JP2002522747A - 微小管脱重合インヒビターを検出するためのアッセイ - Google Patents

微小管脱重合インヒビターを検出するためのアッセイ

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ハートマン、ジェームズ、ジェイ．
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞周期の進行に大きな影響を及ぼす薬剤をスクリーニングおよび同定する方法を提供する。一実施形態において、前記方法は、(i) 重合微小管と微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質とを、ATPまたはGTPおよび試験薬剤の存在下で接触させ、(ii)チューブリンの単量体、二量体またはオリゴマーの形成を検出することを含む。カタニンのp60サブユニットは、ATPアーゼ活性と微小管切断活性の両活性を備えた特に好ましい微小管切断タンパク質を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願の相互参照 本出願は、1998年4月14日に提出された米国仮特許USSN 60/081,734の米国特許
法（35U.S.C.）第119条(e)に基づく利益を主張するものであり、あらゆる目的の
為に、その全文を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】連邦によって発起された研究および開発の下で為された発明に対する権利に関す
る明細書 （適用不可能）発明の分野 本発明は、微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質をモジュレー
ト（例えば、アップレギュレート、ダウンレギュレートまたは完全に抑制）する
薬剤についてのアッセイに関する。そのような薬剤は、細胞周期の進行に対し深
在性の効果を及ぼし、有効な抗分裂剤として作用する。
【０００３】発明の背景 細胞骨格は、染色体および細胞の分裂、細胞運動性ならびに細胞内輸送などの
、生物学の多くの重要な過程に関与するタンパク質の大きなファミリーを構成す
る。ValeおよびKreis,1993, Guidebook to the Cytoskeletal and Motor Protei
ns（細胞骨格およびモータータンパク質のガイドブック）New York: Oxford Uni
versity Press；Albertsら(1994) Molecular Biology of the Cell, 788-858）
。細胞骨格タンパク質は、全ての細胞に見られ、かつ広範囲の臨床学的疾患の病
因に関与する。細胞骨格には、ポリマータンパク質、微小管、アクチン、中間径
フィラメントおよびセプチン（septin）の集合、ならびにこれらのポリマーに結
合する多様なタンパク質（ポリマー相互作用性タンパク質）が含まれる。いくつ
かのポリマー相互作用性タンパク質は、細胞中への物質輸送（例えば、分裂中期
の間の染色体移動）、筋収縮および細胞移動に必須の分子モーター（ミオシン、
キネシン、ダイニン）である（Goldstein(1993) Ann. Rev. Genetics 27: 319-3
51；MoosekerおよびCheney (1995) Annu. Rev. Cell Biol.11: 633-675）。他の
タンパク質群（例えば、ビンキュリン、テーリンおよびα−アクチン）は、異な
るフィラメントに結合し、細胞骨格を細胞膜に連結し、細胞骨格ポリマーの構築
および解体を制御し、かつ細胞内のポリマーの組織化を加減する。
【０００４】 細胞分裂、細胞移動、炎症、および真菌／寄生虫の生活環における細胞骨格の
中心的な役割を示すことにより、多く薬剤を発見するシステムとなる。
【０００５】 細胞骨格構成成分の分子的特徴および構造的特徴についてはよく知られている
が、細胞骨格の構造および機能を効率的に操作する方法については比較的ほとん
ど知られていない。そのような操作には、細胞骨格の構造および機能を、予想通
りにかつ安全に改変しうる特異的な化合物の発見および開発が必要である。しか
し現在のところ、細胞骨格の薬剤標的は比較的未開発である。大規模な研究が、
細胞骨格ポリマー自体と相互作用する薬剤（例えば、タキソールおよびビンクリ
スチン）ならびに運動性アッセイに向けられてきた。Turnerら(1996)Anal. Bioc
hem. 242 (1): 20-5；Gittesら(1996) Biophys. J. 70 (1): 418-29；Shirakawa
ら(1995) J. Exp. Biol. 198: 1809-15；Winkelmannら(1995) Biophys. J. 68:
2444-53；Winkelmannら(1995) Biophys. J. 68: 72S。実際には、異なるフィラ
メントに結合する細胞骨格タンパク質を標的とする薬剤の発見には全く労力は割
かなかったが、該タンパク質は望ましくない副作用がより少ない、より特異的な
標的となりうる。
【０００６】発明の概要 本発明は、微小管を脱重合または切断するタンパク質（例えば、モータータン
パク質）の発見により、そのような活性のモジュレーターに対する有効な標的を
提供することに関する。特定の理論にとらわれずに、微小管の脱重合活性または
切断活性は、有糸分裂紡錘体の正常な形成および／または機能に重要であると考
えられる。従って、脱重合活性または切断活性をモジュレート（例えば、アップ
レギュレート、ダウンレギュレートまたは完全に抑制）する薬剤は、細胞周期の
進行に有意な活性を有すると予想される（例えば、有効な抗分裂剤として作用す
る）。
【０００７】 *従って本発明は、一つの実施形態において、微小管の脱重合をモジュレート
する薬剤を同定するためのアッセイに関する。該アッセイは、重合化微小管と微
小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質とを、ATPまたはGTPおよび「
試験」薬剤の存在下で接触させること、ならびにチューブリン単量体、二量体ま
たはオリゴマーの形成を検出することを含む。微小管を、種々の標識のいずれで
も標識することができるが、好ましい実施形態においては、DAPIで標識する。チ
ューブリン単量体、二量体またはオリゴマーの形成は、限定するものではないが
、DAPI蛍光の変化、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、遠心分離などを含む多様
な方法の任意のものにより検出することができる。微小管は、天然で安定な微小
管（例えば、軸糸微小管）、または、例えばパクリタキセル、パクリタキセル類
似体もしくは非加水分解性ヌクレオチドGTP類似体などの作用剤との接触により
安定化される微小管（例えば、グアニリル−(α,β)−メチレンジホスフェート(
GMPCPP)）のいずれかであるのが好ましい。
【０００８】 前記アッセイは、溶液中または固相（すなわち1以上のアッセイ成分が固体表
面に結合している）で行うことができる。固相アッセイの一つの実施形態におい
て、微小管を、直接結合することにより、あるいは不活性化微小管モータータン
パク質、アビジン−ビオチン結合、抗チューブリン抗体、微小管結合タンパク質
（MAP）またはポリリシンなどの作用剤を用いて結合させることにより、該表面
に結合させる。微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質は、カタニ
ン、カタニンのp60サブユニット、XKCM1またはOP18ポリペプチドであるのが好ま
しい。特に好ましい実施形態では、該微小管切断タンパク質は、本明細書で記載
されるカタニンまたはカタニンのp60サブユニットである。
【０００９】 カタニンp60サブユニットが、カタニンにおいて観察されるATPアーゼ活性およ
び微小管切断活性の両方を示すということもまた本発明の発見である。従って、
p60サブユニットは、潜在的な治療用リード化合物についてスクリーニングする
ための有効な標的を提供する。従って他の実施形態において、本発明は、微小管
系の脱重合または切断をモジュレートする治療用リード化合物のスクリーニング
方法（同定方法）を提供する。前記方法には、カタニンp60サブユニットおよび
微小管を含有するアッセイ混合物を準備すること、該アッセイ混合物を、該p60
サブユニットの微小管切断活性またはATPアーゼ活性を抑制または増強する能力
についてスクリーニングすべき試験化合物と接触させること、ならびに該試験化
合物の該p60サブユニットへの特異的結合または該p60サブユニットのATPアーゼ
活性の変化を検出することが含まれる。該検出は、限定するものではないが、検
出試薬としてマラカイトグリーンを用いてATPアーゼ活性を検出することを含む
、多様な方法の任意のものによるものでありうる。結合活性は、該p60サブユニ
ットを標識し、該試験薬剤を固体支持体に結合させるか、あるいは逆に、該試験
薬剤を標識し、p60サブユニットを固体支持体に結合させる、結合アッセイで容
易に検出することができる。好ましい実施形態において、安定化された微小管の
存在下でATPアーゼアッセイを実施する。
【００１０】 本発明のアッセイ法はまた、ハイスループットスクリーニングに改善しうる。
従って一つの実施形態において、本明細書に記載される任意の方法を、多数の反
応混合物が含むアレイで実施し、各反応混合物は該アレイの別個の識別可能なド
メインを含み、ならびに該アッセイステップを各反応混合物において実施する。
該アレイは多数の形式をとることができるが、好ましい一形式では、該アレイが
マイクロタイタープレートを含み、好ましくは少なくとも48、そしてより好まし
くは少なくとも96の反応混合物を含有するマイクロタイタープレートを含む。該
試験薬剤は複数の薬剤のうちの1つであることができ、また各反応混合物は該複
数の薬剤のうち1つの薬剤を含むことができる。
【００１１】 更に本発明は、微小管切断活性を有するポリペプチドを提供する。該ポリペプ
チドはカタニンの単離されたp60サブユニットを含み、該p60サブユニットは、カ
タニンp60のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする核酸とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされている。特定の好ましい実
施形態において、該ポリペプチドは配列番号１のポリペプチドまたは保存的置換
を有する配列番号１のポリペプチドである。該ポリペプチドは、配列番号１に示
される核酸によりコードされるポリペプチド配列由来の、少なくとも8個の連続
したアミノ酸を含むことができ、そこで該ポリペプチドは、抗原として提示され
る場合に、配列番号１に示される核酸によりコードされるポリペプチド配列と特
異的に結合する抗体の産生をもたらし、かつ、該ポリペプチドは、配列番号１に
示される核酸配列によりコードされるポリペプチドに対して誘導された抗血清で
あるが、配列番号１に示される核酸配列によりコードされるポリペプチドを用い
て完全に免疫吸着されている該抗血清とは結合しない。最も好ましい実施形態に
おいて、該ポリペプチドは配列番号１のポリペプチドである。
【００１２】 本発明はまた、微小管切断活性を有するカタニンp60サブユニットをコードす
る単離された核酸を提供する。好ましくは、該核酸には、配列番号１のポリペプ
チドをコードする核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズす
る核酸が含まれる。好ましくは、該核酸が配列番号１のポリペプチドまたはその
保存的置換体をコードする。該カタニンp60をコードする核酸は、プロモーター
（例えば、バキュロウイルスプロモーター）に機能しうる形で連結されることが
できるし、またベクター中に存在してもよい。
【００１３】 別の実施形態において、本発明は、微小管の重合または脱重合もしくは切断を
改変する薬剤のスクリーニング方法を提供する。該方法には、標識チューブリン
を準備すること、該標識チューブリンを試験薬剤と接触させて接触済みチューブ
リンを得ること、ならびに接触済みチューブリンの蛍光強度またはパターンを、
該試験薬剤と接触させていない標識チューブリンの蛍光強度またはパターンと比
較することを含み、その際接触済みチューブリンと非接触チューブリンとの蛍光
パターンまたは強度の差異が該薬剤が微小管の重合または脱重合もしくは切断を
改変することを示すものである。特に好ましい実施形態において、該標識チュー
ブリンは、チューブリン単量体、チューブリン二量体、チューブリンオリゴマー
または微小管の形態である。特定の実施形態において、微小管を（例えば、不活
性化微小管モータータンパク質、アビジン−ビオチン結合、抗チューブリン抗体
、微小管結合タンパク質（MAP）、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびポリ
リシンからなる群より選択される作用剤との結合により）固体表面に結合させる
。好ましい標識には、DAPI、ANS、Bis-ANS、ルテニウムレッド、クレゾールバイ
オレットおよびDCVJが含まれ、DAPIを用いるのが最も好ましい。特定の実施形態
において、「接触させる」ステップは、該チューブリンを微小管脱重合タンパク
質または微小管切断タンパク質と接触させることを更に含みうる。好ましい微小
管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質には、限定されるものではない
が、カタニン、カタニンのp60サブユニット、XKCM1およびOP18ポリペプチドが含
まれる。好ましいカタニンのp60サブユニットは、配列番号１のポリペプチドで
ある。前記方法には、微小管の重合、脱重合または切断を改変する薬剤を、細胞
骨格系に作用する治療用リード化合物のデータベースに入れることが更に含まれ
る。この方法は、本明細書に記載される種々のアレイの実施形態で実施すること
ができる。
【００１４】 本発明はまた、本明細書に記載される任意の方法を実施するためのキットを提
供する。一つの実施形態において、該キットは、単離された微小管切断タンパク
質または微小管脱重合タンパク質を含有する1以上の容器を含む。該キットは、D
APIで標識した重合微小管を更に含むことができる。該微小管は、パクリタキセ
ルまたはパクリタキセル誘導体との接触により安定化されうる。該微小管はまた
、任意に固体表面に（例えば、不活性化モータータンパク質との結合により）結
合させてもよい。該微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質は、カ
タニン、カタニンのp60サブユニット、XKCM1およびOP18ポリペプチドからなる群
より選択されるのが好ましい。特定の好ましい実施形態において、該微小管切断
タンパク質は、カタニンまたはカタニンのp60サブユニットである。
【００１５】定義 「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態であるデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを意味する。特に限定する他は
、該用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチ
ドと類似した様式で代謝される天然ヌクレトチドの既知類似体を含む核酸を包含
する。その他の点では、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその変異体
（例えば、縮重コドン置換体）および保存的配列、ならびに明示された配列を暗
に包含する。
【００１６】 特に縮重コドン置換体は、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によ
り、1つ以上の選択された（または全ての）コドンの3番目の位置が置換された配
列を作製することにより達成しうる（Batzerら(1991) Nucleic Acid Res. 19: 5
081；Ohtsukaら(1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608；およびCassolら(1992)
；Rossoliniら(1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98）。核酸という用語は、遺伝
子、cDNA、および遺伝子によりコードされるmRNAと互換的に用いられる。
【００１７】 「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、隣接す
る残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに連結さ
れている直鎖状につながっているアミノ酸残基を示すために、本明細書において
互換的に用いられる。該アミノ酸残基は、天然の「L」異性体であるのが好まし
い。しかし、所望の機能特性がポリペプチドにより保持されているならば、「D
」異性体である残基を任意のL−アミノ酸残基と置換することもできる。更に該
アミノ酸には、20種の「標準」アミノ酸に加えて、改変型アミノ酸および異常な
アミノ酸が含まれ、それらには、限定するものではないが37 CFR з1.822 (b) (
4)に挙げられているものが含まれる。更に、アミノ酸残基配列の始まりまたは終
わりのダッシュは、1つ以上のアミノ酸残基からなる別の配列へのペプチド結合
、あるいはカルボキシル末端基またはヒドロキシル末端基への共有結合を示すこ
とに注意すべきである。
【００１８】 「保存的置換」という用語は、分子の活性（特異性または結合親和性）を実質
的には改変しないアミノ酸置換を反映するタンパク質またはペプチドを指すのに
用いられる。典型的には、保存的アミノ酸置換には、1つのアミノ酸を類似の化
学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸で置換することが
含まれる。以下の6つの群はそれぞれ、互いに典型的な保存的置換であるアミノ
酸を含む： 1) アラニン (A)、セリン (S)、トレオニン (T)； 2) アスパラギン酸 (D)、グルタミン酸 (E)； 3) アスパラギン (N)、グルタミン (Q)； 4) アルギニン (R)、リシン (K)； 5) イソロイシン (I)、ロイシン (L)、メチオニン (M)、バリン (V)；および 6) フェニルアラニン (F)、チロシン (Y)、トリプトファン (W)。
【００１９】 「単離された」または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で見ら
れるものには通常は付随する成分を、実質的にまたは本質的に持たない物質を意
味する。しかし「単離された」という用語は、電気泳動ゲルまたは他の分離培地
に存在する成分を意味しない。単離された成分は、そのような分離培地にはなく
、また他の適用で容易に使用するための、または新しい適用／環境で既に使用さ
れている形態である。
【００２０】 2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における、「同一の」また
は「同一性」％あるいは「相同性」％という用語は、下記配列比較アルゴリズム
のうちの１つを用いるか、あるいは目視検査により測定した際に、比較し、最大
一致についてアライメントをとった場合に、同じであるかまたは同じアミノ酸残
基もしくはヌクレオチドを特定のパーセンテージで有する、2つ以上の配列また
は部分配列を意味する。
【００２１】 2つの核酸またはポリペプチドの文脈における、「実質的に同一」という句は
、下記配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いるか、あるいは目視検査により
測定した際に、比較し、最大一致についてアライメントをとった場合に、少なく
とも30ヌクレオチドのウィンドウ(window)にわたって、好ましくは少なくとも40
ヌクレオチドのウィンドウにわたって、より好ましくは少なくとも80ヌクレオチ
ドのウィンドウにわたって、および最も好ましくは少なくとも100ヌクレオチド
、150ヌクレオチド、200ヌクレオチドまたはそれ以上のウィンドウにわたって、
少なくとも60%、好ましくは80%、最も好ましくは90〜95%、または更に少なくと
も98%のアミノ酸残基同一性を有する2つ以上の配列または部分配列を意味する。
【００２２】 配列比較について、典型的には、1つの配列を基準配列として、それと試験配
列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および基準配列
をコンピュータにインプットし、部分配列座標を指定し、必要であれば配列アル
ゴリズムプログラムパラメータを指定する。続いて、該配列比較アルゴリズムは
、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列と比較した試験配列の
配列同一性％を計算する。
【００２３】 配列比較のための最適アライメントを、例えば、SmithおよびWaterman, Adv.
Appl. Math. 2: 482 (1981)のローカル・ホモロジー・アルゴリズムにより、Nee
dlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性アライメントアル
ゴリズムにより、PearsonおよびLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444
(1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実
施（GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package,
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)により、あるいは
目視検査（一般的にAusubelら、前掲を参照）により、実施することができる。
【００２４】 有用なアルゴリズムの一例としては、PILEUPがある。PILEUPは、段階的なペア
ワイズアライメントを使用して関連する配列群からマルチプル配列アライメント
を作製し、関連性および％配列同一性を示す。それはまた、アライメントを作製
するのに用いられるクラスター化した関連性を示すツリーまたはデンドログラム
(dendogram)をプロットする。PILEUPは、FengおよびDoolittle (1987) J. Mol.
Evol. 35: 351-360の段階的な(progressive)アライメント方法を簡略化したもの
を利用する。利用される方法は、HigginsおよびSharp (1989) CABIOS 5: 151-15
3により記載される方法と類似している。該プログラムは、それぞれヌクレオチ
ド長またはアミノ酸長が最高5,000である配列について、最高300個までアライメ
ントをとることができる。マルチプルアライメント法は、2つの最も類似する配
列のペアワイズアライメントで始め、アライメントをとった2つの配列のクラス
ターを作製する。続いてこのクラスターと、次に最も関連する配列またはアライ
メントをとった配列のクラスターとのアライメントをとる。2つの配列クラスタ
ーを、2つの個々の配列のペアワイズアライメントを単純に拡張することにより
アライメントをとる。最後のアライメントは、一連の段階的なペアワイズアライ
メントにより達成する。該プログラムを、特定の配列および配列比較領域につい
てのそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、およびプ
ログラムパラメータを指定することにより実行する。例えば、次のパラメータ（
デフォルトギャップウエイト（3.00）、デフォルトギャップ長ウエイト（0.10）
、および加重(weighed)末端ギャップ）を用いて、基準配列を他の試験配列と比
較して、配列同一性％の関連性を決定することができる。
【００２５】 配列同一性％および配列類似性％を決定するのに好適な他のアルゴリズムの例
としては、Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されているBLA
STアルゴリズムがある。BLAST解析を実行するためのソフトウエアは、国立バイ
オテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Informatio
n(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)）より公に入手可能である。このアルゴ
リズムでは、検索配列における長さWの短い文字列を同定することによりハイス
コアの配列対（HSP）を最初に同定し、それはデータベース配列における同じ長
さの文字列でアライメントをとった場合に、ある程度の正値の閾値(threshold)
スコアTと一致するかまたは該スコアＴを満たすものである。Tは文字列のスコア
閾値(neighborhood word score threshold)を意味する（Altschulら、前掲）。
これらの最初の文字列ヒットは、それらを含むより長いHSPを見つけるために検
索を開始するための出発点として働く。続いて、該文字列ヒットを、累積的アラ
イメントスコアが増加するまで、各配列に沿って両方向に伸長する。各方向にお
ける文字列ヒットの伸長は、数量Xにより最高到達値から累積的アライメントス
コアが減少した場合、1以上の負のスコア残基アライメントの蓄積により累積的
スコアがゼロまたはそれ以下になった場合、あるいは、いずれかの配列の末端に
達した場合に、停止する。該BLASTアルゴリズムパラメータのW、TおよびXは、ア
ライメントの感度および速さを決定する。該BLASTプログラムは、デフォルトと
して、文字列の長さ(W) 11、BLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoffおよ
びHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915を参照）アライメン
ト(B) 50、期待値(E) 10、M=5、N=−4および両方の鎖の比較を使用する。
【００２６】 配列同一性％の計算に加え、前記BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類
似性を統計的に解析する（例えば、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照のこと）。BLASTアルゴリズムにより示さ
れる類似性の一つの測定値は、最小総和確率(P(N))であり、それは2つのヌクレ
オチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こりうる確率を示す。例
えば、試験核酸と基準核酸とを比較した際の最小総和確率が、約0.1未満、より
好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合に核酸が
基準配列に類似していると考える。 2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることは、以下に記載
するように、第1の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸により
コードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることにより更に示され
る。従って、典型的にポリペプチドは、例えば2つのペプチドが保存的置換によ
ってのみ異なる場合に、第2のポリペプチドと実質的に同一である。他には、2つ
の核酸配列が実質的に同一であることは、以下に記載するように、ストリンジェ
ントな条件下で2つの分子が互いにハイブリダイズすることにより示される。
【００２７】 「特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション」あ
るいは「選択的にハイブリダイズする」という句は、特定のヌクレオチド配列が
複合混合物（例えば全細胞の）DNAまたはRNAにある場合に、ストリンジェントな
条件下で、核酸分子が選択的に該ヌクレオチド配列に結合、二本鎖化またはハイ
ブリダイズすることを意味する。
【００２８】 「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブが優先的にその標的部分
配列にハイブリダイズする、および他の配列にはより少ない程度にハイブリダイ
ズするかまたは全くハイブリダイズしない条件を意味する。サザンハイブリダイ
ゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの、核酸ハイブリダイゼ
ーション試験の文脈における、ストリンジェントなハイブリダイゼーション、お
よびストリンジェントなハイブリダイゼーションの洗浄条件は、配列に依存的で
あり、また異なる環境パラメータで異なる。核酸のハイブリダイゼーションにつ
いての更なる手引きは、Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistr
y and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes 第I部第2
章で示される。ハイブリダイゼーションおよび核酸プローブアッセイ手法の原理
については、Elsevier, New Yorkに概説されている。一般的に、高ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびpHで
特定の配列の熱融点（Tm）より約5℃低くなるように選択される。Tmは、（規定
のイオン強度およびpHで）標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブにハイ
ブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブ
に対するTmに等しくなるよう選択される。
【００２９】 サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に100個以上の
相補性残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのための、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件の例では、42℃で1mgのヘパリンと共に50%
ホルムアミドで、ハイブリダイゼーションを一晩実施する。高ストリンジェント
な洗浄条件の例は、72℃で約15分間の0.15 M NaCIである。ストリンジェントな
洗浄条件の例では、65℃で15分間0.2×SSCで洗浄する（Sambrookら(1989) Molec
ular Cloning-A Laboratory Manual (第2版)第1〜3巻, Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor Press, NY, SSCバッファーの記載については(Sam
brookら)前掲を参照のこと）。しばしば高ストリンジェンシー洗浄は、低ストリ
ンジェンシー洗浄が先行して、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する
。例えば100以上のヌクレオチドの二本鎖のための中程度のストリンジェンシー
洗浄の例は、45℃で15分間のl×SSCである。例えば100以上のヌクレオチドの二
本鎖のための低ストリンジェンシー洗浄の例は、40℃で15分間の4〜6×SSCであ
る。一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連しないプ
ローブで観察されるものの2倍の（またはそれより高い）ノイズに対するシグナ
ル比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条
件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、該核酸によりコードされるポリペ
プチドが実質的に同一である場合なら、実質的に同一である。こうしたことは、
例えば遺伝暗号により容認される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーを作製す
る場合に起こる。
【００３０】 「カタニン」または「カタニンp60サブユニット」という用語は、本明細書、
引用される参考文献および配列表で記載される、カタニンおよびカタニンp60サ
ブユニットを意味する。該用語には、本明細書で示されるカタニンまたはカタニ
ンp60サブユニット配列と、実質的にアミノ酸配列同一性を有し、ATPアーゼ活性
および微小管切断活性を示すタンパク質も含まれる。
【００３１】 「タキソール」および「タキソール誘導体または類似体」という用語は、一般
的にパクリタキセル（NSC番号：125973）として知られている薬剤のタキソール
を意味する。パクリタキセル（タキソール）誘導体および類似体は、類似する微
小管安定化活性を示す。好ましい誘導体には、タキソテア（taxotere）等が含ま
れる。
【００３２】 脱重合した微小管構成成分は、微小管の脱重合または切断の生成物を含むと定
義される。チューブリン単量体、二量体またはオリゴマーが含まれる。
【００３３】 「試験薬剤」という用語は、本明細書に記載の1以上のアッセイでスクリーニ
ングしようとする薬剤を意味する。該薬剤は、実際には任意の化学化合物であり
うる。それは、単一の単離された化合物として存在することができるし、または
化学的（例えばコンビナトリアル）ライブラリーのメンバーでありうる。特に好
ましい実施形態において、該試験薬剤は有機小分子である。
【００３４】 有機小分子という用語は、一般的に医薬品に用いられる有機分子に相当する大
きさの分子を意味する。該用語には、生物学的巨大分子（例えば、タンパク質、
核酸など）は含まれない。好ましい有機小分子は、最大約5000Da、より好ましく
は最大2000Daおよび最も好ましくは最大約1000Daの範囲の大きさである。
【００３５】 本明細書で用いられる「標識」または「検出可能な標識」という用語は、分光
学、光化学、生化学、免疫化学、電気学、光学または化学的手段によって検出可
能な全ての組成物を意味する。そのような標識には、標識ストレプトアビジンコ
ンジュゲートで染色するためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、Dynabeads商標
）、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍
光タンパク質など）、放射性標識（例えば、3H、l25I、35S、14Cまたは32P）、
酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびEL
ISAで一般的に用いられる他の酵素）、ならびに金コロイドまたは着色ガラスも
しくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど
）ビーズなどの比色標識が含まれる。そのような標識の使用について指示する特
許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345
号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,241号が含まれる。そのよ
うな標識を検出する手段は、当業者には公知である。従って例えば、放射性標識
を写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができ
、蛍光マーカーを、放出された光を検出する光検出器を用いて検出することがで
きる。酵素標識は典型的に、基質に酵素を与えて、基質での酵素作用により生成
される反応生成物を検出することにより検出し、ならびに比色標識は、着色した
標識を単純に視覚化することにより検出する。
【００３６】発明の説明 I.序論 本発明は、微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質の活性をモジ
ュレートする薬剤を同定するためのアッセイを提供する。該アッセイは一般的に
、重合微小管と微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質（例えば、
XKCM1、OP18、カタニンなど）とを、試験薬剤および化学的エネルギー源（例え
ば、ATPまたはGTP)の存在下で接触させることを含む。次に、薬剤が微小管の脱
重合または切断に及ぼす影響を、典型的には微小管分解成分（例えば、チューブ
リンの単量体、チューブリンの二量体、またはチューブリンオリゴマー）の形成
を検出することにより検出する。1以上の対照アッセイと比較したときに、微小
管の脱重合もしくは切断の量および/または速度を変化させる試験薬剤を、微小
管脱重合活性または微小管切断活性のモジュレーターとして同定する。
【００３７】 微小管を脱重合または切断するある種のタンパク質が、正常な有糸分裂におけ
る紡錘体形成のモジュレーターとしての良い標的を提供するということが、本発
明の発見であった。特定の理論に拘束されることなく、微小管脱重合活性または
微小管切断活性は、正常な有糸分裂における紡錘体の形成および/または機能に
とって重要なものであると考えられている。脱重合活性または切断活性をモジュ
レートする（例えば、アップレギュレート、ダウンレギュレート、または完全に
抑制する）薬剤は、細胞周期の進行に有意な活性を有すると予想される。従って
、例えば、微小管脱重合または微小管切断のインヒビターは有力な抗-有糸分裂
薬剤として作用するであろう。
【００３８】 抗-有糸分裂薬剤は、非常に多様な状況において有用である。本明細書に記載
のスクリーニング（アッセイ）法によって同定される微小管の脱重合活性または
切断活性のインヒビターは、強力な抗-有糸分裂または抗-成熟分裂性のものとし
て非常に多様な用途を有し、特に異常細胞増殖によって特徴づけられる病的状態
の治療（例えば改善）において用途を有するであろう。このような状態には、限
定するものではないが、真菌感染、内皮細胞の異常刺激作用（例えば、アテロー
ム硬化症）、固化腫瘍および腫瘍転移、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫瘍
、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、血管機能不全（例えば、動
脈静脈機能不全）、創傷治癒異常、炎症性および免疫性疾患、Bechet's疾患、通
風もしくは通風性関節炎、異常な脈管形成に付随する：慢性関節リウマチ、乾癬
、糖尿病性網膜症、ならびにその他の眼の脈管形成疾患（例えば、早産の網膜疾
患（水晶体後線維増殖）、黄班変性、角膜過剰成長、角膜移植拒絶反応、神経管
障、Oster Webber症候群など）がある。
【００３９】 微小管の脱重合または切断のインヒビターもまた、同様に多様なin vitroでの
用途を有するであろう。例えば、それらを用いて、細胞周期の特定の段階のもの
から得られた核酸の単離、その他における様々な目的のために（例えば、組織検
査のためのサンプル調製において）、細胞を細胞周期の特定の段階で停止させる
ことができる。
【００４０】 本発明のアッセイによって同定されるモジュレーターは、好ましくは、標的と
する微小管脱重合タンパク質もしくは微小管切断タンパク質に対する特異性、ま
たはこれらのタンパク質の活性に特有の経路に対する特異性によって特徴づけら
れる。従って、該モジュレーターは、微小管脱重合タンパク質のファミリーおよ
びサブファミリーならびに/または微小管切断タンパク質のファミリーおよびサ
ブファミリーに対する高度に特異的なインヒビター開発のための新規リード化合
物を提供し、そのため該モジュレーターは厳格な化学的介入を可能にするもので
ある。
【００４１】II. 微小管脱重合モジュレーター検出のためのアッセイ Ａ）脱重合アッセイ ある実施形態において、本発明は、微小管の脱重合または切断をモジュレート
する活性を有する薬剤の検出／同定のためのアッセイを提供する。該アッセイは
、一般に、重合微小管と微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質と
を、化学的エネルギー源（例えば、ATPまたはGTP)および該薬剤の存在下で接触
させ、微小管分解産物（例えば、チューブリン単量体）の形成を検出および/ま
たは定量することを含む。微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質
の活性を抑制する薬剤は、重合微小管の分解を抑制し、そのためチューブリン単
量体もしくはオリゴマーの形成を遅延させるかまたはその量を減少させる。従っ
て、チューブリン単量体の形成速度もしくはその量の減少、またはチューブリン
ポリマー（微小管）のチューブリン単量体に対する比の増加は、該薬剤が抑制的
にモジュレートする効果を示す。逆に、チューブリン単量体の形成速度もしくは
その量の増加、またはチューブリンポリマー（微小管）のチューブリン単量体に
対する比の増加は、該薬剤が微小管を安定的にモジュレートする効果を示す。
【００４２】 該増加または減少は、1以上のコントロールに対する比較によって判断する。
コントロールは、試験薬剤が欠けているかまたは既知の活性を有する「対照標準
」薬剤を含有するかいずれかの、本質的には同一のアッセイである。いずれかの
試験試薬を欠いているアッセイはどれもネガティブコントロールの役目をし、一
方、既知のモジュレート活性を有する薬剤を用いたアッセイはポジティブコント
ロールとしての役目をなす。
【００４３】 好ましい実施形態においては、ネガティブコントロールと試験アッセイとの間
に有意な差がある場合および/またはポジティブコントロールと試験アッセイと
の間に有意な差が見られない場合、該アッセイをポジティブなもの（すなわち、
該薬剤が微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質をモジュレートす
る活性を有する）とする。この有意な差は、好ましくは統計学的に有意な差であ
り、より好ましくは少なくとも約10%の差、そして最も好ましくは少なくとも約2
0%、30%、50%または100%の差である。
【００４４】 該アッセイは、溶液中または固相中（すなわち、固体表面に結合した1以上の
アッセイ構成要素を用いて）で以下に記載するように実施できる。特に好ましい
一実施形態を本明細書中の実施例Iに記載する。該アッセイの種々の構成要素を
以下に記載する。
【００４５】Ｂ）結合アッセイ 別の実施形態において、本発明は、微小管脱重合タンパク質もしくは微小管切
断タンパク質の微小管への結合を阻害する薬剤を同定するため、あるいは微小管
脱重合ポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットまたは微小管切断ポリペ
プチドもしくはポリペプチドサブユニットに特異的に結合する薬剤を同定するた
めの結合アッセイを提供する。
【００４６】 好ましい結合アッセイにおいては、試験薬剤の脱重合タンパク質または切断タ
ンパク質に特異的に結合する能力をアッセイする。特に好ましい実施形態におい
ては、試験薬剤がカタニンのP60ドメインに特異的に結合する能力をアッセイす
る。
【００４７】 結合アッセイについては、非常に多様な様式がある。ある実施形態においては
、 脱重合タンパク質もしくはタンパク質サブユニットまたは切断タンパク質もしく
はタンパク質サブユニットを表面に固定して試験薬剤と接触させるか、あるいは
逆に試験薬剤を表面に固定して、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットの
特異的結合をアッセイする。溶液中にある部分（試験薬剤または脱重合タンパク
質もしくは切断タンパク質）が標識され、接触および未結合薬剤の洗浄の後、支
持体と結合した標識部分の同定によって結合が示唆される場合に、結合は最も容
易に検出される。
【００４８】 液相結合アッセイもまた、当業者に公知である。例えば、ある実施形態におい
ては、結合アッセイは共沈降アッセイである。この（ペレット化）アッセイにお
いては、試験薬剤が微小管切断タンパク質もしくはタンパク質サブユニットまた
は脱重合タンパク質もしくはタンパク質サブユニットに結合する場合、遠心にか
けると結合した薬剤とタンパク質は共沈降することになる。未結合のポリペプチ
ドおよび試験薬剤は、異なる速度で沈降するかまたは完全に溶液中に残ることに
なる。
【００４９】 様々な結合アッセイの実施方法を、1997年9月4日出願の同時係属出願USSN 60/
057895に見ることができる。競合結合アッセイおよび直接結合アッセイを含むタ
ンパク質結合アッセイのための異なる様式についての一般的な説明に関しては、
StitesおよびA. Terr(1991) Basic and Clinical Immunology, 7th Edition; Ma
ggio(1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida; およびTij
ssen (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, in Laboratory Te
chniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publish
ers, B.V. Amsterdamを参照されたい。
【００５０】 Ｃ）ATPアーゼアッセイ カタニンのP60サブユニットがATPアーゼのAAAファミリーの新規なメンバーで
あること、ならびに発現したp60がp80サブユニットの不在下で、微小管刺激性AT
Pアーゼ活性および微小管切断活性を有することは、本発明における発見であっ
た。従って、別の実施形態では、本発明は、カタニンのp60サブユニットのATPア
ーゼ活性をモジュレートする薬剤についてのアッセイを提供する。
【００５１】 ATPアーゼアッセイは、当業者に公知である。ある好ましい実施形態において
は、Kodamaら、(1986) J. Biochem. 99:1465-1472に記載の方法に従って、該ア
ッセイを実施することができる。実施例１に詳細に記載されているこのアッセイ
を、存在する試験薬剤を用いて実施し、その結果をネガティブおよび/またはポ
ジティブコントロールアッセイと比較し、試験薬剤がp60 ATPアーゼ活性を変化
させる（モジュレートする）能力を判断する。
【００５２】Ｄ）固相アッセイ ある実施形態においては、本発明のアッセイを固相で実施することができ、該
アッセイにおいては1以上のアッセイ構成要素を固体表面に結合させる。固相ア
ッセイでは、1以上のアッセイ構成要素を固相に結合させる。表面材料が該アッ
セイ試薬と共存できる限り、実質的にどんな固体表面も適しており、アッセイ構
成要素の反応性を過度に変化させることなく該構成要素を表面に付着させること
ができる。固相において活性の減少を示す構成要素もあることが認識されるが、
これは問題のタンパク質の脱重合活性および切断活性を検出および/または定量
するのに十分な活性である限り、一般的に許容される。
【００５３】 固相支持体には、例えばガラスビーズ、平らなガラス、調節細孔ガラス、プラ
スチック、多孔性プラスチック金属または樹脂などの、それに対して分子がが付
着し得る本質的にどんな固体表面も含まれる。当業者であれば、固相支持体を官
能基（例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、エステル、およびメルカ
プト基）で誘導体化して、リンカーが結合するための反応部位または構成要素が
直接結合するための反応部位を提供し得ることが認識されよう。
【００５４】 該アッセイ構成要素（例えば、微小管）の固相支持体に対する付着は、直接的
である（すなわち、微小管を固相支持体に直接接触させる）かまたは間接的であ
る（特定の化合物または化合物群が支持体に結合し、そしてアッセイ構成要素が
固相支持体ではなくこの化合物または化合物群に結合する）。該構成要素は共有
的に（例えば、タンパク質成分を固定するためにシステインの１の反応性チオー
ル基を利用する、Colliuodら、(1993) Bioconjugate Chem.4,528-536)、または
非共有的であるが特異的に（例えば、ポリヒスチジン融合タンパク質を結合する
ための、固定化抗体またはその他特定の結合タンパク質（Schumannら、(1991) A
dv. Mater.3:388-391;Luら、(1995) Anal. Chem. 67: 83-87)、ビオチン/ストレ
プトアビジン系（Iwaneら、(1997) Biophys. Biochem. Res. Comm. 230: 76-80)
、または金属キレートLangmuir-Blodgettフィルム（Ngら、(1995) Langmuir 11
：4048-4055;Schmittら、(1996)Angrew. Chem. Int. Ed. Engl.35:317-320; Fre
yら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：4937-4941；Kubalekら、(1994)J
. Struct. Biol. 113:117-123）および金属キレート自己集合性単分子層（Sigal
ら、（1996）Analytical Chem.,68:490-497)を介して）固定化することができる
。
【００５５】 好ましい実施形態においては、不活性化微小管モータータンパク質への結合に
よって、アビジン-ビオチン結合によって（好ましくはビオチンを微小管に、ア
ビジンを表面上に）、抗-チューブリン抗体によって、微小管結合タンパク質（M
AP)によって、アミノシラン、ポリリシンによって、またはポリカチオン性表面
との相互作用を介して、微小管を固定化する。
【００５６】 固相支持体およびアッセイ構成要素の該支持体への結合形態を操作することに
より、アッセイ構成要素の配向を調節することが可能になる。例えば、同時係属
出願 USSN 60/057,929（1997年9月4日出願）に、細胞骨格タンパク質を雲母フィ
ルに結合するためのアルギニンテイルの使用が記載されている。
【００５７】 ある好ましい実施形態においては、表面（例えばフローセル）をn-エチルマレ
イミド（NEM)で処理したアフリカツメガエルの卵の抽出物(10mMのNEMで10分間処
理し、つづいて100mMのジチオトレイトールを添加した6mg/mlのタンパク質。こ
れは切断活性を不活化する処理である。）または大腸菌発現KAR3タンパク質（ヌ
クレオチドに依存しない方法で微小管を結合する）でコーティングすることによ
って、微小管を固定する。未結合のタンパク質を洗浄除去した後、安定化した微
小管（例えばBR80中100μg/ml、20μM タキソール）を該表面上に注いで結合さ
せる。未結合の微小管を洗浄除去した後、試験しようとするサンプルを該表面に
接触させることができる（例えば、フローセル中に注ぐ）。
【００５８】Ｅ）微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質をモジュレートする候
補薬剤の高効率なスクリーニング 通常、有用な特性を有する新規化学事象は、いくつかの所望の特性または活性
を持つ化学化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、該リード化合物の
変異形を作り出し、その変異化合物の特性および活性を評価することによって生
み出される。しかし、薬物発見におけるすべての側面に対する時間尺度を短縮す
るのが現在の傾向である。大量のサンプルを素早くかつ効率的に試験する能力の
ために、高効率なスクリーニング（high throughput screening；HTS)法が、従
来のリード化合物同定法に取って代わりつつある。
【００５９】 ある好ましい実施形態においては、高効率スクリーニング法は、多数の潜在的
な治療用化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することを含む。次に
、このような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」を本明細書に記載した
ような1以上のアッセイでスクリーニングし、所望の特定の活性を示すそれらラ
イブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。そうして
同定された化合物は、従来の「リード化合物」としての役割を果たすか、または
化合物自体を潜在的なもしくは実際の治療用物質として使用できる。
【００６０】i) コンビナトリアルケミカルライブラリー 近年、新規のリード化合物の生成に役立つコンビナトリアルケミカルライブラ
リーの利用に注目が集まっている。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、
試薬などの数多くの化学的な「構成単位」を組み合わせることによる化学合成ま
たは生合成のいずれかによって生成された、多様な化学化合物の集合である。例
えば、ポリペプチドライブラリーなどの線状のコンビナトリアルケミカルライブ
ラリーは、所定の化合物長（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）に
対して可能であり得る全てのやり方で一連の化学的構成単位すなわちアミノ酸を
組み合わせることにより、作製される。そのような化学的構成単位のコンビナト
リアル混合によって、何百万種類もの化学化合物が合成できる。例えば、100種
の互換性のある化学的構成単位のシステム化されたコンビナトリアル混合により
、理論的には１億種類の四量体化合物または100億種類の五量体化合物が合成さ
れると、ある論評者は述べている(Gallopら,(1994) 37(9): 1233-1250)。
【００６１】 コンビナトリアルケミカルライブラリーの作製およびスクリーニングは、当業
者には周知である。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーとしては
、限定するものではないが、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第5,010,17
5号、Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493、Houghtonら,(199
1) Nature, 354: 84-88を参照のこと）が挙げられる。本発明における使用が構
想および意図される方法としては、ペプチド合成が唯一のものでは決してない。
多様なケミカルライブラリーを作製するためにその他の化学も使用可能である。
そのような化学としては、限定するものではないが、ペプトイド（PCT公開公報
WO 91/19735, 1991.12.26）、コード化ペプチド（PCT公開公報 WO 93/20242, 19
93.10.14）、ランダムバイオオリゴマー（PCT公開公報 WO 92/00091, 1992.1.9
）、ベンゾジアゼピン（米国特許第5,288,514号）、ダイバーソマー(diversomer
s)例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド(Hobbsら,(1993) Pr
oc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913)、ビニロガスポリペプチド(vinylogou
spolypeptide；Hagiharaら,(1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568)、β-D-グ
ルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチドミメティック(Hir
schmannら,(1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218)、小化合物ライブラリ
ーの類似有機合成(Chenら,(1994) J. Amer Chem. Soc. 116:2661)、オリゴカル
バマート(Choら,(1993) Science 261:1303)および／またはぺプチジルホスホナ
ート(Campbellら,(1994) J. Org. Chem. 59:658)が挙げられる。一般的には Gor
donら,(1994) J. Med. Chem. 37:1385、核酸ライブラリー（例えばStrategene,C
orp.を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第5,539,083
号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えばVaughnら,(1996) Nature Biotech
nology, 14(3): 309-314、およびPCT/US96/10287を参照のこと）、炭水化物ライ
ブラリー（例えばLiangら,(1996) Science, 274: 1520-1522、および米国特許第
5,593,853号を参照のこと）ならびに小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾ
ジアゼピンについてのBaum (1993) C&EN, Jan 18,33頁、イソプレノイドについ
ての米国特許第5,569,588号、チアゾリジノンおよびメタチアザノンについての
米国特許第5,549,974号、ピロリジンについての米国特許第5,525,735号および第
5,519,134号、モルホリノ化合物についての米国特許第5,506,337号、ベンゾジア
ゼピンについての米国特許第5,288,514号などを参照のこと）を参照されたい。
【００６２】 コンビナトリアルライブラリー作製のための機器は市販されている（例えば、
357MPS, 390MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Wob
urn, MA、433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore,
Bedford, MAを参照のこと）。
【００６３】 液相化学のために、多くの周知のロボットシステムも開発されている。これら
のシステムは、Takeda Chemical Industries, LTD.(Osaka, Japan)によって開発
された自動化合成装置のような自動化ワークステーション、および化学者が手で
行う合成操作を模倣するロボットアームを利用した数多くのロボットシステム(Z
ymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, P
alo Alto, Calif.)を含む。上記機器はいずれも、本発明に使用するのに適して
いる。（たとえ改変したとしても）機器が本明細書で述べる通り動作し得るよう
な、これらの機器に対する改変の性質および実施は関連分野の当業者には明らか
であろう。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーがそれ自体で市販され
ている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, RU, Tripos, I
nc., St.Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton,
PA, Martek Biosciences, Columbia, MD等を参照のこと）。
【００６４】ii) ケミカルライブラリーのハイスループットアッセイ 本明細書に記載の微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質（もし
くはその他の薬剤）の活性をモジュレートする化合物に対するアッセイは、いず
れもハイスループットスクリーニングに適用できる。上述のように、好適な実施
形態において該アッセイは、カタニン、XKCM1、もしくはOMP19の活性を増強また
は抑制する薬剤に対してスクリーニングするものである。好適なアッセイは、微
小管が脱重合してチューブリン単量体、チューブリン二量体、もしくはチューブ
リンオリゴマーになる比率または量を検出する。
【００６５】 本明細書に記載の該アッセイの高効率な実施は、例えばロボットマニピュレー
ター、大プレート読み取り機等との互換性に関してアッセイ様式にせいぜい型通
りの改変を加えることによって、実現することができる。種々のハイスループッ
トスクリーニングシステム（例えば、タンパク質結合、核酸結合などに対するも
の）が、米国特許第5,559,410号、第5,585,639号、第5,576,220号、および第5,5
41,061号に記載されている。
【００６６】 また、ハイスループットスクリーニングシステムは市販されている（例えば、
Zymark Corp., Hopkinton, MA、Air Technical Industries, Mentor, OH、Beckm
an Instruments, Inc. Fullerton, CA、Precision Systems, Inc., Natick, MA
等を参照のこと）。これらのシステムは、典型的に、全てのサンプルおよび試薬
のピペッティング、液体の分注、時間を定めたインキュベーション、および最後
にアッセイ用の検出機におけるマイクロプレートの読み取りを行うことを含む手
順全体を自動化するものである。これらの設定可能なシステムは、ハイスループ
ット性および高速始動だけでなく、高度な柔軟性およびカスタマイゼーションを
提供する。そのようなシステムの製造業者は、種々のハイスループットに対する
詳細なプロトコールを提供している。このように、例えばZymark Corp.は、遺伝
子転写、リガンド結合などのモジュレートを検出するためのスクリーニングシス
テムについて記載した技術速報を提供している。
【００６７】III) アッセイ構成成分 A) 重合微小管 上記の通り、本発明のアッセイは、脱重合タンパク質または切断タンパク質の
存在下で、脱重合または切断されてチューブリン単量体またはオリゴマーを生ず
る重合微小管を利用する。脱重合タンパク質 または切断タンパク質が阻
害される場合、チューブリン単量体またはオリゴマーの生成が阻害される。
【００６８】 実質的に任意の微小管を本発明のアッセイに用いることができる。そのような
微小管を得る方法は、当業者には周知である。チューブリンは市販されており、
あるいは種々さまざまな供給源、例えば植物、動物組織、卵母細胞等から単離す
ることができる。例えばチューブリンは、シロイヌナズナ(Arabidopsis)細胞の
定常期（10〜11日）の培養細胞（生重量で200〜500mg）から、Bokrosら(1993),
Biochemistry 32(13): 3437-3447に記載の改変を加えたMorejohnら(1985) Cell Biol. Int. Rep. 9(9): 849-857に記載のDEAE-Sephadex A50 クロマトグラフィ
ーによって、単離することができる。簡潔に説明すると、シロイヌナズナ細胞を
、50mg/ml Na-p-トシル-L-アルギニンメチルエステル(TAME)、ならびにペプスタ
チンA、ロイペプチン、ヘミ硫酸塩、およびアプロチニン各5mg/mlを補充した、5
0mM PIPES-KOH, pH6.9, 1mM EGTA, 0.5mM MgSO4, 1mM DTTおよび0.1mM GTPから
なる単離バッファー(IB)中でホモジナイズする。該細胞ホモジェネートをチュー
ブリン単離のためにDEAE-Sephadex A50 クロマトグラフィーにかける。DEAEで単
離したチューブリンの硫酸アンモニウム沈殿は、等分割して、使用するまで-80
℃にて保存する。
【００６９】 以前に記載された通り(Bokrosら (1993), Biochemistry 32(13): 3437-47)、1
mM GTPを添加したIB中での一段階のタキソール誘導性微小管重合工程によって、
微小管を均一に精製することができる。簡潔に説明すると、DEAEで単離したチュ
ーブリンのサンプルを解凍して1mM DTTおよび1mM GTPを添加したIB中に再懸濁し
、さらにBeckman TL-100 超遠心機（TLA-100 ローター）で100,000×g（2℃）に
て1時間遠心分離することにより清澄にする。清澄化チューブリンは、IB、1mM D
TT、1mM GTPおよび1% DMSOからなる微小管構築バッファー中にて、タキソールを
2倍のモル過剰で加えて重合させる。2時間かけて2℃から25℃まで段階的に温度
を上昇させることによって、微小管が構築された。重合体は、構築バッファー中
の20％(w/v)スクロースのクッションを利用して25℃にて30,000×gで45分間遠心
分離することにより回収する。
【００７０】 好適な実施形態においては、チューブリン／微小管を動物組織、例えば脳組織
から、Hymanら (1991) Meth Enzy.,196: 478-485の方法に従って単離する。その
脳のチューブリンは、前掲のHymanら(1991)に記載されるようにテトラメチルロ
ーダミンまたはフルオロセインN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Molecular
Probes, Inc., Eugene, OR)を用いて、修飾することができる。
【００７１】 大部分の微小管は、構築と解体が起こっている流動状態にある。本発明のアッ
セイの好適な実施形態においては、本質的にインタクトな微小管として安定化さ
せた微小管を用いる。このことは、天然にて安定な微小管4s（例えば、軸糸微小
管）を用いることにより、または安定化されるように微小管を処理することによ
り、達成することができる。微小管の安定化方法は当業者に周知であり、限定す
るものではないが、例えばパクリタキセルおよびパクリタキセル誘導体（例えば
、タキソテーレ(taxotere)）、非加水分解性ヌクレオチド（例えば、GTP）類似
体（例えば、グアニリル-(α,β)-メチレンジホスフェート(GMPCPP))等の安定化
薬剤の使用を含む。
【００７２】 好適な実施形態においては、タキソール安定化微小管は、1mM GTPおよび10％
ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むBRB80(80mM PIPES[pH6.8], 1mM MgCl2, 1mM
EGTA)中での37℃にて45分間のチューブリン重合(2〜10mg/ml)によって、調製す
る。続いてタキソールを、20μMの濃度になるように添加する。
【００７３】 GMPCPP安定化微小管は、GTPを0.5mM GMPCPPで代替した上記バッファー中でチ
ューブリンをインキュベートすることにより調製する。このGMPCPP微小管はタキ
ソールを含まずに室温で保存することができ、また好ましくは調製後1日以内に
使用する。
【００７４】B) アッセイ反応混合液 本発明のアッセイは、試験タンパク質（例えば、カタニン、XKCM1、OP18等）
の微小管脱重合活性または微小管切断活性に必要な成分を提供し、かつ試験タン
パク質の酵素活性に適合性のある反応混合液中で行う。典型的には、該反応混合
液は適合バッファー（例えば、HEPES pH6.5〜8.0）、およびグアノシン三リン酸
(GTP)等の微小管脱重合タンパク質にエネルギーを供給する分子、もしくはアデ
ノシン三リン酸(ATP)等の切断分子（例えばカタニン）にエネルギーを供給する
分子を含んでなる。１つの好適なアッセイ混合液を実施例１に記載する。
【００７５】C) 微小管脱重合薬剤および微小管切断薬剤 上記のように、本発明のアッセイは、本質的に、微小管脱重合ポリペプチドま
たは微小管切断ポリペプチドに対する試験薬剤の活性を検出するものである。OP
18(Belmontら (1990) Cell, 62: 579-589)およびXKCM1(Walczakら (1996) Cell,
84: 37-47）などの微小管脱重合ポリペプチドは、カタストロフィー（成長状態
から縮減状態への微小管の変化）の頻度を増大させ、したがって微小管の端から
の微小管の解体を促進させる。
【００７６】 微小管脱重合タンパク質とは対照的に、カタニン等の他のタンパク質は、微小
管内で内部崩壊を生じさせることによって微小管の解体を促進し、微小管切断タ
ンパク質と呼ばれる（例えば、Vale (1991) Cell 64: 827-839; Shiinaら (1994
) Science 266: 282-285; Shiinaら (1992) EMBO J.11: 4723-4731; McNallyお
よびVale (1993) Cell, 75: 419-429を参照のこと）。
【００７７】 本発明の方法に対して好適な微小管脱重合タンパク質としては、限定するもの
ではないが、XKCM1およびOP18が挙げられ、また好適な微小管切断タンパク質と
してはカタニンが挙げられる。
【００７８】i) カタニン カタニン、すなわちウニ類の卵から精製した60kDaおよび80kDaのサブユニット
のヘテロ二量体は、ATP加水分解に由来するエネルギーを利用することにより重
合体格子内部の結合を壊すという点で、既知の微小管およびアクチン切断タンパ
ク質の間ではユニークなものである(McNallyおよびVale (1993) Cell, 75: 419-
429)。カタニン1分子は微小管から数個のチューブリン二量体を放出させ得るの
で、カタニンは準化学量論的なふるまいをする。解体反応から放出されるチュー
ブリンは再重合し得るため、カタニンはチューブリンをタンパク質分解または改
変しないと考えられる(McNallyおよびVale (1993) Cell, 75:419-429)。しかし
ながらカタニンによる微小管切断の機構は知られていない。
【００７９】 カタニン触媒性微小管切断および解体は、in vivoで観察される微小管骨格に
おけるいくつかの変化に含まれる可能性がある。近年の研究は、カタニンがウニ
胚において微小管依存的な様態で中心体に集中していることを示している(McNal
lyら (1996) J.Cell Sci. 109: 561-567)。中心体において微小管の解体が必要
であり得る１つの現象は、有糸分裂の紡錘体におけるチューブリンの極方向への
流動である(Mitchson (1989) J. Cell Biol. 109: 637-652)。極方向への流動の
際、紡錘極における微小管(−：マイナス)端の解体がカタニンにより駆動される
可能性があり、あるいはカタニンが単にγ-チューブリン環状複合体上に結合さ
れた微小管(−)端を脱キャッピングすることによって脱重合しうるようにする可
能性もある(Zhengら (1995) Nature 378: 578-583; Moritzら (1995) Nature 37
8: 638-640)。中心体におけるカタニンの、他に可能性のある役割は、微小管の
その中心体付着点からの解離を促進することにある。微小管は中心体においてγ
-チューブリン環状複合体を核としているが(Joshiら,(1992); Moritzら (1995)
Nature 378: 638-640)、微小管(−)端の解離がディクティオステリウム(Dictyos
telium)において間接的に観察され(Kitanishi-Yumuraら (1987) Cell Motil. Cy
toskeleton 8: 106-117)、さらにPtK1細胞(Keating (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 94: 5078-5083)およびアフリカツメガエルの卵抽出物(Belmontら (19
90) Cell 62: 579-589)において直接的に観察されている。最終的に、カタニン
は細胞質の微小管を切断し、脱重合が起こり得る遊離微小管末端の数を増大させ
ることによって、G2/M期移行に際して間期微小管網の急速な解体(Zhaiら (1996)
J. Cell Biol. 135: 201-214)を加速する可能性がある。その活性の特定の様式
に関わらず、カタニン活性のモジュレートは細胞周期に大きく影響を与えるであ
ろう。
【００８０】 カタニンのP60およびP80サブユニットのアミノ酸配列および核酸配列を、図１
に示した（配列番号１および配列番号２も参照のこと）。本発明における発見は
、微小管切断活性がP60サブユニットにもっぱら存在することであった。したが
って本発明のアッセイは、ヘテロ二量体性のカタニンまたはP60サブユニット単
独のいずれを用いても実施することができる。
【００８１】 カタニンのP60および/またはP80サブユニットは、McNallyおよびVale (1993)
Cell, 75: 419-429に記載されたように精製（例えばウニ卵、例としてストロン
ギロセントロータス・パープレイタス(Strongylocentrotus purpuratus)由来の
卵から）することができる。あるいは、いずれかまたは両方のサブユニットを、
実施例１および以下に記載のように、組換えにより発現させて精製することもで
きる。
【００８２】ii) XKCM1 XKCM1（アフリカツメガエルキネシン中心モーター１）は、in vitroでの有糸
分裂の紡錘体の構築に必須のモータータンパク質である。XKCM1はセントロメア
に局在し、微小管の重合の動力学を調節していると考えられる。XKCM1クローン
の単離についてはWalczakら (1996) Cell, 84: 37-47に記載されており、その中
にXKCM1 cDNAの核酸配列が示されている（配列番号３）。この配列情報を利用し
て、前掲のWalczakら(1996)によって、また後述のように、XKCM1を発現させるこ
とができる。
【００８３】iii) OP18 本発明の方法における使用に適した別の微小管脱重合モータータンパク質はOP
18であり、スタスミンまたはスタスミン/op18とも称される。OP18については、G
radinら (1998) J. Cell Biol., 140(1):131-141、Andersenら (1997) Nature,
389(6651):640-643、Larssonら, (1997) Mol. Cell. Biol., 17(9):5530-5539、
およびBelmontら (1996) Cell, 84(4):623-631に詳述されている。
【００８４】iv) その他の微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質 その他の微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質としては、限定
するものではないが、延長因子-1α(Shiinaら (1994) Science 266: 282-285)お
よびShiinaら (1992) EMBO J.11: 4723-4731に記載の新規のホモオリゴマータン
パク質が挙げられる。
【００８５】 その他の微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質は型通りの実験
のみによって同定され得る。微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク
質の同定に用いられるアッセイは本明細書に記載のアッセイと同一であるが、唯
一の違いは試験薬剤が必要とされないことである。微小管切断タンパク質（カタ
ニン）のアッセイの詳細な例は、McNallyおよびVale (1993) Cell, 75: 419-429
に示されている。他の切断タンパク質または脱重合タンパク質の同定のために同
じ方法を容易に使用することができる。
【００８６】IV) 検出方法 チューブリン単量体もしくはオリゴマーの発生する量または速度、および／ま
たは構築された（重合した）微小管の消失速度を検出ならびに／あるいは定量す
ることができる任意の検出方法を、本発明のアッセイにおいて用いることができ
る。好適な検出方法としては、限定するものではないが、ビデオ顕微鏡法、DAPI
蛍光変化、蛍光共鳴エネルギー転移、および遠心分離が挙げられる。
【００８７】A) ビデオ顕微鏡法 １つの実施形態において、微小管の脱重合または切断は顕微鏡により検出され
る（目視的に、またはビデオもしくは写真記録機器を使用して）。微小管の顕微
鏡による視覚化を伴うアッセイには、好ましくは標識した（例えば蛍光標識した
）微小管を使用する。該微小管は好ましくは固相支持体（例えばスライドガラス
）上に固定化され、微小管脱重合タンパク質または微小管切断タンパク質および
１種のヌクレオシド三リン酸を含む溶液に曝される。インタクトな、および脱重
合もしくは切断された微小管は顕微鏡を用いて直接視覚化することができる。試
験薬剤を含むアッセイとその対照における微小管脱重合を、並べてまたは連続的
に視覚化することができる。
【００８８】 顕微鏡は、任意に静止画カメラまたはビデオカメラを備え付けることができ、
またインタクトな微小管と断片化された微小管の相対的存在割合を定量するため
の画像の取得および解析ソフトウェアも備えることができる。
【００８９】 本方法は、顕微鏡で視覚化できる本質的に任意の標識を用いて使用することが
できる。そのような標識としては、限定するものではないが、蛍光標識（例えば
、フルオレセイン、ローダミン等）、比色分析標識、および放射活性標識（適切
なシンチレーション遮蔽を用いる）等が挙げられる。本発明のアッセイのいくつ
かの実施形態においては、微小管はいずれの標識も用いずに視覚化することがで
きる（例えば、微分干渉対照顕微鏡により）。
【００９０】 カタニンによる微小管切断を視覚化するためにビデオ顕微鏡を使用する具体例
が、Mcnallyら (1993) Cell, 75: 419-429により示されている。この場合、微小
管はローダミンを用いて標識され、切断された微小管の画像がデジタル方式で取
り込まれる。
【００９１】B) DAPI蛍光変化 別の実施形態においては、DAPI染色した微小管の蛍光の変化により、微小管重
合状態を測定できる。この色素が重合したチューブリンに結合している場合には
、遊離チューブリンに結合している場合と比べてDAPI蛍光強度が大きいことが示
される(Heuseleら,(1987) Eur. J. Biochem. 165: 613-620)。カタニンおよびAT
PをDAPI標識微小管と共にインキュベートすると、蛍光強度の線形的な減少が時
間の関数として観察されるが、これは微小管のチューブリンへの転化を反映する
ものである。
【００９２】 したがって上述のように、DAPI標識した安定化微小管を用いてアッセイを行う
ことができる。DAPI蛍光の比率的または量的減少は、前掲のHeuseleらによって
記載されるようにして検出される。試験薬剤による蛍光変化は、陰性対照および
／または陽性対照反応において観察されるものと比較される。
【００９３】 本発明の驚くべき発見は、チューブリン、チューブリン二量体、チューブリン
オリゴマーまたは微小管をDAPI等の種々の標識を用いて標識することができるこ
と、そして該標識は、種々の試験薬剤または細胞骨格関連タンパク質と標識チュ
ーブリンとの相互作用に対し、微小管重合および／または脱重合および／または
切断に対する試験薬剤の影響をアッセイすることを妨げる程には干渉しないこと
、であった。使用可能な標識としては、限定するものではないが、スルホン酸ア
ニリノナフタレン(ANS)（例えば、Molecular Probes Catalogue Nos: A-47, A-5
0, T-53等）、ビス-ANS（Molecular Probes Catalogue No: P-153）、N-フェニ
ル-1-ナフチレン(NPN)（Molecular Probes Catalogue No: P-65）、DCVJ(Molecu
lar Proves Catalogue No: D-3923）、ルテニウムレッド、およびクレゾールバ
イオレットが挙げられる。
【００９４】C) 蛍光共鳴エネルギー転移 微小管の重合／脱重合の程度もまた、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)によって
測定することができる。蛍光共鳴エネルギー転移、すなわち吸収スペクトルおよ
び発光スペクトルが重なり合っている２つの蛍光団が共に近接した距離（例えば
7nm未満）に位置する場合に起こる現象(Stryer (1978) Ann. Rev. Biochem., 47
: 819-846)であるFRETは、タンパク質間の結合を測定するための強力な技術であ
り、単量体アクチンの重合体への重合化(Taylorら (1981) J. Cell Biol., 89: 362-367)および切断によるアクチンフィラメントの解体(Yamamotoら (1982) J.
Cell Biol., 95: 711-719)を測定するために以前から用いられている。
【００９５】 好適な実施形態においては、異なるやり方で標識された（例えば蛍光標識とロ
ーダミン標識）チューブリンを等モル比で混合する。その蛍光はチューブリンの
重合に際して消失するが、それは微小管内のチューブリン結合蛍光色素がエネル
ギー転移が起こるのに十分な程近接していることを示す。微小管が脱重合または
切断されると、蛍光（例えばフルオレセイン）が急速に輝光するのが観察される
。
【００９６】 試験薬剤を伴う反応によって生じた蛍光の比率および／または量は、対照と比
較され得る。試験薬剤の存在下における蛍光の比率または量の減少は、微小管脱
重合タンパク質または微小管切断タンパク質に対する抑制活性を示している。
【００９７】 特に好適な実施形態においては、微小管をフルオレセインチューブリンおよび
ローダミンチューブリンの等濃度での混合物から重合化し、20μMタキソールな
らびにグルコースオキシダーゼ(30μg/ml)、カタラーゼ(100mg/ml)、グルコース
(10mM)、およびジチオトレイトール(10mM)からなる酸素枯渇系(KishinoおよびYa
nigida (1998) Nature 334: 74-76)を含むBRB80中に600μg/mlチューブリンにな
るよう希釈した。これらの微小管のアリコート(150:1)を、例えば精製した切断
タンパク質のサンプルと共に混合することができ、そしてフルオレセインからの
蛍光（励起 492nm、発光 518nm）が記録される。該反応は、好ましくは陽性対照
および陰性対照と共に行う。チューブリン重合に対するFRETアッセイの詳細は、
McNallyら (1993) Cell, 75: 419-429に見出される。
【００９８】Ｄ）遠心分離 溶液中での微小管の分解は、切断もしくは脱重合タンパク質（例えば、カタニ
ン）およびATPまたはGTPとのインキュベーションの後、沈降性および非沈降性チ
ューブリンの相対量を検定することにより、定量的に記録することができる。モ
ジュレート剤の不在下で、タキソールで安定化した微小管をカタニンp80およびp
60サブユニット、ならびにATPとインキュベートすると、微小管ポリマーから非
沈降性チューブリンがほぼ線形に放出される。放出速度は、微小管脱重合または
切断タンパク質の濃度に応じて異なり、また、モジュレートする「試験」薬剤が
存在すれば、その活性にも左右される。
【００９９】 好ましい実施形態では、蛍光微小管（例えば、100〜300μｇ／mlチューブリン
）を、バッファー（例えば、20mM HEPES(pH7.5)、２mM MgCl2、25mMグルタミン
酸カリウム、0.02％トリトンX-100、250μg/ml SBTI、ならびに20μＭタキソー
ルまたはタキソール誘導体）中の微小管脱重合または切断タンパク質と、インキ
ュベーション時間を変えて、インキュベートする。例えば、100：１のアリコー
トを10mM ADPまたはGDPに至らせ（これにより、切断または脱重合反応を停止す
る）、例えば、228,000xgで10分沈降させる。上澄みを除去し、ペレットを100μ
Ｌのバッファーに再懸濁する。ペレットと上澄みは、例えば、BRB80を用いて、3
00μＬまでにすることができ、パーキンエルマー(Perkin Elmer）L25Bルミネセ
ンス分光計を用いて、上澄みおよびペレット中の相対蛍光シグナルを測定する。
【０１００】Ｅ）液晶アッセイ装置 さらに別の形態では、微小管脱重合または切断タンパク質と、微小管との結合
は、液晶を用いて、検出することができる。あるいは、液晶を用いて、チューブ
リン重合の状態を監視することも考えられる。
【０１０１】 液晶を用いて、表面のタンパク質の受容体媒介結合を光学的出力に増幅および
変換することができる。自然に組織化した表面を設計して、これらの表面に宿主
とするリガンド（例えば、微小管）への結合時に、タンパク質分子が、厚さ１〜
20マイクロメータのフィルムの支持液晶の配向に変化を誘発し、従って、タンパ
ク質当たり約105〜106メソゲンの再配向に対応するようにすることができる。液
晶を通じて透過した光の強度の、結合により誘発された変化は、肉眼で容易に認
めることができ、タンパク質−リガンド認識に、よじれたネマチック性液晶がよ
じれを解くように設計した表面を用いることによって、さらに増幅することがで
きる（例えば、Guputaら、（1998）Science、279：2077〜2080を参照のこと）。
このリガンド−受容体結合の検出法は、被験体の標識や、電気分析装置の使用を
必要とせずに、マイクロメータの空間分解能をもたらし、しかも非常に簡単であ
ることから、空間的に分解した化学ライブラリーの生化学的アッセイならびに画
像化に有用である。
【０１０２】Ｄ）微小管脱重合または切断タンパク質の合成もしくは発現 ｉ）de novo化学合成 ここに提供した情報を用いて、微小管脱重合または切断タンパク質、タンパク
質サブユニット、もしくはその部分配列を、標準的化学ペプチド合成法で合成す
ることができる。所望のサブ配列が比較的短い場合には、分子は、単一の連続し
たポリペプチドとして合成してもよい。さらに大きい分子を所望する場合には、
部分配列を別々に（一つ以上の単位で）合成した後、ある分子のカルボキシル末
端を他の分子のアミノ末端と縮合させて融合することにより、ペプチド結合を形
成することができる。
【０１０３】 配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に結合させた後、該配列の残りのアミノ
酸を連続的に付加する固相合成が、本発明のポリペプチドの化学合成には、好ま
しい方法である。固相合成の方法は、BaranyおよびMerrifield（固相ペプチド合
成；pp3〜284、The Peptides；Analysis, Synthesis, Biology, Vol.2：Special
Methods in Peptide Synthesis、PartA；Merrifieldら、（1963）J. Am. Chem.
Soc.、85：2149〜2156；ならびにStewartら（1984）、Solid Phase Peptide Sy
nthesis、第２版、Pierce Chem. Co., Rockford, Ill）に記載されている。
【０１０４】ii）組換え体発現 好ましい実施形態では、組換え体DNA方法を用いて、微小管脱重合または切断
タンパク質、タンパク質サブユニット、もしくはサブ配列を合成する。一般に、
この方法は、タンパク質をコードするDNA配列を作製し、特定のプロモーターの
制御下で、該DNAを発現カセットに導入し、上記タンパク質を宿主に発現させ、
発現したタンパク質を単離し、必要であれば、タンパク質を復元することから成
る。
【０１０５】 本発明の微小管脱重合または切断タンパク質、タンパク質サブユニット、もし
くはサブ配列をコードするDNAは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制
限、もしくは、Narangらのホスホトリエステル法（（1979）Meth. Enzymol. 68
：90〜99）；Brownらのホスホジエステル法（（1979）Meth. Enzymol.68：109〜
151）；Beaucageらのジエチルホスホルアミダイト法（（1981）Tetra. Lett.、2
2：1859〜1862）；ならびに、米国特許第4,458,066号の固相支持体法等の方法に
よる直接化学合成を含む前述したいずれかの適した方法により作製することがで
きる。
【０１０６】 化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列
とのハイブリダイゼーション、もしくは、一本鎖を鋳型としたDNAポリメラーゼ
を用いる重合により、二本鎖DNAに変換することができる。当業者には、DNAの化
学合成が約100塩基の配列に制限されるのが、短い配列を連結することにより、
さらに長い配列が得られることは認識されよう。
【０１０７】 あるいは、サブ配列をクローニングし、適したサブ配列を適切な制限酵素で切
断することも可能である。次に、断片を連結することにより、所望のDNA配列が
得られる。
【０１０８】 一実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等のＤＮＡ増幅方法を用い
て、本発明の微小管脱重合または切断タンパク質をクローニングすることができ
る。従って、例えば、１つの制限部位（例えば、NdeI）を含むセンスプライマー
と、別の制限部位（例えば、HindIII）を含むアンチセンスプライマーとを用い
て、核酸配列またはサブ配列をＰＣＲ増幅する。これによって、末端制限部位を
有する所望の微小管脱重合または切断タンパク質をコードする核酸が生成される
。次に、この核酸を、第２分子をコードしかつ対応する適切な制限部位を有する
核酸を含むベクターに、容易に連結することができる。
【０１０９】 適したＰＣＲプライマーは、ここに記載した配列情報から、当業者が決定する
ことができる。また、部位特異的突然変異誘発により、適した制限部位を、微小
管脱重合または切断タンパク質をコードする核酸に付加することができる。微小
管脱重合または切断タンパク質コード化核酸を含有するプラスミドは、適した制
限エンドヌクレアーゼで切断した後、標準的方法に従い、第２分子をコードする
ベクターに連結する。
【０１１０】 微小管脱重合または切断タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌、その他
の細菌宿主、酵母等の様々な宿主細胞、ならびに、COS、CHOおよびHeLa細胞系お
よび骨髄腫細胞系等の様々な高等真核細胞において発現させることができる。微
小管脱重合または切断タンパク質は、典型的には、真核生物に存在するため、真
核生物宿主が好ましい。組換え体タンパク質遺伝子は、各宿主に対して適切な発
現制御配列に、機能しうる形で結合される。大腸菌の場合、これはT7、trp、も
しくはλプロモーター等のプロモーター、リボソーム結合部位、好ましくは、転
写終結シグナルを含む。真核細胞については、制御配列として、プロモーター、
好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等に由来する
エンハンサー、ならびにポリアデニル化配列があり、また、スプライスドナーお
よびアクセプター配列等も含まれる。
【０１１１】 本発明のプラスミドは、大腸菌の塩化カルシウム形質転換や、哺乳動物細胞の
リン酸カルシウム処理または電気穿孔等の周知の方法により、選択した宿主細胞
に導入することができる。プラスミドにより形質転換した細胞は、プラスミドに
含まれる遺伝子（amp、gpt、neoおよびhyg遺伝子等）により賦与された抗生物質
に対する耐性によって、選択することができる。
【０１１２】 発現したら、組換え体である微小管脱重合または切断タンパク質を、硫酸アン
モニウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動
等の標準的方法に従い、精製する（一般的には、R. Scopes、（1982）Protein P
urification、Springer-Verlag、N.Y.；Deutscher（1990）Methods in Enzymolo
gy、Vol.182：タンパク質精製の指針、Academic Press,Inc. N.Y.を参照）。均
質性が少なくとも約90〜95％の実質的に純粋な組成物が好ましく、98〜99％以上
の均質性が最も好ましい。部分的に、あるいは、所望の均質性にまで精製したら
、ポリペプチドを使用してもよい（例えば、抗体産生のための免疫原として）。
【０１１３】 当業者であれば、化学的合成、生物学的発現、もしくは、精製の後、微小管脱
重合または切断タンパク質が、構成ポリペプチドの天然立体配座とは実質的に異
なる立体配座を有する可能性があることは認識されよう。この場合、ポリペプチ
ドを変性および還元した後、ポリペプチドを、好ましい立体配座に再生させる必
要がある。タンパク質を還元および変性し、再生を誘発する方法は、当業者には
公知である（Debinskiら（1993）J. Biol. Chem.、268：14065〜14070；Kreitma
nおよびPastan（1993）Bioconjug. Chem.、４：581〜585；およびBuchnerら、（
1992）Anal. Biochem.、205：263〜270を参照）。例えば、Debinskiらは、グア
ニジン-DTE中の封入体タンパク質の変性および還元を記載している。次に、酸化
型グルタチオンとL-アルギニンを含有するレドックスバッファー中で、このタン
パク質を再生する。
【０１１４】 当業者であれば、微小管脱重合または切断タンパク質に、それらの生物活性を
減じることなく、修飾を施しうることは認識されよう。ある種の修飾は、ターゲ
ティング分子のクローニング、発現、もしくは融合タンパク質への組込みを容易
にするために行われる。このような修飾は、当業者には公知であり、例えば、メ
チオニンをアミノ末端に付加して、開始部位を賦与する、あるいは、追加アミノ
酸（例えば、ポリHis）をいずれかの末端に付加して、好適に位置した制限部位
または終結コドンもしくは精製配列を形成する等がある。
【０１１５】 特に好ましい実施形態では、カタニンタンパク質は、実施例１に記載したよう
に発現させるのに対し、XKCM1は、Walczakら（1996）（前掲）が記載したように
発現させる。
【０１１６】IV．データ管理 ある態様では、本発明のアッセイは、データベースを使用してアッセイ結果を
記録することによって、容易になる。特に、大規模スクリーニングシステム（例
えば、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング）の使用により、データ
管理は、重大な課題となり得る。例えば、あらゆる天然ヘキサペプチドは、約64
00万の異なる分子を生成する単一の組合せ実験で、合成されている。このような
ライブラリーのスクリーニングにより得られる情報の小さな断片の維持および管
理でさえ、自動化情報検索法、例えば、コンピューターデータベースにより支援
されている。
【０１１７】 このようなデータベースは、限定するものではないが、ライブラリーの登録、
ライブラリーまたは結果の表示、ライブラリーおよび／または結果の明細、文書
化、ならびにデータ検索および探索的データ解析を含む様々な機能に有用である
。データベースの登録機能は、組合せ混合物およびアッセイ結果の記録／登録を
提供し、有形所有物の登録／保護に類似した方式で、所有情報を保護する。ライ
ブラリーおよびアッセイ結果の表示機能は、関連するアッセイデータを閲覧およ
び／またはカテゴリー化するのに効果的な手段を提供する。アッセイが、試験薬
剤として、複雑な組合せ混合物を使用する場合には、ライブラリーの明細／記載
には、データベースが有用である。データベースはまた、アッセイ結果の文書化
、ならびに、迅速に、アッセイデータを検索、相関（またはその他の統計的分析
）、および評価する能力を提供する。
【０１１８】 従って、いくつかの好ましい態様では、本発明のアッセイは、さらに、「陽性
」化合物のデータベース、さらに好ましくは、治療用もしくは生物農業用リード
化合物のデータベースに、「陽性」として同定した（すなわち、微小管重合、お
よび／または脱重合、および／または切断に影響を及ぼす）試験薬剤を入力する
ことを含む。
【０１１９】 データベースは、本発明のアッセイによって得られた情報の記録および検索に
好適であれば、どんな媒体でもよい。このようなデータベースとしては、限定す
るものではないが、手動の記録および指標付けシステム（例えば、ファイル−カ
ード指標付けシステム）がある。しかし、データベースは、その中のデータが、
容易かつ迅速に検索および操作（例えば、ソーティング、分類、分析、および／
またはその他の組織化）できるとき、最も有用であると言える。従って、好まし
い実施形態では、本発明のデータベースのシグニチャー（signature）が、最も
好ましくは「自動化」されており、例えば、電子（例えば、コンピューターに基
づく）データベースである。データベースは、個々の「スタンドアロン型」コン
ピューターシステム上に存在してもよいし、あるいは、分散型コンピューターシ
ステムの構成要素、もしくはその分散した全域多重(across multiple)「ノード
」（プロセッサ）上に存在してもよい。データベースの保存および操作に使用す
るコンピューターシステムは、当業者には公知であり、「パーソナルコンピュー
ターシステム」、メインフレームシステム、インターまたはイントラネット上に
分散したノード、ハードウエア（例えば、マイクロチップ）に保存されたデータ
またはデータベース等を挙げることができるが、これらにに限定されるわけでは
ない。
【０１２０】III．微小管脱重合または微小管切断剤のモジュレーターのスクリーニングキッ
ト さらに別の形態では、本発明は、ここに記載した方法のいずれかを実施するた
めのキットを提供する。このキットは、ここに記載したアッセイ構成要素の１つ
以上を含む１つ以上の容器を備える。このような要素には、限定するものではな
いが、安定化した微小管、微小管脱重合もしくは微小管切断タンパク質またはタ
ンパク質サブユニット、１つ以上の試験薬剤、反応媒質、結合要素を含む固相支
持体（例えば、マイクロタイタープレート）、バッファー、標識、ならびに、こ
こに記載したその他の試薬等が含まれる。
【０１２１】 上記キットは、任意で、本文に記載したアッセイのいずれかを実施するための
使用法を含む使用説明書（すなわち、プロトコル）を備えていてもよい。この使
用説明書は、典型的には、文書または印刷物を含むが、これらに限定されるわけ
ではない。本発明では、これらの使用説明を保存し、かつ、それらをエンドユー
ザに伝達することができるいずれかの媒体が考慮される。これらの媒体として、
限定しないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、
チップ等）、光学的媒体（例えば、CD ROM）等が挙げられる。このような媒体が
、上記の使用説明を提供するインターネットサイトへのアドレスを有していても
よい。
【０１２２】実施例 以下の実施例は、本発明を説明するために提供するものであり、本発明の範囲
を制限するものではない。
【０１２３】実施例１：微小管切断タンパク質であるカタニンは、WD40含有サブユニットを用
いて、中心体にターゲッティングする新規のAAA ATPアーゼである 結果 カタニンの機能性ドメインの分析を開始するために、我々は、ウニ（Strongyl
ocentrotus purpuratus）卵mRNAに由来するcDNAからp60およびp80サブユニット
の、ｃＤＮＡクローンを単離した。まず、２種のウニ・カタニンサブユニット由
来の数個のタンパク質分解断片のペプチド配列を取得した後、縮重PCR、cDNAラ
イブラリースクリーニング、ならびにアンカー連結PCRを組み合わせて用いるこ
とにより、cDNAクローンを単離した（実験手順を参照のこと）。cDNAクローンの
推定アミノ酸配列は、p60およびp80の直接マイクロシークエンシング（microseq
uencing）によりそれぞれ取得した、139アミノ酸（a.a.）および306アミノ酸の
ペプチド配列を含有していた。
【０１２４】p60は、AAA ATPアーゼスーパーファミリーの新規メンバーである p60cDNAクローンの配列分析から、516アミノ酸.ポリペプチドをコードするオ
ープンリーディングフレームが明らかにされた(図１Ａ）。推定p60タンパク質配
列を用いるBLAST検索から、このポリペプチドが、AAA ATPアーゼスーパーファミ
リーに高度に保存されているＣ末端ドメイン（アミノ酸.231〜447）を含むこと
が明らかになった（図１Ｂ）（Confalonieriら（1995）BioEssays17：639〜650
）。この約220アミノ酸領域は、多くのATPアーゼでみいだされた「ウォーカー（
Walker）Ａ」（Ｐループ）および「ウォーカー（Walker）Ｂ」モチーフを含有す
る（Walkerら（1982）EMBO J.1：945〜951）。これら220アミノ酸.ATP結合モジ
ュールの１つまたは２つを含有するAAAタンパク質は、大きなスーパーファミリ
ーを構成し、そのメンバーは、多様な細胞機能に関与していた（Congalonieriら
（1995）前掲）。
【０１２５】 配列データベースに入力したAAAドメインのうち、mei-1、すなわち、減数分裂
に必要なC.エレガンス（elegans）タンパク質（Clark-Maguireら（1994）Geneti
cs 136：533〜546）は、p60に最も近縁である（55％アミノ酸同一性、図１Ｂ）
。mei-1は、減数分裂時の紡錘体形成に必要であるが、その後の有糸分裂中に消
失するタンパク質として、遺伝子スクリーニングで発見された。興味深いことに
、p60（McNallyら（1996）J. Cell Sci. 109：561〜567）およびmei-1（Clark-M
aguireら（1994）J. Cell Sci. 126：199〜209）の両方共、微小管依存的に、紡
錘体極に局在している。しかし、p60のＮ末端半分は、mei-1に有意な相同性を有
していないことから、p60とmei-1はオーソログ(ortholog）ではないと考えられ
る。しかし、p60を用いたBLAST検索では、AAAドメインの外側に強いアミノ酸同
一性を有する数個のヒトEST（発現配列タグ）が明らかにされ、p60の脊椎動物相
同体の存在を示している。
【０１２６】p80はWD40リピートを含む ウニp80cDNAクローンの配列分析から、残基1-256から延びる６つの「WD40」リ
ピートモチーフを含む推定上の690アミノ酸ポリペプチドが明らかになった（図
２Ａ）。２つの無関係のWD40リピート含有タンパク質とこれらのリピートの配列
とのアライメントを図２Ｂに示す。いくつかのタンパク質におけるWD40リピート
は、タンパク質−タンパク質結合相互作用に参加することが記載されている（Ko
machiら（1994）Genes Dev.８：2857〜2867；Wallら（1995）Cell 83：1047〜10
58）。p80のＣ末端領域（残基257〜690）は、以前に記載されたタンパク質のい
ずれに対しても、有意なアミノ酸同一性を示さなかった。しかし、ウニp80の顕
著な同一性が、いくつかのヒトESTクローンで認められた。これらクローンの配
列を用いて、PCRにより全長ヒトp80カタニン相同体を単離した（実験手順を参照
）。ヒトcDNAは、S. purpuratus p80カタニンに対して、WD40ドメイン（アミノ
酸1-256）（図２Ｂ）に61％アミノ酸同一性を、中央の187残基に23％アミノ酸同
一性を、そして、Ｃ末端164アミノ酸に54％アミノ酸同一性を有する推定655アミ
ノ酸タンパク質をコードする（後者２つの領域は示していない）。
【０１２７】カタニンサブユニットのバキュロウイルス発現および分子構造 ２つのカタニンサブユニットの役割を解決することは、酵素の作用機構および
生物活性を理解する上で重要である。しかし、天然ウニp60／p80サブユニットの
分離には、変性条件を必要とする。従って、我々は、両サブユニットを同時に、
および、別々に発現させ、それぞれの酵素活性を試験しようとした。p60の細菌
発現は、大部分が不溶性のタンパク質を産生し、少量の可溶性p60には、微小管
刺激ATPアーゼ活性がなかった（データは示していない）。しかし、バキュロウ
イルス発現系を用いて、我々は、可溶性p60、p80、ならびにp60／p80複合体（そ
れぞれ、Ｎ末端His(6)タグと共に発現させた）を取得し、金属アフィニティーク
ロマトグラフィーを用いて、発現タンパク質を精製した（図３Ａ）。p60およびp
80を同時発現させた場合、精製したタンパク質における両サブユニットの化学量
論は、ほぼ等しかった（クーマシー染色により測定したところ、p60：p80モル比
が1.0：0.9であった）。さらに、抗p60抗体を用いた免疫沈降により、等量のp60
およびp80の共免疫沈降が起こった（図３Ｂ）。これらの結果から、天然カタニ
ンで観測された（McNallyおよびVale（1993）Cell、75：419〜429）ように、バ
キュロウイルス発現p60およびp80がヘテロ二量体化することがわかる。
【０１２８】 カタニンの構造を調べるために、バキュロウイルス発現p60、p80、もしくはp6
0／p80を雲母（マイカ）チップに吸着させ、このチップを凍結、エッチングした
後、プラチナでロータリーシャドーイングした（Heuser（1989）J. ElectronMic
rosc. Technique 13：244〜263；Heuser（1983）J. Mol. Biol. 169：155〜195
）。プラチナ増影したp60は、中央に３〜５nmの開口部を有する14〜16nmのリン
グ状をしており、外側に向かって放射状に延びるひび割れのようなものがしばし
ば認められた（図４Ａ）。これに対し、p80は、約11nmの粒子、また、場合によ
っては、不定形のタンパク質凝集体状をしており、リングは認められなかった（
図４Ｂ）。また、p60／p80複合体（図４Ｃ、４Ｄ）および天然ウニカタニン（デ
ータは示していない）にもリングが認められた。興味深いことに、２つのタイプ
のp60／p80複合体が確認できた：一方は、縁のはっきりとした、直径（約20nm）
の大きなリングであり、雲母から上方に延びる、さらに背の高い複合体を予想さ
せる（図４Ｄ）。また他方は、p60だけのサイズの小径のリングで、中心リング
から複数のp80サイズの粒子を放射状に放出するリングである（図４Ｃ）。大小
のリングは、それぞれ、p60／p80複合体の閉じた型と、「広がった」型を呈示し
ている可能性があり、これらは、複合体が、雲母吸着時に切断する場合に、生成
されるだろう。p60およびp60／p80の両構造は、AAA ATPアーゼNSFおよびp97につ
いて認められたリング（その大きさは15〜17nm）に類似している（Hansonら（19
97）Cell 90：523〜535）。
【０１２９】p60カタニンは、微小管刺激ATPアーゼおよび切断活性を有する 単離したp60およびp80を得た後、我々は、個々のサブユニットがATPアーゼ活
性を有するか否かを検定した。同時発現したp60／p80ヘテロ二量体は、0.3ATP／
秒／ヘテロ二量体のATP代謝回転率を示し、この活性は、微小管により約10倍刺
激された（図５Ａ）。この基底活性および微小管による刺激倍率は、天然ウニカ
タニンで観測されたもの（データは示さず）に類似している。その配列における
AAAドメインの知見と一致して、p60は単独で、微小管刺激ATPアーゼ活性を示し
た。驚くべきことに、p60の最大基底および微小管刺激ATPアーゼ速度は、p60／p
80ヘテロ二量体のそれより、２倍低いだけであった（図５Ａ）。p80自体には、
検出可能なATPアーゼ活性がなかった。微小管によるATPアーゼ活性の活性化は、
変則的な非双曲的挙動を示した。p60およびp60／p80によるATP代謝回転は、低濃
度の微小管（約２μMチューブリンでピーク）で刺激されたが、これより高い微
小管濃度では低下した（図５Ａ）。この同じ複複雑なパターンの微小管刺激が、
天然ウニカタニンでも観測されている（データは示さず）。
【０１３０】 次に、我々は、蛍光顕微鏡アッセイを用いて、p60、p80、およびp60／p80の微
小管切断活性を試験した（McNallyおよびVale（1993）Cell、75：419〜429）。
このアッセイでは、p60およびp60／p80の両方が、微小管を切断した（図５Ｂ）
。0.1μMのp60またはp60／p80を導入して１分以内に、切断された微小管が観測
され、微小管は、５分後にはに完全に分解した。反応は、p60単独の場合、いく
らか遅いようであった。反応からATPアーゼを排除すると、微小管は無傷のまま
であった（データは示さず）。これに対し、p80は、p60に用いた５倍の濃度で、
微小管を切断することはできなかった（図５Ｂ）。これらの実験から、p60は単
独で、ATP加水分解を微小管分解に結びつけるに必要なすべてのステップを実施
できることが証明された。
【０１３１】 p60およびp60／p80の微小管切断活性をさらによく比較するために、我々は、D
API色素が、遊離チューブリンに対して重合重合チューブリンと結合すると、DAP
I蛍光強度が高くなるという以前の研究結果（Heuseleら（1987）Eur. J. Bioche
m. 165：613〜620）に基づき、定量的微小管分解アッセイを開発した。カタニン
とATPをDAPI標識微小管と共にインキュベートすると、時間が経過するにつれ、
蛍光強度の線形減少が認められ、微小管のチューブリンへの変換を表した（図５
Ｃ）。遠心分離試験により、微小管ポリマーの消失が確認され、同様の時間経過
と共に、非沈降性チューブリンの増加を示した（データは図示せず）。これらの
酵素により誘導した蛍光の減少は、定常状態レベルに達したが、このレベルは、
純粋な単量体チューブリンよりやや高いことから、定常状態でチューブリンオリ
ゴマーがいくらか存在する可能性が考えられる。蛍光減少の速度は、10倍のレン
ジにわたって、p60またはp60／p80濃度に比例した（データは図示せず）。微小
管分解の速度を比較したところ、p60の活性は、p60／p80の半分であった（図５C
）。微小管分解のこの遅い速度は、以前に記載されたp60／p80に対する、p60のA
TPアーゼ活性の２倍減少と一致する。
【０１３２】p80 WD40ドメインは、中心体にターゲッティングする p60が単独で、微小管を切断できるという知見は、p80カタニンサブユニットの
機能の問題を未解決のまま残した。p80の少なくとも２つの機能ドメインを仮定
することができる。第１に、カタニンは、ヘテロ二量体であることから（McNall
yおよびVale（1993）Cell、75：419〜429）、p80の一部は、p60とのヘテロ二量
体形成に関与するはずである。第２に、従来の研究から、カタニンは、in vivo
で中心体に集中することが明らかにされている（McNallyら（1996）J. Cell Sci
.109：561〜567）ため、p80は、中心体タンパク質と相互作用するドメインを含
み、カタニンホロ酵素のターゲッティングを可能にすると考えられる。WD40リピ
ートは、異好性タンパク質−タンパク質相互作用に関与している（Komachiら（1
994）Genes Dev.8:2857〜2867；Wallら（1995）Cell 83：1047〜1058）ことから
、p80における６つのWD40リピートは、二量体形成または中心体ターゲッティン
グのいずれかに参加するのに良好な候補ドメインを表わしていた。
【０１３３】 p60とのヘテロ二量体形成に、p80のWD40リピートが必要かどうかを試験するた
めに、我々は、全WD40ドメインを欠失させ、２つのポリペプチドが、ウサギの網
状赤血球系で同時翻訳されたとき、切断型p80（p80Δ1-302）がp60と相互作用し
たかどうかを検定した。切断型p80（p80Δ1-302）は、p60の存在下でのみ、全長
p80と同様に効率的に、抗p60抗体により共免疫沈降した（図６）。この知見から
、２つのカタニンサブユニットの二量体形成には、WD40リピートが必要ないこと
がわかる。それでも、WD40ドメインが、多数の重複p60相互作用ドメインの一つ
であるという可能性は残った。しかし、WD40ドメインだけを含むp80のＣ末端切
断（p80△303-690）は、p60と共免疫沈降しなかった（図６）。これらの結果か
ら、p80 WD40リピートは、p60との二量体形成に必要でもなければ、十分でもな
いことがわかる。p80のどの領域がp60との相互作用に必要かを決定するために、
Ｃ末端130アミノ酸（p80△560-690）を欠失したp80欠失体を構築し、これが、p6
0と共免疫沈降しないことをみいだした（図６）。これらの結果は、WD40リピー
トドメインではなく、p80のＣ末端130アミノ酸が、p60との二量体形成に関与す
ることを示している。
【０１３４】 p80 WD40リピートが、中心体のタンパク質に結合するかどうかを検定するため
に、我々は、これらリピートが、ヒト繊維芽細胞系、MSU1.1での一過性トランス
フェクションの後に、中心体に異種タンパク質（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）
をターゲッティングできるかどうかを試験した（Linら（1995）Int. J. Cancer
63：140〜147）。ヒトタンパク質は、このヒト細胞系において中心体タンパク質
と相互作用する可能性が高いため、ヒトp80カタニンのWD40ドメインを用いた。
ヒトp80カタニンに特異的な抗体によるMSU1.1細胞の免疫蛍光（実験手順を参照
）から、細胞質の標識、ならびに、１または２スポットでの、より濃厚な染色が
明らかになり、これらがγチューブリン染色と同時局在していることがわかった
（図７）。その結果、ウニの胚と同様、内在性カタニンが、繊維芽細胞の中心体
に集中していることを確認した（McNallyら（1996）J. Cell Sci. 109：561〜56
7）。ウニの胚における局在とは対照的に、繊維芽細胞の中心体でのp80の集中は
、ノコダゾールによる微小管の完全な脱重合後も、変わらなかった（データは示
さず）。これは、カタニンが、周辺中心粒物質に結合していることを示している
。緑色蛍光タンパク質（GFP）のＮ末端に付加したヒトp80カタニン（アミノ酸.1
-263）の６つのWD40リピートから成る融合タンパク質を、MUS1.1細胞で発現させ
たところ、細胞質蛍光の拡散に加えて、トランスフェクションから２〜４時間後
に、γチューブリン染色と同時局在した緑色蛍光の１または２つの焦点が認めら
れた（図７）。Hela細胞のトランスフェクションでも同じ結果が得られた（図示
せず）。これらの試験結果とは対照的に、GFPだけでトランスフェクションした
細胞は、中心体に緑色蛍光の焦点をまったく現さなかった（図示せず）。p80 WD
40-GFPの発現をさらに長くした（８〜24時間）ところ、緑色蛍光の、サイズが不
均質な明るい多数の焦点が出現したが、これらは、γチューブリンとは同時局在
せず、後に、直径が数μｍの充実した凝集塊を観測した（図示せず）。これらの
結果から、ヒトp80カタニンのWD40リピートは、GFPを中心体にターゲッティング
するのに十分であることがわかり、また、中心体結合部位が飽和すると、追加の
融合タンパク質が、細胞質で凝集すると考えられる。
【０１３５】考察 カタニンは、ATP加水分解を、微小管格子からのチューブリンサブユニットの
解離に結びつける唯一の酵素である（McNallyおよびVale（1993）Cell、75：419
〜429）。モータータンパク質キネシンおよびダイニン以外に、カタニンは、唯
一の既知の微小管関連ATPアーゼである。この試験において、我々は、p60および
p80カタニンサブユニットの一次構造を測定し、微小管切断における両サブユニ
ットの役割と、酵素の細胞局在を調べた。
【０１３６】カタニン媒介微小管切断の作用機構 p60カタニンの配列分析から、これが、ATPアーゼのAAAファミリーの新規メン
バーであることが明らかになった。この知見から、p60が、天然のカタニン二量
体の既に報告されているATPアーゼ活性に関与していることが考えられる（McNal
lyおよびVale（1993）Cell、75：419〜429）。しかし、p60およびp80のいずれも
、タウ（ButnerおよびKirschner（1991）J. Cell Biol. 115：717〜730）もしく
はMAP1B（Nobleら（1989）J. Cell Biol. 109：3367〜3376）に認められるもの
のような同定可能な微小管結合配列を含んでいないため、配列情報だけに基いて
、いずれのサブユニットにも、カタニンの微小管結合および切断活性の原因を帰
することはできなかった。個別に、ならびに二量体として一緒に精製したp60お
よびp80サブユニットの活性を測定することにより、カタニンのp60サブユニット
がp80サブユニットの不在下で、微小管刺激ATPアーゼ活性および微小管切断活性
の両方を示すことをみいだした。p60は、微小管との機能的相互作用に必要なす
べての要素を有することから、微小管切断の機構に関する将来の構造機能研究は
、この単一サブユニットに焦点を絞ることができる。さらに、我々は、p60カタ
ニンが、リングを形成する可能性があり、その大きさおよび外観が、AAAタンパ
ク質NSFおよびp97について報告されたもの（Hansonら(1997)Cell 90：523〜535
）と類似することをみいだした。以下に述べるように、p60とその他のAAAタンパ
ク質との比較により、どのようにしてカタニンが微小管を分解するかについての
手掛かりが得られる。
【０１３７】 カタニンのATPアーゼ特性は、他のAAAファミリーメンバーとの類似および相違
の両方を示す。0.3ATP／カタニン／秒のカタニンの基底ATPアーゼ活性、ならび
に３ATP／カタニン／秒の最大微小管刺激速度は、p97の場合の１ATP／秒（Peter
sら（1992）J. Mol. Biol.、223：557〜571）および組換え体NSFの場合の0.08AT
P／秒（Morganら（1994）J. Biol. Chem. 269：29347〜29350）の値に匹敵する
。また、NSF ATPアーゼは、その標的タンパク質、α−またはγ−SNAPとの結合
時に、２倍刺激される（Morganら（1994）J. Biol. Chem. 269：29347〜29350）
。しかし、カタニンのATPアーゼ活性は、微小管による複雑な刺激を表示する。
低微小管濃度（＜２μM）で、ATPアーゼ活性は、微小管濃度が増加するにつれて
、増加するが、微小管濃度がより高くなると、ATPアーゼ活性は、基底レベル付
近に達するまで、減少する。これに対し、微小管によるキネシンATPアーゼの刺
激（Gilbertら（1993）Biochemistry 32：4677〜4684）は、典型的な双曲線を表
示し、飽和に達する。
【０１３８】 カタニンの異常なATPアーゼ挙動の理由として、少なくとも２つの説明が考え
られる。一つは、カタニンが２つの部位で微小管に結合し、架橋により局部的に
微小管濃度を上昇させ、これによって、カタニンのATPアーゼ活性を刺激すると
いうものである。しかし、微小管濃度が高くなると、微小管に対するカタニンの
比が低下し、その結果、架橋網が減少し、ATPアーゼ活性の刺激も減少する。こ
の考えを支持するものとして、カタニンによる微小管の集束が顕微鏡法で観測さ
れている（未公表の観測結果）。この挙動は、別の細胞骨格ポリマー刺激ATPア
ーゼである、アカントアメーバ・ミオシンＩに認めらており、これは二つの別個
のアクチン結合部位：低親和性触媒部位と、触媒作用に関与しない高親和性部位
とを有する（Lynchら（1986）J. Biol. Chem.261：17156〜17162）。
【０１３９】 カタニンの複雑な酵素挙動の理由についての第２の説明は、カタニンがリング
状にオリゴマー化することである。ロータリーシャドーイングＥＭ画像では、カ
タニン調製物に、リング状のオリゴマー構造物が認められる。しかし、天然（Mc
NallyおよびVale（1993）Cell、75：419〜429）および組換え体カタニン（デー
タは図示せず）の両方を用いた流体力学実験では、このタンパク質の大部分が単
量体であると考えられる。ある仮説によると、微小管が、p60-p60オリゴマー化
を促進し、微小管で、さらに高次構造へとp60単量体が集合することにより、ATP
アーゼ活性が刺激される。この考えによれば、微小管濃度が低い場合、p60単量
体は、微小管上で、隣接する者同士が一層結合しやすくなるため、多量体化（mu
ltimerization）が促進される。これに対し、微小管濃度が高い場合には、格子
上で、p60単量体を非連続部位に封鎖することにより、p60の集合が阻害されるだ
ろう。また、リング状の自己集合については、GTPアーゼ活性のダイナミンの二
相刺激が原因として考えられている（TumaおよびCollins（1994）J. Biol. Chem
. 269：30842〜30847；Warnockら（1996）J. Biol. Chem. 271：22310〜22314）
。p60−微小管複合体の低温電子顕微鏡法研究により、この仮説を試験する手段
がもたらされている。
【０１４０】 他のAAAファミリーメンバーの研究に基づき、カタニンオリゴマー／リングが
、切断の機構に重要であることが証明されるであろう。様々な機能を切断するが
、多くのAAAタンパク質は、タンパク質複合体を分解するヌクレオチド依存性分
子シャペロンとして、共通の機能を共有すると思われる（ConfalonieriおよびDu
guet（1995）前掲）。最もよく研究されているAAAメンバーは、NSFであり、これ
はATPの加水分解後に、三元SNARE複合体に結合し、この分解を引き起こす（Hans
onら（1995）J. Biol. Chem. 270：16955〜16961；Hayashiら（1995）EMBO J. 1
4：2317〜2325）。この反応は、小胞融合および／または膜輸送経路における成
分の再循環のいずれかにおいて役割を果たしている。近年、電子顕微鏡法による
研究から、NSFリング構造が、ATP-γ-SおよびADP状態で、それぞれ、延長立体配
座および密集立体配座をとることがわかった（Hansonら（1997）Cell 90：523〜
535）。複数の箇所で、タンパク質複合体に結合した場合には、このトランジッ
ション（遷移）は、SNARE複合体の結合を切断する可能性がある（Hansonら（199
7）前掲）。カタニンもこれと同様に働くと思われる。カタニンの大きさのリン
グは、恐らく、微小管上の多数のチューブリン部位に接触し、ATP加水分解中の
構造変化が、チューブリン結合部位の位置を互いに対してシフトさせ、これによ
って、微小管格子を破壊すると考えられる。この他に、カタニンが、アクチン切
断タンパク質のATP調節型のように作用する可能性がある。これらの調節型は、
ポリマー内のタンパク質−タンパク質界面での部位を獲得しようと競合すると考
えられている。このタイプの機構では、AAAドメインが、ATPアーゼサイクル中の
特定の段階で、チューブリン−チューブリン界面と堅く結合し、これらを破壊す
るATP依存性タンパク質クランプとして働く。
【０１４１】カタニンの中心体へのターゲッティング 我々の研究から、p80は、カタニンの酵素的作用機構の主要な要素を構成しな
いことがわかった。微小管切断活動にp80を必要としないという研究結果は、p60
のすべてが、ウニの細胞質ゾルからのp80と共に免疫沈降する（未公表の観測結
果）ことから、いくらか意外であった。しかし、ここに記載した実験から、カタ
ニンをin vivoで中心体にターゲッティングするp80の役割が明らかになった。こ
の結論は、p80のWD40ドメインが、GFPを、培養したヒト細胞系の中心体にターゲ
ッティングすることができるという研究結果に基づくものである。WD40ドメイン
は、内在性p80と二量体形成することができないため、中心体の局在は、WD40ド
メインと、１つ以上の滞留中心体タンパク質との直接相互作用によるものに違い
ない。WD40ドメインは、トランスデューシンおよびＧiのβサブユニットについ
て初めに測定したように、保存されたβプロペラ構造をしていると考えられる（
Wallら（1995）Cell 83：1047−1058；Sondekら（1996）Nature 379：369〜374
）。しかし、各WD40ドメインは、非常に特異的な異好性タンパク質相互作用を示
す。Ｇiのβサブユニット中の露出された残基は、αサブユニットと相互作用す
る（Wallら（1995）前掲）のに対し、WD40転写因子TUP1における対応残基は、第
二転写因子α２への結合を媒介する（KomachiおよびJohnson（1997）Mol. Cell.
Biol. 17：6023〜6028）。Ｇタンパク質βサブユニットが、多数のパートナー
タンパク質と相互作用することから（Wallら（1995）Cell 83：1047−1058；Gau
detら（1996）Cell、87：577〜588）、p80カタニンWD40ドメインは、2以上のタ
ンパク質とin vivoで相互作用できることも考えられる。p80は、WD40モチーフを
有する唯一の既知中心体タンパク質である。カタニンが、中心体の局在に当てら
れるサブユニット全体を有し、このサブユニットが、哺乳動物と棘皮動物の間で
保存されているという研究結果から、中心体でのカタニンの重要な役割が考えら
れる。
【０１４２】 中心体ターゲッティングドメインは、ショウジョウバエタンパク質CP190につ
いて定義されているが、p80カタニンのWD40ドメインは、タンパク質を哺乳動物
の中心体にターゲッティングする構造モチーフの第１例を呈示する（Oegemaら（
1995）J. Cell Biol. 131：1261〜1273）。これは、カタニンの定着に関与する
中心体構成成分を同定する機会を提供する。中心体へのカタニンのドッキングに
関するさらに詳細な情報が、この細胞小器官での微小管分解におけるカタニンの
役割に関する手掛かりを提供するかもしれない。
【０１４３】実験手順 ペプチドのマイクロシークエンシング 20μmセラミックヒドロキシアパタイトビーズ（American International Chem
ical、Natick、MA）でパッキングしたファルマシア（Pharmacia）HR10／30カラ
ムを用いて、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施した以外は、前述
（McNallyおよびVale（1993）Cell、75：419〜429）とほぼ同様に、S. purpurat
usの卵の抽出物から、カタニンを精製した。前述（Iwamatsu（1992）Electropho
resis 13：142〜147）と同様に、p60およびp80サブユニットの内部ペプチド配列
を天然ウニカタニンから得た。また、更に２つのp80ペプチドDASMMAMおよびIQGL
Rも取得した。
【０１４４】p60クローニング p60サブユニット（アミノ酸214-374に対応する）の400bpの断片をコードする
ｃＤＮＡを、変性オリゴヌクレオチドによるプライマーシフトPCRを用いて、S.
purpuratusの第１鎖cDNAからクローニングした。次に、この断片を用いて、S. p
urpuratusの未受精卵mRNAからハイブリダイゼーションによって作製したλZAP-
発現cDNAライブラリーをスクリーニングした。数個の独立した陽性クローンを単
離した。１つのクローンを完全に配列決定した（GENBANK受託番号：AF052191）
。
【０１４５】p80クローニング p80カタニンに特異的な抗体、抗p81aff（McNallyら（1996）J. Cell Sci. 109
：561〜567）を用いて、S. purpuratusの未受精卵cDNAライブラリー（Wrightら
（1991）J. Cell Biol. 113：817〜833）をスクリーニングすることにより、p80
カタニンの最初の部分cDNAクローンを取得した。最初のクローンの挿入断片を用
いて、プラークハイブリダイゼーションにより、同じライブラリーから、さらに
長いcDNAクローン（pFM18）を単離した。pFM18配列に由来するプライマーを用い
た固着−連結PCR（ApteおよびSiebert（1993）Biotechniques15：890〜893）、
ならびに、鋳型としてS. purpuratusの未受精卵mRNAを用いた逆転写反応により
、p80カタニンの5'末端をコードするcDNAクローン（pFM23）を取得した。共通の
BstX1部位でpFM18およびpFM23の挿入断片を結合することにより、完全長p80cDNA
（GENBANK受託番号：AF052433）を生成した。
【０１４６】 p80配列によるGENBANKのBLAST検索から、取得し、配列決定したヒト乳児脳cDN
A（GENBANK受託番号：T16102）との相同性が明らかになった。T16102クローンか
ら得た配列を用いて、HT1080（ヒト線維肉腫）の全RNAからの3'RACEにより、多
数の3'末端cDNAクローンを取得した。ヒト成人海馬のcDNAライブラリー（Strata
gene,Inc）からのPCR増幅により、翻訳開始部位を含む重複cDNAクローン（pFM54
）を取得した。HT1080の全RNAまたは海馬ライブラリーからPCR増幅した部分cDNA
の配列分析は、推定アミノ酸配列が98％以上同じであった。ヒトp80カタニンの
完全なDNA配列は、GENBANKから入手することができる（受託番号：AF052432）。
【０１４７】抗体生成および免疫沈降 完全長S. purpuratus p60 cDNAをコードする配列をpMAL-C2（New England Bio
labs）に挿入し、大腸菌において、マルトース結合タンパク質とのＣ末端融合物
として発現させた。可溶性MBP-p60融合タンパク質をアミロースアフィニティカ
ラムで精製し、マルトースで溶離した後、ウサギに注射した（BABCOによる抗血
清生成物、バークレイ、CA）。他のAAAメンバーと反応しないp60特異的抗体を選
択するために、p60のＮ末端非AAAドメインを認識する抗体を、MBPと融合させたp
60のＮ末端残基1-152と結合したAffi-Gelカラムで、アフィニティ精製した（Har
lowおよびLane（1988）、Antibodies：A Laboratory Manual（ColdSpring Harbo
r、NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press））。このようにした得ら
れたアフィニティ精製抗体は、S. purpuratus未受精卵抽出物のイムノブロット
において、単一の60kDaポリペプチドを認識した。
【０１４８】 ヒトp80カタニンに対する特異的抗体を調製するために、完全長ヒトp80cDNAを
、BamH1-XhoI断片として、大腸菌発現ベクターpET-28a+（Novagen）に連結した
。該タンパク質が発現され、続いてニッケルキレートクロマトグラフィーのヒス
チジン結合樹脂（Novagen）上で、8Mのウレアの変性状態で精製した。SDS-PAGE
で分析したヒトp80カタニンを含有するポリアクリルアミド切片で、ウサギを免
疫した。得られた血清を、CNBrセファロースに結合した、細菌で発現させたヒト
p80カタニンを用いて、アフィニティ精製した。このようにしてアフィニティ精
製した抗体は、SDS-可溶化Hela細胞のイムノブロットにおいて、単一の80kDaの
ポリペプチドを認識した（データは示さない）。
【０１４９】 免疫沈降を用いて、バキュロウイルスで発現されたS. purpuratusのp60および
p80の会合を証明するために、20mMのジメチルピミリデート（dimethylpimilidat
e）を用いて、アフィニティ精製抗p60抗体を、プロテインAセファロースに共有
結合で架橋した（HarlowおよびLane（1988）前掲）。TBSTで平衡化した後、１〜
２mg／mlのダイズトリプシンインヒビター（SBTI）を含有するTBSTで希釈したカ
タニンサンプルに、20〜40：１の抗体ビーズを添加した。免疫沈降物を４℃で１
〜２時間インキュベートし、１mlの氷冷TBSTで５回洗浄した後、SDS含有サンプ
ルバッファーで溶離した。
【０１５０】カタニンのバキュロウイルス発現および精製 Bac-to-Bac（商標）バキュロウイルス発現系(Life Technologies）、すなわち
市販されている組換えバキュロウイルスを作製するための部位特異的転位系（Lu
ckowら（1993）J. Virology 67：4566〜4579）を用いて、カタニンサブユニット
を発現させた。p60およびp80のcDNAコード配列をそれぞれPCR増幅し（Expandポ
リメラーゼ、Boehringer Mannheim）、続いて別々にpFastBac HTにサブクローニ
ングしたところ、p80およびp60のＮ末端と、6xHis Ni2+結合配列との融合物が得
られた。導入ベクターpDualに、完全なp60-FastBac HTおよびp80-FastBac HTコ
ード領域をクローニングすることにより、p60-p80同時発現ウイルスを作製した
。Life Technologiesのプロトコルに従い、組換えバキュロウイルスを作製した
。
【０１５１】 振とう培養法（Weissら（1995）、バキュロウイルス発現プロトコルのPp.79〜
85、C.D.Richardson編、 Totowa、NewJersey：Humana Press Inc.）を用いて、
100X抗生物質／0.5Xまでの抗真菌剤（Life Technologies）を補充したSFM-900II
SFM（Life Technologies）中で、Sf9細胞を増殖させた。カタニンサブユニット
の発現は、200〜300mlの培地を含む11個のフラスコ中で、0.5〜1.0pfu／細胞の
感染多重度を用いて、実施した。低速の遠心分離により、感染から約72時間後に
細胞を回収し、溶解バッファー（50mM Tris pH8.5、300mM NaCl、2mM MgCl2、20
mMイミダゾール、10mM 2-メルカプトエタノール、１mM ATP、１μg/mlペプスタ
チン、１μg/mlロイペプシン、１μg/mlアプロチニン）中に再懸濁した後、液体
窒素で凍結し、−80℃で保存した。
【０１５２】 発現したサブユニットを精製するため、凍結細胞を解凍し、Bio-Neb細胞破砕
器(Cell Disrupter)［100psiヘリウム、13ｌ／分］に２回通過させることにより
、DNAを剪断した。細胞屑を遠心分離（40,000ｇで、45分間）により除去した。
サブユニットを、Ni2+-NTAスーパーフロー（Superflow）(QIAGEN）にバッチごと
に結合させ、洗浄し［20mM Tris pH8.0、１M NaCl、2mM MgCl2、40mMイミダゾー
ル、0.02％トリトンX-100、10mM 2-メルカプトエタノール、0.5mM ATP］、溶離
した［20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、150mMイミダゾール、2mM MgCl2、0.02％
トリトンX-100、10mM 2-メルカプトエタノール、100□M ATP］後、液体窒素で凍
結した。アニオン交換クロマトグラフィーにより更に精製を何度か実施した。市
販のブラッドフォード試薬（Bio-Rad）、あるいは、CCD画像化システム（Foto/A
nalyst,Fotodyne）での画像捕獲後にNIH-IMAGEを用いるクーマシー染色SDS-PAGE
ゲルのデンシトメトリー分析のいずれかを用いて、BSA標準との比較により、カ
タニン濃度を評価した。
【０１５３】電子顕微鏡による画像化 タンパク質を雲母に吸着させ、凍結乾燥した後、確立された手順（Heuser（19
89）J. Electron Microsc. Technique 13：244〜263；Heuser（1983）J. Mol. B
iol. 169：155〜195）に従い、プラチナレプリカを行った。サンプルの作製およ
び画像化は、雲母片を、10mM K-HEPES（pH7.5）、２mM MgCl2、１mMヌクレオチ
ド（ATPまたはATP-γ-S）から成るバッファーで洗浄する以外は、NSF（Hansonら
（1997）Cell90：523〜535）の画像化で用いたものと同様にした。アドビフォト
ショップ(Adobe Photoshop)を用いて、画像を処理し、300,000Xで表示した。
【０１５４】ATPアーゼアッセイ 変更を加えたマラカイトグリーン法（Kodamaら（1986）J. Biochem. 99：1465
〜1472）により、ATPアーゼ活性を測定した。ダイズトリプシンインヒビター（S
BTI）は、バックグラウンドのリン酸汚染を増加させたため、担体タンパク質と
して、SBTIの代わりに、BSAを使用した以外は、天然カタニンのATPアーゼ活性を
測定するのに既に用いられているバッファー［20mM K-HEPESpH8.0、25mM K-グル
タミン酸塩、 2mM MgCl2、10％グリセロール（v/v）、0.02％トリトンX-100（w/
v）、１mg/ml BSA］（McNallyおよびVale（1993）Cell 75：419〜429）において
、50〜100μLのATPアーゼ反応を実施した。0.5〜1.0mMホスホエノールピルビン
酸および2Uのピルビン酸キナーゼから成るATP再生系を導入して、天然カタニン
について認められているADPによる抑制を最小限にする（McNallyおよびVale（19
93）Cell 75：419〜429）。ウシの脳チューブリンから、微小管を作製した（Hym
anら（1990）Meth. Enzymol. 196：303〜319；WilliamsおよびLee（1982）Meth.
Enzymol. 85B：376〜385）。集合の後、微小管を沈降させ（230,000xg；10分）
、BSAが欠如したATPアーゼバッファー中に再懸濁させ、27ゲージニードル(gauge
needle）に繰り返し通過させることにより、ポリマーを再懸濁させた。分子量1
10kDaと、吸光係数1.03ml*mg-1*cm-1を用いて、６MグアニジンHCl中で、275nmで
吸光度を測定することにより、微小管の濃度を測定した(Hackney（1988）Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、85：6314〜6318）。ATPアーゼ反応を、室温で実施し、
カタニンの添加により開始した。
【０１５５】切断アッセイ 既に公表された手順（McNallyおよびVale（1993）Cell 75：419〜429）に従い
、顕微鏡による切断アッセイを実施した。ただし、微小管に強力に結合するが、
ATPを加水分解することはできない、細菌により発現させたキネシン突然変異体
（K560、G234A突然変異体；R.ValeおよびE.Taylor、未公表の結果）で、最初に
、フローセルを潅流することにより、微小管を固定化した。グルコースオキシダ
ーゼ（220μg／ml）、カタラーゼ（36μg／ml）、グルコース（22.5mM）、およ
び2-メルカプトエタノール（71.5mM）から成る酸素スカベンジャーシステムを用
いて、20mM Hepes（pH7.5）、２mM MgCl2、１mM ATPにおいて、アッセイを実施
した。冷却した、低速走査CCD（Photometerics）で画像を捕らえ、アドビフォト
ショップを用いて処理した。
【０１５６】 蛍光強度の変化が、添加したチューブリンポリマーの量に関して直線をなすと
いう条件を用いて、DAPI切断アッセイを実施した（Heuseleら(1987)Eur. J. Bio
chem. 165：613〜620）。２μMの微小管を含む切断反応物（前記と同様、重合し
た後、ATPアーゼバッファー中に再懸濁した）を、１mMのATP、10mMのホスホエノ
ールピルビン酸、250μg／mlのピルビン酸キナーゼ（Boehringer Mannheim）、
ならびに１mM／mlのBSAと共に、10μMのDAPIでインキュベートした。反応容量は
80μLであった。光子計数型の8100型蛍光計（SLM Instruments）を用いて、370n
mで励起し、450nmでの発光を測定することにより、蛍光強度を測定した。
【０１５７】in vitro翻訳共免疫沈降 in vitroで翻訳されたp60およびp80の非放射性検出を容易にするため、各cDNA
をベクターpCITE-4a+（Novagen）に連結し、タンパク質が、37アミノ酸Ｎ末端Ｓ
タグを有するフレームで翻訳されるようにする。プラスミドDNAからのタンパク
質の直接in vitro合成は、シングルチューブタンパク質システム（Single Tube
Protein System）2, T7（Novagen）を用いて、達成した。共免疫沈降アッセイの
ために、p60およびp80構築物は、通常、同時発現させた。しかし、これら構築物
を別々に発現させた後、室温で一緒に30分間インキュベートしても、結果は同じ
であった。免疫沈降のために、溶解物をPansorbin（Calbiochem）−抗体複合体
と共に、氷上でインキュベートし、NETバッファー（50mM Tris-Cl(pH7.5)、150m
M NaCl、0.1％Nonidet P-40、１mM EDTA（pH8.0）、0.25％ゼラチン、0.02％ア
ジ化ナトリウム）で洗浄した後、SDS-PAGEサンプルバッファー中に再懸濁させた
。免疫沈降物からのペレットおよび上澄みの両方のin vitro翻訳産物をSDS-PAGE
により分析し、ニトルセルロースに移し、Sタンパク質HRPコンジュゲート（Nova
gen）でプロービングした後、化学発光により検出した。
【０１５８】細胞培養、トランスフェクション、ならびに、免疫蛍光 Hela細胞に、ヒトp80 WD40-GFP融合タンパク質の一過性発現を起こすために、
推定翻訳開始点に、BamH1部位とコザックのコンセンサスを配置し、アミノ酸263
のコドンの後にEcoR1部位を配置して、PCR増幅により、ヒトp80カタニンのアミ
ノ酸1-263を含有するDNA断片を生成した。このBamH1-EcoR1断片をGFP融合ベクタ
ーpEGFP-N1（Clontech）に連結した。
【０１５９】 10％仔ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したオプチメン
（Optimem）培地（Life Technologies）中の18mmのカバーガラス上で、MSU1.1お
よびHela細胞の両方を増殖させた。２時間スーパーフェクト試薬(Superfect Rea
gent)（Qiagen）を用いて、プラスミドをトランスフェクトした後、上記カバー
ガラスをPBSで洗浄し、37℃および５％CO2の条件下で、新鮮な培地に１〜24時間
放置した。
【０１６０】 ヒトp80カタニン抗体もしくはγチューブリン抗体、モノクローナルGTU88（Si
gma Chemical）を含むGFP蛍光および免疫蛍光の画像化のために、カバーガラス
上の細胞を−20℃のメタノール中、または、22℃で、0.5XPBS、3.7％ホルムアル
デヒド、75％メタノール中のいずれかで10分間固定した後、TBST中で再水和させ
る。抗体の標識は、４％BSAを含有するTBST中で実施する。ニコンマイクロフォ
ト(Nikon Microphoto)SA顕微鏡、100x Plan Fluor 1.3対物レンズ、Photometric
s QuantixカメラおよびIP Lab Spectrumソフトウエア（Scanalytics）で画像を
捕らえた。
【０１６１】 本明細書に記載した実施例および実施形態は、説明を目的とするものであり、
これらに関する様々な改良または変更は、当業者には明らかであり、かつ、本出
願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解さ
れよう。本明細書で引用したすべての出版物、特許、ならびに特許出願は、参照
として、あらゆる目的のためにその全文を本書に組み込むものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1Aおよび１Bはp60カタニンの配列分析を示す。図1AはS.purpuratusカタニン
のp60サブユニット（GENBANK AF052191)の推定タンパク質配列である。直接ペプ
チドマイクロ配列決定によって得られた配列に下線を付す。推定ペプチド配列と
直接配列決定によって得られた配列との間の違いを、２重下線によって示す（S9
5はF、H99はP、そしてP138はTとされていた）。ウォーカーA（Pループ）モチー
フに陰影を付す。図１Bはp60 AAAドメインとAAAメンバーである mei-1（C.elega
ns, GenBank L25423)、Sug1p（S.cerevisiae, GenBank X66400)、ftsH（大腸菌
、GenBank M83138)、Pas1p（S.cerevisiae, GenBank M58676)およびNSF（C.long
icaudatus, GenBank X15652)とのアミノ酸配列アライメントである。一致した残
基に黒の陰影を付ける。示したメンバーの60%以上で保存されている残基に灰色
の陰影を付ける。左側の数字は対応する配列におけるアミノ酸残基を示す。アラ
イメントはPILEUP（Genetics Computer Group)を用いて実施し、MACBOXSHADEを
用いて出力されたものに陰影を付した。
【図２】 図2Aおよび２Bはp80カタニンの配列分析を示す。図２AはS.purpuratusカタニ
ンのp80サブユニット（GENBANK AF052433)の推定タンパク質配列である。直接ペ
プチドマイクロ配列決定によって得られた配列に下線を付す。推定ペプチド配列
と直接配列決定によって得られた配列との間の違い、または2つの異なるp80 cDN
Aクローン間に見られる違いを、２重下線によって示す。図２Bはp80のWD40リピ
ート領域と、推定のp80ヒトオーソログ体（Hs p80,GenBank AF052432)、TFIID（
Homo sapiens, GenBank U80191)、および推定のセリン/スレオニンキナーゼPkwA
（Thermomonospora curvata, GenBank P49695)とのアミノ酸配列アライメントで
ある。一致した残基に黒の陰影を付ける。少なくとも2種の配列に見られる残基
に灰色の陰影を付ける。左側の数字は対応する配列におけるアミノ酸残基を示す
。アライメントはPILEUP（Genetics Computer Group)を用いて実施し、MACBOXSH
ADEを用いて出力されたものに陰影を付した。
【図３】 図３は組換えカタニンサブユニットの発現および精製の結果を図示する。パネ
ルAは発現したカタニンサブユニットのクーマシー(coomassie)染色SDS-PAGE分析
を示す。実験手順に記載したように、6 x Hisでタグ付けしたカタニンサブユニ
ットを、Ni2+-NTA Superflowに結合させ、続いてイミダゾールで溶出させること
によってバキュロウイルス感染昆虫細胞の溶解物から精製した。細胞はp60ウイ
ルスを単独で、p80ウイルスを単独で感染させるか、または等量のp60ウイルスお
よびp80ウイルスを同時感染させた。パネルBは、プロテインAアガロースに架橋
させたアフィニティー精製p60抗体を用いて、p60およびp80を発現するバキュロ
ウイルスを同時感染させた昆虫細胞の抽出物について実施した免疫沈降を示す。
樹脂に結合したタンパク質をSDS-PAGEで分析し、クーマシーで染色した。この免
疫沈降は、バキュロウイルス-発現p60およびp80が等しい化学量論で複合体を形
成することを示す。
【図４】 図4は、ロータリーシャドーイング（rotary-shadowing）電子顕微鏡によって
可視化したカタニンの構造を示す。パネルAは、組換えp60の調製物中に観察され
た直径14〜16nmの環状構造を示す。パネルBは、組換えp80の単一粒子を示し、時
折凝集が見られる（右端の写真）が、環状構造は観察されない。パネルCおよび
４Dは組換えp60/p80調製物中に観察された異なる環状構造を示す。パネルCはp80
に似た輪上粒子によって囲まれた中央に位置するp60様環状構造からなる「広が
った（splayed)」複合体を示す。パネルDでは、直径20nmの完全な環状構造が鮮
明な輪郭で見られ、それらが雲母表面から10nmより上方に存在することを示唆し
ている。すべての画像は300,000Xで示されている。上述の寸法には、典型的には
タンパク質表面に2nmの材料を付加するプラチナシャドーイングが含まれる。
【図５】 図５A、５Bおよび５Cは組換えカタニンサブユニットの活性を図示する。図５A
は、実験手順において記載するように、種々の微小管濃度において測定した0.04
μMのp60カタニン（四角）および同時発現したp60/p80（円形）のATPアーゼ活性
を示す。p60カタニンおよびp60/p80の双方は類似のパターンの微小管刺激性を示
し、p60カタニンはp60/p80の最大刺激ATPアーゼ活性の約半分の活性を有する。
右上の挿入図は、低い（0〜2μM)微小管濃度でのATPアーゼ活性の刺激作用を示
す。図5Bは、組換えカタニンサブユニットの微小管切断活性を示す。タキソール
で安定化し、ローダミンで標識した微小管を顕微鏡灌流チャンバーの表面上に吸
着させ、続いて組換えカタニンサブユニットを導入する。p60/p80(0.1μM)、p60
(0.1μM)またはp80(0.5μM)を注いだあとに経過した時間を示す。組換え同時発
現p60/p80およびp60は、微小管を切断しバラバラにすることができるが、p80は
できない。スケールバー、10μm。図5Cは、DAPI蛍光アッセイを用いた微小管分
解の定量測定を示す。MTはタンパク質を加えていない微小管（２μM)を示し、チ
ューブリンは氷上で1.5時間、10mMのCaCl２で処理して脱重合された微小管を示
す。p60カタニンおよびp60/p80を0.2μMの濃度で添加し、蛍光の変化をタンパク
質添加後の時間の関数として示す。p80は、蛍光の変化を引き起こさず、微小管
単独について示された結果と異なっていた。
【図６】 図６は、p80カタニンのWD40リピートがp60カタニンとの相互作用において必要
でないことを示す。エピトープでタグを付したp60およびp80の誘導体をin vitro
で転写-翻訳を組合せた反応において合成した。p60および相互作用するタンパク
質をp60に特異的な抗体で免疫沈降し、得られた免疫沈降物をSDS-PAGEで分析し
、ニトロセルロースにブロットした。in vitroで翻訳されたタンパク質を、実験
手順に記載のように、化学発光によって検出した。レーン1：分子量標準Mr：100
,000、75,000、50,000、35,000、および25,000；レーン2：全長p80とともに同時
翻訳されたp60；レーン３：p80のΔ560〜690誘導体と同時翻訳されたp60；レー
ン４：p80のΔ1〜302誘導体と同時翻訳されたp60；レーン5：p80のΔ303〜690誘
導体と同時翻訳されたp60。p80の欠失誘導体それぞれの構造を右側に示す。Δ56
0〜690およびΔ303〜690翻訳産物が、免疫沈降物の上澄中で検出された（データ
示さず）。
【図７】 図７は、ヒトp80カタニンおよびヒトp80 WD40ドメインとGFPとの融合タンパク
質は、MSU1.1ヒト線維芽細胞の中心体にあるγ-チューブリンと共局在化するこ
とを示す。パネルAおよびパネルB：ヒトp80カタニン特異的抗体（図７A)および
γ-チューブリン特異的抗体（パネルB）による免疫蛍光染色の共局在化。パネル
C〜Fは、γ-チューブリン特異的抗体（パネルDおよびパネルF)による染色をとも
なうGFP蛍光（パネルCおよびパネルE)の共局在化を示す。二つの中心体への共局
在化がパネルCおよびパネルDに見られ、一方、単一の中心体への共局在化がパネ
ルEおよびパネルFに見られる。パネルEに見られる、パネルCと比較して明らかに
高い原形質緑色蛍光のバックグラウンドは、表示装置の人為要素でる。パネルC
中の中心体の蛍光強度は、パネルE中の中心体のものより少なくとも5倍強い。p8
0抗体をOregon Green 488第2抗体で検出し、γ-チューブリン抗体をTexas Red-X
第2抗体で検出した。蛍光シグナルをフルオレセインおよびTexas Redフィルター
セット（Chroma Technologies)を用いて分離した。バー＝14μm。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ハートマン、ジェームズ、ジェイ． アメリカ合衆国 94110 カリフォルニア 州、サンフランシスコ、ガイサー コート ３ Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 DA06 EA01 FA02 FA03 LA03 LA04 NA05 2G045 AA40 BB25 DA20 DA36 DA77 FA05 FB01 FB03 FB07 FB11 FB12 GC15 HA16

Claims (59)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微小管の脱重合をモジュレートする薬剤を同定する方法であ
    って、次のステップ： (i) 重合微小管と微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質とを、
    ATPまたはGTPおよび該薬剤の存在下で接触させること、および (ii)チューブリンの単量体、二量体またはオリゴマーの形成を検出すること、
    を含んでなり、その際、チューブリンの単量体、二量体またはオリゴマーの形成
    は、該薬剤が微小管の脱重合をモジュレートすることを示すものである、上記方
    法。
  2. 【請求項２】 重合微小管がDAPIで標識されている、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記検出が蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)により行なわれる
    、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記検出が標識した微小管の蛍光の変化を検出することを含
    む、請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 チューブリン単量体が存在する場合は、前記検出がチューブ
    リン単量体を遠心分離することを含む、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記微小管が、パクリタキセル、パクリタキセル類似体およ
    び非加水分解性ヌクレオチドGTP類似体からなる群より選択される作用剤との接
    触により安定化される、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記微小管が固相表面に結合されている、請求項１記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 前記微小管が、不活性化微小管モータータンパク質、アビジ
    ン−ビオチン結合、抗チューブリン抗体、微小管結合タンパク質(MAP)およびポ
    リリシンからなる群より選択される作用剤との結合により前記表面に結合されて
    いる、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質がカタ
    ニン、カタニンのp60サブユニット、XKCM1およびOP18ポリペプチドからなる群よ
    り選択される、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 微小管切断タンパク質がカタニンまたはカタニンのp60サ
    ブユニットである、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 カタニンのp60サブユニットが請求項26記載のポリペプチ
    ドである、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記p60サブユニットが配列番号１のアミノ酸配列を有す
    るポリペプチドである、請求項10記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記方法が多数の反応混合物を含むアレイで行なわれ、各
    反応混合物が該アレイの別個の識別可能なドメインを構成しており、前記ステッ
    プが各反応混合物において行なわれる、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記アレイがマイクロタイタープレートからなる、請求項
    13記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記アレイが少なくとも48の反応混合物を含む、請求項13
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記薬剤が複数の薬剤のうちの１つであり、各反応混合物
    が該複数の薬剤のうちの１つの薬剤を含む、請求項13記載の方法。
  17. 【請求項１７】 微小管系の脱重合または切断をモジュレートする治療用リ
    ード化合物を同定する方法であって、次のステップ： i) カタニンp60サブユニットおよび微小管を含むアッセイ混合物を準備する
    こと、 ii) 該アッセイ混合物を、該p60サブユニットの微小管切断活性またはATPアー
    ゼ活性を抑制または増強する能力についてスクリーニングすべき試験化合物と接
    触させること、および iii)該試験化合物の該p60サブユニットへの特異的結合または該p60サブユニッ
    トのATPアーゼ活性の変化を検出すること、 を含んでなる、上記方法。
  18. 【請求項１８】 前記検出が検出試薬としてマラカイトグリーンを用いてAT
    Pアーゼ活性を検出することを含む、請求項17記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記p60サブユニットが標識されており、前記試験薬剤が
    固相支持体に結合されている、請求項17記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記試験薬剤が標識されており、前記p60サブユニットが
    固相支持体に結合されている、請求項17記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記微小管が、パクリタキセル、パクリタキセル類似体お
    よび非加水分解性ヌクレオチドGTP類似体からなる群より選択される作用剤との
    接触により安定化される、請求項17記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記方法が多数の反応混合物を含むアレイで行なわれ、各
    反応混合物が該アレイの別個の識別可能なドメインを構成しており、前記ステッ
    プが各反応混合物において行なわれる、請求項17記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記アレイがマイクロタイタープレートからなる、請求項
    22記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記アレイが少なくとも48の反応混合物を含む、請求項22
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記薬剤が複数の薬剤のうちの１つであり、各反応混合物
    が該複数の薬剤のうちの１つの薬剤を含む、請求項22記載の方法。
  26. 【請求項２６】 カタニンの単離されたp60サブユニットからなる微小管切
    断活性を有するポリペプチドであって、該p60サブユニットが配列番号１のアミ
    ノ酸配列をコードする核酸とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸
    によりコードされる、上記ポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 前記ポリペプチドが配列番号１のポリペプチドまたは保存
    的置換を有する配列番号１のポリペプチドである、請求項26記載のポリペプチド
    。
  28. 【請求項２８】 前記ポリペプチドが配列番号１に示される核酸によりコー
    ドされるポリペプチド配列からの少なくとも８個の連続したアミノ酸を含み、 該ポリペプチドは、抗原として提供される場合、配列番号１に示される核酸に
    よりコードされるポリペプチド配列と特異的に結合する抗体の産生をもたらし、
    かつ 該ポリペプチドは、配列番号１に示される核酸配列によりコードされるポリペ
    プチドに対して誘導された抗血清であるが、配列番号１に示される核酸配列によ
    りコードされるポリペプチドを用いて完全に免疫吸着されている該抗血清とは結
    合しない、 請求項26記載のポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 前記ポリペプチドが配列番号１のポリペプチドである、請
    求項26記載のポリペプチド。
  30. 【請求項３０】 微小管切断活性を有するカタニンp60サブユニットをコー
    ドし、配列番号１のポリペプチドをコードする核酸とストリンジェント条件下で
    特異的にハイブリダイズする核酸を含む、単離された核酸。
  31. 【請求項３１】 前記核酸が配列番号１のポリペプチドまたはその保存的置
    換体をコードする、請求項30記載の核酸。
  32. 【請求項３２】 プロモーターをさらに含む、請求項30記載の核酸。
  33. 【請求項３３】 前記プロモーターがバキュロウイルスプロモーターである
    、請求項32記載の核酸。
  34. 【請求項３４】 単離された微小管切断タンパク質または微小管脱重合タン
    パク質を含む１以上の容器からなる、微小管の脱重合をモジュレートする薬剤を
    スクリーニングするためのキット。
  35. 【請求項３５】 DAPIで標識した重合微小管をさらに含む、請求項34記載の
    キット。
  36. 【請求項３６】 前記微小管がパクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体
    との接触により安定化されている、請求項34記載のキット。
  37. 【請求項３７】 前記微小管が固相表面に結合されている、請求項36記載の
    キット。
  38. 【請求項３８】 前記微小管がモータータンパク質との結合により前記表面
    に結合されている、請求項37記載のキット。
  39. 【請求項３９】 微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質がカ
    タニン、カタニンのp60サブユニット、XKCM1およびOP18ポリペプチドからなる群
    より選択される、請求項34記載のキット。
  40. 【請求項４０】 微小管切断タンパク質がカタニンまたはカタニンのp60サ
    ブユニットである、請求項39記載のキット。
  41. 【請求項４１】 カタニンのp60サブユニットが請求項26記載のポリペプチ
    ドである、請求項34記載のキット。
  42. 【請求項４２】 微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質が固
    相表面に結合されている、請求項34記載のキット。
  43. 【請求項４３】 微小管の重合または脱重合もしくは切断を改変する薬剤を
    スクリーニングする方法であって、次のステップ： 標識チューブリンを準備すること、 標識チューブリンを該薬剤と接触させて接触済みチューブリンを得ること、 接触済みチューブリンの蛍光強度またはパターンを、該薬剤と接触していない
    標識チューブリンの蛍光強度またはパターンと比較すること、 を含んでなり、その際、接触済みチューブリンと非接触チューブリンとの蛍光強
    度またはパターンの差異は、該薬剤が微小管の重合または脱重合を改変すること
    を示すものである、上記方法。
  44. 【請求項４４】 標識チューブリンがチューブリン単量体、チューブリン二
    量体またはチューブリンオリゴマーの形態である、請求項43記載の方法。
  45. 【請求項４５】 標識チューブリンが微小管の形態である、請求項43記載の
    方法。
  46. 【請求項４６】 前記微小管が固相表面に結合されている、請求項45記載の
    方法。
  47. 【請求項４７】 前記標識がDAPI、ANS、Bis-ANS、ルテニウムレッド、クレ
    ゾールバイオレットおよびDCVJからなる群より選択される、請求項45記載の方法
    。
  48. 【請求項４８】 前記標識がDAPIである、請求項47記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記微小管が、不活性化微小管モータータンパク質、アビ
    ジン−ビオチン結合、抗チューブリン抗体、微小管結合タンパク質(MAP)、ポリ
    アルギニン、ポリヒスチジンおよびポリリシンからなる群より選択される作用剤
    との結合により前記表面に結合されている、請求項46記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記接触が前記チューブリンを微小管脱重合タンパク質ま
    たは微小管切断タンパク質と接触させることをさらに含む、請求項43記載の方法
    。
  51. 【請求項５１】 微小管切断タンパク質または微小管脱重合タンパク質がカ
    タニン、カタニンのp60サブユニット、XKCM1およびOP18ポリペプチドからなる群
    より選択される、請求項50記載の方法。
  52. 【請求項５２】 微小管切断タンパク質がカタニンまたはカタニンのp60サ
    ブユニットである、請求項51記載の方法。
  53. 【請求項５３】 カタニンのp60サブユニットが請求項26記載のポリペプチ
    ドである、請求項52記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記p60サブユニットが配列番号１のアミノ酸配列を有す
    るポリペプチドである、請求項52記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記方法が多数の反応混合物を含むアレイで行なわれ、各
    反応混合物が該アレイの別個の識別可能なドメインを構成しており、前記ステッ
    プが各反応混合物において行なわれる、請求項43記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記アレイがマイクロタイタープレートからなる、請求項
    55記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記アレイが少なくとも48の反応混合物を含む、請求項55
    記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記薬剤が複数の薬剤のうちの１つであり、各反応混合物
    が該複数の薬剤のうちの１つの薬剤を含む、請求項55記載の方法。
  59. 【請求項５９】 微小管の重合または脱重合もしくは切断を改変する薬剤を
    、細胞骨格系に作用する治療用リード化合物のデータベースに入れることをさら
    に含む、請求項43記載の方法。
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