AT412281B

AT412281B - Verfahren zur herstellung einer von rosai-dorfmann disease stammenden, menschlichen plasmacytoiden dendritischen zellinie

Info

Publication number: AT412281B
Application number: AT0178802A
Authority: AT
Inventors: Rudolf Dr Berger
Original assignee: Rudolf Dr Berger
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2002-11-29
Publication date: 2004-12-27
Also published as: ATA17882002A

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Stand der Technik 
Dendritische Zellen (DZ) sind Immunzellen die man sowohl in Geweben als auch in peripherem Blut findet. Sie können ausgezeichnet Antigen präsentieren und sind Targetzellen für das mensch- liche Immundefizienzvirus HIV-1 (human immunodeficiency virus-1,   HIV-1).   Diese Eigenschaften machen sie ausserordentlich interessant für biomedizinische Anwendungsbereiche wie Tests für neue anti-allergisch wirkende Substanzen oder für Infektionsstudien mit HIV-1. Es ist möglich, DZ für eine beschränkte Zeit in Kultur wachsen zu lassen   ( < 3   Wochen). Permanent wachsende menschliche DZ Linien waren bis jetzt nicht verfügbar. Das ist insofern ein grosser Nachteil, da sich Testbedingungen jedes Mal ändern wenn man neu isolierte DZ verwendet. Daher sind permanent wachsende DZ von enormer Bedeutung. 



   Wir haben eine Methode angewandt, die die Etablierung permanent-wachsender DZ Linien aus menschlichem Gewebe erlaubt. Hier beschreiben wir eine so genannte plasmazytoide DZ Linie die von einem Patienten mit Rosai-Dorfman Erkrankung (RDD) stammt. RDD ist eine seltene Erkran- kung die Lymphknoten befällt und durch grosse, durchscheinende Phagozyten chakterisiert ist. Am ersten Blick sehen die Zellen den epidermalen Langerhans Zellen ähnlich. Das sind Antigen- präsentierende Zellen myeloischen Ursprungs in der Haut, die einfach durch ultrastrukturelle Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie differenziert werden können. 



   Biopsiematerial eines 6-jährigen Patienten wurde unter Anwendung eines speziellen, für die Langzeitkultivierung dendritischer Zellen entwickelten Protokolls, gezüchtet. Die resultierende   Zellline (im Folgenden plasmazytoide dendritische Zelllinie, PDZ genannt ; Bezeichnung:   AB-4) hat eine sehr starke antigenpräsentierende Kapazität, kann durch HIV-1 trotz Fehlens seines Hauptrezeptors (CD4) infiziert werden und repliziert HIV-1. Überdies sezerniert diese Zelllinie ein Protein (dendritic cell-derived fibroblast growth factor, DCD-FGF), das das Wachstum mesenchy- maler Zellen, myeloischer dendritischer Zellen und adulter menschlicher Stammzellen stimuliert. 



  Überdies fördert DCD-FGF in vivo bei Mäusen und Hühnern das Wachstum von Blutgefässen und dermalen Zellen. 



   Reagenzien und Methoden 
Reagenzien und Antikörper. Zellkulturmedia (RPMI 1640, MCDB 104), Penicillin- Streptomycin, L-Glutamin und fötales Kälberserum (fetal calf serum, FCS) wurden von Gibco, Life Technologies (Paisley, Scotland) bezogen. Monoklonale Antikörper (Mak) gegen die Antigene die in Tabelle 2 aufgelistet sind und die zugehörigen Isotypkontrollen sowie ABComplexTM für die Western blot Analysen wurden von Dako (Kopenhagen, Denmark) erhalten. Rekombinantes menschliches bFGF (basic fibroblast growth factor, rhbFGF) wurde über R & D Systems (Minneapo- lis, MN, USA) bezogen und ein biotin-markierter Ziege anti-Maus Antiköper wurde bei Accurate Chemicals (West Bury, NY, USA) gekauft. Für immunozytochemische Untersuchungen wurde ein Maus anti-human FGF4 mab (clone Ab-3, Oncogene Science, Uniondale, NY, USA) verwendet. 



   Unmarkierte oder FITC-markierte monoklonale Antiköper (siehe Tabelle 3 ; Mak) wurden von PharMingen (SanDiego, CA) bezogen. Die Hybridome N418 (anti-CD11c, HB 224), M51114.15.2 (anti-I-Ab,d,q & I-Ed,k, TIB 120),   RA33A1/6.1   (anti-CD45R/B220,TIB 146), und F4/80 (anti-Makrophagen, HB 198) wurden bei der American Type Culture Collection (Manassas, VA) gekauft. So genannte second step reagents waren polyklonales FITC-markiertes F (ab)2 Ziege-anti- Ratte IgG (H + L) (Immunotech, Marseille, France), FITC-konjugiertes Ziege-anti-Hamster IgG   (H + L) (Caltag, South San Francisco, CA), Streptavidin-Phycoerythrin (SAv-PE) oder   Streptavidin Texas Red (AmershamPharmacia Biotech, Vienna, Austria). Irrelevante, isotype- gematchte Mak wurden als Negativkontrollen verwendet.

   Einige der verwendeten Mak wurden aus dem Überstand der jeweiligen Hybridome gereinigt und Proteinkonzentrationen wurden auf 1 mg pro ml vor der FITC - Konjugation oder Biotinylierung genormt. 



   Etablierung der plasmazytoiden dendritischen Zelllinie (PDZ): Eine Lymphknotenbiopsie wurde einem 6jährigen Knaben, der an einer sogenannten Rosai-Dorfman Erkrankung, einer seltenen Form einer Sinus Histizytose, erkrankt war, entnommen. Das Biopsiematerial wurde zu gleichen Teilen in einer Lösung aus 2% Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd in o.1 M Cacody- lat Puffer, pH 7. 4 für Elektronenoptische Untersuchungen fixiert oder in Tissue-Tek OCT (Miles Scientific, Naperville, IL) unter der Verwendung von vorgekühltem Isopentan eingefroren und bei -70 C für Immunozytochemie aufbewahrt. Ein anderer Teil des Biopsiematerials wurde in 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 RPMI 1640 Medium mit Dispase/Kollagenase (2U/ml, Boehringer-Mannheim, FRG) für 2h at 37 C inkubiert. Einzelzellsuspensionen wurden durch Passieren des Gewebes durch ein rostfreies Stahlnetz erreicht.

   Nach dem Waschen in serumfreien   RPMI 1640,   wurden die Zellen mit verschie- denen Zytokinen (siehe Tabelle 2), Epstein Barr-Virus (EBV; zellfreier Kulturüberstand von BL74, einer EBV-produzierenden menschlichen Zellline) oder Medium inkubiert. Zellkulturen wurde durch Kultivierung von   2x106   Zellen in 6-Loch Platten (Nunc, Denmark) initiert. Nach 6 Wochen waren Cluster von stark proliferierenden Zellen sichtbar, und zwar ausschliesslich in Kulturen die GM-CSF und EBV enthielten. Diese Zellen wurden expandiert and weiter auf ihre funktionellen Eigenschaften analysiert. 



   Kontroll-Zelllinien: H9 and Molt-3 sind CD4-positive T-Zelllinien, L929 sind Mausfibroblasten (ATCC, CCL&num;1). R588-3 ist eine Epstein-Barr Virus (EBV)-positive B-Zellline etabliert durch den Antragsteller (R. Berger). Zellen wurden bei 37 C, 5% CO2 in RPMI 1640, supplementiert durch 20% Hitze-inaktiviertes FKS, 2 mM L-Glutamin and 50  g/ml Penicillin-Streptomycin (alle Reagen- zien von Gibco, Paisley, UK) gezüchtet und 1:4 alle 3-4 Tage geteilt. Humane Endothelzellen aus der Nabelschnur (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) wurden in MCDB 104 Medium, supplementiert wie oben beschrienen, plus 10   ng/ml   endothelial cell growth factor (ECGF, Boeh- ringer-Mannheim, Mannheim, Deutschland) und 50  g/ml Heparin (Sigma, St.Louis, MO) auf Fibronectin-beschichteten Kulturgefässen.

   MRC-5 (ATCC &num;CCL 171) und D-15 sind humane Lun- genfibroblasten beziehungsweise dermale Fibroblasten. 



   Immunofluoreszenz und FACS Analyse. Monoklonale Antikörper wurden verwendet um die Zusammensetzung der Membranproteine der PDZ zu bestimmen. Für die FACS Analyse wurden 2x105 Zellen in PBS/BSA (1%), das 0,1% Natriumazid enthielt, mit FITC-markierten Mak oder Isotypekontrollen für 30 Minuten bei 4 C gefärbt. Die Proben wurden auf einem FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) analysiert. Die so genannten Gates für die Datenanalyse wurden mittels der jeweiligen Isotypfärbung als negative Kontrolle gesetzt. 
 EMI2.1 
 als zellfreie Überstände bei -80 C gelagert. Primäre Zellen oder Zelllinien und zellfreier Kulturüber- stand, der Virus mit > 100,000 cpm RT enthielt, wurde für 1 hr bei 37 C inkubiert. Zellen wurden vor Kulturbeginn drei mal in Serum-freiem Medium   (RPMI 1640)   gewaschen. 



   Isolierung peripherer mononukleärer Zellen (MNZ): MNZ wurden aus heparinisiertem periphärem Blut gesunder Spender (HIV-1-seronegativ) durch Dichtegradientenzentrifugation unter der Verwendung von Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norway) isoliert. In bestimmten Experimenten wurden T-Lymphozyten mit Hilfe einer Rosettentechnik mit Neuraminidase-behandelten Schafe- rytherozyten abgetrennt. MNZ wurden in RPMI 1640 supplementiert mit 10% Hitze-inaktiviertem FKS, 2 mM L-Glutamin and 50  g/ml Penicillin-Streptomycin bei 37 C in feuchter Atmosphäre, die mit 5% CO2 angereichert war, kultiviert. 



   Produktion von konditioniertem Medium (KM). Wenn nicht anders angegeben, wurde Kul- turüberstand unstimulierter, Serum-freier PDZ Kulturen verwendet. 48 Stunden nach Kulturbeginn (Zelldichte   5x105     Zellen/ml)   wurde der Überstand geerntet, 10 Minuten zentrifugiert bei 200 x g, sterilfiltriert und bis zur Austestung bei -20 C gelagert. 



   Proliferationstests. NIH-3T3 Fibroblasten und primäre humane dermale Fibroblasten wurden unter Serum-freien Bedingungen für 24 Stunden kultiviert bevor konditioniertes Medium von PDZ zugegeben wurde. Nach 2 bez. 4 Tagen wurden die Zellen mit   1 uCi   3H-Thymidine (3H-TdR; NEN, Boston, MA, USA) für 8 Stunden inkubiert, geerntet und die 3H-TdR-Aufnahme wurde mittels eines Beta-Plate Scintillation Counter (Wallac-Pharmacia, Uppsala, Sweden) bestimmt. Zellkulturen wurden dreifach pro Ansatz in 96-Lochplatten angesetzt. 



   Gemischte   Lymphozvtenreaktion   (Mixed lymphocyte reactions,   MLR)   Humane MNZ wur- den von gesunden Probanden isoliert und T Zellen (responder Zellen) wurden durch Rosettierung mit Schaferythrozyten angereichert. Die daraus resultierenden Zellen wurden mit Mitomycin- behandelten PDZ (Stimulatorzellen) gemischt und 6 Tage in 96 Lochplatten inkubiert. Zellzahlen waren 1x105 (Responderzellen) and graduell abnehmende Zahlen für PDZ (Stimulatorzellen). 



  T-Zellproliferation wurde durch die 3H-TdR Inkorporationsmethode gemessen (siehe oben). 



   Detektion von HIV-1 in Kulturüberständen: Überstände wurden wöchentlich geemtet und auf Virusproduktion durch einen ELISA spezifisch für HIV-1 p24 (Coulter Electronics, Hialey, FL) getestet. HIV-1 Replikation wurde über einen Zeitraum von zumindest 10 Wochen getestet und 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 Kulturen wurden positiv eingestuft, wenn die Extinktion für p24 3-fach über dem Hintergrundsignal in aufeinander folgenden Tests lag. 



     Immunzvtochemie:   Zellen wurden in so genannten slide-flasks (Nunc, A.S., Roskilde, Den- mark) eine Woche vor Inokulation mit Virus gezüchtet. 2 Wochen nach Infektion wurden die Zellen in Aceton fixiert und einer immunzytochemischen Analyse unterzogen. Die Objektträger wurden für 2 Stunden mit einem Mak der mit HIV-1 p24 reagiert (clone 3H6.2 ; Epitope, Beaverton, OR) ver-   dünnt 1 :50 PBS-BSA (1%) inkubiert, gefolgt von einem biotinilierten Schaf-anti-Maus Ig Antikörper (Amersham Ltd., Amersham UK) 1 :200 PBS-BSA (1%) verdünnt und schliesslich mit einem   Streptavidin-Biotin-Peroxidasekomplex (Dakopatts A. S., Copenhagen, Denmark). Positive Färbun- gen wurden mit Diaminobenzidin als Substrat (Amersham Ltd., Amersham, UK) nachgewiesen. 



  Einzelfärbungen wurden auf Kryostatschnitten oder auf Zellen die in chamber slides kultiviert wurden durchgeführt (Nunc,   Roskilde,   Denmark). Nach Fixierung und Blockieren der Fc-Rezeptoren mit 20% Schafserum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7. 4), wur- den die Objektträger mit dem jeweiligen spezifischen monoklonalen Antikörper in der optimalen Verdünnung, gefolgt von einem Biotin-konjugiertem Schaf-anti-Maus Ig (Amersham, Amersham, U. K) beschichtet. Die Objektträger wurden anschliessend sorgfältig gewaschen, inkubiert mit einem Streptavidine-Biotin-alkalische Phosphatase-Komplex (Dakopatts, Copenhagen, Denmark) und positive Reaktionen wurden mittels bromochloro-indolylphosphat   (BICP)lnitroblue   tetrazolium (NBT) als Substrate sichtbar gemacht.

   Bei Kontrollen wurde entweder der erste AK weggelassen oder durch einen Mak von gleichem Isotyp ersetzt (Isotypkontrolle). 



   Nachweis von Zytokinen. Konditioniertes Medium wurde auf das Vorhandensein verschiede- nere Wachstumsfaktoren durch kommerziell erhältliche ELISA-Systeme (Bio-Trak, Amersham, Backinghamshire, UK) geprüft. Die Tests erfolgten anhand der Vorschriften des Herstellers. Die Proben wurden zweifach getestet, die optische Dichte wurde mit Hilfe eines Computer- unterstützten ELISA-Messgeräts gemessen (Dynatech, Guernsey Channel Islands, UK). 



   Transmissionselektronenmikroskopie: 106 PDZ wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, zweimal in PBS gewaschen und resuspendiert in gleichen Teilen Glutaraldehyd und Paraformaldehyd. Die Proben wurden fixiert (30 Min. bei Raumtemperatur) und bei 4 C für 24 Stunden, postfixiert in 1 % Osmium Tetroxid, mit 5% Uranylacetat behandelt und in Aralditharz eingebettet. Nach dem Schneiden wurden die Zellen mit Uranylacetat und Bleizitrat gefärbt und mit Hilfe eines JEOL Transmissionselektronenmiroskops (Typ 1200 EX) untersucht. mRNA-lsolierung und Northern Blotting. Zellen wurden 48 Stunden nach Kulturbeginn geerntet, zweimal in eiskaltem PBS gewaschen und automatisch gezählt (Coulter Counter, Coulter Electronics Ltd; Luton, UK). Die RNA Isolierung erfolgte durch die   Guanidin-Isothiocyanate-Phenot-   Chloroform Extraktion.

   RNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. 



  Northern blotting, Hybridisierung mit Digoxigenin   (DIG)-markierten   cDNA Sonden, die für die jewei- ligen Gene spezifisch waren sowie Exposition von Röntgenfilmen wurde nach Standardprotokollen durchgeführt. 



   Proteinreinigung mittels   Affinitätschromatoaraphie.   Serumfreie Kulturüberstände von 2 Liter PDZ (5x105 Zellen/ml), die für 4 Tage kultiviert wurden, wurden mit Amicon Ultra-15 Zentri- fugenfilter (Millipore) 50-fach konzentriert und 30 ml Probe wurde auf eine Säule, die mit Heparin Sepharose CL 6B (Amersham Biosciences) in 0. 01 mM NaH2P04 gepackt war, in 0.15M NaCI, pH 7. 3 aufgebracht. Nach Eluierung des ungebundenen Proteins wurde die spezifische Elution bei 0. 5M NaCI durch einen Stufengradienten erreicht, wobei die lonenstärke ansteigend war, (0. 5, 1 and 1.5M NaCI). 



   Metabolische Markierung, Labeling mit Radionukliden und MALDI-TOF: PDZ wurden in 
 EMI3.1 
 Labeling Mix ; NEG-072, NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA) in 5 ml Methionin-freien RPMI-1640 Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) inkubiert. Nach 2 Stunden wurde der Über- stand zentrifugiert, sterilfiltriert und mit Äthanol präzipitiert. Zweidimensionale Elektrophorese, Autoradiographie, Isoelektrische Fokussierung, SDS-PAGE (13 % Polyacrylamid) und Silberfär- bung wurde durchgeführt wie in der Literatur beschrieben [Gerner et al., 1998]. Nach der Silberfär- bung wurden die Gele für 20 Min. mit Enlightning NEF974G (NEN) equilibriert und bei 60 C mittels eines Slab Gel Dryer SE1160 von Hoefer (San Francisco, CA) getrocknet.

   Exposition von BLOMAXTMMR Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, NY) wurde bei Raumtemperatur in Autoradiogra- 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 phiekassetten mit Verstärkerfolien durchgeführt. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) wurde folgendermassen durchgeführt : Proteinspots wurden nach Färbung mit Syproorange und Entfärbung von 2D Gelen ausgeschnitten und anschliessend trypsinisiert (Prome- ga, sequencing grade). Die resultierenden Molekulargewichtspeaks des MALDI-Spektrums wurden anschliessend in Datenbank-Suchen unter Verwendung der Programme   MassSearch   (Computional Biology Research Group, Switzerland) und MOWSE (UK Human Genome mapping Project Resource Center) analysiert. 



   Mäuse : 12 Wochen alte, weibliche Inzuchtmäuse [BALB/c (H-2d)] wurden von Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, Germany) bezogen. Den Mäuse wurden 3 mal (Zeitintervall 4 Tage) entwe- der 50  l PBS, rekombinanter humaner bFGF (0. 5ng, 5ng, 50ng) oder gereinigter DCD-FGF (0.5ng, 5ng, 50ng) gespritzt. Applikationsstellen waren die Pinna der Ohren und die Rückenhaut. 



   Histologie,   Immunzytochemie,   und ultrastrukturelle Analysen Die Ohren und Rückenhaut wurden entfernt und geteilt. Eine Hälfte wurde eingebettet und in flüssigen Stickstoff eingefroren, die andere Hälfte wurde in 4% neutral-gepuffertem Formalin fixiert und entweder in Paraffin oder in Technovit 7100 (Kulzer, Wehrheim, Germany) eingebettet. Schnitte wurden entweder mit Masson- trichrom zur Identifizierung von Kollagenfasern oder Hämatoxilin-Eosin gefärbt und wurden dann mittels Lichtmikroskopie untersucht. Epidermale Häutchen von den Ohren und Rücken wurde durch die Ammoniumthiocyanat-Separationstechnik präpariert und mit FITC-markiertem anti-MHC class ll Mak M5/114 oder anti-CD3 für 60 Min bei 37 C (Elbe et al, 1989) inkubiert.

   Die Zellen wurden anschliessend mittels Azeton fixiert (10 min bei Raumtemperatur) und nachfolgend mit biotinyliertem anti-MHC class II-Streptavidin Texas Red/FITC-CD45 Mak oder mit dem passenden Isotypenkontroll-Mak inkubiert, gewaschen und in Glycergel (Dakopatts) eingebettet. Die Häutchen wurden in   PBS/Glycerol   (Difco, Detroit, MI) eingebettet, auf Glasobjektträger aufgebracht, mit einem Deckglas versehen und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leitz Diaplan, Wetzlar, Germa- ny) untersucht. Die Färbemuster wurden mittels eines Leitz Orthomate E Systems (Wetzlar) und einem 29 DIN Kunstlichtfarbfilm (Scotch Chrome, 640-T, 3M, Milan, Italy) dokumentiert. Die gefärb- ten Zellen wurden bei 40x Vergrösserung mit einem rechteckigen Rasterfeld ausgezählt. 



   Hühnerembryo-Chorioallantois Membrantest (CAM) mittels Gelatineschwämmchen (Chick embryo chorioallantoic membrane   (CAM)-gelatin   sponge assay). CAM von befruchte- ten White Leghorn Hühnereiern wurden verwendet. Am Tag 3 der Bebrütung wurde ein rechtecki- ges Fenster in die Schale geschnitten und 2 bis 3mL Albumin wurde entfernt um die CAM von der Schale abzuheben. Am Tag 8 wurde 10  L gereinigtes DCD-FGF auf 5 mm3 Gelatinschwämmchen (Gelfoam; Upjohn Co, Kalamazoo, MI) appliziert, die dann auf die CAM implantiert wurden. 



  Schwämmchen mit RPMI 1640 oder rekombinanten, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF/FGF-2; 200ng/mL) wurden als negative bez. positive Kontrollen verwendet. Das Schwämm- chen dient dazu, die Probe aufzunehmen und wieder langsam an die CAM abzugeben. Die CAM's wurden täglich untersucht. Am Tag 12 wurden die CAMs in ovo photographiert, die Schwämmchen entfernt, mittels Paraformaldehd, fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Haematoxilin- Eosin gefärbt. Die Proben wurden lichtmikroskopisch analysiert. 



   Beschreibung der Resultate 
1. Etablierung der einer Zellline und Bestimmung des Phänotyps 
Biopsiematerial (Lymphknoten) wurde in kleine Stücke geschnitten (in PBS auf Eis) und mit einer Dispase/Kollagenaselösung (Boehringer Mannheim) über Nacht bei 4 C inkubiert. Nach Trennung von Geweberesten mit einem Sieb wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen und in Kulturmedium (RPMI 1640 supplementiert mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kalbsserum, Antibi- otika und 2mM L-Glutamin; alle Reagenzien von GIBCO, Paisley) aufgenommen. 



   Wie aus Tabelle 2 entnommen werden kann, wurden rekombinante humane Wachstumsfakto- ren und/oder Epstein-Barr Virus (EBV) in definierten Konzentrationen zu bestimmten Kulturen gegeben. (TNF-alpha: 20   ng/ml,   GM-CSF : 50   ng/ml;   die rekombinanten Wachstumsfaktoren wur- den durch R & D Systems, Minneapolis bezogen). EBV ist ein humanpathogenes Virus, das human B-Lymphozyten transformieren kann. Die Infektion wurde folgendermassen durchgeführt: zellfreier Kulturüberstand der Burkitt's Lymphomzellline BL74 (freundlicherweise von Dr. G. Lenoir, Lyon zur Verfügung gestellt) wurde mit   5x106   Zellen bei 37 C für 2 Stunden inkubiert, zweimal gewaschen und in einer Zelldichte von 2x106 Zellen/Loch in 6-Lochplatten kultiviert (Nunc, Copenhagen). 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 



   Figur 1 zeigt die Form der Zellkulturen nach 6 Wochen. Auf der linken Seite sind Zellen abge- bildet die nur mit Medium kultiviert wurden. Die Zellen liegen zerstreut und zeigen häufig Zeichen von Auflösung und Membrandesintegration. Es gibt keinen phänotypischen Hinweis auf Zellprolife- ration. Im Gegensatz dazu formieren sich EBV-infizierte Zellen, die mit humanem rekombinantem GM-CSF supplementiert sind (rechtes Bild) zu so genannten Clustern und exprimieren Aktivie- rungsantigene an der Zellmembran, die auf Zellproliferation hinweisen. Es war möglich, diese Zellen zu subkultivieren, in grossen Mengen zu vermehren und auch nach langer Lagerung in flüssigem Stickstoff ( > 5 Jahre) wuchsen sie wieder exzellent. Anhand der Patienteninitialen wurden sie mit AB-4 bezeichnet. 



   Phänotyp der Zellline. Für immunzytochemische Färbungen wurden die Zellen auf Glasobjekt- träger zentrifugiert, in Äthanol fixiert and mit Giemsa-Farbstoff (Sigma-Aldrich, St. Louis) gefärbt. 



  Besonders beachtenswert sind hier die dendritische Form und der grosse, gelappte Kern, der für dendritische Zellen typisch ist. 



   Ultrastrukturelle Untersuchungen bestätigten und verstärkten diese Ergebnisse (Fig. 3). Wieder auffällig sind die langen zytoplasmatischen Fortsätze, Vakuolen, und ein grosser Kern, charakteris- tisch für dendritische Zellen. Es gab jedoch keinen morphologischen Hinweis auf Birbeck-Granula, Organellen die auf epidermale Langerhans Zellen (ELZ) hinweisen. Dies schliesst die Möglichkeit aus, dass diese Zellen mit epidermalen Langerhanszellen identisch sind. 



   Um den Ursprung dieser Zellen einzuengen und um den Phänotyp näher zu analysieren wur- den FACS Analysen durchgeführt. Durch die Verwendung von linien- und aktivierungsspezifischen Maks ist es evident, dass diese Zellen hochaktiviert sind und lymphoide, myeloide und dendritische Oberflächenantigene exprimieren. 



   2. Antigen präsentierende Kapazität von PDZ   Gemischte Leukozytenreaktion (Mixed Leukocyte Reaction ; Kulturen humaner   T-Lymphozyten (Responderzellen) wurden zusammen mit abnehmenden Zahlen von Mitomycin- behandelten Stimulatorzellen (Makrophagen, epidermale Langerhanszellen und PDZ) kultiviert. Die Proliferation wurde an Hand des Einbaus von 3H-Thymidine gemessen. Die starke Proliferation der Responderzellen (=T- Zellen) ist ein Hinweis auf die hohe Ag-präsentierende Kapazität der PDZ. 



  (Fig. 4). 



   Die hohe Expression von HLA-DR an dieser Zelllinie, gemessen durch immunzytochemische Färbungen, ist ein weiterer Indikator für die sehr hohe Ag-Präsentationskapazität (siehe Fig. 5). 



   3. PDZ sind exzellente Targets für das Humane Immundefizienzvirus Typ-1 
Obwohl die   PD-Zelllinie   das CD4 Protein weder am mRNA noch am Proteinlevel exprimiert, ist sie für die Infektion durch HIV-1 suszeptibel. Dies wurde durch den Nachweis von HIV-1 Struktur- protein in Zellkulturüberständen nach Infektion und der Detektion von kompletten viralen Partikeln durch Elektronenmikroskopie evident. 



   Ein Korezeptor von HIV-1 (CCR-5) ist sehr stark auf PDZ exprimiert. Dies könnte eine Erklä- rung für die Anfälligkeit dieser Zellen für HIV-1 trotz Fehlens des Hauptrezeptors CD4 sein. 



  (Fig. 6-9) 
4. Wachstumsfaktorsekretion durch PDZ 
Da Histiozyten (die Zellen, die in RDD proliferieren) für die Fibrose in RDD ursächlich in Zusammenhang gebracht werden, wurde die Produktion von Wachstumsfaktoren durch die Zellline getestet. 



   Resultate zeigten, dass in Kulturüberständen Zytokine/Wachstumsfaktoren wie   IFN-a,   VEGF and TNF-a, die alle für die Proliferation mesenchymaler Zellen und für plasmacytoide DZ charakte- ristisch sind. Des weiteren zeigten Genexpressionsstudien die Produktion eines Wachstumsfaktors der mit jenen der fibroblast growth factor- Familie verwandt ist. PDZ mRNA zeigt eine die Kreuzre- aktion in Northern blots mit einer FGF-4-spezifischen cDNA Sonde und die Zelllinie reagiert mit einem anti-FGF-4 Antikörper (Fig. 11, 12). 



   Um die Möglichkeit der Produktion zusätzlicher Heparin-bindender Wachstumsfaktoren durch PDZ zu prüfen, wurden serumfreie Kulturüberstände konzentriert, chromatographisch gereinigt und einer 2-dimensionalen   Geielektrophorese   unterzogen. Einzelne Spots wurden durch MALDI-TOF analysiert und eine Aktivität mit einem Molekulargewicht von 38kD wurde identifiziert (Fig. 13). 



  Weitere biochemische Analysen zeigten, dass es sich um ein Heparin-bindendes Protein mit hoher Stabilität handelt (Tabelle 4). Dieses Protein wurde DCD-FGF (dendritic cell-derived fibroblast 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 growth factor) bezeichnet und wurde für die Stimulation von Wachstum und Differenzierung ver- schiedener Zelltypen in vitro verwendet. Es induziert die Proliferation primärer dermaler Fibroblasten, induziert Röhren-ähnliche Strukturen in Endothelzellen und unterstützt das Wachs- tum eines so genannten skin tissue equivalents in serumfreien organoiden Kulturen. Die relative Dicke von 3-dimensionalen organoiden Strukturen wurde nach 14 Tagen Kulturdauer bestimmt und mittels lichtmikroskopischer Methoden gemessen (Fig. 14-17). DCD-FGF steigert ebenfalls die Viabilität und Entstehung humaner mesenchymaler Stammzellen (Fig. 18).

   Mesenchymale Stamm- zellen wurden in Abwesenheit eines anderen exogenen Proteins ausser DCD-FGF für 96 Stunden kultiviert. > 95% dieser Zellen waren vital (Trypanblau-Färbung, Annexin-Bindung) und proliferier- ten. In Kontrollkulturen (ohne DCD-FGF) waren mehr als 70% der Zellen tot. 



   Schliesslich hat DCD-FGF einen wachstumsstimulierenden Effekt auf humane myeloide dendri- tische Zellen. Dendritische Zellen konnten von humanen periphären Blutmonozyten in Abwesenheit von IL-4/GM-CSF generiert werden. Fig. 19 zeigt die starke Expression von CD83, einen Marker für DZ, in humanen myeloischen dendritischen Zellen induziert durch DCD-FGF. 



   Meine Arbeitsgruppe hat in einer früheren Arbeit gezeigt, dass primäre humane dendritsche    Zellen Wachstumsfaktoren für mesenchymale Zellen produzieren (z. B. FGF-2 ; Ref. 1). In der   vorliegenden Beschreibung berichten wir über die Entstehung einer Zelllinie humaner plasmazytoi- der dendritischer Zellen (PDZ), die aus einem Lymphknoten eines Patienten mit Rosai-Dorfman Erkrankung, einer seltenen, gutartigen Hyperproliferation weisser Blutzellen (Histiozyten) isoliert wurde. Auf Grund einer speziellen Zellkulturmethode wurden permanent wachsende Zellen gene- riert. Diese Zelllinie mit der Bezeichnung AB-4 zeigt eine Zahl von charakteristischen Kennzeichen, die sie zu einem attraktiven Target für biomedizinische Applikationen macht. Die Zellen sind ein- zigartig in Bezug auf ihre Herkunft und ihr lineage commitment".

   Phänotypische und funktionelle Analysen zeigten, dass die PDZ zu den so genannten plasmazytoiden dendritischen Zellen, einer Subpopulation dendritischer Zellen gehört. Die Analyse dieses aussergewöhnlichen Phänotyps wird durch eine Reihe funktioneller Charakteristika die für PDZs spezifisch sind, unterstrichen. 



   Durch ihre hohe Expression von HLA-DR Antigen an der Zelloberfläche sind exzellente Anti- gen-präsentierende Zellen. Diese Eigenschaft macht die Zellen zu einem attraktiven Werkzeug für das Screening von Substanzen mit anti-allergischer Wirkung, da DZ eine wichtige Rolle für die Präsentation von Allergenen für T-Lymphozyten spielen. 



   Die   PD-Zelllinie   ist im Stande, das humane Immundefizienzvirus Typ 1   (HIV-1)   zu transmittie- ren und zu replizieren. Interessanterweise passiert dies in Abwesenheit von CD4, dem Hauptre- zeptor von HIV-1. PDZ als Targets und Testmodell für CD-4 unabhängige HIV-1 Infektion könnten als langgesuchtes zelluläres Modell sowohl für HIV-1 drug testing wie für neue Strategien für die Vakzinentwicklung dienen. 



   PDZ sezernieren ein Protein, das Proliferation and funktionelle Differenzierung humaner me- senchymaler Zellen (Fibroblasten, Endothelzellen) induziert. Die Charakterisierung dieses Proteins durch physikalische, biochemische und molekulare Methoden wurde durchgeführt. An Hand funkti- oneller Ähnlichkeiten mit der Familie der fibroblast growth factor (FGF) family wurde das Protein vorderhand DCD-FGF (dendritic cell-derived   fibroblast   growth factor) bezeichnet. Es ist ein Hepa- rin-bindendes, 38kD Protein das das Wachstum von primären humanen Hautfibroblasten stimuliert, röhren-ähnliche Strukturen in Endothelzellen induziert und das Wachstum von 3-dimensionalen Hautkulturen sowie mesenchymaler Stammzellen und myeloider dendritischer Zellen promoviert.

   In vivo Experimente zeigten dass DCD-FGF das Wachstum von Blutgefässen in Hühner-Chorio- allantiosmembran-Assays (CAM) steigert. In Mäusen führte das Injizieren in Ohren und Rücken- haut zu einer Verdickung der Dermis, Gefässneubildung und zur Rekrutierung von Lymphozyten an der Injektionsstelle. 



   Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Zellline als Modellsystem für das Testen neu- er anti-allergener Substanzen, für die Aufklärung der Mechanismen der CD4-unabhängigen HIV-1 Infektion und deren Prävention, sowie als Produzent von Wachstumsfaktoren, die für regenerative Medizin und Tissue Engineering angewandt werden können, wichtig ist. 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 



   Literatur
Basic fibroblast growth factor is expressed by CD19/CD11c-positive cells in hairy cell leukemia. 



   Gruber,-G; Schwarzmeier,-J-D; Shehata,-M; Hilgarth,-M; Berger,-R
Blood. 1999 Aug 1 ; 94 (3): 1077-85 
A report of intracranial Rosai-Dorfman disease with literature review. 



   Wu,-M ; Anderson,-A-E; Kahn,-L-B   Ann-Diagn-Pathol. 2001 Apr ; 96-102   
Rosai-Dorfman disease isolated to the central nervous system: a report of 11cases. 



   Andriko,-J-A; Morrison,-A;   Colegial,-C-H;   Davis,-B-J; Jones,-R-V
Mod-Pathol. 2001 Mar; 14(3): 172-8 
Bone Marrow Neovascularization, Plasma Cell Angiogenic Potential, and Matrix Metalloproteinase-2 Secretion Parallel Progression of Human Multiple Myeloma
Angelo Vacca, Domenico Ribatti, Marco Presta, Monica Minischetti, Monica lurlaro, Roberto Ria, Adriana Albini, Federico Bussolino, and Franco Dammacco
Blood, Vol 93, No 9 (May   1), 1999:   pp 3064-3073 
Maturational steps of bone marrow-derived dendritic murine epidermal cells. Phenotypic and functional studies on Langerhans cells and Thy-1+dendritic epidermal cells in the prenatal period. 



   Elbe A, Tschachler E, Steiner G, et al. 



   J Immunol 143:2431-2438, 1989 
Tabelle 1: Kennzeichen der Rosai-Dorfman Erkrankung (RDD) 
 EMI7.1 
 
<tb> Rosai-Dorfman <SEP> Erkrankung
<tb> 
<tb> 
<tb> (Rosai-Dorfman <SEP> disease, <SEP> RDD)
<tb> 
<tb> 
<tb> Idiopathische <SEP> Histiozytenproliferation
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Befällt <SEP> Lymphknoten
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Gutartig
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Schmerzfreie <SEP> zervikale <SEP> Lymphadenopathie
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Fibrose
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Seltene <SEP> Erkrankung, <SEP> Behandlung: <SEP> Exzision
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Grosse <SEP> helle <SEP> Zellen, <SEP> die <SEP> Lymphozyten <SEP> phagozytieren
<tb> 
 
Tabelle 2 :

   Entwicklung einer plasmazytoiden, dendritischen Zelllinie (PDZ) von einem Patienten mit RDD (Rosai-Dorfman Erkrankung) - Zellkulturbedingungen 
 EMI7.2 
 
<tb> Zellkulturbedingungen <SEP> Permanentes <SEP> Wachstum
<tb> 
<tb> Medium <SEP> Kontrolle <SEP> nein
<tb> EBV <SEP> nein <SEP> 
<tb> GM-CSF <SEP> nein
<tb> TN <SEP> F-a <SEP> nein
<tb> TNF-a <SEP> + <SEP> GM-CSF <SEP> nein <SEP> 
<tb> TNF-a <SEP> + <SEP> EBV <SEP> nein <SEP> 
<tb> GM-CSF <SEP> + <SEP> EBV <SEP> Ja
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 Table 3 :

   Phänotypische Charakterisierung der Zellen mittels FACS 
 EMI8.1 
 
<tb> lymphoide <SEP> myeloide <SEP> Dendritische <SEP> Aktivierungsl
<tb> 
<tb> 
<tb> Marker <SEP> Marker <SEP> Zellmarker <SEP> Kostimulator-
<tb> 
<tb> 
<tb> Antigene
<tb> 
<tb> 
<tb> CD2 <SEP> neg. <SEP> CD11c <SEP> 44 <SEP> BCDA1 <SEP> neg. <SEP> CD23 <SEP> 95
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CD3 <SEP> neg. <SEP> CD13 <SEP> 15 <SEP> BCDA2 <SEP> neg. <SEP> CD30 <SEP> 84
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CD4 <SEP> neg. <SEP> CD14 <SEP> neg. <SEP> BCDA3 <SEP> neg. <SEP> CD40 <SEP> 95
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CD8 <SEP> neg. <SEP> CD15 <SEP> 85 <SEP> BCDA4 <SEP> 88 <SEP> CD80 <SEP> 99
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CD19 <SEP> > 95 <SEP> CD16 <SEP> neg.

   <SEP> CD83 <SEP> 78 <SEP> CD86 <SEP> 90
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CD20 <SEP> > 95 <SEP> CD33 <SEP> 30 <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CD68 <SEP> 50 <SEP> --¯¯¯¯-¯--¯¯¯-¯¯¯-
<tb> 
 Table 4 : Stabilität von DCD-FGF 
 EMI8.2 
 
<tb> BEHANDLUNG <SEP> AKTIVITÄT <SEP> (%)
<tb> 
<tb> 
<tb> Neuraminidase <SEP> 95
<tb> 
<tb> O-Glykanase <SEP> 90
<tb> 
<tb> N-Glykanase <SEP> 90
<tb> 
<tb> Trypsin <SEP> 5
<tb> 
<tb> Papain <SEP> 5
<tb> 
<tb> 4 C, <SEP> 1 <SEP> Monat <SEP> 90 <SEP> 
<tb> 
<tb> 37 C, <SEP> 1 <SEP> Woche <SEP> 90 <SEP> 
<tb> 56 C, <SEP> 1 <SEP> Stunde <SEP> 75 <SEP> 
<tb> 
<tb> 90 C, <SEP> 1 <SEP> Minute <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 
<tb> > pH <SEP> 5,5 <SEP> 50 <SEP> 
<tb> 
<tb> Heparin-Sepharose <SEP> < 10
<tb> 
 
PATENTANSPRÜCHE: 1.

   Verfahren zur Herstellung einer permanent wachsenden humanen plasmazytoiden dendri- tischen Zelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangszelle(n) von der Rosai- 
Dorfman-Erkrankung stammt/stammen.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Etablierung perma- nent wachsender dendritischer Zelllinien GM-CSF und Epstein-Barr Virus kombiniert ein- gesetzt werden.

3. Verwendung einer Zelllinie, die nach einem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 hergestellt wurde, zum Screenen von Arzneimitteln.

4. Verwendung einer Zelllinie nach Anspruch 3, mit der Massgabe, dass zum Screenen die Antigen-präsentierenden Eigenschaften der Zelllinie ausgenützt werden.

5. Verwendung einer Zelllinie, die nach einem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 hergestellt wurde, zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung der CD-4 unabhängigen HIV-1 Infektion.

6. Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die das Wachstum von dendritischen Zellen, <Desc/Clms Page number 9> adulten Stammzellen und mesenchymalen Zellen ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass Zelllinien, welche durch einem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 hergestellt wurden, eingesetzt werden.

HIEZU 23 BLATT ZEICHNUNGEN