JP2015524402A - 創傷治療用の薬剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、患者の慢性創傷または疾患依存性もしくは薬剤依存性の創傷治癒障害の治療に使用するため、あるいは、間葉系細胞もしくは幹細胞の増殖および／または移動を増加または誘導するため、免疫細胞、好ましくはナチュラルキラー細胞を刺激するため、線維芽細胞を刺激するため、上皮細胞、好ましくは表皮の上皮細胞を刺激するため、または血管新生を刺激するためのスタスミン、前記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞に関する。

Description

本発明は、再生治療、特に創傷治癒用の薬剤の分野に関する。

創傷治癒は、皮膚組織の破壊が起こると活性化され、複雑で動的かつ高度に組織化されたプロセスを構成する。血小板凝集、凝固カスケードの活性化、細胞移動、細胞増殖、炎症性浸潤、細胞分化、および組織のリモデリングなど広範囲の事象が、創傷治癒のプロセスを介して行われる。これらの事象のカスケードは、はっきりと分かれ３つのフェーズ、すなわち炎症、増殖、そして創傷の収縮およびリモデリングに分担されているように見えるが、実際にはフェーズが互いにオーバーラップし、既にある創傷内の関連箇所において、継続的または再発した組織の損傷によりその流れを再開することがある。

皮膚組織の損傷および血管の破壊の後にフィブリン塊の形成が起こり、フィブリン塊が創傷への細胞移動の基板となる。好中球は、一定の範囲の分子、貪食性の異物、および細菌に誘引され、徐々に単球に置換し、これがマクロファージへと分化する。マクロファージは、微生物、細胞外マトリックス、フィブリン、好中球、赤血球、および他の蓄積物等の断片を貪食し、効果的な創傷修復に重要だと考えられる様々な分子を分泌する。慢性創傷では、このフェーズの構成要素の１つまたは複数が調節不全になっているために創傷治癒が遅延しているようである。糖尿病性の創傷では、角化細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞からの成長因子の発現が減少しており、初期の止血血栓の形成に負の効果をもたらしている。加えて、高血糖ならびに高脂血症に関連したサイトカイン放出、走化、接着、および食作用活性の障害が観察されている。

創傷治癒障害は、罹患率および死亡率の上昇と関連する。非治癒性の創傷により、しばしば切断しなくてはならないことがある。しかし、大規模な調査にもかかわらず、正確な病因の基礎となるメカニズムは完全には解明されていない。これは、小血管および大血管疾患の総合的な結果であるようだ。

創傷治癒は、典型的には、糖尿病で遅延する。血管障害が創傷治癒に非常に寄与しているようだ。また、神経障害、そして間葉系細胞の移動および活性化を支援する成長因子の欠乏が、糖尿病性創傷治癒遅延の原因の一つとして認識されている。糖尿病状態自体に固有と思われる他の要因、例えば、細胞形態および機能の変化も病因に関与している。

Ｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｃｈａｒｉｔａ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００７）には、抗スタスミンリボザイムによる治療後にＨＵＶＥＣの細胞増殖が減少することについて記載されている。このリボザイムは、微小管の代謝を阻害し微小管が重合する方向に微小管の重合と脱重合の間の平衡をシフトさせることにより細胞増殖を妨害し、抗血管新生効果を有するようになると述べられている。

国際出願ＷＯ２００８／０３９３９０Ａ２号には、癌治療における腫瘍関連抗原およびキトサンのワクチン複合体について記載されている。可能性のある抗原は、スタスミンである。

国際出願ＷＯ２００７／０８９１５１Ａ１号（ＥＰ１８１５８６３Ａ１）では、ＴＬＲ３を活性化する物質としてスタスミンが同定され、アルツハイマー病などの神経変性疾患における変性炎症プロセスの治療についての示唆がされている。また、創傷の治療についての言及もある。

一方、米国特許第６，４２９，３０４Ｂ１号では、癌または「異常創傷治癒」など様々な増殖性疾患の治療に使用できる抗有糸分裂活性を有する化合物が教示されている。作用機序は、細胞増殖の予防である。化合物の抗有糸分裂活性は、微小管の脱重合に基づくと主張されている。かかる化合物はスタスミンであり、ＯＰ１８とも呼ばれている。

更に、国際出願ＷＯ２００４／１１３５６１Ａ２号では、スタスミンまたは腫瘍性タンパク質１８は、チューブリンの減少に起因する無制御細胞増殖を防ぐと主張されている。

これらの文献のいずれも、実際の創傷治癒におけるスタスミンの役割を調べてはいない。これらの特許文献の著者らは、むしろ、創傷治癒における効果の可能性について反対的な意見を述べている。よって、スタスミンが創傷治癒に有益な効果を有するか否かについては未だ解明されていない。

現在の創傷治癒の治療は創傷の洗浄および清拭と目的し、可能性のある感染を治療することで創傷の炎症フェーズを軽減し、そして場合によりＰＤＧＦなどの移動または成長因子を適用するものである。現在の創傷治療用製剤は未だ満足のいくものではなく、依然として創傷治癒用の組成物を改良する必要がある。

本発明は、創傷の治療におけるあるいは創傷瘢痕を縮小するためのスタスミン、スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞の使用を提供する。関連する態様では、本発明は、創傷治療に使用するためのスタスミン、スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞にも関する。さらに、本発明は、創傷治療用の薬剤の製造におけるスタスミン、スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞の使用に関する。また、スタスミンを含む医薬組成物も提供する。本発明は更に、免疫細胞、好ましくはナチュラルキラー細胞を刺激するため、線維芽細胞を刺激するため、上皮細胞、好ましくは表皮の上皮細胞を刺激するため、血管新生を刺激するため、特に上記および／または下記の細胞、特に間葉系細胞および／または線維芽細胞におけるＩＬ−８の産生を刺激するため、単球および／またはマクロファージを刺激するために、間葉系細胞、表皮細胞、および／または幹細胞、特に間質幹細胞および／または造血幹細胞、の増殖および／または移動を増加または誘導するインビトロまたはインビボの方法を提供する。単球および／またはマクロファージを誘導してＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２などのサイトカインを産生させることができる。これらの態様のすべてが同等であり、全ての好ましい実施形態は、等しくこれらの各態様に関連する。

本発明者らは、ＰＤＧＦ製剤等の一般的な薬剤に比べて優れた非常に強力な創傷治癒促進剤としてスタスミンを同定した。特に驚くべきなのは、創傷治癒の低下または創傷治癒の障害の場合に、予期不能なほど高速で創傷の閉鎖を達成できるというスタスミンの効果である。更に、本発明の主題を特許請求の範囲で規定する。

ヒトｐＤＣ様細胞によるｈｕ Ｓｔａｔ１の分泌。ＡＢ４（ヒトｐＤＣ）およびＰＳ細胞（初代ヒト皮膚線維芽細胞）を無血清培地で４８時間培養した。培養上清または細胞溶解物を採取し、ウサギ抗ｈｕ Ｓｔａｔ１抗血清を用いてウェスタンブロットで解析した。レーン１〜３：陽性対照としての組み換えｈｕ Ｓｔａｔ１（５００ｎｇ、５０ｎｇ、および５ｎｇ）、レーン４〜６：４）ＡＢ４溶解液４×１０⁴個の細胞、ＡＢ４上清１０⁴個の細胞、ＡＢ４上清４×１０⁴個の細胞；レーン７〜９：ＰＳ溶解液４×１０⁴個の細胞、ＰＳ上清１０⁴個の細胞、ＰＳ上清４×１０⁴個の細胞。

ＡＢ４細胞由来のｈｕ Ｓｔａｔ１のクローニング。ｐＴｒｉＥｘ４ Ｎｅｏ／ＴＯＰ１０クローン４中のｈｕ ＳＴＡＴ１のプラスミドＤＮＡを４２℃で３０秒の熱ショックによりＢＬ２１ ＤＥ３化学的コンピテント細胞に形質転換した。形質転換反応物を、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で１２時間インキュベートした。コロニーＰＣＲおよび対照の消化は上記のとおり行った。ＮｃｏＩ／Ｂｓｕ３６Ｉによる対照の消化後、ｈｕ ＳＴＡＴ１を含むｐＴｒｉＥｘ４ ＮｅｏＢＬ２１ ＤＥ３クローンはアガロースゲルにおいてそれぞれ４５０ｂｐのバンドを示した。

連続的陰イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｈｕ Ｓｔａｔ１の精製。ＤＥＡＥセファロースおよびオクチルセファロースＦａｓｔ ＦｌｏｗクロマトグラフィーにＡＫＴＡ精製ＦＰＬＣシステムを使用した。

電気的な細胞−基質間インピーダンス（ＥＣＩＳ）計測。ｈｕ Ｓｔａｔ１媒介性のインビトロ創傷治癒。ヒト上皮細胞（Ａ４３１）をフィブロネクチンでコーティングした培養容器（８Ｗ１Ｅ，ＩＢＩＤＩ，Ｍｕｎｉｃｈ）内で培養した。４８時間後に、高磁場パルスを用いると（矢印参照）、電極に覆われた領域のインピーダンスの急激な低下および細胞死が起こった。ｈｕ Ｓｔａｔ１の添加は、用量依存的に創傷領域への細胞の増殖および移動を引き起こす。１０％ＦＣＳ：陽性対照、無血清培地：陰性対照

コラーゲンのみ（Ａ）またはスタスミンとコラーゲンの組み合わせ（Ｂ）によって処理したＺｕｃｋｅｒラット。同じラットに異なる処理をした創傷の治療開始後９日目の写真を示す。

Ｓｔａｔ１による管様構造および管腔の誘導。ヒト内皮細胞（ＥＣＶ３０４）は、無血清培地中のフィブロネクチンでコーティングした培養容器上で増殖させた。組換えＨｕ Ｓｔａｔ１（０．５ｎｇ／ｍｌ）またはＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）の添加３日後に、培養物を透過光学顕微鏡（２００倍）で解析した。Ｓｔａｔ１で処理した培養物は明らかに萌出を示した（矢頭参照）が、この現象は無血清培養物中では本質的にみられなかった。

組み換えｈｕ Ｓｔａｔ１は、ヒトＮＫ細胞活性を刺激する。ヒトＮＫ細胞を、ＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０−０９２−６５７）によりヒト末梢血リンパ球から単離したところ、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が＜９７％であった（Ｂ）。単離前のＣＤ５６＋細胞の割合は１３％であった（Ａ）。 Ａ４３１細胞を標的として用い、読み取りシステムとしてＥＣＩＳ検査システムを用いた細胞傷害アッセイにおいて、エフェクターとして機能するＣＤ５６＋濃縮細胞（エフェクター：標的比＝１０：１）（Ｃ）。青線（下）はｈｕ ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）存在下でのＮＫ細胞の活性を示す。緑線（中央）はｈｕ Ｓｔａｔ１（０．５μｇ／ｍｌ）存在下でのＮＫ細胞の活性を示す。培地のみが存在するＮＫ細胞（赤線、上）では、Ｓｔａｔ１またはＩＬ−２処理細胞の活性に到達しなかった。

（ａ）ヒト初代皮膚線維芽細胞における組み換えスタスミン１によるｈｕ ＩＬ−８の誘導。ヒト初代皮膚線維芽細胞は、ｈｕ Ｓｔａｔ１無し（赤、手前）または５０ｎｇのｈｕ Ｓｔａｔ１を添加した（緑、奥）無血清培地で培養した。細胞を１８時間後に採取、溶解、そして可溶性受容体分子に特異的なタンパク質アレイ（Ｒ＆Ｄ）により分析した。タンパク質アレイは化学発光により分析した。(ｂ)ヒト初代皮膚線維芽細胞における組み換えスタスミン１によるＴＩＭＰ−１および−２の下方制御。ヒト初代皮膚線維芽細胞は、ｈｕ Ｓｔａｔ１無し（赤、奥）または５０ｎｇのｈｕ Ｓｔａｔ１を添加した（緑、手前）無血清培地で培養した。細胞は図８ａで記載のように分析した。

３７℃の創傷液におけるｈｕ Ｓｔａｔ１の安定性。１．５μｇのｈｕ組み換えＳｔａ１をＴｒｉｓバッファー、ヒト血漿、または慢性創傷から出た創傷液のいずれかと混合し、指定した時間３７℃でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして更にウサギ抗ｈｕ Ｓｔａｔ１血清を用いたウェスタンブロットにより分析した。

Ｈｕ Ｓｔａｔ１は、ヒドロゲル内において少なくとも５カ月間安定である。Ｈｕ組み換えＳｔａｔ１を０．９％ＮａＣＬへの溶解またはヒドロゲルへの混合のいずれかを行い、指定した温度で保存した。１μｇのＳｔａｔ１を、１、３、および５カ月後にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色により分析した。

(ａ)マイクロＰＥＴ画像。¹²⁴Ｉ−ｈｕ Ｓｔａｔ１（５μｇ）を投与した１匹のマウスについて（３台のベッドの位置でそれぞれ１０分間スキャンしたものを）統合した投影図。創傷は、図中では鋭い白色のスポットとして確認できる。(ｂ)マイクロＰＥＴ画像。¹²⁴Ｉ−ｈｕ Ｓｔａｔ１（５μｇ）を投与してから２４時間後の１匹のマウスについて（３台のベッドの位置でそれぞれ１０分間スキャンしたものを）統合した投影図。創傷は、図中では鋭い白色のスポットとして確認できる。

雄Ｚｕｃｋｅｒラットの創傷治癒モデルにおけるｈｕ Ｓｔａｔ１の効果。８および９日間における創傷領域の変化を示す（創傷サイズが縮小した割合％）。ｈｕ ＳＴＡＴ１（２５μｇ／創傷）による処理で創傷サイズが著しく縮小した。これに対し、組み換えＰＤＧＦは、未処理創傷と比較してもほんの少しの効果しかなく、非常にｈｕ Ｓｔａｔ１に劣っていた。

(ａ)Ｉ型コラーゲンと組み合わせた組み換えスタスミンの放出検査（ＥＬＩＳＡによる分析）。０．４％コラーゲンゲルに５０ｍｇのスタスミンを含浸させ、放出したタンパク質の量をスタスミン特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。(ｂ)コラーゲンから放出したスタスミンは生物学的に活性である。コラーゲン−スタスミン上で増殖またはコラーゲンＴＭＢＰゲルから得た上清で培養したヒト内皮細胞から分泌したＩＬ−８レベルを示す。 （ｃ）ヒト内皮細胞は、Ｉ型コラーゲン上で完全に成長した。一晩の培養後に撮影したマイクロ写真は、本質的に何の違いも示していない。

（ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析。これは、単離リボ核酸ｍＲＮＡからの遺伝子発現について正確な定量および特徴付けをするのに標準的な方法である。

（ｂ）白血球細胞から分泌した免疫応答タンパク質についてのＥＬＩＳＡによる定量。

ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いたインビトロでの血管形成。３つの独立した実験の平均数を示す。

スタスミンは、既知の配列を有するタンパク質である（ＮＣＢＩデータベースＮＰ＿００５５５４およびＣＡＤ１９０５７、または配列番号１（スタスミンａ）もしくは配列番号２（スタスミンｂ））。スタスミンそしてそのアイソフォームは、さらに、上述の背景技術におけるものが公知である。これは、哺乳動物のほとんどの組織で見られる普遍的に発現するタンパク質である。リン酸化可能な部位間の特定の組み合わせに応じて多くの異なるリン酸化型が見られる。Ｓｅｒ−１６におけるリン酸化は、神経細胞の極性に必要であると思われている。Ｓｅｒ−６３におけるリン酸化は、チューブリン結合を１０倍減少させ、そしてＭＴ重合阻害活性を抑制する。

配列番号１：
MASSDIQVKE LEKRASGQAF ELILSPRSKE SVPEFPLSPP KKKDLSLEEI QKKLEAAEER 60
RKSHEAEVLK QLAEKREHEK EVLQKAIEEN NNFSKMAEEK LTHKMEANKE NREAQMAAKL 120
ERLREKDKHI EEVRKNKESK DPADETEAD 149
配列番号２：
MASSDIQVKE LEKRASGQAF ELILSPRSKE SVPEFPLSPP KKKDLSLEEI QKKLEAAEER 60
RKSHEAEVLK QLAEKREHEK EVLQKAIEEN NNFSKMAEEK LTHKMEANKE NREAQMAAKL 120
ERLREKMYFW THGPGAHPAQ ISAEQSCLHS VPALCPALGL QSALITWSDL SHHH 174

本発明者らによって、分泌スタスミンが形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を模したヒト細胞株において同定された。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、創傷のある皮膚において特徴的な役割を有しており、急性の炎症反応および成長因子の産生を介する創傷治癒に関与している。組織再生に役立つ特有のタンパク質セットを分泌するヒト樹状細胞株が開発された。これらのタンパク質の一つは、スタスミン、つまり１７，３ｋＤの分子量を有するタンパク質である（配列番号１）。ｐＤＣからスタスミン遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させ、均質になるよう精製した。

インビトロにおいて、スタスミンは、ヒト間葉系細胞の増殖および移動を誘導し、血管新生を支援し、ナチュラルキラー細胞の活性を刺激する。真皮細胞の増殖、新血管、および細菌感染に対する第一線の防御が無いことが、多くの慢性創傷において鍵となる問題である。メタボリックシンドロームにより創傷治癒が遅延しているＺｕｃｋｅｒラットにおける創傷治癒を研究したところ、インビボで顕著な結果が得られた。スタスミンは。ヒドロゲルを用いて局所的に塗布するとＰＤＧＦを顕著に上回っていた。また、¹²⁴Ｉで標識したスタスミンを用いたＰＥトモグラフィーにより、このタンパク質が創傷領域に残っていたことが示された。スタスミンは、創傷液中で非常に安定しており（８時間以上）、局所的に塗布したところ血清中では検出されず、全身曝露も測定されなかった。

これらの新たなインビトロおよびインビボの結果に基づき、本発明は、実験証拠によってサポートされた創傷治療におけるスタスミンの使用を初めて提供する。

中心的な態様では、本発明は更に、非治癒性（集中的な治療を行わない非治癒性）の創傷、あるいは創傷治癒の低下したまたは創傷治癒の障害を有する創傷の治療におけるスタスミンの使用を提供する。創傷治癒の低下したまたは創傷治癒の障害を有する創傷とは、例えば、慢性創傷、または疾患依存性もしくは薬剤依存性の創傷治癒障害の創傷（これが慢性創傷である可能性、もしくは慢性創傷に進行する可能性もある）のことである。同様に、スタスミンをコードしスタスミンの発現を誘導する核酸を細胞中で使用することも、あるいはかかる細胞をこのような治療に使用することも可能である。

本発明は更に、創傷の治療におけるスタスミンとコラーゲンとの組み合わせを提供する。この組み合わせにより、相乗効果による創傷治癒速度のさらなる上昇が見られる。

本明細書中で使用する場合、スタスミンは、任意のスタスミンアイソフォームまたは変異体、あるいはリン酸化形態などの任意の翻訳後修飾形態にも関する。好ましい実施形態では、スタスミンは、配列番号１の１位〜１２６位のアミノ酸、または配列番号１の１位〜１２６位のアミノ酸の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号１の１位〜１２６位のアミノ酸は、配列番号２にも見られ、相同領域であることがある。更に好ましいスタスミン変異体は、国際出願ＷＯ２００７／０８９１５１号、米国特許第６，４２９，３０４Ｂ１号、国際出願ＷＯ２００４／１１３５６１号Ａ２およびＮＣＢＩデータベースのエントリーＮＰ＿００５５５４およびＣＡＤ１９０５７に開示されている（全ての文献は参照により本明細書に援用される）。

用語「配列同一性」は、２つの配列、通常、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）またはＣｌｕｓｔａｌＷ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）のような配列アラインメントプログラムによって決定できるアミノ酸配列の間の同一性を指す。これらのアルゴリズムは、選択された配列に対し最も一致するものを計算し、それらを同一性、類似点、および相違点がわかるように並べる。

本発明の好ましい実施形態では、本発明に係るスタスミンは、配列番号１の１位〜１２６位のアミノ酸の配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明にかかるスタスミンは、配列番号１に記載の配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。スタスミンは、スタスミン１、スタスミン２、スタスミン３またはスタスミン４であってもよく、好ましくはスタスミン１である。スタスミンは、組み換えスタスミンであってもよい。更に好ましいのは、同じ患者由来のスタスミンであるが、他の動物由来のスタスミン変異体を使用してもよい。好ましくは、患者は、哺乳動物、特にヒトまたはは非ヒト動物、とりわけ家畜動物、例えば、ブタ、げっ歯類、もしくは霊長類である。好ましくは、スタスミンは、ヒトスタスミンまたは非ヒト動物、特に家畜動物、例えば、ブタ、げっ歯類、もしくは霊長類由来のスタスミンである。

本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンな意味、すなわち、本発明のスタスミンがさらにアミノ酸またはタンパク質成分を有することがあるという意味で使用される。融合タンパク質であってもよい。このような拡張された意味を有するスタスミンタンパク質は、好ましい実施形態では、限定されたサイズ、例えば、最大２０００個のアミノ酸、最大１８００個のアミノ酸、最大１６００個のアミノ酸、最大１４００個のアミノ酸、最大１２００個のアミノ酸、最大１０００個のアミノ酸、最大８００個のアミノ酸、最大６００個のアミノ酸、最大４００個のアミノ酸、最大３００個のアミノ酸、最大２００個のアミノ酸、または最大１６０個のアミノ酸を有し得る。勿論、本発明はまた、上述の実施形態に含まれる上記配列のいずれか１つからなるスタスミンタンパク質にも関する。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、クローズな意味、つまり限定的な意味で使用する。

好ましい実施形態では、スタスミンはリン酸化されている。リン酸化は、自然な転写後プロセスであり、組換え発現中に起こる。可能性のあるリン酸化部位は、配列番号１のアミノ酸１６位、２５位、２８位、３８位、６３位、１４６位に相当するアミノ酸におけるものである。好ましいリン酸化は、配列番号１のアミノ酸１６位および／または６３位に相当するアミノ酸におけるものである。本発明にかかるスタスミンは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸のリン酸化を含み得る。

好ましい実施形態では、スタスミンはアセチル化されている。アセチル化は、自然な転写後プロセスであり、組換え発現中に起こる。可能性のあるアセチル化部位は、配列番号１のアミノ酸２位、９位、８０位、９５位、１００位、１１９位、１２８位に相当するアミノ酸におけるものである。本発明にかかるスタスミンは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のアミノ酸のアセチル化を含み得る。

スタスミンはグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。大腸菌が産生するスタスミンは、グリコシル化されなく効果的である。

スタスミンタンパク質を使用する代わりとして（またはスタスミンタンパク質と組み合わせて）、上述したスタスミンタンパク質をコードする核酸を使用することも可能である。そのような配列は、例えば、配列番号３に記載されており、配列番号１をコードするものである。

配列番号３：
atggcttctt ctgatatcca ggtgaaagaa ctggagaagc gtgcctcagg ccaggctttt 60
gagctgattc tcagccctcg gtcaaaagaa tctgttccag aattccccct ttcccctcca 120
aagaagaagg atctttccct ggaggaaatt cagaagaaat tagaagctgc agaagaaaga 180
cgcaagtccc atgaagctga ggtcttgaag cagctggctg agaaacgaga gcacgagaaa 240
gaagtgcttc agaaggcaat agaagagaac aacaacttca gtaaaatggc agaagagaaa 300
ctgacccaca aaatggaagc taataaagag aaccgagagg cacaaatggc tgccaaactg 360
gaacgtttgc gagagaagga taagcacatt gaagaagtgc ggaagaacaa agaatccaaa 420
gaccctgctg acgagactga agctgactaa 450

核酸は、創傷周辺の細胞におけるスタスミンの産生を誘導するために使用できる。核酸送達に好ましい製剤は、例えば、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、または送達制御用の小胞である。細胞は、その後スタスミンを産生および分泌し、これにより治療薬の継続的な生産ができるようになる。

また、本発明にかかる使用のためにスタスミンを発現する細胞も提供する。このような細胞は、好ましくは連続的にスタスミンを分泌して治療効果をもたらす。このような細胞は、任意の細胞であり得る。好ましくは、細胞はｐＤＣであるが、非ｐＤＣでも可能である。好ましい実施形態では、細胞は、患者にとって非免疫原性、例えば、スタスミンを発現するように組換えによって遺伝子操作された患者から得られた細胞である。細胞のこのような変形はインビトロまたはインビボで実施できる。

特に、核酸または細胞について直接的に有効な治療因子は発現したスタスミンであるため、今までに記載したそしてこれから記載する詳細な説明は、等しく、スタスミンタンパク質、核酸、および細胞に関するものである。

本発明は、特に、患者における慢性創傷または血管形成不全の創傷の治療に使用するためのスタスミン、上記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞を提供する。好ましくは、治療する組織は皮膚である、あるいは治療する組織または領域は、少なくとも部分的に皮膚を含む。慢性創傷または創傷治癒障害の創傷は、皮下組織、もしくは骨にすら影響を与えることがある。治療は、好ましく局所的で、特に、ヒドロゲルなどの局所製剤を用いるものである。

スタスミン、核酸、または細胞は、患者における創傷、好ましくは慢性創傷または血管形成不全の創傷の治療に使用するために、生体適合性マトリックス、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、キサンタン、ヒドロキシエチルセルロース、キトサンおよび／またはヒアルロン酸を含む生体適合性マトリックスと調合あるいは当該マトリックスに結合できる。実際、この製剤は、他の従来製剤を凌ぐ驚くほど新しい性質および新規な効果をもたらす。したがって、本発明は、急性および慢性創傷ならびに創傷治癒障害の創傷を含む創傷の治療のためのかかる製剤におけるスタスミンの使用を提供する。生体適合性マトリックスの調製は、当該分野で公知であり、例えばＴａｎ ｅｔ ａｌ．（９）に記載されている。生体適合性マトリックスは、好ましくは、創傷治癒および／または特に創傷における細胞の接着を支援する。これらは、再成長した細胞瘢痕組織の強化につながる。好ましくは、生体適合性マトリックスはヒアルロン酸を有する足場を含む。

スタスミンは、創傷治癒における瘢痕吸収および再上皮形成に重要なメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を阻害する酵素の１クラスであるメタロプロテアーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）を抑制するので、創傷治癒の間における瘢痕の形成を軽減し、そして瘢痕が形成された後の傷跡を縮小させるために使用できる。

好ましい実施形態では、スタスミンはヒドロゲル中において製剤化される。ヒドロゲルは、好ましくはゼラチン、アルギン酸、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。有機化学ヒドロゲルは、多数の親水性基を有するポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマーおよびコポリマーを含んでもよい。ヒドロゲルは、親水性で、ときどき水が分散媒であるコロイド状ゲルとして見られるポリマー鎖のネットワークを含む。ヒドロゲルは、高吸収性（９９．９％以上の水を含み得る）天然または合成ポリマーである。ヒドロゲルは、含水量が非常に高いために天然組織にとても類似した柔軟度を有する。ヒドロゲルは局所薬物送達におけるリザーバーとなる。

好ましい実施形態では、治療対象の創傷は、慢性創傷である。慢性創傷は、その創傷が全く治癒しないかまたは限定的にしか治癒しない創傷のことである。つまり、秩序だった一連の治癒段階内および予測可能な時間内に治癒しない創傷のことである。特定の実施形態において、慢性創傷は、１４日、好ましくは１８日、特に好ましくは２２日、さらにより好ましくは２８日、３４日、４０日、５０日、または６０日以内に創傷が治癒しないかまたは治癒度が低い（例えば、約２０％の創傷領域しか閉鎖していない）創傷のことである。好ましい実施形態では、創傷は、無酸素、および／または十分な酸素供給を欠いている、および／または新たに形成された動脈を欠いている。また、本発明は、血管新生を刺激し、創傷の治癒および創傷または他の場所における血管の新生を適切にまたは加速して修復できる。

代わりにまたは組み合わせとして、創傷は、疾患依存性の創傷治癒障害（疾患依存性の創傷治癒障害は、上述のように慢性であり得る）を有する創傷である。疾患依存性の創傷治癒障害は、糖尿病またはメタボリックシンドローム、慢性静脈不全（ＣＶＩ）、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、癌、自己免疫、特に関節リウマチ、狼瘡（特に全身性紅斑性狼瘡）およびリベド血管症から選択される自己免疫、手術創、造瘻、長期の炎症プロセス、褥瘡成長因子の欠乏または成長因子受容体の欠乏などによる細胞老化から選択される疾患によるものであり得る。本発明による治療対象の患者は、これらの疾患または状態を１つまたは複数有していてもよい。好ましくは、上記患者は糖尿病またはメタボリックシンドロームに罹患している。

代わりにまたは組み合わせとして、創傷は、薬剤依存性の創傷治癒障害を有する創傷である。薬剤依存性の創傷治癒障害は、コルチコステロイド、ニコチン、抗生物質、免疫抑制剤、抗凝固剤、細胞毒性剤、抗リウマチ薬、特に抗関節リウマチ薬、血管収縮薬から選択される薬剤を用いた治療によるものである。本発明による治療対象の患者は、これらの治療を１つまたは複数受けていてもよい。

したがって、本発明は、血管新生を刺激するためのスタスミンの使用を提供する。動脈からの供給が不十分な組織を有する患者を治療してもよい。患者は、本発明により治療する無酸素組織を有していてもよい。また、動脈からの供給が不十分な組織は、慢性、例えば、１４日、好ましくは１８日、特に好ましくは２２日、更により好ましくは２８日、３４日、４０日、５０日、または６０日間この状態であってもよい。

慢性疾患は、外科手術または事故による創傷といった急性の原因、あるいは糖尿病または他の併存疾患といった慢性の原因を有することもあり、特に、皮膚または他の組織における低酸素を引き起こすような他の疾患との組み合わせであることもある。

したがって、本発明は、スタスミンによる血管新生の誘導が必要な患者、特にかかる治療が必要な組織における治療に関する。好ましくは、治療は局所的である（これは、本発明の全ての実施形態において好ましい）。

好ましい実施形態では、患者は、全身性変性炎症プロセスに罹患していない。治療する創傷は、変性炎症プロセスを含んでもよいし含んでいなくてもよい。

更に、治療は、免疫を調節するために、先天性免疫応答を刺激する必要がある、ならびに／あるいは、サイトカイン／成長因子および／またはＴＩＭＰを誘導する必要がある患者用である。このような患者は、局所性または全身性の免疫不全を有していてもよい。免疫不全とは、全免疫細胞の供給が不足（局所的または全身的に）していること、または免疫細胞の活性が制限されていること、または特定の細胞、特にＮＫ細胞などの先天性免疫系の細胞、好ましくは、本発明に従って刺激される細胞の供給が制限されている（局所的または全身的に）ことである。局所とは、好ましくは、創傷領域に関するものである。好ましくは、免疫不全は、細胞介在性免疫の不全および／または先天性免疫系の不全である。免疫系は、原始的な先天性免疫系と、後天性または適応性免疫系とに分けられる。これら免疫系はそれぞれ液性および細胞性成分を含む。

スタスミン、核酸、または細胞は、糖尿病またはメタボリックシンドロームに罹患している患者における創傷の治療に使用することができる。糖尿病およびメタボリックシンドロームは、患者の増殖および代謝能力の調節異常を引き起こし、これにより創傷治癒の低下または創傷治癒の喪失につながる。更に、糖尿病は、免疫低下および小血管の損傷を引き起こし、組織への適切な酸素供給を防げ、急性の原因なしに慢性的な創傷を引き起こす可能性がある。

スタスミンで治療可能な創傷または状態の特定の例として、糖尿病性足部創傷、特に糖尿病性足部潰瘍、一般的な潰瘍、特に静脈性潰瘍、褥瘡または圧迫潰瘍、熱傷、好ましくは第三度熱傷、手術創、事故による創傷、壊死性創傷、感染傷から選択される創傷が挙げられる。これらの創傷および状態は慢性であってもよく、特定の場合は急性であってもよい。好ましい実施形態では、これらの慢性的な創傷および状態を本発明に従って治療する。

本発明は更にスタスミンを含む医薬組成物に関する。治療的使用のための医薬組成物または製剤は、医薬的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントを含んでもよい。また、本発明は、治療的有効量のスタスミンを含む医薬組成物も提供する。「治療有効量」という用語は、特定の条件および投与経路において治療効果をもたらす量という意味である。組成物は、液体または凍結乾燥形態であってもよく、種々のｐＨ値およびイオン強度を有する希釈剤（Ｔｒｉｓ、酢酸またはリン酸緩衝液、ＮａＣｌ）、Ｔｗｅｅｎまたはポリソルベートなどの可溶化剤、ヒト血清アルブミンまたはゼラチンなどの担体、チメロサールまたはベンジルアルコールなどの防腐剤を含む。特定の組成物の選択は、治療すべき状態、投与経路、および所望の薬物動態パラメータを含む多くの因子に依存するであろう。

好ましい製剤は、局所投与用の製剤である。特に好ましいのはヒドロゲルである。また、溶解性、安定性、血漿半減期、および生物学的利用能を増加させるために水溶性ポリマーで修飾したスタスミンを含む組成物も包含される。組成物は、長期間にわたる制御送達のために、スタスミンをリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、微粒子、または小胞へ組み込んだものを含んでもよい。

特定の実施形態では、スタスミンは担体を備える。好ましくは、担体は、ゲル、好ましくは、ヒドロゲル、または創傷被覆材または綿棒から選択される。これらは、場合によりスタスミンを含む溶液が含浸されている。更に、担体は、活性薬剤の混合物が長期わたり効果があるように遅延させてまたはゆっくりと放出する徐放用の担体を含む。対応する担体を有するかかる製剤は、局所的で迅速な投与に特に適している。これらの担体のいずれかの代わりにまたは組み合わせにして、担体は、生理食塩水、好ましくはＮａＣｌ塩を、特に好ましくは約０．９％の濃度で含んでもよい。かかる担体は、例えば皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内等の非経口投与または注入技術に使用してもよい。

好ましい実施形態では、スタスミンは、創傷ｃｍ²当たり０．１μｇ〜１０００μｇのスタスミン量で使用する。また、好ましいのは、創傷ｃｍ²当たり少なくとも０．１μｇ、少なくとも０．２μｇ、少なくとも０．５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも２μｇ、少なくとも５μｇ、および／または多くとも１０００μｇ、多くとも７５０μｇ、多くとも５００μｇ、多くとも４００μｇ、多くとも３００μｇ、多くとも２００μｇ、多くとも１００μｇ、または多くとも５０μｇの量、あるいはこれらの値の任意の範囲の量である。

医薬組成物は、前述のように、生体適合性マトリックス、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、キトサン、および／またはヒアルロン酸を含む生体適合性マトリックスと調合された、またはかかるマトリックスに結合されたスタスミンを含んでもよい。医薬組成物は、代わりまたは組み合わせとして、前述のようなスタスミンを有するヒドロゲルを含んでもよく、例えば、アルギン酸を有するスタスミンの製剤であってもよい。

特に、本発明は、薬剤として使用するための医薬組成物を提供する。特定の用途は、上述のような創傷の治癒および／または血管新生の刺激である。

更なる態様では、本発明は、免疫細胞を刺激するため、線維芽細胞を刺激するため、上皮細胞、好ましくは表皮または血管の上皮細胞を刺激するため、マクロファージまたは単球を刺激するため、あるいは血管新生を刺激するために、間葉系細胞、表皮細胞、および／または幹細胞、特に間質幹細胞もしくは造血幹細胞の増殖および／または移動を増加または誘導する方法であって、上記細胞に、スタスミン、上記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞を投与する工程を含む方法を提供する。この方法は、インビトロ、例えば、単離細胞または細胞培養物で実施し得る。特に本発明にかかる方法は、上記細胞、特に間葉系細胞および／または線維芽細胞におけるＩＬ−８の産生を刺激するために使用できる。本発明は、創傷治癒に対し特に有益な効果をもたらすＩＬ−８の産生を刺激する。単球および／またはマクロファージは、創傷治癒において更に有益な効果を有するサイトカイン、例えばＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２を産生するように誘導できる。

また、この方法のインビボにおける使用、特に創傷を有する患者または上記の治療、例えば、血管新生を刺激すること、が必要とする患者に対する使用を提供する。よって、患者における免疫細胞を刺激するため、線維芽細胞を刺激するため、上皮細胞、好ましくは表皮または血管の上皮細胞を刺激するため、あるいは血管新生を刺激するために間葉系細胞、表皮細胞、および／または幹細胞、特に間質幹細胞もしくは造血幹細胞の増殖および／または移動を増加または誘導する方法であって、患者に、スタスミン、上記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞を、好ましくは創傷部の局所投与により投与する工程を含む方法を提供する。患者は、例えば、創傷または無酸素状態、組織の壊死または感染（あるいはそれらの組み合わせ）により、かかる増加、誘導、または刺激が必要であってもよい。特に本発明の方法は、前述の通り、上記細胞、特に間葉系細胞および／または線維芽細胞におけるＩＬ−８の産生を刺激するために使用できる。

刺激可能な免疫細胞は、好ましくは先天性免疫系の細胞、特にナチュラルキラー細胞である。

本発明は更に、表２に記載の成長因子のいずれか１つ、特にＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦおよび／またはＫＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａまたはＭＩＰ−２の刺激を提供する。この方法は、上記のインビトロまたはインビボの方法において使用することができる。

本発明を更に以下の図および実施例により説明するが、本発明はこれら特定の態様に限定されない。

略語
ＤＦＵ、糖尿病性足部潰瘍
ＦＣＳ、ウシ胎児血清
ＦＮ、フィブロネクチン
ＦＰＬＣ、高速タンパク質液体クロマトグラフィー
ＨＩＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｈｒｓ、時間
ＯＮ、一晩
ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞
ＰＤＧＦ、血小板由来成長因子
Ｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１、組み換えヒトスタスミン１
ＴＩＭＰ、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子
ＴＬＲ、Ｔｏｌｌ様受容体

実施例１：材料と方法
１．１ 細胞培養物
初代細胞物（ＳＮＦ、ＰＳ）は、整形手術を受けた患者から得られたヒト皮膚由来の線維芽細胞である。組織標本を細かく切断し、脂肪組織から遊離させ、コラゲナーゼ／ディスパーゼの存在下、３７℃で４時間インキュベートした。

細胞株：ＡＢ４細胞は、形質細胞様樹状細胞に類似したヒト細胞であり、組織球増殖症の患者由来である。ＥＣＶ３０４およびＡ４３１は、それぞれ内皮および上皮由来のヒト細胞株である。細胞は、１０％の熱で不活化したＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン−１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した（全ての試薬は、ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａから入手）。細胞を１：４の割合で週２回継代培養した。

１．２ 試薬
組み換えＩＬ−２、ＶＥＧＦ、およびＰＤＧＦをＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から入手した。ウシＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヒドロゲルは、Ｎｏｒｍｌｇｅｌ（登録商標）（Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）を指し、ＰＤＧＦを含むヒドロゲルをＪａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇから入手した（Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標），Ｂｅｌｇｉｕｍ）。

１．３ ヒトスタスミン１のクローニング、発現、および機能的特徴
-由来：ヒト細胞株ＡＢ４由来のｃＤＮＡ
-特許第ＡＴ ４１２２８１Ｂ号に記載されている形質様樹状Ｂ細胞
-大腸菌（ＢＬ２１株）における発現
-均一になるまで精製
-技術的な詳細は、参考文献１〜５に記載されている。

１．３．１ クローニング
ＡＢ４ｃＤＮＡを、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い業者の説明書に従って生成した。ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いて設定し、オリゴヌクレオチド「ｈｕ ＳＴＡＴ１-ＮｃｏＩ-Ｆ」および「ｈｕ ＳＴＡＴ１-Ｂｓｕ-Ｒ」およびＡＢ４-ｃＤＮＡを鋳型として用い、５’末端にＮｃｏＩ制限部位を有し３’末端にＢｓｕ３６Ｉ制限部位を有するＰＣＲ産物を生産した。

ＰＣＲ 産物およびｐＴｒｉＥｘ４ ＮｅｏプラスミドＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＢｓｕ３６Ｉにより３７℃で２時間消化した。消化産物をアガロースゲル電気泳動により分離した。消化ＰＣＲ産物およびプラスミドＤＮＡについての各バンドをアガロースゲルから精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて室温で４時間ライゲーションした。ライゲーション反応物は、３０秒間４２℃で熱ショックを与えＴＯＰ１０ワンショット化学的コンピテント細胞に形質転換した。形質転換反応物は、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で１２時間インキュベートした。

コロニーＰＣＲはＧｏＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチド「ｈｕ ＳＴＡＴ１-ＮｃｏＩ-Ｆ」および「ｈｕ ＳＴＡＴ１-Ｂｓｕ-Ｒ」を用いて行い、陽性の形質転換体を同定した。

ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で確認したところ、陽性の形質転換体は、アガロースゲルにおいて４５０ｂｐに特異的なバンドを示した。陽性クローンはアンピリシンを含む４ｍｌのＬＢブロスに接種し、３７℃で１２時間インキュベートした。

プラスミド調製物を、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅプラスミド単離キットを用いて業者の説明書に従い行った。プラスミドＤＮＡはＮｃｏＩおよびＢｓｕ３６Ｉを用いて３７℃で２時間消化し、さらに、陽性形質転換体を確認した。

ｈｕ ＳＴＡＴ１は、ｐＴｒｉＥｘ４ ＮｅｏおよびＴＯＰ１０ワンショット化学的コンピテント細胞へクローニングできた。ＮｃｏＩ／Ｂｓｕ３６Ｉによる対照消化により、ｐＴｒｉＥｘ４ Ｎｅｏ／ＴＯＰ１０クローン４、６、および８にあるｈｕ ＳＴＡＴ１は、アガロースゲルにおいてそれぞれ４５０ｂｐに特異的なバンドを示した（図１参照）。

陽性形質転換体のプラスミドＤＮＡを配列評価のためＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に送付し、得られた配列を、多重配列アラインメントツールを採用するＧｅｎＢａｎｋの参照ｈｕ ＳＴＡＴ１配列とアラインさせることによって評価した。

１．３．２ 発現
ｐＴｒｉＥＸ−４ Ｎｅｏ内のＮｃｏＩ／Ｂｓｕ３６Ｉにてクローニングしたｈｕ Ｓｔａｔ１を含むＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌クローン４−３を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中でＯＤ₆₀₀＞０．５になるまで増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加した後に、ｈｕ Ｓｔａｔ１に特異的なタンパク質のバンド（１７，３ ｋＤ）を誘導した。細菌細胞を４５００ｒｐｍで１時間の遠心分離をすることにより回収した。細胞ペレットを溶解緩衝液中に再懸濁し（５００μｌの溶解緩衝液中に１０ｍｌの培養物由来ペレット）、３回の凍結／解凍サイクルを行い細胞溶解を行った。次に溶解物を１時間４５００ｒｐｍで遠心分離することにより細胞の沈殿物と上清に分離した。溶解物の上清を０．４５μｍシリンジフィルタで濾過した。

１．３．３ 陰イオン交換クロマトグラフィー
溶解物の上清は、ＡＫＴＡ精製ＦＰＬＣシステム上で陰イオン交換バッファーＡを用いたＣａｐｔｏ ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に加えた。未結合の試料を１０ＣＶの陰イオン交換バッファーＡでカラムから洗い流し、その後カラムを１０ＣＶの５％陰イオン交換バッファーＢで洗浄した。５ＣＶの２０％陰イオン交換バッファーＢをカラムに流して溶出を行った。溶出液を１５ｍｌの画分に回収し、クマシー染色し１２％のＢｉｓＴｒｉｓゲルで分析した。

１．３．４ 硫酸アンモニウム沈殿
陰イオン交換クロマトグラフィーから得た画分を含むｈｕ ＳＴＡＴ１をプールし、３０％硫酸アンモニウムを用い４℃で２４時間攪拌しながら沈殿させた。沈殿後、試料を４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレットと上清中に分離した。上清を０．４５μｍシリンジフィルタで濾過した。

１．３．５ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
硫酸アンモニウム沈殿後の上清を、ＡＫＴＡ精製ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＩＣバッファーＡ１入りのオクチルセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗに加えた。未結合の試料を１０ＣＶのＨＩＣバッファーＡによりカラムから洗い流した。２０ＣＶで０〜１００％ＨＩＣバッファーＢの勾配により溶出を行った。溶出液を１０ｍｌの画分に回収し、クマシー染色、銀染色、およびウェスタンブロットを用いて１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲルで分析した。

ＨＩＣ工程から得たｈｕ ＳＴＡＴ１を含む画分をプールし、遠心フィルタ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｖｉｅｎｎａ）を用いて濃縮した。この工程では、バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）に交換した。最後に生成物を０．２μｍシリンジフィルタで滅菌した。得られた生成物の純度は銀染色（図３のレーン１０を参照）によって確認した。タンパク質の同一性を、標的タンパク質特異的ウェスタンブロットで確認した（図３のレーン１２を参照）。

ｐＴｒｉＥｘ４ Ｎｅｏ／ＴＯＰ１０クローン４へ挿入したｈｕ ＳＴＡＴ１の配列はｈｕＳＴＡＴｌの配列と同一であり、ｐＴｒｉＥｘ４ Ｎｅｏベクターの制限部位５’ＮｃｏＩおよび３’Ｂｓｕ３６Ｉに正しくライゲートされていたので、ベクターがコードするアミノ酸なしに天然のタンパク質の発現が可能であることが分かった（図２参照）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１．３．６ 細胞溶解物および培養上清のウェスタンブロット分析
ＡＢ４およびＰＳ−Ｆ細胞をＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ）入りの７５ｃｍ^ｃフラスコ（Ｎｕｎｃ）内で培養してから、培養物を、無血清ＲＰＭＩ（ＰＡＡ）中で４８時間保持した。その後ＡＢ４細胞を遠心分離により回収し、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎに２×１０⁶個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＰＳ−Ｆ細胞をトリプシン（ＰＡＡ）で処理し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎに２×１０⁶個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。両方の細胞株の培養上清を回収し、Ｕ−Ｔｕｂｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，２Ｈ−２（Ｍｅｒｃｋ）で濃縮した。細胞溶解物および上清を１２％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏｒａｄ，Ｖｉｅｎｎａ）で分離し、半乾燥ブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。膜は、３％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳粉末入りのＴＢＳＴ中で３７℃で１時間ブロッキングした後、１０分間の洗浄を３回行った（ＴＢＳＴで２回、ＴＢＳで１回）。スタスミン１であらかじめ免疫したウサギの血清をＴＢＳＴで１：１００に希釈し、膜に塗布し、４℃で２４時間インキュベートした。３回の洗浄工程の後、膜をＩｍｍｕｎ−Ｓｔａｒヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）−ＨＲＰ検出キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてインキュベートし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。

１．４ 電気セルインピーダンス測定
ＥＣＩＳ電極アレイ（８Ｗ１Ｅ）はＩＢＩＤＩ，Ｍｕｎｉｃｈから入手した。細胞を播種する前に、５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆ１１４１）を含む超純水により３７℃で３〜４時間アレイをコーティングした。コーティング後、フィブロネクチンを吸引し、室温で乾燥させ、無菌条件下で保存した。

細胞型および用途に応じて、異なる細胞濃度を採用してもよい。１×１０⁵個の細胞／ｍｌだと２〜３日以内にコンフルエント層が得られた。

ＦＮコーティング後、２００μｌの無血清ＲＰＭＩを各ウェルに添加した。アレイをＣＯ₂インキュベーターに入れ培地を雰囲気に慣らし、細胞接着をより良くした。細胞増殖、創傷、および細胞傷害性は、本質的にＫｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ（８）に記載のＥＣＩＳモデル１６００Ｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＵＳＡ）を用いて測定した。

１．５ 血管新生アッセイ
血管新生は、フィブリノゲン／トロンビンでコーティングした培養容器で増殖させたＥＣＶ３０４細胞を用いて測定した。簡単に言うと、３０μＬのフィブリノゲン溶液を平底９６ウェルプレートのウェルに分注した。プレートを穏やかに振盪し、確実にフィブリノゲン溶液が９６ウェルプレートの底部をカバーするようにしてから、ウェルあたり２０μＬのトロンビンを添加した。

プレートを振盪し、１５〜６０分間３７℃に置き重合を行った。検査対象のタンパク質（ｒ ｈｕＳｔａｔ１）は、無血清培地中で希釈した。１００μＬのＥＣＶ３０４細胞を含む無血清培地（１０⁵個の細胞／ｍｌ）を９６ウェルプレートのウェルに添加してから、各ｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１希釈液を１００μｌ添加した。陽性対照として、ｈｕ ｒＶＥＧＦ−１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を使用した。培養物を３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、２４、４８、及び７２時間後に光学顕微鏡／デジタル写真によって分析した。

１．６ ＮＫ媒介性細胞傷害
ヘパリン化血液を健康な対象から採取し、末梢血液単核細胞をＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離により単離した。続いて、ＮＫ＋細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙのプロトコル（ＮＫ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い磁気ビーズによりネガティブ選択することにより単離した。細胞集団の純度はフローサイトメトリーによって決定した。得られたＮＫ画分を回収し、計数し、純度をＦＡＣＳ分析によって確認した。

１×１０⁵個のＡ４３１細胞を８ウェルＥＣＩＳアレイに播種した。２４時間後、１×１０⁶個のＮＫ細胞（標的：エフェクター比＝１：１０）を各ウェルに加えた。様々な濃度の組み換えｈｕ Ｓｔａｔ１を加え、ｒ ｈｕ ＩＬ２（５０単位／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を陽性対照として使用した。標的細胞株のインピーダンスを数日間観察して、ＮＫ細胞媒介性殺傷を評価した。Ａ４３１の１つのウェルには、Ａ４３１が誘導なしで死亡する時点を決定するためにＮＫを添加しなかった。

１．７ スタスミンの刺激によるＳＮ−Ｆ細胞の遺伝子発現
ＳＮ−Ｆ細胞（初代ヒト皮膚繊維芽細胞）を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。約８０％のコンフルエンスに達した後、細胞をトリプシン処理し、２００，０００個の細胞／ウェルの細胞数で６ウェルプレートに播種した。刺激するために、ｒｈｕＳｔａｔ１を５μｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および５００ｐｇ／ｍｌの濃度で培養物に添加した。刺激時間（２時間、６時間、２４時間、４８時間）の終了後、細胞をウェルから剥離し、さらに、ＲＮＡの単離用に処理した。

全ＲＮＡを、ＰｒｏｍｅｇａのＳＶ全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて単離した。その目的のために、細胞をトリプシン処理し、１０分間８００ｒｐｍで遠心分離した。その後、ペレットを１×ＰＢＳで希釈し、３００ｇで５分間遠心分離し、残りの細胞ペレットを、１７５μｌの溶解バッファー中で溶解した。最後に、３５０μｌの希釈バッファーを溶解細胞に添加し、試料を７０℃で３分間インキュベートした。その後、試料を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。すべての追加工程は、製造業者のプロトコルに従って実施した。

得られたＲＮＡ調製物は、Ｐｒｏｍｅｇａの「ＩｍＰｒｏｍＩＩ（商標）逆転写システム」（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳ）を用いてｃＤＮＡ合成用に処理した。ハウスキーピング遺伝子および特定の遺伝子のＰＣＲ反応用に、２つの異なるマスターミックスを使用した。各マスターミックスに、２．７Ｍのベタイン、６．７ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、６．７％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、および５５μｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）からなる複合エンハンサー溶液（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＣＥＳ）を補充した。

プライマーは、インターネットツールのプライマー設計アシスタント（ＰＤＡ）を利用して設計し、ＶＢＣ Ｏｌｉｇｏｔｅｃｈ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって合成した。全てのプライマーは、１０ｐｍｏｌの最終濃度で使用した。プライマーを表１に示す。

３０、３５、および４０サイクルを比較することにより適切なサイクル数を決定した。最良の結果が３５サイクル後から観察できたので、今後の使用は３５サイクルで設定した。

ＰＣＲ試料のアガロースゲル電気泳動を、１％アガロースゲル（１ｇのアガロース＋１００ｍｌの１×トリスホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液）を用いて実施した。臭化エチジウムの代わりに７μｌのＬｏｎｚａ（登録商標）Ｇｅｌ Ｓｔａｒ核酸染色で、ゲルを染色した。分析のため、１５μｌのＰＣＲ試料および１０μｌのＤＮＡラダー（Ｑｕｉｃｋ−Ｌｏａｄ（登録商標）１００ｂｐ ＤＮＡラダー、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をゲルに載せ、１１５Ｖで約４５分間電気泳動にかけた。泳動後のゲルの写真を、ＵＶトランス照明器の下で撮影した。

画像解析をＫａｐｅｌａｎ（Ｌｅｉｐｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のソフトウェアＬａｂＩｍａｇｅ １Ｄを用いて行った。このプログラムを利用して、試料のＤＮＡバンドをマーカーのＤＮＡ量と比較することによってＤＮＡ量を定量した。

１．８ ヒト可溶性受容体アレイ
ヒト初代線維芽細胞（ＳＮ−Ｆ）を、５０ｎｇ／ｍｌのＴＭＢＰ３の存在下（ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＣＳ＋ＴＭＢＰ３）または非刺激（ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＣＳ）で一晩培養した。培養細胞を剥離した後、ＰＢＳでリンスし、溶解緩衝液（アレイキットの一部）に１×１０⁷個の細胞／ｍｌの濃度で溶解した。溶解物を４℃で３０分間揺動した。５分間のマイクロ遠心分離後、上清を清浄な試験管に移した。全ての追加工程は、ｈｕ可溶性受容体に特化したＰｒｏｔｅｏｍｅ ＰｒｏｆｉｌｅｒＡｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＲＹ０１２）のＲ＆Ｄプロトコルに従って行った。

化学発光試薬を添加した後、信号の光強度を、ＵＶＰ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ ＡＣ画像システム（ＵＶＰ，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）を用いて３０分の露光時間で測定した。得られた画像はＴｏｔａｌＬａｂ ＴＬ１００プログラム（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）の一部であるＰｈｏｒｅｔｉｘ Ａｒｒａｙソフトウェアを用いて分析した。このソフトウェアは、各個々のスポットの画素値（光強度）を計算するものである。

１．９ 陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）による試験
Ｓｔａｔ１は、ヨウ素−１２４およびクロラミンＴで標識後、品質管理のために紙電気泳動およびＨＰＬＣをした。３匹の雄Ｓｐｒａｑｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに創傷を作成した。ラットに麻酔をし、体の背面を剃毛した。２つの全層創傷を、生検パンチ（Ｆａ．Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ（登録商標）、直径：０．８ｃｍ）を用いて、獣医によって作成した。創傷の作成後、動物を３８℃に保ったｍｉｃｒｏＰＥＴのベッド上に配置した。動物は５μｇまたは１００μｇのｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１を含む５０μｌヒドロゲル（Ｎｏｒｍｌｇｅｌ（登録商標），Ｍｏｌｎｙｃｋｅ）で処理した。Ｆｏｃｕｓ２２０ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍｕｎｉｃｈ）を用いて０、４、８、および２４時間後に４回スキャンした。測定は、放射性トレーサー投与から４、８、および２４時間後に直接行った。ラットの全身をカバーするように３台のベッドの位置で１０分間静的スキャンを取得した。すべての画像は、ＦＯＲＥ ｒｅｂｉｎｎｉｎｇを使用して再構成し、その後フィルタ補正逆投影アルゴリズムを行った。関心領域（ＲＯＩ）を手作業で再構成画像に描いた。

１．１０ Ｚｕｃｋｅｒラットにおけるインビボの創傷治癒
雄Ｚｕｃｋｅｒラット（Ｃｒｌ：ＺＵＣ−Ｌｅｐｒ^fa（ｆａ／ｆａ））をインビボモデルとして使用して創傷治癒遅延におけるｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１の効果を検査した。剃毛した各ラットの背中に生検パンチによって１つの創傷を作成した。創傷は異なる濃度（２５．５μｇまたは０．５μｇ）のｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１を含む５０μｌのヒドロゲルである５０μｌＲｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）で処理するか、または処理しないままにした。創傷はＶａｒｉｈｅｓｉｖｅ（登録商標）ｅｘｔｒａ ｍｉｎｃｅ（ＣｏｖａＴｅｃ）で閉じ、Ｌｅｕｋｏｐｌａｓｔで固定した。各動物につき、１つの円形傍脊椎真皮／表皮全層創傷を背中に作成し、異なる量のｈｕ ＳＴＡＴ１（０．５μｇ／創傷、５μｇ／創傷、および２５μｇ／創傷）またはＲｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）（５μｇ／創傷）で毎日局所的に処理した。さらにもう１つの円形傍脊椎真皮／表皮全層創傷を対照として非処理動物に作成した。検査対象のｈｕ ＳＴＡＴ１および参照対象のＲｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）は非常に耐容性が良好であった。ラットを１２日間にわたって毎日処理した。創傷サイズの決定のためにデジタル写真を用いて創傷を評価した。個々の創傷領域の範囲を、元の創傷サイズに対する割合として表した。治癒の進捗は、デジタル写真の創傷面積を計算することによって分析した。治療の効果は、マンホイットニーＵ検定を用いて分析した。

１．１１ 創傷液におけるスタスミンの安定性
精製した組み換えスタスミンを０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、創傷液およびヒト血清にそれぞれ１００μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、３７℃で合計７２時間インキュベートした。試料（１５μｌ）を様々な時間間隔で取り出し、１２％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上で分離した。前述したように、膜転写およびブロッキングを行った。あらかじめスタスミンで免疫したウサギから採取した全血清をＴＢＳＴ中に１：１０００で希釈し、膜に塗布し、室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄工程（前述）の後、ＴＢＳＴ中に１：１０００に希釈したウサギＩｇＧ−Ｈ＆Ｌ−ＡＰ（Ａｂｃａｍ）に対するヤギポリクローナル二次抗体と共に膜を室温で１時間インキュベートした。更に別の３回の洗浄工程の後、供給元のガイドラインに従って希釈したブロッティングおよび免疫組織化学用のＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液（Ｒｏｃｈｅ）で膜を覆い、１０分間室温でインキュベートした。

１．１２ ヒドロゲルの調製
プロピレングリコールを含まないアルギン酸ゲル：
アルギン酸ゲル４％ １００．０ｇ
アルギン酸ナトリウム塩 ４．０ｇ
脱塩水 ８６．０ｇ

アルギン酸ゲル６％ １００．０ｇ
アルギン酸ナトリウム塩 ６．０ｇ
脱塩水 ８４．０ｇ

プロピレングリコールを含むアルギン酸ゲル：
アルギン酸ゲル４％ １００．０ｇ
アルギン酸ナトリウム塩 ４．０ｇ
プロピレングリコール ５．０ｇ
脱塩水 ８１．０ｇ
アルギン酸ゲル６％ １００．０ｇ
アルギン酸ナトリウム塩 ６．０ｇ
プロピレングリコール ５．０ｇ
脱塩水 ７９．０ｇ

プラスチック乳鉢および乳棒を、分析天秤で重量測定する必要がある。アルギン酸ナトリウム塩をプラスチック乳鉢に載せて秤量し、等量の脱イオン水を加える必要がある。慎重に、この水の一部と共に塩をすり潰す。アルギン酸ナトリウム塩がプラスチック乳鉢の表面に付着しないように注意を払う必要がある。塩を除去するのにスパチュラを使用してもよい。慎重に撹拌しながら、残りの水を混合物にゆっくりと少しずつ追加する必要がある。製剤中の気泡を避けるよう注意を払う必要がある。しばらく撹拌した後、アルギン酸ナトリウム塩を水に分散し、ゲル化を開始する。プラスチック乳鉢は少なくとも１２時間冷蔵庫に保管する必要がある。

現時点で不足の１０ｇを治療用タンパク質と共に後で追加する。

必要であればＮａＣｌ溶液でｐＨを調整できる。

作成したゲルを滅菌しなくてはならない。この工程では、試料を１２０℃で３０分間オートクレーブ内に置く。

治療用タンパク質としてのスタスミンの追加では、次の工程を層流下で行い確実に殺菌条件にする必要がある。治療用タンパク質を水に溶解する必要がある。薬物濃度は５００μｇ／ｍｌに決定した。１００ｇの製剤に対し、規定濃度のタンパク質溶液１０ｇを０．４５μｍの孔径を有する滅菌フィルタで濾過しなければならない。滅菌水溶液をゲルに注入した。その後、ゲルの滅菌を行った容器内でゲルとタンパク質溶液を混合して均質化を行った。各製剤はボルテックスで均質化する必要があった。次いで、製剤を２〜８℃の冷蔵庫に保存した。

１．１３ Ｉ型コラーゲンゲルへのスタスミンの含浸
最終組換えタンパク質濃度が１００μｇ／ｍｌのゲルを得るためにＩ型コラーゲンとスタスミンを混合し、１００μｌのゲル混合物を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後に、スタスミン入りまたは無しのゲルを含むウェルを２００μｌの無血清培養培地で覆った。３７℃で１、６、または１６時間のインキュベーション後、１００μｌを回収し、培養培地中に放出した組み換えスタスミンの量を分析した。放出したスタスミンの量をサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量した。値は、投入量に対する割合パーセントで表す。ＥＬＩＳＡでは、プレートを抗スタスミンマウスモノクローナル抗体で被覆し、５％ＢＳＡを有する緩衝液でブロックした。試料由来の可溶性スタスミンは、モノクローナル抗体によって捕捉され、さらに、ポリクローナル抗体によって認識される。最後に、ビオチン結合免疫グロブリンおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ−アビジンをウェルに加えた。リンス後、プレートをウルトラＴＭＢ基質と共にインキュベーションして、色の変化を４５０ｎｍで測定し、基準値と比較し、各ウェル内のスタスミン量を評価した。

機能的活性：コラーゲン（Ｉ型）ゲルを製造業者の説明書（Ｇｉｂｃｏ，Ｉ型コラーゲン（５ｍｇ／ｍＬ），Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１０６４４−０１）に従い調製した。簡潔に言うと、以下の試薬を調製し、氷上で冷却した：１０×ＰＢＳ、１Ｍ ＮａＯＨ、Ｈ₂Ｏ（細胞培養用）、スタスミンストック溶液（５．５ｍｇ／ｍＬ）、１×ＰＢＳ、および０．５％Ｉ型コラーゲンストック溶液。１．５ｍＬのゲルの場合は、１５０μＬの１０×ＰＢＳ、３０μＬのＮａＯＨ、９２．７３μＬのＨ₂Ｏ、２７．２７μＬのスタスミンまたは１×ＰＢＳ、および１．２ｍＬのＩ型コラーゲンストック溶液を氷上で十分に混合し、１００μｇ／ｍＬのスタスミンを含む／または含まない０．４％Ｉ型コラーゲンゲルを得た。９６ウェル毎に１００μＬの当該ゼリー状溶液を、表面を被覆するときに気泡ができないよう注意しながら移した。９６ウェルプレートを３７℃で１時間置いた後、ゲルを室温で形成させて、ゲル形成を完成する。

ゲル上清（ＳＮ）を用いた実験では、ウェルあたり２００μＬのＤＭＥＭを添加した。１５０μＬのゲルＳＮを、規定の期間（１、６、および１６時間）後に除去し、放出効率の評価（５０μｇ／ｍＬスタスミン溶液に対するスタスミンＥＬＩＳＡ）および／またはＥＣＶ３０４細胞（ＩＬ−８ＥＬＩＳＡ）の刺激のため、別個の９６ウェルプレートに保存した。

ゲルの上に載せた細胞を用いた実験では、コントロール／スタスミンを含有するゲルは、上記のように調製した。ＥＣＶ３０４細胞を０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中で洗浄し、０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ内に３０×１０³個／ｍＬの密度にした。そのうちの２００μＬ、つまり６×１０³個のＥＣＶ３０４細胞を含む溶液をゲルの上層に使用した。

ＥＣＶ３０４細胞：細胞を、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートに播種し３時間置いた。その後、プレートを、シンク上でひっくり返し、乾燥ブロットし、ＰＢＳで洗浄し、再び乾燥ブロットした。別々に調製した９６ウェルプレートから、ウェルあたり２００μＬの刺激カクテル（０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中）を調製し、ＥＣＶ３０４細胞と、例えば、０対５０μｇ／ｍＬのスタスミン溶液またはＩ型コラーゲンゲルＳＮ、を含む９６ウェルプレートに移した。

１．１４ ヒト内皮細胞および造血細胞におけるサイトカイン発現
ＥＣＶ３０４細胞は、スタスミン（５０μｇ／ｍｌ）有りまたは無しで６時間処理した。ＲＮＡを単離し、標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した（ｎ＝３）。データは、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対し正規化し、値は、未処理条件と比較した倍率の違いとして表した。

２．結果
２．１ 形質細胞様樹状細胞に類似するヒト細胞によって分泌されるスタスミン
ＡＢ４細胞は、組織球増殖症の患者のリンパ節から単離された永久増殖ヒト細胞である。これらの細胞は、形質細胞様樹状細胞型特有の種々機能及び表現型上の特徴（すなわち、膜抗原発現、抗原提示能、樹枝状形状、ＩＦＮ−１型の高発現）を示すので、形質細胞様樹状細胞に類似する。ＡＢ４細胞を４８時間無血清培地で培養し、細胞溶解物および培養上清の両方を、Ｓｔａｔ１が５ｎｇのレベルまで容易に検出できる敏感ウェスタンブロッティング手順によって分析した。ＡＢ４細胞の溶解物および上清の両方で１７，３ｋＤに明確なシグナルがＳｔａｔ１特異的ウサギ免疫血清によって検出できた。対照的に、初代ヒト皮膚細胞の細胞溶解物だけは、かすかなバンドしか検出されなかった。培養上清は、分泌Ｓｔａｔ１を本質的に欠いていた（図１を参照）。これまでのところ、このタンパク質Ｓｔａｔ１は、細胞骨格構造および／またはＴＬＲ３と関連し、細胞内でのみ発現するものとして文献に記載されているので、Ｓｔａｔ１が分泌されているというのは素晴らしい発見である。

２．２ ｈｕ Ｓｔａｔ１によるヒト上皮細胞の増殖
電気的な細胞−基質間インピーダンス計測を使用して、組織培養における創傷治癒および細胞増殖を行った。ヒト上皮細胞株Ａ４３１を、ＥＣＩＳ電極アレイで４８時間培養した。細胞がコンフルエントに達した時点でインピーダンスがプラトーに達した。データ取得を短時間保留し、１０秒もう１つはさらに３０秒、ウェルに上昇磁場パルスを与えてから、データ取得を再開した。パルスの直後に、種々な濃度のｈｕ Ｓｔａｔ１を個々の培養物に添加した。１０％ＦＣＳを陽性対照ウェルに添加し、一方陰性対照培養物には無血清培地のみを与えた。スタスミン１は、用量依存的に電極に覆われた領域における細胞の増殖を急速に誘導し、これは、陽性対照培養物と同等であった。無血清培地は効果を有していなかった（図４）。

Ｓｔａｔ１とＩ型コラーゲンの複合作用があったことは興味深い。コラーゲンのみだとＺｕｃｋｅｒラットにおける創傷治癒に対する効果がなかったが、Ｓｔａｔ１およびコラーゲンの組み合わせだと創傷領域が良好に回復した（図５）。

２．３ ｈｕ Ｓｔａｔ１による血管新生／萌出／管様構造の誘導
下肢／足の領域内の微小血管の損失および組織の同時栄養失調はＤＦＵの顕著な特徴の１つである。したがって、微小血管系を再構成することが最も重要である。図６に見られるように、ヒト内皮細胞へｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１を添加すると、強い反応が見られた。これは、多数の萌出、管腔、および管様構造の形成により明らかであった。Ｓｔａｔ１の非存在下では、そのような反応は観察されなかった。ＰＤＧＦで処理した培養物でも、いくつかの萌出／管腔があったがその程度はかなり劣っていた。

２．４ ｈｕ Ｓｔａｔ１によるＮＫ細胞媒介性細胞傷害の刺激
ほぼ全ての慢性創傷は、病原体が占めているので抗生物質による治療が必要である。創傷領域は細菌の増殖に理想的な環境であることから、樹状細胞またはナチュラルキラー細胞のいずれかによる第一線の防衛が望ましいだろう。Ｓｔａｔ１はＴＬＲ３のアゴニストであることが、文献で報告されている（ＷＯ０７／０８９１５１号）。しかし、本発明以前に、Ｓｔａｔが免疫防御機構における役割を果たすことを示す実質的な証拠はなかった。

したがって、標的細胞の死滅をリアルタイムで高濃度のヒトＮＫ細胞によって測定できるようなＥＣＩＳベースのＮＫアッセイを設計した。ｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１の添加は、実際に４日もたたないうちにＮＫ細胞の活性化および標的細胞の全体的な破壊をもたらした(図７）。

２．５ 初代ヒト皮膚線維芽細胞におけるＳｔａｔ１媒介性のサイトカイン／成長因子特異的なｍＲＮＡの誘導
慢性創傷の重要な特徴は、特定のサイトカイン／成長因子遺伝子発現が存在しないことまたは下方制御されていることである。これらのタンパク質は、表皮／真皮細胞の増殖および移動を支援するだけでなく、樹状細胞、間葉系幹細胞、および組織リモデリングの機能をも支援するので、このような特徴は大きな欠点である。結果を表２に要約する。そこに見られるように、Ｓｔａｔ１によって、サイトカイン／成長因子を上方制御するように初代ヒト皮膚線維芽細胞を活性化することができる。慢性創傷では、ＰＤＧＦを除きサイトカイン／成長因子は存在しない。さらに、分析した遺伝子の遺伝子発現は、皮膚に存在する免疫細胞および幹細胞の細胞機能に不可欠なものである。

２．６ Ｓｔａｔ１は、ＩＬ−８を上方制御しＴＩＭＰ−１および−２の発現を抑制する
Ｓｔａｔ１タンパク質によって刺激されたタンパク質の分析を拡大するために、アレイ研究を行った。図８ａおよび図８ｂに、創傷治癒に重要なタンパク質（ＩＬ−８、ＴＩＭＰ−１、−２）の結果を示す。ＰＭＮに重要な化学誘引物質であるＩＬ−８は８倍刺激されている。生体活性ＩＬ−８は、創傷中で発現し創傷治癒を増強する。

興味深いことに、Ｓｔａｔ１は、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を阻害するクラスの酵素であるメタロプロテアーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）を５０％抑制する。ＭＭＰは、創傷治癒における瘢痕の再吸収および再上皮化の活性などに重要である。ＴＩＭＰの下方制御は、創傷治癒におけるリモデリングに重要であり得る。

２．７ ｒ ｈｕ Ｓｔａｔ１の安定性
タンパク質は、創傷液中で急速に劣化する。治療用の生体物質としてＳｔａｔ１を使用する前提条件は、創傷および臨床試験で使用する予定のヒドロゲル中の製剤の両方において安定であることだろう。

タンパク質の安定性を検査するために、２つのラインの実験を行った。
１．組み換え試料を、創傷液の存在下３７℃でインキュベートし、その後、図１０に示す時間にわたってウェスタンブロット分析をした。図から分かるように、Ｓｔａｔ１は最大８時間までで検出可能であった。これは、慢性創傷には存在しない細胞機能を誘導するのに十分な時間である。

２．組み換え試料をヒドロゲル（Ｎｏｒｍｌｇｅｌ，Ｍｏｌｎｙｃｋｅ）と混合し、４℃、−２０℃、および−８０℃でインキュベートした。試料を図１０に示す時間で採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。試料が少なくとも５カ月間劣化する兆しなくそのままの状態で残っていたという結果だったので、更なる医療用途に最適であることが示される。

２．８ 局所塗布後のｈｕ Ｓｔａｔ１の分布−マイクロＰＥＴ画像
本研究の目的は、全層創傷への局所投与後における放射性標識ｈｕ ＳＴＡＴ１の局所および全身分布を評価することである。

研究により、¹²⁴Ｉ標識ｈｕ ＳＴＡＴ１の組織分布および薬物動態が、マイクロＰＥＴ技術を用いて測定可能であることが示された。５μｇおよび１００μｇのｈｕ ＳＴＡＴ１で処理した動物において、物質を投与して４時間後から放射活性分布の違いが見られた（図１１ａおよび１１ｂ）。放射活性レベルは、膀胱、胃、及び甲状腺において検出できた。これらの器官以外では、体内のどの部位においても放射性標識ｈｕ ＳＴＡＴ１の取り込みが認められなかった。¹²⁴Ｉ−ｈｕ ＳＴＡＴ１ストック溶液自体に遊離ヨウ素の４％が含まれていたので、胃、甲状腺、および血液中でのレベルが高いのは、遊離ヨウ素の取り込みに関連している可能性がある（これらの器官における放射能の取り込みは、文献に報告されたものよりも少ない）。全対象の膀胱に放射活性が取り込まれていたのは、放射性標識物の腎排泄を示している。

結論として、この研究は明らかにほとんどの¹²⁴Ｉ−ｈｕ ＳＴＡＴ１が創傷領域に残っていることを示している。他の領域はＰＥＴ画像では視認できず、これら他の領域では¹²⁴Ｉ−ｈｕスタスミンの実質的な取り込みが無かったことを示している。

２．９ ｈｕ ＳＴＡＴ１は、Ｚｕｃｋｅｒラットにおける創傷治癒の加速を用量依存的に誘導する。

本研究の目的は、慢性創傷研究用のモデルの代表である雄Ｚｕｃｋｅｒラット使用して創傷治癒モデルにおけるｈｕ ＳＴＡＴ１の効果をＲｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）（ＰＤＧＦ）と比較して検査することである。Ｚｕｃｋｅｒラットにメタボリックシンドロームを発症させ、正常な動物と比較して創傷治癒が遅延していることに留意する。このインビボ系で最も関連する創傷治癒は８日目から始まる。

試験８日目から、ｈｕ ＳＴＡＴ１処理動物（第３、４、５群）は、創傷領域がＰＤＧＦ処理動物に比べ生物学的に有意に小さいことが示された（図１２）。創傷治癒は用量依存的である。また、ｈｕ ＳＴＡＴ１は、創傷治癒を加速する。ｈｕ ＳＴＡＴ１の用量が高い群（２５μｇ／創傷）において最も速い創傷治癒が記録された。これは、９日および１０日目におけるＰＤＧＦ群を統計学的に有意に超えるものである。総合的に考えると、ｈｕ ＳＴＡＴ１は、慢性創傷の動物の治癒を加速し、現在の標準的な治療より優れたものである。

コラーゲンとスタスミンを組み合わせると、迅速な上皮形成および創傷閉鎖により創傷治癒がさらに増強された（図５）。

２．１０ コラーゲンゲル
コラーゲンは、多くの種でよく見られる天然のタンパク質である。特に、Ｉ型コラーゲンが結合組織のコラーゲンで最も多く見られる型である。ここで、組み換えスタスミン有りまたは無しのＩ型コラーゲンを０．４％の最終濃度で使用した。図１３ｃに見られるように、ＥＬＩＳＡの測定では、注入タンパク質の８０％がゲルから放出された。コラーゲンから放出されたスタスミンが生物学的に活性であるかどうかをテストするために、ヒト内皮細胞を、コラーゲンスタスミン結合体またはこれらのゲル／タンパク質の組み合わせから放出した上清のいずれかにおいて増殖させた。細胞培養の１６時間（一晩）後、１００μＬの上清試料をＩＬ−８の分泌について検査し、それぞれの背景よりも高い割合％のＩＬ−８分泌（１００％＝２倍）としてプロットした。図１３ｂに示す結果から、ヒト内皮細胞の活性化およびＩＬ−８の分泌による反応があったことは明らかである。

この分析により、１６時間後にスタスミンが非常に放出されそしてヒト標的細胞への刺激があったことが示された。これは、慢性創傷、例えば糖尿病性足部潰瘍の患者にスタスミンを含有する液体を塗布することが有効であることの裏付けとなる。

２．１１ ヒト内皮細胞および造血細胞におけるサイトカインの発現
インターロイキン（ＩＬ−６、ＩＬ−８）、ケモカイン（ＭＩＰ−２ａ）、またはインターフェロン（ＩＦＮα）といった免疫応答タンパク質をコードする遺伝子はスタスミンにより誘導されるが、一方、成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）は誘導されない（図１４ａ）。

ＩＬ−６は、例えばリンパ球およびマクロファージにより分泌され、例えば、感染や炎症の間、免疫応答反応を刺激する。ＩＬ−８は、生化学反応の連鎖を介して分泌され、リモデリングおよび創傷閉鎖を支援する細胞移動の重要な仲介物質である。ＭＩＰは、活性化マクロファージによって産生される化学誘引タンパク質である。それらは、感染症や炎症に対する免疫応答に重要である。ＩＦＮは、病原体または腫瘍細胞に反応し細胞から合成および分泌されるタンパク質である。また、ＩＦＮαはＮＫ細胞の強力な活性化因子である。感染は糖尿病性足部潰瘍を有する患者の主要な合併症であり、多くの場合、下肢切断につながる。これらの結果は、スタスミンが自家ＮＫ細胞の刺激により患者の感染レベルを減少させる可能性があることを示している。

これらのサイトカインは全て創傷治癒を支援するが、一方、成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）量の増加は、細胞成長、増殖、および分化の望ましくない刺激につながることもあり、腫瘍形成の可能性もある。

末梢血単核細胞は、非凝固血液から単離し、さらに高濃度の単球（＞９０％）中でＭＡＣＳ（登録商標）技術によって分離した。

免疫応答の活性化は、創傷治癒の前提条件である。単球は、炎症に応答し感染部位に急速に移動する能力があり、治癒過程に関与し、ヒトにおける先天性免疫系の重要な成分である。図１４ｂは、バッファーのみ（陰性対照）、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（陽性対照）、または２５μｇ／ｍｌ組み換えスタスミンによる処理に反応して末梢血単核細胞、単球枯渇白血球、または単離単球により分泌された２つのケモカインＩＬ−８（左パネル）またはＭＣＰ−１（右パネル）の量を示す（ｎ＝５）。

組換えスタスミンは、単球特異的に作用する。これは、化学誘導性物質の生産を引き起こすことにより免疫細胞および真皮間葉系細胞の浸潤を刺激していることを示唆する。

２．１２ 組換えスタスミンは、血管新生特性を有する。
細胞を適切なマトリックスに播種した後、ＰＢＳ（陰性対照）、Ｄｋｋ−２（陽性対照）、または組み換えスタスミンで処理した（ｎ＝３）（図１５）。３７℃で７時間インキュベーションした後、細胞の画像を撮影して定量化に用いた。活性化ＨＵＶＥＣは、血管に類似する管様構造を形成する。これは、顕微鏡画像の分析により定量できる。

組換えスタスミンは、血管新生効果を示す。この効果は、創傷治癒の過程における組換えスタスミンの役割を強化する。なぜなら、慢性創傷では微小血管の新生ができないからである。実験で使用したマトリックスはＧｅｌｔｒｅｘである。

形成した管の数を、各画像および各条件毎に手動でカウントした。５つの異なる画像を、各実験毎に撮影した。

３．まとめ
スタスミンはＺｕｃｋｅｒラットにおける創傷治癒遅延の速度を上げ、そして全身活性ではない。また、慢性創傷の治癒に重要ないくつかの利点、皮膚細胞増殖の促進、血管新生の誘導、およびナチュラルキラー細胞活性の活性化、を組み合わせるものである。

また、組換えＳｔａｔ１（スタスミン）は、免疫調節および癌治療に重要な特定のサイトカイン遺伝子及びタンパク質の活性化に有用である。

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Claims (15)

1. 患者における慢性創傷または疾患依存性もしくは薬剤依存性の創傷治癒障害の治療において使用するため、および／あるいは創傷瘢痕を縮小するのに使用するための、スタスミン、前記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞。
2. 患者における創傷、好ましくは慢性創傷または疾患依存性もしくは薬剤依存性の創傷治癒障害の治療に使用するための、生体適合性マトリックス、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、キトサン、および／またはヒアルロン酸を含む生体適合性マトリックスと共に調合あるいは当該マトリックスに結合されているスタスミン。
3. 前記スタスミンはヒトスタスミンである、請求項１または２に記載の使用のためのスタスミン、核酸、または細胞。
4. 前記スタスミンは組み換えスタスミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミンまたは細胞。
5. スタスミンは、配列番号１の１位〜１２６位のアミノ酸、または配列番号１の１位〜１２６位のアミノ酸の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミン、核酸、または細胞。
6. 前記スタスミンがヒドロゲル内に調合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミン。
7. 前記患者は、免疫を調節あるいは瘢痕を縮小するために、血管新生の誘導の必要がある、先天性免疫応答の刺激の必要がある、ならびに／あるいはサイトカイン／成長因子およびＴＩＭＰの誘導の必要がある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミン、核酸、または細胞。
8. 前記疾患依存性の創傷治癒障害が、糖尿病またはメタボリックシンドローム、慢性静脈不全（ＣＶＩ）、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、癌、自己免疫、特に関節リウマチ、狼瘡およびリベド血管症から選択される自己免疫、造瘻、長期の炎症プロセス、褥瘡から選択される疾患によるものであり、好ましくは前記患者が糖尿病またはメタボリックシンドロームに罹患している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミン、核酸、または細胞。
9. 前記薬剤依存性の創傷治癒障害は、コルチコステロイド、ニコチン、抗生物質、免疫抑制剤、抗凝固剤、細胞毒性剤、抗リウマチ薬、血管収縮薬から選択される薬剤を用いた治療によるものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミン、核酸、または細胞。
10. 前記創傷が、慢性または非治癒性の糖尿病性足部創傷、潰瘍、特に静脈性潰瘍、褥瘡、または圧迫潰瘍、熱傷、好ましくは第三度熱傷、手術創、事故による創傷、壊死性創傷、感染傷から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのスタスミン、核酸、または細胞。
11. スタスミン、場合により更に請求項３〜６のいずれか１項で定義したスタスミンであり、生体適合性マトリックス、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、キトサンおよび／またはヒアルロン酸を含む生体適合性マトリックス、特にヒドロゲルマトリックス、好ましくはアルギン酸、と共に調合または当該マトリックスに結合されているスタスミンを含む医薬組成物。
12. 薬剤として使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 創傷または瘢痕の治療に使用するため、好ましくは更に請求項１、７〜１０のいずれか１項で定義した使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 免疫細胞、好ましくはナチュラルキラー細胞を刺激するため、線維芽細胞を刺激するため、上皮細胞、好ましくは表皮の上皮細胞を刺激するため、または血管新生を刺激するため、特に上記および／または下記の細胞、特に間葉系細胞および／または線維芽細胞におけるＩＬ−８の産生を刺激するため、単球および／またはマクロファージを刺激するために、間葉系細胞、表皮細胞、および／または幹細胞、特に間質幹細胞、の増殖および／または移動を増加または誘導するインビトロの方法であって、
    前記細胞に、スタスミン、前記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞を投与する工程を含む方法。
15. 患者における、免疫細胞、好ましくはナチュラルキラー細胞を刺激するため、線維芽細胞を刺激するため、上皮細胞、好ましくは表皮の上皮細胞を刺激するため、または血管新生を刺激するため、特に上記および／または下記の細胞、特に間葉系細胞および／または線維芽細胞におけるＩＬ−８の産生を刺激するため、単球および／またはマクロファージを刺激するために、間葉系細胞および／または幹細胞、特に間質幹細胞、の増殖および／または移動を増加または誘導する方法であって、
    患者に、スタスミン、前記スタスミンをコードする核酸、またはスタスミンを発現する細胞を、好ましくは創傷に対する局所投与により投与する工程を含む方法。