印迹使用兔抗hu Stat1血清进一步分析。

图10：Hu Stat1在水凝胶中稳定至少5个月。Hu重组Stat1溶解于0.9％NaCL中或在水凝胶中混合，并且贮存于所示温度下。在1、3和5个月后通过SDS-PAGE和考马斯染色分析1μg Stat1。

图11a：微型PET成像。在施用124I-hu Stat1(5μg)后，来自一只大鼠的总计数据的投影图像(3个床位置，各自10分钟扫描)。伤口可以通过清晰的白斑在图像中鉴定。

图11b：微型PET成像。在施用124I-hu STAT1(5μg)后24小时，来自一只大鼠的总计数据的投影图像(3个床位置，各自10分钟扫描)。伤口可以通过清晰的白斑在图像中鉴定。

图12：hu Stat1在雄性Zucker大鼠中的伤口愈合模型中的功效。显示的是在第8和9天时的伤口区域发展(伤口大小的减少百分比)。当用huSTAT1(25μg/伤口)处理时，伤口大小显著减少。相比之下，与未经处理的伤口相比较，重组PDGF仅发挥较小效应，并且明显弱于hu Stat1。

图13：重组stathmin与I型胶原组合且通过ELISA分析释放研究。

a)0.4％胶原凝胶浸渍有50mg stathmin，并且通过stathmin特异性ELISA测定释放的蛋白质的量；b)由胶原释放的stathmin是生物学活性的。显示的是通过在胶原-stathmin上生长或由来自胶原-TMBP凝胶的SN培养的人内皮细胞分泌的IL-8水平；c)人内皮细胞在胶原1型上良好生长。显示的是在过夜培养后获得的显微照片，基本上未显示差异。

图14a：通过qRT-PCR的基因表达分析，所述qRT-PCR是用于精确定量和表征来自分离的核糖核酸信使的基因表达的标准方法。

图14b：图2b：经由ELISA定量白血细胞分泌的免疫应答蛋白质。

图15：使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的体外管形成。显示的是3次独立实验的平均数。

实施例

实施例1：材料与方法

1.1 细胞培养：

原代细胞(SNF，PS)是衍生自来自经历整形外科的患者的人皮肤的成纤维细胞。将组织样本切割成小片，剥离脂肪组织且在37℃下在胶原酶/分散酶的存在下温育4小时。

细胞系：AB4细胞是类似浆细胞样树突状细胞的人细胞，并且衍生自具有组织细胞增多症的患者。ECV304和A431分别是具有内皮和上皮起源的人细胞系。细胞在RPMI1640中培养，所述RPMI1640补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/ml青霉素-100μg/ml链霉素(所有试剂均来自PAA Laboratories，Linz，奥地利)。细胞以1:4的比率每周传代培养两次。

1.2 试剂：

重组IL-2、VEGF和PDGF得自PeproTech(London，UK)。牛胶原I型和纤连蛋白购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。水凝胶指(Gothenburg，瑞典)，并且含PDGF水凝胶通过Janssen-Cilag(比利时)获得。

1.3 人Stathmin1的克隆、表达和功能特点

-来源：衍生自人细胞系AB4的cDNA

-如专利AT 412281 B中所述的浆细胞样树突状B细胞

-在大肠杆菌(菌株BL21)中表达

-纯化至同质

-技术细节在参考文献1-5中描述。

1.3.1 克隆

根据供应商的说明书，由ImProm-II Reverse Transcription System(Promega)生成AB4 cDNA。用Phusion High Fidelity DNA聚合酶、寡核苷酸“hu STAT1-NcoI-F”和“hu STAT1-Bsu-R”以及作为模板的AB4-cDNA设置PCR反应，以生成在5'末端具有NcoI限制性位点和在3'末端具有Bsu36I限制性位点的PCR产物。

PCR产物和pTriEx4-Neo质粒DNA用NcoI和Bsu36I在37℃下消化2小时。消化产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。消化的PCR产物和质粒DNA的各自条带由琼脂糖凝胶纯化，并且用T4 DNA连接酶在室温下连接4小时。在42℃下使用热休克30秒，将连接反应物转化到TOP10 One Shot化学感受态细胞内。转化反应在具有氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺平板，并且在37℃下温育12小时。

菌落PCR用GoTaq DNA聚合酶以及寡核苷酸“hu STAT1-NcoI-F”和“huSTAT1-Bsu-R”进行，以鉴定阳性转化体。

PCR产物在琼脂糖凝胶上检查，阳性转化体显示在琼脂糖凝胶中在450bp处的特异性条带。将阳性克隆接种到具有氨苄青霉素的4ml LB肉汤内，在37℃下温育12小时。

根据制造商的说明书，用High Pure Plasmid Isolation Kit进行质粒制备。质粒DNA在37℃下用NcoI和Bsu36I消化2小时，以进一步验证阳性转化体。

hu STAT1成功地克隆在pTriEx4-Neo和TOP10 One Shot化学感受态细胞中。在NcoI/Bsu36I控制消化后，在pTriEx4-Neo/TOP10克隆4、6和8中的hu STAT1显示在琼脂糖凝胶中在450bp处的各自条带(参见图1)。

将阳性转化体的质粒DNA送往MWG Biotech(Munich，德国)用于序列验证，并且采用多重序列比对工具，通过比对所得到的序列与来自genbank的参考hu STAT1序列进行评估。

1.3.2 表达

含有以NcoI/Bsu36I克隆于pTriEX-4 Neo中的hu Stat1的BL21 DE3大肠杆菌克隆4-3在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中生长至OD₆₀₀>0.5。在添加1mM IPTG后诱导hu Stat1(17,3kD)的特异性蛋白质条带。通过以4,500rpm离心1小时收获细菌细胞。将细胞团块重悬浮于裂解缓冲液中(来自10ml培养物的团块在500μl裂解缓冲液中)，并且进行3个冻/融循环以进行细胞裂解。随后，通过以4,500rpm离心1小时，将裂解产物分离成细胞碎片和上清液。裂解产物-上清液通过0.45μm针筒式滤器进行过滤。

1.3.3 阴离子交换色谱法

将裂解产物-上清液施加于在Purifier FPLC System上具有阴离子交换缓冲液A的Capto DEAE Sepharose Fast Flow(GE Healthcare，德国)。用10CV阴离子交换缓冲液A从柱中洗涤未结合的样品，随后用10CV 5％阴离子交换缓冲液B洗涤柱。对于洗脱，将5CV 20％阴离子交换缓冲液B施加于柱。洗脱物收集于15ml级分中，并且在具有考马斯染色的12％BisTris凝胶上分析。

1.3.4 硫酸铵沉淀

将来自阴离子交换色谱法的含hu STAT1级分合并，并且用30％硫酸铵沉淀，在4℃下搅拌24小时。在沉淀后，通过以4500rpm离心10分钟，样品分离为团块和上清液。上清液通过0.45μm针筒式滤器进行过滤。

1.3.5 疏水作用色谱法

来自硫酸铵沉淀的上清液施加于在Purifier FPLC System(GEHealthcare)上具有HIC缓冲液A1的Octyl Sepharose Fast Flow。用10CV HIC缓冲液A从柱中洗涤未结合的样品。对于洗脱，进行超过20CV来自0-100％HIC缓冲液B的梯度。洗脱物收集于10ml级分中，并且在12％BisTris凝胶上用考马斯染色、银染色和蛋白质印迹分析。

将来自HIC步骤的含hu STAT1级分合并，并且用Centrifugal FilterDevice(Millipore，Vienna)浓缩，在该步骤还将缓冲液更换成20mM TrispH 7.3。最后，产物通过0.2μm针筒式滤器进行灭菌。所得到的产物的纯度通过银染色加以证明(参见图3泳道10)。蛋白质身份在靶蛋白质特异性蛋白质印迹中加以验证(参见图3，泳道12)。

在pTriEx4 Neo/TOP10克隆4中的hu STAT1的插入片段序列与huSTAT1相同，并且在限制位点5'-NcoI和3'-Bsu36I处正确连接到pTriEx4-Neo载体内，因此允许不含载体编码氨基酸的天然蛋白质的表达(参见图2)。

SDS-PAGE

1.3.6 细胞裂解产物和培养上清液的蛋白质印迹分析

AB4和PS-F细胞在具有RPMI、10％FCS(PAA)的75cm²烧瓶中培养，随后将培养物维持在无血清RPMI(PAA)中48小时。在那之后，通过离心收获AB4细胞，并且以2x10^6细胞/ml的浓度重悬浮于0.5％(v/v)Triton中，PS-F细胞用胰蛋白酶(PAA)处理，并且以2x10^6的浓度重悬浮于0.5％Triton中。收集两种细胞系的培养上清液，并且用U-Tube Concentrator，2H-2(Merck)浓缩。细胞裂解产物和上清液在12％Criterion XT Bis-Tris Gel(Biorad，Vienna)上分离，并且通过半干印迹转移至PVDF膜(Carl Roth，德国)。膜用在TBST中的3％(w/v)脱脂奶粉在37℃下封闭1小时，随后为三次10分钟洗涤(2x使用TBST，1x使用TBS)。来自先前用Stathmin1免疫接种的兔的血清在TBST中1:100稀释，施加于膜并且在4℃下温育24小时。在三个洗涤步骤后，膜与Immun-Star Goat Anti-Rabbit(GAR)-HRPDetection Kit(Bio-Rad Laboratories)一起温育，并且用ChemiDoc MP系统(Bio-Rad Laboratories)分析。

1.4 电细胞阻抗传感

ECIS电极阵列(8W1E)得自IBIDI，Munich。在种植细胞前，阵列在37℃下用在超纯水中以5μg/ml的纤连蛋白(Sigma-Aldrich，F1141)涂布3-4小时。在涂布后，吸出纤连蛋白，在室温下干燥并且贮存于无菌条件下。

取决于细胞类型和应用，可以使用不同的细胞浓度；1×10⁵细胞/ml在2–3天内产生汇合层。

在FN涂布后，将200μl无血清RPMI添加于每个孔。将阵列放入CO₂温箱内用于培养基调整至大气，以促进更佳的细胞贴壁。基本上如由Keese等人(8)描述的，使用ECIS Model 1600R(Applied Biophysics，USA)测量细胞增殖、受创和细胞毒性。

1.5 血管生成测定法

使用在涂布有纤维蛋白原/凝血酶的培养容器中生长的ECV304细胞测量血管生成。简言之，将30μL纤维蛋白原溶液分散到平底96孔板的孔内。使板轻轻振荡，以确保纤维蛋白原溶液覆盖孔的底部，随后将20μL/孔凝血酶加入96孔板。

使板振荡且置于37℃下15-60分钟用于聚合。待测试的蛋白质(r huStat1)在无血清培养基中稀释。在无血清培养基中的100μL ECV 304细胞(10⁵细胞/ml)加入96孔板的孔中，随后添加100μl各自的r hu Stat1溶液。使用hu rVEGF-165(Peprotech，UK)作为阳性对照。使培养物在37℃、5％CO₂下温育，并且在24、48和72小时后通过光学显微镜检查/数字摄影术进行分析。

1.6 NK介导的细胞毒性

肝素化血液从健康志愿者中抽取，并且外周血单核细胞通过Ficoll密度离心分离。随后，根据Milteny的方案，通过用磁珠的负选择分离NK+细胞。(NK Cell Isolation Kit，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)。细胞群体的纯度通过流式细胞术进行测定。收集所得到的NK级分，计数且通过FACS分析检查纯度。

将1x10⁵A431细胞种植到8孔ECIS阵列内。在24小时后，将1x10⁶NK细胞加入每个孔(靶：效应物比1:10)。加入不同浓度的重组hu Stat1；rhu IL2(50单位/ml；Peprotech，UK)用作阳性对照。观察靶细胞系的阻抗几天，以便评价NK细胞介导的杀死。在A431的一个孔中不加入NK，以便测定在没有诱导时A431死亡的时间点。

1.7 用stathmin刺激的SN-F细胞的基因表达

SN-F细胞(原代细胞皮肤成纤维细胞)在RPMI-1640培养基中培养，所述RPMI-1640培养基补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素。在达到约80％汇合后，使细胞受胰蛋白酶作用，并且以200 000细胞/孔的细胞数目种植到6孔板上。对于刺激，将以5μg/ml、50ng/ml和500pg/ml浓度的rhuStat1加入培养物中。在刺激时间(2小时、6小时、24小时、48小时)结束后，使细胞从孔中脱离且进一步加工用于RNA分离。

用Promega的SV Total RNA isolation System(Promega，Madison，USA)分离总RNA。为此，使细胞受胰蛋白酶作用并且以800rpm离心10分钟。在那之后，将团块在1xPBS中稀释且以300g离心5分钟，并且将剩余细胞团块在175μl裂解缓冲液中裂解。最后，将350μl稀释缓冲液加入裂解的细胞中，并且使样品在70℃下温育3分钟。随后，将样品以13 000xg离心10分钟。所有进一步步骤均根据制造商的方案进行。

所得到的RNA制剂进一步加工用于cDNA合成，使用Promega的“ImProm II^TM Reverse Transcription System”(Promega，Madison，USA)。对于看家基因和特异性基因的PCR反应，使用两种不同的主混合物(mastermixes)。每种主混合物补充有组合增强剂溶液(CES)，其由2.7M甜菜碱、6.7mM DTT(二硫苏糖醇)、6.7％DMSO(二甲基亚砜)和55μg/ml BSA(牛血清白蛋白)组成。

借助于因特网工具Primer Design Assistant(PDA)设计引物，并且由VBC Oligotech(Vienna，奥地利)合成。所有引物均以10pmol的最终浓度使用。引物在表1中给出：

表1：引物序列(以降序的SEQ ID NO 4-21)

生长因子	引物序列	产物大小(bp)
			IFNα	F:CCTGGATAACAGGAGGACCTTG	400
	R:CCAGGCACAAGGGCTGTATTTC
			IFNβ	F:CTGCCTCAAGGACAGGATGAAC	350
	R:TGACTATGGTCCAGGCACAGTG
			PDGF-B	F:CCCCACACTCCACTCTGATT	181
	R:GCCCTGGCCTCTAGTCTTCT
			FGF-2	F:ATGAAGGAAGATGGAAGATT	216
	R:TCAGCTCTTAGCAGACATTG
			HGF	F:CAAATGTCAGCCCTGGAGTTCC	400
	R:AATTGCACAGTACTCCCAGCGG
			TGFβ	F:CACGTGGAGCTGTACCAGAA	239
	R:GAACCCGTTGATGTCCACTT
			VEGF-A	F:TCGGGCCTCCGAAACCATGAAC	320
	R:TGGCCTTGGTGAGGTTTGATCC
			KGF	F:ACACCCGGAGCACTACAC	168
	R:GGGCTGGAACAGTTCACATT
			核糖体蛋白质1	F:GTCAACATTGGGAGCCTCAT	176
	R:AGACCAAAGCCCATGTCATC

通过比较30、35和40个循环测定适当的循环数。考虑到在35个循环后可以观察到最佳结果，确定该数目用于进一步使用。

PCR样品的琼脂糖凝胶电泳在1％琼脂糖凝胶(1g琼脂糖+100ml 1xTris硼酸盐EDTA(TBE)缓冲液)中进行。代替溴化乙啶，凝胶用7μlGel Star Nucleic Acid染剂进行染色。对于分析，将15μl PCR和10μl DNA梯(100bp DNA梯，New England Biolabs)装载到凝胶上，并且电泳在115V下运行大约45分钟。准备好的凝胶的照片在UV透视仪下获得。

通过Kapelan(Leipig，德国)用软件LabImage 1D进行图像分析。借助于该程序，通过比较样品的DNA条带与标记中的DNA量来定量DNA的量。

1.8 人可溶性受体阵列

人原代成纤维细胞(SN-F)在50ng/ml TMBP3(RPMI培养基+10％FCS+TMBP3)的存在下培养过夜，或未受刺激(RPMI培养基+10％FCS)。在培养后，使细胞脱离，用PBS清洗并且在裂解缓冲液(阵列试剂盒的一部分)中以1x10⁷细胞/ml的浓度溶解。裂解产物在4℃下摇动30分钟。在微量离心5分钟后，将上清液转移到干净的试管内。根据随hu可溶性受体特异性的Proteome ProfilerArray(R&D，目录号ARY012)提供的R&D方案，完成所有进一步步骤。

在添加化学发光试剂后，用UVP BioSpectrum AC Imaging System(UVP，Upland，CA.)测量信号的光强度，伴随30分钟的曝光时间。用软件Phoretix Array分析所得到的照片，所述软件Phoretix Array是TotalLabTL100程序(Nonlinear Dynamics Newcastle，英国)的一部分。该软件计算每个个别斑点的像素值(光强度)。

1.9 正电子发射断层摄影术(PET)研究

Stat1用碘-124和氯胺T进行标记，随后为纸电泳和HPLC用于质量控制。使3只雄性Spraque Dawley大鼠受伤。使大鼠麻醉且在身体背部上剃毛。使用活检穿孔器(Fa.Henry直径:0.8cm)，通过兽医外科医生制备两个全层伤口。在伤口设置后，将动物置于维持在38℃下的microPET床上。动物用在50μl水凝胶中的5μg或100μg r huStat1进行处理。使用Focus220 microPET扫描仪(Siemens Medical Solutions，Munich)进行在0、4、8和24小时的4次扫描。测量直接在放射性示踪剂施用后4、8和24小时后进行。为了覆盖大鼠的全身，获得在3个床位置处的10分钟静态扫描。所有图像使用FORE重排(rebinning)进行重建，随后为过滤反向投影算法。感兴趣的区域(ROI)在重建图像上手动描绘。

1.10 在Zucker大鼠中的体内伤口愈合

雄性Zucker大鼠(Crl:ZUC-Lepr^fa(fa/fa)用作体内模型，以测试r hu Stat1在延迟的伤口愈合中的功效。在每只大鼠的剃毛背部上通过活检穿孔器设置单个伤口。伤口用不同浓度(25.5μg或0.5μg)的在50μl水凝胶中的r huStat1、50μl进行处理，或不予处理。伤口用extramince(CovaTec)闭合，并且用Leukoplast固定。在每只动物上，在背部上设置一个圆形脊柱旁皮肤-表皮全层伤口，并且每天用不同剂量的hu STAT1(0.5μg/伤口、5μg/伤口和25μg/伤口)或(5μg/伤口)进行局部处理。作为另外的对照，在未经处理的动物上设置一个圆形脊柱旁皮肤-表皮全层伤口。测试物品hu STAT1和参考物品是非常良好耐受的。大鼠在12天的时期每天进行处理。通过数字摄影术评估伤口，所述数字摄影术用于伤口大小测定。单个伤口面积的程度表示为原始伤口大小的百分比。通过由数字照片计算伤口面积进行愈合过程的分析。使用曼怀二氏U检验分析处理的效应。

1.11 伤口液体中的Stathmin稳定性

纯化的重组Stathmin以100μg/ml浓度分别稀释于0,9％(w/v)NaCl、伤口液体和人血清中，并且在37℃下温育总共72小时。在不同时间间隔时取样(15μl)，并且在12％Criterion XT Bis-Tris Gel(Biorad)上分离。膜转移和封闭如前所述进行。来自先前用Stathmin免疫接种的兔的全血清在TBST中1:1000稀释，施加于膜且在室温下温育1小时。在三个洗涤步骤(如前所述)后，使膜与针对兔IgG-H&L-AP(Abcam)的山羊多克隆二抗一起在室温下温育1小时，所述二抗在TBST中1:1000稀释。在另外三个洗涤步骤后，膜根据制造商的指导由稀释的用于印迹和免疫组织化学(Roche)的NBT/BCIP储液覆盖，并且在室温下温育10分钟。

1.12 水凝胶制备

不含丙二醇的海藻酸盐-凝胶：

含丙二醇的海藻酸盐-凝胶：

具有研棒的塑料研钵必须在分析天平上称皮重。海藻酸钠盐必须称重到塑料研钵内，并且必须加入等量去矿物质水。小心地，用该水的一部分研磨盐。必须注意下述事实：海藻酸钠盐不能粘在塑料研钵的底面上。为了移除它，可以使用刮刀。在小心搅拌下，剩余水必须缓慢地及分部分地加入混合物中。必须小心避免制剂中的气泡。在搅拌一会儿后，海藻酸钠盐将在水中分散并且将开始胶凝。现在塑料研钵须贮存于冷藏库中至少12小时。

此时缺失的10g将以后与治疗蛋白质一起加入。

必要时，pH可以用NaCl溶液进行调整。

产生的凝胶必须进行灭菌。对于该步骤，样品将置于高压灭菌器中在120℃下30分钟。

对于作为治疗性蛋白质的stathmin的添加，下一步必须在层气流下完成，以确保杀菌条件。治疗性蛋白质必须溶解于水中。药物浓度决定为500μg/ml。对于100g制剂，具有所决定的浓度的10g蛋白质溶液必须通过孔径0.45μm的无菌滤器过滤。将无菌水溶液注射到凝胶内。其后通过在凝胶灭菌的容器中混合凝胶和蛋白质溶液完成均质化。每种制剂必须在涡旋下均质化。制剂随后贮存于在2℃至8℃下的冷藏库中。

1.13 用stathmin浸渍胶原1型凝胶

I型胶原与stathmin组合以获得在凝胶中100μg/ml的最终重组蛋白质浓度，并且将100μl凝胶混合物加入96孔板的每个孔。在37℃下温育1小时后，含或不含stathmin的含凝胶孔用200μl不含血清的培养基覆盖，并且在37℃下1、6或16小时温育后收集100μl，以分析在培养基中释放的重组stathmin的量。释放的stathmin量通过夹心ELISA进行定量。值以输入的百分比表示。ELISA：板用抗stathmin小鼠单克隆抗体涂布，并且用在缓冲液中的5％BSA封闭。来自样品的可溶性stathmin通过单克隆抗体捕获，并且通过多克隆抗体进一步识别。最后，将生物素缀合的免疫球蛋白和辣根过氧化物酶-抗生物素蛋白加入孔中。在清洗后，使板与ultra-TMB底物一起温育，并且在450nm处测量变色，并且与标准值相比较，以计算每个孔中的stathmin量。

功能活性：根据制造商的说明书制备胶原(I型)凝胶(Gibco，Collagen I(5mg/mL)，目录号A10644-01)。简言之，制备下述试剂且在冰上冷却：10xPBS、1M NaOH、用于细胞培养的H₂O、stathmin储液(5.5mg/mL)、1x PBS和0.5％胶原I储液自身。对于1.5mL凝胶，150μL 10x PBS、30μL NaOH、92.73μL H₂O、27.27μL stathmin或1x PBS和1.2mL胶原I储液在冰上充分混合，以获得含/或不含100μg/mL stathmin的0.4％胶原I凝胶。小心地转移100μL该胶状物溶液/96孔，从而避免当覆盖表面时的气泡。凝胶形成将在RT下发生-在将96孔板置于37℃1小时后，凝胶形成完成。

对于使用凝胶上清液(SN)的实验，加入200μL DMEM/孔。在所示时期(1、6和16小时)后取出150μL凝胶SN，并且贮存于分开的96孔板用于评价释放功效(stathmin ELISA，针对50μg/mL stathmin溶液控制)和/或刺激ECV304细胞(IL-8ELISA)。

对于使用在凝胶自身上细胞的实验，如上制备对照/含stathmin凝胶。ECV304细胞在0％FCS/DMEM中洗涤，并且在0％FCS/DMEM中达到30x10^3/mL的密度–其含有6x10^3ECV304细胞绝对值的200μL用于凝胶顶部。

ECV304细胞：细胞种植到10％FCS/DMEM中的96孔板中3小时。随后，将板在槽上倒置，印干，用PBS洗涤且再次印干。将200μL刺激混合物(在0％FCS/DMEM中)/孔由分开制备的96孔板转移到含有ECV304细胞的96孔板，例如0相对于50μg/mL stathmin溶液或胶原I凝胶SN。

1.14 在人内皮细胞和造血细胞中的细胞因子表达

ECV304细胞用或不用stathmin(50μg/ml)处理6小时。分离RNA，并且通过qRT-PCR分析靶基因的表达。(n＝3)数据针对看家基因(GAPDH)标准化，并且值表示为与未经处理的条件相比较的倍数变化。

2.结果

2.1 Stathmin由类似于浆细胞样树突状细胞的人细胞分泌

AB4细胞是从具有组织细胞增多症的患者的淋巴结中分离的永久生长的人细胞。这些细胞类似浆细胞样树突状细胞，因为它们表达该特定细胞类型的多种功能和表型特点(即膜抗原表达、抗原呈递能力、树突状形状、高IFN-1型表达)。AB4细胞在无血清培养基中培养48小时，并且细胞裂解产物和培养上清液两者均通过灵敏的蛋白质印迹操作进行分析，其可以容易地检测下至5ng水平的Stat1。在AB4细胞的裂解产物和培养上清液两者中，通过Stat1特异性兔免疫血清可以检测到在17.3kD处的清楚的切割信号。相比之下，在原代人皮肤细胞中，仅在细胞裂解产物中，可以检测到模糊条带。培养上清液基本上缺乏分泌的Stat1(参见图1)。Stat1的分泌是惊人发现，因为迄今为止该蛋白质已在文献中描述为与细胞骨架结构和/或TLR3相关，并且专一地细胞内表达。

2.2 人上皮细胞通过hu Stat1的增殖

电细胞-基质阻抗传感用于进行组织培养中的伤口愈合和细胞增殖。人上皮细胞系A431在ECIS电极阵列中培养48小时。在那时，细胞已达到汇合并且阻抗达到平台。数据采集暂时暂停，并且孔接受升高的场脉冲，一次10秒并且另一次30秒；数据采集随后重新开始。在脉冲后立即，将多种浓度的hu Stat1加入个别培养物中。10％FCS加入阳性对照孔中，而阴性对照培养物仅接受无血清培养基。Stathmin1以剂量依赖性方式快速诱导覆盖电极的区域中的细胞增殖，这与阳性对照培养物可比较。无血清培养基没有作用(图4)。

有趣的是注意到存在Stat1和胶原1型的组合作用。虽然胶原单独对Zucker大鼠中的伤口愈合没有作用，但Stat1和胶原的组合令人满意地恢复受伤区域(图5)。

2.3 hu Stat1诱导新生血管生成/萌芽/管样结构

在下肢/足区域中的微血管丧失和伴随的组织营养不良是DFU的标志之一。因此，重建微血管系统是非常重要的。如图6中可见，r hu Stat1对人内皮细胞的添加导致强应答。这通过众多萌芽、腔和管样结构的形成是显而易见的。在不存在Stat1的情况下，未观察到此类反应。在PDGF处理的培养物中也存在一些萌芽/腔，但程度少得多。

2.4 hu Stat1刺激NK细胞介导的细胞毒性

几乎所有慢性伤口均由病原体定殖，并且需要用抗生素治疗。因为伤口区域是细菌生长的理想环境，所以通过树突状细胞或天然杀伤细胞的第一线防御将是期望的。在文献中存在Stat1是TLR3的拮抗剂的报告(WO07/089151)。然而，在本发明之前不存在Stat在免疫防御机制中起作用的功能证明。

因此，设计了基于ECIS的NK测定法，其中靶细胞的杀死可以通过高度富集的人NK细胞实时进行测量。r hu Stat1的添加事实上导致NK细胞的活化和在小于四天后的靶细胞的完全破坏(图7)。

2.5 在原代人皮肤成纤维细胞中Stat1介导的细胞因子/生长因子特异性mRNA的诱导

慢性伤口的重要特点是某些细胞因子/生长因子基因表达的不存在或下调。这是重大缺点，因为这些蛋白质不仅支持表皮/皮肤细胞增殖和迁移，还支持树突状细胞、间充质干细胞和组织重塑的功能。结果在表2中总结。如可见，原代人皮肤成纤维细胞可以通过Stat1活化，以上调在慢性伤口中不存在的除PDGF之外的细胞因子/生长因子。此外，分析的基因的基因表达对于位于皮肤中的免疫细胞和干细胞的细胞功能是至关重要的。

表2：生长因子/细胞因子基因的活化

2.6 Stat1上调IL-8且阻遏TIMP-1和-2表达

为了扩展由Stat1刺激的蛋白质的分析，进行了蛋白质阵列研究。在图8a和8b中，显示了对于伤口愈合重要的蛋白质结果(IL-8、TIMP-1,-2)。Il-8，其为PMN的重要化学吸引剂，比刺激8倍。生物活性IL-8在伤口中表达且增强伤口愈合。

有趣的是，Stat1使金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)(抑制金属蛋白酶(MMP)的一类酶)被阻遏50％。MMP对于在伤口愈合期间的诸如瘢痕恢复和再上皮化的活性是重要的。TIMP的下调对于在伤口愈合期间的重塑可能是关键的。

2.7 rhu Stat1的稳定性

蛋白质在伤口液体中变得快速降解。Stat1作为用于治疗的生物制品的用途的必要条件是其在伤口中的稳定性以及在水凝胶中配制两者，所述水凝胶是计划用于临床试验中的制剂。

为了测试蛋白质的稳定性，进行两个实验系列：

1.重组样品在伤口液体的存在下在37℃下温育，随后为经过图10中所示时间的蛋白质印迹分析。如可见，Stat1最高达8小时可检测，这是诱导在慢性伤口中不存在的细胞功能的充足时间。

2.重组样品与水凝胶(Normlgel，)混合，并且在4℃、-20℃和-80℃下温育。样品在图10中所示的时间获得，并且通过SDS-PAGE分析。结果显示样品保持完整至少5个月，而无任何降解迹象，并且因此完全适合于临床中的进一步应用。

2.8 在局部施加后hu Stat1的分布-微型PET成像

研究的目标是评估在局部施用到全层伤口内后，放射性标记的huSTAT1的局部和全身分布。

研究显示¹²⁴I标记的hu STAT1的组织分布和药物代谢动力学可以使用微型PET技术进行测量。在物质应用后4小时开始，在经处理的动物中在5μg和100μg hu STAT1之间发现放射性分布中的差异(图11a和11b)。放射性水平在膀胱、胃和甲状腺中也是可检测的。除这些器官之外，在身体的任何区室中未观察到放射性标记的hu STAT1的摄取。在胃、甲状腺和血液中的更高水平可能与游离碘的摄取相关，因为¹²⁴I-hu STAT1储液已含有4％游离碘，即使在这些器官中的放射性摄取小于文献中报告的。在所有测试对象的膀胱中的放射性摄取指示放射性标记的产物的肾清除。

总之，该研究明确指示绝大部分¹²⁴I-hu STAT1保留在伤口区域中。在PET图像中不可见其他器官，意味着在身体的其他区域中无¹²⁴I-huStathmin的大量摄取。

2.9 hu STAT1诱导Zucker大鼠中的剂量依赖性的、加速的伤口愈合。

该研究的目的是测试hu STAT1与(PDGF)相比较在使用雄性Zucker大鼠的伤口愈合模型中的功效，所述Zucker大鼠代表慢性伤口研究的模型。应当指出Zucker大鼠展现代谢综合征，并且与正常动物相比较，具有延迟的伤口愈合。在该体内系统中最相关的伤口愈合期在第8天开始。

从研究第8天起，与PDGF处理的动物相比较，hu STAT1处理的动物(组3、4和5)显示生物学显著的更小的伤口面积(图12)。除了这点，伤口的愈合遵循剂量依赖性方式。此外，hu STAT1加速伤口愈合。最快的伤口愈合在hu STAT1高剂量组(25μg/伤口)中记录到，在第9和10天时具有超过PDGF组的统计学显著的优势。总之，hu STAT1加速具有慢性伤口的动物中的愈合，并且优于目前的标准治疗。

在stathmin与胶原的组合中，伤口愈合进一步增加，伴随快速的上皮化和伤口闭合(图5)。

2.10 胶原凝胶

胶原是遍及许多物种频繁发现的天然蛋白质。基本上，I型胶原是在结缔组织中发现的最丰富的胶原类型。此处，I型胶原以0.4％的最终浓度连同和不连同重组stathmin一起使用。如图13c中可见，如通过ELISA测定的，80％输入蛋白质从凝胶中释放。为了测试由胶原释放的stathmin是否是生物学活性的，人内皮细胞在胶原-stathmin缀合物上或从这些凝胶/蛋白质组合中释放的上清液中生长。在含/不含细胞培养物16小时后，100μL SN样品测试IL-8分泌且标绘为相对各自背景的％IL-8分泌(100％＝2倍)。由图13b中所示的结果，显而易见的是内皮细胞被活化且通过IL-8的分泌响应。

分析显示在16小时后的stathmin的强释放，并且人靶细胞的刺激支持含stathmin敷料对具有慢性伤口例如糖尿病性足溃疡的患者的应用。

2.11：在人内皮细胞和造血细胞中的细胞因子表达

虽然编码免疫应答蛋白质例如白细胞介素(IL-6、IL-8)、趋化因子(MIP-2a)或干扰素(IFNα)的基因被stathmin诱导，但生长因子(例如VEGF)则不是(图14a)。

IL-6例如由淋巴细胞和巨噬细胞分泌，以刺激例如在感染和炎症期间的免疫应答反应。IL-8通过生物化学反应链分泌，并且是细胞迁移的重要介质，从而支持重塑和伤口闭合。MIP是由活化巨噬细胞产生的化学吸引蛋白质。它们对于针对感染和炎症的免疫应答是关键的。IFN是由响应病原体或肿瘤细胞的细胞合成且分泌的蛋白质。IFNα还是NK细胞的有力活化剂。感染是具有糖尿病性足溃疡的患者的重要并发症，并且通常导致小腿截肢。这些结果指示stathmin可能通过刺激自体NK细胞来减少患者中的感染水平。

虽然所有这些细胞因子支持伤口愈合，但增加的生长因子(例如VEGF)量可能导致不希望的细胞生长、增殖和分化刺激，并且因此保持致瘤潜力。

从未凝固的血液中分离PBMC，并且通过技术进一步分离为高度富集(>90％)的单核细胞。

免疫应答的活化是伤口愈合的必要条件。单核细胞具有响应炎症快速移动至感染部位的能力，并且因此参与愈合过程且是人类先天性免疫系统的重要组分。图14b显示响应仅用缓冲液的处理(阴性对照)、50μg/ml聚(I:C)(阳性对照)或25μg/ml重组stathmin，相对于单核细胞耗尽的白血细胞或分离的单核细胞，由PBMC分泌的两种细胞因子IL-8(左图)或MCP-1(右图)的量。n＝5

重组stathmin特异性作用于单核细胞，提示它通过触发化学吸引剂的产生来刺激免疫细胞和皮肤间充质细胞的浸润。

2.12 重组stathmin具有血管生成特性

在种植到适当基质上之后，细胞用PBS(阴性对照)、Dkk-2(阳性对照)或重组stathmin进行处理。n＝3(图15)。在37℃下温育7小时后，获得细胞照片用于定量。活化的HUVEC形成类似血管的管样结构。这可以通过分析显微图像进行定量。

重组stathmin显示血管生成效应。该效应强化重组stathmin在伤口愈合过程中的作用，因为慢性伤口缺乏微血管化。在该实验中使用的基质是Geltrex。

对于每个图像和每种条件手动计算形成的管数目。对于每个实验获得五个不同图像。

3.总结

Stathmin加速Zucker大鼠中的延迟的伤口愈合，并且不是全身活化的。另外，它组合了对于慢性伤口愈合关键的几个优点：促进皮肤细胞增殖，诱导血管生成和活化天然杀伤细胞活性。

此外，重组Stat1(stathmin)可用于活化对于免疫调节和癌症治疗重要的特异性细胞因子基因和蛋白质。

参考文献

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Claims

1.Stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞，其用于治疗患者中的慢性伤口或者疾病依赖性或药物疗法依赖性受损的伤口愈合和/或减少伤口结瘢。

2.用生物相容性基质配制或与生物相容性基质偶联的stathmin，其用于治疗患者中的伤口，优选慢性伤口或者疾病依赖性或药物疗法依赖性受损的伤口愈合，所述生物相容性基质优选包含胶原、明胶、壳聚糖和/或透明质酸。

3.根据权利要求1或2使用的stathmin、核酸或细胞，其中所述stathmin是人stathmin。

4.根据权利要求1、2或3使用的stathmin或细胞，其中所述stathmin是重组stathmin。

5.根据权利要求1-4中任一项使用的stathmin、核酸或细胞，其中所述stathmin包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至126，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1至126的序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项使用的stathmin，所述stathmin在水凝胶中配制。

7.根据权利要求1-6中任一项使用的stathmin、核酸或细胞，其中所述患者需要诱导血管生成、需要刺激先天性免疫应答和/或需要诱导细胞因子/生长因子和TIMP用于免疫调节或瘢痕减少。

8.根据权利要求1-7中任一项使用的stathmin、核酸或细胞，其中所述疾病依赖性受损的伤口愈合是由于选自下述的疾病：糖尿病或代谢综合征，慢性静脉功能不全(CVI)，外周动脉闭塞性疾病(PAOD)，癌症，自身免疫尤其是选自类风湿性关节炎、狼疮和青斑样血管病变的自身免疫，造口术，长期炎症过程，褥疮，优选地其中所述患者患有糖尿病或代谢综合征。

9.根据权利要求1-8中任一项使用的stathmin、核酸或细胞，其中所述药物疗法依赖性受损的伤口愈合是由于选自使用以下进行治疗的药物疗法：皮质类固醇、尼古丁、抗生素、免疫抑制剂、抗凝血剂、细胞毒性药剂、抗风湿病药剂、血管收缩剂。

10.根据权利要求1-9中任一项使用的stathmin、核酸或细胞，其中所述伤口选自慢性或不愈合的糖尿病足伤口，溃疡特别是静脉溃疡、褥疮或压力性溃疡，烧伤优选三度烧伤，外科伤口，意外伤口，坏死伤口，感染伤口。

11.药物组合物，其包含用生物相容性基质配制或与生物相容性基质偶联的stathmin，所述stathmin任选如权利要求3-6中任一项进一步定义，所述生物相容性基质优选包含胶原、明胶、壳聚糖和/或透明质酸，特别是水凝胶基质，优选海藻酸盐。

12.根据权利要求11的药物组合物，其用作药物。

13.根据权利要求11的药物组合物，其用于治疗伤口或瘢痕，优选如权利要求1、7-10中任一项中进一步定义的。

14.一种体外方法，其用于增加或诱导间充质细胞、表皮细胞和/或干细胞，特别是基质干细胞的增殖和/或迁移，刺激免疫细胞优选天然杀伤细胞，刺激成纤维细胞，刺激上皮细胞优选表皮的上皮细胞，或刺激血管生成，特别是刺激所述细胞尤其是间充质细胞和/或成纤维细胞中的IL-8产生，刺激单核细胞和/或巨噬细胞，

所述体外方法包括给所述细胞施用stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞的步骤。

15.一种方法，其用于在患者中增加或诱导间充质细胞和/或干细胞，特别是基质干细胞的增殖和/或迁移，刺激免疫细胞优选天然杀伤细胞，刺激成纤维细胞，刺激上皮细胞优选表皮的上皮细胞，或刺激血管生成，特别是刺激所述细胞尤其是间充质细胞和/或成纤维细胞中的IL-8产生，刺激单核细胞和/或巨噬细胞，

所述方法包括给所述患者施用stathmin、编码所述stathmin的核酸或表达stathmin的细胞的步骤，优选通过在伤口上的局部施用。