WO2005095958A1

WO2005095958A1 - 薬剤候補を同定するためのアッセイ法

Info

Publication number: WO2005095958A1
Application number: PCT/JP2005/006728
Authority: WO
Inventors: Naoyuki Sato; Masayasu Okouchi; Yoshiaki Taniyama; Toshio Ogiwara; Ryuichi Morishita
Original assignee: Angesmg, Inc.
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2005-10-13
Also published as: DE602005016537D1; EP1739425A4; JPWO2005095958A1; EP1739425B1; EP1739425A1; ATE442588T1; US20090087916A1

Abstract

本発明は、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維(fibril)または凝集物(aggregate)からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法を提供する。さらに本発明は、当該同定方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。

Description

明細書

薬剤候補を同定するためのアツセィ法

技術分野

本発明は、細繊維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候; ϋを同定する方法に関する。

背景技術

アミロイド /3 (以下、ともいう）を含む老人斑は、アルツハイマー病の病理像の一つである。

Α βの低下は主要な治療対象だと思われる。

抗抗体による免疫化後のアミロイド除去が報告されている。

最近のデータは、抗体が Α/3の末梢溶出（s i nk) として働き、末梢/脳の動力学を変化させているかもしれないことを示している。

老人斑が消失したという事実は、 A β凝集過程が可逆的であることを意味している。

しかしながら今なお、可溶性 Α βが凝集 Α βから溶出した証拠は存在しない。ここで本発明者らは、インビトロで細線維の遠心分離に続く上清への移行 (r e p 1 a c e) を分析する類似溶出（s i n k— 1 i k e) Α アツセィを開発したものであり、可溶性 Α が凝集 Α から溶出したことのみならず、超音波が A /3溶出を促進したことを示すものである。

このインビトロ類似溶出（s i nk— 1 i k e) A jSアツセィにおいて A j3溶出を促進する化合物あるいは超音波は、アルツハイマー病治療の可能性ある選択肢になり得るかもしれない。

アルツハイマー病（AD) は、脳における老人斑の存在によって特徴付けられる、神経変性疾患である。

40〜42アミノ酸からなるペプチドの A)3は、老人斑の主成分である。この疾患の遺伝性型は、アミロイド前駆タンパク（APP) およぴプレセニリン（p r e s e n i 1 i n) 遺伝子の変異に関連している。これらの遺伝子における疾患に関連する変異は、老人斑において優勢に存在する Αβ (1-42) 産生の増加をもたらす。

最近、変異 ΑΡΡ遺伝子導入マウスへのによる免疫付与が、プラーク沈着の抑制に効果的であることが示された。（S c h e n k， B a r b o u r e t a 1. 1 999年）

さらに、 Αβ抗体の単回投与後、プラークおよび神経病変の双方が可逆的であつた。（L omb a r d o, S t e r n e t a 1. 2003年）

A /3抗体に加え、 Αβ (g e 1 s ο 1 i nまたは GM1) に高い親和性を有する薬剤による末梢治療は、脳内における A レベルを低下させた。（Ma t s u o k a , S a i t o e t a 1. 2003年）

抗体投与による末梢での溶出（s i nk) メカ-ズムの発現は、細胞外スぺースへの異常タンパク蓄積により特徴付けられる多数の疾患の治療に有用であることが提案されている。（DeMa t t o s, B a l e s e t a 1. 200 1年）

インビトロでの、 A )3凝集過程については十分に研究されている。

しかしながら、凝集 A )3から A が溶出する反対の現象は、まだ研究されていなかった。

本研究においては、凝集 A 3からの Α /3溶出について検討するため、我々は新規なインビトロ類似溶出（s i nk— 1 i k e) A アツセィを開発した。

ここで、我々は可溶性が凝集から溶出したことを示すものである。さらに、超音波は Α 溶出を促進した。

このインビトロ類似溶出（s i n k— 1 i k e) A ]3アツセィにおいて A )3溶出を促進した化合物および/または超音波は、ァルツハイマー病治療の選択肢となり得るかもしれない。

WO 94/10569公報（特表平 8— 502587号）には、患者において一アミロイド .ペプチド（以下、 j3APともいう）一関連症状を診断又はモ- タリングする方法であって：患者サンプル中の可溶性 ΑΡ又は ]3 A P断片の量 P T/JP2005/006728 を測定し；その測定値を所定量の )3 A P又は A P断片と比較し；そして測定された ]3 A P又は A P断片の量と所定の A P又は j3 A P断片の量との間の差異に基づき患者の状態を評価することを含んで成る方法が開示されている。（請求項 2 3 )

WO 0 0 / 2 6 2 3 8公報（特表 2 0 0 2— 5 3 1 0 6 5号）には、プリオンタンパク質のサンプルを提供し、試験試薬の存在下およぴ不存在下で質的若しくは量的に β形態の量を比較することを含む、 β形態へのプリオンタンパク質の変換を予防、減少及び/または可逆化可能である試薬の同定方法が開示されている。

(請求項 5 0 )

WO 0 0 / 4 3 7 9 1 (特表 2 0 0 2— 5 4 0 3 8 3号）公報には、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な種および神経変性疾病凝集体または原繊維形成を阻害する候補薬剤のための神経変性疾病凝集体または原繊維形成種を含むと考えられる 1個のサンプルを含む溶液を作成することと、成分を前記溶液に移したり、容器から溶液を取り出したりせずに、神経変性疾病に特徴的な溶液中の凝集体を検出することより成る方法を開示している。（請求項 1 7 2 ) しかしながらこれらの先行技術は、多数のテスト化合物を評価するには、容易でない、迅速でない、信頼 'ί生が高くない、あるいは安価でない方法であった。発明の開示

本発明者らは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いることができる薬剤候補を同定する方法を確立すベく、鋭意検討を重ねた。そして、 Α 凝集過程が可逆的であることを知見し、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリべプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維 (fibril)または凝集物（aggregate)からぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定できる方法を確立した。

すなわち本発明は、以下のとおりである。 (1) 被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維 (fibri 1)または凝集物（aggregate)からぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。

(2) 薬剤候補が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いられるものである、上記（1) 記載の方法。

(3) 疾患がアルツハイマー病（AD)、パーキンソン病（PD)、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビ一小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト 'ヤコブ病、ゲルストマン 'ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（SCA：)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPL A)、家族性筋萎縮性側索硬化症、 FTDP— 17 (frontotemporal dementia a nd parkinsonisms linked to chromosome 17、第 1 7 ¾■染色体に速鎖するノヽーキンソン症候群を伴った前頭側頭型痴呆)、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、 familial British dementia および-ユーロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、上記（1) または（2) 記載の方法。

(4) 細線維または凝集物がインビトロで形成されたものである、上記（1) ないし（3) いずれか記載の方法。

( 5 )平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、上記（ 1 )ないし（ 4 ) いずれか記載の方法。

( 6 )超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、上記（ 1 )ないし（ 5 ) いずれか記載の方法。

(7) 超音波照射条件が、 lMHz、 2W/cm²、デューティ比 20%、 30 秒照射に続き 10秒休止の 5回反復である、上記（1) ないし（6) いずれか記載の方法。

(8) 被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性 /3—アミロイド (Αβ) の溶媒中濃度を測定することにより、インビトロで凝集した細 #泉維または凝集物から /3—アミロイド (Αβ) を除去することのできる薬剤候補を同定する方法。

(9)細 H維または凝集物が Α (1-40) からなる、上記 (8)記載の方法。

(10) 細線維または凝集物が (1-42) からなる、上記（8) 記載の方法。

(11) 平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、上記（8) ないし

(10) いずれか記載の方法。

(12) 超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、上記（8) ないし

(11) いずれか記載の方法。

(13) 超音波照射条件が、 1ΜΗζ、 2WZcm²、デューティ比 20%、 3 0秒照射に続き 10秒休止の 5回反復である、上記 (8) ないし（12) いずれか記載の方法。

(14) 患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法。

(15) 疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト 'ャコプ病、ゲルストマン 'ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（SCA)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA)、家族性筋萎縮性側索硬化症、 FTDP— 17，進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、 familial British dementiaおよびニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、上記（14) 記載の方法。

(16) 上記（1) ないし（13) いずれか記載の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。

(17) デヒドロポルフィリン第 2鉄 I X、アムホテリシン B、ミリセチン、タンユン酸、クルクミン、ァズール Bおよびべ一シックプル一 41からなる群より選ばれる少なくとも 1つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。

(1 8) 上記（1) ないし（1 3) いずれか記載の方法により得られる化合物を用いて、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出する溶出方法。

(1 9) 細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための、上記（1) ないし（13) いずれか記載の方法により得られる化合物の使用。

(20) ぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置。

(2 1)被験化合物の存在下、細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。

図面の簡単な説明

図 1. インビトロ類似溶出（s i n k—l i k e) A3アツセィの実験手順を示した図である。

図 2. 溶出 Αβ (1-40) およ A/3 (1-42) のためのサンドイッチ EL I SA法の結果、可溶性 A/3が凝集 A から溶出したことを示した図である。図 3. 溶出 A β (1-40) および Α (1-42) のための質量分析の結果を示した図である。

図 4. 溶出 A )3 (1-40) のウェスタンプロット法分析の結果を示した図である。

図 5. 超音波が溶出を促進したことを表す、溶出 Α/3 (1 -40) の SEC 分析を示した図である。

図 6. 超音波の実験手順を示した図である。図 7 . 溶出 A ]3 ( 1— 4 0 ) のサンドイッチ E L I S A法の結果を示した図である。

図 8 . Α β ( 1— 4 2 ) の細線維ィ匕おょぴオリゴマー化の、 S E C分析を示した図である。

図 9 . インビトロ類似溶出（s i n k— 1 i k e ) A アツセィを図式的に示した図である。

図 1 0 . 実施例 2の結果を示した図である。発明の詳細な説明

以下、本発明を詳細に説明する。

<薬剤候補の同定方法 >

本発明は、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴぺプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物から、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法を提供する。

本発明の同定方法の工程においては、被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶^¾ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの溶媒中濃度が測定される。

被験化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糠質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、または微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。あるいは、被験化合物は、ぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に実際に用いられているものであってもよい。

上記、可溶'性ぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクとしては、それらの凝集によって弊害、延いては疾患が引き起こされ得るものであれば特に限定されないが、例えば、 Αβ、プリオンタンパク質、ポリグルタミン、 α シヌクレイン、タウ、スーパーォキシドジムターゼ 1 (SOD l)、ニューロセノレピン、アミロイド前駆タンパク質（APP) などが挙げられる。

A βは、ァルツハイマー病の主要な神経病理学的変化の 1つである老人斑を構成する主要成分であり、アミロイド前駆体タンパク質（ΑΡ Ρ) が 2種の (β— 及ぴ γ—）セクレターゼで切断されることにより産生される。その主要な分子種として、 40アミノ酸残基からなる A/3 (1— 40) (配列番号： 1) と C末端側がさらに 2残基長い Α (1 -42) (配列番号： 2) がある。

A の凝集あるいは蓄積は、アルツハイマー病、ダウン症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は老人斑おょぴ脳血管ァミロイドである。プリオンタンパク質の凝集あるいは蓄積は、クロイツフェルト 'ヤコプ病、ゲルストマン ' ストロイスラー症候群、狂牛病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はシナプス、神経細胞およびクル斑アミロイドである。ポリグルタミンの凝集あるいは蓄積は、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（SCA)、歯状核赤核淡蒼球ルィ体萎縮症（DRP LA；)、ハンチントン舞踏病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は神経細胞核内封入体である。 _αシヌクレインの凝集あるいは蓄積は、パーキンソン病、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はレビー小体（神経細胞内）およびオリゴデンドロサイト（GC I ) である。タウの凝集あるいは蓄積は、アルツハイマー病、 FTDP — 1 7、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は神経原繊維変化部位、グリア細胞内封入体およぴピック球である。スーパーォキシドジムターゼ 1の凝集あるいは蓄積は、家族性筋萎縮性側索硬化症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位はレビー小体様封入体である。ニューロセルピンの凝集おょぴ蓄積は、ニューロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は Collins小体 (神経細胞内）である。 AB r iペプチドの凝集あるいは蓄積は、 familial Bri tish dementia などの疾患の原因とされており、その蓄積部位は脳 ·血管ァミ口ィドである。

本発明において「平衡状態にある」とは、不溶性であるペプチド、オリゴぺプチド、ポリベプチドまたはタンパクの細線維や凝集物から、可溶性のぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが溶媒中へ溶出する速度と、溶媒中の可溶 1·生のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが凝集して、不溶性の細線維や凝集物を形成する速度とが同一で、釣り合つている状態をいう。

本発明の同定方法の工程は、被験化合物の存在下、単に細線維または凝集物から溶出した可溶性べプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することによって行ってもよい。

本発明において、細線維とはペプチド等が線状に連なった直径 1 i m前後の構造体のことであり、凝集物とは複数の細線維の集合体のことである。細線維または凝集物は、インビトロで形成されたものであっても、インビポで形成されたものであってもよいが、薬剤候補同定の効率、操作性、試験の再現性などを考察すると、インビトロで形成されたものが好ましい。

また、本発明において「除去する」とは、凝集したペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの細線維または凝集物から、可溶性のぺプチド、ォリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出させて取り除くことをいう。平衡状態のサンプルを調製するには、例えば、溶媒に可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、あるいはそれらの細線維または凝集物を加え、適切な温度（通常 0〜4 0 °C) にて平衡状態が達成されるまで放置すればよい。平衡状態に達したことは、溶媒中の可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの濃度を経時的に測定することで確認できる。平後 ί 状態が達成された段階で、反応系に被験化合物を加え、適温（通常 3 7 °C前後）でインキュベート（好ましくは 1日間）する。適切な温度（通常 0〜4 0 °C) で 1〜6 0分間遠心分離した後、得られた上清を分析に供す。

また、平衡状態ではないサンプルを調製するには、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶媒に加え、適当な温度（通常 0〜4 0 °C)で 1〜 6時間インキュベートすることによつて細線維化または凝集させる。細線維化または凝集が完了した段階で、適切な温度（通常 0〜4 0 °C) で 1〜6 0分間遠心分離するなどして上清を取り除く。その後、得られた上清に被験化合物を加え、、適温（通常 3 7 °C前後）でインキュベート（好ましくは 1日間）する。適切な温度（通常 0〜4 0 °C) で 1〜6 0分間遠心分離した後、上清を採取し分析に供す。

ここで、本発明の方法で用いられる溶媒としては、本発明の目的を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、 P B S、酢酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が用いられる。かかる溶媒は、生理的条件の観点力ら、 p H 3〜 8程度、より好ましくは p H 6〜 8程度に調整するのが好ましい。可溶性べプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの溶媒中濃度は、自体公知の方法を使用して測定できる。例えば、 E L I S A、ウェスタンプロット法、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ（S E C) 等の方法により測定できる。

上記測定の結果、被験ィヒ合物を添加しない場合と比較して、被験化合物を添加したときに可溶性べプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの溶媒中濃度の上昇が確認できれば、その被験ィヒ合物は細線維または凝集物からぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補と判定され得る。このようにして得られた化合物は様々な用途に用いられ得、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防 ·治療薬あるいは該疾患の研究用試薬の開発に有用である。かかる疾患としては、例えば、アルツハイマー病（AD)、パーキンソン病（P D)、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト 'ヤコブ病、ゲルストマン ·ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（S C A)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（D R P L A；)、家族性筋萎縮性側索硬化症、 F T D P— 1 7、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、：amilial British dementia または-ユーロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症などが挙げられる。本発明によれば、本発明の同定方法により得られる化合物もまた提供される。

本発明の同定方法においては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの種類を適宜選択することによって、特定のペプチド、オリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの細線維または凝集物から、ぺプチド、オリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを特異的に除去することのできる薬剤候補を得ることができる。このような薬剤候補は、当該特定のペプチド、オリゴぺプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防 '治療に有用であり得る。

<超音波 >

上記平衡状態は、超音波照射下でもたらされたものであってもよい。かかる超音波照射は実質的に熱発生を伴わないものが好ましい。また、超音波照射は特に限定はされないが、通常、 1〜2 O MH z、 0 . 1〜1 O WZ c m ²、デューティー比 1 0〜 9 0 %の条件で、 1 0秒照射に続き 1 0秒休止を 1 5回繰り返して行い、より好ましくは、 2 . 5〜7 . 5 MH z、 0 . 5〜5 WZ c m ²、デューティー比 2 0〜 7 0 %の条件で、 3 0秒照射に続き 1 0秒休止を 5回繰り返して行う。ここでデューティー比とは、送信時間 Z (送信時間 +送信間隔）のことである。上記超音波照射は、細線維または凝集物からのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク除去を促進する。したがって、超音波照射は平衡状態への到達時間を速め、より迅速な薬剤候補の同定を可能とする。

また、超音波照射することによって、細線維または凝集物からペプチド、オリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去する方法も本発明の範疇とする。さらに、本発明には、患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法も含まれるものとする。

本発明はまた、ぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置を提供する。

ここで、超音波照射は、通常、 1〜2 O MH z、 0 . 1〜1 0 WZ c m²、デューティー比 1 0〜 9 0 %の条件で、 1 0秒照射に続き 1 0秒休止を 1 5回繰り返して行い、より好ましくは、 2 . 5〜7 . 5 MH z、 0 . 5〜5 W/ c m²、デューティ一比 2 0〜 7 0 %の条件で、 3 0秒照射に続き 1 0秒休止を 5回繰り返して行う。

<溶出促進剤 >

本発明は、上記の同定方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。

下記の実施例から明らかなように、上記同定方法により得られた化合物として、デヒドロポルフィリン第 2鉄 I X、アムホテリシン B、ミリセチン、タン-ン酸、クルクミン、ァズール Bおよぴベーシックプル一 4 1が提供される。

従って、本発明は、デヒドロポルフィリン第 2鉄 I X、アムホテリシン B、ミリセチン、タン-ン酸、クノレクミン、ァズーノレ Bおよびベーシックブノレー 4 1から選ばれる少なくとも 1つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からぺプチド、オリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤を提供する。

デヒドロポルフィリン第 2鉄 I Xは、以下の化学式 1 ：

(化学式 1 ) で表される化合物であり、プロテアーゼに対して抵抗性を有するタンパク質（Pr P-res； protease- resistant protein)の形成をインビトロで阻害し伝達性海綿状脳症の治療に有用である可能性があると報告されている（S. A. Priola et al. , Science, 287, 1503 (Feb 25, 2000) )。また、タウフィラメント形成を阻害するとの報告もある（S. Taniguchi et al. , J Biol Chem, 280 (9) , 7614-7623, 200 5) ₀

アムホテリシン Bは以下の化学式 2 ：

(化学式 2 ) で表される化合物であり、 A )3繊維の形成を遅らす働きがあることが知られている（S. C. Hartsel et al.， Biochemistry 42, 6228 (May 27， 2003) )。

ミリセチンおよびタンニン酸はそれぞれ以下の化学式 3および 4 ：

(化学式 4 )

で表される化合物であり、インビトロで A の形成 ·伸張に阻害作用を示すことが報告されている (K. Ono, Biochim Biophys Acta 1690, 193 (Nov 5, 2004) _D クルクミンは以下の化学式 5 ：

(化学式 5 ) で表される化合物であり、 Αβ (1一 40) 繊維の形成を阻害することが報告されており（F.Yang et al.， J Biol Chem, 280(7), 5892-5901, 2005)、アルッハイマ一治療薬として効果があることが知られている（G.P. Lim et al. , J Neuro sci， 21(21) :8370-7 (Nov 1, 2001)および WO03/103583)。

ァズール Bは以下の化学式 6 ：

CI一

(化学式 6 )

で表される化合物であり、タウフイラメント形成を阻害することが報告されている（S. Taniguchi et al. , J Biol Chem 280(9), 7614 - 7623, 2005)。

ベーシックプ — 41は以下の化学式 7 ：

(化学式 7)

で表される化合物であり、チオフラビン Τの 1種で、チオフラビン Τはアミロイド繊維の蛍光インディケ一ターであることが知られている（H. Nakai et al, La b Invest 62, 768 (Jun 1990))。

本発明の溶出促進剤は、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去する作用を高めることができるため、ぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防または治療に有用である。

また、上記化合物は各々上述した文献に記載されているように、種々の疾患に用いられることが公知であるが、本発明において細線維または凝集物からぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出しうることが新たに知見されたため、これらの化合物を含有する溶出促進剤もペプチド、オリゴぺプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の予防または治療に用いられ得ることが示唆された。

本発明の溶出促進剤は、上記の化合物に加え、任意の担体などを含有できる。任意の担体としては、医薬上許容され得る担体（後述）が挙げられる。

本発明の溶出促進剤は、医薬又は試験用試薬などとして、あるいはインビポ又はインビトロにおいて用いられ得る。本発明の溶出促進剤が医薬として使用される場合、動物（例えば、ヒト、サル、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ゥサギ、ラット、マウス等の哺乳動物）に経口または非経口で投与することができ、錠剤、カプセル剤、トローチ、顆粒剤、散剤等の経口投与剤の剤形で、または、外用剤（液剤、ローション剤、懸濁剤、乳剤、クリーム、軟膏、ゲル剤等）、注射剤、坐剤等の剤形で用いられ得る。

医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプンの結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウムーグリコールースターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壌剤、ステアリン酸マグネシウム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、タエン酸、メントール、グリシルリシン 'アンモニゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシヱ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。

非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張ィヒ剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやパイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分およぴ医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。

本発明の溶出促進剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人 1日あたり有効成分量として約 0 . 0 0 1〜約 5 ιη _§ k gである。

実施例

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

実施例 1

( I ) 方法 (1) 薬品および溶媒

特に明示がない限り、薬品はシグマあるいは和光から入手した。

水は 2回蒸留し、 Milli- Qシステム（ミリポア社、べッドフォード、マサチューセッッ州）を用いて脱イオン化した。

(2) ペプチド

Αβ (1-40)および (1 - 42)はペプチド研究所 (大阪、日本）から入手した。 Αβ 溶液は実験毎に、記載のようにして新しく調製した（Hartley, Walsh et al. 199 9)。 Αβ (1 - 40)ペプチド 0.55mgを、 0.01°/。フエノールレツドを含む ImM NaOH 130 1に溶解した。

pH 7.5に調整するため、 10mM NaOHを加えた。 500 Μ Αβ溶液を得るため、 ΡΒ SAWH20を加えた。溶解しなかった Α を取り除くため、上清を分取する前に遠心分離した。（15,000X_g, 3分間）

(3) サンプル調製

500 μΜ Αβ溶液 20 1を、 1.5mlエツペンドルフ管に分取した。サンプルは細線維化が完了するまで、 37。Cにて何通りかの時間インキュベートした。 22°Cで遠心分離した後（15,000X_g， 10分間）、上清を除いた。

得られたペレツト（すなわち Αβ細線維）をリン酸緩衝液 (PBS)で 3回洗浄した。そのペレツトに、新しい PBS 20 μΐを徐々に注意深く加えた。このサンプルを、 3 7°Cにて 1日間インキュベートした。 22°Cにおいて遠心分離した後（15，000Xg, 1 0分間）、上清 16 μ 1を採取し分析に供した。残りの上清は取り除いた。そのペレツトに、新しい PBS 20 1を徐々に注意深く加えた。

これらの操作を繰り返した。（図 1参照）

サンプルを、下記のようにして、 ELISA、ウェスタンプロット法、質量分析、サィズ排除ク口マトグラフィ (SEC)により分析した。

(4) サンドィツチ法 Αβ ELISA

Αβ (1 - 40)および Aj3 (1-42)のためのサンドイッチ ELISA法は、それぞれ Aj3 (1 -40) ELISAキットおょぴ A3 (卜 42) ELISAキット（Biosoure社、 I B L社、 Sign et Laboratories社など）を用いて行った。

( 5 ) SEC

注入器おょぴ紫外検出器からなる HPLCシステムに、 Superose 6カラム（Amersh am)を取り付けた。カラムから 0. 04ml/分にて溶出させ、ペプチドは 21⁸nmの紫外吸収にて検出した。

各実験は少なくとも 2回行った。実験の間にプレパックカラムを 2N NaOHで洗浄した。

それぞれの検討のため、適切なカラムを少なくともカラム体積の 3倍量の溶出緩衝液で平衡化し、次いで 5種類の分子量標準品：トリ 'ォブアルブミン（44, 00 0) ; ゥマ 'ミオグロビン（17， 000)；ヒト γ -グロプリン（158， 000)；ゥシ 'サイログロプリン（670， 000)；およびビタミン B₁₂ (l, 350)を用いて較正した。

溶出緩衝液として、 75mM NaCl、 5mM Tris- HCl (pH 7. 4)を用いた。

( 6 ) ゲル電気泳動おょぴウェスタンプロット法

Tris/Tricineゲル（Invitrogen)を用い、 SDSポリアタリルァミドゲル電気泳動（S DS- PAGE)を行った。サンプルを、 2 X SDS サンプル緩衝液（Invitrogen)と混合し、電気泳動に先立ち 5分間急速沸騰させた。サンプルをポリビニリデン ·ジフルォリド（PVDF)膜（ミリポア、べッドフォード、マサチューセッツ、米国）上に移した。ウェスタンプロット法は、 6E10抗体を用いて行った。

ECLを検出システムとして用いた。

( 7 ) 質量分析

Α β種の、免疫沈降/マトリックス支援レーザーイオン化-飛行時間型 (MALDI- Τ0 F)、複合質量分析計（IP/MS)分析を記載のようにして行った。（Okochi, Steiner et al. 2002)

( 8 ) 超音波

サンプル管に、室温にて 30秒間超音波処理（2. 5 /cm²)した。（30秒照射の 5回繰り返し）

( I I ) 結果可溶性 A が凝集 A|3 から溶出した。

(1) 溶出 Α/3 (1-40)および - 42)のための、サンドイッチ ELISA法溶出 Α)3 (1-40)および Α (1-42)のための、サンドィツチ ELISA法を記載の実験法により行った。溶出した A ;3 (1-40)量は、 6562.5±1750.9(S.E.) pg/mlであつた（n=6)。溶出した A （1-42)量は、 1939.7±607.6 (S. E. ) pg/mlであった（n=6)。それぞれの結果を図 2に示す。

(2) 溶出 A j3 (1 - 40)および A （1-42)質量分析

質量分析にて、溶出した A （1-40)および A （1-40)の分子量、それぞれ 4329· 8と 4514.0を確認した。（図 3 )

(3) 溶出 A/3 (卜 40)のウエスタンプロット

低分子量のほぼ単一のパンドの検出を示した。（図 4)

( 4 ) 溶出 Α β (1-40)および Α (1-42)の SEC分析

SEC分析は、十分な単一の 2. ½1ピークを示した。（図 5)

(5) 超音波の効果

超音波は A 溶出を促進した。

サンプル管に、室温にて 30秒間、デューティー比 20%で超音波処理 (2.5Wん m²) した。（30秒照射の 5回繰り返し）

溶出 A/3 (1-40)および Aj3 (1-42)のための、サンドイッチ ELISA法を行った。 30秒間の超音波（2.5W/cm²、デューティー比 20%、室温、 30秒照射の 5回繰り返し）は、 A (1-40)溶出を促進した。（図 6)

(コントロール群： 8791.7±3121.1(S.E. ) pg/ml (n=3)；超音波群： 49479.3± 2 167.6(S.E.)pg/ml (n=3)； p 0.001未満）

もう一つの、デューティー比 50%での実験方法（30秒、 2.5W/cm²、室温、 30秒照射の 2回繰り返し）もまた、 λβ (1-40)溶出を促進した。

(コントロール群: 8791.7±3121.1(S.E. ) pg/ml (n=3)；超音波群 50%X2回： 3 5520土 7140 (S. E. ) pg/ml (n=3)； p 0.05未満）

超音波の効果を図 7に示す。 (6) A3 (卜 42)細線維化およびオリゴマー化の、 SEC分析

溶解後直ちに記述の実験方法にて、可溶性 Αβ (1-42)を Superose 6 クロマトグラフィー分析した。結果を図 8に示す。

ゲルに由来するピーク（gel - included peak)は 1.9mlにおいて溶出した。

このピーク中の Aj3オリゴマー.サイズを決定することはできなかった。

大きなオリゴマーと細線維前駆体は、 1時間から 12時間の間に観察された（図中、矢印または三角印）。

2. ½のピークは 5h時に上昇した（図中、矢印）。

このピークは、 SECにおいて AjS (1 - 40)溶出が分析された時観察されたので、同じフラクションに溶出した。実施例 2

( I ) 方法

(1) 薬品および溶媒

デヒドロポルフィリン第 2鉄 I X、アムホテリシン B、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、ァズール Bおよぴベーシックプル一 41はそれぞれ、 Sigma- Aldrich 社から入手した。

上記以外は実施例 1と同様にして準備した。

(2) ペプチド

ペプチドは実施例 1の（I ) 一（2) と同様にして準備した。

(3) サンプル調製

500μΜΑ]3 (1-42)溶液 20 μ 1を 1.5ml管に分取した。 37°Cにて細線維化が完了するまで、ぺプチドを数 3間ィンキュベートした。 22°Cにて遠心分離後（15, 000 Xg, 10分間）、上清を取り除いた。得られたペレットを PBSで 3回徐々に慎重に洗浄した。ペレットに、新しい PBS 20μ 1を徐々に注意深く加えた。サンプルを 37°C にて 1 日間インキュベートした。 22°Cにて遠心分離後（15,000Xg， 10分間）、上清を取り除いた。次いで、化合物：デヒドロポルフィリン第 2鉄 I X、アムホテリシン B、ミリセチン、タン-ン酸、クルクミン、ァズール Bまたはベーシックプル一 4 1をそれぞれ含んだ新しい PBS 20 μ 1およぴコントロールとして化合物含まない新しい PBS 20 1をペレツトにゆつくりと注意深く加えた。サンプルを 37°Cにて 1日間ィンキュベートした。 22°Cにて遠心分離後（15, 000 X g, 10分間）、上清 16 μ 1 (細線維から溶出した A ）を採取し A E L I S A分析により分析した。

( I I ) 結果

結果を表 1およぴ図 1 0に示す。

表 1 ·

平均値はコン十ロールを 1とした場合の倍率である。

表 1およぴ図 1 0に示すとおり、上記の化合物を加えた場合、 A i3の有意な溶出が観察された。文献

1. DeMattos, R. B. , K. R. Bales, et al. (2001) .

" Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer' s disease.，， Proc Natl Acad Sci U S A 98 (15)： 8850-5.

2. Hartley, D. M. , D. M. Walsh, et al. (1999) .

"Protofibrillar intermediates of amyloid beta-protein induce acute electrophysiological changes and progressive neurotoxicity in cortical neurons.

J Neurosci 19 (20)： 8876 - 84.

3. Lombardo, J. A. , E. A. Stern, et al. (2003) .

〃Amyloid— beta antibody treatment leads to rapid normalization of plaque-induced neuritic alterations. "

J Neurosci 23 (34)： 10879-83.

4. Matsuoka, Y. , M. Saito, et al. (2003) .

'Novel "therapeutic approach for the treatment of Alzheimer' s disease by peripheral administration of agents with an affinity to beta-amyloid. " J Neurosci 23 (1)： 29-33.

5. Okochi, M. , H. Steiner, et al. (2002) .

Presenilins mediate a dual intramembranous gamma - secretase cleavage of Notch - 1.〃

Embo J 21 (20)： 5408-16.

6. Schenk, D. , R. Barbour, et al. (1999) .

"Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse.〃

Nature 400 (6740)： 173 - 7. 産業上の利用可能性

以上の説明で明らかなように、本発明によれば、細線維または凝集物からぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定することが可能となり、それにより、現代社会に様々な波紋を投げかけているアルツハイマー病などの、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患に関する治療.予防、あるいらそれらの研究に大いに役立つことが期待される。本出願は、日本で出願された特願 2004-107746を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。配列表フリ一テキスト

配列番号 1 ： A /3 (1-40)

配列番号 2 '· Αβ (1-42)

Claims

請求の範囲

1 . 被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性ペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維 (fibril) または凝集物（aggregate)からべプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。

2 . 薬剤候補が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療に用いられるものである、請求項 1記載の方法。

3 . 疾患がアルツハイマー病（AD)、パーキンソン病（P D)、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフエルト ·ヤコプ病、ゲルストマン ·ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ S C A)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（D R P L A)、家族性筋萎縮性側索硬化症、 F T D P— 1 7、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、 familial British dementiaおよび-ユーロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、請求項 1または 2記載の方法。

4 . 細線維または凝集物がインビトロで形成されたものである、請求項 1ないし 3いずれか記載の方法。

5 . 平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、請求項 1ないし 4いずれか記載の方法。

6 . 超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、請求項 1ないし 5いずれか記載の方法。

7. 超音波照射条件が、 1ΜΗζ、 2W/cm\ デューティ比 20%、 30秒照射に続き 10秒休止の 5回反復である、請求項 1ないし 6いずれ力、記載の方法。

8. 被験化合物の存在下、平衡状態にある可溶性 j3—アミロイド（A/3) の溶媒中濃度を測定することにより、インビトロで凝集した細線維または凝集物から β 一アミロイド（Α ）を除去することのできる薬剤候補を同定する方法。

9. 細線維または凝集物が Α (1-40) からなる、請求項 8記載の方法。

10. 細線維または凝集物が A /3 (1-42) からなる、請求項 8記載の方法。

1 1. 平衡状態が超音波照射下にもたらされたものである、請求項 8ないし 10 いずれか記載の方法。

12. 超音波照射が実質的に熱発生を伴わないものである、請求項 8ないし 11 いずれか記載の方法。

13. 超音波照射条件が、 lMHz、 2W/cm²、デューティ比 20%、 30 秒照射に続き 10秒休止の 5回反復である、請求項 8ないし 12いずれか記載の方法。

14. 患者に超音波照射することからなる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリべプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患の治療方法。

15. 疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、プリオン病、ダウン症、レビー小体型痴呆症、多系統萎縮症、クロイツフェルト ·ヤコプ病、ゲルストマン ·ストロイスラー症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（S C A)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（D R P L A)、家族性筋萎縮性側索硬化症、 F T D P— 1 7、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、 familial British dementiaおよび-ユーロセルピン封入体を伴う家族性痴呆症からなる群より選ばれた疾患である、請求項 1 4記載の方法。

1 6 . 請求項 1ないし 1 3いずれか記載の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。

1 7 . デヒドロポルフィリン第 2鉄 I X、アムホテリシン B、ミリセチン、タンニン酸、クルクミン、ァズール Bおよびベーシックプル一 4 1からなる群より選ばれる少なくとも 1つを有効成分として含有する、細線維または凝集物からぺプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための溶出促進剤。

1 8 . 請求項 1ないし 1 3いずれか記載の方法により得られる化合物を用いて、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを溶出する溶出方法。

1 9 . 細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去するための、請求項 1ないし 1 3いずれか記載の方法により得られる化合物の使用。

2 0 . ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの凝集に起因する疾患を治療するための装置であって、超音波を患部に照射し、細線維または凝集物からペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを除去する手段を有することを特徴とする装置。

2 1 . 被験化合物の存在下、細線維または凝集物から溶出した可溶性ペプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクの溶媒中濃度を測定することにより、細線維または凝集物からぺプチド、ォリゴぺプチド、ポリぺプチドまたはタンパクを除去することのできる薬剤候補を同定する方法。