JPWO2005095958A1 - 薬剤候補を同定するためのアッセイ法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維（ｆｉｂｒｉｌ）または凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法を提供する。さらに本発明は、当該同定方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。
Description
本発明は、細繊維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法に関する。
アミロイドβ（以下、Ａβともいう）を含む老人斑は、アルツハイマー病の病理像の一つである。
Ａβの低下は主要な治療対象だと思われる。
抗Ａβ抗体による免疫化後のアミロイド除去が報告されている。
最近のデータは、抗体がＡβの末梢溶出（ｓｉｎｋ）として働き、末梢／脳の動力学を変化させているかもしれないことを示している。
老人斑が消失したという事実は、Ａβ凝集過程が可逆的であることを意味している。
しかしながら今なお、可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出した証拠は存在しない。
ここで本発明者らは、インビトロで細線維の遠心分離に続く上清への移行（ｒｅｐｌａｃｅ）を分析する類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイを開発したものであり、可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出したことのみならず、超音波がＡβ溶出を促進したことを示すものである。
このインビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）ＡβアッセイにおいてＡβ溶出を促進する化合物あるいは超音波は、アルツハイマー病治療の可能性ある選択肢になり得るかもしれない。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳における老人斑の存在によって特徴付けられる、神経変性疾患である。
４０〜４２アミノ酸からなるペプチドのＡβは、老人斑の主成分である。
この疾患の遺伝性型は、アミロイド前駆タンパク（ＡＰＰ）およびプレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）遺伝子の変異に関連している。
これらの遺伝子における疾患に関連する変異は、老人斑において優勢に存在するＡβ（１−４２）産生の増加をもたらす。
最近、変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスへのＡβによる免疫付与が、プラーク沈着の抑制に効果的であることが示された。（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９９９年）
さらに、Ａβ抗体の単回投与後、プラークおよび神経病変の双方が可逆的であった。（Ｌｏｍｂａｒｄｏ，Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．２００３年）
Ａβ抗体に加え、Ａβ（ｇｅｌｓｏｌｉｎまたはＧＭ１）に高い親和性を有する薬剤による末梢治療は、脳内におけるＡβレベルを低下させた。（Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．２００３年）
抗体投与による末梢での溶出（ｓｉｎｋ）メカニズムの発現は、細胞外スペースへの異常タンパク蓄積により特徴付けられる多数の疾患の治療に有用であることが提案されている。（ＤｅＭａｔｔｏｓ，Ｂａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１年）
インビトロでの、Ａβ凝集過程については十分に研究されている。
しかしながら、凝集ＡβからＡβが溶出する反対の現象は、まだ研究されていなかった。
本研究においては、凝集ＡβからのＡβ溶出について検討するため、我々は新規なインビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイを開発した。
ここで、我々は可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出したことを示すものである。
さらに、超音波はＡβ溶出を促進した。
このインビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）ＡβアッセイにおいてＡβ溶出を促進した化合物および／または超音波は、アルツハイマー病治療の選択肢となり得るかもしれない。
ＷＯ９４／１０５６９公報（特表平８−５０２５８７号）には、患者においてβ−アミロイド・ペプチド（以下、βＡＰともいう）一関連症状を診断又はモニタリングする方法であって：患者サンプル中の可溶性βＡＰ又はβＡＰ断片の量を測定し；その測定値を所定量のβＡＰ又はβＡＰ断片と比較し；そして測定されたβＡＰ又はβＡＰ断片の量と所定のβＡＰ又はβＡＰ断片の量との間の差異に基づき患者の状態を評価することを含んで成る方法が開示されている。（請求項２３）
ＷＯ００／２６２３８公報（特表２００２−５３１０６５号）には、プリオンタンパク質のサンプルを提供し、試験試薬の存在下および不存在下で質的若しくは量的にβ形態の量を比較することを含む、β形態へのプリオンタンパク質の変換を予防、減少及び／または可逆化可能である試薬の同定方法が開示されている。（請求項５０）
ＷＯ００／４３７９１（特表２００２−５４０３８３号）公報には、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な種および神経変性疾病凝集体または原繊維形成を阻害する候補薬剤のための神経変性疾病凝集体または原繊維形成種を含むと考えられる１個のサンプルを含む溶液を作成することと、成分を前記溶液に移したり、容器から溶液を取り出したりせずに、神経変性疾病に特徴的な溶液中の凝集体を検出することより成る方法を開示している。（請求項１７２）
しかしながらこれらの先行技術は、多数のテスト化合物を評価するには、容易でない、迅速でない、信頼性が高くない、あるいは安価でない方法であった。
Ａβの低下は主要な治療対象だと思われる。
抗Ａβ抗体による免疫化後のアミロイド除去が報告されている。
最近のデータは、抗体がＡβの末梢溶出（ｓｉｎｋ）として働き、末梢／脳の動力学を変化させているかもしれないことを示している。
老人斑が消失したという事実は、Ａβ凝集過程が可逆的であることを意味している。
しかしながら今なお、可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出した証拠は存在しない。
ここで本発明者らは、インビトロで細線維の遠心分離に続く上清への移行（ｒｅｐｌａｃｅ）を分析する類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイを開発したものであり、可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出したことのみならず、超音波がＡβ溶出を促進したことを示すものである。
このインビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）ＡβアッセイにおいてＡβ溶出を促進する化合物あるいは超音波は、アルツハイマー病治療の可能性ある選択肢になり得るかもしれない。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳における老人斑の存在によって特徴付けられる、神経変性疾患である。
４０〜４２アミノ酸からなるペプチドのＡβは、老人斑の主成分である。
この疾患の遺伝性型は、アミロイド前駆タンパク（ＡＰＰ）およびプレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）遺伝子の変異に関連している。
これらの遺伝子における疾患に関連する変異は、老人斑において優勢に存在するＡβ（１−４２）産生の増加をもたらす。
最近、変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスへのＡβによる免疫付与が、プラーク沈着の抑制に効果的であることが示された。（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９９９年）
さらに、Ａβ抗体の単回投与後、プラークおよび神経病変の双方が可逆的であった。（Ｌｏｍｂａｒｄｏ，Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．２００３年）
Ａβ抗体に加え、Ａβ（ｇｅｌｓｏｌｉｎまたはＧＭ１）に高い親和性を有する薬剤による末梢治療は、脳内におけるＡβレベルを低下させた。（Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．２００３年）
抗体投与による末梢での溶出（ｓｉｎｋ）メカニズムの発現は、細胞外スペースへの異常タンパク蓄積により特徴付けられる多数の疾患の治療に有用であることが提案されている。（ＤｅＭａｔｔｏｓ，Ｂａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１年）
インビトロでの、Ａβ凝集過程については十分に研究されている。
しかしながら、凝集ＡβからＡβが溶出する反対の現象は、まだ研究されていなかった。
本研究においては、凝集ＡβからのＡβ溶出について検討するため、我々は新規なインビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイを開発した。
ここで、我々は可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出したことを示すものである。
さらに、超音波はＡβ溶出を促進した。
このインビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）ＡβアッセイにおいてＡβ溶出を促進した化合物および／または超音波は、アルツハイマー病治療の選択肢となり得るかもしれない。
ＷＯ９４／１０５６９公報（特表平８−５０２５８７号）には、患者においてβ−アミロイド・ペプチド（以下、βＡＰともいう）一関連症状を診断又はモニタリングする方法であって：患者サンプル中の可溶性βＡＰ又はβＡＰ断片の量を測定し；その測定値を所定量のβＡＰ又はβＡＰ断片と比較し；そして測定されたβＡＰ又はβＡＰ断片の量と所定のβＡＰ又はβＡＰ断片の量との間の差異に基づき患者の状態を評価することを含んで成る方法が開示されている。（請求項２３）
ＷＯ００／２６２３８公報（特表２００２−５３１０６５号）には、プリオンタンパク質のサンプルを提供し、試験試薬の存在下および不存在下で質的若しくは量的にβ形態の量を比較することを含む、β形態へのプリオンタンパク質の変換を予防、減少及び／または可逆化可能である試薬の同定方法が開示されている。（請求項５０）
ＷＯ００／４３７９１（特表２００２−５４０３８３号）公報には、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な種および神経変性疾病凝集体または原繊維形成を阻害する候補薬剤のための神経変性疾病凝集体または原繊維形成種を含むと考えられる１個のサンプルを含む溶液を作成することと、成分を前記溶液に移したり、容器から溶液を取り出したりせずに、神経変性疾病に特徴的な溶液中の凝集体を検出することより成る方法を開示している。（請求項１７２）
しかしながらこれらの先行技術は、多数のテスト化合物を評価するには、容易でない、迅速でない、信頼性が高くない、あるいは安価でない方法であった。
本発明者らは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いることができる薬剤候補を同定する方法を確立すべく、鋭意検討を重ねた。そして、Ａβ凝集過程が可逆的であることを知見し、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維（ｆｉｂｒｉｌ）または凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定できる方法を確立した。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維（ｆｉｂｒｉｌ）または凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
（２）薬剤候補が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いられるものである、上記（１）記載の方法。
（３）疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７、第１７番染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴った前頭側頭型痴呆）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、上記（１）または（２）記載の方法。
（４）細線維または凝集物がインビトロで形成されたものである、上記（１）ないし（３）いずれか記載の方法。
（５）平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、上記（１）ないし（４）いずれか記載の方法。
（６）超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、上記（１）ないし（５）いずれか記載の方法。
（７）超音波照射条件が、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２、デューティ比２０％、３０秒照射に続き１０秒休止の５回反復である、上記（１）ないし（６）いずれか記載の方法。
（８）被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性β−アミロイド（Ａβ）の溶媒中濃度を測定することにより、インビトロで凝集した細線維または凝集物からβ−アミロイド（Ａβ）を除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
（９）細線維または凝集物がＡβ（１−４０）からなる、上記（８）記載の方法。
（１０）細線維または凝集物がＡβ（１−４２）からなる、上記（８）記載の方法。
（１１）平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、上記（８）ないし（１０）いずれか記載の方法。
（１２）超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、上記（８）ないし（１１）いずれか記載の方法。
（１３）超音波照射条件が、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２、デューティ比２０％、３０秒照射に続き１０秒休止の５回反復である、上記（８）ないし（１２）いずれか記載の方法。
（１４）患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法。
（１５）疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７，進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、上記（１４）記載の方法。
（１６）上記（１）ないし（１３）いずれか記載の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。
（１７）デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。
（１８）上記（１）ないし（１３）いずれか記載の方法により得られる化合物を用いて、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出する溶出方法。
（１９）細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための、上記（１）ないし（１３）いずれか記載の方法により得られる化合物の使用。
（２０）ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置。
（２１）被験化合物の存在下、細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維（ｆｉｂｒｉｌ）または凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
（２）薬剤候補が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いられるものである、上記（１）記載の方法。
（３）疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７、第１７番染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴った前頭側頭型痴呆）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、上記（１）または（２）記載の方法。
（４）細線維または凝集物がインビトロで形成されたものである、上記（１）ないし（３）いずれか記載の方法。
（５）平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、上記（１）ないし（４）いずれか記載の方法。
（６）超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、上記（１）ないし（５）いずれか記載の方法。
（７）超音波照射条件が、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２、デューティ比２０％、３０秒照射に続き１０秒休止の５回反復である、上記（１）ないし（６）いずれか記載の方法。
（８）被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性β−アミロイド（Ａβ）の溶媒中濃度を測定することにより、インビトロで凝集した細線維または凝集物からβ−アミロイド（Ａβ）を除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
（９）細線維または凝集物がＡβ（１−４０）からなる、上記（８）記載の方法。
（１０）細線維または凝集物がＡβ（１−４２）からなる、上記（８）記載の方法。
（１１）平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、上記（８）ないし（１０）いずれか記載の方法。
（１２）超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、上記（８）ないし（１１）いずれか記載の方法。
（１３）超音波照射条件が、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２、デューティ比２０％、３０秒照射に続き１０秒休止の５回反復である、上記（８）ないし（１２）いずれか記載の方法。
（１４）患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法。
（１５）疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７，進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、上記（１４）記載の方法。
（１６）上記（１）ないし（１３）いずれか記載の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。
（１７）デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。
（１８）上記（１）ないし（１３）いずれか記載の方法により得られる化合物を用いて、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出する溶出方法。
（１９）細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための、上記（１）ないし（１３）いずれか記載の方法により得られる化合物の使用。
（２０）ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置。
（２１）被験化合物の存在下、細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
図１．インビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイの実験手順を示した図である。
図２．溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果、可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出したことを示した図である。
図３．溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための質量分析の結果を示した図である。
図４．溶出Ａβ（１−４０）のウエスタンブロット法分析の結果を示した図である。
図５．超音波がＡβ溶出を促進したことを表す、溶出Ａβ（１−４０）のＳＥＣ分析を示した図である。
図６．超音波の実験手順を示した図である。
図７．溶出Ａβ（１−４０）のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示した図である。
図８．Ａβ（１−４２）の細線維化およびオリゴマー化の、ＳＥＣ分析を示した図である。
図９．インビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイを図式的に示した図である。
図１０．実施例２の結果を示した図である。
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
＜薬剤候補の同定方法＞
本発明は、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物から、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法を提供する。
本発明の同定方法の工程においては、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度が測定される。
被験化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、または微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。あるいは、被験化合物は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に実際に用いられているものであってもよい。
上記、可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクとしては、それらの凝集によって弊害、延いては疾患が引き起こされ得るものであれば特に限定されないが、例えば、Ａβ、プリオンタンパク質、ポリグルタミン、αシヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジムターゼ１（ＳＯＤ１）、ニューロセルピン、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）などが挙げられる。
Ａβは、アルツハイマー病の主要な神経病理学的変化の１つである老人斑を構成する主要成分であり、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が２種の（β−及びγ−）セクレターゼで切断されることにより産生される。その主要な分子種として、４０アミノ酸残基からなるＡβ（１−４０）（配列番号：１）とＣ末端側がさらに２残基長いＡβ（１−４２）（配列番号：２）がある。
Ａβの凝集あるいは蓄積は、アルツハイマー病、ダウン症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は老人斑および脳血管アミロイドである。プリオンタンパク質の凝集あるいは蓄積は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はシナプス、神経細胞およびクル斑アミロイドである。ポリグルタミンの凝集あるいは蓄積は、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、ハンチントン舞踏病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は神経細胞核内封入体である。αシヌクレインの凝集あるいは蓄積は、パーキンソン病、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はレビー小体（神経細胞内）およびオリゴデンドロサイト（ＧＣＩ）である。タウの凝集あるいは蓄積は、アルツハイマー病、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は神経原繊維変化部位、グリア細胞内封入体およびピック球である。スーパーオキシドジムターゼ１の凝集あるいは蓄積は、家族性筋萎縮性側索硬化症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はレビー小体様封入体である。ニューロセルピンの凝集および蓄積は、ニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はＣｏｌｌｉｎｓ小体（神経細胞内）である。ＡＢｒｉペプチドの凝集あるいは蓄積は、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａなどの疾患の原因とされており、その蓄積部位は脳・血管アミロイドである。
本発明において「平衡状態にある」とは、不溶性であるペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの細線維や凝集物から、可溶性のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが溶媒中へ溶出する速度と、溶媒中の可溶性のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが凝集して、不溶性の細線維や凝集物を形成する速度とが同一で、釣り合っている状態をいう。
本発明の同定方法の工程は、被験化合物の存在下、単に細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することによって行ってもよい。
本発明において、細線維とはペプチド等が線状に連なった直径１μｍ前後の構造体のことであり、凝集物とは複数の細線維の集合体のことである。細線維または凝集物は、インビトロで形成されたものであっても、インビボで形成されたものであってもよいが、薬剤候補同定の効率、操作性、試験の再現性などを考察すると、インビトロで形成されたものが好ましい。
また、本発明において「除去する」とは、凝集したペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの細線維または凝集物から、可溶性のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出させて取り除くことをいう。
平衡状態のサンプルを調製するには、例えば、溶媒に可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、あるいはそれらの細線維または凝集物を加え、適切な温度（通常０〜４０℃）にて平衡状態が達成されるまで放置すればよい。平衡状態に達したことは、溶媒中の可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの濃度を経時的に測定することで確認できる。平衡状態が達成された段階で、反応系に被験化合物を加え、適温（通常３７℃前後）でインキュベート（好ましくは１日間）する。適切な温度（通常０〜４０℃）で１〜６０分間遠心分離した後、得られた上清を分析に供す。
また、平衡状態ではないサンプルを調製するには、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶媒に加え、適当な温度（通常０〜４０℃）で１〜６時間インキュベートすることによって細線維化または凝集させる。細線維化または凝集が完了した段階で、適切な温度（通常０〜４０℃）で１〜６０分間遠心分離するなどして上清を取り除く。その後、得られた上清に被験化合物を加え、、適温（通常３７℃前後）でインキュベート（好ましくは１日間）する。適切な温度（通常０〜４０℃）で１〜６０分間遠心分離した後、上清を採取し分析に供す。
ここで、本発明の方法で用いられる溶媒としては、本発明の目的を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が用いられる。かかる溶媒は、生理的条件の観点から、ｐＨ３〜８程度、より好ましくはｐＨ６〜８程度に調整するのが好ましい。
可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度は、自体公知の方法を使用して測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）等の方法により測定できる。
上記測定の結果、被験化合物を添加しない場合と比較して、被験化合物を添加したときに可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度の上昇が確認できれば、その被験化合物は細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補と判定され得る。このようにして得られた化合物は様々な用途に用いられ得、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防・治療薬あるいは該疾患の研究用試薬の開発に有用である。かかる疾患としては、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａまたはニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症などが挙げられる。本発明によれば、本発明の同定方法により得られる化合物もまた提供される。
本発明の同定方法においては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの種類を適宜選択することによって、特定のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの細線維または凝集物から、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを特異的に除去することのできる薬剤候補を得ることができる。このような薬剤候補は、当該特定のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防・治療に有用であり得る。
＜超音波＞
上記平衡状態は、超音波照射下でもたらされたものであってもよい。かかる超音波照射は実質的に熱発生を伴わないものが好ましい。また、超音波照射は特に限定はされないが、通常、１〜２０ＭＨｚ、０．１〜１０Ｗ／ｃｍ２、デューティー比１０〜９０％の条件で、１０秒照射に続き１０秒休止を１５回繰り返して行い、より好ましくは、２．５〜７．５ＭＨｚ、０．５〜５Ｗ／ｃｍ２、デューティー比２０〜７０％の条件で、３０秒照射に続き１０秒休止を５回繰り返して行う。ここでデューティー比とは、送信時間／（送信時間＋送信間隔）のことである。
上記超音波照射は、細線維または凝集物からのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク除去を促進する。したがって、超音波照射は平衡状態への到達時間を速め、より迅速な薬剤候補の同定を可能とする。
また、超音波照射することによって、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する方法も本発明の範疇とする。
さらに、本発明には、患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法も含まれるものとする。
本発明はまた、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置を提供する。
ここで、超音波照射は、通常、１〜２０ＭＨｚ、０．１〜１０Ｗ／ｃｍ２、デューティー比１０〜９０％の条件で、１０秒照射に続き１０秒休止を１５回繰り返して行い、より好ましくは、２．５〜７．５ＭＨｚ、０．５〜５Ｗ／ｃｍ２、デューティー比２０〜７０％の条件で、３０秒照射に続き１０秒休止を５回繰り返して行う。
＜溶出促進剤＞
本発明は、上記の同定方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。
下記の実施例から明らかなように、上記同定方法により得られた化合物として、デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１が提供される。
従って、本発明は、デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。
デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸは、以下の化学式１：
で表される化合物であり、プロテアーゼに対して抵抗性を有するタンパク質（ＰｒＰ−ｒｅｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の形成をインビトロで阻害し伝達性海綿状脳症の治療に有用である可能性があると報告されている（Ｓ．Ａ．Ｐｒｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，１５０３（Ｆｅｂ ２５，２０００））。また、タウフィラメント形成を阻害するとの報告もある（Ｓ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０（９），７６１４−７６２３，２００５）。
アムホテリシンＢは以下の化学式２：
で表される化合物であり、Ａβ繊維の形成を遅らす働きがあることが知られている（Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｔｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２，６２２８（Ｍａｙ ２７，２００３））。
ミリセチンおよびタンニン酸はそれぞれ以下の化学式３および４：
で表される化合物であり、インビトロでＡβの形成・伸張に阻害作用を示すことが報告されている（Ｋ．Ｏｎｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６９０，１９３（Ｎｏｖ ５，２００４）。
クルクミンは以下の化学式５：
で表される化合物であり、Ａβ（１−４０）繊維の形成を阻害することが報告されており（Ｆ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０（７），５８９２−５９０１，２００５）、アルツハイマー治療薬として効果があることが知られている（Ｇ．Ｐ．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２１（２１）：８３７０−７（Ｎｏｖ １，２００１）およびＷＯ０３／１０３５８３）。
アズールＢは以下の化学式６：
で表される化合物であり、タウフィラメント形成を阻害することが報告されている（Ｓ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（９），７６１４−７６２３，２００５）。
ベーシックブルー４１は以下の化学式７：
で表される化合物であり、チオフラビンＴの１種で、チオフラビンＴはアミロイド繊維の蛍光インディケーターであることが知られている（Ｈ．Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ６２，７６８（Ｊｕｎ １９９０））。
本発明の溶出促進剤は、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する作用を高めることができるため、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防または治療に有用である。
また、上記化合物は各々上述した文献に記載されているように、種々の疾患に用いられることが公知であるが、本発明において細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出しうることが新たに知見されたため、これらの化合物を含有する溶出促進剤もペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防または治療に用いられ得ることが示唆された。
本発明の溶出促進剤は、上記の化合物に加え、任意の担体などを含有できる。任意の担体としては、医薬上許容され得る担体（後述）が挙げられる。
本発明の溶出促進剤は、医薬又は試験用試薬などとして、あるいはインビボ又はインビトロにおいて用いられ得る。本発明の溶出促進剤が医薬として使用される場合、動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物）に経口または非経口で投与することができ、錠剤、カプセル剤、トローチ、顆粒剤、散剤等の経口投与剤の剤形で、または、外用剤（液剤、ローション剤、懸濁剤、乳剤、クリーム、軟膏、ゲル剤等）、注射剤、坐剤等の剤形で用いられ得る。
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の溶出促進剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５ｍｇ／ｋｇである。
図２．溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果、可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出したことを示した図である。
図３．溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための質量分析の結果を示した図である。
図４．溶出Ａβ（１−４０）のウエスタンブロット法分析の結果を示した図である。
図５．超音波がＡβ溶出を促進したことを表す、溶出Ａβ（１−４０）のＳＥＣ分析を示した図である。
図６．超音波の実験手順を示した図である。
図７．溶出Ａβ（１−４０）のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示した図である。
図８．Ａβ（１−４２）の細線維化およびオリゴマー化の、ＳＥＣ分析を示した図である。
図９．インビトロ類似溶出（ｓｉｎｋ−ｌｉｋｅ）Ａβアッセイを図式的に示した図である。
図１０．実施例２の結果を示した図である。
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
＜薬剤候補の同定方法＞
本発明は、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物から、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法を提供する。
本発明の同定方法の工程においては、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度が測定される。
被験化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、または微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。あるいは、被験化合物は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に実際に用いられているものであってもよい。
上記、可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクとしては、それらの凝集によって弊害、延いては疾患が引き起こされ得るものであれば特に限定されないが、例えば、Ａβ、プリオンタンパク質、ポリグルタミン、αシヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジムターゼ１（ＳＯＤ１）、ニューロセルピン、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）などが挙げられる。
Ａβは、アルツハイマー病の主要な神経病理学的変化の１つである老人斑を構成する主要成分であり、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が２種の（β−及びγ−）セクレターゼで切断されることにより産生される。その主要な分子種として、４０アミノ酸残基からなるＡβ（１−４０）（配列番号：１）とＣ末端側がさらに２残基長いＡβ（１−４２）（配列番号：２）がある。
Ａβの凝集あるいは蓄積は、アルツハイマー病、ダウン症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は老人斑および脳血管アミロイドである。プリオンタンパク質の凝集あるいは蓄積は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はシナプス、神経細胞およびクル斑アミロイドである。ポリグルタミンの凝集あるいは蓄積は、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、ハンチントン舞踏病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は神経細胞核内封入体である。αシヌクレインの凝集あるいは蓄積は、パーキンソン病、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はレビー小体（神経細胞内）およびオリゴデンドロサイト（ＧＣＩ）である。タウの凝集あるいは蓄積は、アルツハイマー病、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は神経原繊維変化部位、グリア細胞内封入体およびピック球である。スーパーオキシドジムターゼ１の凝集あるいは蓄積は、家族性筋萎縮性側索硬化症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はレビー小体様封入体である。ニューロセルピンの凝集および蓄積は、ニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はＣｏｌｌｉｎｓ小体（神経細胞内）である。ＡＢｒｉペプチドの凝集あるいは蓄積は、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａなどの疾患の原因とされており、その蓄積部位は脳・血管アミロイドである。
本発明において「平衡状態にある」とは、不溶性であるペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの細線維や凝集物から、可溶性のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが溶媒中へ溶出する速度と、溶媒中の可溶性のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが凝集して、不溶性の細線維や凝集物を形成する速度とが同一で、釣り合っている状態をいう。
本発明の同定方法の工程は、被験化合物の存在下、単に細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することによって行ってもよい。
本発明において、細線維とはペプチド等が線状に連なった直径１μｍ前後の構造体のことであり、凝集物とは複数の細線維の集合体のことである。細線維または凝集物は、インビトロで形成されたものであっても、インビボで形成されたものであってもよいが、薬剤候補同定の効率、操作性、試験の再現性などを考察すると、インビトロで形成されたものが好ましい。
また、本発明において「除去する」とは、凝集したペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの細線維または凝集物から、可溶性のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出させて取り除くことをいう。
平衡状態のサンプルを調製するには、例えば、溶媒に可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、あるいはそれらの細線維または凝集物を加え、適切な温度（通常０〜４０℃）にて平衡状態が達成されるまで放置すればよい。平衡状態に達したことは、溶媒中の可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの濃度を経時的に測定することで確認できる。平衡状態が達成された段階で、反応系に被験化合物を加え、適温（通常３７℃前後）でインキュベート（好ましくは１日間）する。適切な温度（通常０〜４０℃）で１〜６０分間遠心分離した後、得られた上清を分析に供す。
また、平衡状態ではないサンプルを調製するには、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶媒に加え、適当な温度（通常０〜４０℃）で１〜６時間インキュベートすることによって細線維化または凝集させる。細線維化または凝集が完了した段階で、適切な温度（通常０〜４０℃）で１〜６０分間遠心分離するなどして上清を取り除く。その後、得られた上清に被験化合物を加え、、適温（通常３７℃前後）でインキュベート（好ましくは１日間）する。適切な温度（通常０〜４０℃）で１〜６０分間遠心分離した後、上清を採取し分析に供す。
ここで、本発明の方法で用いられる溶媒としては、本発明の目的を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が用いられる。かかる溶媒は、生理的条件の観点から、ｐＨ３〜８程度、より好ましくはｐＨ６〜８程度に調整するのが好ましい。
可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度は、自体公知の方法を使用して測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）等の方法により測定できる。
上記測定の結果、被験化合物を添加しない場合と比較して、被験化合物を添加したときに可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度の上昇が確認できれば、その被験化合物は細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補と判定され得る。このようにして得られた化合物は様々な用途に用いられ得、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防・治療薬あるいは該疾患の研究用試薬の開発に有用である。かかる疾患としては、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａまたはニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症などが挙げられる。本発明によれば、本発明の同定方法により得られる化合物もまた提供される。
本発明の同定方法においては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの種類を適宜選択することによって、特定のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの細線維または凝集物から、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを特異的に除去することのできる薬剤候補を得ることができる。このような薬剤候補は、当該特定のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防・治療に有用であり得る。
＜超音波＞
上記平衡状態は、超音波照射下でもたらされたものであってもよい。かかる超音波照射は実質的に熱発生を伴わないものが好ましい。また、超音波照射は特に限定はされないが、通常、１〜２０ＭＨｚ、０．１〜１０Ｗ／ｃｍ２、デューティー比１０〜９０％の条件で、１０秒照射に続き１０秒休止を１５回繰り返して行い、より好ましくは、２．５〜７．５ＭＨｚ、０．５〜５Ｗ／ｃｍ２、デューティー比２０〜７０％の条件で、３０秒照射に続き１０秒休止を５回繰り返して行う。ここでデューティー比とは、送信時間／（送信時間＋送信間隔）のことである。
上記超音波照射は、細線維または凝集物からのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク除去を促進する。したがって、超音波照射は平衡状態への到達時間を速め、より迅速な薬剤候補の同定を可能とする。
また、超音波照射することによって、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する方法も本発明の範疇とする。
さらに、本発明には、患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法も含まれるものとする。
本発明はまた、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置を提供する。
ここで、超音波照射は、通常、１〜２０ＭＨｚ、０．１〜１０Ｗ／ｃｍ２、デューティー比１０〜９０％の条件で、１０秒照射に続き１０秒休止を１５回繰り返して行い、より好ましくは、２．５〜７．５ＭＨｚ、０．５〜５Ｗ／ｃｍ２、デューティー比２０〜７０％の条件で、３０秒照射に続き１０秒休止を５回繰り返して行う。
＜溶出促進剤＞
本発明は、上記の同定方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。
下記の実施例から明らかなように、上記同定方法により得られた化合物として、デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１が提供される。
従って、本発明は、デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。
デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸは、以下の化学式１：
アムホテリシンＢは以下の化学式２：
ミリセチンおよびタンニン酸はそれぞれ以下の化学式３および４：
クルクミンは以下の化学式５：
アズールＢは以下の化学式６：
ベーシックブルー４１は以下の化学式７：
本発明の溶出促進剤は、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する作用を高めることができるため、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防または治療に有用である。
また、上記化合物は各々上述した文献に記載されているように、種々の疾患に用いられることが公知であるが、本発明において細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出しうることが新たに知見されたため、これらの化合物を含有する溶出促進剤もペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防または治療に用いられ得ることが示唆された。
本発明の溶出促進剤は、上記の化合物に加え、任意の担体などを含有できる。任意の担体としては、医薬上許容され得る担体（後述）が挙げられる。
本発明の溶出促進剤は、医薬又は試験用試薬などとして、あるいはインビボ又はインビトロにおいて用いられ得る。本発明の溶出促進剤が医薬として使用される場合、動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物）に経口または非経口で投与することができ、錠剤、カプセル剤、トローチ、顆粒剤、散剤等の経口投与剤の剤形で、または、外用剤（液剤、ローション剤、懸濁剤、乳剤、クリーム、軟膏、ゲル剤等）、注射剤、坐剤等の剤形で用いられ得る。
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の溶出促進剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５ｍｇ／ｋｇである。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
実施例１
（Ｉ）方法
（１）薬品および溶媒
特に明示がない限り、薬品はシグマあるいは和光から入手した。
水は２回蒸留し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて脱イオン化した。
（２）ペプチド
Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）はペプチド研究所（大阪、日本）から入手した。Ａβ溶液は実験毎に、記載のようにして新しく調製した（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９９）。Ａβ（１−４０）ペプチド０．５５ｍｇを、０．０１％フェノールレッドを含む１ｍＭ ＮａＯＨ １３０μｌに溶解した。
ｐＨ７．５に調整するため、１０ｍＭ ＮａＯＨを加えた。５００μＭ Ａβ溶液を得るため、ＰＢＳ／ｄｄＨ２０を加えた。溶解しなかったＡβを取り除くため、上清を分取する前に遠心分離した。（１５，０００×ｇ，３分間）
（３）サンプル調製
５００μＭ Ａβ溶液２０μｌを、１．５ｍｌエッペンドルフ管に分取した。サンプルは細線維化が完了するまで、３７℃にて何通りかの時間インキュベートした。２２℃で遠心分離した後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清を除いた。
得られたペレット（すなわちＡβ細線維）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。そのペレットに、新しいＰＢＳ ２０μｌを徐々に注意深く加えた。このサンプルを、３７℃にて１日間インキュベートした。２２℃において遠心分離した後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清１６μｌを採取し分析に供した。残りの上清は取り除いた。そのペレットに、新しいＰＢＳ ２０μｌを徐々に注意深く加えた。
これらの操作を繰り返した。（図１参照）
サンプルを、下記のようにして、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により分析した。
（４）サンドイッチ法Ａβ ＥＬＩＳＡ
Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、それぞれＡβ（１−４０）ＥＬＩＳＡキットおよびＡβ（１−４２）ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｅ社、ＩＢＬ社、Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社など）を用いて行った。
（５）ＳＥＣ
注入器および紫外検出器からなるＨＰＬＣシステムに、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を取り付けた。カラムから０．０４ｍｌ／分にて溶出させ、ペプチドは２１８ｎｍの紫外吸収にて検出した。
各実験は少なくとも２回行った。実験の間にプレパックカラムを２Ｎ ＮａＯＨで洗浄した。
それぞれの検討のため、適切なカラムを少なくともカラム体積の３倍量の溶出緩衝液で平衡化し、次いで５種類の分子量標準品：トリ・オブアルブミン（４４，０００）；ウマ・ミオグロビン（１７，０００）；ヒトγ−グロブリン（１５８，０００）；ウシ・サイログロブリン（６７０，０００）；およびビタミンＢ１２（１，３５０）を用いて較正した。
溶出緩衝液として、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた。
（６）ゲル電気泳動およびウェスタンブロット法
Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。サンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、電気泳動に先立ち５分間急速沸騰させた。サンプルをポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ、米国）上に移した。
ウェスタンブロット法は、６Ｅ１０抗体を用いて行った。
ＥＣＬを検出システムとして用いた。
（７）質量分析
Ａβ種の、免疫沈降／マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、複合質量分析計（ＩＰ／ＭＳ）分析を記載のようにして行った。（Ｏｋｏｃｈｉ，Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）
（８）超音波
サンプル管に、室温にて３０秒間超音波処理（２．５Ｗ／ｃｍ２）した。（３０秒照射の５回繰り返し）
（ＩＩ）結果
可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出した。
（１）溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法
溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を記載の実験法により行った。溶出したＡβ（１−４０）量は、６５６２．５±１７５０．９（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌであった（ｎ＝６）。溶出したＡβ（１−４２）量は、１９３９．７±６０７．６（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌであった（ｎ＝６）。それぞれの結果を図２に示す。
（２）溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）質量分析
質量分析にて、溶出したＡβ（１−４０）およびＡβ（１−４０）の分子量、それぞれ４３２９．８と４５１４．０を確認した。（図３）
（３）溶出Ａβ（１−４０）のウェスタンブロット
低分子量のほぼ単一のバンドの検出を示した。（図４）
（４）溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のＳＥＣ分析
ＳＥＣ分析は、十分な単一の２．４ｍｌピークを示した。（図５）
（５）超音波の効果
超音波はＡβ溶出を促進した。
サンプル管に、室温にて３０秒間、デューティー比２０％で超音波処理（２．５Ｗ／ｃｍ２）した。（３０秒照射の５回繰り返し）
溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を行った。
３０秒間の超音波（２．５Ｗ／ｃｍ２、デューティー比２０％、室温、３０秒照射の５回繰り返し）は、Ａβ（１−４０）溶出を促進した。（図６）
（コントロール群：８７９１．７±３１２１．１（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；超音波群：４９４７９．３±２１６７．６（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；ｐ０．００１未満）
もう一つの、デューティー比５０％での実験方法（３０秒、２．５Ｗ／ｃｍ２、室温、３０秒照射の２回繰り返し）もまた、Ａβ（１−４０）溶出を促進した。
（コントロール群：８７９１．７±３１２１．１（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；超音波群５０％×２回：３５５２０±７１４０（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；ｐ０．０５未満）
超音波の効果を図７に示す。
（６）Ａβ（１−４２）細線維化およびオリゴマー化の、ＳＥＣ分析
溶解後直ちに記述の実験方法にて、可溶性Ａβ（１−４２）をＳｕｐｅｒｏｓｅ６クロマトグラフィー分析した。結果を図８に示す。
ゲルに由来するピーク（ｇｅｌ−ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｐｅａｋ）は１．９ｍｌにおいて溶出した。
このピーク中のＡβオリゴマー・サイズを決定することはできなかった。
大きなオリゴマーと細線維前駆体は、１時間から１２時間の間に観察された（図中、矢印または三角印）。
２．４ｍのピークは５ｈ時に上昇した（図中、矢印）。
このピークは、ＳＥＣにおいてＡβ（１−４０）溶出が分析された時観察されたので、同じフラクションに溶出した。
実施例２
（Ｉ）方法
（１）薬品および溶媒
デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１はそれぞれ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
上記以外は実施例１と同様にして準備した。
（２）ペプチド
ペプチドは実施例１の（Ｉ）−（２）と同様にして準備した。
（３）サンプル調製
５００μＭ Ａβ（１−４２）溶液２０μｌを１．５ｍｌ管に分取した。３７℃にて細線維化が完了するまで、ペプチドを数日間インキュベートした。２２℃にて遠心分離後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清を取り除いた。得られたペレットをＰＢＳで３回徐々に慎重に洗浄した。ペレットに、新しいＰＢＳ２０μｌを徐々に注意深く加えた。サンプルを３７℃にて１日間インキュベートした。２２℃にて遠心分離後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清を取り除いた。次いで、化合物：デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢまたはベーシックブルー４１をそれぞれ含んだ新しいＰＢＳ ２０μｌおよびコントロールとして化合物含まない新しいＰＢＳ ２０μｌをペレットにゆっくりと注意深く加えた。サンプルを３７℃にて１日間インキュベートした。２２℃にて遠心分離後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清１６μｌ（細線維から溶出したＡβ）を採取しＡβ ＥＬＩＳＡ分析により分析した。
（ＩＩ）結果
結果を表１および図１０に示す。
平均値はコントロールを１とした場合の倍率である。
表１および図１０に示すとおり、上記の化合物を加えた場合、Ａβの有意な溶出が観察された。
文献
１．ＤｅＭａｔｔｏｓ，Ｒ．Ｂ．，Ｋ．Ｒ．Ｂａｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．
”Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｔｉ−Ａ ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｌｔｅｒｓ ＣＮＳ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ Ａ ｂｅｔａ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｂｒａｉｎ Ａ ｂｅｔａ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．”
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８（１５）：８８５０−５．
２．Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｓｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．
″Ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅ ａｃｕｔｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ．″
Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９（２０）：８８７６−８４．
３．Ｌｏｍｂａｒｄｏ，Ｊ．Ａ．，Ｅ．Ａ．Ｓｔｅｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）．
″Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒａｐｉｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｑｕｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ．″
Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２３（３４）：１０８７９−８３．
４．Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｙ．，Ｍ．Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）．
″Ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ．″
Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２３（１）：２９−３３．
５．Ｏｋｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｈ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）．
″Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ａ ｄｕａｌ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ−１．″
Ｅｍｂｏ Ｊ ２１（２０）：５４０８−１６．
６．Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．，Ｒ．Ｂａｒｂｏｕｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．
″Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＤＡＰＰ ｍｏｕｓｅ．″
Ｎａｔｕｒｅ ４００（６７４０）：１７３−７．
実施例１
（Ｉ）方法
（１）薬品および溶媒
特に明示がない限り、薬品はシグマあるいは和光から入手した。
水は２回蒸留し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて脱イオン化した。
（２）ペプチド
Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）はペプチド研究所（大阪、日本）から入手した。Ａβ溶液は実験毎に、記載のようにして新しく調製した（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９９）。Ａβ（１−４０）ペプチド０．５５ｍｇを、０．０１％フェノールレッドを含む１ｍＭ ＮａＯＨ １３０μｌに溶解した。
ｐＨ７．５に調整するため、１０ｍＭ ＮａＯＨを加えた。５００μＭ Ａβ溶液を得るため、ＰＢＳ／ｄｄＨ２０を加えた。溶解しなかったＡβを取り除くため、上清を分取する前に遠心分離した。（１５，０００×ｇ，３分間）
（３）サンプル調製
５００μＭ Ａβ溶液２０μｌを、１．５ｍｌエッペンドルフ管に分取した。サンプルは細線維化が完了するまで、３７℃にて何通りかの時間インキュベートした。２２℃で遠心分離した後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清を除いた。
得られたペレット（すなわちＡβ細線維）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。そのペレットに、新しいＰＢＳ ２０μｌを徐々に注意深く加えた。このサンプルを、３７℃にて１日間インキュベートした。２２℃において遠心分離した後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清１６μｌを採取し分析に供した。残りの上清は取り除いた。そのペレットに、新しいＰＢＳ ２０μｌを徐々に注意深く加えた。
これらの操作を繰り返した。（図１参照）
サンプルを、下記のようにして、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により分析した。
（４）サンドイッチ法Ａβ ＥＬＩＳＡ
Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、それぞれＡβ（１−４０）ＥＬＩＳＡキットおよびＡβ（１−４２）ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｅ社、ＩＢＬ社、Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社など）を用いて行った。
（５）ＳＥＣ
注入器および紫外検出器からなるＨＰＬＣシステムに、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を取り付けた。カラムから０．０４ｍｌ／分にて溶出させ、ペプチドは２１８ｎｍの紫外吸収にて検出した。
各実験は少なくとも２回行った。実験の間にプレパックカラムを２Ｎ ＮａＯＨで洗浄した。
それぞれの検討のため、適切なカラムを少なくともカラム体積の３倍量の溶出緩衝液で平衡化し、次いで５種類の分子量標準品：トリ・オブアルブミン（４４，０００）；ウマ・ミオグロビン（１７，０００）；ヒトγ−グロブリン（１５８，０００）；ウシ・サイログロブリン（６７０，０００）；およびビタミンＢ１２（１，３５０）を用いて較正した。
溶出緩衝液として、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた。
（６）ゲル電気泳動およびウェスタンブロット法
Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。サンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、電気泳動に先立ち５分間急速沸騰させた。サンプルをポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ、米国）上に移した。
ウェスタンブロット法は、６Ｅ１０抗体を用いて行った。
ＥＣＬを検出システムとして用いた。
（７）質量分析
Ａβ種の、免疫沈降／マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、複合質量分析計（ＩＰ／ＭＳ）分析を記載のようにして行った。（Ｏｋｏｃｈｉ，Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）
（８）超音波
サンプル管に、室温にて３０秒間超音波処理（２．５Ｗ／ｃｍ２）した。（３０秒照射の５回繰り返し）
（ＩＩ）結果
可溶性Ａβが凝集Ａβから溶出した。
（１）溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法
溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を記載の実験法により行った。溶出したＡβ（１−４０）量は、６５６２．５±１７５０．９（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌであった（ｎ＝６）。溶出したＡβ（１−４２）量は、１９３９．７±６０７．６（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌであった（ｎ＝６）。それぞれの結果を図２に示す。
（２）溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）質量分析
質量分析にて、溶出したＡβ（１−４０）およびＡβ（１−４０）の分子量、それぞれ４３２９．８と４５１４．０を確認した。（図３）
（３）溶出Ａβ（１−４０）のウェスタンブロット
低分子量のほぼ単一のバンドの検出を示した。（図４）
（４）溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のＳＥＣ分析
ＳＥＣ分析は、十分な単一の２．４ｍｌピークを示した。（図５）
（５）超音波の効果
超音波はＡβ溶出を促進した。
サンプル管に、室温にて３０秒間、デューティー比２０％で超音波処理（２．５Ｗ／ｃｍ２）した。（３０秒照射の５回繰り返し）
溶出Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）のための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を行った。
３０秒間の超音波（２．５Ｗ／ｃｍ２、デューティー比２０％、室温、３０秒照射の５回繰り返し）は、Ａβ（１−４０）溶出を促進した。（図６）
（コントロール群：８７９１．７±３１２１．１（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；超音波群：４９４７９．３±２１６７．６（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；ｐ０．００１未満）
もう一つの、デューティー比５０％での実験方法（３０秒、２．５Ｗ／ｃｍ２、室温、３０秒照射の２回繰り返し）もまた、Ａβ（１−４０）溶出を促進した。
（コントロール群：８７９１．７±３１２１．１（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；超音波群５０％×２回：３５５２０±７１４０（Ｓ．Ｅ．）ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝３）；ｐ０．０５未満）
超音波の効果を図７に示す。
（６）Ａβ（１−４２）細線維化およびオリゴマー化の、ＳＥＣ分析
溶解後直ちに記述の実験方法にて、可溶性Ａβ（１−４２）をＳｕｐｅｒｏｓｅ６クロマトグラフィー分析した。結果を図８に示す。
ゲルに由来するピーク（ｇｅｌ−ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｐｅａｋ）は１．９ｍｌにおいて溶出した。
このピーク中のＡβオリゴマー・サイズを決定することはできなかった。
大きなオリゴマーと細線維前駆体は、１時間から１２時間の間に観察された（図中、矢印または三角印）。
２．４ｍのピークは５ｈ時に上昇した（図中、矢印）。
このピークは、ＳＥＣにおいてＡβ（１−４０）溶出が分析された時観察されたので、同じフラクションに溶出した。
実施例２
（Ｉ）方法
（１）薬品および溶媒
デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１はそれぞれ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
上記以外は実施例１と同様にして準備した。
（２）ペプチド
ペプチドは実施例１の（Ｉ）−（２）と同様にして準備した。
（３）サンプル調製
５００μＭ Ａβ（１−４２）溶液２０μｌを１．５ｍｌ管に分取した。３７℃にて細線維化が完了するまで、ペプチドを数日間インキュベートした。２２℃にて遠心分離後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清を取り除いた。得られたペレットをＰＢＳで３回徐々に慎重に洗浄した。ペレットに、新しいＰＢＳ２０μｌを徐々に注意深く加えた。サンプルを３７℃にて１日間インキュベートした。２２℃にて遠心分離後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清を取り除いた。次いで、化合物：デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢまたはベーシックブルー４１をそれぞれ含んだ新しいＰＢＳ ２０μｌおよびコントロールとして化合物含まない新しいＰＢＳ ２０μｌをペレットにゆっくりと注意深く加えた。サンプルを３７℃にて１日間インキュベートした。２２℃にて遠心分離後（１５，０００×ｇ，１０分間）、上清１６μｌ（細線維から溶出したＡβ）を採取しＡβ ＥＬＩＳＡ分析により分析した。
（ＩＩ）結果
結果を表１および図１０に示す。
表１および図１０に示すとおり、上記の化合物を加えた場合、Ａβの有意な溶出が観察された。
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Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２３（１）：２９−３３．
５．Ｏｋｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｈ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）．
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Ｅｍｂｏ Ｊ ２１（２０）：５４０８−１６．
６．Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．，Ｒ．Ｂａｒｂｏｕｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．
″Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＤＡＰＰ ｍｏｕｓｅ．″
Ｎａｔｕｒｅ ４００（６７４０）：１７３−７．
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定することが可能となり、それにより、現代社会に様々な波紋を投げかけているアルツハイマー病などの、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患に関する治療・予防、あるいらそれらの研究に大いに役立つことが期待される。
本出願は、日本で出願された特願２００４−１０７７４６を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００４−１０７７４６を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
配列番号１：Ａβ（１−４０）
配列番号２：Ａβ（１−４２）
配列番号２：Ａβ（１−４２）
Claims (21)
- 被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維（ｆｉｂｒｉｌ）または凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
- 薬剤候補が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いられるものである、請求項１記載の方法。
- 疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、請求項１または２記載の方法。
- 細線維または凝集物がインビトロで形成されたものである、請求項１ないし３いずれか記載の方法。
- 平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、請求項１ないし４いずれか記載の方法。
- 超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、請求項１ないし５いずれか記載の方法。
- 超音波照射条件が、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２、デューティ比２０％、３０秒照射に続き１０秒休止の５回反復である、請求項１ないし６いずれか記載の方法。
- 被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性β−アミロイド（Ａβ）の溶媒中濃度を測定することにより、インビトロで凝集した細線維または凝集物からβ−アミロイド（Ａβ）を除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
- 細線維または凝集物がＡβ（１−４０）からなる、請求項８記載の方法。
- 細線維または凝集物がＡβ（１−４２）からなる、請求項８記載の方法。
- 平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、請求項８ないし１０いずれか記載の方法。
- 超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、請求項８ないし１１いずれか記載の方法。
- 超音波照射条件が、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２、デューティ比２０％、３０秒照射に続き１０秒休止の５回反復である、請求項８ないし１２いずれか記載の方法。
- 患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法。
- 疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、ｆａｍｉｌｉａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、請求項１４記載の方法。
- 請求項１ないし１３いずれか記載の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。
- デヒドロポルフィリン第２鉄ＩＸ、アムホテリシンＢ、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、アズールＢおよびベーシックブルー４１からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。
- 請求項１ないし１３いずれか記載の方法により得られる化合物を用いて、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出する溶出方法。
- 細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための、請求項１ないし１３いずれか記載の方法により得られる化合物の使用。
- ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置。
- 被験化合物の存在下、細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。
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