JP2002540383A - 神経変性疾患における異常型タンパク質凝集の迅速かつ高感度の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的なサンプルを神経変性疾病に関連する種の存在について迅速および高感度に分析可能な方法、アッセイおよび構成要素について述べる。疾病を診断するための技術および構成要素も、神経変性疾病を治療するための候補薬剤のスクリーニングと同様に提供する。該技術は簡単で、非常に高感度であり、ただちに入手可能な構成要素を利用する。神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な結合種は、電極表面または粒子表面に固定されるか、溶液中で遊離した状態で供給され、原繊維形成種に結合および／または凝集体に包含される。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】 本発明は、神経変性疾患に関連したペプチド凝集の迅速かつ高感度な検出並び
に分析ついての方法、アッセイおよび成分に関するものである。このような方法
並びにアッセイは、高処理量の薬品選別によって薬品の発見を容易にするのみな
らず、臨床試験用に用いることもできる。 【０００２】 【従来の技術】 現在、多くの神経変性疾患は、ニューロペプチドの異常型凝集の結果生じた脳
内の凝集および、または原繊維形成に関係するプラークに連結していること、お
よび、または、プラークが原因であることが分かっている。アルツハイマー病、
パーキンソン病、ゲルストマン・ストライスラー・シャインカー症候群、到死性
家族性不眠症、ハンチントン舞踏病、クールー、さらには、クロイツフェルト・
ヤコブ病、羊海綿状脳症および牛海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病）のような家族性
アミロイド多発ニューロパチー並びに伝播性海綿状脳症は、脳内に形成された配
列タンパク質原繊維、すなわち凝集を特徴とする。これらの原繊維を形成するタ
ンパク質は、配列相同性、あるいは、保存されたモチーフさえも共有することは
ないが、原繊維自体は一定の形態的な特徴を共有する。参照：ランズベリ（Ｌａ
ｎｓｂｕｒｙ）著、Ｐｒｏｃ． ＮａｔＬ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９
６号：３３４２頁（１９９９年刊）。これらの疾患においては、病原状態に関係
する常態では可溶性のペプチドが、自然ペプチドの突然変異や、変更ペプチドと
の物質的な関連を通して３次元構造に転化を受け、神経変性疾患に罹病した脳内
の見られる異常なタンパク質沈積の特徴である不溶性の配列重合状態に変化する
。この配列重合または凝集は、内因性ないし外因性の作用因、またはペプチドが
核となって生じる場合がある。 【０００３】 例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）の場合、これらの原繊維は、配座変化を受
けて可溶性の単量体から不溶性のβ−シート低重合体に変化したβ−アミロイド
タンパク質から形成される。脳内におけるこれらの原繊維の濃度は、臨床疾患の
進行と相互関係を示してきた。特徴的な原繊維の発達図は極端に非線形であり、
この事実を用いれば、なぜ罹病者が何年間も兆候を示さず、その後、突然、急速
な変性を受けて痴呆状態に陥るのかが説明可能となる。生体外における原繊維形
成は、ペプチド濃度に依存する。アルツハイマー病の特徴である模擬原繊維形成
を目的として生体外で原繊維を形成するために、β−アミロイド（Ａβ）タンパ
ク質から誘導された短い合成ペプチドを生成することができる。Ａβ １−４２
（長い疎水性のＣ−終末を持つ）は、Ａβ １−４０よりも速い割合で原繊維を
形成することが分かっている。参照：Ｊ． ジャレット（Ｊａｒｒｅｔｔ）他著
『β−アミロイドタンパク質のカルボキシル基終末はアミロイド形成の核となる
危険がある：アルツハイマー病因に関する潜在的重要性』「生化学（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）」誌第３２号、４６９３−４６９７頁（１９９３年刊）。Ａβ
１−４０はそれ自体の上に原繊維および凝集を形成することができる一方で、
Ａβ １−４０を含む溶液は、可溶性の低い１−４２ペプチドとの「混合物」で
あるか、または、予め形成されたペプチド原繊維の「核を有する」場合には、促
進された原繊維形成を受ける。Ａβ １−４０は神経炎プラーク内における優勢
タンパク質であるが、これらの研究は、原繊維形成率が、１−４０に対する１−
４２の濃度比率に依存すると思われることを示している。これらの研究結果に一
致して、あらゆる形態の初期ＡＤ兆候は、１−４２ペプチドの高い発現水準を伴
う。 【０００４】 ２つの最も優勢な変異体であるＡβ、１−４２並びに１−４０を用いた生体外
における原繊維形成に関する原子力顕微鏡（ＡＦＭ）研究は、準安定中間物を突
き止め、原繊維形成以前に生じるそれを「プロトフィブリル」と名づけた。参照
：Ｊ． ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）他著『原子力顕微鏡による準安定Ａβプロト
フィブリルの観察』「Ｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｌ」第４号、１１９−１２５
頁（１９９７年刊）。原繊維に対するこれらの先駆物質の存在は、ＡＤの素因を
持つ人々の脳内で観察される広汎性のアミロイド沈着を説明すると思われる。Ａ
β原繊維がＡＤの発病因であるとすることに関して賛成と反対の議論が起きてい
る、生体外および生体内で観察されるいくつかの矛盾は、毒性中間物であるプロ
トフィブリルの存在によって説明できるだろう。神経変性疾患の原繊維または原
繊維形成種の試験、または、神経変性疾患の治療に適した薬品の選別を目的とす
る既存のアッセイは、コンゴレッド並びにチオフラビン−Ｔによるアッセイであ
る（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」大学出版（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９９９年刊、第３０９巻、２７４−２８７、３０４−３０
５頁）が、その方法では、一般的には、小型の凝集やプロトフィブリルを検出す
ることはできない。特に、約１００μＭ以下の濃度では凝集や原繊維形成種を直
接検出することはできない。この方法は、初期段階にある疾患の検出用、並びに
、初期段階疾患への使用に適した薬品選別用としては不適当である。 【０００５】 疾患の発症前段階（小型の原繊維ないし凝集しか存在しない時）に有効な薬品
候補は、プラークおよび、または原繊維の抑制、並びに、兆候疾患の予防に関し
てより強い効果を持つと思われる。このため、小型の原繊維凝集を効率よく検出
する必要がある。しかし、これらの凝集は小さすぎて、ほとんどすべての検出法
で検出不能である。ＡＦＭを用いれば検出可能であるが、この技術は臨床的な特
徴や薬品選別プロトコルには向かない。そのため、これまで、小型の原繊維性種
に有効な薬品の選別は不可能とされてきた。さらに、すべての段階で原繊維形成
を抑制する薬品を選別しようとすると、非常に制限された。 【０００６】 凝集および原繊維形成率は、突然変異ニューロまたは転化プリオンペプチドな
どの、保存されたか、または、誤って折り返されたペプチドの濃度の極端に非線
形な関数であり、それらのペプチドは凝集形成および原繊維形成種である。いっ
たん、異常型の種の濃度が危険濃度に達すると、反応率は急激に進行するため、
投薬治療は有効ではない。そのため、プラーク形成の抑制に有効な薬品について
は、このように症状緩和的なものではなく予防治療的なものであって、必ず、初
期段階で有効なものでなければならない。現状の専門技術では、平行薬品選別法
または非侵襲性診断法と両立する形で、小型の凝集および原繊維を検出すること
はできない。このことは、１）初期疾患状態の治療薬は容易には特定できない、
２）発症前の患者は特定できない、さらに、３）存在するか、または、将来確認
される可能性のある潜在的な薬品候補の効果は正確には評価できないことを意味
する。 【０００７】 コンゴレッド並びにチオフラビン−Ｔを例とする既存技術のもう一つの欠点は
、処理過程に機械的な介入が必要な点である。すなわち、原繊維形成を促進する
非再現的な方法におけるアッセイを乱す、体液を容器から容器へ移すなどの処理
を必要とする。さらに、コンゴレッド並びにチオフラビン成分は反応を消滅させ
、凝集過程を停止させる。そのため、一回の溶液アッセイでは、いくつかの観察
時点のデータが得られない。 【０００８】 神経変性疾患の診断に伴う複雑な状況の一つは、疾患の特徴である凝集および
原繊維を形成することのできる種が極端に低い濃度で存在する場合があり、その
濃度でも、検出された場合には疾患の開始を示すとされることにある。 【０００９】 神経変性疾患の過程に関する情報が存在する一方で、特に診断法および薬品選
別に関して、神経変性疾患を対象とした簡易で高価に傾かない信頼できるアッセ
イ法や、神経変性疾患治療の候補薬品を選別する技術、および、それに関連する
成分が示されたなら、この分野における重要な進歩となることだろう。 発明の概要 本発明は、神経変性疾患に関係する一連の構成、アーティクル、キット、およ
び方法を提供する。提供される技術並びに成分は、神経変性疾患治療の候補薬品
の選別のためのみならず、疾患診断のためにも提供できる。技術は簡易で、感度
が極端に高く、かつ、容易に入手できる成分を利用している。発明の技術並びに
成分は、神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種を非常に感度よく検出する
が、それらは、概して非常に小さく、例えば、長さ１から１００ｎｍの間であり
、これまで、既存の技術を用いた方法や、神経変性疾患の治療薬の選別法では検
出することが困難か、または不可能であった。 【００１０】 そのため、当発明は、これらの神経変性疾患の初期段階の特徴である原繊維お
よび前−原繊維の検出および監視を可能にする予定である。また、推定上の薬品
候補を用いた治療によって生ずる凝集形成率の研究も可能にする予定である。 【００１１】 当発明は、神経変性疾患の表現型に含まれるペプチド配列の選別に使用可能な
凝集および原繊維の検出法を提供する。一方の技術では、選択したペプチド配列
を合成して、粒子に固定するか、または、固定しやすい形にして、発明のアッセ
イにかけ、粒子凝集、または、神経変性疾患過程に関与する可能性のあるペプチ
ド配列を示す、本文中に記すような粒子を包合するその他の結合が生じるかどう
か調査する。もう一方の技術では、任意のペプチド配列を遺伝子操作してファー
ジに作り変えるが、そのファージは粒子に結合して発明のアッセイに関与するこ
とができる。当発明の方法は、原繊維およびペプチド凝集の検出用に提供される
もので、これらの疾患の診断に利用できる。と言うのも、原繊維性種が、容易に
試料採取できる脳脊髄液（ＣＳＦ）および他の体液中を循環することが分かって
いるからである。 【００１２】 実施例の一つでは、当発明は、伝播性海綿状脳症を含む神経変性疾患の特徴で
ある凝集、原繊維、および前−原繊維（凝集形成および原繊維形成種）の存在に
関して生物学的試料を迅速、高感度に分析できる検出方式を示す予定である。あ
る面から見た場合、発明は、疾患検出や薬品選別に利用可能な一連のキットを提
供する。具体的使用法の一つでは、キットには、１表面を持つ第１アーティクル
と、１表面を持つ第２アーティクル、および、多数の結合種が含まれており、少
なくとも、結合種のうちのいくつかは、第１アーティクルか第２アーティクルの
表面に固定されるか、または、固定されやすい形になっている。結合種は、神経
変性疾患の凝集形成および原繊維形成種を結合する能力を持つ。以下の詳細な記
述で明らかになるように、この実施例の中では、アーティクルを様々に組み合わ
せて使用することができる。各アーティクルは溶液懸濁作用がある分離可能アー
ティクルであり、その組み合わせとしては、両方がそれぞれコロイド粒子を有す
る場合、一方がコロイド粒子を有し、他方が磁気ビーズなどを有する場合、ある
いは、一方のアーティクルが、電極、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）チップ、ま
たはその他の肉眼で見えるアーティクルのような大きい方のアーティクルの表面
となることが可能で、他方のアーティクルが上記のような溶液懸濁作用を有する
場合がある。 【００１３】 発明の別のキットには、１表面を持つ１アーティクル（様々なアーティクルを
予定している）と、多数の結合種が含まれており、少なくとも、結合種のうちの
いくつかはアーティクル表面に固定されるか、または、固定されるやすい形にな
っている。この実施例では、アーティクル表面は、表面、または、凝集形成およ
び原繊維形成種に固定されていないか、または、固定されやすい形になっていな
い結合種の不特定結合を、実質的に抑制する化学的な機能を持つ。この実施例は
、特に高感度の検出技術を可能にする。発明の本概要で用いる場合、「結合種」
とは、神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種を結合する能力のある結合種
を指す。 【００１４】 発明の別のキットには、１表面を持つ１アーティクルと、アーティクル表面に
固定されるか、または、固定されやすい形になっている多数の結合種が含まれて
おり、この実施例では、アーティクルがＳＰＲ成分ではないことがはっきりして
いる。この実施例は、罹病試料や薬品活性の電子分析などに関する非常に高感度
で非ＳＰＲの分析を可能にする。 【００１５】 別の面から見た場合、発明は、発明の様々なキット並びに方法と共に利用でき
る一連の成分、方式およびアーティクルを提供する。本発明のアーティクルの１
つには、結合種が固定された表面が含まれる。信号エレメントもこのアーティク
ルの表面に固定されている。発明の構成には、結合種と、結合種との関係で固定
される電子信号統一体が含まれる。発明の別の構成には、金属を配位結合できる
部分に固定された結合種が含まれる。 【００１６】 発明の方式の一つには、神経変性疾患の原繊維および凝集との関係で固定され
た少なくとも２粒子が含まれる。発明のもう一つの方式には、神経変性疾患の凝
集形成および原繊維形成種との関係で固定された少なくとも２粒子が含まれる。
これらの方式は、概して、罹病および前−罹病状態、または、混合物を選別する
候補薬品を検出するために計画されたアッセイの結果である。 【００１７】 別の面から見た場合、発明は一連の方法を提供する。一つの方法には、アーテ
ィクル表面に固定されたか、または、固定されやすい形になった１結合種を投入
して、その結合種を、神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種でない状態か
ら、凝集形成および原繊維形成種である状態に転化させることが含まれる。この
方法は、以下の詳細な記述から明らかになるように、高感度アッセイにおいて重
要な用途を持つことになる。 【００１８】 別の実施例では、新案の方法には、結合種と神経変性疾患の凝集形成ないしは
原繊維形成種との相互作用を可能にして、その結果、結合種を神経変性疾患の凝
集形成ないしは原繊維形成種へ転化させることが含まれる。転化を受けたこの種
は、その後、神経変性疾患の凝集形成ないしは原繊維形成種の存在に特徴的な凝
集に関与することになる。その後、この凝集を検出する。この方法も、疾患状態
ないしは疾患前状態の選別に関する感度において重要な進歩を示すものである。 別の実施例では、この目的を含むがそれに限らず、薬品選別に利用することが
でき、その分野において重要な前進を示す発明の方法を提供する。方法には、ア
ーティクル表面に固定されたか、または、固定されやすい形になった１結合種を
投入して、随意、（最初に固定されていない場合には）その結合種を表面に固定
し、さらに、神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種に結合することが含ま
れる。結合は、結合種を表面に固定する前もしくは後に行なうことができ、結合
種は結合過程で凝集形成および原繊維形成種へは転化しない。第２アーティクル
の表面に固定されたか、または、固定されやすい形になった第２の結合種は、凝
集形成および原繊維形成種に結合できる。第２の結合種の凝集形成および原繊維
形成種との結合は、この方法による他の処理に関連して随時行なうことができる
。 【００１９】 発明の別の方法には、１表面を持つ１アーティクルと、表面に固定されたか、
または、固定されやすい形になった多数の結合種が含まれる。アーティクルの表
面は、神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種を含む懸濁試料に曝露される
。以下で明らかになるように、例えば、試料中の罹病状態の検出用の技術など、
様々な個別技術がこの方法に付随可能である。 【００２０】 発明の別の方法には、凝集形成および原繊維形成種を含む試料中に、神経変性
疾患の凝集および原繊維を最初に形成することが含まれる。凝集および原繊維は
、アーティクルの表面に固定されたか、または、固定されやすい形になった多数
の結合種を含むアーティクルに曝露される。結合種は、凝集、原繊維、凝集形成
種、または原繊維形成種を結合する能力を持つ。 【００２１】 別の面から見た場合、発明は、神経変性疾患抑制用の候補薬品効果を測定する
１技術を提供する。技術には、神経変性疾患の原繊維および凝集形成種の分泌機
能を持つ１細胞を、候補薬品に曝露して、細胞から分泌された物質の凝集可能性
を測定することが含まれる。Ａβ原繊維形成種を例とする発現過剰なプラスアミ
ドを用いた転写によって、細胞を、原繊維および凝集形成種を分泌しやすい形に
変えることができる。細胞から分泌される物質が神経変性疾患の特徴である凝集
を形成する可能性は、候補薬品に対して細胞を暴露した後、原繊維形成および凝
集形成種の存在を示すコロイド凝集を抑制するよう計画された発明のアッセイに
、細胞環境を暴露することによって監視することができる。 【００２２】 発明の別の面は、表面に自己集積的な単層を形成する一連の方法である。これ
らの方法は、発明の他の面との関係で使用可能な単層被膜のアーティクルを形成
するために使用できる。ある方法には、自己集積的な単層を形成する分子性種お
よび界面活性剤を含む媒質に表面を曝露することによって、表面に自己集積的な
単層を形成することが含まれる。別の方法では、自己集積的な単層を形成する分
子性種およびカルボン酸塩を含む媒質に表面を曝露する。さらに別の方法では、
界面活性剤およびカルボン酸塩の両方を媒質に入れる。種の上に自己集積的な単
層を沈積させるという発明のこの面に一致する形で使用可能な界面活性剤には、
本質上、広範囲の様々な界面活性剤が含まれる。自己集積的な単層形成を助ける
ために使用するカルボン酸塩には、クエン酸ナトリウムを含むカルボン酸塩が含
まれることが好ましい。 【００２３】 自己集積的な単層形成の別の方法には、コロイド粒子の表面に自己集積的な単
層を形成することが含まれる。形成は、コロイド粒子自身が形成されている間は
起こらない。例えば、予め形成の完成したコロイド粒子の上に単層は形成される
。別の方法では、自己集積的な単層は、粒子がいかなる溶液・溶液界面にも存在
しないような懸濁溶液中のコロイド粒子の表面に形成される。 【００２４】 発明の様々な面におけるより特殊な例として、凝集プラーク並びに原繊維に組
み込まれるか、あるいは、それらと結合する能力を持つペプチドもしくはほかの
結合種は、信号部分に変更を受けた後、疾患に関係するペプチド凝集および、ま
たは原繊維を含む可能性のある生物学的な試料、あるいは、凝集形成を誘導する
効果を持つ薬剤と混合される。プラーク並びに原繊維に組み込み可能で、感知表
面に特異的に引き寄せられる漸増部分に変更を受けたその他の種も、同一の試料
に混合される。適切な定温放置期間の後、試料溶液は、検出装置に対して補充可
能なペプチドが特異的に引き寄せられる条件下に置かれる。予め存在していたプ
ラークおよび原繊維に対する信号部分並びに補充部分のこの組み込みは、凝集に
標識付けを行なった後、それらを検出域に集中される感度の高い効果的な方法を
提供する。 【００２５】 既存の原繊維ないし凝集に対する組み込みは容易であるが、既存の原繊維が存
在しない場合は容易に凝集しないような、信号および漸増種に付着した結合種の
配列を選ぶことができる。ペプチドは、標識付けされたデンドリマーまたはポリ
マーに対する直接、化学的な結合付着によって信号部分に連結される。それに代
わる方法として、ペプチドは、結合種と信号群の両方に同時に存在する、コロイ
ドを含む粒子様金属との結合を通して信号部分に連結される。さらに、原繊維の
形成に関与可能な異型種を添加して、溶液中に遊離させ（標識付けの有無を問わ
ず）、凝集過程を促進させることで増幅装置として用いる。 【００２６】 結合種は、電磁場または定置磁石を通じて検出域に補充可能な磁気ポリマーに
ペプチドを付着させるなどの、直接、化学的な付着によって漸増部分に連結され
る。さらに、結合種は、磁気ビーズ、Ａ−セファローズビーズ（抗体を結合する
タンパク質Ａ部分を含む表面機能を表わす）、あるいは、感知域または表面に特
異的に付着する帯電粒子などの、粒子様物質との結合によって漸増部分に連結さ
れる。結合種も、直接、化学的な結合によって、または、金属結合標識（ヒスジ
ビン標識など）に連結されたペプチドなどの生物学的認識単位の効果によって補
充が可能な漸増部分に対する、粒子様物質を用いた結合によっても、連結される
ことができる。後に、金属結合標識は、表面の自己集積的な単層（ＳＡＭ）部分
として表面に固定することの可能なニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などの表面に結合
したキレートによって配位結合された金属に結合する。結合種もしくはその他の
種も、チオールなどの自己集積的な単層を形成する種に付着したバイオメトラか
ら工業的に入手可能なストレプト標識を用いて表面に連結される。自己集積的な
単層部分を形成するストレプト標識は、ビオチン変更結合種などのビオチン変更
部分を容易に固定すると思われる。結合種は、以下により完全な形で記すような
別の方法によっても表面に連結される。 【００２７】 発明のその他の利点、新しい特徴、および目的は、付随の図とともに考察され
た時、以下の詳細な記述から明らかになるだろう。図は概要を示すものであり、
尺度を考慮して描かれたものではない。図中では、様々な図に記された各々の同
一か、ほとんど同一の成分は、単一の数字で表わされている。明解にする目的か
ら、すべての図のすべての成分に標識付けを行なうことはせず、専門分野に通常
の技能を有する人々が、発明を理解する上で図解が不要な個所では、発明の各々
の実施例のすべてに関する全成分を示すこともしていない。 詳細な説明 定義 本文中で「小型の分子」という場合は、５キロダルトン未満の分子を、より一
般的には、１キロダルトン未満の分子を指す。 【００２８】 「神経変性疾患の凝集および原繊維」の用語は、分子混合物（例：結合相手ど
うしなど相互に作用する分子）のみならず、同族分子からなる錯体（例：原繊維
凝集）も指すが、一般的には、神経変性疾患の特徴であり、同疾患を引き起こす
と見なされるタンパク質性分子を指す。当発明の凝集は、一般的には、光散乱ま
たは色彩変化によって顕微鏡下で目に見えるものとなる程度の大きさ（コロイド
の相互作用の効によって）である。 【００２９】 「原繊維を目に見えるものとする」という句は、目に見えない原繊維を、目で
、顕微鏡で、あるいは、吸光度によって見えるものにする技術を指す。原繊維に
着色粒子を付着させるか、または、同粒子で修飾することを含むが、それに限ら
ず、様々な方法が予定されている。 【００３０】 本文中で「候補薬品」の用語を用いる場合は、人体もしくは他の動物体内で使
用するすべての医学的な物質を指す。この定義の範囲内には、類似化合物や、自
然発生および合成組み換えによる調合剤、ホルモン、抗菌薬、神経伝達物質など
が含まれる。この語には、神経変性疾患の治療薬または予防薬として有効と評価
されるすべての物質（自然発生、合成、組み換えを問わず）が含まれる。評価は
、一般的には、当発明の選別アッセイなど、アッセイ活動を通して実施される。 【００３１】 発明では、様々な型の粒子を使用する。例えば、「溶液懸濁粒子」とは、懸濁
溶液中に留まるように作成されたものであり、懸濁溶液中で、発明の目的のため
に（一般的には水溶液として）単独で利用されるか、または、磁場や電磁場にか
けたり、かき混ぜたり振ったり、振動、超音波処理、遠心分離器、渦巻運動など
のような撹拌にかけることによって溶液中に維持することができる。「磁気によ
る懸濁が可能な」粒子とは、磁場にかけることによって懸濁溶液中に留めおくこ
とのできる粒子である。電磁気による懸濁が可能な粒子とは、電磁場にかけるこ
とによって懸濁溶液中に留めおくことのできる粒子である（例：帯電粒子、また
は、帯電可能に変更された粒子）。「自己懸濁粒子」とは、十分に小さいサイズ
および、または量なので、少なくとも１時間は利用可能な状態（一般的には水溶
液）で懸濁中に留まるような粒子である。その他の自己懸濁粒子には、他の助力
なしに５時間、１日、１週間、あるいは、さらに１ヵ月でも、発明により懸濁中
に留まるような粒子である。 【００３２】 本文中で「神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種を結合する能力を持つ
結合種」という場合は、タンパク質、ペプチド、それぞれの配列、抗体、コンゴ
レッド、チオフラビン−Ｔ、または、具体的に記された結合能力を持つ種などの
、すべての種が含まれる。抗体の場合には、この結合は位置特定的である。その
他のものの場合は、位置特定的ではない。タンパク質またはペプチドの場合には
、結合は、一般的に、不特定のβ−シートおよび、またはβ−シート相互作用を
含む。結合種には、自然発生による神経変性疾患の凝集体または原繊維形成種に
一致するペプチド、断片、または完全体のタンパク質も含まれる。 【００３３】 「タンパク質」並びに「ペプチド」は専門的によく知られた用語であり、各々
が含むアミノ酸の数に関しては専門的には厳密に定義されていない。これらの用
語を本文中で用いる場合、専門で通常用いる意味に使用する。通例、ペプチドは
、長さにおいて約１００個未満のアミノ酸からなるアミノ酸配列であるが、３０
０個までのアミノ酸からなる配列も含まれる。 【００３４】 本文中で「金属結合標識」という場合は、キレートによって配位結合された金
属に固定された分子群を指す。利用に適したこのような分子群には、ヒスジビン
並びにシステイン（「ポリアミノ酸標識」）を含むが、それに限らないアミノ酸
配列が含まれる。金属結合標識には、以下で定義するヒスジビン標識が含まれる
。 【００３５】 本文中で「金属を配位結合するキレート」または、キレートによって配位結合
された金属という場合には、金属上の利用可能な配位位置を全部は満たず、いく
つかの配位位置を、金属結合標識による結合に利用できるように残しておくキレ
ート剤によって配位結合された金属を指す。 「信号統一体」とは、特定の試料
または特定の位置にそれ自体の存在を示す能力を持つ統一体を意味する。発明の
信号統一体には、裸眼で識別可能なものや、孤立した形では見えないが十分な量
が集まれば裸眼で検出可能であると思われるもの（例：コロイド粒子）、目で（
裸眼または顕微鏡などを用いて）または分光器で容易に検出できるレベルまたは
波長幅内で電磁気放射を吸収もしくは放射する統一体、または、適切な活性化エ
ネルギーに対する曝露時に、特徴的な酸化および、または還元パターンを示す酸
化還元活性のある分子などの電子的に検出可能な統一体（「電子信号統一体」）
などが該当する。例としては、染料や、色素、酸化還元活性分子など電気活性を
有する分子、蛍光部分、上昇調整（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）蛍光体、また
は、セイヨウワサビぺルオキシダーゼ並びにアルカリ性ホスファターゼを含む、
酵素に連結した信号部分が含まれる。 【００３６】 アーティクルの表面に関係する種について、本文で文脈中で「固定されるか、
または、固定されやすい形になって」という場合には、共有結合による付着によ
って種が化学的および生化学的に連結しているか、あるいは、キレートおよび、
または金属結合のような配位結合などを意味する（例：バイオチンおよび、また
はストレプトアビジン）。例えば、この状況でいう「固定されて」には、ポリエ
チレンビーズ上で発達したペプチドなどの結合種や、ビーズに共有結合するタン
パク質Ａなどのタンパク質に不特定的および、または生物学的に結合した抗体と
特に生物学的に結びついた結合種や、共有結合によって表面に固定された結合相
手に、後で特に生物学的に結合するＧＳＴやファージなどの分子の（遺伝子工学
的に形成された）一部を形成する結合種（例：ＧＳＴの場合にはグルタチオン）
などを含むが、それに限らない、複合の化学的な結合や、複合の化学的および、
または生物学的な結合などが含まれる。別の例として、共有結合でチオールに連
結した部分は、チオールが非常に強力に、たぶん共有結合で、金を結合するため
に、金の表面に固定されやすい形になる。同様に、金属結合標識を帯びる種は、
表面に共有結合された分子（チオールおよび、または金結合など）を帯びる表面
に固定されやすい形になるが、それらの分子も金属を配位結合させるキレートを
示す。種も、表面が特定のヌクレオチド配列を帯びる場合には、表面に固定され
やすい形になっており、相補性のヌクレオチド配列も種に含まれる。「固定され
て」の定義には、いくつかの不特定結合、すなわち、発明の技術の目的ための、
種の表面に対する志向的な付着が含まれる。発明の「固定されて」の定義に該当
する不特定結合は、発明のアッセイに関係する洗浄処理手順に耐える付着を生じ
ると思われる。具体的には、不特定結合した種は、トウィーン−２０などの界面
活性剤、並びに、溶液を生理的ｐＨに保つためのリン酸塩緩衝液などの緩衝液を
一般的には含む洗浄水溶液による少なくとも１回の洗浄手順に耐えるような場合
には、表面に「固定されて」いるという。 【００３７】 「明確に固定されて」または「明確に固定されやすい形になって」とは、「固
定されるか、または、固定されやすい形になって」の定義に関連して上に記した
ように、種が化学的および生化学的に表面に連結されていることを意味するが、
すべての不特定結合は除く。 【００３８】 本文中で「不特定結合」という場合は、生化学分野で通常用いられる意味で用
いる。 本文中で「コロイド」という場合は、生化学分野で通常用いられる意味で用い
る。一般的に、コロイド粒子とは、どの断面で切っても２５０ｎｍ未満のもの、
より一般的には、どの断面で切っても１００ｎｍ未満のものをいう。 【００３９】 本文中で「金属を配位結合できる部分」という場合は、金属結合標識やキレー
トなど、金属原子の少なくとも二つの配位位置を占めることができるすべての分
子を意味する。 【００４０】 本文中で用いられているように、他の成分に固定されるか、または、例えば、
他の成分もまた固定されている第三の成分に固定されることによって、あるいは
他の方法で、間接的に他の成分に固定される他の成分に「関連して固定され」た
成分は、換言すれば、他の成分に結合していることになる。例えば、信号統一体
が結合種に固定されている場合には、結合種との関連で固定されたことになり、
結合種が固定されたコロイド粒子に固定され、結合種が固定されたデンドリマー
またはポリマーに固定されたことになる、などということである。 【００４１】 本文中で「神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種」という場合には、神
経変性疾患に関係のある他の分子（類似分子を含む）に結合して、神経変性疾患
の特徴である原繊維および凝集を形成する十分な結合能力を持つ、神経変性疾患
に関係する生物学的な種を意味する。このような凝集形成および原繊維形成種は
、一般的には、配列相同性が健常な対部分に関連する分子配座の変更を特徴とし
、類似および同様の分子に対する対部分の結合をより容易なものとする。いくつ
かの場合には、このような凝集形成および原繊維形成種は、結合種を非凝集形成
および原繊維形成配座から凝集形成および原繊維形成配座へと転化する能力を持
つ。プロトフィブリルは、神経変性疾患に関係する他の分子を結合して、神経変
性疾患の特徴である凝集に関わる原繊維を形成することが報告されている。この
例で見る限りでは、プロトフィブリルは、神経変性疾患の凝集形成および原繊維
形成種に関して本文中で用いられている定義に含まれる。凝集体または原繊維形
成種には、一般的には、１−３８から１−４４までのアミノ酸配列が含まれる。 【００４２】 「異なる生物学的種」とは、マウスとハムスター、マウスとヤギなどのように
別々の動物を意味する。 「試料」という用語は、生物学的採取源から得られた細胞、組織、体液のすべ
て（「生物学的試料」）、または、患者から得られた生物学的試料や、動物から
得られた試料、人の食用を意図した食品から得られた試料、家畜飼料など動物の
食用を意図した食品から得られた試料、臓器提供試料などを含むが、それに限ら
ず、発明に従って有益と評価されるその他のすべての媒質を指す。 【００４３】 特定の成分を「含むと推測される試料」とは、関係成分の内容が分かっていな
い試料を意味する。例えば、神経変性疾患であると推測はされるが、神経変性疾
患を罹病していたかどうか分からない人から得られた体液試料は、神経変性疾患
の凝集形成および原繊維形成種を含むと推定される試料と定義される。この場合
の「試料」には、「構造的に前決定された試料」のみならず、人やその他の動物
から得られた生理学的な試料や、食品や家畜飼料などの自然発生試料が含まれる
。本文中にいう「構造的に前決定された試料」とは、構造が神経変性疾患に関係
しているかどうか試験することを意図する分析で使用される前決定構造からなる
化学的および生物学的な配列および構造である。例えば、「構造的に前決定され
た試料」には、ペプチド配列、および、ファージ表示ライブラリー中の任意のペ
プチド配列などが含まれる。動物から採取される定型的な試料には、血液、尿、
涙液、唾液、脳脊髄液、扁桃由来の体液あるいは他の試料、リンパ節、針生検な
どが含まれる。 【００４４】 本文中で用いられるように、「ポリ−ヒスチジン域（ｔｒａｃｔ）」または「
ヒスチジン標識」または「ＨＩＳ−標識」とは、ペプチドまたはタンパク質のア
ミノ基およびカルボキシル基のどちらかの終末を持つ２個から１０個までのヒス
チジン残基の存在を指す。６個から１０個までの残基からなるポリ−ヒスチジン
域は、発明で好んで使用される。ポリ−ヒスチジン域は、機能的には、問題とな
るタンパク質に付け加えられたいくつかの連続的なヒスチジン残基であるとも定
義され、キレートコラム（ｃｏｌｕｍｎ）上に生じたタンパク質の親和力精製、
または、もう一つの分子（例：ＨＩＳ−標識と反応可能な抗体）との相互作用を
通じたタンパク質終末の同定を可能にする。ヒスチジン標識を持つ配位子および
ヒスチジン標識を持つ推定上の結合相手は、コロイド状態を示すＮＴＡおよび、
またはＮｉ（ＩＩ）ともに定温放置される。その結果、２成分が相手を結合した
場合には、目に見える網状組織が生じるはずである。それに代わる方法として、
推定上の結合相手を、コロイド上に現れるダンタチオンに結合するＧＳＴ溶解タ
ンパク質にすることもできる。発明のアッセイにおいて結合種やその他の関連物
を表面に付着するのに役立つリンカーには、親和力標識が含まれる。親和力標識
は、生物学、生化学などの分野で幅広く利用されるよく知られた種である。 【００４５】 図１について言えば、当発明の１配合法を略図的に図にしたものである。図１
に示されたアーティクル２０は、具体的には、表面にＳＡＭ２２を含む電極であ
る。ＳＡＭ２２が相対的に電気伝導性を持つことが望まれる実施例では、ＳＡＭ
２２は、「分子ワイヤー」２４を含む。一般的に、混合ＳＡＭは、アリキルなど
の比較的伝導性のない種から形成され、ポリエチレングリコールなどの不特定の
結合抑制物質で任意の終末を構成し、分子ワイヤーと混合されている。表面およ
び、表面に自己集積的な単層分子を結合させる機能群の選択は、よく知られた専
門技術である。この件およびその他の参考のために参考文献として本文に組み込
まれた米国特許番号５，５１２，１３１並びに５，６２０，８５０、および、国
際特許公示番号ＷＯ９６／２９６２９を参照のこと。 【００４６】 本文中で「分子ワイヤー」という場合には、ＳＡＭで被膜した電極の作用を受
ける溶液の能力を高めて電極と電気的に連絡できるようにするワイヤーを意味す
る。これには、伝導性分子、すなわち、上で少し触れ、以下でより完全に例示す
るように、溶液の電極への接触を許すことでＳＭＡ内で欠陥を引き起こす可能性
のある分子が含まれる。追加可能な分子ワイヤーの終わりのないリストには、２
−メルカプトピリジン、２−メルカプトベンゾチアゾール、ジチオトレイトル、
１，２−ベンゼンジチネル、１，２−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼン−エ
タンチオール、および２−メルカプトエチルエーテルが含まれる。単層の伝導率
は、伝導率を高める分子を電極面に添加することによっても高められる。伝導Ｓ
ＡＭは、１）硫黄終末を持つポリ（エチニルフェニル）鎖、２）ベンゼン環終末
を持つアルキルチオール、３）ＤＮＡ塩基終末を持つアルキルチオール、４）単
層中に不完全に詰まった硫黄終末を持つすべての種、５）不特定の吸着を抑制す
るエチレングリコル単位またはメチル基の終末を持つ上記のプラス・マイナスど
ちらかのアルキルチオールスペーサー分子から構成されるが、それだけに限定は
されるものではない。チオールを取り上げたのは、ＳＡＭの容易な形成において
金に対する親和力を持つためである。米国特許番号５，６２０，８２０およびそ
の他の参考文献由来の技術で知られているチオールの代わりに、他の分子を用い
ることもできる。分子ワイヤーは、容積またはその他の配位のために、一般的に
、他の方法で相対的にしっかりと詰まったＳＡＭの中では、ＳＡＭが表面を密閉
して曝露された溶液に触れないようすることを妨げる欠陥を生む。分子ワイヤー
は、しっかりと詰まった自己結積構造の崩壊を引き起こし、その結果、表面が曝
露されている溶液が表面と電気的に連絡することを許す欠陥が明らかとなる。こ
の状況において、溶液は、表面に接触するか、または、トンネル効果が生じるほ
ど表面近くまで接近することによって、表面と電気的に連絡する。 【００４７】 アーティクル２６、具体的には磁気ビーズは、神経変性疾患の凝集形成および
原繊維形成種を結合する能力を持つビーズに固定されたか、または、固定されや
すい形になった多数の結合種とともに投入される。多数の結合種２８も、実施例
の図解では各々が多数の信号統一体３４を運ぶように示されたデンドリマー３２
を含む信号統一体３０に固定されたか、または、固定されやすい形で投入される
。神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種である多数の標的分子３６は、例
えば、分子を含むと推測される生理的試料中に入れることによって導入可能であ
る。結合種２８は、凝集形成および原繊維形成種３６に結合して、付着した結合
種を持つビーズ２６、付着した結合種を持つ信号統一体３０、および、各々に固
定された凝集体または原繊維形成種３６を含む連結の存在を明らかにする。この
配合は、電極の下にある磁石３８の働きによって電極２０の表面に引き寄せられ
、さらに、信号統一体３４が電子信号統一体である場合には、試料中の凝集形成
および原繊維形成種３６の存在を示す電極２０付近への接近が検出される。 【００４８】 特に、この実施例では、電子信号統一体３４には、メタロセン、特にフェロセ
ンなどの酸化還元活性を有する分子を用いることができる。信号統一体３４とし
てのフェロセンの電極２０付近への接近は、交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）な
どの循環ボルタンメトリー技術を用いて測定される。 【００４９】 結合種２８は、信号統一体３０および、またはビーズ２６に最初から固定され
ている必要はないが、混合物は、種３６、結束種２８、信号統一体３０、および
ビーズ２６を含むと推測される試料を含む形で投入され、その中で、結束種２８
は、まだ固定されていない場合には、信号統一体３０および、またはビーズ２６
に固定されやすい形になる。この配合で、種２８は、化学的および生物学的な結
合相手である、信号統一体３０またはビーズ２６に固定された分子を含むことに
よって、信号統一体３０および、またはビーズ２６に固定されやすい形になるこ
とができる。ビーズ２６が重合体ビーズの場合には、共有結合で結びついた様々
な連結分子を含むことができる。同様に、統一体３０も、このような方法でも変
更可能である。上に載せたＳＡＭの形成を促進する働きのある金のような物質の
表面層に、ビーズ２６も被膜可能であり、連結分子を帯びる、分子を形成するＳ
ＡＭ（金表面の場合にはチオール）が、その上で形成される。ビーズ２６上の連
結分子または信号統一体３０と、結合種２８の間の連結は、金属結合標識、金属
、キレートの連結や、相補性の核酸配列、ビオチン、ストレプトアビジンなどを
含むことができる。金属結合標識、金属、キレートの連結（ｌｉｎｋａｇｅ）を
用いた配列で、キレートは、ビーズ２６上のＳＡＭ部分を形成することが可能で
、共有結合で信号統一体３０に付着する。キレートは金属を配位結合させるが、
少なくとも金属上の２カ所の配位位置は空けたままにしておく。ポリアミノ酸標
識などの金属結合標識は、結合種３６に組み込むことが可能で、金属に結合する
金属の配位結合によってビーズまたは信号統一体に標識を固定する能力を結合種
３６に与える。適したキレートの例としては、ニトロトリ酢酸、２，２−ビス（
サリチリインデンアミノ）−６，６−デメチルジフェニル、または、１，８−ビ
ス（ａ−ピリジル）−３，６−ジチアオクタンが含まれる。交替固定技術では、
結合種３６は、終端のシステインを帯びることができ、それによってビーズ２６
の金表面に固着する。 【００５０】 様々な結合種３６が選択可能である。結合種には、ペプチド、タンパク質、タ
ンパク質由来の配列、コンゴレッドやチオフラビン−Ｔなどの小型分子、あるい
は、凝集形成種やＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオチド誘導体、または、凝集形成およ
び原繊維形成種３６に対する抗体から誘導した配列と相同の配列を用いることが
できる。 【００５１】 様々な表面を用いて、キットまたは方式の成分を形成するか、または、発明の
方法を実施することができる。ビーズ、コロイド、電極、ＥＬＩＳＡプレート、
または、その他の多ウェルプレートなどが使用可能である。 【００５２】 多くの発明の技術においては、アッセイに導入されたすべての結合種の凝集形
成への関与を防ぐことが望ましい。このような場合には、凝集結合性の、ただし
、凝集形成耐性のある結合種を利用することができる。専門分野に通常の技能を
有する人々であれば、抗体、または、タンパク質やペプチドの断片などのような
凝集を結合するが形成しない種の中から、凝集形成に耐性を持つ結合種を容易に
選択することができる。 【００５３】 電極、粒子、ビーズなどを問わず、アーティクルの表面は、凝集形成および原
繊維形成種の不特定結合を実質的に抑制する化学的機能を有することが望ましい
。ある実施例では、これに、アッセイで望まれる機能提示のため、表面上でＳＡ
Ｍ形成を行なうことも可能であるが、この場合のＳＡＭは、他の不特定結合抑制
物質を含む混合ＳＡＭである。ＮＳＢ抑制物質には、ポリエチレングリコール終
末を持つＳＡＭ形成種が含まれる。 【００５４】 コロイドを被膜するＳＡＭは、コロイド・コロイドの自己凝集を抑制する。こ
れには、帯電部分および、またはカルボキシル基終末を持つ種がＳＡＭ外へ出る
ことを防ぐ十分な量のＳＡＭ形成種を使用することができる。帯電部分および、
またはカルボキシル基終末を持つ種は、量においてＳＡＭの約１０パーセント以
上か、または、望ましくは、最低値でＳＡＭの約３０パーセントおよび約４５パ
ーセント存在する必要がある。 【００５５】 次に、図２について言えば、図１に示されたようなアッセイに用いるのに適し
たもう一つの配合が示されているが、変更点がある。図２の配合では、種２８に
固定されたか、または、固定されやすい形になった信号統一体３０ではなく、個
々の信号統一体３４に関係するか、関係して固定されやすい形になった種２８が
、コロイド粒子４０に固定されたか、または、固定されやすい形になった各々の
種２８並びに信号統一体３４を通じて固定されている。種２８並びに信号統一体
３４は、専門分野で知られているか、または、本文中に記すような様々な化学的
ないし生物学的な技術通じて、コロイド粒子４０に固定されやすい形になること
ができる。金コロイド粒子４０を使用することによって特に便利なのは、コロイ
ド４０の表面に結合する予定のチオールに対して信号統一体３４並びに結合種２
８を付着させる過程である。ＳＡＭは、信号統一体３４並びに結合種２８を含む
コロイド４０の表面を被膜して形成することができる。図２の配合では、塩基２
６並びにコロイド４０の各々に固定された結合種２８の凝集体または原繊維形成
種３６に対する結合は、ビーズ２６を電極２０付近へ引き寄せる磁石３８による
活性化を受けて、信号統一体３４がビーズ２６に関係して固定されている理由か
ら、次には、信号統一体３４を電極２０付近へ引き寄せる。電極２０付近にある
信号統一体３４の電子的な検出は、ＡＣＶなどを用いる通常の手順である。 【００５６】 図１並びに２に示されたアッセイは、様々な目的に使用することができる。凝
集体または原繊維形成種３６が試料中に存在するどうかの測定に使用する場合に
は、ビーズ２６、信号統一体３０（図１）、またはコロイド粒子４０（図２）、
および、ビーズ２６、統一体３０、またはコロイド粒子４０に固定されたか、ま
たは、固定されやすい形の結合種２８を含むキットを投入し、試料とともに溶液
中に混合する。凝集体または原繊維形成種３６が試料中に存在する場合には、混
合と磁石３８による活性化の後、電極２０付近に信号統一体３４が集まることに
よって分かる。凝集体または原繊維形成種３６が存在しない場合には、信号統一
体３４は磁石による活性化を受けても電極付近には引き寄せられない。 薬品選
別に利用される別の技術では、神経変性疾患の候補治療薬とともに、凝集体また
は原繊維形成種３６が既アッセイ、試料中に加えられる。このような配合では、
凝集体または原繊維形成種３６を通して、異なる候補薬品が、結合、信号統一体
３０、コロイド粒子４０、または、ビーズ２６に対して異なる効果を現わすと思
われる。この結合を抑制する候補薬品が、神経変性疾患の候補治療薬である。ア
ッセイは、信号（電極２０付近への信号統一体３４の接近）が、試料中の凝集体
または原繊維形成種３６の濃度のみならず、試料中で生じる凝集および原繊維形
成の程度とも比例または他の方法で関係するような方法を用いて確立される。薬
品選別アッセイにおけるこのような配合では、信号は、特定の薬品候補が、神経
変性疾患の特徴である凝集および原繊維形成を妨げて、試料中の凝集体または原
繊維形成種３６を凝集させないようにする程度に比例または関係すると思われる
。 【００５７】 薬品選別アッセイでは、しばしば、信号統一体３４に関係したビーズ２６の固
定と、特定の溶液中における凝集体または原繊維形成種３６の濃度および、また
は薬品候補の濃度との間の関係を量的に測定することが望まれる。このような配
合では、結合種２８が凝集体または原繊維形成種に転化されることなく、凝集体
または原繊維形成種３６を結合して、結合事象と信号の間の１対１の関係を維持
することが望ましい。これは、異なる生物学的な種、例えば、ハムスターとマウ
スから別個に、または、標的に１対１で結合する同一種から誘導された配列など
の中から、結合種２８並びに凝集体または原繊維形成種３６を選択することによ
って達成される。 【００５８】 別の配合では、結合事象と信号の間の、すなわち、溶液中の種間の１対１関係
を維持するよりも、アッセイ感度を最大化することの方が望まれる。このような
配合では、結合種２８を、ただ、神経変性的な凝集体または原繊維形成種３６に
結合するだけで、それ自体は凝集体または原繊維形成種ではない種から、他の結
合種を凝集体または原繊維形成種に転化する能力を持つ凝集体または原繊維形成
種に転化することが望まれる。このような配合では、図１並びに２に見るように
、ほんの少量の凝集体または原繊維形成種３６しか試料中に存在しない（例えば
、ごく初期段階の神経変性疾患患者から得られた試料に特徴的に見られる１０万
分子ほどの少量であっても検出されなければならない。なぜなら、感染性プリオ
ン分子はその数で十分疾患を引き起こす）場合には、溶液中に「増幅」種２９が
投入され、試料と混合される。このような配合では、試料中にごく少量の凝集体
または原繊維形成種３６しか存在しなくても、それによって増幅種２９が凝集体
または原繊維形成種へ転化された結果、凝集体または原繊維形成種は、アッセイ
で使用するために十分検出可能な濃度で存在するようになる。試料中に凝集体ま
たは原繊維形成種３６が最初から存在しない場合には、その後増幅種２９は転化
を止めて、信号はほとんど、ないし、まったく、検出されなくなる。増幅種２９
は、試料中の凝集体または原繊維形成種３６の濃度を検出可能なレベルまで増幅
するのみならず、神経変性疾患の特徴である種３６の塊状凝集を促進するが、そ
れは、後には、何百、何千ものビーズ、コロイド、および、または、１マクロ構
造内の何千もの凝集体または原繊維形成種に結合した信号統一体を含むマクロ構
造を形成する。これらの構造は電子的に、さらに、しばしば、目で容易に検出で
きる。 【００５９】 増幅種２９は、上記にリストされた結合種２８を結合する種のすべての中から
選択可能であるが、特定のアッセイでは、結合種２８を結合する種と同一であっ
てはならない。例えば、特定のアッセイにおける結合種２８は結合種ではあるが
、凝集体または原繊維形成種への転化能力はない。一方、増幅種２９は、凝集体
または原繊維形成種の存在を明らかにするように転化可能である。後者の状況（
結合種２８は転化不能であるが、増幅種２９は凝集体または原繊維形成種へ転化
可能である）は、陽性反応が出ない（試料中に凝集体または原繊維形成種３６が
ない）場合の粒子・粒子の凝集を防ぐのに役立つが、種３６の増幅は、試料中に
投入されると発生し、アッセイ感度を上げる。 【００６０】 塊状凝集を引き起こすために十分な量（種３６の検出に望まれるレベルに達し
てはいないが）の凝集体または原繊維形成種３６を最初から含んでいる試料に、
塊状凝集を引き起こすために増幅種２９を使用することに合わせて、必ずしも、
図１並びに２に記されたような電子信号統一体並びに磁気ビーズを使用する必要
はない。このような配合では、コロイド粒子４０と、コロイド粒子４０に固定さ
れたか、または、固定されやすい形になった結合種２８、および、増幅結合種２
８を含むキットが投入される。このようなキットは、凝集体または原繊維形成種
３６を含むと推測される試料と混合することができる。非常に低いレベルであっ
ても、種３６は、増幅結合種２８を凝集体または原繊維形成種に転化することが
可能で、例えば、裸眼や、顕微鏡、光散乱、吸光度などで容易に検出可能な塊状
凝集、並びに、マクロ構造の形成を引き起こす。この配合では、コロイド粒子４
０は、必ずしも、補助的な信号統一体を帯びる必要はない。 【００６１】 図１並びに２に関する上記の配合では、表面固定ではない補助的な凝集形成お
よび原繊維形成種３６の不存在下で、（１）補助的な凝集体または原繊維形成種
の不存在下における凝集と（２）補助的な凝集体または原繊維形成種の存在下に
おける凝集の比較を可能にする時間枠の間、粒子・粒子曝露上の粒子凝集を抑制
できる結合種２８が選択され、ビーズ２６並びにコロイド粒子４０（コロイド粒
子が使用されている場合）の表面濃度に投入される。すなわち、凝集体または原
繊維形成種３６が最初から試料中に存在していない場合には、コロイド粒子の凝
集が生じるが、それは、ごくゆっくりとした限られた範囲に留まるものであるの
に対して、種３６が最初から存在している場合には、凝集はより迅速に、および
、または、より広範囲に生じることになる。このようなアッセイでは、対照に試
料自体は用いず、試料から得られた割合および、または凝集レベルを、対照値と
比較することが可能である。 【００６２】 当発明の方式並びにアッセイは、特定の神経変性疾患に関係する特定の１原繊
維に限定されるものではない。実際、当発明は、このような疾患（例：アルツハ
イマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病など）の宿主に関係す
る原繊維の検出を予定している。 【００６３】 本発明は、疾病を検出し、そのような疾病の治療用薬剤の有効性を判定するた
めの各種アッセイおよびアッセイの構成要素を提供する。アッセイには、サンプ
ルまたは薬剤スクリーニングアッセイと検出電極との電子的相互作用が含まれる
こともあり、これに限定されるわけではないが、目視検査、密度走査、光透過、
吸収、色変化および光散乱などを含む様々な手法で検出できる凝集が含まれるこ
ともある。凝集に関連して、凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な、また
は先在する凝集体または原繊維に包含可能な結合種は、コロイド（たとえば金コ
ロイド）または他の粒子（たとえば蛍光ビード）に結合する。これらの粒子は、
随意に遊離結合種（コロイドに結合していないが、コロイドが浮遊している流体
中に浮遊または溶解している種）とともに、凝集体または原繊維（たとえば患者
サンプル）を含む溶液と混合される。粒子（たとえばコロイド）が原繊維内に包
含されるにつれ、粒子によって原繊維が目視検出できるようになる。コロイド上
に固定化されたペプチドが相互に作用するのを阻害するために、荷電部分（ＣＯ
ＯＨ、ＰＮＡ、荷電ペプチド）などの反発基をコロイド表面に固定できる。この
ことにより、固定ペプチドが相互作用せずに、原繊維と作用するために、診断ア
ッセイにおける偽陽性の発生が減少する。 【００６４】 また、グリコール単位などの柔軟性基はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）部分およ
びチオール部分の間に化学的に挿入できる。さらに自由度を導入すると、反応の
エントロピーコストが上昇することによって、相互作用の速度が低下する。本発
明は検出方法によって限定されるものではない。検出を行いやすくするために、
本発明は各種手法を検討する。たとえば、染料などの信号伝達エンティティは、
原繊維およびプラークを包含可能なペプチドの片方の末端に固定できる。信号修
飾ペプチドを原繊維内に導入すると、ペプチドによって原繊維の表面で染料が濃
縮され、「見える」ようになる。別の態様において、蛍光部分および消光部分を
ペプチドの両端に別々に結合させる。低濃度の溶液中では、これらは頻繁に相互
作用しない；しかし、原繊維上で共局在化されると、消光反応が起こり、溶液の
蛍光に変化が生じる。これらの変化は標準のＥＬＩＳＡプレートリーダーを用い
て分析できる。また別の態様において、２個の別個の化合物を、原繊維またはプ
ラーク中に包含可能なペプチドのＮ−末端側に結合させる。該化合物は、片方の
化合物が第２の化合物を改変し、それを活性化または検出可能になるように設計
されている。該化学修飾は、修飾しない場合は化合物は発光しないが、修飾後に
は発光するように行う。統計的には、該反応は２個の化合物が原繊維またはプラ
ーク上に共局在化している場合に、何桁倍も頻繁に発生する。別の態様において
、たとえば、酸化還元活性分子に固定化された種を、電極に固定化された種ある
いは、磁気ビードなどの、電極に引きつけられる補強可能な粒子に結合すること
を示す、電極表面付近における酸化還元活性分子の存在を検出可能な場合に、電
子的相互作用は検出手法の役割を果たす。別の検出手法において、サンプルの画
像をデジタル化し、次にパターン認識ソフトウェアを使用して、サンプルが凝集
体を含むかどうかを判定する。たとえば、図８に示すサンプルはＣＣＤカメラを
用いてデジタル化可能であり、パターン認識を用いて、色、凝集体のサイズ、凝
集体の空間分布、凝集体の相対量などを決定できる。多数の薬剤をスクリーニン
グする場合に、各種サンプルを個別および空間的に位置指定できることは特に有
用である。本発明の手法は、多ウェルプレートの各種プレート（図８を参照）お
よび／または複数の電極などの、個別および空間的に位置指定可能な領域を用い
て実施できる。 【００６５】 複数の電極は多ウェルプレートの個々のウェルなどに配置できる。 多数の薬剤をスクリーニングする場合に、各種サンプルを個別および空間的に
位置指定できることは特に有用である。本発明の手法は、多ウェルプレートの各
種プレート（図８を参照）および／または複数の電極などの、個別および空間的
に位置指定可能な領域を用いて実施できる。 用いる態様とは無関係に、本発明
のアッセイは凝集体または原繊維形成を阻害する化合物の薬剤ライブラリのスク
リーニングを行うためにただちに改変できる。薬剤スクリーニングアッセイでは
、結合種をコロイド（または他の粒子）に結合させて、凝集体形成または原繊維
形成種および薬剤候補を含む溶液を用いて培養できる。該溶液は、ペプチドの原
繊維内への包含を促進するために攪拌しても、しなくてもよい。結合種が凝集体
または原繊維内に包含されるにつれ、あるいはその後凝集体または原繊維を形成
する凝集体形成または原繊維形成種に包含されるにつれ、結合種は結合したコロ
イドを相互に接近させるため、コロイド溶液の色が変化する（たとえばピンク色
の懸濁液から透明溶液中の暗青色の沈殿へ）。この変化は、明確に目視可能であ
る。吸収分光測光法によると、５６９ｎｍのピークはコロイドの凝集につれて低
下する。 【００６６】 １つの態様において、１μＭ β−アミロイド（Ａβ）原繊維４６「種」およ
び金コロイドに結合したＨｉｓ付加β−アミロイドペプチドを含む溶液と、原繊
維を含まない対照溶液で、吸収分光測定を行う。どちらも主吸収ピークを５６９
ｎｍに示す。最初の走査の後、手段（たとえばキュベット、管、マイクロウェル
など）を含む反応物を撹拌し、次に再走査する。ペプチドがはるかに低い密度の
コロイドに結合すると、コロイドは溶液から沈殿せず、色も変わらないが、原繊
維を目視可能な粒子で修飾するよう作用する。暗赤色のクラスターが透明溶液中
に現れ、はっきりと目視できる。溶液を６０−１００倍に拡大して観察すると、
解像度の向上が得られる。分析は、（例示目的のみで）吸収分光測定または光散
乱を用いて自動化可能であり、これによって大きな原繊維構造を小さな微粒子物
質と見分けることができる。 【００６７】 １つの態様において、本発明の方法は（神経変性疾病に特徴的な原繊維を形成
する）ペプチドを使用して、信号伝達および／または補強部分によって改変し、
疾病状態を示す変換または凝集ペプチドを潜在的に含む生物由来のサンプル（ま
たはそのようなサンプルの生体外模造品）を用いて培養する。 【００６８】 ペプチドプラーク、凝集体または原繊維の存在は、標識ペプチドの包含により
検出される。本アッセイは以下に述べるような各種方法で、原繊維または凝集種
を迅速に効率よく検出できる系において実施できる。 たとえば、ある要素は原
繊維またはプラーク形成に関与するペプチドを持つ磁気粒子でもよい。第２の要
素は、原繊維またはプラーク形成に関与するペプチドと、信号伝達部分として作
用する、フェロセンなどの金属含有化合物の両者を与える、非相同ＳＡＭによっ
て誘導体化されたコロイドの形である。原繊維またはプラーク形成に関与するペ
プチドは、ビードやコロイドに結合したような、他のペプチドの誤折畳および自
発的凝集を触媒できる。ペプチドのこのような原繊維または変換種の存在は、磁
気ビード上のペプチドと信号伝達コロイド上のペプチドの会合を、それらが原繊
維または凝集体に同時に含まれていることによって検出して、サンプル中で検出
できる。 【００６９】 このような凝集が起きる培養期間の後、いまや磁気粒子はもちろん信号伝達コ
ロイドを含む錯体を引き付ける電磁場を印加することができる。このような系に
おいて磁気粒子は、大容量のサンプルによって生体認識粒子を混合し、次に検出
のために電極に標識された標的を迅速に補充する方法を提供する。振動ポテンシ
ャルを電極に印加すると、包含金属に特徴的な酸化ポテンシャルにおける電流ピ
ークによって、電極に凝集が存在することが示され、結果として凝集ペプチドが
存在することが示される。さらに、凝集速度および／または凝集物質量を上昇さ
せるために、遊離した変換されていないペプチドを測定溶液に加えて、凝集増幅
因子として作用させることもできる。凝集体形成も、周波数パルス、温度および
電場ならびに磁場の変化を用いることを含めて、培養および測定条件を変化させ
ることによって加速できる。 【００７０】 錯体は各種手法を用いて検出可能であるが、好ましい検出方法は交流ボルタメ
トリー（ＡＣＶ）である。この検出方法は、高次調和分析などの追加の分析手法
を用いて補完できる。 【００７１】 これらの錯体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの光学手段によっても検
出可能である。後者の手法を使用する場合、検出表面に錯体を補充することによ
って、光学特性に大きな変化が生じる。 【００７２】 このような疾病関連ペプチドの凝集状態は、重合種または凝集体（結合種を凝
集体または原繊維形成種に随意に変換できる凝集体または原繊維形成種）の導入
時に、目視確認できるようにしたり、光散乱検出において光を散乱できるように
したり、フロー検出系で粘度を変化させたり、電子信号伝達エンティティが凝集
体の一部を形成する成分に結合している場合は電子的に検出したりすることによ
って、検出可能な特性が元の非凝集状態から変化する凝集体を鎖が形成するよう
に、潜在的に病原性のペプチド（結合種あるいは凝集体または原繊維形成種）を
リンカーの一端に結合させることによっても検出できる。あるいは、正常な形の
病原性ペプチドを機能化ハイドロゲルまたはゲル状物質の規則「正孔」に結合さ
せることもできる。種またはタンパク質凝集体を導入すると、ポリマー内に与え
られた可溶性ペプチドまたは凝集体の変換が起こり、光学特性が変化するため、
これらの凝集体が目視検出できるようになる。 【００７３】 または、磁気粒子は金コートするか、ＳＡＭによって誘導体化することができ
る。ＳＡＭは、ペプチド−チオールの直接付加によって、またはＳＡＭに含まれ
るＤＮＡ−チオールに結合するＤＮＡ−ペプチド、あるいはＳＡＭ中に包含され
るＮＴＡ−チオールに結合するヒスチジン付加ペプチドなどのように間接的に、
望ましいペプチドを与える。本明細書で述べるコロイドは金属原子のクラスタで
あり、好ましい金属は金である。金クラスタはわずか２０個の金原子から作成で
きるため、コロイドは直径わずか数ナノメーターの考えられる最小の粒子内に含
まれる。このことは、これらの比較的小規模な原繊維形成ペプチドおよび金属含
有化合物を原繊維およびプラーク内に包含させ、浮遊状態で維持する場合に著し
く有利である。 【００７４】 該磁気粒子はヒスチジン付加ペプチドおよびペプチドフラグメントを捕捉する
ために、金でコートし、ＮＴＡチオールを含むＳＡＭで誘導体化することもでき
る。ＳＡＭは、またペプチドに共有結合している相補ＤＮＡ配列に結合している
ＤＮＡ−チオールによって誘導体化することもできる。立体障害が正常および異
常なプリオンペプチド間の相互作用に干渉しないように、ペプチドおよび粒子ま
たはコロイド、あるいはペプチドを粒子またはコロイドに結合させる認識基の間
にリンカーを挿入することもできる。 【００７５】 このリンカーまたはスペーサーは、グリコールまたはアミノ酸を含む、各種の
物質より構成できる。スペーサーの長さは、凝集体に近接させて疎水性環境を促
進すると、電子活性信号検出物質の酸化ポテンシャルの変化を促すために変化さ
せることができる。 【００７６】 磁気粒子はさらに寸法の大きい第２のコロイドで置換することも可能であり、
これらの大きなコロイドは電極表面に電磁気的に吸着される。しかしこれらは、
信号伝達部分に存在する付随コロイドによって修飾された場合のみ信号伝達を行
う。あるいは、どちらかのコロイドを、電磁力が加えられた場合にその移動度を
変化させる荷電部分によって修飾することもできる。すべてのコロイドは同じサ
イズでもよく、そのとき、電磁力を用いて凝集したコロイドを個々の粒子から分
離することもできる。別の変形では、第１の粒子は培養中に機械的に混合可能な
さらに重い粒子またはコロイドであり、次に測定を行う際に沈殿によって電極表
面に蓄積される。 【００７７】 これらの手法は１粒子系でも使用できる。たとえば、磁気ビードは病原性ペプ
チドおよび遷移金属錯体を供与できる。溶液中の病原性ペプチドがビード上のペ
プチドと相互作用して凝集体を形成すると、遷移金属の局所的環境は、より高い
ポテンシャルで酸化するように変化する。病原性凝集体または原繊維の存在は、
この系を電気化学的に分析すると、遷移金属の酸化ポテンシャルの変化として、
またはより低いポテンシャルでの第２酸化ピークの出現として検出される。別の
１粒子系は、遷移金属錯体を含む溶液中に正常なペプチドおよび増幅ペプチドを
出現させる磁気粒子を含む。これらの遷移金属は、導電性または非導電性のデン
ドリマーまたはポリマーに結合させることができる。試験サンプル中の病原性ペ
プチドが凝集体生成を促進するため、金属含有化合物は、磁気粒子に結合したペ
プチドと絡み合い、補充および電子的に検出可能な電子活性および磁気錯体が生
じる。 【００７８】 本アッセイ系はビードを使わずに構築することもできる。金属含有化合物また
はペプチド−チオールを含むペプチドおよび遷移金属錯体チオールは、電極上の
ＳＡＭに固定化したり、包含させることができる。増幅ペプチドは測定溶液に加
えても、加えなくてもよい。試験サンプルが病原性または感染性ペプチドを含む
場合は、表面固定化ペプチドに結合する。 【００７９】 このことは、金属錯体の局所的環境を変化させ、その酸化ポテンシャルを変化
させる。測定溶液中の増幅ペプチドは、デンドリマーまたはポリマーに結合する
金属錯体を含む。試験サンプルが病原性ペプチドを含む場合は、凝集種は金属化
ペプチドおよび表面固定化ペプチドをブリッジするよう作用する。この相互作用
によって、信号伝達部分が電極表面付近に配置され、電子信号は電極に伝達され
る。同様に、ＳＡＭに包含されたペプチドは、チオールによる直接結合によって
、またはＨｉｓ付加ペプチドを予備形成ＮＴＡ−ＳＡＭに結合することによって
電極上に生成し、病原性ペプチドと、ペプチドとフェロセンなどの信号伝達部分
の両方を与えるコロイドをさらに含むサンプル溶液中に導入できる。これらを再
度、原繊維／凝集体に組み込むと、信号伝達部分（この場合はコロイド）が電極
に近づけられ、信号が伝達される。反対に、ＮＴＡ基によって誘導体化されたペ
プチドは、ヒスチジン６個分の長さのペプチドとの相互作用によって、表面に結
合することができる。増幅ペプチドは、測定溶液に加えても、加えなくてもよい
。 【００８０】 これらの手法は、これらの神経変性疾病を治療する潜在的な薬剤候補のスクリ
ーニング用に改変することもできる。詳細には、記載した変形すべてにおいて、
薬剤候補を溶液に添加して、凝集体形成を阻害するその能力を、用量に変換され
る時間および濃度の関数として測定することができる。信号損失や電流ピークの
位置の変化などの各種パラメータは、陽性の、したがって治療上有用な効果を示
すことができる。さらに、薬剤候補を金属含有化合物を有するビードに結合させ
ると、ＮＴＡ−チオールがあってもなくてもＳＡＭｓによってコートされたコロ
イドとなり、ペプチドが結合したコロイドに結合したそれらの金属含有化合物と
は異なるポテンシャルで酸化を行う。次に異なる酸化ピークを探す。信号伝達金
属含有化合物は、ペプチドが結合したコロイドから除去することも可能であり、
薬剤含有コロイドによる単一の電流ピークも測定できる。また、薬剤候補をマイ
クロアレイに加え、分析のためにアレイ全体をＳＡＭ修飾電極蓋上に反転させて
載せる、多重薬剤スクリーニング装置を設計することもできる。 【００８１】 信号検出化合物が薬剤候補を含むコロイド上にある系では、競合阻害アッセイ
を実施することもできる。 この系では、金属含有信号検出化合物を含まない磁気ビードがペプチドを有す
る。溶液中の遊離ペプチドが、これらの磁気ビードに結合したペプチドと相互作
用可能である。推定薬品候補は金属含有信号検出化合物を含むコロイドに配置さ
れる。コロイド上の金属含有信号検出化合物は、凝集プロセスを中断し、磁気ビ
ード上のペプチドと直接相互作用すると、信号伝達を行う。薬剤候補が凝集体と
相互作用した場合にも信号が得られる。後者の情報は有用であるが、薬剤の作用
箇所を判定するために、その後のマルチステップアッセイが必要な場合が多い。 薬剤候補は、予備形成原繊維、電子信号伝達コロイドに結合したペプチドおよ
び磁気ビードに結合したペプチドを含む溶液に添加される。培養時間の後、磁気
ビードは検出電極に引き付けられ、ＡＣＶによって分析される。信号の損失は、
薬剤候補が原繊維形成を阻害したことを示す。 【００８２】 準安定性プロト原繊維は選択的に形成され、サイズ排除クロマトグラフィーに
よって均質になるまで精製され、その後、薬剤スクリーニングの標的原繊維使用
することができる。同様に、パーキンソン病に特徴的な原繊維中に包含されるタ
ンパク質であるアルファ−シヌクレインは、Ｈｉｓ付加され、電子信号伝達コロ
イドおよび磁気粒子に結合されることが可能である。これらの粒子は、溶液中ま
たはパーキンソン病患者のサンプルによるシヌクレインによって培養された後、
電子分析用の検出電極に磁気的に引き付けられる。 【００８３】 このような分析では、表面（または粒子状実体の表面）に結合するペプチドま
たはタンパク質が、興味のある相互作用が発生するように、表面から離れて（表
面から隔離されて）存在する場合に有用である。粒子または表面は、アッセイに
必要な結合プロセスを立体的に干渉できる。柔軟性のリンカーはタンパク質また
はペプチドおよびＨｉｓタグの間に挿入できる。あるいは、ＮＴＡ基が結合する
炭素鎖の長さは変更可能であり、多数のリンカー基をＮＴＡ基および炭素鎖ＨＳ
−（Ｒ）ｎ−（Ｘ）ｍ−ＮＴＡの間に挿入できる。ここでＳは硫黄、ＲはＣＨ２
などのＳＡＭに包含される任意の分子、Ｘはエチレングリコールなどのリンカー
単位、ＮＴＡはニトリロトリ酢酸である。電磁場または機械的撹拌によって溶液
にパルスを与えることは、包含プロセスの促進に用いられる。 以前述べたよう
に、本発明のアッセイは電子相互作用に限定されるものではない。ある実施態様
において、方法は検出表面を使用しない。むしろ該方法は、これに限定されるわ
けではないが、目視検査、密度走査、光伝送、吸収、色変化および／または光散
乱を含む各種手法によって検出可能な凝集を含む。 【００８４】 予備形成原繊維に包含可能なペプチドは、コロイド（たとえば金コロイド）ま
たは他の粒子（たとえば蛍光ビード）に結合される。これらのペプチド供給粒子
は遊離ペプチドとともに、原繊維（たとえば患者サンプル）を含む溶液と混合さ
れる。粒子（たとえばコロイド）が原繊維内に包含されるにつれ、原繊維が視覚
的に検出可能となる。 【００８５】 本発明は、本態様がアッセイとして形式化される詳細な方法に限定されるもの
ではないが、都合のよい手法は９６ウェルＥＬＩＳＡプレート形式である。反応
のために、以下の試薬をリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）中のＥＬＩＳＡプレートに添加し、以下の濃度を都合よく使用す
ることができる：５８．２μＭまたは１４μＭのＮ−末端（Ｈｉｓ）６タグを持
つ合成Ａβ（１−４０）ペプチド、金コロイドを与える３０μＬ ＮＴＡ／Ｎｉ ⁺⁺ （下記に示す調製）および０．６μＭ Ａβアミロイド原繊維「種」。次にＥ
ＬＩＳＡプレートを３７℃で撹拌せずに、望ましい時間だけ（たとえば３０分〜
２時間）培養する。１時間後に、５８．２μＭ（Ｈｉｓ）６−Ａβペプチドを含
むウェルで暗赤色の凝集体構造がはっきりと見られた。望ましい時間の後（たと
えば１〜４．５時間）、プレートを短時間撹拌してから、目視検査できる。凝集
体構造は、（Ｈｉｓ）６−ＡβペプチドおよびＡβ原繊維「種」の両方を含むす
べてのウェルではっきりと見られた。これらの凝集体、原繊維状の構造体は、よ
り低い速度であるが、最大５０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む溶液中でも形
成可能である。ＦＢＳ濃度を連続希釈して、一定濃度の原繊維種および（Ｈｉｓ
）６−Ａβペプチドを用いて培養すると、目視可能な原繊維形成速度はＦＢＳ濃
度の低下とともに上昇し、このことは、該アッセイがＡβ原繊維に固有のもので
あり、胎仔血清中に存在する原繊維種を認識しないことを示している。原繊維ま
たは（Ｈｉｓ）６−Ａβペプチドのどちらかを含むウェルは、目視可能な凝集体
を形成しない。負の対照として、無関係なＨｉｓ付加ペプチドをコロイドおよび
種原繊維を用いて培養できる。このような対照溶液は、目視可能な原繊維凝集体
を生成しない。 【００８６】 上述の方法を使用すると、１０ピコモルという低い濃度の原繊維種濃度は、コ
ロイドおよびＡβペプチドを含む溶液から目視識別可能であったが、種原繊維を
含んでいなかった。 【００８７】 本明細書で述べる比色手法は、アッセイプロセスを阻害しない。 １つの流体混合物を調製すると、移転または他の撹拌を用いずに、凝集体の生
成またはその欠如を判定するために観察できる。あるいは特定のアッセイに、撹
拌または別の形式のエネルギーを与えることができる。たとえば、ある例におい
ては、特定の系にエネルギーを導入することが凝集形成に影響を与えるかどうか
を判定することが望ましい。エネルギーは、かき混ぜ、振盪、振動、超音波処理
または他の機械的撹拌などの撹拌、赤外線、紫外線または可視光などの電磁気放
射への曝露、無線周波数エネルギー、マイクロ波放射またはスペクトルの任意の
部分での実質的に任意の電磁放射への曝露の形で導入できる。ある例において、
系のエネルギーへの曝露は、凝集の速度に影響を与え、このことは神経変性疾病
プロセスに対するエネルギーの潜在的な影響を示す。 【００８８】 本発明のこれらおよび他の態様の機能および利点は、以下の例によりさらに十
分に理解されるであろう。以下の例は本発明の恩恵を例示する目的であるが、本
発明の全範囲を例証するものではない。 【００８９】 【実施例】 以下の実施例は本発明のある好ましい態様を例示するものであり、その範囲を
制限するものと解釈されるべきではない。 【００９０】 以下に続く実験開示において、以下の省略形を適用する：ｅｑ（当量）；μ（
ミクロン）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度
）；Ｎ（ノルマル）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイ
クロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ
（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリット
ル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメート
ル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；ｎＭ（ナノモル濃度
）；℃（摂氏度）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；Ｕ（単位）；ｄ（日数）
。 【００９１】 実施例１：原繊維の分光光度法による検出 本実施例において、１４μＭ Ｈｉｓ−Ａβ（１−４０）ペプチドを含む１０
０μＬの分割量および３０μＬのＮＴＡ−チオールコロイドを、１μＭ Ａβ原
繊維種、５０ｐＭ Ａβ原繊維種または原繊維なしで培養した。混合物を３７℃
にて３０分間培養した後、キュベットに移し、日立Ｕ−２０００分光光度計に配
置した。各分割量について、５６９ｎｍでの吸収を記録してから、キュベットを
取り外し、ペプチドの原繊維内への包含を促進するために硬い表面に激しく叩き
つけ、１０分間放置した後、５６９ｎｍで再度走査した。 【００９２】 我々は原繊維種を含む溶液で、（原繊維が溶液より沈殿したため）５６９にお
ける吸収が急激に低下したのを観察したが、ペプチドのみを含む溶液における吸
収は安定したままであった（図３）。グラフの棒の高さは、２回目の測定値に対
する最初の測定値の比である。１）１μＭ Ａβ原繊維種（斜線棒）および原繊
維なし（塗りつぶし棒）および２）５０μＭ Ａβ原繊維種（斜線棒）および原
繊維なし（塗りつぶし棒）。 【００９３】 実施例２：コロイドの沈殿 本実施例において、１．５ｍｌの市販金コロイド（ＡｍｅｒｓｈａｍのＡｕｒ
ｏ Ｄｙｅ）を微量遠心管内に入れ、高で１０分間遠心分離してペレットにした
。ペレットを１００μＬの貯蔵緩衝液（クエン酸ナトリウムおよびｔｗｅｅｎ−
２０）中で再懸濁させた。４０μＭ ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）−チオール、
１００μＭ フェロセン−チオールおよび５００μＭ カルボキシ−末端チオー
ルを含む１００μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を加えた（フェロセ
ン信号実体は随意である）。チオール溶液で３時間培養した後、コロイドをペレ
ットにし、上澄は廃棄した。ペレットはその後、１００μＬの４００μＭ トリ
−エチレングリコール末端チオールＤＭＦ溶液中で５５℃にて２分間、３７℃に
て２分間、５５℃にて１分間、３７℃にて２分間、室温にて１０分間培養した。
次にコロイドをペレットにし、１００μＬの１００ｍＭ ＮａＣｌリン酸緩衝液
を加えた。さらにコロイドを１８０μＭ ＮｉＳＯ４のコロイド貯蔵緩衝液を用
いて、１：１に希釈した。 【００９４】 実施例３：ＳＡＭコード化電極の形成 以下に示す実施例の一部において、該実施例はＳＡＭ形成、コラーゲンコーテ
ィング、細胞増殖、コロイド形成およびを含む交流ボルタメトリー（ＡＣＶ）を
含む。ＳＡＭ形成の場合、ガラス製の顕微鏡スライドはＴｉ層、次いでＡｕ層に
よってスパッタリングされる。各電極は、１０％ メチル末端チオール（ＨＳ−
（ＣＨ２）１５ＣＨ３）、４０％ トリ−エチレングリコール末端チオール、Ｈ
Ｓ（ＣＨ２）１１（ＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ、（式）および５０％ ポリ（エチニ
ルフェニル）チオール（Ｃ１６Ｈ１０Ｓ）を含む３００μＬのＤＭＦ溶液によっ
て室温にて０．５時間培養した。次に２ｍｌの４００μＭ トリ−エチレングリ
コール末端チオールを、チップを含むシンチレーションバイアルに加え、該バイ
アルに対し、水浴中で次のような熱サイクルを行った：５５℃で２分間；３７℃
で２分間；５５℃で１分間；３７℃で２分間、次に室温で１０分間。次いで電極
をＥｔＯＨ中に漬け、さらに滅菌ＰＢＳですすいだ。 【００９５】 実施例４：非常に高感度の凝集体検出を示すアッセイ 我々は、色の変化および視覚的な原繊維形成を時間の関数として監視すること
によって、事前に形成された凝集体、神経変性疾病の特徴を高感度に検出するこ
とができる。 【００９６】 金コロイドは、実施例２に記載したようにヒスチジン付加タンパク質を捕捉す
るために、ニトリロトリ−酢酸／ニッケル自己凝集単層（ＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭ
ｓ）によって誘導体化される。コロイドは、最近隣のペプチドの凝集を抑制する
ために低密度のＮＴＡ−Ｎｉ（１０００：Ｍのチオール総濃度中の４０μＭ Ｎ
ＴＡ−チオール）によってコーティングし、通常のコロイド粒子に固定化した。
３０μＬの誘導体化コロイドの分割量を９６ウェルプレートに配置した。ヒスチ
ジン付加βアミロイドペプチド（アミノ酸１−４０）はｐＨ７．４のリン酸緩衝
液に溶解させ、次に、１００μＬの体積における最終濃度が１４μＭになるよう
にコロイド溶液に添加した。合成のヒスチジンが付加していないμ−アミロイド
ペプチドより作成された予備形成の原繊維は連続希釈し、原繊維の最終濃度が３
３０ｎＭ〜５０ｐＭの範囲になるように溶液に加えた。各アッセイ（各ウェル）
について、原繊維を加えない、負の対照アッセイを実施した（図４）。溶液は３
７℃で１時間培養し、溶液を攪拌しないように注意した。原繊維を含む溶液の色
は、金コロイドの特徴的なピンク色から濃い紫／灰色に変化した。ヒスチジン結
合μーアミロイド（１−４０）を含むが予備形成原繊維を含まない溶液は、原繊
維を加えた溶液も低い速度でより薄い紫色に変化した。ウェルの中心の、予備形
成原繊維を含む黒ずんだ塊は、肉眼ではっきりと見えた（図５）。解剖顕微鏡に
よって４０倍に拡大して観察すると、大きな紫色の網状組織が見られた。これら
の凝集体はプレートの底に沈殿しているのではなく、明らかに液体培地中に浮遊
していた。負の対照のウェルは粒状の沈殿物を示したが、大きな凝集体はなかっ
た。目視検査によって、予備形成原繊維を含むウェルと含まないウェルを、５０
ピコモルの添加原繊維濃度まで区別することができた（図６）。結果は、倒立顕
微鏡に取り付けたニコン製カメラ（ＡＳＡ８００フィルム）を用いて４０倍で撮
影した写真によって記録した。 【００９７】 実施例５：コロイドを用いた描出 ペプチドおよび原繊維の濃度が高くなると、大きなコロイド修飾原繊維構造が
見られる。４０μＭ ＮＴＡ−Ｎｉ ＳＡＭを含むコロイドは実施例２に記載し
たように調製した。コロイドの３０μＬの分割量を９６ウェルプレートに加えた
。１００μＬの最終体積中で２０μＭの最終濃度となるように、ヒスチジン付加
β−アミロイドペプチド（１−４０）を加えた。１００μＭの最終体積中で最終
濃度が２０μＭとなるように、予備形成β−アミロイド原繊維を加えた。 【００９８】 最終濃度が１μＭとなるように、予備形成β−アミロイド原繊維を加えた。サ
ンプルは３７℃で２０分間培養し、次に凝集を加速するために３回激しく叩きつ
けた。 【００９９】 ３７℃で１時間培養を続けた後、大きなコロイド−原繊維構造が肉眼ではっき
りと見られた（図７Ａ）。コロイドが原繊維の構造に集塊するにつれて、周囲の
溶液は透明になった（ピンク色なし）。負の対照では、コロイドに固着する結合
種の代わりに、無関係のタンパク質が固着した。結果を図７Ｂに示す。 【０１００】 実施例６：薬剤のスクリーニング 我々はヒスチジン付加β−アミロイド（１−４０）ペプチドが原繊維を形成す
る条件を決定した。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＲＢＩ薬剤ライブラリによる
薬剤候補を各アッセイ溶液に別々に加え、アルツハイマー病の特徴である原繊維
形成を阻害する薬剤候補を判定した。結果を描出する方法として、（以前述べた
）ＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭｓを含むコロイドを加えた。 【０１０１】 ９６ウェルプレートの各ウェルに、各薬剤の最終濃度が１００〜２００μＭと
なるように以下を加えた：３０μＬのＮＴＡ−ＳＡＭを含むコロイド、６５μＬ
の１０．７μＭ ヒスチジン付加βーアミロイド（１−４０）ペプチドの溶液（
最終濃度６．６μＭ）および５μＬの薬剤候補。溶液を含むプレートを３７℃で
数時間培養した。この時間内に、プレートを目視検査し、経過を定期的に記録す
るために写真を撮影した。 結果： 色の変化（ピンクから青）によって、原繊維形成を阻害する薬剤が予測された
。培養時間約２時間で、陽の対照を含む、すなわち薬剤を含まないウェルおよび
負の対照を含む、すなわち薬剤を添加したがヒスチジン付加ペプチドがβ−アミ
ロイドではなく、ＧＳＴであるウェルと、溶液の色を比較することによって、原
繊維形成を阻害した薬剤を含むウェルを肉眼ではっきりと見ることができた。 【０１０２】 ウェル内で原繊維に集塊したコロイドによっても、ウェル内に目で見える凝集
体がないことに注目すれば、原繊維形成を阻害する薬剤を含むウェルを識別でき
る。４０倍に拡大すると、異なるウェルでの薬剤の作用を区別する能力が向上し
た。 【０１０３】 図８は３７℃で７２時間培養した後の、小分子ライブラリ、ラック１の写真の
コピーである。プレートの最右端（第１２列）のウェルは、ピンクのままであっ
た負の対照ウェルであり、そこではＨｉｓ付加ＧＳＴがβ−アミロイドペプチド
の代わりとなっていた。 【０１０４】 左隣の列、列番号１１は、Ｈｉｓ付加β−アミロイドを含み、薬剤候補を含ま
ない陽の対照であった。ウェルＧ９は明るいピンクであったが、そのウェル内の
化合物が原繊維形成を阻害したことを示す。ウェルＡ４、Ｂ５、Ｃ５、Ｄ５、Ｆ
５、Ｆ９、Ｇ５およびＨ１０がすべて、ただちに目視確認可能な凝集体形成を示
していることに注意する。 【０１０５】 生理条件下で時間の関数として色および／または凝集体形成を監視することは
、薬剤の有効性および薬剤の安定性の指標である。 実施例７：溶液中で遊離したペプチドの増幅への使用 ＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭｓを示すコロイドは、実施例２に記載したように調製し
た；１０００μＭのチオール総濃度において４０μＭ ＮＴＡ−チオールを使用
した。ヒスチジン付加β−アミロイド（１−４０）ペプチドを加えて、１００μ
Ｌの最終体積において最終濃度が５８．２μＭとなるようにした。負の対照とし
て、無関係のヒスチジン付加ペプチド、ＧＳＴをβ−アミロイドペプチドの代わ
りにコロイド溶液に加えた。溶液は３７℃で培養した。１５分以内に大きな凝集
体が溶液内ではっきり見えるようになり、それにはヒスチジン付加β−アミロイ
ドペプチドが含まれていた。対照溶液中には構造物が見られなかった。β−アミ
ロイドペプチドを含む溶液は灰色／紫に変化したが、負の対照溶液はピンクのま
まであった。これらの結果は、溶液中の遊離β−アミロイドペプチドが凝集し、
凝集過程を増幅または加速するよう作用したという考えに矛盾しない。 【０１０６】 実施例８：電子的検出 β−アミロイド原繊維を電子的に検出する我々の戦略は最初に、ヒスチジン付
加β−アミロイドペプチド（１−４０）を、μ−アミロイド１−４２ペプチドか
ら作成した予備形成原繊維に含めることであった。電子信号伝達のために、ＮＴ
Ａおよびフェロセン誘導体を含むコロイドを、少なくとも一部のＨｉｓ付加βア
ミロイドペプチドがコロイド粒子に付加するように加えた。我々の目的は次に、
コロイド修飾原繊維に結合する結合リガンドを押しのけて進み、それらを作用電
極に磁気的に補充する磁気ビードを加えることであった。 【０１０７】 ＮＴＡ−ＳＡＭｓを持つコロイドは、実施例２に記載したように調製した（標
準のフェロセン−チオールの代わりに、１００μＭ オクタメチルフェロセン−
チオールを使用したことを除く）。３０μＬのコロイドを各アッセイ溶液に加え
た。ペプチド添加後に溶液をピペットで取らずに（このことは予備形成原繊維が
ない場合にペプチドの原繊維形成を促進する）、交流ボルタメトリー（ＡＣＶ）
分析を促進するために、アッセイ溶液を、実施例３に記載したように、静止マグ
ネット上で自己凝集単層によって誘導体化した金コートガラススライド上にクラ
ンプされた容量１ｍｌのシリコンガスケット中で混合した。 【０１０８】 ヒスチジン付加β−アミロイドペプチド（アミノ酸１−４０）を、１００μＬ
の体積において最終濃度が１４μＭとなるように添加した。β−アミロイドペプ
チド（１−４２）より成る予備形成原繊維は、最終濃度が１５μＭとなるように
加えた。負の対照溶液は以下のとおりであった：（１）コロイド、ヒスチジン付
加ＧＳＴと原繊維を含むが、Ｈｉｓ付加β−アミロイドペプチド（１−４０）を
含まない；（２）コロイド、Ｈｉｓ付加β−アミロイドペプチド（１−４０）を
含むが、原繊維を含まない；および（３）陽の結果を与えることが予想される成
分すべて、ただしＨｉｓ付加ペプチドが原繊維内に含まれる以前の、時間０にて
測定。溶液は３７℃にて２０分間培養した。タンパク質Ａによって誘導体化した
（抗体のＦｃ部分を結合する）市販の磁気ビード（Ｂａｎｇ ＬａｂｓおよびＰ
ｒｏｚｙｍｅによる）はその結合性能の１／１０まで、β−アミロイドペプチド
１−４２を認識するが、１−４０は認識しない抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎ
ｔ．より購入）に予備結合された。２０μＬの抗体表示磁気ビードを、ＡＣＶ分
析（１０Ｈｚ；２５ｍＶ過電位；Ｐｔ補助を備えたＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極；作
用電極として作用するＳＡＭコート金チップ）の直前に各溶液に注入した。 【０１０９】 結果： ヒスチジン付加β−アミロイドペプチド（１−４０）、ＮＴＡ−Ｎｉおよびフ
ェロセンを持つコロイド、さらに予備形成原繊維を含む溶液は、３７℃にて２０
分間培養すると、コロイド粒子に結合したフェロセン誘導体（オクタメチルフェ
ロセン）特徴的な酸化ポテンシャル（２２０ｍＶ）において２．０μＡの電流ピ
ークが生じた。図９の線Ａを参照。 ヒスチジン付加ペプチドが原繊維に含有さ
れる直前に測定した同一の溶液は、図９の線Ｂに示すように、２２０ｍＶにおい
て約０．１７μＡのわずかなピークを生成した。 【０１１０】 予備形成原繊維を除くすべての成分を含む、別の負の対照溶液は、０．０２２
μＡのわずかなピークを生成した（図９、線Ｃ）。 予備形成原繊維を含むが、ヒスチジン付加β−アミロイドペプチドの代わりに
ヒスチジン付加ＧＳＴタンパク質がコロイドに結合している第３の負の対照溶液
は、電流ピークを生成しなかった（図９、線Ｄ）。 【０１１１】 実施例９：光散乱分析 溶液中の粒子の平均直径を定量化する市販の光散乱装置を用いて、ＮＴＡ−Ｎ
ｉ−ＳＡＭコートコロイドおよびヒスチジン付加β−アミロイド（１−４０）ペ
プチドを含む溶液を、予備形成原繊維のある場合とない場合に分析した。 【０１１２】 コロイドは実施例２に記載したように調製し、１００μＬの最終体積において
最終濃度が１０．２μＭとなるようにヒスチジン付加β−アミロイドを加えた。
予備形成原繊維は、最終濃度が２μＭとなるように加えた。平均粒子直径の基線
測定値は、いずれの成分もβ−アミロイド原繊維がない場合に凝集しないように
するために、試薬についてのみ得た。 【０１１３】 基線測定値： １． ４０μＭ ＮＴＡ−ＳＡＭ誘導体化コロイドのみ；直径＝１４．８７ｎ
ｍ ２． ヒスチジン付加Ａβ１−４０ペプチドを示すコロイド；直径＝１４．９
６ｎｍ ３． １μＭβ−アミロイドペプチド（１−４２）予備形成原繊維と混合した
コロイド（表面固定化Ｈｉｓ付加Ａβ１−４０を除く）；直径＝１５．９３ｎｍ
；ｔ＝０ 実験： １． ヒスチジン付加Ａβ１−４０ペプチドを示すコロイド、１μＭ β−ア
ミロイドペプチド（１−４２）予備形成原繊維と混合、ｔ＝０で測定 １５．５
ｎｍ ２． ヒスチジン付加Ａβ１−４０ペプチドを示すコロイド、１μＭ β−ア
ミロイドペプチド（１−４２）予備形成原繊維と混合、高輝度ランプのもとで、
ｔ＝１．５時間で測定：直径＝１０，０００ｎｍ超、図１０を参照。 【０１１４】 負の対照： ３． ヒスチジン付加Ａβ１−４０ペプチドを示すコロイド；予備形成原繊維
の代わりに緩衝液を加えた；ｔ＝０で測定；直径＝１４．９６ｎｍ。 【０１１５】 ４． ヒスチジン付加Ａβ１−４０ペプチドを示すコロイド；予備形成原繊維
の代わりに緩衝液を加えた；ｔ＝１．５で測定；直径＝５７９．７ｎｍ、図１１
を参照。 【０１１６】 これらの結果は、試料における凝集体の量が、生じたマクロ構造体の直径を測
定することによって定量化できることを示している。同時に９６ウェルプレート
形式の溶液の平均粒子直径も測定する光散乱装置は、市販されている。現在まで
に、光散乱を使用してペプチドモノマーとβ−アミロイド凝集体を区別しようと
する試みは、両方の種の直径が非常に小さく、さらに低い検出限界では（β−ア
ミロイド原繊維がおよそ数百ナノメータである）、モノマーと凝集体の差も小さ
いために、成功する場合は限られていた。 【０１１７】 しかし発明者らは、リガンドを持つコロイドが、より小さく、検出しにくい原
繊維を相互に結合させ、それらを検出しやすいマクロ構造体にまとめるように作
用することを示している。 【０１１８】 実施例１０：特異性 誘導体化コロイドによって示されるβ−アミロイドペプチドが、通常の診断サ
ンプル中に存在する原繊維種に非特異的に含まれるかどうかを判定するために、
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で目視アッセイを実施した（ＦＢＳは、他の原繊維種
を含め、ＣＳＦの１００倍以上の無関係なタンパク質を含む）。ヒスチジン付加
Ａβ１−４０を示す４０μＭ ＮＴＡ−ＳＡＭコロイドの異なるＦＢＳ濃度の溶
液３０μｌに、１μＭ Ａβ １−４２原繊維を加えた。誘導体化コロイドの原
繊維への凝集はＦＢＳ濃度の上昇とともに増加せず、アッセイは他のタンパク質
や原繊維種によって生じるアーティファクトが起こりにくいことを示している。
コロイドに固定化されたＨｉｓ付加Ａβ１−４０を含むが、予備形成Ａβ原繊維
を含まない負の対照溶液は、ピンクのままであった；４０または１００倍拡大で
は構造体は見られなかった。 【０１１９】 実施例１１：ＣＳＦサンプルにおけるアルツハイマー病診断への可視原繊維構
の範囲の利用 ＣＳＦサンプルを使用した盲検（サンプルの片方、両方がアルツハイマー病患
者によるものか、あるい両方ともアルツハイマー病患者によるものでないことを
作業者に知らせていない）において、実施例２に記載したように調製した、４０
μＭ ＮＴＡ−ＳＡＭｓを含むコロイドの３０μＭの分割量を９６ウェルプレー
トのウェルに加えた。Ｈｉｓ付加Ａβ（１−４０）ペプチドは最終濃度が３．７
５μＭとなるように加えた。２人のアルツハイマー病患者によるＣＳＦの分割量
をコロイド／ペプチド溶液に加えた。加えたＣＳＦの量は、最終ＣＳＦ濃度が１
２．５％または２５％となるように変化させた。試験を行った各ＣＳＦサンプル
について、条件を次のように変化させた：（１）サンプル溶液は予備形成Ａβ原
繊維（１μＭ；１−４２）を用いてドープまたは「播種」した；（２）溶液は予
備形成Ａβ原繊維（０．１μＭ；１−４２）によって播種した；（３）溶液には
何も播種しなかった；（４）負の対照として、プローブＨｉｓ−Ａβをコロイド
に固定化しなかった。３７℃にて３時間後、患者＃１０１によるＣＳＦを含む原
繊維のマクロ構造が、負の対照を除くすべての試験溶液で見られた。原繊維構造
の範囲は、ＣＳＦ濃度の上昇とともに広がった。同様に、種濃度の上昇とともに
構造形成も増大した。他のＣＳＦ含有溶液はピンクから紫に変化したが、４０倍
拡大では減繊維構造の形成は見られなかった。対照溶液（コロイドへの固定化Ｈ
ｉｓ−Ａβなし）はピンクのままであり、構造形成の徴候は一切見られなかった
。 【０１２０】 一晩（合計１０時間）培養した後、患者＃１０９によるＣＳＦを含む原繊維も
溶液中ではっきり見えたが、それらは最初の患者によるものよる原繊維よりもま
だはるかに小規模なものであった。患者１と同様に、構造形成の範囲は、ＣＳＦ
濃度およびβ−アミロイド種濃度の上昇とともに拡大した。サンプル記録の検査
によって、ＣＳＦサンプルは両方ともアルツハイマー患者によるものであり、診
断してからの時間およびＢｌｅｓｓｅｄ Ｄｅｍｅｎｔｉａスケールのスコアに
基づいて、最初の患者（１０１）の疾病の進行は第２の患者の約２倍であること
が確認された。患者１０１のＢｌｅｓｓｅｄ Ｄｅｍｅｎｔｉａスケールのスコ
アは２１であったが、患者１０９のスコアは１２であった。患者１０１のβ−ア
ミロイド濃度は、８ｍｇｓ／ｍｌにて測定したが、＃１０９は４．６ｍｇｓ／ｍ
ｌであった。 【０１２１】 実施例１２：ＣＪＤ検出および診断 この仮説的な実施例では、少なくともＨｉｓ付加ペプチドの一部がコロイドに
結合するように、可溶形（未変換形）のＨｉｓ付加ＰｒＰタンパク質を含む溶液
にＮＴＡ−Ｎｉを示すコロイドを加える。伝染性ＰｒＰを含むと思われるサンプ
ルを加える。伝染性ＰｒＰは、コロイド上の、および溶液中で遊離している正常
なＰｒＰタンパク質を、それらが他のＰｒＰタンパク質を変換できるように変換
する（アルファらせんから、正常なＰｒＰとは異なり、プロテイナーゼＫ消化に
対して耐性である、ひだ付きベータシートへのラジカル立体配座変化を含む凝集
を引き起こす）。この種の信号増幅、すなわち変換増幅は、比色（ピンクから紫
）変化としてただちに検出可能な塊状の凝集と、肉眼または光散乱装置によって
検出可能である大規模なタンパク質凝集体の生成を引き起こす。添加した正常な
ＰｒＰの変換によって生じるこの信号増幅の場合、添加ＰｒＰ（Ｈｉｓ付加、ま
たはなし）はサンプル中に予測されるＰｒＰと同じ種に由来するか、ＰｒＰが伝
染性サンプルによって変換可能な種に由来しなければならないことに注意する。 あるいは、定量的で上述した信号増幅を含まないアッセイ、あるいは未知の種
起源のプリオン疾病を検出可能なアッセイが必要な場合がある。このような場合
、シリアンハムスターＰｒＰから切除した１１９−１４１（ＧＡＶＶＧＧＬＧ ＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲＰＭＭＨＦ）に相同性の配列などの、プリオンタンパク質
（ＰｒＰ）に由来するペプチドまたはタンパク質は、好ましくはＮ末端にヒスチ
ジン付加され、実施例２に記載したようなＮＴＡ−ＳＡＭｓを示すコロイドに添
加される。この配列は、変換または伝染性ＰｒＰの複数の部位に結合するため、
他の正常なＰｒＰタンパク質を「変換する」その能力を阻害することがわかって
いる。 【０１２２】 伝染性ＰｒＰが含まれると考えられるサンプルは、コロイドおよびペプチドに
添加される。 サンプルが伝染性ＰｒＰを含む場合、コロイド結合ペプチドの凝集が発生し、
上記と同様に検出できる。これらは、全長タンパク質に加えて、ｈｉｓ付加され
、このアッセイで使用できるハムスターＰｒＰに由来する配列である。 １０６−１２８（ＫＴＮＭＫＨＭＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹ） １０９−１４１（ＭＫＨＭＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲ
ＰＭＭＨＦ） １１３−１４１（ＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲＰＭＭＨ
Ｆ） １１９−１４１（ＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲＰＭＭＨＦ） １１７−１４１（ＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲＰＭＭＨＦ） １１５−１４１（ＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲＰＭＭＨＦ） １１３−１４１（ＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹＭＬＧＳＡＭＳＲＰＭＭＨ
Ｆ） Ｃｈａｒｂｙ Ｊ， Ｃａｕｇｈｅｙ Ｂ， Ｃｈｅｓｅｂｒｏ Ｂ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８ Ｍａｙ ２２； ２７３（２１）： １３２０３−７； Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ９０−１４５ ｏｆ Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ＰｒＰ（シリアンハムスターＰｒＰの残基９０−１４５）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９７） ２７０， ５７４−５８６ 実施例１３：電子的検出 この仮説的な実施例では、サンプル中のプリオン疾病の存在も電子的に検出で
きる。少なくともＨｉｓ付加ペプチドの一部がコロイドに結合するように、可溶
形（未変換形）のＨｉｓ付加ＰｒＰタンパク質を含む溶液にＮＴＡ−Ｎｉを示す
コロイドおよびオクタメチルフェロセンを加える。ＰｒＰまたはそれに対する抗
体のいずれかを与える磁気粒子もアッセイに加える。伝染性ＰｒＰが含まれると
思われるサンプルを加える。コロイド上の、および溶液中に遊離している伝染性
ＰｒＰは正常なＰｒＰを変換し、この正常なＰｒＰを他のタンパク質の変換に関
与させ、その結果として塊状凝集が起こる。磁気粒子およびコロイド粒子の両者
が同一の凝集体に含まれる塊状凝集が生じ、これらの凝集体はＳＡＭコート可能
な電極に磁気的に引き付けられ、ＡＣＶによって分析される。 【０１２３】 実施例１４：ＥＬＩＳＡ 分子または細胞生物学の当業者に周知の技術を使用する。酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコル）， Ｖｏ
ｌｕｍｅ ２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１．２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．による著作権、１９９４−１９９８）。通常、ＥＬＩ
ＳＡを実施する場合は、第１の種を直接または間接的にプラスチック基質に結合
させる。 【０１２４】 第２の種を加え、プレートを洗浄し、信号伝達機能も備えている「第２の」抗
体を結合させて第２の種を検出する；第２の抗体は、通常はセイヨウワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素、また
は加えられた基質上で色の変化を生じる（分光光度計によって検出）反応を起こ
す能力のある蛍光標識、またはフルオリメータによって検出可能な蛍光標識タグ
に結合される（たとえば「生体内での感染神経線維および感覚神経に対する単純
疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄの、受動的に伝達されたヒト組換えモノクローナル
抗体の局在化」Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｓｓｉｖｅｌｙ ｔ
ｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｎｅｒｖｅ ｆｉ
ｂｅｒｓ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ， Ｓａ
ｎｎａ ＰＰ， Ｄｅｅｒｉｎｃｋ ＴＪ， ａｎｄ Ｅｌｌｉｓｍａｎ ＭＨ
， １９９９， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｏｃｔ． Ｖｏｌ
７３（１０８８１７−２３）を参照）。便宜上、各抗体を酵素に結合させずに
すむように、マウス抗体を特異性認識抗体として使用し、次に酵素結合ウサギ抗
マウス抗体を添加することが最も多い。 【０１２５】 本明細書に記載した技術を使用して、ＥＬＩＳＡの感度を大幅に上昇させて、
天然リガンド（タンパク質またはペプチド）または薬剤候補をプローブ分子とし
て使用して固定標的種の存在を検出することができる。固定種の存在は、複数の
セイヨウワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰＯ）またはアルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）も与えるコロイドに結合されたリガンドにその固定種を結合することによっ
て検出される。酵素は、酵素に直接結合したヒスチジンタグを含む各種方法によ
って、あるいはヒスチジン付加タンパク質Ｇによってコロイドに結合したヤギ抗
体にマウス抗ヤギ酵素結合抗体を結合させて、都合よく該コロイドに結合するこ
とができる（Ａｋｅｒｓｔｏｍ， Ｂ．， Ｎｉｅｌｓｏｎ， Ｅ．， Ｂｊｏ
ｒｃｋ， Ｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ， １９８７ Ｏｃｔ． ５ Ｖｏｌ ２６２（２８）； ｐｇｓ． １
３３８８−９１およびＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ， Ｓ． Ｒ．， Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒ， Ｐ．， Ｎａｇｌｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｆｉｌｐｕｌａ， Ｄ．（１９
８６） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １６７
， ８７０−８８０）。コロイド上に複数の酵素とともに固定化されたリガンド
を第２の抗体の代わりに標的種に結合させることによって、結合事象に対する信
号伝達分子の比は、著しく上昇する。コロイド上の１個の抗体またはリガンドを
、ＥＬＩＳＡプレート上に与えられた抗原に結合させると、間接的に数千また数
百万の］酵素の結合につながる。あるいは、信号伝達酵素とともにそれぞれ別個
の薬剤候補を与えるコロイドによって調査できるようにするために、既知の種を
故意に９６ウェルプレートのプレートに結合させることができる。現在、各薬剤
候補が酵素に結合できない既存のＥＬＩＳＡ技術では、このことを実施できない
。あるいは固定標的の天然リガンドを、相互作用を阻害するために各プレート上
に加えた信号伝達酵素および薬剤候補とともにコロイド上に与えることができる
。 【０１２６】 未結合コロイド、そしてその信号は洗浄ステップで消失する。抗体またはリガ
ンド供与コロイドの標的は、ＥＬＩＳＡプレートに直接または間接的に（別の抗
体またはリガンド経由で）結合した細胞でもタンパク質でもよい。ＥＬＩＳＡの
このような改良の利点は、感受性だけでなく、有効性でもある。数百の信号伝達
酵素がコロイド経由で１個の抗原に結合されたままになっているため、基質の加
水分解がさらに迅速に起こり、十分な読取りに必要な時間がさらに短くなる。 【０１２７】 この仮説的な実施例では、ＥＬＩＳＡプレート上での、サンプル中の凝集体形
成または原繊維形成、プロト原繊維、凝集体種の存在の検出方法、神経変性疾病
を阻害する薬剤のスクリーニングについて述べる。神経変性疾病凝集体または原
繊維形成種を結合する結合種、あるいは原繊維または凝集体形成種、プロト原繊
維、凝集体に対する抗体（特にＡβ１−４２に対する抗体）は、ＥＬＩＳＡプレ
ートのウェル内に固定化される。診断アッセイでは、抗体は次に、凝集体形成ま
たは原繊維形成種を含むと思われるサンプルに曝露され、該サンプルは金属結合
タグ（ヒスチジンタグ）を持つ結合種、随意に上述した増幅因子種、それぞれ粒
子に固定された金属（ＮＴＡ）および非電子信号伝達エンティティを配位するキ
レートを持つコロイド粒子と混合される。非電子信号伝達エンティティは、蛍光
タグ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどである。 このアッセイを用いて薬剤をスクリーニングしたい場合は、神経変性疾病を阻
害する候補薬剤の存在下で、同様の手順を実施する。 【０１２８】 実施例１５：疾病の生化学的進行の各種段階において神経変性疾病を阻害する
めの候補薬剤の細胞ベーススクリーニングアッセイ この仮説的な実施例では、酵素β−分泌酵素およびγ−分泌酵素などの、神経
変性疾病での凝集体形成または原繊維形成種の生成に関与する細胞プロセスに対
する活性について候補薬剤を試験する方法について述べる（Ｗｏｌｆｅ， ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９９ Ａｐｒｉｌ ８； ３９８（６７２７
）；５１３−７； Ｈａａｓｓ， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． Ｄｅｃｅｍｂｅｒ， １９９９； １（１２）；１２９１−６）。 【０１２９】 ＥＬＩＳＡプレートのウェルには、原繊維形成または凝集体形成種、特にＡβ
−原繊維形成種を分泌する細胞を配置する。細胞はＡβの過発現プラスミドを用
いて形質移入する（ＬａＢｌａｎｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
Ｒｅｓ．， Ａｐｒｉｌ， １９９２， ３１（４）：６３５−４５）。 【０１３０】 細胞がＡβ原繊維形成種を過発現するために十分な時間が経過した後、薬剤ス
クリーニングのための上述したアッセイの１つの成分をウェル内に導入する。た
とえば、コロイドおよびコロイドに固定されたまたは固定するよう改変された結
合種、随意に増幅因子種をウェル内に導入する。薬剤がＡβ原繊維形成種を阻害
する能力（該薬剤は過発現開始前に導入されている）は、分泌された基質の凝集
可能性を示す、ウェル内でのコロイドの相対的凝集を観察することによって監視
される。 【０１３１】 本実施例は、神経変性疾病を阻害する候補薬剤を、神経変性疾病原繊維または
凝集体形成種を分泌するよう改変された細胞に曝露することと、細胞から分泌さ
れた物質の凝集可能性に対する候補薬剤の効果を決定することを含む、本発明の
また別の態様を示す。 【０１３２】 当業熟練者は、本明細書に挙げたすべてのパラメータが例示のためであり、実
際のパラメータは本発明の方法および装置が使用される具体的な応用例によって
変化することをただちに認識するであろう。したがって、上述の実施態様は例示
目的のみで与えられており、添付請求項およびその相当物の範囲内で、本発明は
明細記述した通り以外にも実施できるものであることを理解されたい。 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１は、デンドリマーまたはポリマーを介してフェロセンなどの金属含有化合
物に付着する原繊維およびプラーク形成に関与する能力を持つペプチドを示した
ものである。これらの誘導されたペプチドは、ニューロペプチドの凝集および原
繊維への同時の組み込みを通じて、類似のペプチド型を示す磁気粒子と結合する
。磁石を介したＳＡＭ被膜電極に対する漸増の後、凝集の存在は、組み込まれた
電気活性を有するフェロセンなどの信号部分の存在を、サイクリックボルタンメ
トリー（ＣＶ）や交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）などの技術を用いて検出する
ことによって測定される。 【図２】 図２は、原繊維形成と、コロイド粒子に付着したフェロセン誘導体などの金属
錯体に関与する能力を持つペプチドを示したものである。これらのペプチドは、
両方がこれらのプリオン型の（および、原繊維形成性の）異常な型の凝集に組み
込まれた場合、類似のぺプチドを持つ磁気粒子に結合する。磁石を介したＳＡＭ
被膜電極に対する漸増の後、凝集の存在は電気的に検出される。 【図３】 図３は、分光測光法的手法を用いた原繊維形成の検出を示す棒グラフである。 【図４】 図４は、発明のアッセイを通じてネガティブコントロールの写真を複写したも
のである。 【図５】 図５は、発明のアッセイを通じて形成された、裸眼で容易に識別可能な凝集の
写真の複写である。 【図６】 図６は６発明のアッセイを通じて５０ピコモルのＡβ原繊維から形成された、
顕微鏡下で観察することのできる小型凝集の写真の複写である（図４−６はすべ
て４０倍に拡大してある）。 【図７】 図７Ａは、発明の別のアッセイに関係して形成された、裸眼で容易に識別可能
な大型のコロイド凝集を４０倍に拡大した写真の複写である。 図７Ｂは、図７
Ａのアッセイのネガティブコントロールの写真の複写である。 【図８】 図８は、発明の薬品選別アッセイの結果を示すＥＬＩＳＡプレートの写真の複
写である。 【図９】 図９は、発明の別のアッセイによる原繊維の電子修飾を示す４つのＡＣＶから
なるオーバーレイである。 【図１０】 図１０は、発明の光散乱原繊維アッセイの結果を示す。 【図１１】 図１１は、図１０の光散乱実験のネガティブコントロールである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/68 33/68 (31)優先権主張番号 ６０／１５５，９３７ (32)優先日 平成11年９月24日(1999．9．24) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 CA25 DA36 DA77 FA05 FA11 FB07 GC11 GC12 JA01 JA07 4H045 AA10 AA20 AA30 BA63 CA40 EA50 FA82

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 表面を持つ第１のアーティクルと； 表面を持つ第２のアーティクルと； 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種より成
   るキットであり、 前記結合種の少なくとも一部が第１のアーティクルの表面に固定されている、
   または固定されるように改変され、前記結合種の少なくとも一部が第２のアーテ
   ィクルの表面に固定されている、または固定されるように改変されているキット
   。 【請求項２】 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な結合種と； 結合種に対して固定化された電子信号伝達エンティティより成る組成物。 【請求項３】 アーティクルであって： 前記アーティクルの表面と； 前記表面に固定された神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能
   な結合種と； 表面に固定された信号伝達エンティティより成るアーティクル。 【請求項４】 ＳＰＲアーティクルではない、表面を持つアーティクルと； 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種より成
   るキットであり、前記結合種の少なくとも一部が前記表面に固定されている、ま
   たは固定されるように改変されているキット。 【請求項５】 表面を持つアーティクルと； 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種より成
   るキットであり、前記結合種の少なくとも一部が前記表面に固定されている、ま
   たは固定されるように改変されており、前記表面が凝集体形成または原繊維形成
   種の非特異性結合を実質的に阻害する化学機能性を備えているキット。 【請求項６】 神経変性疾病原繊維または凝集体と、前記原繊維または凝集体に対して固定化
   された少なくとも２個の粒子より成る系。 【請求項７】 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に対してそれぞれ固定化された少
   なくとも２個の粒子より成る系。 【請求項８】 金属を配位できる部分に固定された神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成
   種を結合可能な結合種より成る組成物。 【請求項９】 第１の表面および前記表面に固定されている、または固定されるように改変さ
   れた神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種を備
   えたアーティクルを供給することと； 前記第１の表面を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含むと考えら
   れるサンプルに曝露することより成る方法。 【請求項１０】 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含むサンプル中で神経変性疾病
   凝集体または原繊維を形成することと； 前記凝集体または原繊維を、表面および凝集体、原繊維、凝集体形成種または
   原繊維形成種を結合可能な複数の結合種を備えたアーティクルに曝露することよ
   り成る方法であって、 前記結合種が前記アーティクルの表面に固定されている、または固定されるよ
   うに改変された方法。 【請求項１１】 第１のアーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変さ
   れた、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種ではないが、神経変性疾病凝集
   形成または原繊維形成種を結合可能な結合種を供給することと； 前記結合種を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に変換することより
   成る方法。 【請求項１２】 神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種ではないが、神経変性疾病凝集形成
   または原繊維形成種を結合可能な結合種を供給することと； 前記結合種を神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種と相互作用させること
   によって、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種に変換し、神経変性疾病凝
   集形成または原繊維形成種の存在時の凝集特性に関与させることと、 神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種の存在時の凝集特性を検出すること
   より成る方法。 【請求項１３】 神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種を結合可能で、アーティクルの表面
   に固定されている、または固定されるように改変された結合種を供給することと
   ； 随意に前記結合種を前記アーティクルの表面に固定させることと； 前記結合種を神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種に変換せずに、神経変
   性疾病凝集形成または原繊維形成種に結合させることと、 第２のアーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変さ
   れた第２の結合種を、前記凝集形成または原繊維形成種に結合させることより成
   る方法。 【請求項１４】 結合種がペプチドである、上述の請求項のいずれかに記載のキット、方法、組
   成物、系またはアーティクル。 【請求項１５】 結合種がタンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載のキット、方法、
   組成物、系またはアーティクル。 【請求項１６】 結合種がタンパク質からの配列である、請求項１〜５のいずれかに記載のキッ
   ト、方法、組成物、系またはアーティクル。 【請求項１７】 結合種が小規模の分子である、請求項１〜５のいずれかに記載のキット、方法
   、組成物、系またはアーティクル。 【請求項１８】 小規模の分子がコンゴレッドまたはチオフラビンＴである、請求項１７に記載
   のキット。 【請求項１９】 結合種が凝集形成または原繊維種に対する抗体である、請求項１〜５のいずれ
   かに記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。 【請求項２０】 結合種が神経変性原繊維または凝集体を結合可能である、請求項１に記載のキ
   ット、方法、組成物、系またはアーティクル。 【請求項２１】 結合種が複数の神経変性疾病原繊維または凝集体に結合した複数のアーティク
   ルを含むマクロ構造を形成可能である、請求項２０に記載のキット。 【請求項２２】 結合種が神経変性疾病に特徴的な凝集を持つタンパク質である、上述の請求項
   のいずれかに記載のキット、組成物、アーティクル、系または方法。 【請求項２３】 結合種がベータアミロイドタンパク質、アミロイドタンパク質、Ｔａｕ、シン
   ヌクレイン、ＰｒＰ ＣＪＤ、ＰｒＰ ＢＳＥ、ＰｒＰ Ｓｃｒａｐｉｃ、およ
   びそのフラグメントならびに融合物である、上述の請求項のいずれかに記載のキ
   ット、組成物、アーティクル、系または方法。 【請求項２４】 タンパク質、フラグメントまたは融合物が凝集体結合、凝集体形成耐性である
   、上述の請求項のいずれかに記載のキット、組成物、アーティクル、系または方
   法。 【請求項２５】 アーティクルが流体中に浮遊可能で、単離可能な粒子である、請求項１−５に
   記載のキット。 【請求項２６】 アーティクルがコロイド粒子である、請求項２５に記載のキット。 【請求項２６．１】 アーティクルが金コロイド粒子である、請求項２５に記載のキット。 【請求項２７】 アーティクルがＳＰＲチップである、請求項１−５に記載のキット。 【請求項２８】 少なくとも一部の結合種に固定されている、または固定されるように改変され
   た粒子をさらに含む、請求項２２に記載のキット。 【請求項２９】 少なくとも一部の結合種に固定されている、または固定されるように改変され
   た粒子をさらに含む、請求項１−５に記載のキット。 【請求項３０】 アーティクルが粒子であり、キットがさらに少なくとも一部の結合種に固定さ
   れている、または固定されるように改変された追加の粒子をさらに含む、請求項
   １−５に記載のキット。 【請求項３１】 表面に固定されている、または固定されるように改変された結合種が金属結合
   タグ／金属／キレート結合によって表面に固定可能である、請求項１−５に記載
   のキット。 【請求項３２】 表面が、表面に対して固定化された金属を配位しているキレートを持ち、結合
   種がポリアミノ酸タグによって誘導体化される、請求項３１に記載のキット。 【請求項３３】 表面が、表面に対して固定化された金属を配位しているキレートを持ち、結合
   種がヒスチジンタグによって誘導体化される、請求項３１に記載のキット。 【請求項３４】 表面に固定されている、または固定されるように改変された結合種が相補核酸
   配列対によって表面に固定可能である、請求項１−５に記載のキット。 【請求項３５】 結合種が末端システインを持ち、それにより表面に固定されている、請求項１
   −５に記載のキット。 【請求項３６】 少なくとも一部の結合種に固定された複数の粒子より成るキットであり、表面
   以外に固定化された補助凝集体形成または原繊維形成種がない場合に、補助凝集
   体または原繊維形成種が存在しない場合の凝集を補助凝集体または原繊維形成種
   が存在する場合の凝集と比較可能な時間内に、粒子上または粒子曝露時の粒子凝
   集が十分に阻害される低い表面濃度において、結合種が粒子の表面に対して固定
   化されている、請求項３０に記載のキット。 【請求項３７】 さらに神経変性疾病を阻害する候補薬剤より成る、請求項３０に記載のキット
   。 【請求項３８】 表面に自己集合単層を持つ、請求項３−５に記載のキット。 【請求項３９】 自己集合単層がコロイド／コロイド自己凝集を阻害する種より成る、請求項３
   ８に記載のキット。 【請求項４０】 自己集合単層が荷電部分を含む、請求項３９に記載のキット。 【請求項４１】 自己集合単層がカルボキシ末端種を含む、請求項３９に記載のキット。 【請求項４２】 荷電部分がニトリロトリ酢酸、２，２−ビス（サリチリデンアミノ）−６，６
   −デメチルジフェニル、または１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６−ジチア
   オクタンを含む、請求項４０に記載のキット。 【請求項４３】 荷電部分がニトリロトリ酢酸より成る、請求項４２に記載のキット。 【請求項４４】 自己集合単層がオリゴヌクレオチドより成る、請求項３８に記載のキット。 【請求項４５】 自己集合単層がＤＮＡ部分より成る、請求項４４に記載のキット。 【請求項４６】 自己集合単層が荷電ペプチドを含む、請求項３８に記載のキット。 【請求項４７】 自己集合単層が界面活性剤を含む溶液より表面上に付着した、請求項３８に記
   載のキット。 【請求項４８】 自己集合単層がカルボン酸塩を含む溶液より表面上に付着した、請求項３８に
   記載のキット。 【請求項４９】 自己集合単層がコロイド粒子自体の形成中以外に表面に付着した、請求項３８
   に記載のキット。 【請求項５０】 自己集合単層が流体中に浮遊状態に保たれた表面に付着し、粒子が流体−流体
   界面に存在しない、請求項３８に記載のキット。 【請求項５１】 自己集合単層がさらに結合種より成る混合自己集合単層である、請求項３８に
   記載のキット。 【請求項５２】 結合種が末端システインを持つペプチドであり、表面が金である、請求項１お
   よび３−５に記載のキット。 【請求項５３】 結合種が神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種ではない、上述のいずれ
   かの請求項に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。 【請求項５４】 結合種が他の結合種を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に変換する
   ことができない、請求項５３に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティ
   クル。 【請求項５５】 結合種が神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種によって凝集体形成また
   は原繊維形成種に変換される、上述のいずれかの請求項に記載のキット、方法、
   組成物、系またはアーティクル。 【請求項５６】 凝集体形成または原繊維形成種に変換された結合種が、他の結合種を凝集体形
   成または原繊維形成種に変換可能である、請求項５５に記載のキット、方法、組
   成物、系またはアーティクル。 【請求項５７】 金属を配位可能な部分がポリアミノ酸タグより成る、請求項８に記載の組成物
   。 【請求項５８】 金属を配位可能な部分がヒスチジンタグより成る、請求項８に記載の組成物。 【請求項５９】 結合種が金属を配位可能な部分にＮ−末端で固定されたペプチドである、請求
   項２０に記載の組成物。 【請求項６０】 さらにアーティクルの表面に対して固定化された金属を配位可能な部分より成
   る、請求項２６に記載のキット。 【請求項６２】 結合種が少なくとも１個のキレート、カルボン酸塩基、ｎ−ヒドロキシ−スク
   シンイミド、核酸配列、グルタチオニン、ビオチン、ストレプトアビジン、また
   はそのフラグメントによって表面に固定されている、または固定されるように改
   変された、請求項１−５に記載のキット。 【請求項６３】 流体中に浮遊可能で、単離可能な粒子の断面がいずれの方向でも２５０ｎｍを
   超えない、請求項２５に記載のアーティクル。 【請求項６４】 流体中に浮遊可能で、単離可能な粒子の断面がいずれの方向でも１００ｎｍを
   超えない、請求項２５に記載のアーティクル。 【請求項６５】 コロイド粒子および金属を配位可能な部分より成る該粒子の表面上の自己集合
   単層より成る、請求項６０に記載のアーティクル。 【請求項６６】 自己集合単層がキレートを含む、請求項６５に記載のアーティクル。 【請求項６７】 自己集合単層がニトリロトリ酢酸、２，２−ビス（サリチリデンアミノ）−６
   ，６−デメチルジフェニル、または１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６−ジ
   チアオクタンを含む、請求項６６に記載のアーティクル。 【請求項６８】 自己集合単層が、自己集合単層形成種を含む混合自己集合単層であり、すべて
   でなく一部の自己集合単層形成種が金属を配位可能な部分を含む、請求項６５に
   記載のアーティクル。 【請求項６８．１】 さらに信号伝達エンティティより成る、請求項６０に記載のアーティクル。 【請求項６９】 複数の信号伝達エンティティより成る、請求項６８に記載のアーティクル。 【請求項７０】 コロイド粒子に固定された複数の信号伝達エンティティより成る、請求項６８
   に記載のアーティクル。 【請求項７１】 少なくとも２個の粒子がそれぞれ神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種
   を結合する結合種に固定されている、請求項７に記載の系。 【請求項７２】 少なくとも２個の粒子がそれぞれ、粒子に固定され、原繊維または凝集体を結
   合する結合種によって原繊維または凝集体に対して固定化されている、請求項６
   に記載の系。 【請求項７３】 少なくとも２個の粒子に対して固定化されている原繊維または凝集体より成り
   、少なくとも１個の粒子が第２の原繊維または凝集体に対して固定化されている
   、請求項７２に記載の系。 【請求項７４】 粒子および原繊維または凝集体がヒトの肉眼で見える構造体を形成する、請求
   項７３に記載の系。 【請求項７５】 凝集体または原繊維を結合種に固定可能な複数のコロイドに曝露することと、
   それによってコロイドを原繊維または凝集体に結合することをより成る、請求項
   １０に記載の方法。 【請求項７６】 コロイドの添加によって原繊維または凝集体を目視検出可能にすることより成
   る、請求項７５に記載の方法。 【請求項７７】 表面が粒子の表面であって、 前記表面に固定化された結合種を持つ複数の粒子を供給することと； 前記粒
   子をサンプルに曝露することより成る、請求項９に記載の方法。 【請求項７８】 さらに、サンプル中に存在する神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を
   示す、粒子の凝集範囲を決定することより成る、請求項７７に記載の方法。 【請求項７９】 表面が粒子の表面であって、 粒子の表面に固定されている、または固定されるように改変された複数の粒子
   および結合種を供給することと； 前記粒子および結合種をサンプルに曝露することより成る、請求項９に記載の
   方法。 【請求項８０】 結合種およびサンプルが多様な生物種より由来する、請求項７８に記載の方法
   。 【請求項８０．１】 相互作用する種およびサンプルが多様な生物種より由来する同一のタンパク質
   またはタンパク質フラグメントである、請求項８０に記載の方法。 【請求項８１】 さらに、粒子の凝集範囲を決定することより成る、請求項７８に記載の方法。 【請求項８２】 サンプルが神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含み、曝露ステップ
   が神経変性疾病原繊維または凝集体形成を阻害すると考えられる候補薬剤の存在
   下で粒子および結合種をサンプルに曝露することを含む、請求項８１に記載の方
   法。 【請求項８３】 サンプルが細胞から分泌される、請求項８２に記載の方法。 【請求項８４】 さらに、粒子の凝集範囲を決定することより成る、請求項８３に記載の方法。 【請求項８５】 最初にサンプルを分泌する細胞を、神経変性疾病を阻害すると考えられる候補
   薬剤に曝露させることと、次に粒子および結合種を前記サンプルに曝露させるこ
   とより成る、請求項８４に記載の方法。 【請求項８６】 薬剤が、神経変性疾病に関連する活性を備えた酵素を阻害すると考えられる、
   請求項８５に記載の方法。 【請求項８７】 候補薬剤がβ−分泌酵素を阻害すると考えられる、請求項８６に記載の方法。 【請求項８８】 候補薬剤がγ−分泌酵素を阻害すると考えられる、請求項８６に記載の方法。 【請求項８９】 曝露ステップが、１−３８〜１−４４のアミノ酸配列を含むβ−アミロイドの
   存在下で粒子をサンプルに曝露することを含む、請求項８２に記載の方法。 【請求項９０】 β−アミロイドペプチドが１−４０のアミノ酸配列を含む、請求項８９に記載
   の方法。 【請求項９１】 曝露ステップが、神経変性疾病に関連すると考えられるサンプルから得た生物
   試料に粒子を曝露させることより成る、請求項７８に記載の方法。 【請求項１００】 試料を粒子および結合種に曝露することより成る、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０１】 サンプルが血液サンプルより成る、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０２】 サンプルをヒト患者より採取する、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０３】 サンプルを動物より採取する、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０４】 サンプルを家畜より採取する、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０５】 サンプルを家畜飼料より採取する、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０６】 サンプルを臓器提供サンプルより採取する、請求項９１に記載の方法。 【請求項１０７】 さらに、粒子をサンプルに曝露したときに、目視可能なサンプルの変化を観察
   することより成る、請求項７８に記載の方法。 【請求項１０８】 目視可能な変化が粒子の凝集より成る、請求項１０７に記載の方法。 【請求項１０９】 目視可能な変化が金コロイド粒子の凝集より成る、請求項１０８に記載の方法
   。 【請求項１１０】 目視可能な変化が色の変化より成る、請求項１０７に記載の方法。 【請求項１１１】 さらに、サンプルに粒子を曝露させるときに、光散乱装置を使用して有効粒子
   ／凝集サイズの変化を測定することより成る、請求項７８に記載の方法。 【請求項１１２】 サンプルの画像をデジタル化することと、次にパターン認識を使用してどのサ
   ンプルが凝集体を含んでいるかを判定することより成る、請求項７８に記載の方
   法。 【請求項１１３】 表面以外に固定化された補助凝集体形成または原繊維形成種がない場合に、補
   助凝集体または原繊維形成種が存在しない場合の凝集を補助凝集体または原繊維
   形成種が存在する場合の凝集と比較可能な時間内に、粒子上または粒子曝露時の
   粒子凝集が十分に阻害される表面濃度において、結合種が粒子の表面に対して固
   定化されている、請求項９１に記載の方法。 【請求項１１４】 さらに、結合種とサンプル中に存在するすべての凝集体形成または原繊維形成
   種との相互作用を判定することより成る、請求項９に記載の方法。 【請求項１１５】 結合種およびサンプルが多様な生物種である、請求項９に記載の方法。 【請求項１１６】 凝集体形成または原繊維形成種に結合する粒子に対して固定化された結合種の
   存在下で、サンプルに表面を曝露することより成る、請求項９に記載の方法。 【請求項１１７】 粒子が補助信号伝達エンティティを備えている、請求項１１６に記載の方法。 【請求項１１８】 補助信号伝達エンティティが、ワサビダイコンペルオキシダーゼおよびアルカ
   リホスファターゼを含む、染料、色素、電子活性粒子、蛍光部分、アップレギュ
   レーションリン光体、酵素固定信号伝達部分より成る、請求項１１７に記載の方
   法。 【請求項１１９】 表面が電極表面であり、粒子が前記表面に固定化された電子活性種を備えてい
   る、請求項１１６に記載の方法。 【請求項１２０】 粒子が複数の固定化された電子活性種を備えている、請求項１１９に記載の方
   法。 【請求項１２１】 複数の電子活性種がメタロセンより成る、請求項１２０に記載の方法。 【請求項１２２】 複数の電子活性種がフェロセンより成る、請求項１２０に記載の方法。 【請求項１２３】 アーティクルが磁気ビードである、請求項９に記載の方法。 【請求項１２４】 アーティクルがＳＰＲチップである、請求項９に記載の方法。 【請求項１２５】 アーティクルが電極である、請求項９に記載の方法。 【請求項１２６】 アーティクルがＥＬＩＳＡプレートである、請求項９に記載の方法。 【請求項１２７】 表面が複数の個別および空間的に位置指定可能な領域より成る、請求項９に記
   載の方法。 【請求項１２８】 個別および空間的に位置指定可能な領域が多ウェルプレートの別個のウェルよ
   り成る、請求項１２８に記載の方法。 【請求項１３１】 神経変性疾病を阻害する候補薬剤の存在下で、表面にサンプルを曝露すること
   より成る、請求項１３２に記載の方法。 【請求項１３２】 さらに、候補薬剤の存在による、凝集体形成または原繊維形成種と表面固定化
   結合種との相互作用の低下を観察することを含む、請求項１３３に記載の方法。 【請求項１３５】 サンプルが凝集体形成または原繊維形成種を含んでいても、含んでいなくても
   よい、請求項９に記載の方法。 【請求項１３６】 サンプルが凝集体形成または原繊維形成種を含む薬剤スクリーニング調製物で
   ある、請求項１４５に記載の方法。 【請求項１３７】 表面が粒子表面であり、 結合種、結合種に固定された粒子および固定種に固定可能な磁気ビードより成
   る、流体溶媒中に浮遊した組成物を作成することと； 前記組成物をサンプルに曝露することより成る、請求項９に記載の方法。 【請求項１３８】 粒子および／または磁気ビードが固定化キレートを備え、少なくとも一部の結
   合種がキレートによって配位される金属に固定可能な金属結合タグを備えている
   、請求項１３５に記載の方法。 【請求項１３９】 各粒子およびビードの少なくとも一部が結合種に固定されている、請求項１３
   ７に記載の方法。 【請求項１４０】 組成物がさらに、粒子に固定されている、または固定可能な酸化還元活性種よ
   り成る、請求項１３７に記載の方法。 【請求項１４２】 さらに、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含むと考えられるサン
   プルに組成物を曝露することより成る、請求項１３７に記載の方法。 【請求項１４３】 さらに、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種および神経変性疾病を阻
   害する候補薬剤を含むサンプルに組成物を曝露することより成る、請求項１３７
   に記載の方法。 【請求項１４４】 さらに、酸化還元活性剤を含む粒子に固定された凝集体形成または原繊維形成
   種に固定された少なくとも一部の磁気ビードを電極に引きつけることと、電極に
   近接した酸化還元活性剤の有無を判定することより成る、請求項１４２に記載の
   方法。 【請求項１４５】 電極が非特異結合性の阻害剤によってコートされている、請求項１４４に記載
   の方法。 【請求項１４６】 非特異結合性の阻害剤が自己集合単層より成る、請求項１４５に記載の方法。 【請求項１４７】 自己集合単層がポリエチレングリコール末端自己集合単層形成種より成る、請
   求項１４６に記載の方法。 【請求項１４９】 自己集合単層がさらに、電子に対する自己集合単層の透過性を向上させる種よ
   り成る、請求項１４６に記載の方法。 【請求項１５０】 電子に対する透過性を向上させる種が、導電性自己集合単層形成種より成る、
   請求項１４９に記載の方法。 【請求項１５１】 電子に対する透過性を向上させる種が、自己集合単層の欠陥部位を生じさせる
   種より成る、請求項１４９に記載の方法。 【請求項１５２】 信号伝達エンティティが複数の信号伝達エンティティである、上述の請求項の
   いずれかに記載の組成物、アーティクル、方法、系またはキット。 【請求項１５３】 結合種に他の結合種を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に変換させ
   ることより成る、請求項１１に記載の方法。 【請求項１５４】 結合種に神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種と相互作用させることと
   、それによって神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に構造変換させるこ
   とと、次に前記種を他の結合種に変換させることより成る、請求項１５３に記載
   の方法。 【請求項１５５】 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種でない、表面以外に結合した補助
   結合種に系を曝露することと、前記補助結合種を神経変性凝集体形成または原繊
   維形成種に変換させることより成る、請求項１１に記載の方法。 【請求項１５６】 結合種が最初にアーティクルの表面に固定される、請求項１１に記載の方法。 【請求項１５７】 結合種が最初にアーティクルの表面に固定されない、請求項１１に記載の方法
   。 【請求項１５８】 結合種および神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種が異なる生物分類種
   に由来する、請求項１３に記載の方法。 【請求項１５９】 表面を自己集合単層形成分子種および界面活性剤を含む媒体に曝露することに
   よって、表面上に自己集合単層を作成することより成る方法。 【請求項１６０】 表面を自己集合単層形成分子種およびカルボン酸塩を含む媒体に曝露すること
   によって、表面上に自己集合単層を作成することより成る方法。 【請求項１６１】 コロイド粒子の表面上に、コロイド粒子自体の形成時以外に、自己集合単層を
   作成することより成る方法。 【請求項１６２】 流体中で浮遊状態にあるコロイド粒子の表面上に自己集合単層を作成すること
   より成り、前記粒子が流体−流体界面に存在していない方法。 【請求項１６３】 自己集合単層形成分子種および界面活性剤を含む媒体が溶液または懸濁液であ
   る、請求項１５９および１６０に記載の方法。 【請求項１６４】 さらに、表面上に自己集合単層を作成した後に、自己集合単層から残留界面活
   性剤をすべて除去することより成る、請求項１５９に記載の方法。 【請求項１７０】 神経変性疾病凝集体または原繊維形成種をそれぞれ結合可能であって、相互に
   固定化された、または相互に固定化されるように改変された少なくとも２個の結
   合種を供給することと、それによって神経変性疾病凝集体または原繊維リンカー
   を規定することと、 前記リンカーを、神経変性疾病凝集体または原繊維種を含むと考えられるサン
   プルあるいは神経変性疾病を阻害する候補薬剤を含む溶液に曝露することより成
   る方法。 【請求項１７１】 神経変性疾病凝集体または原繊維形成種を分泌するよう改変された細胞を、神
   経変性疾病を阻害する候補薬剤に曝露することと、 神経変性疾病に特徴的な凝集体を形成する細胞から分泌される物質のポテンシ
   ャルを監視することより成る方法。 【請求項１７２】 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な種および神経変性疾
   病凝集体または原繊維形成を阻害する候補薬剤のための神経変性疾病凝集体また
   は原繊維形成種を含むと考えられる１個のサンプルを含む溶液を作成することと
   、 成分を前記溶液に移したり、容器から溶液を取り出したりせずに、神経変性疾
   病に特徴的な溶液中の凝集体を検出することより成る方法。 【請求項１７３】 エネルギーを流体に導入することより成る方法。 【請求項１７４】 原繊維または凝集体を見えるようにすることより成る、上述の請求項のいずれ
   かに記載の方法。 【請求項１７５】 アーティクルが流体中に浮遊可能な粒子である、上述の請求項のいずれかに記
   載のアーティクル、方法、キット、系または組成物。 【請求項１７６】 アーティクルが磁気的に浮遊可能な粒子である、上述の請求項のいずれかに記
   載のアーティクル、方法、キット、系または組成物。 【請求項１７７】 アーティクルが自己浮遊可能な粒子である、上述の請求項のいずれかに記載の
   アーティクル、方法、キット、系または組成物。 【請求項１７８】 結合種が表面に特異的に固定されている、または特異的に固定されるように改
   変される、上述の請求項のいずれかに記載の方法、アーティクル、系、キットま
   たは組成物。 【請求項１７９】 サンプルが天然型サンプルである、上述の請求項のいずれかに記載の方法、ア
   ーティクル、系、キットまたは組成物。 【請求項１８０】 サンプルが構造的に既定されたサンプルである、上述の請求項のいずれかに記
   載の方法、アーティクル、系、キットまたは組成物。