CN103735554B - 蛋白聚集抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及二氨基吩噻嗪化合物用于抑制或逆转突触核蛋白聚集的用途，并涉及所述化合物在制备用于该目的的药物中的用途，例如在制备用于治疗帕金森病的药物中的用途。本发明还涉及检测或标记聚集的突触核蛋白的方法。

Description

蛋白聚集抑制剂
本申请是中国申请号为200780020257.1、发明名称为“蛋白聚集抑制剂”且申请日为2007年3月28日的专利申请(PCT申请号为PCT/GB2007/001105)的分案申请。
技术领域
本发明涉及与神经变性疾病如帕金森病(Parkinson’s disease,PD)有关的α-突触核蛋白聚集和能调节这种聚集的二氨基吩噻嗪化合物。
背景技术
帕金森病是一种常见的神经变性运动失调，有1％的老年人受此病影响(参见Kapurniotu(2004)chemistry&Biology 11,1476-1478页中的讨论)。PD的主要临床症状为运动过慢、静止性震颤、肌强直和平衡困难。PD神经病理学特征为多巴胺能神经元的显著且进行性退化，并且在大脑的黑质和其它区域中存在原纤维细胞质内含物(卢易体[Lewybodies,LB])和营养不良性神经突(卢易神经突[Lewy neuritis,LN])(Recchia等人，(2004)FASEB J 18:617-626)。
尽管多巴胺神经元丢失一定与PD的主要临床症状有关，但这种多因子病及“突触核蛋白病(synucleinopathies)”的病因和发病机理在较大程度上仍然是未知的。
LB和LN的主要组分是α-突触核蛋白的原纤维聚集体。α-突触核蛋白是经广泛表达的神经元突触前蛋白，其在膜相关过程和突触可塑性中扮演重要角色，并且与学习和发育过程有关。尽管LB和LN的形成机理及它们与PD的关系还没有明了，但现有的几条证据表明α-突触核蛋白纤维化与PD有关，并且表明α-突触核蛋白纤维化会导致毒性(参见，例如masliah等人，Science,287:1265-1269(2000)；Feany等人，Nature 404:394-8(2000))。
除了α-突触核蛋白外，β-突触核蛋白也牵涉在神经变性突触核蛋白病中。人β-突触核蛋白是134-残基神经元蛋白，该蛋白与α-突触核蛋白有78％同源性。所述α-和β-突触核蛋白共有保守的C-端，具有三个相同位置的酪氨酸残基。除了含有α-突触核蛋白的LB和LN外，具有LB的PD和痴呆的发展伴随着在海马中出现了新型α-和β-突触核蛋白-阳性损伤(Galvin等人，1999)，这说明除了α-突触核蛋白外，β-突触核蛋白也参与了该疾病的发作和发展。据了解，β-突触核蛋白可调节α-突触核蛋白纤维化，也许起到侣伴蛋白的作用而使α-突触核蛋白的聚集最小化(Hashimoto等人，2001；Uversky等人，2002；Park and Lansbury,2002)。因此，β-突触核蛋白水平的降低被认为是PD的病因之一(Uversky等人，2002)。
因此，抑制或逆转突触核蛋白聚集被认为具有治疗益处。
Li等人(chemistry&Biology 11:1513-1521页,2004)讨论了通过抗菌素利福平(rifampicin)抑制α-突触核蛋白纤维化和原纤维的解聚集。
Zhu等人(Journal of Biologicalchemistry 279,26:26846-26857页,2004)讨论了通过类黄酮黄芩素抑制α-突触核蛋白纤维化和原纤维的解聚集。
现有技术还有很多其它文献涉及针对这种聚集的抑制剂。这些文献包括：“Compositions for inhibiting the aggregation pathway of alpha-synuclein”(US6780971-2004-08-24)；“Polyhydroxylated aromaticcompounds for the treatmentof amyloidosis and alpha-synuclein fibril diseases”(US2004152760-2004-08-05)；Peptide and peptide derivatives for the treatment of alpha-synuclein relateddiseases(WO2004009625-2004-01-29)；Proanthocyanidins for the treatment ofamyloid and alpha-synuclein diseases(EP1377287-2004-01-07)；Methods forpreventing neural tissue damage and for the treatment of alpha-synucleindiseases(CN1440420T-2003-09-03)。
然而，应当理解的是，如果能提供现有技术还未知的、并且能抑制突触核蛋白聚集的化合物将对该领域是有贡献的。
发明内容
本发明的发明人首次证明二氨基吩噻嗪化合物可用于抑制突触核蛋白聚集。
简言之，本发明的发明人表达并纯化了两种形式α-突触核蛋白，并将它们用在自组装和原纤维形成试验(fibril formation)中。结果发现，截短形式的α-突触核蛋白(truncated form ofα-synuclein,tsyn)在纤维形成试验中是特别有效的，并且这种自组装的tsyn经证明能提高硫黄素T的荧光。发明人试验了二氨基吩噻嗪类化合物和其它化合物的这种原纤维-破坏活性(fibril-disrupting activity)。结果表明，所述二氨基吩噻嗪类化合物破坏组装的α-突触核蛋白的活性小于1μM。
也设计了针对突触核蛋白结合的固相试验，该试验用于证明诸如锍氯化物(thioninium chlorides)等的二氨基吩噻嗪类化合物和黄酮类能抑制这种结合。
根据本发明公开的内容，本领域技术人员理解的是，这些结果说明了这类化合物尤其可用于治疗与突触核蛋白聚集有关的疾病(如PD和本发明所述其它疾病)的潜在病因。
Piotrowski,G.(The treatment of parkinsonian tremor.medical Record,144:322-323,1936)报道了在对4个个体的研究中，采用亚甲蓝(甲基锍氯化物-MTC)使得帕金森病震颤(Parkinsonian tremor)的症状得到了缓解。将所述MTC以1或2mg/kg剂量静脉给药。由于副反应而中止了口服给药8格令(grains)(＝518mg)/天的药物。根据该报道，对震颤的效果不是很强，而且仅维持了有限长的时间，同时对不同症状(强直)的影响不大。另一采用硫素(thionin)的单独试验没有得到结果。因此，该文献的本质为，已知具有副交感神经作用的MTC仅对帕金森病症状之一即“帕金森病震颤”具有有限的作用。
相比之下，本发明涉及直接针对潜在的疾病过程的治疗而不是针对所述疾病的症状表现。
先前已知二氨基吩噻嗪类化合物能抑制τ蛋白聚集并破坏PHFs结构，而且逆转PHF核心的蛋白水解稳定性(参见WO 96/30766,F Hoffman-La Roche)。这些化合物被披露用于治疗各种疾病包括阿尔茨海默氏病和卢易体病(Lewy Body Disease)。
此外，尽管WO02/055720(The University Court of the University ofAberdeen)主要涉及τ蛋白病，但其讨论了还原形式的二氨基吩噻嗪类化合物专门用于治疗各种蛋白聚集疾病的用途。
WO 2005/030676(The University Court of the University of Aberdeen)讨论了经放射标记的吩噻嗪，及其在诊断和治疗如τ蛋白病中的用途。
然而，这些公开出版物中没有明确披露二氨基吩噻嗪类化合物，特别是非还原形式在抑制或逆转α-突触核蛋白聚集中的用途。
二氨基吩噻嗪化合物
本发明涉及具有如下结构式之一的特定二氨基吩噻嗪化合物及其类似物和它们的可药用盐、水合物和溶剂化物(本发明中统称为“二氨基吩噻嗪类”或“二氨基吩噻嗪化合物”)：
式(1)描述了还原形式的化合物，而式(2)、(3)和(4)各自描述了氧化形式的化合物。
在一个实施方案中，所述化合物选自式(1)化合物及其可药用盐、水合物和溶剂化物。
在一个实施方案中，所述化合物选自式(2)或(3)化合物及其可药用盐、水合物和溶剂化物。
在一个实施方案中，所述化合物选自式(4)化合物及其可药用盐、水合物和溶剂化物。
上述结构中的每个结构仅为众多等同共振结构之一，所有共振结构都被该代表性结构所涵盖。例如，结构(4)仅为众多等同共振结构之一，所述共振结构的一些结构如下所示，所有这些共振结构都被结构(4)涵盖：
碳环原子取代基
在上述每个结构式中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H；
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR；
-SH；-SR；
-NO2；
-C(＝O)R；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR；
-C(＝O)NH2；-C(＝O)NHR；-C(＝O)NR2；-C(＝O)NRN1RN2；
-NH2；-NHR；-NR2；-NRN1RN2；
-NHC(＝O)H；-NRC(＝O)H；-NHC(＝O)R；-NRC(＝O)R；和
-R；
其中，各R独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基(carboaryl)；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
其中，在每个-NRN1RN2基团中，独立地，RN1和RN2各自与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
-NRN1RN2基团(其中RN1和RN2与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环)的例子包括：吡咯烷子基(pyrrolidino)、哌啶子基(piperidino)、哌嗪子基(piperazino)、吗啉代(morpholino)、吡咯基和它们的取代形式，如N-取代形式如N-甲基哌嗪子基(piperazino)。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：
-H；
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR；和
-R。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：
-H；和
-R。
在一个实施方案中，各个R独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
在一个实施方案中，各个R独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；和经取代的脂肪族C1-6烷基。
在一个实施方案中，各个R独立地选自：-Me(甲基)、-Et(乙基)、-nPr(正丙基)和-iPr(异丙基)。
在一个实施方案中，各个R独立地选自：-Me和-Et。
在一个实施方案中，所述C1-6烷基为C1-4烷基。
在一个实施方案中，所述C2-6烯基为C2-4烯基。
在一个实施方案中，所述C3-6环烷基为C3-4环烷基。
未经取代的脂肪族C1-6烷基的例子包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、新戊基、己基、异己基等。
未经取代的脂肪族C2-6烯基的例子包括：丙烯-1-基、丙烯-2-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基等。
未经取代的C3-6环烷基的例子包括：环丙基、环丙基-甲基、环丁基、环戊基、环己基等。
在一个实施方案中，所述C6-10碳芳基为C6碳芳基。
在一个实施方案中，所述C5-10杂芳基为C5-6杂芳基。
在一个实施方案中，所述C6-10碳芳基-C1-4烷基为C6碳芳基-C1-2烷基。
未经取代的C6-10碳芳基的例子包括：苯基、萘基。
未经取代的C5-10杂芳基的例子包括：吡咯基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、唑基、异唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基。
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基的例子包括：苄基、苯乙基。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)独立地选自：
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR’；
-SH；-SR’；
-NO2；
-C(＝O)R’；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR’；
-C(＝O)NH2；-C(＝O)NHR’；-C(＝O)NR’2；-C(＝O)NR’N1R’N2；
-NH2；-NHR’；-NR’2；-NR’N1R’N2；
-NHC(＝O)H；-NR’C(＝O)H；-NHC(＝O)R’；-NR’C(＝O)R’；和
-R’；
其中，各个R’独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
其中，在每个-NR’N1R’N2基团中，R’N1和R’N2各自与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)独立地选自：
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR’；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR’；和
-R’。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)如上所述，除了各R’独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)如上所定义，除了各R’独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)如上所定义，除了各R’独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；和经取代的脂肪族C1-6烷基。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)如上所定义，除了各R’独立地选自：-Me、-Et、-nPr和-iPr。
在一个实施方案中，任选取代基(如在脂肪族C1-6烷基上、在脂肪族C2-6烯基上、在C3-6环烷基上、在C6-10碳芳基上、在C5-10杂芳基上、在C6-10碳芳基-C1-4烷基上的任选取代基)如上所定义，除了各R’独立地选自：-Me和-Et。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H、-Me和-Et。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H和-Me。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9中除了4个基团外，其它都是-H。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9中除了2个基团外，其它都是-H。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9中除了1个基团外，其它都是-H。
在一个实施方案中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自为-H。
氨基
在上述每个结构式中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地为-H或如上述针对R的定义；或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
例如，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地如上述针对R的定义；或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
例如，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
例如，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在另一个例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在另一例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在另一例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；
或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在另一例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；
或R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在另一例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
在另一例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H、-Me和-Et(如-NR3NAR3NA为-NH2、-NHMe、-NMe2、-NHEt、-NEt2或-NMeEt)。
在另一例子中，在一个实施方案中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H和-Me(如-NR3NAR3NA为-NH2、-NHMe或-NMe2)。
非常相似地，在上述每个结构式中如果存在-NR7NAR7NB基团，则在每个-NR7NAR7NB基团中，R7NA和R7NB各自独立地为-H或如上述针对R的定义；R7NA和R7NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
例如，在一个实施方案中如果存在-NR7NAR7NB基团，则在每个-NR7NAR7NB基团中，R7NA和R7NB各自独立地如上述针对R的定义；或R7NA和R7NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
在一个实施方案中，-NR3NAR3NB和-NR7NAR7NB如果都存在，则是相同的。
在一个实施方案中，-NR3NAR3NB和-NR7NAR7NB如果都存在，则是不同的。
在上述每个结构式中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地为-H或具有如上针对R的定义。
例如，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC具有如上针对R的定义。
例如，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基。
例如，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：-H、-Me和-Et(如＝NR3NC为＝NH、＝NMe或＝NEt)。
在另一个实施例中，在一个实施方案中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：-H和-Me(如＝NR3NC为＝NH或＝NMe)。
非常相似地，在上述每个结构式中如果存在＝NR7NC基团，则在每个＝NR7NC基团中，R7NC为如上针对R3NC的定义。
氮环原子取代基
同样地，非常相似地，在上述每个结构式中，如果存在RN10，则RN10独立地具有如上针对R3NC(或R7NC)的定义。
例如，在一个实施方案中，如果存在RN10，则RN10独立地选自：-H和未经取代的脂肪族C1-6烷基。
例如，在一个实施方案中，如果存在RN10，则RN10独立地选自：-H、-Me和-Et。
例如，在一个实施方案中，如果存在RN10，则RN10独立地选自：-H和-Me。
例如，在一个实施方案中，如果存在RN10，则RN10独立地选自：-H。
反离子
如果存在X-，则X-是一个或多个实现电中性的阴离子反离子(anionic counter)。
合适的阴离子反离子的例子在以下标题为“盐”的部分讨论。
在一个实施方案中，X-独立地为卤素阴离子(即卤素离子)。
在一个实施方案中，X-独立地为Cl-、Br-或I-。
在一个实施方案中，X-独立地为Cl-.
在一个实施方案中，X-独立地为NO3 -.
组合
在本申请中公开了上述实施方案的所有可能组合，就如同每种组合单独而详尽地记载了那样。
异构体
某些化合物可能以一种或多种特定的形式存在，所述形式为几何异构形式、光学形式、对映异构形式、非对映异构形式(diasteriomeric)、差向异构形式(epimeric)、阻转异构形式(atropic)、立体异构形式、互变异构形式、构象异构形式(conformational)或端基异构形式(anomeric forms)，包括但不限于顺式-和反式-形式；E-和Z-形式；c-、t-和r-形式；内(endo-)和外(exo-)形式；R-、S-和内消旋-形式；D-和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮-、烯醇-和烯醇化物-形式；顺(syn)-和反(anti)-形式；顺错(synclinal)-和反错(anticlinal)-形式；α-和β-形式；轴(axial)和平展(equatorial)形式；船式-、椅式-、扭转-、信封式-和半椅式；及它们的组合，下文中统称为"异构体"(或"异构体形式")。
需要注意的是，除以下讨论中对互变异构形式之外，从本发明使用的术语“异构体”中明确排除了结构异构体(或constitutional isomer)(即在原子间联接方面就存在不同的异构体，而不仅仅是原子在空间位置的不同)。例如，不能将甲氧基-OCH3解释为其结构异构体羟甲基-CH2OH。类似地，不能将邻-氯苯基解释为其结构异构体间氯苯基。然而，当提到一类结构时，该类结构包括落入该类结构范围内的结构异构形式(如C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基和对甲氧基苯基)。
上述例外不涉及互变异构体形式，例如酮-、烯醇-和烯醇化物-形式，如以下的互变异构体对那样：酮/烯醇(如下所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚胺醇、脒(amidine)/脒(amidine)、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮和硝基/酸式-硝基。
需要注意的是，具体地，术语“异构体”包括具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是其任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可以是其任何同位素形式，包括11C、12C、13C和14C；O可以是其任何同位素形式，包括16O和18O；依此类推。
除非另有说明，当提到具体化合物时，包括所有这些异构体形式，包括(全部或部分)的外消旋体和它们的其它混合物。这些异构形式的制备方法(如不对称合成)和分离方法(如分步结晶和色谱法)是本领域已知的或可采用本发明披露的的方法或采用已知方法按照已知方式很容易地制备得到。
盐
可以很方便或可能需要制备、纯化和/或处理所述化合物的盐，例如可药用盐。可药用盐的例子如在Berge等人，1977,"Pharmaceutically AcceptableSalts,"J.Pharm.Sci.,卷66，1-19页中讨论的那些。
例如，如果化合物是阴离子性的或者具有可以是阴离子性的官能团(如-COOH可以为-COO-)，则盐可由合适的阳离子形成。合适的无机阳离子的例子包括但不限于碱金属离子如Na+和K+，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+，其它阳离子如Al+3。合适的有机阳离子的离子包括但不限于铵离子(即NH4 +)和经取代的铵离子(如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的经取代的铵离子的例子为衍生自如下的那些：乙胺、二乙基胺、二环己基胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄基胺、胆碱、葡甲胺和氨基丁三醇，以及氨基酸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的例子为N(CH3)4 +。
如果所述化合物为阳离子性的或者具有可以是阳离子性的官能团(如-NH2可以为-NH3 +)，则盐可由合适的阴离子形成。合适的无机阴离子的例子包括但不限于衍生自下述无机酸的那些：氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的例子包括但不限于衍生自下述有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二磺酸(ethanedisulfonic)、乙磺酸(ethanesulfonic)、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基乙酸、羟基马来酸、羟萘酸(hydroxynaphthalene carboxylic)、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸(pamoic)、泛酸(pantothenic)、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和缬草酸(valeric)。合适的多有机阴离子(polymeric organic anions)包括但不限于衍生自下述多元酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素。
所述化合物也可以混盐(mixed salt)的形式提供(即所述化合物与一种盐或另一种盐结合)。例如，甲基-锍氯化物氯化锌混盐(MTZ)是一种甲基-锍氯化物(MTC)(氯化物盐)和另一种盐，即氯化锌的混盐。这些混盐可由术语“及(或)其可药用盐”涵盖。
除非另有说明，否则当提到某特定化合物时，还包括其盐的形式。
水合物和溶剂化物
可以很方便或可能需要制备、纯化和/或处理所述活性化合物的相应溶剂化物。本申请使用的术语“溶剂化物”具有常规含义，是指溶质(如化合物、化合物的盐)与溶剂的复合物(complex)。如果溶剂是水，则溶剂化物可便利地为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
除非另有说明，否则当提到特定化合物时，也包括其溶剂化物。
一些优选实施例
一些优选的二氨基吩噻嗪类化合物包括如下所述化合物及其可药用盐、水合物和溶剂化物。
在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪选自：MTC、ETC、DEMTC、DEETC、硫堇和托洛氯铵(也已知称作Toluidine Blue O)。
本发明优选的化合物为在本申请的试验中表现出高活性的那些化合物。
聚集的抑制
在本发明的所有治疗方面和其它方面，优选的是所述二氨基吩噻嗪为基本上被氧化的形式，如至少50、60、70、80、90、95、99或100％被氧化的形式。
因此，本发明第一方面披露了二氨基吩噻嗪抑制例如细胞中突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)的聚集中的用途。
在疾病状态(disease state)的情况下，所述聚集可表现为神经变性和/或临床痴呆。
另一方面，本发明提供二氨基吩噻嗪化合物，该化合物用在处置或治疗人体或动物体的方法中，例如用在治疗或预防与突触核蛋白(特别是与α-突触核蛋白)聚集有关的神经变性疾病和/或临床痴呆的方法中。
在另一方面，本发明提供二氨基吩噻嗪在制备用于抑制突触核蛋白(特别是抑制α-突触核蛋白)聚集的药物中的用途，所述聚集与表现为神经变性和/或临床痴呆的疾病状态有关，例如用于治疗或预防与突触核蛋白聚集有关的神经变性疾病和/或临床痴呆的药物。
另一方面，本发明提供治疗或预防与突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)聚集有关的神经变性疾病和/或临床痴呆的方法，该方法包括向受试者给药预防有效量的或治疗有效量的二氨基吩噻嗪，或给药含有该化合物的治疗组合物，从而抑制突触核蛋白聚集。
另一方面，本发明提供调节哺乳动物的脑中突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)聚集的方法，所述聚集与如下讨论的疾病状态有关，所述治疗包括向所述需要这种治疗的哺乳动物给药预防有效量的或治疗有效量的二氨基吩噻嗪的步骤。
在另一方面，本发明提供抑制哺乳动物的脑中突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)聚集体产生的方法，该治疗如上所述。
在另一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物与突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)聚集有关的疾病的药物产品，该哺乳动物患有由所述聚集导致的疾病，该药物产品包括容器，所述容器标有或带有说明所述药物是用于治疗所述疾病的标签，所述容器含有一个或多个剂量单位，每个单位含有至少一种可药用的赋型剂和作为活性成分的、单独的、纯的选自上述的本发明二氨基吩噻嗪化合物。
二氨基吩噻嗪可以单独给药，或与其它治疗剂或方法联合使用，根据要治疗的病症或疾病同时或顺序给药。特别是，通常希望与其它相关蛋白聚集反应抑制剂共同使用或配制二氨基吩噻嗪类化合物。
优选的联合是如上所述的二氨基吩噻嗪化合物的一种或多种加上能调节要进行治疗的哺乳动物多巴胺水平的化合物。这样的另外化合物可包括左旋-DOPA和多巴胺能激动剂如罗平尼咯(参见如Olanow,c.W.2004,The scientific basis for thecurrenttreatment of Parkinson's disease,Ann.Rev.med.55:41-60)。
在每种情况下，优选的哺乳动物为人类。
配体
本发明讨论的能够抑制α-突触核蛋白聚集的二氨基吩噻嗪也能用作α-突触核蛋白(或聚集的α-突触核蛋白)的配体或标记(labels)。因此，在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪为配体，如突触核蛋白(或聚集的突触核蛋白)，特别是α-突触核蛋白的配体。
这些二氨基吩噻嗪化合物(配体)可以与其它化学基团结合(incorporate)、连接(conjugated)、螯合(chelated)或联合(associated)，所述其它化学基团为可检测的标记，例如稳定的或不稳定的可检测同位素、放射性同位素、正电子发射原子(positron-emitting atoms)、磁共振标记(magnetic resonance labels)、染料、荧光标记物、抗原基团(antigenicgroups)、治疗部分(therapeutic moieties)或其它任何有助于预防、诊断或治疗用途的原子或基团。
例如，在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪化合物如上所定义，但是附加的限定是将所述化合物与一个或多个(如1、2、3、4个等)同位素、放射性同位素、正电子发射原子、磁共振标记、染料、荧光标记物、抗原基团、治疗部分结合、连接、螯合或联合。
在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪化合物为配体，也是标记，如针对α-突触核蛋白(或聚集的α-突触核蛋白)的标记，并且与一个或多个(如1、2、3、4个等)可检测标记结合、连接、螯合或联合。
例如，在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪化合物如上所定义，但是附加的限定是将所述化合物与一个或多个(如1、2、3、4个等)可检测标记结合、连接、螯合或联合。
在一个实施方案中，所述可检测标记为稳定的可检测同位素、不稳定的可检测同位素、放射性同位素(例如99Tc)、正电子发射原子(例如11C、18F)、磁共振标记(例如19F)、染料、荧光基团或抗原基团，或结合有稳定的可检测同位素、不稳定的可检测同位素、放射性同位素(例如99Tc)、正电子发射原子(例如11C,18F)、磁共振标记(例如19F)、染料、荧光基团或抗原基团。
可以通过任何合适的手段显现或检测经标记的二氨基吩噻嗪化合物(例如，当配合到α-突触核蛋白或聚集的α-突触核蛋白时)，本领域技术人员能够理解的是可使用任何本领域已知的合适检测手段。
例如，所述二氨基吩噻嗪化合物(配体-标记)可以合适地如下检测：结合正电子发射原子(例如11C)(例如作为一个或多个烷基取代基(如甲基取代基)中的碳原子)，并用本领域已知的正电子发射断层扫描术(PET)对所述化合物进行检测。
例如，在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪化合物如上所定义，但是附加的限定是二氨基吩噻嗪化合物的至少一个(如1、2、3、4个等)环碳原子为正电子发射原子，例如11C；和/或取代基R1、R2、R4、R6、R8、R9、R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB、R7NC和RN10中的至少一个(如1、2、3、4个等)上的至少一个(如1、2、3、4个等)碳原子为正电子发射原子，例如11C。
在一个实施方案中，取代基R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB和R7NC中的至少一个(如1、2、3、4个等)上的至少一个碳原子(如1、2、3、4个等)为正电子发射原子，例如11C。
在一个实施方案中，取代基R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB和R7NC中的至少一个(如1、2、3、4个等)为-11CH3。
这些二氨基吩噻嗪化合物的例子(即结合有PET可检测的正电子发射原子的化合物)包括如下所列的这些：
制备上述这些化合物和相似的11C标记的二氨基吩噻嗪类化合物的合适方法公开在例如WO 02/075318(参见图11a、11b、12)和WO 2005/030676中。
可选择地或额外地，所述二氨基吩噻嗪可连接到螯合基团(即适用于通过形成复合物或螯合物而连接到另一分子或原子或离子的部分)(例如放射同位素螯合基团，如锝-螯合基团，例如二亚乙基三胺五乙酸基团)，其螯合到可检测标记(例如放射同位素，例如99Tc)上。
例如，在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪化合物如上所定义，但是附加的限定是取代基R1、R2、R4、R6、R8、R9、R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB、R7NC和RN10中的至少一个(如1、2、3、4个等)为螯合基团或结合有螯合基团(如锝-螯合基团，如二亚乙基三胺五乙酸基团)，其能螯合到可检测标记(如放射同位素，如99Tc)上。
可选择地或额外地，所述二氨基吩噻嗪化合物可结合磁共振标记(例如19F)，因此适用于MRI成像(参见如Higuchi等人，Nat Neurosci.2005Apr；8(4):527-33)。
例如，在一个实施方案中，所述二氨基吩噻嗪化合物如上所定义，但附加的限定为取代基R1、R2、R4、R6、R8、R9、R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB、R7NC和RN10中的至少一个(如1、2、3、4个等)为磁共振标记或结合有磁共振标记(如19F，如-19F、-C(19F)3，等)。
因此，一个方面，本发明提供标记突触核蛋白(或聚集的突触核蛋白)，特别是α-突触核蛋白的方法，该方法包括如下步骤：将突触核蛋白(或聚集的突触核蛋白)与二氨基吩噻嗪化合物接触，所述化合物结合、连接、螯合或联合可检测标记。
另一方面，本发明提供一种检测突触核蛋白(或聚集的突触核蛋白)，特别是α-突触核蛋白的方法，包括如下步骤：将突触核蛋白(或聚集的突触核蛋白)与二氨基吩噻嗪接触，该化合物结合、连接、螯合或联合可检测标记，检测与突触核蛋白(或聚集的突触核蛋白)结合的所述化合物的存在和/或其量。
在另一方面，本发明提供一种诊断或预测(prognosis)被认为患有突触核蛋白病的受试者中所述疾病的方法，包括如下步骤：
(i)向所述受试者中引入能标记突触核蛋白或聚集的突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)的二氨基吩噻嗪化合物(例如与可检测标记结合、连接、螯合或联合的二氨基吩噻嗪)，
(ii)检测所述受试者的脑中结合与突触核蛋白或聚集的突触核蛋白结合的所述化合物的存在和/或其量，
(iii)将(ii)得到的检测结果与受试者的疾病状态相关联。
在另一方面，本发明提供能够标记突触核蛋白或聚集的突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)的二氨基吩噻嗪化合物(例如与可检测标记结合、连接、螯合或联合的二氨基吩噻嗪)，以用在诊断或预测突触核蛋白病的方法中。
在另一方面，本发明提供能够标记突触核蛋白或聚集的突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)的二氨基吩噻嗪化合物(如与可检测标记结合、连接、螯合或联合的二氨基吩噻嗪化合物)在制备用在诊断或预测突触核蛋白病中的诊断剂或预测剂(prognosticreagent)方法中的用途。
本领域技术人员能理解的是，二氨基吩噻嗪配体物/标记物可以以前体形式给药，通过所述受试者中存在的活化剂或服用的活化剂而转化为活性形式(如配合形式、标记形式)，而不是直接给药这些二氨基吩噻嗪配体物/标记物。
疾病
本发明涉及的疾病状态为突触核蛋白病。
本领域技术人员将会意识到，术语“突触核蛋白病”用于一类神经变性障碍的称谓，这类障碍的特点是突触核蛋白(特别是α-突触核蛋白)的原纤维聚集体在神经元和神经胶质的选择性群体的胞质中，并且特别是其中含有突触核蛋白的内含物的存在是所述疾病的病征。
这应当将该疾病与非-突触核蛋白病区分开，在非-突触核蛋白病中，除了其它病理原因外，含突触核蛋白的内含物可能存在或可能不存在。
所述突触核蛋白病目前包括如下疾病：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、卢易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)、多系统萎缩症(multiple system atrophy,MSA)、药物诱发帕金森综合征(drug-induced parkinsonism)(如由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶[MPTP]或杀虫剂如鱼藤酮诱发的帕金森综合征)和单纯性自主神经衰竭(pureautonomic failure,PAF)。
可能发现有卢易体的非-突触核蛋白病包括如下疾病：阿尔茨海默氏病、匹克病/额颞痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、共济失调-毛细管扩张症(ataxia telangectasia)、皮质延髓变性(cortico basal degeneration)、张力失常(dystonia)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)、神经轴索性营养不良(neuraxonal dystrophy)、亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosingpanencephalitis)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、ALS-关岛痴呆综合征(ALS-dementia guam complex)、米尔罗伊综合征(Meige’s syndrome)和哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease,HSD)(伴有脑铁的神经变性疾病)。LB通常发生在各种神经变性疾病中。研究表明不管潜在的疾病，α-突触核蛋白原纤维在神经元中的形态具有基本的相似性。
与MSA的发病率(4/100,000)，帕金森病具有高发病率(约100/100,000)。
采用DLB作为共同名称，以涵盖其它几种早就存在的疾病(McKeith,I.g.等人(1996)."Consensusguidelines for theclinical and pathologic diagnosis ofdementia with Lewy bodies(DLB):report of theconsortium on DLB internationalworkshop.Neurology,47,1113-1124."Neurology 47:1113-1124)。这些疾病包括卢易体老年痴呆、阿尔茨海默氏病的卢易体变体、皮质卢易体痴呆症(cortical Lewy bodydementia)和卢易体痴呆。MSA涵盖夏-德综合征(MSA encompasses Shy Dragersyndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellar atrophy)和纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)。据报道，DLB是继阿尔茨海默氏病后老年人痴呆中第二常见疾病类型。
帕金森病的特征在于黑质中的LB，但是也在皮质中发现了LB。DLB的特征在于出现更多的皮质LB。据发现，在MSA中，丝状内含物(称作神经胶质细胞质内含物(glialcytoplasmic inclusions,GCI))主要存在于少突胶质细胞中。LB中的组分细丝的性质直到1997年才弄清楚，当时的两个发现确定了其主要组分：(i)α-突触核蛋白中的错义突变经发现能导致家族性PD的罕见形式(Polymeropoulos,m.H.等人(1997)."Mutation intheα-synucleingene identified in families with’s disease."Science 276:2045-2047)，和(ii)在特发性的PD和DLB中的LB和LN经发现对α-突触核蛋白为免疫活性的(Spillantini,m.g.等人(1997)."α-synuclein in Lewy bodies"Nature 388:839-840)。重组α-突触核蛋白可在体外形成细丝(filaments)。该蛋白为天然未折叠蛋白。在产生该蛋白质聚集体(protein aggregates)的疾病中，其与β-折叠结构形成原纤维。
优选地，本发明所述化合物用于突触核蛋白病中，所述突触核蛋白病选自PD、PAF、MSA和HSD。
受试者的选择
本发明披露的配体可用作诊断或预测方法的一部分。可用其选择要进行治疗的患者，或用于评估治疗或治疗剂的有效性，所述治疗剂为例如给药到受试者的α-突触核蛋白相关抑制剂。
用于所述方法的合适受试者可以基于通常的因素进行选择。因此，最初对患者的选择可能涉及如下的一个或多个：通过有经验的临床医生的严格评价；通过增补实验和其它研究方法尽可能排除非-AD诊断；利用神经病理有效的实验组客观评价认知功能的水平。
剂量单位和制剂及化合物的给药
给药本申请所述的化合物、组合物和药物优选采用“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防也可能被认为是治疗)，这足以对个体产生有益效果。
对于配体，所述量是诊断有效量的，该量在含有突触核蛋白病的患者体内含有产生可检测的结合。
对于药物，实际给药量和给药的速度及时程依赖于要进行治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方如剂量的确定，是在全科医师和其它医生的责任范围内，并且典型地需要考虑进行治疗的疾病、患者个体的状况、给药部位、给药方法和医师已知的其它因素。
尽管本发明也涉及用在动物上(如出于试验目的或兽用治疗目的)，但典型地，所述哺乳动物为人类。
本发明吩噻嗪的例子是本领域已知的，并可参考标准教材记载的方法进行制备(如Merckmanual,Houben-Weyl,BeilsteinE III/IV 27,1214ff,J.Heterocycl.chem 21,613(1984)，等等)。上述结构式的化合物、它们的可药用盐或经发现具有由所提供的试验定义的性质的其它化合物可在经进一步毒性试验后用做药物(如采用药物制剂的形式)。
已经披露了亚甲蓝具有很广范围的医学适应症，包括治疗高铁血红蛋白症(methaemoglobineamia)和预防躁郁症(Naylor(1986)Biol.Psychiatry 21,915-920)，并且还描述了全身给药后的CNS穿透(CNS penetration)(Muller(1992)Acta Anat.,144,39-44)。天蓝A和天蓝B的产生是亚甲蓝的正常代谢降解(Disanto and Wagner(1972a)J.Pharm.Sci.61,598-602；Disanto and Wagner(1972b)J.Pharm.Sci.61 1086-1094)。药物的给药可如下进行：经肠胃(例如口服，采用片剂、包衣片剂、锭剂、硬明胶胶囊和软明胶胶囊、溶液剂、乳剂或混悬剂形式)、经鼻给药(如采用鼻腔喷雾形式)或直肠给药(如采用栓剂形式)。所述给药也可经非肠胃(parentally)，例如肌内注射或静脉注射(如采用注射液形式)进行。
除了上述组分外，所述组合物还可能包括：可药用赋型剂、防腐剂、助溶剂、增粘剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂或包衣剂。这些物质应当是非毒性的，并且不应影响活性成分的有效性。所述载体或其它物质的确切形式可取决于给药途径。各种技术和方案的实例记载在“Remington’s PharmaceuticalSciences”,16thedition,Osol,A.(ed.),1980。
当将所述组合物配制成药物组合物时，该药物组合物可如下进行：经肠胃(例如口服给药，采用散剂、片剂、包衣片剂、锭剂、硬明胶胶囊和软明胶胶囊、溶液、乳剂或悬浮剂形式)、经鼻给药(如采用鼻腔喷雾形式)或直肠给药(如采用栓剂形式)。然而，所述给药也可非肠胃，例如肌内注射或静脉注射(如采用注射液形式)进行。
因此，例如，当所述药物组合物采用片剂形式时，其可包括固体载体如明胶或助剂。对于片剂、包衣片剂、锭剂、硬明胶胶囊和软明胶胶囊的制备，可将活性化合物及其可药用酸加成盐与药用惰性的、无机或有机赋型剂一起加工。可以使用乳糖、玉米(maize)、淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸及其盐，等等，例如用于片剂、锭剂、硬明胶胶囊和软明胶胶囊的赋型剂。用于软明胶胶囊的合适赋型剂为如植物油、蜡、脂肪物质、半固体和液体多元醇等。当所述组合物采用液体药物制剂形式时，其通常包括液体载体如水、石油醚、动物油或植物油、矿物油或合成油。也可包括生理盐水溶液溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。其它合适的制备溶液和糖浆剂的赋型剂为如水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、海藻糖(trihalose)，等等。针对注射溶液的合适赋型剂为如水、醇、多元醇、甘油、植物油，等。对于静脉注射、皮肤注射或皮下注射或对于腔内灌输到脑中，所述活性成分可采用非肠道-可接受的水溶液形式，该形式不含热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够利用如等渗载体，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏(注射液)制备合适的溶液。如果需要，也可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂和/或其它添加剂。
本申请化合物在作为配体的用途中也可采用相似载体或组合物。
因此，本发明一方面将二氨基吩噻嗪(如MTC)用在治疗或医治人或动物的方法中，该方法优选包括口服给药有效量的二氨基吩噻嗪。
优选地，所述药物适用于口服给药，优选采用固体剂量单位形式。
优选地，所述剂量口服给药。优选地，每天总剂量为小于或等于400、300、200或100mg。例如，其可包括如下剂量单位：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130mgt.i.d.(一天三次)
可选择地，其可包括如下剂量单位：10、20、30、40、50、70、60、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg b.i.d.(一天2次)。
优选地，所述治疗将持续或至少持续2、3或4周。
针对这些剂量的说明可以记载在书面说明中，或置于本发明药物产品的容器中。
当给药采用静脉给药形式时，优选的是，所述二氨基吩噻嗪不是MTC。
本发明还涉及以下项：
1.二氨基吩噻嗪化合物在制备用于抑制或逆转突触核蛋白聚集的药物中的用途，其中所述化合物选自下述结构式的化合物或其可药用盐、混盐、水合物或溶剂化物：
其中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：
-H；
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR；
-SH；-SR；
-NO2；
-C(＝O)R；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR；
-C(＝O)NH2；-C(＝O)NHR；-C(＝O)NR2；-C(＝O)NRN1RN2；
-NH2；-NHR；-NR2；-NRN1RN2；
-NHC(＝O)H；-NRC(＝O)H；-NHC(＝O)R；-NRC(＝O)R；和
-R；
其中，各R独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
其中，在每个-NRN1RN2基团中，独立地，RN1和RN2与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环；
并且其中，如果存在-NR3NAR3NA基团，则在每个-NR3NAR3NA中：
R3NA和R3NB各自独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
或者：R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环；
并且其中，如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
并且其中，如果存在-NR7NAR7NA基团，则在每个-NR7NAR7NA基团中：
R7NA和R7NB各自独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
或者：R7NA和R7NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环；
并且其中，如果存在＝NR7NC基团，则在每个＝NR7NC基团中，R7NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
并且其中如果存在RN10，则RN10独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
并且其中，如果存在X-，则X-为一个或多个阴离子反离子，从而实现电中性。
2.项1所述的用途，其中所述化合物选自式(2)化合物或其可药用盐、混盐、水合物和溶剂化物。
3.项1所述的用途，其中所述化合物选自式(3)化合物或其可药用盐、混盐、水合物和溶剂化物。
4.项1所述的用途，其中所述化合物选自式(4)化合物或其可药用盐、混盐、水合物和溶剂化物。
5.项1-4任一所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：
-H；
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR；和
-R。
6.项1-4任一所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：
-H；
-R。
7.项1-6任一所述的用途，其中R独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
8.项1-6任一所述的用途，其中R独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；和经取代的脂肪族C1-6烷基。
9.项1-8任一所述的用途，其中如果存在R上的取代基，则所述取代基独立地选自：
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR’；
-SH；-SR’；
-NO2；
-C(＝O)R’；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR’；
-C(＝O)NH2；-C(＝O)NHR’；-C(＝O)NR’2；-C(＝O)NR’N1R’N2；
-NH2；-NHR’；-NR’2；-NR’N1R’N2；
-NHC(＝O)H；-NR’C(＝O)H；-NHC(＝O)R’；-NR’C(＝O)R’；和
-R’；
其中，各R’独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基；
其中，在每个-NR’N1R’N2基团中，独立地，R’N1和R’N2与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
10.项1-8任一所述的用途，其中如果存在R上的取代基，则所述取代基独立地选自：
-F；-Cl；-Br；-I；
-OH；-OR’；
-C(＝O)OH；-C(＝O)OR’；和
-R’。
11.项9或10所述的用途，其中各R’独立地选自：
未经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；
未经取代的C3-6环烷基；
未经取代的C6-10碳芳基；
未经取代的C5-10杂芳基；和
未经取代的C6-10碳芳基-C1-4烷基。
12.项1-6任一所述的用途，其中各R独立地选自：-Me、-Et、-nPr和-iPr。
13.项1-4任一所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
14.项1-4任一所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H、-Me和-Et。
15.项1-4任一所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H和-Me。
16.项1-4任一所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9为-H。
17.项1-16任一所述的用途，其中如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
或者，R3NA和R3NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
18.项1-16任一所述的用途，其中，如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
19.项1-16任一所述的用途，其中如果存在-NR3NAR3NB基团，则在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H和-Me。
20.项1-16任一所述的用途，其中如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
21.项1-16任一所述的用途，其中如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
22.项1-16任一所述的用途，其中如果存在＝NR3NC基团，则在每个＝NR3NC基团中，R3NC独立地选自：-H和-Me。
23.项1-22任一所述的用途，其中如果存在-NR7NAR7NB基团，则在每个-NR7NAR7NB基团中，R7NA和R7NB各自独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基；
或R7NA和R7NB与它们相连的氮原子一起形成具有3-7个环原子的环。
24.项1-22任一所述的用途，其中如果存在-NR7NAR7NB基团，则在每个-NR7NAR7NB基团中，R7NA和R7NB独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
25.项1-22任一所述的用途，其中如果存在-NR7NAR7NB基团，则在每个-NR7NAR7NB基团中，R7NA和R7NB各自独立地选自：-H和-Me。
26.项1-22任一所述的用途，其中如果存在＝NR7NC基团，则在每个＝NR7NC基团中，R7NC独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
27.项1-22任一所述的用途，其中如果存在＝NR7NC基团，则在每个＝NR7NC基团中，R7NC独立地选自：-H、-Me、-Et、-nPr和-iPr。
28.项1-22任一所述的用途，其中如果存在＝NR7NC基团，则在每个＝NR7NC基团中，R7NC独立地选自：-H和-Me。
29.项1-28任一所述的用途，其中如果存在RN10，则RN10独立地选自：
-H；
未经取代的脂肪族C1-6烷基；经取代的脂肪族C1-6烷基；
未经取代的脂肪族C2-6烯基；经取代的脂肪族C2-6烯基；和
未经取代的C3-6环烷基；经取代的C3-6环烷基。
30.项1-28任一所述的用途，其中如果存在RN10，则RN10独立地选自：-H和未经取代的脂肪族C1-6烷基。
31.项1-28任一所述的用途，其中如果存在RN10，则RN10独立地选自：-H、-Me和-Et。
32.项1-28任一所述的用途，其中如果存在RN10，则RN10独立地为-H。
33.项1-32任一所述的用途，其中如果存在X-，则X-为一个或多个阴离子反离子，从而实现电中性，X-任选地选自Cl-、Br-和I-。
34.项1所述的用途，其中所述化合物选自下列化合物或其可药用盐、混盐、水合物和溶剂化物：
35.项1-34任一所述的二氨基吩噻嗪化合物的用途，其用于抑制或逆转突触核蛋白聚集。
36.项1-35任一所述的用途，其中所述聚集与表现为神经变性和/或临床痴呆的疾病状态有关。
37.项1-34任一所述的二氨基吩噻嗪化合物在制备用于治疗或预防受试者中与突触核蛋白聚集有关的神经变性疾病和/或临床痴呆的药物中的用途。
38.一种治疗或预防与突触核蛋白聚集有关的神经变性疾病和/或临床痴呆的方法，所述方法包括向受试者给药预防有效量或治疗有效量的项1-34任一所述的二氨基吩噻嗪化合物或含有该化合物的治疗组合物，从而抑制突触核蛋白聚集。
39.一种调节或抑制哺乳动物的脑中突触核蛋白聚集的方法，所述聚集与表现为神经变性和/或临床痴呆的疾病状态有关，所述治疗包括向需要所述治疗的哺乳动物给药预防有效量的或治疗有效量的项1-34任一所述二氨基吩噻嗪化合物的步骤。
40.一种用于治疗患有与突触核蛋白聚集有关的疾病状态的哺乳动物中所述疾病的药物产品，该药物产品包括容器，所述容器标有或带有指明所述药物是用于治疗所述疾病的标签，所述容器含有一个或多个剂量单位，每个单位含有至少一种可药用的赋型剂和作为活性成分的、单独的、纯的项1-34任一所述的二氨基吩噻嗪化合物。
41.项37-40任一所述的用途、方法或产品，其中所述治疗包括将所述二氨基吩噻嗪化合物与调节要进行治疗的哺乳动物中多巴胺水平的化合物联合给药。
42.项37-41任一所述的用途、方法或产品，其中在所述治疗中，将二氨基吩噻嗪化合物口服给药。
43.项37-42任一所述的用途、方法或产品，其中每天给药总剂量多于或等于400、300、200或100mg。
44.项43所述的用途、方法或产品，其中给药剂量单位为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130mg，每天三次。
45.项43所述的用途、方法或产品，其中给药剂量单位为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg，每天2次。
46.项1-45任一所述的用途、方法或产品，其中所述药物中，式(1)化合物或其可药用盐、混盐、水合物或溶剂化物的量为二氨基吩噻嗪化合物总量的少于50％。
47.能够标记聚集的突触核蛋白的二氨基吩噻嗪化合物在制备用于诊断或预测突触核蛋白病的诊断剂或预测剂的方法中的用途，
其中所述二氨基吩噻嗪化合物如项1-34任一所述，并结合、连接、螯合或联合有一种或多种同位素、放射性同位素、正电子发射原子、磁共振标记、染料、荧光标记物或抗原基团。
48.项47所述的用途，其中二氨基吩噻嗪化合物的至少一个环碳原子为正电子发射碳原子和/或至少一个如下取代基中的至少一个碳原子为正电子发射碳原子，所述取代基为：R1、R2、R4、R6、R8、R9、R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB、R7NC和RN10。
49.项47或项48所述的用途，其中二氨基吩噻嗪化合物的至少一个环碳原子为11C和/或至少一个如下取代基中的至少一个碳原子上为11C，所述取代基为：R1、R2、R4、R6、R8、R9、R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB、R7NC和RN10。
50.项47-49任一所述的用途，其中至少一个如下取代基中的至少一个碳原子为11C，所述取代基为R3NA、R3NB、R3NC、R7NA、R7NB和R7NC。
51.项48所述的用途，其中所述化合物选自下列化合物或其可药用盐、混盐、水合物和溶剂化物：
52.一种标记聚集的突触核蛋白的方法，包括如下步骤：将聚集的突触核蛋白与项47-51任一所述的二氨基吩噻嗪化合物接触。
53.一种检测聚集的突触核蛋白的方法，包括如下步骤：将所述聚集的突触核蛋白与项47-51任一所述的二氨基吩噻嗪化合物接触，并检测与聚集的突触核蛋白结合的所述化合物的存在和/或其量。
54.一种诊断或预测被认为患有突触核蛋白病的受试者中所述疾病的方法，包括如下步骤：
(i)向受试者中引入项47-51任一所述的二氨基吩噻嗪化合物，
(ii)检测受试者脑中与突触核蛋白或聚集的突触核蛋白结合的所述化合物的存在和/或其量，
(iii)将(ii)中得到的检测结果与受试者的疾病相关联。
55.项37-45或54任一所述的用途、方法或产品，其中所述受试者或哺乳动物为人类。
56.项36-45，或47-51，或54任一所述的用途、方法或产品，其中所述疾病选自：帕金森病(PD)、卢易体痴呆(DLB)、多系统萎缩症(MSA)、药物诱发帕金森综合征；和单纯性自主神经衰竭(PAF)。
57.项56的用途、方法或产品，其中所述疾病选自PD、PAF、MSA和HSD。
58.前述任一项所述的用途、方法或产品，其中所述突触核蛋白为α-突触核蛋白。
59.前述任一项所述的用途、方法或产品，其中所述突触核蛋白为β-突触核蛋白。
对于本发明引用的任何交叉参考披露的内容，本领域技术人员可根据需要补充到本发明中，因此将这些交叉参考专门并入本申请。
通过参考如下非限定附图和实施例对本发明做进一步披露。本领域技术人员根据这里公开的内容可想到本发明的其它实施方案。
附图说明
图1.利用硫酸铵对tsyn分级和Ni-亲和色谱纯化的样品。通过15％SDS-PAGE和考马斯蓝(Coomassie Blue)染色，以对样品进行分析。
图2.利用硫酸铵对tsyn分级和DEAE-Sepharose阴离子交换层析纯化的样品。通过15％SDS-PAGE和考马斯蓝染色对样品进行分析。
图3.利用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和CM-凝胶阳离子交换层析对fsyn纯化的样品。通过15％SDS-PAGE和考马斯蓝染色对样品进行分析。
图4.通过tsyn和fsyn的原纤维形成的时程，该时程经硫黄素T和樱草黄的荧光监测。将在20mM Tris.HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、pH7.5，加上50μg/ml肝素(经指示)中的1mg/ml(A)tsyn-8和2mg/m fsyn-14(B)在37℃搅拌培养。通过将10μl所述培养物加入到总体积为100μl的1μM硫黄素T或樱草黄中来分析原纤维形成，测量激发光谱，发射波长为480nm。在测量位于激发峰的信号之前从光谱中减去针对单独荧光团的信号(樱草黄为420nm，硫黄素T为450nm)。
图5.MTC和ETC对经组装的tsyn诱导的硫黄素T或樱草黄荧光的效果。将1mg/ml(～95μM)Tsyn-13加上50μg/ml肝素在37℃培养20h，然后将等分与MTC(A、C)或ETC(B、D)混合，得到所示浓度(μM)，再培养1h。将10μl所述蛋白质加到总体积为100μl的1μM硫黄素T(A,B)或樱草黄(C,D)中，测量激发光谱，发射波长为480nm。显示的迹线为从来自蛋白质加上荧光团和化合物的信号中减去荧光团加上化合物的信号所得到的结果。
图6.MTC和ETC对经组装的fsyn-14诱导的樱草黄荧光的效果。将将2mg/ml(～140μM)蛋白质加上50μg/ml肝素在37℃培养47h，然后将等份与MTC(A、C)或ETC(B、D)混合，得到所示浓度(μM)，再培养1h。将10μl所述蛋白质加到总体积为100μl的樱草黄中，测量激发光谱，发射波长为480nm。显示的记录为从来自蛋白质加上荧光团和化合物的信号中减去荧光团加上化合物的信号所得到的结果。
图7.MTC和ETC对经组装的tsyn或fsyn诱导的硫黄素T或樱草黄荧光的效果。从图5显示的记录中测得针对tsyn-8(A)的荧光值或从图6显示的记录中测得针对fsyn-14(B)的荧光值，并且归一化到没有化合物情况下的测量值。
图8.MTC和ETC对经组装的tsyn诱导的硫黄素T或樱草黄荧光的效果，针对不同浓度的硫黄素T和樱草黄进行分析。组装Tysn-16并如图5所述分析MTC或ETC的效果，不同的是硫黄素T和樱草黄为0.2、1或5μM。校准背景后，将荧光峰值归一化到没有化合物情况下的测量值，并作为化合物浓度函数绘图。MTC(A、B)或ETC(C、D)的效果用硫黄素T(A,c)或樱草黄(B,D)监测。
图9.水相fsyn与固相tsyn的结合。0-10μM的fsyn-20与以0-2μM结合在固相上的tsyn-13一起培养，利用抗体211对结合的fsyn进行检测。
图10.化合物对突触核蛋白-突触核蛋白结合的影响。在所示化合物存在下，将水相中的5μM fsyn-10与固相中的1μM tsyn-13一起培养。
图11.MTC对樱草黄荧光的影响。
图12.MTC对硫黄素T和樱草黄荧光的影响。
图13.DEETC对SSFsyn在NIE细胞中的表达的抑制作用。每种药物浓度(0-100nM)均一式三份地进行。加入DEETC和dbcAMP，2天后通过免疫印迹用mAb 42分析细胞。
图14.用mAb 42检测到的额外蛋白带的存在，但用mAb 211没有检测到。道1，未处理的；道2、3、4，三个独立的板，利用dbcAMP进行区分。
图15.在表达SSFsyn的NIE细胞中的聚集的α-突触核蛋白。左组，SSFsyn细胞；右组，非转染的，在dbcAMP处理后的对照NIE-115细胞。
图16.在表达SSFsyn的NI细胞中的聚集的α-突触核蛋白。用得克萨斯红-标记的-α-突触核蛋白(左)染色的SSFsyn细胞；右组，樱草黄标记；中间组，合并的图像，显示了抗体和樱草黄标记的共区域化。
图17.MTC对tsyn聚合的影响。在所示浓度的MTC的存在下，将在20mMTris.HCl、pH7.5,50μg/ml肝素中的1mg/ml(95μM)tsyn-16在37℃搅拌培养。在不同时间取样品(10μl)，分析它们1μM时对硫黄素T(上方组)或樱草黄(下方组)荧光的影响。
图18.针对不同syn制剂的结合曲线。将结合到ELISA板上的1μMTsyn-13与所示三种不同syn制剂的一系列稀释液一起培养。水相缓冲液为20mM Tris.HCl、50mM NaCl、pH7.5、0.05％Tween-20、1％鱼鳞胶(fishskingelatine)。
图19A和19B:在不同缓冲液中的syn-10结合曲线。将结合到ELISA板上的1μMTsyn-13与syn-10的一系列稀释液一起培养。水相缓冲液全为20mM，并包括50mM NaCl、0.05％Tween-20和1％鱼鳞胶。
图20:针对不同syn制剂的结合曲线。结合到ELISA板上的1μM Tsyn-13与所示syn的一系列稀释液一起培养。水相缓冲液为20mM Tris.HCl、pH7.0、50mM NaCl、0.05％Tween-20、1％鱼鳞胶。
图21：针对不同syn制剂的结合曲线。结合到ELISA板上的1μM Tsyn-13与所示syn的一系列稀释液一起培养。水相缓冲液为20mM Tris.HCl、pH7.0、50mM NaCl、0.05％Tween-20、1％鱼鳞胶。
图22.针对在不同缓冲液中的fsyn和20fsyn-22的结合曲线。A.将结合到ELISA板上的1μM Tsyn-13与在20mM TrispH7.0中或在50mM Na磷酸盐pH6.0或5.5中的一系列fsyn-20稀释液一起培养。B.将结合到ELISA板上的1μM Tsyn-13与在Na磷酸盐pH6.0中的一系列fsyn-20或fsyn-22缓冲液一起培养。在这两种情况下，缓冲液也含有50mM NaCl、0.05％Tween-20和1％鱼鳞胶。
实施例
化学合成
如下所述，下述合成仅用于说明目的而不是对本发明的范围进行限制。
合成1
乙基-锍氯化物(ETC)
N,N-二乙基-对苯二胺二盐酸盐
将N,N-二乙基-对苯二胺(5g,30.4mmol)溶解在乙醚(25cm3)中，加入盐酸(6cm3,10m)，对所得混合物进行浓缩，得到标题化合物(7.22g,100％)，为红/褐色固体。δH(250MHz；D2O):7.68(4H,m,ArH),3.69(4H,q,7.32,NCH2),1.11(6H,t,7.32,CH3)；δC(62.9MHz；D2O):12.1(CH3),56.4(NCH2),126.8(ArC),127.6(ArC),135.5(ArC),139.1(ArC)。
乙基-锍氯化物
将N,N-二乙基-对苯二胺二盐酸盐(7.22g,30.4mmol)溶解在水(250cm3)中，用HCl将pH调节到1.6，向其中逐滴加入硫化钠(>60％)(3.95g,30.4mmol)。搅拌该悬浮液直到所有硫化钠溶解。制备氯化铁(III)(27.15g,100mmol)的水(200cm3)溶液，并将该溶液的一半加到上述混合物中。立即发生颜色变化，从浅黄色变为蓝色。然后向溶液中充气1h，接着加入剩余的氯化铁(III)溶液。将混合物冷却到5℃，过滤除去浅绿色淤浆。向滤液中加入HCl水溶液(15cm3,6m)，然后加入氯化钠(60g)，悬浮液搅拌5分钟，过滤得到固体产物，将其溶解在DCM中，经硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到紫/绿色固体(1.28g,22％)。将该紫/绿色固体加载在制备性C18反向柱上，用水洗(1L)或直到黄颜色褪去。用MeOH/HCl(pH2)将产物从柱上冲洗下来，浓缩得到标题化合物(0.64g,11％)，为粘稠紫色固体。δH(250MHz；D2O):1.26(12H,t,6.5,CH3),3.56(8H,q,6.5,NCH2),7.01(2H,s,ArH),7.20(2H,d,9.25,ArH),7.54(2H,d,9.25,ArH)；m/z(ESI)340.2(100％,[M-Cl]+)。
合成2
1,9-二甲基-甲基-锍氯化物(DMMTC)
3-甲基-N,N-二甲基苯二胺二盐酸盐
向250cm3圆底烧瓶中加入水(100cm3)，用冰浴将温度降低到5℃。向该冷却的溶液中小心加入硫酸(98％,22.5g)。向该溶液中加入3-甲基-N,N-二甲基苯胺(10g,74mmol)和亚硝酸钠(5.6g,81.4mmol)，将该溶液在室温搅拌1小时。加入铁(Fe)屑(12.8g,229mmol)，将混合物再搅拌2小时。过滤该溶液，然后用饱和碳酸氢钠溶液中和，有机物萃取到乙酸乙酯(3x 100cm3)中。萃出物用硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到棕色油状物。将该油状物溶解在乙醚(100cm3)中，加入浓盐酸(50cm3)。对溶液进行蒸发干燥，得到标题化合物(10g,60％)，为淡褐色固体。νmax(KBr)/cm-1:2849(CH),2821(CH),2543(CH),2444(CH),1586(C＝N),1487(CH),1445(CH),1415(CH),1138(CH)；δH(250MHz；D2O):7.59(1H,s,ArH),7.50(2H,s,ArH),3.24(6H,s,CH3),2.39(3H,s,CH3)；δC(62.9MHz；D2O)18.9(CH3),48.8(CH3),122.1(ArC),126.2(ArC),127.6(ArC),133.7(ArC),137.4(ArC),144.4(ArC)。
二甲基甲基锍氯化物
向500cm3圆底烧瓶中加入3-甲基-N,N-二甲基-苯二胺二盐酸盐(0.9g,4.03mmol)，将该化合物溶解在盐酸水溶液(50cm3,3m)中，然后加入硫化钠(>60％)(0.52g,4.03mmol)。将氯化铁(III)六水合物(7.26g,27mmol)溶解在水(50cm3)中，制得的溶液的一半倒入反应混合物中，溶液立即变为蓝色。然后向所述溶液中充气2小时，之后加入剩余的氯化铁(III)水溶液。将所得混合物冷却到5℃并过滤；沉淀物溶解在沸水(60cm3)中，过滤，冷却。向该冷却的溶液中加入盐酸(10cm3,6m)，然后过滤得到标题化合物(0.22g,16％)，为紫/蓝色固体。νmax(KBr)/cm-1:2926(CH),1604(C＝N),1535,1496,1444(CH),1404(CH),1315(CH),1185(CH)；δH(250MHz；DMSO):7.29(2H,s,ArH),7.23(2H,s,ArH),3.29(12H,s,CH3),2.55(6H,s,CH3)；δC(62.9MHz；DMSO):18.9(CH3),41.5(CH3),105.7(ArC),118.7(ArC),133.6(ArC),134.5(ArC),147.2(ArC),154.2(ArC)；C18H22N3S.3H2O的分析值:C,51.98；H,6.74；N,10.11；S,7.70。实测值:C,52.03；H,6.59；N,10.05；S,7.66。
合成3
1,9-二乙基-甲基-锍氯化物(DEMTC)
N,N-二甲基-间乙基苯胺
向100cm3圆底烧瓶中加入3-乙基苯胺(10g,82.5mmol)、乙醇(15cm3)、碳酸钠(11.81g,111.4mmol)。逐滴加入碘甲烷(31.63g,222mmol)。然后在45℃加热该混合物10分钟，之后冷却到室温并加入水(100cm3)。将该混合物萃取到乙醚(3x 100cm3)中，该萃出物用硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到标题化合物(4.68g,38％)，为浅黄色油状物。νmax(净)/cm-1:3045(CH),2960(CH),2920(CH),2891(CH),2797(CH),1597(C＝N),1494(CH),1438(CH),1352(CH),1225(CH)；δH(250MHz；CDCl3):7.22(1H,t,7.75,ArH),6.63(3H,m,ArH),2.97(6H,s,NCH3),2.63(2H,q,7.5,CH2),1.27(3H,t,7.5,CH3)；δC(62.9MHz；CDCl3):15.8(CH3),29.5(NCH2),40.8(NCH3),110.3(ArC),112.4(ArC),116.5(ArC),129.1(ArC),145.3(ArC),150.9(ArC)。
N,N-二甲基-间乙基-对苯二胺二盐酸盐
向250cm3圆底烧瓶中加入N,N-二甲基-间乙基苯胺(4.68g,31.3mmol)、水(100cm3)和盐酸(8.5cm3,37％)，该溶液冷却到5℃。然后向该苯胺混合物中逐滴加入亚硝酸钠(2.46g,3.57mmol)的水(80cm3)溶液，室温搅拌3小时。加入铁(Fe)屑(5.24g,94mmol)和盐酸(8.5cm3,37％)，所得混合物在室温搅拌3小时。过滤该悬浮液，用碳酸氢钠溶液将滤液的pH调整到7，然后萃取到乙酸乙酯(3x 50cm3)中。合并萃出物，经硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到棕色油状物。将该油状物溶解在乙醇(100cm3)和乙醚(80cm3)中，小心加入盐酸(7cm3,37％)得到标题化合物(7.42g,72％)，为淡褐色固体。νmax(KBr)/cm-1:2976(CH),2894(CH),2859(CH),2753(CH),1583(C＝N),1508(CH),1486(CH),1459(CH),1183(CH)；δH(250MHz；D2O):7.66(1H,s,ArH),7.56(2H,s,ArH),3.29(6H,s,NCH3),2.74(2H,q,7.5,CH2),1.25(3H,t,7.5,CH3)；δC(62.9MHz；CDCl3):15.5(CH3)25.6(NCH2),48.9(NCH3),122.1(ArC),124.6(ArC),128.1(ArC),132.6(ArC),143.3(ArC),144.9(ArC)。
1,9-二乙基甲基锍氯化物
将N,N-二甲基-间乙基-对苯二胺二盐酸盐(1.3g,5.5mmol)溶解在水(50cm3)中，然后将该溶液的pH值调整到pH 1.6。接着向该粉色溶液中逐份加入硫化钠>60％(0.71g,5.5mmol)。所得悬浮液中加入氯化铁(III)水溶液(2.23g,8.2mmol，在50cm3水中的溶液)，立即发生颜色变化，变为紫色。然后向该溶液中充气1小时，再加入第二份氯化铁(III)溶液(2.23g,8.2mmol，在50cm3水中的溶液)。将该溶液冷却到5℃，过滤，用水洗涤沉淀物。向滤液中加入氯化钠(50g)，搅拌溶液10分钟，随着产物盐析，颜色变为红/紫色。过滤该悬浮液，将固体溶解在二氯甲烷(100cm3)和甲醇(10cm3)中，然后经硫酸镁干燥。过滤浓缩，得到绿色固体状的标题化合物(0.15g,15％)。νmax(KBr)/cm-1:3408(CH),2613(CH),1606(C＝N),1399(CH),1316(CH)；δH(250MHz；D2O):6.55(2H,s,ArH),6.23(2H,s,ArH),2.92(12H,s,NCH3),2.56(4H,q,7.5,CH2),0.99(6H,t,7.5,CH3)；(ESI),340.4(100％,[M–Cl]+)。任选地，进行快速柱色谱除去氯化铁残余物，洗脱液为10％甲醇:90％二氯甲烷，利用硅胶
合成4
1,9-二甲基-乙基-锍氯化物(DMETC)
将N,N-二乙基-3-甲基对苯二胺二盐酸盐(10.74g,50mmol)溶解在水(400cm3)中，将pH调整到1.6，然后加入硫化钠(>60％)(3.90g,50mmol)。加入氯化铁(III)(20.28g,75mmol)的水溶液(175cm3)，颜色立即发生变化，从黄色变为深蓝色。向混合物中充气1小时，然后加入第二等份氯化铁(III)水溶液(20.28g,75mmol，在175cm3中的溶液)。将溶液冷却到5℃，维持在该温度1小时，然后过滤。滤液中加入氯化钠(200g)，过滤，得到蓝/紫色固体状的粗产物。该粗产物固体用柱色谱纯化(洗脱液为10％meOH,90％DCM，利用40-63μ)得到标题化合物(0.80g,4％)，为绿/紫色固体。νmax(KBr)/cm-1:2971(CH),2921(CH),2865(CH),1600(C＝N),1412(CH),1326(CH)；δH(250MHz；D2O):6.62(2H,s,ArH),6.39(2H,s,ArH),3.30(8H,q,NCH2),1.89(6H,s,ArCH3),1.09(12H,t,CH3)；δC(62.9MHz；D2O)12.6(CH3),18.0(CH3),46.2(NCH2),103.6(ArC),117.1(ArC),132.3(ArC),133.9(ArC),147.3(ArC),151.9(ArC)；m/z(ESI)368.1(100％,[M-Cl]+)。
合成5
1,9-二乙基-乙基-锍氯化物(DEETC)
N,N-二乙基-间乙基苯胺
向100cm3圆底烧瓶中加入3-乙基苯胺(5.0g,41.3mmol)、乙醇(7.5cm3)、碳酸钠(5.9g,55.7mmol)。逐滴加入碘乙烷(17.38g,111.4mmol)。接着将混合物在45℃加热12小时，然后冷却到室温，加入水(50cm3)。将该混合物萃取到乙醚(3x 50cm3)中，萃出物用硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到标题化合物(7.03g,96％)，为浅黄色油状物。δH(250MHz；CDCl3):7.20(1H,dd,9,7.25,ArH),6.60(3H,m,ArH),3.43(4H,q,7,NCH2),2.69(2H,q,7.25,CH2),1.32(3H,t,7.5,CH3),1.23(6H,t,7,CH3)；δC(62.9MHz；CDCl3):12.7(CH3),15.8(CH3),29.5(CH2),44.4(NCH3),109.4(ArC),111.4(ArC),115.1(ArC),129.2(ArC),145.4(ArC),147.9(ArC)。
N,N-二乙基-间乙基-对苯二胺二盐酸盐
向250cm3圆底烧瓶中加入N,N-二乙基-间乙基苯胺(5g,28.2mmol)、水(50cm3)和盐酸(9cm3,37％)，将该溶液冷却到5℃。然后向该苯胺混合物中逐滴加入亚硝酸钠(2.14g,31.0mmol)的水(20cm3)溶液，低温搅拌1小时。加入铁(Fe)屑(4.72g,84.6mmol)和盐酸(9cm3,37％)，将混合物在低于30℃搅拌2小时。过滤悬浮液，滤液的pH值用碳酸氢钠调整到pH 7，然后萃取到乙酸乙酯(3x50cm3)中。合并的萃出物用硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到棕色油状物。用柱色谱纯化该粗品油状物(洗脱液为乙酸乙酯，利用硅胶40-63μ)得到所述苯二胺(2.2g,41％)，为棕色油状物。将该油溶解在乙醚(50cm3)中，加入盐酸(2.5cm3,37％)，浓缩该溶液得到标题化合物(2.76g,41％)，为淡棕色固体。δH(250MHz；D2O):7.50(3H,m,ArH),3.59(4H,q,7.25,NCH2),2.69(2H,q,7.5,CH2),1.20(3H,t,7.5,CH3),1.03(6H,t,7.25,CH3)；δC(62.9MHz；D2O):12.1(CH3),15.5(CH3),25.5(CH2),56.3(NCH2),123.9(ArC),126.0(ArC),127.9(ArC),133.1(ArC),139.4(ArC),143.3(ArC)。
1,9-二乙基乙基锍氯化物
N,N-二乙基-间乙基-对苯二胺二盐酸盐(2g,7.5mmol)溶解在水(75cm3)中，并将所得溶液的pH值调整到pH 1.6。然后向所得粉色溶液中逐份加入硫化钠(>60％)(1.35g,10.4mmol)。向悬浮液中加入氯化铁(III)水溶液(4.22g,15.6mmol，在35cm3水中的溶液)，立即发生颜色变化，变为紫色。然后向该溶液中充气1小时，接着加入第二份氯化铁(III)溶液(4.22g,15.6mmol，在35cm3水中的溶液)。将所得溶液冷却到5℃，过滤，用水洗涤沉淀物。沉淀也用乙醇洗涤，并将随后得到的乙醇浓缩得到粘稠紫色固体。向含水滤液中加入氯化钠(50g)，所得溶液搅拌10分钟，随着产物盐析，溶液的颜色变为红/紫色。过滤该悬浮液，并将固体溶解在二氯甲烷(100cm3)和甲醇(10cm3)中，然后经硫酸镁干燥。过滤并与可溶于乙醇的产物浓缩，得到标题化合物(0.06g,3％)，为紫色固体。δH(250MHz；D2O):6.73(2H,s,ArH),6.48(2H,s,ArH),3.45(8H,brdq,NCH2),2.46(4H,q,7.5,CH2),1.17(12H,brdt,CH3),0.93(6H,t,7.5,CH3)；m/z(ESI)396.2(100％,[M-Cl]+)。任选地，进行快速柱色谱以除去氯化铁残余物，洗脱液为10％甲醇:90％二氯甲烷，利用硅胶40-63μ
合成6
乙基-锍氯化物·氯化锌的复盐(ETZ)
将N,N-二乙基-对苯二胺(5.0g,30.4mmol)在H2O(100cm3)和H2SO4(浓的,‘98％’,1cm3)中的搅拌混合物用非还原性ZnCl2溶液(ZnCl2,7.60g,55mmol，在15cm3水中的溶液，含100mg的Na2Cr2O7.2H2O)处理，得到淡红色反应混合物。加入Al2(SO4)3.16H2O溶液(5.80g,9.2mmol，在10cm3H2O中的溶液)、Na2S2O3.5H2O溶液(8.0g,32.2mmol，在10cm3H2O中的溶液)和随后加入三分之一的Na2Cr2O7.2H2O(8.7g,29.2mmol，在15cm3H2O中的溶液)溶液，接着温度迅速升高到40℃。加入N,N-二乙基苯胺(3.0g,20.1mmol，在浓HCl,4cm3中的溶液)，然后加入剩余的Na2Cr2O7.2H2O溶液。观察到深绿色沉淀生成。温度迅速升高到75℃，之后加入经活化的MnO2悬浮液(3.80g,44.7mmol，在5cm3H2O中的悬浮液)。温度升高到85℃，并在该温度保持搅拌30分钟。观察蓝色溶液生成，并伴有沉淀。将反应混合物冷却到50℃并缓慢加入H2SO4(浓，11cm3)。将反应进一步冷却到20℃，真空过滤以回收沉淀，然后用盐水(饱和食盐水)洗涤该沉淀。将该黑色固体重新溶解在100℃的H2O(250cm3)中，冷却，然后真空过滤以除去不溶物。滤液用ZnCl2(4g)和NaCl(23g)处理，置于冷冻装置中16小时。之后真空过滤回收所得沉淀物，用盐水(30cm3)洗涤，真空箱干燥3小时，得到标题化合物(5.7g,71％)，为锈红色粉末。δH(250MHz,D2O):1.20(12H,br t,CH3),3.50(8H,br q,CH2),6.80(2H,s,ArH),7.05(2H,br d,ArH)和7.30(2H,br d,ArH)。参见，例如Interscience(London,UK)出版的Fierz-David and Blangley,1949,“F.Oxazine and Thiazine Dyes,”in:Fundamental Processes of Dyechemistry,第308-314页。
合成7
甲基-锍碘化物(MTI)
将甲基-锍氯化物(2.00g,6.25mmol)溶解在水(50cm3)中，加入碘化钾(1.56g,9.4mmol)，同时搅拌。有沉淀生成，并过滤，固体用沸水(50cm3)重结晶得到标题化合物(1.98g,77％)，为微细绿色针状物。δH(250MHz；DMSO):7.88(2H,br d,ArH),7.49(4H,br s,ArH),3.37(12H,s,CH3)。C16H18N3SI的分析值:C,46.72；H,4.41；N,10.22；S,7.80；I,30,85；实测值:C,46.30；H,4.21；N,10.14；S,7.86；I,29.34。
合成8
甲基-锍碘化物·碘化氢的混盐(MTI.HI)
将甲基-锍碘化物(0.50g,1.22mmol)溶解在甲醇(20cm3)中，加入碘甲烷(1.90g,13.37mmol)，同时搅拌。将所得混合物加热回流18小时，之后加入另外的碘甲烷(0.42g,6.69mmol)，混合物再次加热回流并搅拌8小时。将所得混合物冷却到室温，得到固体，该固体经过滤，用甲醇洗涤，得到标题化合物(0.30g,46％)，为铜绿色(bronze green)固体。δH (250MHz；DMSO):7.82(2H,d,J＝8.5,ArH),7.42(4H,s,ArH),3.34(12H,s,CH3).δC(62.9MHz；DMSO):153.8(ArC),137.9(ArC),134.9(ArC),133.5(ArC),119.1(ArC),118.8(ArC),106.9(ArC),106.6(ArC),41.1(NCH3)。
合成9
乙基-锍碘化物(ETI)
用氢氧化钠水溶液(10％)将N,N-二乙基-对苯二胺(10.0g,61mmol)在盐酸水溶液(0.5m,200cm3)中的搅拌混合物的pH值调整到pH 2。将该二胺溶液冷却到5℃，之后加入Na2S2O3.5H2O水溶液(16.65g,67mmol，在20cm3H2O中的溶液)。历时15分钟，将Na2Cr2O7.2H2O水溶液(7.27g,24mmol，在35cm3H2O中的溶液)逐滴加到上述混合物中，得到黑色悬浮液。将该悬浮液在5℃搅拌1小时(pH＝8.07,T＝3.7℃)。将N,N-二乙基苯胺(8.25g,61mmol)、H2SO4(6g)和水(10cm3)的溶液冷却到5℃，之后加到所述悬浮液中。然后历时20分钟向混合物中逐滴加入Na2Cr2O7.2H2O水溶液(19.09g,64mmol，在50cm3H2O中的溶液)，得到粘稠的深绿色悬浮液。该混合物在5℃搅拌2小时(pH＝6.75,T＝6℃)，过滤。得到的紫绿色固体用水(2x50cm3)洗。将该固体浆化在盐酸水溶液(300cm3,pH2)中，得到悬浮液，该悬浮液在22℃时的pH＝6.37。向该悬浮液中加入CuSO4(1.52g,6.1mmol)，所得混合物加热到90℃，形成深蓝色溶液。在该温度搅拌1小时后，将混合物冷却到25℃，过滤。固体用水(2x 50cm3)洗涤，滤液的pH值用盐酸(5M)从pH 6.33调整到pH 2.00，T＝25℃。将该深蓝色溶液加热到80℃，加入碘化钾(14g)，一经冷却就有橙紫色沉淀析出。过滤得到紫色粉末(8.8g,31％)，该粉末经热乙醇(400cm3)重结晶，得到标题化合物，为微细紫色针状物。Mp 211℃；νmax(KBr)/cm-1:3574(CH),3484(CH),3028(CH),2965(CH),1662(C＝C),1539(CH),1474(CH),1346(CH)；δC (62.9MHz,CDCl3):1.33(12H,t,7,CH3),3.72(8H,q,7,NCH2),7.23(2H,d,9.75,ArH),7.41(2H,s,ArH),7.83(2H,d,9.75,ArH)；δH(62.9MHz,CDCl3):152.4,138.8,135.7,135.2,118.3,106.4,46.8,13.2。
合成10
乙基-锍碘化物·碘化氢的混盐(ETI.HI)
将乙基-锍碘化物(2.00g,4.28mmol)溶解在乙醇(100cm3)中，加入碘乙烷(27.35g,175mmol)，同时搅拌。将所得混合物加热回流18小时，然后冷却到室温，得到沉淀。该沉淀经过滤、乙醇洗涤得到标题化合物(1.02g,40％)，为青铜色固体。δH(250MHz；D2O):7.90(2H,br d,ArH),7.42(4H,s,ArH),2.45(8H,br q,NCH2),1.23(12H,br t,CH3)。
合成11
乙基-锍硝酸盐(ETN)
用氢氧化钠水溶液(10％)将N,N-二乙基-对苯二胺(10.0g,61mmol)在盐酸水溶液(0.5m,200cm3)中的搅拌混合物的pH值调整到pH 2。将该二胺溶液冷却到5℃，之后加入Na2S2O3.5H2O水溶液(16.65g,67mmol，在20cm3H2O中的溶液)。历时15分钟内向该混合物中逐滴加入Na2Cr2O7.2H2O水溶液(7.27g,24mmol，在35cm3H2O中的溶液)得到黑色悬浮液。将该悬浮液在5℃搅拌1小时(pH＝8.07,T＝3.7℃)。将N,N-二乙基苯胺(8.25g,61mmol)、H2SO4(6g)和水(10cm3)溶液冷却到5℃，然后加入到上述悬浮液中。历时20分钟，向所得混合物中逐滴加入Na2Cr2O7.2H2O(19.09g,64mmol，在50cm3H2O中的溶液)溶液，得到粘稠的深绿色悬浮液。将该混合物在5℃搅拌2小时(pH＝6.75,T＝6℃)，过滤。得到的紫绿色固体用水洗(2x50cm3)。将所得固体浆化在盐酸水溶液(300cm3,pH2)中，得到悬浮液，其22℃时的pH＝6.37。向该悬浮液中加入CuSO4(1.52g,6.1mmol)，所得混合物加热到90℃，此时有深蓝色溶液形成。在该温度搅拌1小时后，将该混合物冷却到25℃，然后过滤。所得固体用水洗(2x50cm3)，滤液用盐酸(5m)从pH6.33调节到pH2.00，T＝25℃。将该深蓝色溶液加热到80℃，加入硝酸钠(50g)，并使其在轻微搅拌下缓慢冷却到25℃。所得产物经过滤为绿色针状物(6.80g,28％)。δH(250MHz,CDCl3):1.36(12H,t,7,CH3),3.72(8H,q,7,NCH2),7.23(2H,d,9.5,ArH),7.39(2H,s,ArH),7.89(2H,d,9.5,ArH)；δH(62.9MHz,CDCl3):152.5,138.8,135.7,135.6,118.1,106.4,46.6,12.9。
生物学研究
方法
α-突触核蛋白的纯化
构建了两种质粒，以在大肠埃希杆菌(E.coli)中表达α-突触核蛋白。α-突触核蛋白的核心聚集域(氨基酸31-109)用N-端多组氨酸标记表达(tsyn)，这允许在Ni-螯合柱上对其进行纯化。全长α-突触核蛋白(syn)没有用标记表达，但是在DEAE Sepharose上通过离子交换色谱进行纯化，并且在某些情况下，随后在CM-Sepharose进行纯化。对于这两种蛋白质，首先通过采用30-50％硫酸铵馏分，使细菌提取物富集。针对pH9.5的20mMcAPS或20mMTris.HCl、pH7.5、50mM NaCl，对从柱上洗脱出来的蛋白质进行透析(详见表1)，并在-70℃储存。
对细丝组装(filament assembly)的荧光分析
将α-突触核蛋白(tsyn或fsyn)在37℃培养，培养时间如附图中图标所示，并伴随搅拌以诱导原纤维形成。在某些情况下，加入50μg/ml肝素以促进原纤维形成。
然后用水加上1μM硫黄素T(thioflavine T)或樱草黄(primulin)(在某些情况时为0.2或5μM)，将10μl样品稀释至100μl。在VariancareyEclipse荧光分光光度计中的96孔板上测量荧光激发光谱，发射波长为480nm。用不含tsyn测得的信号和从该光谱测得的信号峰校准激发光谱。将数据归一化到没有化合物情况下的测量值，并且从归一化的荧光对化合物浓度图中测得的P50值。
对突触核蛋白-突触核蛋白结合的ELISA分析
利用固相分析来测量α-突触核蛋白的自结合(self-association)。将稀释在碳酸盐缓冲液中的tsyn(pH8.5)结合到分析板上，加入在水相中的全长α-突触核蛋白(fsyn)。该水相结合缓冲液为50mM磷酸钠，pH6.0、20mM NaCl、0.05％Tween-20、1％鱼鳞胶(fish skingelatine)。利用购得的不识别tsyn的抗体(211)，检测结合的fsyn。
实施例1.α-突触核蛋白的纯化
图1显示了tsyn的纯化样品，样品用SDS-PAGE分析，并用考马斯蓝染色。Ni-亲和柱能实现非常有效的纯化；最终经纯化的蛋白(图1中的tsyn-8)的纯度大于95％，从750ml细菌培养物中得到44mg蛋白质。
图2显示了在DEAE-Sepharose上对fsyn进行纯化。利用该方法得到的最终蛋白质不是很纯。(图2中的fsyn-9)。
图3显示了将fsyn在DEAE-Sepharose纯化，然后在CM-Sepharose上纯化。利用这种方法得到的蛋白质的纯度>95％，但是收率很低(与只用DEAE-Sepharose得到的85mg相比，该方法得到了12mg蛋白质)。
在以下所述的分析中，采用了若干不同的α-突触核蛋白制剂，对它们纯化的简要描述总结在表1中。
表1.突触核蛋白制剂的纯化细节
通过热处理制备的蛋白质在该分析中是失活的。通过DEAE离子交换色谱制备的蛋白质是有活性的。因此，在CM-或SP-Sepharose上进行了进一步的纯化步骤。结果发现，CM-Sepharose产生了最干净的制剂，但比SP-凝胶的收率低。比较了这些制剂的结合活性(参见实施例9)。表1总结了用于这些试验的突触核蛋白制剂。
实施例2.通过荧光对突触核蛋白组装进行分析
已经报道了，α-突触核蛋白的组装和原纤维形成能增强硫黄素T的荧光。我们测试了α-突触核蛋白对硫黄素T和樱草黄的荧光的影响。使用和不使用50μg/ml肝素，在37℃培育所述蛋白，从而诱导了所述蛋白组装；样品在不同时间点用1μM硫黄素T或樱草黄进行分析。
图4显示了tsyn和fsyn制剂的组装时程。在不采用肝素的情况下，针对两种蛋白质出现的硫黄素T荧光都非常少(图4A,4B)。在不采用肝素的情况下，tsyn蛋白在第20-30小时期间出现了樱草黄信号；在采用肝素的情况下，樱草黄信号的出现没有停滞期，但最终的荧光强度与不采用肝素的情况相似(图4A)。对tsyn而言，肝素刺激了硫黄素T信号的出现，强度与使用樱草黄时相似(图4A)。对于fsyn而言，在没有肝素的情况下，硫黄素T和樱草黄信号的出现都非常慢。在存在肝素的情况下，对这两种荧光团而言均出现了信号，但是tsyn中观察到了更长的停滞期(图4B)。樱草黄信号出现的停滞期比硫黄素T出现的停滞期短，但是硫黄素T信号的最终强度比樱草黄信号的强度大(图4B)。樱草黄和硫黄素T信号上的不同说明了，这两种荧光团检测突触核蛋白的不同组装状态，这与下述观点一致，该观点认为樱草黄检测原纤维形成前的组装的较早前体状态，而原纤维形成物是由硫黄素T检测的。
实施例3.由MTC和ETC分析原纤维破裂(fibril disruption)
使用荧光效果分析化合物MTC和ETC对组装的α-突触核蛋白的影响。
图5显示了MTC和ETC对经组装的tsyn诱导的硫黄素T或樱草黄荧光信号的影响，图上的荧光峰值显示为图7A所示的化合物浓度的函数。图6显示了MTC和ETC对由组装的fsyn诱导的硫黄素T或樱草黄荧光信号的影响，图上的荧光峰值显示为图7B所示的化合物浓度的函数。从图7曲线上测得的P50值总结在表2中。
表2.由MTC和ETC抑制α-突触核蛋白-依赖的硫黄素T或樱草黄荧光的P50值
蛋白质 荧光团 化合物 P50(μM)
tsyn-13 硫黄素T MTC 18.5
tsyn-13 硫黄素T ETC 30.3
tsyn-13 樱草黄 MTC 12.9
tsyn-13 樱草黄 ETC 24.1
fsyn-14 硫黄素T MTC 3.8
fsyn-14 硫黄素T ETC 25.3
fsyn-14 樱草黄 MTC 23.5
fsyn-14 樱草黄 ETC 30.6
化合物对硫黄素T和樱草黄荧光的影响也可能是由于对荧光配体的竞争引起的，而不是原纤维破裂引起的。为了验证这一观点是否正确，以三种不同浓度的荧光团进行了实验，因为如果该影响是由于竞争的原因，则P50仅依赖于荧光团浓度。一个实验的数据显示在图8中，所有实验的平均值显示在表3中。荧光团浓度25-倍内变化时测得的P50值没有明显区别，这说明化合物的影响是由于原纤维破裂引起的。
表3.通过MTC和ETC抑制α-突触核蛋白-依赖的硫黄素T或樱草黄荧光的P50值。荧光团浓度的影响。
化合物 荧光团 [荧光团](μM) P50(μM) SEM N
MTC 硫黄素T 0.2 11.6 6.7 3
MTC 硫黄素T 1.0 12.7 3.9 3
MTC 硫黄素T 5.0 20.2 0.0 2
MTC 樱草黄 0.2 41.7 8.2 2
MTC 樱草黄 1.0 35.1 2.2 3
MTC 樱草黄 5.0 31.2 0.7 2
ETC 硫黄素T 0.2 3.2 2.5 3
ETC 硫黄素T 1.0 9.0 6.6 3
ETC 硫黄素T 5.0 17.6 2.3 2
ETC 樱草黄 0.2 41.7 8.2 2
ETC 樱草黄 1.0 34.0 3.3 3
ETC 樱草黄 5.0 32.3 - 1
实施例4.化合物对体外α-突触核蛋白质聚集体的组装的影响。
MTC不仅能影响组装的α-突触核蛋白质聚集体，其也能抑制α-突触核蛋白组装成聚集体，如樱草黄结合竞争所测定的那样。已经确定了从tsyn和fsyn组装成聚集体的最佳条件，并且MTC的抑制效果如图11所示。使tsyn(1mg/ml，在20mM Tris.HCl,pH7.5+50μg/ml肝素中)在37℃组装24小时。MTC在浓度高于5μM(○,空心圆点)时能抑制tsyn组装。使fsyn在相同条件下组装，不同的是fsyn的浓度为2mg/ml，并且培养了120小时。MTC对fsyn抑制作用要比对tsyn的抑制作用强，对前者(●,实心圆点)而言，在0.05μM发生抑制。
MTC和ETC对α-突触核蛋白聚集的抑制(fsyn；如上所述利用樱草黄分析)与DEMTC和DEETC对α-突触核蛋白聚集所观察的抑制作用相当或前者比后者更强。所有这些化合物在浓度为50μM时完全抑制了组装。
表4.利用fsyn研究二氨基吩噻嗪类化合物对α-突触核蛋白聚集的影响
也使用硫黄素T来监测fsyn组装。硫黄素T信号的发出比樱草黄信号的发出要慢，但是能达到一个更高的水平，并且看上去其显示了原纤维的延长而不是聚集体的形成。在组装的后期(第160小时)，当硫黄素T信号达到一个稳态，所述硫黄素T信号对MTC的抑制比所述樱草黄信号对MTC的抑制更敏感，0.05μM时能观察到明显效果。这显示在图12中。
实施例5.利用固相ELISA分析实验对α-突触核蛋白结合进行分析
在结合分析中也使用这两种α-突触核蛋白。将tsyn结合在固相中，将全长fsyn加到水相中。使用对抗不识别tsyn的α-突触核蛋白中的表位的抗体，对结合的fsyn进行量化。
图9显示了tsyn-13与fsyn-20结合的水相结合曲线和固相结合曲线。fsyn-20的结合稳态在约5μM，tsyn-13的结合稳态在约2μM。这些浓度用于测试各种锍氯化物和黄酮对突触核蛋白-突触核蛋白结合的影响
抑制曲线如图10所示，从这些曲线计算的B50值总结在表4中。
在结合分析中测试的所有黄酮化合物具有良好的抑制活性，而尽管大多数锍氯化物具有活性，即MTC、ETC、DMMTC、DEMTC、DMETC、DEETC、硫堇和托洛氯铵，但其它如天蓝A和天蓝B不具有活性。
表5.抑制突触核蛋白-突触核蛋白结合的P50和B50值。P50如下测量：使用1μg/ml、用在含有肝素(50μg/ml)的20μM Tris.HCl(pH7.5)中的组装tsyn-16，并且用两种荧光团，即硫黄素T或樱草黄中的任意一种(1μM)进行分析。B50如下测量：使用1μM tsyn-16(固相)和5μM fsyn-20(水相)，并且利用含有20mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)。
实施例6.对α-突触核蛋白聚集的基于细胞的分析
所述基于细胞的分析采用小鼠成神经瘤细胞系NIE-115，该细胞系已经经工程化来表达全长α-突触核蛋白，该蛋白结合N端信号序列(SSfsyn)以靶向蛋白质至膜上(参见WO02/059150)。当细胞用双丁酰环化腺苷酸(dibutyrylcyclicAMP,dbcAMP)(1mM)分化时，α-突触核蛋白的表达增强。
通过免疫印迹利用各种抗-α-突触核蛋白抗体来检测α-突触核蛋白。这些包括：mAb 42(BD Biosciencescat No.610787)，其识别tsyn内的表位(α-突触核蛋白的残基31-109)。除了α-突触核蛋白，mAb 42也与高分子量蛋白发生非特异性反应(该蛋白不能被其它抗-α-突触核蛋白抗体识别)。这种蛋白也用于对细胞数量进行评估，因为细胞中该蛋白水平与细胞密度相关。用这些细胞对药物进行测试，通过测定药物浓度来计算抑制活性(EC50)，其中α-突触核蛋白对非特异带的比率降到只用dbcAMP处理的细胞的比率的50％。
改变加入dbcAMP的时间和在收集细胞前使细胞置于药物+dbcAMP存在下的环境。典型的结果显示在针对DEETC的图13中。
当将细胞置于MTC和dbcAMP存在下的环境中多于2天的时间时，MTC是具有抑制活性的。最有效的化合物是DEETC，其能以nM级进行抑制；DEMTC、DMETC和ETC也表现出抑制活性(表6)。黄酮、鼠李素也是具有抑制活性的。
表6.吩噻嗪化合物对FSyn在NIE细胞中表达的抑制，所述NIE细胞经dbcAMP分化。
实施例7.α-突触核蛋白在细胞基分析中的截短和聚集
当DH60.21NIE细胞用dbcAMP分化后，SSFsyn的表达增加，如利用mAb42(识别α-突触核蛋白的核心)或mAb 211(识别α-突触核蛋白的C-端表位)检测的那样。此外，还产生了两种约15和16kDa的低分子量带。后者可能对应于缺少信号序列的Fsyn。而这两种蛋白中分子量较大的一个蛋白可通过这两种抗体都能检测，使用mAb 211，15kDa的带最多仅仅被微弱地检测出来。典型的实施例显示在图14中。这说明，这是C-端截短的蛋白质。还观察到另一种流动性明显大于FSyn的22kDa带，但仅利用mAb 42，而不是利用mAb211(图14)。22-kDa对SSFsyn带的比率根据采用的抗体不同而明显不同(p<0.001；表7)。这说明存在N-和C-端都被截短的聚集的突触核蛋白。也在用SSFsyn转染的SH-SY5Y成神经瘤细胞中观察到该22-kDa带。
表7.如对c-端mAb211缺少反应性所证实的，细胞中存在聚集的和截短的α-突触核蛋白。
检测抗体 22kDa:SSFsyn的平均比率(±SEM；n＝30)
mAb 42 0.14±0.02
mAb 211 0.01±0.003
当表达SSFsyn的细胞用荧光显微镜观察时，能观察到大量表达，包括颗粒样物质，这说明存在聚集蛋白(图15)。而且，在细胞中观察到的聚集体同时被樱草黄识别出来，樱草黄是结合蛋白质聚集体的荧光团(图16)。这肯定了下述研究，这些研究表明α-突触核蛋白聚集在SH-SY5Y成神经瘤细胞分化后发生(Hasegawa等人，2004；Brain Res.1013:51-59)。
实施例8.MTC对体外α-突触核蛋白低聚物组装和α-突触核蛋白结合的影响
参考表5突触核蛋白分析中P50和B50的测量结果，可以看出尽管某些黄酮化合物具有低的B50(与锍氯化物相当的B50)，但是当在突触核蛋白分析中锍氯化物的P50通常比黄酮的P50低。这说明，尽管这两类化合物在抑制突触核蛋白自聚集反应中是有效的，但仅锍化合物具有破解预形成的聚集体的能力。
作为对MTC活性的进一步分析，在tsyn组装的时程中检测其效果(图17)。如图17所示，在不存在MTC的情况下，在组装前的约2小时有一个滞后期。荧光信号峰出现在第4-5小时，然后在20小时内逐渐减弱。荧光出现的时程与两种荧光团荧光出现的时程相似。在低浓度MTC(0.05μM)存在的情况下，组装开始之前的滞后期减少到1小时，并且24小时后的最终荧光信号更强。特别地，在使用樱草黄时，对应于樱草黄的最大荧光强于硫黄素T。在0.5μMMTC存在的情况下，组装比对照慢，但最终荧光水平强于对照。使用5μMMTC时，最初的4-5小时时程内的组装与对照相似，但是之后荧光更快地减弱，尽管最终荧光水平与对照相似。使用MTC 50μM时，在实验的时程内没有组装。图17的数据说明MTC对突触核蛋白的组装具有复杂的效果；在较低浓度时(摩尔比，突触核蛋白:MTC为2000:1)，MTC在一定程度上显然刺激组装，而在较高浓度时(最大摩尔比，突触核蛋白:MTC为2:1)，其完全抑制组装。尽管不受理论束缚，但是可以总结出，MTC在较低摩尔比率时提供配体交联效果，该摩尔比率不足以实现对聚集的抑制，但是能使化合物与不止一种的突触核蛋白分子结合，从而促进聚集。
实施例9.α-突触核蛋白固相结合分析的优化
图18显示了实施例1所描述的三种不同突触核蛋白制剂的结合曲线。利用syn-10，显示了最好的结合，syn-10是最纯的制剂；利用syn-14，显示了最差的结合，syn-14是纯度最差的制剂。这说明，第二个纯化步骤能除去抑制结合的杂质，并且尽管第二CM-Sepharose步骤会降低收率，但所述蛋白质应该用这一步骤纯化。
在所测试的三种制剂中，Syn-10给出了最好的结合，但是最大结合程度仍然很低。对Tsyn的两种不同的固相制剂进行了测试，结果表明没有差别，并且采用的tsyn浓度表明是最佳的(没有给出数据)。因此，测试了对水相步骤的不同缓冲条件。
图19A说明缓冲液，即HEPES和MES完全破坏了syn的结合。图19B表明pH7.0的Tris缓冲液比以前使用的pH7.5的Tris缓冲液实现了更好的结合。pH8.0的Tris的结合较差，因此pH越低对syn结合越有利。既然Tris不能用来在较低的pH进行缓冲，也尝试了使用磷酸盐缓冲液，在pH6.5进行测试。pH6.5的磷酸盐比pH7.0的磷酸盐实现了更好结合。尽管这两个实验在结合方面存在差异，但这些结果表明缓冲液的化学性质以及pH会影响syn结合，最好的缓冲液为pH7.0的Tris。
图18的数据表明，对用于固相结合实验的syn而言，最好的纯化方法是DEAE-色谱，然后进行CM-色谱。经该方法纯化的其它3种Syn制剂也在Tris(pH7.0)缓冲液中进行了测试(图20)。结果说明，制剂之间的结合特性有一定变化。在进一步的方法中，将所述蛋白质对高pH值的缓冲液(syn-20)进行了透析。图21中，将该蛋白质的结合与syn-19进行了比较。2μM后结合的减弱是由于高非特异性结合引起的，从结合中减去该值。Syn-20比syn-19显示出了明显更好的结合，这证实了透析缓冲液的变化。
为了尝试并且为了减少变化，也对较低pH值的磷酸盐缓冲液进行了研究。图22A表明在磷酸盐缓冲液pH6.0中分析的fsyn-20比在pH7.0的Tris或pH5.5的磷酸盐中分析的fsyn-20得到了更好的结合。重要地，由于噪音(background)增强，因此在较高fsyn浓度时曲线没有跌落。将另一种fsyn制剂(fsyn-22)(其也对高pH值的CAPS进行了透析)在pH6.0的磷酸盐缓冲液中进行测试，得到与fsyn-20相似的结合(图22B)。在固相抑制分析(实施例5)中，使用经由最终高pH透析制备的、在pH6.0的磷酸盐缓冲液中分析的Fsyn。
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Claims (22)

1.每天小于或等于400mg口服剂量的二氨基吩噻嗪化合物在制备用于抑制或逆转突触核蛋白聚集的药物中的用途，
其中所述药物为片剂或胶囊的剂量单元，且
其中所述聚集与表现为神经变性和/或临床痴呆的疾病状态有关，且其中所述疾病是帕金森病、卢易体痴呆或多系统萎缩症；且
其中所述化合物选自下述结构式的化合物：
其中，R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：
-H；-Me和-Et；
并且其中，在每个-NR3NAR3NB基团中：
R3NA和R3NB各自独立地选自：
-H；-Me和-Et；
并且其中，-NR7NAR7NB基团与-NR3NAR3NB基团相同；
并且其中，X-为一个或多个阴离子反离子，从而实现电中性。
2.权利要求1所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9各自独立地选自：-H和-Me。
3.权利要求1所述的用途，其中R1、R2、R4、R6、R8和R9为-H。
4.权利要求1所述的用途，其中在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H和-Me。
5.权利要求2所述的用途，其中在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H和-Me。
6.权利要求3所述的用途，其中在每个-NR3NAR3NB基团中，R3NA和R3NB各自独立地选自：-H和-Me。
7.权利要求1-6任一所述的用途，其中X-为一个或多个阴离子反离子，从而实现电中性，X-选自Cl-、Br-和I-。
8.每天小于或等于400mg口服剂量的二氨基吩噻嗪化合物在制备用于抑制或逆转突触核蛋白聚集的药物中的用途，
其中所述药物为片剂或胶囊的剂量单元，且
其中所述聚集与表现为神经变性和/或临床痴呆的疾病状态有关，且其中所述疾病是帕金森病、卢易体痴呆或多系统萎缩症；且
其中所述化合物选自下述结构式的化合物：
9.权利要求1-6和8任一所述的用途，其用于体外抑制或逆转突触核蛋白聚集。
10.权利要求7所述的用途，其用于体外抑制或逆转突触核蛋白聚集。
11.权利要求1-6和8任一所述的用途，包括将所述二氨基吩噻嗪化合物与调节要进行治疗的哺乳动物中多巴胺水平的化合物联合给药。
12.权利要求7所述的用途，包括将所述二氨基吩噻嗪化合物与调节要进行治疗的哺乳动物中多巴胺水平的化合物联合给药。
13.权利要求1-6和8任一所述的用途，其中每天给药总剂量少于或等于300mg。
14.权利要求1-6和8任一所述的用途，其中每天给药总剂量少于或等于200mg。
15.权利要求1-6和8任一所述的用途，其中每天给药总剂量少于或等于100mg。
16.权利要求7所述的用途，其中每天给药总剂量少于或等于300mg。
17.权利要求7所述的用途，其中每天给药总剂量少于或等于200mg。
18.权利要求7所述的用途，其中每天给药总剂量少于或等于100mg。
19.权利要求1-6和8任一所述的用途，其中给药剂量单位为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130mg，每天三次。
20.权利要求7所述的用途，其中给药剂量单位为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130mg，每天三次。
21.权利要求1-6和8任一所述的用途，其中给药剂量单位为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg，每天2次。
22.权利要求7所述的用途，其中给药剂量单位为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg，每天2次。
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