JP4223804B2 - 磁力でのInSitu希釈法 - Google Patents
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Description
【発明の分野】
本発明は、生物学的または化学的種の間の結合の検出及び分析の為の方法、アッセイ、及び成分に関するもので、具体的には薬物発見の為に使用されうる。
【0002】
【発明の背景】
化学及び生物学の一定の領域においては、分子間の結合相互作用の確認が最も重要である。このことは生理学に関連する研究に関して特にあてはまる。生理学的方法と関連したまたは化学物質と生理学的方法との相互作用に関連した無数の化学的及び生化学的相互作用は、ある分子存在物の、別の分子による認識を包含する。そのような相互作用の1つのクラスは、医薬品(薬物)の生理学的活性を包含する。その薬物の生理学的存在物との相互作用の正確な理解、及び生理学的に相互作用しうる薬物のデザイン及び/または発見は、もちろん社会にとって非常に興味のあることである。
【0003】
薬物発見は、典型的には、非常に多くの薬物候補を、標的受容体またはタンパク質のような生理学的標的との相互作用についてスクリーニングすることによって促進される。薬物スクリーニングについての既知の技術は、薬物候補の薬学的潜在性について、しばしば数十、数百、数千の他の薬物候補と並行して、個々に薬物候補を研究することを包含する。典型的な方法においては、数千の薬物候補(ライブラリー)であって、各々が数タイプの薬学的用途について少なくともいくつかの潜在性を有すると分かっている薬物候補が、具体的な生理学的標的に関連したそれらの活性について並行して研究される。このような及び他の薬物スクリーニングについての技術、及び他の化学的または生物学的結合相互作用の研究が知られているが、いくつかは時間浪費性でありかつ骨が折れるものである。そのような相互作用の研究についての、改良され、多様化され、そして時にはより迅速である技術の必要性が存在している。
【0004】
【発明の要旨】
本発明は、一般的に、推定上の結合パートナーの混合物から相互作用性成分を引き離し、未知分析物の同定を行い、多くの種のどれが既知の種に結合するかを確認し、別の種に結合する種が別の混合物中に存在するか否かを確認する為の技術、及び/またはこれらと他の技術の組み合わせを提供する。
【0005】
1つの態様においては、本発明は、第1物品及び第1物品に関して不動化された第1化学的または生物学的物質を第1場へ磁力で引き寄せ、かつ第2物品を第2場へ引き寄せることを包含する。その第1または第2物品がその場から選択的に放され、他方がその場へ保持される。
【0006】
さらなる態様においては、第1または第2物品のいずれを放つかの決定が、第1または第2物品が、結合パートナーまたは分析物を捕らえたか否かに基づいてなされうる。磁力で引き寄せて引き放す段階の繰り返しが、一連の推定上の結合パートナーからの、単一の結合パートナーの分析物の分離をもたらすことができる。
【0007】
本発明の他の効果、新規な特徴、及び目的は、概略図でありかつ限定が意図されていない添付図面と組み合わせて考慮すれば、以下の発明の詳しい説明から明らかとなるであろう。それらの図においては、種々の図に描かれた同一のまたはほぼ同一の各成分は単一の数字で表わされている。明確性のため、全ての図の全成分に符号が付されている訳でなく、当業者が本発明を理解するのに示す必要がない場合には、本発明の各態様の全ての成分が示されている訳ではない。
【0008】
【発明の詳しい説明】
Bamdadらによって2000年1月25日に出願され、“Rapid and Sensitive Detection of Aberrant Protein Aggregation in Neurodegenerative Diseasesと題された国際特許出願第PCT/US00/01997号(WO 00/43791として2000年7月27日に公開)、Bamdadらによって2000年1月21日に出願され、“Interaction of Colloid-Immobilized Species with Species on Non-Colloidal Structures”と題された国際特許出願第PCT/US00/01504号(WO 00/34783として2000年7月27日に公開)、Bamdadらによって2000年6月23日に出願され、“Interaction of Colloid-Immobilized Species with Species on Non-Colloidal Structures”と題され、共通に所有された係属中の米国特許出願09/602,778号、及びBamdadらによって2000年8月3日に出願され、“Rapid and Sensitive Detection of Protein Aggregation”と題され、共通に所有された係属中の米国特許出願第09/631,818号は、すべて参照によって本明細書に組み込まれる。
定義:
本明細書において使用される“小分子”は、5KDa未満の分子、より典型的には1KDa未満の分子を意味する。本明細書において使用される“小分子”はタンパク質を除外する。
【0009】
本明細書において使用される“薬物候補”という用語は、ヒト、動物、または植物に用いられるあらゆる医学的物質のことを言う。この定義に含まれるものは、化合物類似体、天然に存在し、合成され、または組み換えられた医薬品、ホルモン類、抗菌剤、神経伝達物質等である。これは、神経変性性疾患、または異常な凝集によって特徴付けられる他の疾患を治療または予防する為の薬物としての使用について評価される、あらゆる物質または前駆物質(天然に存在するか、合成されるか、または組み換えられているかに関係ない)を包含する。評価は、典型的には、本発明のスクリーニングアッセイのようなアッセイにおける活性を通じて行われる。
【0010】
多様なタイプの粒子が、本発明において使用されうる。例えば、“流体懸濁性粒子”は、本発明の目的の為にそれ自体だけで使用される流体(典型的には水溶液)中で、懸濁状態に留まらせることができる粒子、または磁場;電磁場;掻き混ぜ、振とう、振動、超音波処理、遠心分離、渦等のような攪拌を適用することによって溶液中で維持されうる粒子を意味する。“磁力懸濁性”粒子とは、磁場の適用を介して流体中で懸濁状態に維持されうるものである。電磁力懸濁性粒子とは、電磁場の適用によって流体中で懸濁状態に維持されうる粒子(例えば、電荷を帯びた粒子、または電荷を帯びるように修飾された粒子)である。“自己懸濁性”粒子とは、十分に小さいサイズ及び/または低い質量の粒子である為に、その中でその粒子が使用される流体(典型的には水溶液)中で、例えば磁場による補助がなくとも、最低1時間懸濁状態のままでいる粒子である。本発明によれば、他の自己懸濁性粒子は、補助がなくとも、5時間、1日、1週間、または1ヶ月でも懸濁状態であるだろう。
【0011】
“タンパク質”及び“ペプチド”は、当該分野において周知の用語であるが、各々が包含するアミノ酸の数の点においては、正確には定義づけられていない。本明細書において使用されるこれら用語には、当該分野におけるそれらの通常の意味が与えられる。一般的に、ペプチドは長さが約100未満のアミノ酸配列であるが、300までのアミノ酸の配列を含みうる。タンパク質は、一般的に、少なくとも100のアミノ酸の分子であると考えられる。
【0012】
本明細書において使用される“金属結合性タグ”は、キレートによって配位結合された金属に固定されることになることができる分子の集団のことを言う。そのような分子の適した集団には、典型的には約2〜約10のアミノ酸残基のアミノ酸配列が含まれる。これらには、ヒスチジン類やシステイン類(“ポリアミノ酸タグ”)が含まれるが、これらに限られない。そのような結合タグは、ヒスチジンを含む時には“ポリ−ヒスチジントラクト”、“ヒスチジンタグ”または“HISタグ”と呼ばれ、ペプチドまたはタンパク質または核酸のアミノ末端にでもカルボキシ末端にでも、あらゆる露出した区域にでも存在しうる。本発明における使用の為には、6〜10残基のポリ−ヒスチジントラクトが好ましい。そのポリ−ヒスチジントラクトは、興味の対象であるタンパク質に付加された多くの連続したヒスチジン残基であるとも機能上定義され、それは、生成したタンパク質の金属キレートカラム上での親和性精製をできるようにするか、または別の分子(例えば、HISタグと反応する抗体)との相互作用を通じてタンパク質末端を同定できるようにするものである。
【0013】
“親和性タグ”は、当該分野における通常の意味が与えられる。親和性タグには、例えば、金属結合性タグ、GST(GST/グルタチオン結合クリップにおけるもの)、及びストレプトアビジン(ビオチン/ストレプトアビジン結合におけるもの)が含まれる。本明細書における種々の場面で、結合相互作用に関連して具体的なアフフィニティータグが記載されている。本発明は、親和性タグを用いるいずれの態様においても、本明細書において記載されたあらゆる親和性タグを選択することを包含する、一連の個々の態様を包含することが理解されるべきである。
【0014】
本明細書において使用される、“キレートに配位結合する金属”またはキレートによって配位結合される金属とは、その金属上の全ての利用可能な配位結合部位は満たさずに、金属結合性タグを介した結合の為に利用可能ないくつかの結合部位を残すキレート化剤によって配位結合された金属のことを言う。
【0015】
本明細書において使用される、“金属結合性タグ/金属/キレート連結”は、第1及び第2種の間の連結であって、第1種が金属結合性タグに関して不動化され、かつ第2種がキレートに関して不動化され、そこで、そのキレートが、その金属結合性タグにも配位結合されている金属に配位結合している連結と定義される。本明細書において参照により組み込まれるBamdadらの米国特許第5,620,850号は、例示的な連結を記載している。
【0016】
“信号発信体”は、一定の試料中においてまたは一定の場においてその存在を示すことのできる存在物を意味する。本発明の信号発信体は、補助されていないヒトの目によって同定可能なもの、補助されていないヒトの目によって孤立しては見えないがもし十分な量であれば検出できるもの(例えばコロイド粒子)、それらが目で(補助されていないか、または電子顕微鏡等を包含する顕微鏡で)もしくは分光学的に容易に検出されうるようなあるレベルでまたは波長域内で電磁線を吸収または放射する存在物、適切な活性化エネルギーへの曝露で特徴的な酸化/還元パターンを示すレゾックス活性分子のような、電子的にまたは電気化学的に検出されうる存在物(“電子的信号発信体”)等でありうる。例には、染料、顔料、レゾックス活性分子のような電子活性分子、蛍光性部分(当然、リン光性部分を包含する)、上方制御性リン光体、化学発光性存在物、電子化学発光性存在物または、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼを包含する酵素連結信号発信性部分が含まれる。“信号発信体の前駆体”とは、それ自体だけでは信号発信能力は有さないが、別の種との化学的、電気化学的、電気的、磁力的、または物理的相互作用で信号発信体となる存在物である。一例には、別の分子との化学的相互作用でのみ一定の検出できる波長範囲内において放射線を放射する能力を有する発色団が含まれる。信号発信体の前駆体は、本明細書で用いられる“信号発信体”から識別可能であるが、 その定義内に含まれる。本明細書で用いられる“固定されまたは固定されるように適合された”とは、ある種の別の種とのまたはある物品の表面との関連において、その種が、共有結合での付着、特異的生物学的結合(例えば、ビオチン/ストレプトアビジン)を介した付着、キレート/金属結合のような配位結合等を介して、化学的にまたは生物化学的に連結されることを意味する。例えば、この文脈における“固定された”には、複合された化学的連結、複合された化学的/生物学的連結等が含まれ、その化学的/生物学的連結には、ポリスチレンビーズ上に合成されたペプチドのような結合種、共有結合でビーズに付着されたタンパク質Aのようなタンパク質に結合された抗体に生物学的に特異的にカップリングされた結合種、GSTまたはファージのような分子であって、順次ある表面に共有結合で固定された結合パートナー(例えば、GSTの場合におけるグルタチオン)に生物学的に特異的に結び付けられた分子の一部分を(遺伝子工学を介して)形成する結合種等を包含するがそれらに限定されない。別の例としては、チオールは金と共有結合で結合するので、共有結合でチオールに連結したある部分は、金表面に固定されるよう適合される。同様に、金属結合性タグを担持する種は、その表面に共有結合で付着された分子(チオール/金結合のようなもの)であって金属を配位結合するキレートをも提示する分子を有する表面に固定されるよう適合される。ある種は、もしある表面が一定のヌクレオチド配列を有し、その種が相補的なヌクレオチド配列を包含しているなら、やはりその表面に固定されるよう適合されている。
“共有結合で固定された”とは、1またはそれを超える共有結合だけを介して固定されたことを意味する。例えば、EDC/NHS化学を介して、カルボキシレート提示アルキルチオールに共有結合でカップリングされ、順繰りに金表面に結合されているある種は、その表面に共有結合で固定されている。
【0017】
“特異的に固定された”または“特異的に固定されるよう適合された”とは、“固定されまたは固定されるように適合された”の定義に関して先に記載されたように、ある種が化学的にまたは生化学的にある表面に連結されたことを意味し、全ての非特異的結合は除外される。
【0018】
本明細書で用いられる“非特異的結合”には、生化学の分野における通常の意味が与えられる。
本明細書で用いられる“コロイド”は、ナノ粒子、即ち、例えば無機物または有機物、重合体、セラミック、半導体、金属(例えば金)、非金属、結晶、非結晶、またはある組み合わせである材質でできたものを包含する、非常に小さい自己懸濁性または流体懸濁性粒子を意味する。典型的には、本発明に従って使用されるコロイド粒子は、いずれの方向においても横断面250nm未満で、より典型的にはいずれの方向においても横断面100nm未満の粒子であり、そして多くの場合は横断面約2〜30nmである粒子である。本発明における使用に適したコロイドの1つのクラスは、横断面が10〜30nmであり、もう1つは横断面において約2〜10nmである。本明細書において使用されるこの用語は、生化学の分野において通常に使用される定義を包含する。
【0019】
本明細書で用いられる“ある金属に配位結合することができる部分”は、金属結合性タグやキレートのような、金属原子上の少なくとも2つの配位結合部位を占有することのできるあらゆる分子を意味する。
【0020】
本明細書において使用される、別の成分に“関して不動化された”成分は、その別の成分に固定されているか、例えば、その別の成分も固定されている第3成分に固定されることによって、その別の成分に間接的に固定されているか、または別のやり方で中継的に別の成分に付けられている。例えば、ある信号発信体は、もしその信号発信体がある結合種に固定されたり、その結合種が固定されているコロイド粒子に固定されたり、その結合種が固定されているデンドリマーまたは重合体に固定されたりすれば、その結合種に関して不動化されていることになる。
【0021】
“別種の生物学的種”は、マウスとハムスター、マウスとヤギ、等のような異なった動物を意味する。
“試料”という用語は、あらゆる細胞、組織、または供給源からの流体(“生物学的試料”)、または本発明に従って有利に評価されうる生物学的なもしくは非生物学的な他のあらゆる媒質のことを言い、それには、ヒト患者から採取された生物学的試料、動物から採取された試料、ヒトが消費する為にデザインされた食物から採取された試料、家畜の餌やミルクのような動物が消費する為にデザインされた食物を包含する試料、臓器提供試料、血液供給の為に予定された血液の試料、水源からの試料等が含まれるが、これらに限定されない。試料の一例は、薬物候補がその薬物の効能を確認する為に人または動物に与えられたそのヒトまたは動物から採取された試料である。
【0022】
ある特定の成分を“含有していると疑われる試料”は、それに関してその成分の量が未知である試料を意味する。例えば、神経変性性疾患または非神経変性性疾患のような疾患を有していると疑われるがその疾患を有しているとは分かっていないヒトからの流体試料は、神経変性性疾患凝集体形成性種を含んでいると疑われた試料と定義される。この文脈における“試料”には、ヒトまたは他の動物からの生理学的試料、食物や家畜の餌等からの試料のような天然に存在する試料、並びに、その化学的または生物学的な配列または構造が、神経変性性疾患のような特定の経過に関連しているかどうかを試験する為にデザインされたアッセイにおいて用いられる予め決められた構造である試料を意味するものと本明細書中において定義される“構造的に予め決められた試料”も含まれる。例えば、“構造的に予め決められた試料“には、ペプチド配列、ファージディスプレイライブラリー中のランダムペプチド配列等が含まれる。ヒトまたはその他の動物から採取された典型的な試料には、細胞、血液、尿、眼液、唾液、脳脊髄液、扁桃腺からの流体または他の試料、リンパ節、針生検等が含まれる。
【0023】
本明細書で用いられる“分子ワイヤー”は、SAMで覆いされた電極に遭遇する流体がその電極と電気的に連絡する能力を高めるワイヤーを意味する。これには導電性の分子、または、上で述べまた以下でも十分に例示されるように、その電極との連絡ができるようにSAMに欠損を生じさせる分子が含まれる。追加の分子ワイヤーの非制限的リストには、2−メルカプトピリジン、2−メルカプトベンゾチアゾール、ジチオスレイトール、1,2−ベンゼンジチオール、1,2−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼンーエタンチオール、及び2−メルカプトエチルエーテルが含まれる。単層の導電性は、電極の平面部において導電性を高める分子を加えることによっても高められうる。導電性SAMは、:1)硫黄で終結されたポリ(エチニルフェニル)鎖;2)ベンゼン環で終結されたアルキルチオール;3)DNA塩基で終結されたアルキルチオール;4)単層中に不完全に詰められたあらゆる硫黄終結種;5)上記の全てのものに、非特異的吸着を阻害する為にエチレングリコール単位またはメチル基で終結されたアルキルチオールスペーサ分子を加えたものまたは差し引いたものから構成されうるが、それらに限定されない。SAMを容易に形成する金についてのそれらの親和性ゆえに、チオール類が記載されている。米国特許第5,620,820号及びその他の参考文献から当該分野において知られているように、その他の分子がチオール類に置き換えられうる。分子ワイヤーは、典型的には、それらのかさ高さまたは他のコンフォーメーション故に、別のやりかたで比較的堅く詰められたSAMの中に欠損を作り出して、SAMがそれが曝される流体に対してその表面を堅く封止するのを防止する。分子ワイヤーは堅く詰められた自己集成構造の崩壊を引き起こし、それによって、その表面が曝される流体がその表面と電気的に連絡できるようにする欠損を画定する。この文脈においては、その流体は、その表面に接触することにより、またはトンネリングを介した電子的連絡が起こりうるほど十分にその表面の近接に近寄ること等によって、その表面と電子的に連絡する。
【0024】
“生物学的結合”という用語は、相互的親和性または結合能力を示す対応した分子の対の間の相互作用のことを言い、典型的には、生化学的、生理学的及び/または薬学的相互作用を包含する、特異的なまたは非特異的な結合または相互作用のことを言う。生物学的結合は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモン類等を包含する分子の対の間で起きる相互作用の1タイプと定義される。具体的な例には、抗体/抗原、抗体/ハプテン、酵素/基質、酵素/阻害剤、酵素/補助因子、結合性タンパク質/基質、担体タンパク質/基質、レクチン/炭水化物、受容体/ホルモン、受容体/エフェクター、核酸の相補鎖、タンパク質/核酸、抑制因子/誘導因子、リガンド/細胞表面受容体、ウイルス/リガンド等が含まれる。
【0025】
“結合パートナー”という用語は、特定の分子との結合を受ける分子のことを言う。生物学的な結合パートナーが例である。例えば、タンパク質Aは、生物学的分子であるIgGの結合パートナーであり、またその逆も同じである。
【0026】
“確認すること”という用語は、例えば、分光学、偏光解析法、圧電的測定、イムノアッセイ、電気化学的測定等を介して、定量的または定性的にある種を分析することをいう。“確認すること”は、種の間の相互作用の検出または定量をも、例えば2つの種の間の結合の検出をも意味する。
【0027】
用語“自己集成単層”(SAM)は、自発的にある表面へ化学吸着された分子の比較的順序だった分子の集成体のことを言い、そこでそれらの分子は互いにほぼ並行に、そしてその表面におよそ垂直に配向されている。それら各々の分子は、その表面に接着する官能基、及びその単層中の隣接した分子と相互作用して比較的順序だったアレイを形成する部分を包含している。各々が参照により本明細書に組み込まれるLaibinis, P. E.; Hickman, J.; Wrighton, M. S.; Whitesides, G. M. Science 245, 845 (1989), Bain, C.; Evall, J; Whitesides, G. M. J. Am. Chem. Soc. 111, 7155-7164(1989), Bain, C.; Whitesides, G. M. J. Am. Chem. Soc. 111, 7164-7175 (1989)を参照のこと。
【0028】
用語“自己集成混合単層”は、異成分からなる自己集成単層、即ち、少なくとも2つの異なる分子の比較的順序だった集成体から作り上げられたもののことを言う。
【0029】
本発明は、化学的または生物学的種間の結合の確認の為であって、特に一連の種のうちでどれが特定の標的種に結合しどれが結合しないかの確認の為の技術、キット、及び物品を提供する。本発明の技術は、本質的にあらゆる結合相互作用の、典型的には生物学的結合相互作用の確認に有用である。
【0030】
本発明の一定の態様は、コロイド粒子の表面のような表面上での自己集成単層(SAM)の使用、及びSAMで被覆された表面を有するコロイド粒子のような物品の使用を行う。1組の好ましい態様においては、完全に合成分子で形成されたSAMがある表面またはある表面のある領域を完全に覆い、例えば、コロイド粒子の表面を完全に覆う。この文脈における“合成分子”とは、天然に存在するのではなく、むしろ人の指示または、人に創作されたかもしくはヒトに指示された制御のもとで合成された分子を意味する。この文脈における“完全に覆う”とは、完全で直接的なSAMでの覆いを防止するタンパク質、抗体、またはその他の種と直接接触する部分がその表面または領域にないことを意味する。即ち、その表面または領域は、非天然存在性分子(即ち、合成分子)から完全になっているSAMをその全体に渡って包含する。そのSAMは、表面で密に詰められたSAMを形成するSAM形成性種、分子ワイヤーまたはその他の種と組み合わさってそのSAMを通じた電子的連絡を促進することができるこれら種(SAMに参加できる欠損促進性種を包含する)、SAMに参加することのできるその他の種、及びこれらなんらかの組み合わせとで、完全に作り上げられることができる。好ましくは、そのSAMに参加する全てのその種は、金表面に共有結合で結合するチオールのように、その表面に、場合により共有結合で結合する官能基を包含する。本発明によれば、ある表面上の自己集成単層は、あらゆる化学的または生物学的官能基を本質的に提示する(曝す)ことができる種(例えば、金がその表面であればチオール種)の混合物を含んでなることができる。例えば、それらには、非特異的吸着に抵抗する為のトリエチレングリコール終結種(例えば、トリエチレングリコール終結チオール類)、及びある親和性タグの結合パートナー中で終結しているその他の種(例えばチオール類)、例えば、ニッケル原子と複合化した時にヒスチジンタグが付けられた結合種を補足するニトリロトリ酢酸のような金属に配位結合することができるキレート中で終結している種が含まれうる。これら配置は、本発明の種々の態様について使用されうる。一例として、自己集成単層は、コロイド上かまたは別の表面上に形成されたかに関係なく、非特異的吸着に抵抗する為のトリエチレングリコール終結チオール類、及びある親和性タグの結合パートナー中で終結しているチオール類、例えば、ニッケル原子と複合化すればヒスチジンタグ付結合種を補足するニトリロトリ酢酸のような金属と配位結合することができるキレート中で終結しているチオール類を包含する(金がその表面であれば)チオール種の混合物を含んでなることができる。ある好ましい態様においては、その結合種は容易に自己凝集しうる、βアミロイドペプチドである。本発明は、コロイド表面上に提示された、ヒスチジンタグ付ペプチドの濃度を厳密に制御する方法を提供する。各々のコロイド粒子上のペプチド密度についてのこのような厳密な制御がなければ、同時不動化されたペプチドは互いに容易に凝集し、試料中に存在する凝集体形成性種の不存在下でコロイド−コロイド凝集に触媒作用を示すであろう微小疎水性ドメインを形成するだろう。これが、現行のコロイド凝集アッセイに勝った本発明の利点である。
【0031】
本発明において記載されている方法は、BSAでのブロッキングのようなタンパク質ブロッキング段階なしで非特異的吸着に抵抗する自己集成単層をコロイド上に生成する。本明細書において記載されている方法は、生物学的に関連する流体中で安定で、かつ結合反応を妨げる洗浄剤(安定性の為にコロイドを懸濁状態に維持する)を必要としない、誘導化されたコロイドも生成する。このことが、高感度の結合性アッセイが溶液中で行われるようにする。このことが、現行のコロイド凝集アッセイについては共通している、結合パートナーを吸着剤表面に接着させる必要性を排除する。以下に説明されるように、洗浄剤はコロイド上でのSAM形成に有利に使用されうる。この場合には、洗浄剤はSAM形成の後に除去されることができ、好ましくはSAM形成の後に除去されて、結合相互作用またはその他のコロイドの使用の間には、もはやコロイド上にも、SAM中にも、他のどこかにも存在しない。
【0032】
ある標的分子が、電子的信号発信性コロイドに付着され、次いで各々が別々の薬物候補種を提示する複数の磁性ビーズと共にインキュベートされることができる。インキュベーションに続いて、その磁性ビーズは磁力で感知性電極へ引き寄せられ、そして例えばACVによって分析されることができる。ある磁性ビーズ上の薬物と電子的信号発信性コロイド上の標的分子の間の相互作用が、生じる複合体をリクルートできかつ、検出できるようにする。複合体は、磁力で電極へ引き寄せられ、電子的に分析される。コロイド上にSAMを生成する技術及びビーズとコロイド状粒子に関するアッセイについての種々の技術が、Bamdadらによって2000年1月25日に出願され、“Rapid and Sensitive Detection of Aberrant Protein Aggregation in Neurodegenerative Disieses”と題され、2000年7月27日にWO 00/43791として公開された国際特許出願第PCT/US00/01997号、及びBamdadらによって2000年1月21日に出願され、“Assays Involving Colloids and Non-Colloidal Structures”と題され、WO 00/43783として2000年7月27日に公開された、国際特許出願第PCT/US00/01504号に記載されている。
【0033】
小分子薬物ライブラリーは、数百万の別異の化合物を含有し、それらは論理計算的な難題を提起する。現在のプラクティスは、薬物候補をプールし、陽性を示したプールの個々の成分を試験し、分析し、そして単一の相互作用種が同定されるまで繰り返すことである。このプラクティスは、非常に時間浪費性である。別のアプローチは、各々の薬物候補をその同一性をコードする独自のタグ及び蛍光性の標識で修飾することである。ポリスチレンビーズ上に不動化された標的分子は、プールされた薬物候補と共にインキュベートされ、次いでリンスされる。ある薬物候補を捕獲したポリスチレンビーズは蛍光を発し、そして顕微鏡を使用してその他のものから分離されうる。次いで、その捕獲された薬物は、相互作用したその小分子を同定する為に解読される。このアプローチの問題は、薬物候補に付加された多くの標識が相互作用に参加して、多くの偽陽性をもたらしてきたことである。
【0034】
別のアプローチは、磁性ビーズ上で薬物候補を合成するか、または薬物候補をそれに付着させることである。次いで、エンコード標識が、その薬物候補でなくそのビーズに付着される。次いで、薬物提示磁性ビーズの複数のプールが、その標的分子と電子的標識(コロイド上のSAMに取り込まれたフェロセン−チオールのようなもの)の両方を提示するコロイドと混合される。その溶液は微小電極のアレイ上に保持される。磁場は、そのアレイの各々の電極パッドに別々に適用されうる。まず、その磁性ビーズを引き寄せる為に、磁場がそのアレイ中の各々の電極に適用される。次いで、そのアレイは、電子的に分析される(ACVが好ましい)。陽性を示すパッドは、そのアドレスで、磁性ビーズ上の薬物候補が信号発信性コロイド上の標的分子を捕獲したことを示す。陽性を示した空間的アドレスでその磁場は“オンにされた”まま、他の磁場が放たれ、相互作用しなかった薬物候補を有する磁性ビーズを流し去る為に出口弁が開放される。出口弁は閉じられ、その薬物候補をin situで希釈する為にさらなる溶液が加えられる。本方法は、各々の陽性信号が単一の薬物候補を有している単一の磁性ビーズからのものであることが確かめられるまで、数回繰り返される。これら陽性のものが集められ、相互作用性薬物候補を同定する為に分析される。薬物候補を有するビーズがエンコードされていても、薬物がビーズから放たれてマススペクトル、NMR、配列決定等のような分析技術に提出されてもよい。
【0035】
ここで図を参照すると、結合相互作用の確認の為の1つの技術が記載されている。図1は、それぞれ第1及び第2物品である20及び22を概略的に示す。物品20及び22は、結合研究の為の化学的または生物学的種を不動化することができるあらゆる物品であることができ、そして磁場を介してある所から他の所へ磁力で引き寄せられることができる。典型的には生化学的分析において使用される重合体磁性ビーズが、物品20及び22について用いるのに都合がよく、そして他の物品が使用されうるという理解のもと、以下その物品は、磁性ビーズと呼ばれる。
【0036】
磁性ビーズ20は、そのビーズに関して不動化されている第1化学的または生物学的物質24(D)を担持し、磁性ビーズ22は不動化された第2化学的または生物学的物質26(D’)を同様に担持する。
【0037】
図1において、結合パートナー28(P)も提供され、各々は信号発信体30に関して不動化されている。示されているように、信号発信体30は、コロイド粒子である。その示された態様においては、結合パートナー28は、第1化学的または生物学的物質24について結合親和性を有しているが、第2生物学的または化学的物質26については結合親和性を有していない。従って、図1に示された全ての成分の互いの曝露は、例えば典型的に生化学的なアッセイ流体媒質中で混合することを介して、結合パートナー28の第1物品24への結合、及び信号発信体30に関したビーズ20の対応する不動化をもたらす。信号発信体30は、ビーズ22に関して不動化されることにはならない。
【0038】
種々の信号発信体は、もし望まれれば、コロイド粒子のような種々の物品の表面に関して不動化されうる。本発明によれば、蛍光接合抗体及び、緑色蛍光タンパク質を包含する他の蛍光融合タンパク質のような信号発信体は、推定上の結合パートナーをも提示する金コロイドの表面及び他の表面に、親和性タグやEDC/NHS化学を通じてか、またはNTA−SAM被覆コロイド上に提示されたHis−タグ付タンパク質AもしくはGに結合することによって、容易に付着される。蛍光部分のような信号発信体は、ビオチン終結リガンドを介してコロイド上に同時不動化されることも、キレート/金属/金属結合性タグ連結を介してコロイド上に固定されこともできる。蛍光部分は、それを抗体に付着させ、その抗体を結合させる為のHis−タンパク質Gと一緒に及びキレート/金属/金属結合性タグを用いることによってもその抗体に固定されうる。次いで、その部分は直接的に検出されうる。好ましい態様においては、その信号発信体は電気活性、具体的にはレゾックス活性錯体であるので、交流ボルタンメトリ−(Alternating Current Voltammetry(ACV))によって電気化学的に検出されうる。
【0039】
本発明に従って、種々の結合相互作用が研究されることができるが、好ましい技術は、薬物候補/標的分子相互作用の高処理量検出を包含する。このような配置においては、第1及び第2物質である24及び26(それぞれD及びD’)は薬物候補であり、そして結合パートナー28は、一方の薬物候補に結合できるが、他方の薬物候補には結合できない標的タンパク質である。この特異的なアッセイが、残りの図に関して説明されるが、本発明は薬物候補/標的タンパク質相互作用に限定されないものと理解されるべきである。
【0040】
典型的な薬物スクリーニングアッセイにおいて、非常に多数(数千から数百万)の薬物候補が提供され、磁性ビーズに関して不動化されることができる。好ましくは、各々の磁性ビーズが1タイプの不動化された薬物候補だけを担持し、提供された薬物候補当たり1ビーズだけがあっても、薬物候補当たり多くのビーズがあってもよい。本発明の1つの利点は、以下の記載からより十分に理解されることとなるように、各々の薬物候補についてただ1つのビーズだけが提供される必要があることである。即ち、異なった不動化薬物候補を担持する各々のビーズについて、複数のビーズが1アッセイにおいて提供されることができるということである。
【0041】
図においては、信号発信体30がコロイド粒子として示されており、信号発信体としてのまたは標的タンパク質28に関して異なる信号発信体の不動化における支援の為の構造体(以下に記載される)としてのコロイド粒子の使用が好ましい。特に、金のコロイド粒子のような金表面を曝しているコロイド粒子は特に都合がよい。コロイド粒子は、以下においてはタンパク質28と関連して説明されるが、そのタンパク質、または他の結合パートナーは、コロイド粒子を用いなくても信号発信体に関して不動化されることができるものと理解される。
【0042】
薬物候補24及び26の磁性ビーズ20及び22への不動化は、当該技術分野で公知のあらゆる技術によって行われうる。そのような技術は日常的なものである。薬物候補は、その磁性ビーズの表面へ、適度な結合及び信号発信を容易にするのに十分な濃度で提示されるべきであり、それは、本発明のアッセイの要件の知識を有している当業者によって容易に決定されうる。
【0043】
結合パートナー28は、チオール連結を介してコロイド粒子30に関して不動化されることができる。即ち、結合パートナー28は、チオールを取り込んでも、または化学的に付着もしくは他のやり方でチオールに不動化されてもよく、そのチオールは、コロイド粒子30の金表面に結合するということになる。1つの好ましい態様においては、タンパク質28は、金属結合性タグ/金属/キレート連結を介して金コロイド粒子30の表面上に形成された自己集成単層(SAM)に付着される。このような場合には、金属結合性タグは結合パートナー28に付着されることができ、そしてそのコロイドは、その結合タグが結合する金属を配位結合しているキレートを提示するSAMを担持することができる。別の親和性タグが、結合パートナー28をコロイド粒子上のSAM種に付着させる為に使用されうる。別の態様においては、コロイド粒子上のSAMは、カルボキシレート基を提示し、そして結合パートナー28は1級アミンを取り込むか、またはそれに関して不動化され、そのアミンがEDC/NHS化学を介してSAMに連結されることができる。親和性タグ/結合パートナー連結、またはEDC/NHS化学は、本質的にあらゆる種を本質的に本発明の表面へ連結させる為に使用されうる。好ましくは、そのようなSAMは、薬物候補24への結合を容易にする為のタンパク質28の十分な露出を包含し、自己集成単層の残余はポリエチレングリコール終結SAM形成性種のような非特異的結合を阻害する種を含んでなる。望まれる化学的または生化学的官能基を露出している表面に自己集成単層を形成する為の、種々の種の自己集成単層形成性種への選択的付着が、上で記された参考文献、及び米国特許第5,512,131号及び1996年6月26日に公開された国際公開WO 96/29629を包含する追加的文書から知られており、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質28のコロイド粒子38への付着の為の化学も、2000年1月21日に出願され2000年7月27日にWO 00/34783として公開された、BandadとBandadの係属中で、共通に所有されている国際特許出願第PCT/US00/01504号に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0044】
別の技術においては、カルボキシ終結チオール類を取り込んでいるSAMが、コロイド粒子30上に形成されうる。次いで、EDC/NHSカップリング化学が、ある1級アミンを提示するあらゆる分子をそのSAMに付着させる為に使用されうる。殆どのタンパク質28は1級アミンを包含するので、コロイド粒子30上のSAMへの続く付着の為の分子への1級アミンの付着が、それによって容易にされる。典型的なEDC/NHS連結は、次のように行われうる。
【0045】
20〜40μMNTA(ニトリロトリ酢酸)C11チオール、540〜580μMCOOH−C11チオール及び+/−40μMフェロセニル−C11チオールを含有するジメチルホルムアミド(DMF)溶液が調製される。コロイド粒子がその溶液中でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、そのDMF溶液が除去され、そしてそのコロイド粒子が400μMポリエチレングリコールC11チオールを含有する第2DMF溶液に導入され、そして上に記載されたように、熱サイクルが行われる。30μLのそのコロイドがペレットにされ、そして100μLのリン酸緩衝液中に再懸濁される。その緩衝液に、0.5μモルのN−エチル−N’(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と、0.1μモルのN−ヒドロキシスクシンイミドへそのコロイドに連結することになる1級アミン含有結合パートナー28を加えたものが加えられる。このコロイド溶液に結合パートナーが加えられたものは、10分間インキュベートされ、その間に、結合パートナーがコロイド上のSAMに付着する。その溶液を除去し、引き続いて洗浄し、そして再懸濁が続けられる。結合パートナーが1を超えるコロイド粒子への連結するのを回避する為に、その反応が起こる溶液の容量は適切に2倍化または3倍化されうる。その結合パートナーは、不動化された標的を担持しているアガロースビーズに曝露されること及び凝塊形成を観測することによって、そのコロイドに関して不動化されていることが実証されうる。
【0046】
図2においては、図1に示された成分が、タンパク質28の薬物候補24への結合に引き続いて流体媒質中で懸濁されているのが示されている。それら成分は、磁性粒子20及び22が磁力でそこに引き寄せられうる第1場40及び第2場42の近傍で懸濁される。場40及び42は、単一の物品の表面の予め決められた区域であっても、または異なる物品の表面であってもよい。場40及び42が、同じ物品の場であるかまたは異なる物品の場であるかは、信号発信体の一方の場における不動化が他方の場における不動化から識別できる程度に場が離れている為に識別できる限り(以下の記載から明らかとなる)、本発明に関しては重要ではない。好ましい態様において、第1及び第2場40及び42は、それぞれ第1及び第2電極44及び46の表面であり、そこで電磁石が各々の電極に付けられている。電磁石はビーズ20及び22を第1及び第2場40及び42の近傍に引き寄せるように位置付けられうる。示されているように、電磁石48及び50は各々の電極44及び46にそれぞれ付けられているのが示されており、そしてアッセイの成分に関して電極の背後に位置付けられている。電極及び電磁石に向かう電気回路部品は慣習的なものであり、示されていない。
【0047】
磁性ビーズ20及び22は、電磁石48及び50の活性化によって、第1及び第2場40及び42へ磁力で引き寄せられる。典型的には、ビーズ20及び22は、それに表面区域40及び42が曝される水溶液のような流体媒質中に保持される。図3は、表面場40及び42に引きよせられた、ビーズ20及び22及びそれらに関して不動化された種を示す。そのビーズは、ビーズ20に関して不動化された信号発信体の同一性が確認されうる程度でのみその表面場に近接した域内に引き寄せられる必要がある。1つの態様においては、信号発信体30は目で特定できる。この態様において信号発信体30はコロイド粒子(ビーズ20の表面に最も近い凝集が、そのビーズに他のビーズから区別できる青または紫色を示させる)であっても、蛍光性部分であっても、蛍光性粒子等であってもよい。このような場合においては、電極44及び46は必要とされない;それはビーズが磁力で離れた場へ引き寄せられることを要求するだけである。これが起こった時には、表面場40は、信号発信体30を誘引したものとして特定され、場42は信号発信体30を誘引しなかったものとして特定される。
【0048】
別の態様においては、信号発信体は、レゾックス活性種のような電気活性分子を含んでなり、電極44に近接したその存在、及び電極46に近接したその不存在が、CV及びACVのような公知の電気化学技術を介して確認されうる。そのような電気活性分子は、典型的には、遷移金属錯体、即ち、カドミウム、銅、コバルト、パラジウム、亜鉛、鉄、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、テクネチウム、タングステン、及びイリジウムに限定されない金属から選択された金属を包含する錯体を包含する金属含有レゾックス活性分子である。特に好ましいのは、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金、及びパラジウムであり、ルテニウム及び鉄が格別に好ましい。これら金属を包含する錯体には、例えば、イソニコチンアミド、イミダゾール、ビピリジン、ターピリジン、フェナントロリン類、一酸化炭素、イソシアニド、及びメタロセンリガンドのようなリガンドであってこれらの置換誘導体を包含するリガンドを持った金属が含まれる。その他のリガンドは、当業者には明らかであろう。本発明の特に好ましい金属錯体は、メタロセン錯体であり、特に1つの鉄原子と2つのシクロペンタジエンリガント含むフェロセンまたはその誘導体が好ましい。
【0049】
タンパク質28に関して不動化された信号発信体(31、最初に図3に示されているが場合によっては他の図にも存在する)は、タンパク質28自体が固定されている共通のコロイド粒子30に固定されうる。これは、タンパク質28、その信号発信体(場合によってはフェロセンのように電気活性である)、及び場合によっては非特異的結合阻害性SAM形成種を含む混合SAMをコロイド粒子30上に形成することによって達成されることができる。電気活性信号発信体31が使用される場合には、それが場40及び42に近接していることまたはそれがないことが、述べたように、CVまたはACVのような公知の電気化学技術を使用して、電極44及び46で、当業者によって容易に確認されることができる。
【0050】
どの信号発信技術が使用されようと、信号発信体が場40のすぐ近くに存在し場42のすぐ近くには存在しないと確認されれば、電磁石50が脱活性化されるので、場42のすぐ近くに引き寄せられていたビーズは選択的に放される一方で、場40のすぐ近くのビーズは同じ場所に磁力で保持される。場42からのビーズの引き放しに引き続き、磁力で場40に保持されていない全てのビーズを除去する為に、少なくとも場42、及び場合によって場42及び40がリンスされる。次いで、好ましくはビーズを含有しない流体が表面場40及び42の環境へ導入され、ビーズ20及び22が表面場40から放されてその流体中へ懸濁され、そしてビーズを表面場へ磁力で引き寄せる段階、信号発信体が存在する場を確認する段階、及び信号発信体が存在しない表面場からビーズを引き放す段階が繰り返される。具体的には、ビーズ20及び22の表面区域40からの引き放しに引き続き、電磁石48及び50が再活性化される。次いで、理想的には、ビーズ20及び22が異なる表面場に引き寄せられ、それらを互いから効果的に引き離す(図5に示されているように;このアッセイの繰り返しは最終的にそのような引き離しをもたらすことになる)。ビーズ20が表面場42へ引き寄せられるたなら(信号発信体によって特定される)、電磁石48が脱活性化され、リンスによって除去されうるビーズ22を引き放し、ビーズ20だけが表面場に不動化されたままにされることができる。次いで、薬物候補24は、標的タンパク質28についての結合親和性を有しているものとして同定されうる。これは種々の公知技術のどんなものによっても達成されうる。1つの技術においては、各々のビーズに独自の放射性標識のタグが付けられ、それが読み取られて、付着された薬物候補の化学的履歴が明らかにされる。各々の合成段階の核酸またはペプチド標識化を包含するその他の標識スキームが可能である。別のアプローチには、薬物候補24をビーズ20から切り離して、マススペクトルのような技術を使用してそれを分析することが含まれる。
【0051】
図1〜5に示したように、2タイプだけの薬物候補(D及びD’)を担持する2タイプだけのビーズ(20及び22)が示されている。実際のアッセイにおいては、各々がある独自の薬物を担持している数百、数千、または数百万のビーズが使用される。薬物候補を担持しているビーズは、容易に入試可能であるか、または、例えば、コンビナトリアル合成、固相合成アプローチ、または合成後付着を使用して、当業者により容易に調製されることができる。典型的な高容量スクリーニング技術においては、例えば1千万の薬物(D、D’、D”、...)を、ある結合パートナーとの相互作用に対してスクリーニングするのが望ましいかもしれない。慣用的な技術においては、これには、典型的には、1千万の実験、または1千万の薬物の並行スリーニング(例えば多穴プレート上で)が含まれ、時間浪費性でありかつ骨が折れる方法である。しかしながら、本発明においては、スクリーニングされる薬物候補の数よりずっと少ない数の表面場(40、42、...)が採用される必要があるに過ぎない。表面区域の大きさ及びそれらの数は、多くの薬物種を提示する多くのビーズ(20、22、...)が単一の表面場に引き寄せられるように選択される。典型的なアッセイにおいては、これらビーズの1つだけ、または僅かだけが信号発信体に関して不動化されることになる。このようにして、表面場の数が、ビーズ及び薬物候補の数及び予期される陽性結合相互作用の数に関連して、少なくともいくつかの表面場(一般に多くのまたは殆どの表面場)において、離れた表面場へ複数のビーズを引き寄せる第1段階が信号発信体の存在を示さないように、選ばれることができる。一定の場が信号発信体を誘引していないと同定されると、それら場から全てのビーズは放たれ、そして洗い去られることができ、そして表面場(信号発信体を示している表面場;ここではずっと少ない数)に保持されたビーズが放たれ、再配分され、表面区域に再び引き寄せられることができ、そして、統計的にただ1つの磁性ビーズが各々の表面場に存在するまでそのアッセイが繰り返されることができる。この時、信号発信体を担持しているビーズは、他の全てのビーズから分けられることができ、そしてそれらの不動化された薬物候補の同一性が確認されることができる。
【0052】
本発明の技術は、多数の可能性ある結合相互作用のスクリーニングにおける労力を削減できるようにする。例えば、1千万の薬物候補の単一の潜在的結合性タンパク質に対するスクリーングは、1万の表面場、またはずっと少ない例えば千の場だけ、または百のもしくはそれより少ない表面場を使用してでも行われることができる。もちろん、また、薬物ライブラリーが、タンパク質の一団との相互作用について同時にスクリーニングされてもよい。この場合には、薬物の同一性だけでなくそれが結合しているタンパク質の同一性を確認する為に、異種粒子複合体が後で分析されてもよい。
【0053】
本発明のこの利点(効率的なスクリーニング)は、別々の物品に関して各々不動化された薬物候補のような複数の結合パートナー候補を提供すること、及び結合パートナー候補の信号発信体に関して不動化された標的との結合を検討することを包含する本発明の1側面を決定づけ、一方法においては、結合パートナー候補の数に関して10分の1の数の表面場が、具体的には、少なくとも1つの結合パートナー候補とその標的の間の結合を確認することを包含する。
【0054】
本発明の別の側面においては、磁性ビーズが、タンパク質様分子を提示するように修飾され、次いで、本発明の方法に従って、やはりタンパク様であってもよい金コロイドの集団へ付着されている(ある)標的種と相互作用するそれらの能力について試験されうる。細胞溶解産物または天然物試料のような複雑な試料混合物は分画されることができ、次いで単一のまたは僅かの別異の分子種を含有する画分が磁性ビーズに付着されることができる。磁性ビーズへの付着は、非特異的吸着または官能化されたビーズへの化学的カップリングによって容易にされることができる。これらビーズは、SAMのそれらの表面上への形成を容易にする為に、金で被覆されてもされなくてもよい。本発明の方法を使用して、コロイド不動化標的分子と相互作用する種を提示している少数のビーズが特定される。次いで、相互作用種が、粒子から脱着または切り離されることができ、そしてマススペクトル(MS)またはマトリックスレーザー脱着イオン化(MALDI)MSまたはペプチド配列決定技術のような標準的生化学分析技術を使用して同定されることができる。磁性ビーズに親和性タグとの相互作用を介して付着されたタンパク質は、親和性タグとの相互作用の競合的阻害によって分析の為に放されることができる。例えば、NTA−Ni部分を有している磁性ビーズは、ヒスチジンタグ付種を選択的に捕獲する。そのHisタグ付種は、加えられたイミダゾールで相互作用を競合的に阻害することによってビーズから放されることができる。
【0055】
また、複雑な混合物からの少数の別異の分子種が、分画なしで磁性ビーズに付着されてもよい;小さい数の分子が、少数の官能基を提示するビーズを使用することによって、または低濃度の複雑混合物と共に多数のビーズを使用することによって、各々のビーズ上に提示されることができる。
【0056】
さらに、分子生物学的技術が、単一のまたは少数の別異の種をビーズ上に提示する為に使用されることができる。このようにして、本明細書に記載されているin situ磁力的選択希釈技術は、特にプロテオミクスの研究に適用できる。1群の磁性ビーズが、cDNAライブラリーの遺伝子産物を提示するよう生成され、次いで、補助的信号発信要素をも有していてよい(複数の)集団のコロイド上に不動化された標的種と相互作用するそれらの能力について試験されることができる。cDNAライブラリーは、タンパク質を特異的にコードするゲノムの断片を含んでなる。cDNAライブラリーは、標準的技術を使用して容易に生成されることができ、そして興味の対象である株細胞から広く入手可能である。タンパク質のビーズまたはコロイドへの付着を容易にする為に、cDNAライブラリーが、親和性タグ発現ベクターの中に1まとまりでまたは別々に挿入されることができる。例えば、親和性タグベクターは、ヒスチジンタグ付またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)タグ付タンパク質を生成する為に使用される。次いで、細胞がその結果的に生じるプラスミドDNAで形質移入されうる。当業者が知っている様に、細菌性細胞は一般的に単一のプラスミドを取り込む;このようにして、cDNAプラスミドのプールが、同時に複数の細胞中へ形質移入され、アガロース上で増殖されることができ、そして各々のコロニーが統計的に形質移入プラスミドDNAの単一の種を含有することとなる。コロニーは採取され、そして標準的方法に従ってミニ培養される。
【0057】
次いで、細胞培養は増殖され、そして標準的技術に従ってコードされたタンパク質を発現するように誘導される。その方法を加速する為、複数の細胞培養物(各々が単一のクローンを表している)が一緒にプールされ、1まとまりで増殖し、コードされたタンパク質を発現するように誘導される。次いで、そのプールされたタンパク質が、単一のビーズに付着される。このことは、ある標的種を提示するコロイドでアッセイされると、陽性信号を発生するビーズが相互作用種並びに無関係な種を同時に提示することを意味する。それ故に、もしプールされた複数の形質移入体が使用されれば、その操作は、ビーズ付着混合物のどの成分が実際にそのコロイド不動化種と相互作用したかを確認する為に次のように繰り返されることができる。ビーズ−コロイド混合物が、どの培養プールがその特定のビーズに付着されたかを確認する為に、ペプチドマイクロ配列決定法のような標準的分析技術に付されることができる。そのビーズに付着された混合物からの単一のタンパク質の同定によって、その形質移入体が由来するプールが特定される。その個々の形質移入体のアリコートが確保され、各々の形質移入体がタンパク質を発現するように別々に増殖され誘導され、次いで、それが別々に1組のビーズに付着される。次いで、そのアッセイは、単一の相互作用性成分を同定するまで繰り返される。
【0058】
タンパク質精製は、そのタンパク質に取り込まれた親和性タグの結合パートナーを示す磁性ビーズを使用することによって簡略化されうる。また、発現されたタンパク質が、粗製混合物からの親和性タグ相互作用を介して磁性ビーズに付着されても、標準的精製の後にされてもよい。
【0059】
コロイド−ビーズ不動化種のような、相互作用種の分析の説明が引き続く。
コロイド不動化種と相互作用する種を提示する磁性ビーズは、種の間の相互作用の完了に因って、コロイド層で被覆されることとなる。これらビーズは、電子信号を発生する。In situ磁力的選択希釈法の後、磁性ビーズが、それらの付着されたコロイドと一緒に、推定上の相互作用種の同一性を確認する為に、MS、MALDI MS、ペプチド配列決定法(エドマンマイクロ配列決定法のようなもの)等のようなそれらが酵素切り離し段階を包含してもよい分析技術にかけられうる。不動化されたタンパク質は、親和性タグ−ビーズ相互作用の競合的阻害、酵素による消化、酸溶離及びレーザー脱着を包含するがこれらに限定されない種々の方法による分析の為に、ビーズ及びコロイドから除外されることができる。例えば、ニトリロトリ酢酸/ニッケル(NTA−Ni)基を提示する表面への付着を容易にするようにヒスチジンタグと共に発現されたタンパク質は、イミダゾールの導入によって放されることができる。また、タンパク質は、トリプシンでの切り離しを使用して支持物から除外されることができる。分子は、レーザーイオン化脱着によって粒子から除外され、次いで、MSのような自動化分析システムに直接投入されてもよい。
【0060】
本発明の1つの方法は、多数の推定上の相互作用種の壮大な並行分析を提供する。そのようなシステムは、ヒトゲノム全体からの遺伝子産物のタンパク質相互作用ネットワークを解読するのに、特に有用である。
【0061】
この場合には、ゲノム全体をコードするcDNAライブラリー、疾患関連遺伝子のサブセットまたはライブラリーが、離れた場の別異のアリコートで提供される。各々のcDNA断片が、別々にタンパク質発現ベクター中に挿入される。発現されたタンパク質のビーズまたはコロイド粒子への付着を容易にする為に、親和性タグベクターが使用されうる。細胞が、そのプラスミドDNAで別々に形質移入され、そしてタンパク質発現が誘発される。この時点で、親和性タグを有するタンパク質が、その親和性タグについての結合パートナーを有するビーズまたはコロイドと別々に混合される。このようにして、各々の粒子が単一のタンパク質種を提示することとなる。例えば、ヒスチジンタグを有するタンパク質の第1組は、ニトリロトリ酢酸(NTA)ニッケル部分を有する磁性ビーズの第1組に付着される;NTA−Ni(II)はヒスチジンの伸張部に結合する。グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合部分を有するタンパク質の第2組は、GSTの結合パートナーであるグルタチオンを提示する金コロイドに付着される。異なる粒子タイプ、即ち、コロイドVSビーズが、異なる親和性タグを有する必要はない。しかしながら、各々の粒子は、その表面に表示されるタンパク質を独自に特定する標識を有する。好ましい態様においては、この標識はDNA配列であり、そして金コロイドは電気活性信号発信部分も示す。
【0062】
上で記載された本発明の方法によれば、第1タンパク質組を有する磁性ビーズが、第2タンパク質組及び電気活性信号発信部分を有する金コロイドと混合される。その溶液は、電極アレイの上に据えられる。電極アレイの各々のパッドの真下に、別々に制御できる電磁石がある。コロイド上に表示されるタンパク質が、磁性ビーズ上に表示されるタンパク質と相互作用できるようにされる。電子的信号発信コロイドに付着されたタンパク質が磁性ビーズ上のタンパク質と相互作用すると、その複合体が、その電極にリクルートされた時に電子的信号を変換することを想起のこと。磁性ビーズだけではこの信号を提供することはできない。少しの間インキュベートした後、全ての電磁石が一斉にオンにされる。陽性信号を示すパッドの下の電磁石が“オン”に保たれる一方で、信号を生じなかった電磁石は、コロイド不動化パートナーと相互作用しなかったビーズを放す為に解除される。出入り口が開けられ、放されたビーズが洗い去られる。流体が、残っているビーズを希釈する為に相互作用室に導入され、そして陽性を示したパッドの下の電磁石が解除される。この方法は、統計的に信号発信コロイドが付いたビーズだけが残っていることが確信されるまで繰り返される。
【0063】
各々の磁性ビーズ及び各々のコロイドは、付着されたタンパク質の同一性をコードするDNA鎖を有することができる。この時点で、一本鎖複合DNA片がその相互作用室に加えられる。各々のDNA鎖は、2つの部分を含んでなる:一方の終末は磁性ビーズ上のDNA配列に相補的であり、そして他方の終末はコロイド上の配列に相補的である。ビーズ及びコロイド上の配列の全ての可能な組み合わせが表される。そのDNAは、ビーズ−コロイド複合体と自由に相互作用できるようにされている。未結合DNAが、相互作用室から洗い出される。磁性ビーズ上の相補的配列及びコロイド上の相補的配列に同時に結合するDNA鎖が、どのタンパク質が互いに相互作用するかという問題への“解答”に相当する。相互作用対の同一性を明らかにする為には、ペプチドマイクロ配列決定法を行うのではなく、単に、結合DNA解答を溶離させ、そしてそれらをDNA配列決定法に提出するのである。各々のDNA鎖の配列は、各々のタンパク質を特定するDNAコードの相補物である。
【0064】
一本鎖DNAを消化する酵素が、DNAの未結合部分を除去する為に、ハイブリダイゼーション及びリンスの後にその解答に加えられうる。このようにして、一方の粒子だけに結合し他方には結合しなかったDNAの鎖は、解答として読み取られない。一本鎖DNAを末端から消化するE.coliDNApolIのような3’及び/または5’エクソヌクレア−ゼ活性を有する酵素が、DNAの継目を消化しないので好ましい。
【0065】
タンパク質の組をコードする為に必要とされるDNAの長さは、その組の中の別異の種の数と相関関係にある。このDNA“タグ”の長さは、ハイブリダイゼーションを破壊することなく許されるミスマッチ塩基の数にも、正比例する。この為、短いDNA鎖が好ましい。温度及び塩濃度のような条件も、ホルムアミドのような化学物質の添加と一緒に、完全にマッチしたDNAだけが確実にハイブリダイズするよう最適化されることができる。
【0066】
また、磁性ビーズ−コロイド複合体は、各々の電極パッドの真下にある電磁石の逐次的解除によって、DNA“解答”鎖の導入の前に、相互作用室から別々に放出されることができる。次いで、各々の相互作用複合体が離れた場に向けさせられ、そこで、全ての可能なDNA解答が導入される。DNAハイブリダイゼーションへの立体的干渉を和らげる為、DNA解答鎖の導入の前に、その相互作用タンパク質パートナーが各々の粒子から解離され、そして孤立した場から除去されることができる。DNA鎖が、タンパク質−タンパク質相互作用の不存在下、ビーズ及びコロイドに同時にハイブリダイゼーションするようにされる。非相互作用性DNA種が、例えば粒子をペレット化し上澄液を除去することによってすすぎ去られる。DNAハイブリッドの解離に適した緩衝液が加えられ、次いで、ペレット化された粒子及び、その上澄液に含有される、相互作用タンパク質の同一性をコードするDNAが、標準的配列決定方法またはDNAアレイチップへのハイブリダイゼーションによって配列決定される。
【0067】
コロイド上のタンパク質を導入する前に磁性ビーズ上のタンパク質が互いに結合するのを防止する為に、磁性ビーズは、(一まとめに、または別々に)加えられ、そして直ちに電極アレイに磁力で引き寄せられることができる。インキュベーション時間の後、電磁石が解除され、そして選択及び希釈の第1ラウンドの前に、溶液中で遊離状態でインキュベートされる。
【0068】
また、ビーズ及びコロイドに付着された成分は、種のプールであることができる。
上に記載された磁力での選択/希釈方法は、分析を確実に簡略化し、そして実験の正確性を確実に高める。しかしながら、DNAハイブリッド解答の添加だけで相互作用対の同一性を解明する際には、絶対的に必要な訳ではない。
【0069】
コロイドに付着された信号発信メカニズムは、電子的である必要はなく、またコロイドに限定される必要もない。例えば、コロイドがある表面上に凝塊形成する時にそれらが付与する赤色は、ビーズ上の種がコロイド上の種と相互作用したことを示すインジケーターとして役立ちうる。この場合には、そのビーズは磁性である必要はない。また、ある蛍光部分をそのコロイドに付着させてもよい。インキュベーション時間の後、そのビーズ(磁性であってもなくてもよい)が、非相互作用性コロイドを含有する溶液が除去されうるように、集結されてもペレットにさてもよい。次いで、蛍光性ビーズが、非相互作用性ビーズから分離され、そして相互作用パートナーの同一性を明らかにする為に分析される。
【0070】
上の記載中においては、cDNAライブラリーからの“タンパク質”がビーズ及びコロイドに付着されるが、本発明は、広範な推定上相互作用種の粒子への付着を想定する。これら種には、化合物、化合物の前駆体、反応性基、タンパク質複合体、核酸−タンパク質複合体、胞子、細胞、核酸、ペプチド及び薬物候補が含まれるが、それらに限定されない。これら種は、親和性タグ相互作用、非特異的結合、特異的結合を介して、または共有結合での化学カップリングを介してコロイド及びビーズに付着されることができる。
【0071】
さらに、磁性ビーズ及びコロイドに付着された同定タグは、核酸に基づく必要はない。ビーズ−コロイド複合体が、電極パッドから別々に放され、そして、そのビーズ上のタグが、解読される離れた場に向けられうる。同定タグには、核酸タグ、高周波タグ、蛍光性タグ、粒子に付随した蛍光、及び化学的タグが含まれうるが、それらに限定されない。
【0072】
本発明の種々の方法は、別々の結合パートナーではなく、相互作用モチーフを同定する為に使用されてもよい。この特別な用途の為に、タンパク質の第1異種集団が1組の磁性ビーズに付着され、そしてタンパク質の第2異種集団が1組のコロイドに付着される;各々の粒子は単一の種を提示する。本明細書において記載される磁力での選択希釈法の後、ビーズ−コロイド複合体が、相互作用モチーフを同定する為にプール配列決定技術に付される。個々のコロイド付きビーズが分けられる。それによって、各々の磁性ビーズが、コロイド付着分子の異種集団によって結合された単一の種を提示する。相互作用性分子は、親和性タグ相互作用の競合的阻害によってそれらの粒子支持体から放される。相互作用性複合体は、一般的な酵素消化、例えばトリプシンによる消化に付される;相互作用領域は、消化から保護される。次いで、複合体は、N−末端から相互作用領域または相互作用モチーフが始まるポイントまで消化するN−末端ぺプチダーゼで消化される。消化の後、その相互作用性分子が、酸溶離を介して互いから放される。次いで、その混合物が、典型的にはエドマンマイクロ配列決定を包含するプール配列決定技術に付される。プール配列決定の結果、どこにコンセンサスモチーフがあろうとそれらのアミノ酸の同一性が明確になる一方で、他の領域はノイズとして現われる。
【0073】
HPLC及び同様の技術が、配列決定分析の前に、相互作用種を分離する為に使用されてもよい。
また、コロイド付きビーズが分けられた後、第1コロイド付着種が、親和性タグ−コロイド相互作用の競合的阻害を介してそれらの支持体から放されることができる一方で、タンパク質の第2組は、ビーズに結合されたままでいられるようにされる。これは、異なる親和性タグ相互作用を介してタンパク質をビーズに結合させることによっても、種をビーズに共有結合でカップリングさせることによっても達成されうる。これで、酵素消化が行われる一方で、タンパク質対がビーズに結合されたままとなる。この操作が、ビーズに直接的に付着されていない第1タンパク質を優先的に消化する一方で、第2ビーズ付着種を保護する。消化産物は、ビーズを集結させ上澄液を廃棄することによって、容易に除去されうる。次いで、第1種が、酸溶離または類似の技術によってその結合パートナーから溶離されることができる。次いで、消化された第1種を含有する上澄液が、(複数の)コンセンサス結合モチーフを解明する為に、プール配列決定技術に付される。第2種は、ビーズから放されそしてプール配列決定法に付されることができる。また、その操作は、ビーズに付着された第1種またはその第1種に由来するコンセンサス配列と、コロイドに付着された第2種で繰り返されてもよい。
【0074】
本発明の方法は:コロイド上に提示された単一の種とビーズに付着された多くの種;コロイドに付着された多くの種とビーズに付着された多くの種;またはコロイドに付着された多くの種とビーズに付着された単一の種;で行われうる。さらに、各々が単一の別異の種を提示する粒子の混合集団が使用されてもよいし、または混合された種を提示する粒子の混合集団が使用されてもよい。本発明の別の側面においては、相互作用性コロイドの層で被覆された磁性ビーズが、差のある質量に基づいて電磁的に選択される。また、コロイドは、推定上の結合パートナーだけでなく、(複数の)磁性ビーズと複合体を形成する時に差のある電磁的特性を与える部分をも提示するように修飾されうる。次いで、これらコロイドを付けた磁性ビーズは選択され、分離され、そして粒子不動化相互作用パートナーの同一性を明らかにする為に分析される。
【0075】
本発明のさらに別の側面においては、ビーズは磁性である必要はない。コロイド−ビーズ複合体は、沈降、遠心分離によって、または補助的信号発信要素を提示してもしなくてもよいコロイドが付けられたビーズを物理的に除外することによって、非結合コロイドから分離されうる。
【0076】
同様に、補助的信号発信要素を有するかまたは有しない推定上の結合パートナーを提示する粒子は、コロイド状である必要はない。例えば、脂質にカップリングされたフェロセン誘導体のように、分子が、信号発信部分を携えてリポソームに直接的に取り込まれうる。また、分子が、親和性タグ相互作用を介して親和性タグについての結合パートナーをも取り込むリポソームへ付着されうる。
【0077】
本発明の方法は、各々が単一の種を提示するコロイド、または1を超える種を提示するコロイドの異種集団を使用して行われうる。本明細書において記載されているように、粒子に付着されることができる種には、タンパク質、クリングルドメイン(kringle domain)のようなドメインまたはタンパク質の断片、小分子、天然物、及び薬物が含まれるが、これらに限定されない。
【0078】
電気活性信号発信要素を提示しないコロイドも、追加的信号発信要素を表示するコロイドも本発明の側面で使用されることができる。例えば、コロイドは、電気活性部分、並びに蛍光性部分(本明細書における定義により、リン光性部分を包含する)を提示するように誘導化されることができる。コロイドの各々の組は、異なる蛍光の色を提示することができる。FACS(蛍光活性化セルソート)分析は、磁力での選択の後であるが各々のビーズに付着された分子種の同定の前に、異種粒子複合体を区分けする為に使用されうる。コロイド付き磁性ビーズも、電磁的方法によって分離されことができる。さらに、補助的信号発信要素を有さないコロイドが、本発明の側面で使用されることができる。これらコロイド付きビーズは、粒子上の金コロイドの凝塊形成がそれらを赤色に染める為、視覚で確認されうる。さらに、例えば、それらの大きさに相関して本来的に蛍光を発するナノ粒子が、信号発信する為と表面付着生体分子を特定する為のどちらにも使用されることができる。
【0079】
技術水準を超える本発明の側面の1つの特質は、相互作用種の“多重”同定及び分離を可能とすることである。この能力は、タンパク質である遺伝子産物の間の可能な相互作用の数が莫大である為、プロテオミクスの分野で、特に有用である。現在約40,000と見積もられるヒトゲノムにおける遺伝子の数について、相互作用ネットワークを逐次的pair-wise試験によって確認することは、8×108という最少の実験を包含することになる。粒子様支持体に付着された相互作用種の分離は、相互作用モチーフの同定を包含する相互作用種の分析を簡略化してくれる。さらに、推定上の結合パートナーの固体支持体への付着が、相互作用しなかった種を提示した粒子の回収及び再使用を可能とすることになる。
【0080】
【実施例】
実施例1
タンパク質−タンパク質相互作用の壮大な並行分析:ヒトプロテオームの相互作用マップの解明
以下の予言的な実施例は、タンパク質−タンパク質相互作用の壮大な並行分析をどのように行うかを説明し、それは、タンパク質がまだ特徴付けられていない時に特に有用である。ここでは、この方法が、ヒトプロテオームのタンパク質相互作用マップを解明する為に使用される。サブセットの、または全セットのプロテオームのタンパク質が、発現タンパク質の、粒子の組への付着が容易にできるように親和性タグと一緒に発現される。粒子不動化タンパク質が一緒にプールされ、そして相互作用できるようにされる。相互作用対が、磁力での選択/希釈過程の反復によって、プールされた混合物から選択される。その選択/希釈過程の後、相互作用パートナーの同一性が確認される。その選択段階が、非相互作用タンパク質を分析する必要性を排除することによって、問題の複雑さを減少させる。
【0081】
タンパク質とそれらのコーディングDNA分子が、両方を共通の粒子またはビーズ上に同時不動化することによって互いに間接的に連結され、そこで各々の粒子(またはビーズ)が単一のタンパク質種及びそのコーディングDNAを提示する。発現タンパク質をそのコーディングDNAに連結することが、選択/希釈過程の後の、相互作用タンパク質の各々の組の特定を加速する。各々のタンパク質及びそのコーディングDNAが、2つの異なる種類、つまり、リクルートできる粒子及び信号発信粒子の粒子上に不動化される。より小さい信号発信粒子が各々のより大きなリクルートできる粒子の周りに衛星粒子を形成できるように、粒子の大きさも異なっている。本実施例においては、各々のタンパク質とそのコーディングDNAは、単一の4〜10ミクロンの磁性ビーズ上、並びに直径が4〜40nmで電気活性信号発信体を有するたくさんの流体懸濁性ナノ粒子上に不動化される。磁性ビーズ上の第1種が、信号発信ナノ粒子上の第2種と生物学的に相互作用すると、そのリクルートできる粒子は、信号発信粒子に“連結された”ことになる。次いで、これら異種粒子複合体は、磁力で感知性電極にリクルートされ(図6を参照のこと)、そこでそれらは電子的信号または電気化学信号のような信号を送達することができる。多重分析を容易にする為に、それら粒子は、個々にアドレスで位置付けることのできる多くの電極パッドを有する電極アレイへ磁力で誘引される。各々の電極パッドの真下には、各々のパッド上の磁場が選択的にオフ及びオンにされることができるように、個々に制御できる電磁石がある。しかしながら、信号発信粒子に連結されず信号を送達することができない磁性粒子も、陽性信号を送達する同じ電極パッドにリクルートされることができる。これら非信号発信磁性ビーズは、パッドから電磁力で放され、そして相互作用槽から洗い出される。磁性粒子上の種と相互作用しない信号発信ナノ粒子は、均質な懸濁状態のままで信号を送達しないが、これも相互作用槽から洗い出される。これら掃出機能は両方とも、相互作用複合体を保持するように陽性信号を送達する電極パッドの真下の磁場を維持する一方で、陽性信号を送達しないパッドの真下の磁場が非相互作用磁性ビーズを放す為にゼロにされることによって達成される。出入り口150(図6)が開放され、そして流体が、相互作用槽から洗い出され、非相互作用磁性ビーズ及び非相互作用ナノ粒子を運び去る。その出入口が閉じられ、全ての磁場がゼロにされ、そして粒子を再懸濁して再分配するように機械的攪拌をしながら、更なる緩衝液が第2出入り口160を通じて加えられる。全ての電極パッドの真下の全ての磁場が再びオンにされ、そして、統計的に、陽性信号を送達する各々のパッドが、たくさんの信号発信ナノ粒子に結合された単一の磁性ビーズを含有するまで、選択/希釈過程が繰り返される。
【0082】
相互作用タンパク質の同一性を確認する為に、その寸法が電極アレイの寸法にに一致している磁性ピンのアレイが、電極アレイの上に並列に置かれ、そして全電極アレイの真下の磁場がゼロにされ、各々の磁性ピンが単一の異種粒子複合体を捕獲する。負荷を持ったピンアレイが、その各々の穴がDNA増幅試薬を含有する溶液で満たされている適合寸法の多穴プレート中に浸される。それぞれのコーディングDNA配列(ナノ粒子及びビーズ上に不動化されているもの)は、PCRまたは類似の技術によって増幅され、そして相互作用タンパク質の各々の組の同一性を明らかにする為に配列決定される。実験の個々の側面が、以下に詳細に説明される。
タンパク質の調製
プロテオームの各々のタンパク質メンバーをコードするDNA配列が、細菌性タンパク質発現ベクター中に挿入される。その発現ベクターは、この場合には(His)6である親和性タグ、Gal4コンセンサス配列のタンデム反復、及びタンパク質同定配列の側面にあるPCRプライマーが結合できる2つの配列を有する。ヒスチジンタグは、発現タンパク質の粒子への付着を容易にする。そのGal4コンセンサス配列が、認識モチーフと、この場合にはGST-Gal4融合タンパク質である粒子不動化酵母菌DNA結合性ドメインとの間の相互作用を介して、そのコーディングDNAをその粒子につなぐように働く。Gal4(aa'1-100)のDNA結合性ドメインが、コンセンサス配列CGGattAgAagcCgCCGAGに結合し、そしてそのGSTがその粒子上のグルタチオン部分に結合する。タンパク質は、無関係なタンパク質及び細胞残骸の発生量を減少させる為に、無細胞翻訳系中で別々に発現される。タンパク質発現の後、各々の発現混合物は、そのコーディングDNA及びその発現タンパク質を含有する。各々のタンパク質発現混合物が、2のアリコートに分割される。単一の磁性ビーズ(直径が4〜10ミクロン)が、第1アリコートに加えられ、そしてある量のNTA−グルタチオン−SAM被覆ナノ粒子が第2アリコートに加えられる。粒子はペレット化され、粒子と結合性していないタンパク質を除去する為に洗浄される。粒子及びビーズが、プール当たり1000種のサブセット中に一緒にプールされ、そして磁力での選択/希釈及び電気化学分析に付される。このようにして、未確認のタンパク質が、対応するコーディングDNAにも結合する同じビーズまたは粒子に結合されることができる。
ナノ粒子の調製
金ナノ粒子(直径=4〜25nm)が、:
a)ヒスチジンタグ付きタンパク質を捕獲するNTA(ニトリロトリ酢酸)−Ni++;
b)グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質に結合するグルタチオン;
c)電子的信号または電気化学信号を送達することができるレゾックス活性部分であるオクタメチルフェロセン;
d)粒子凝集を防止する為のカルボキシレート;及び
e)非特異的吸着に抵抗するトリエチレングリコール
を提示する異種自己集成単層(SAM)で誘導化される。実質的には、あらゆる生物学的種がコロイド上に不動化されうる。
電気化学分析
CH Instruments(Austin, TX)からのモデル630電気化学的アナライザーが、磁性ビーズ上に不動化された種と、レゾックス活性金属をも有するコロイド上に不動化された種の間の相互作用を検出する為に使用される。その装置は、多重検出を容易にするように修飾される。この場合には、レゾックス活性金属は、フェロセン誘導体である。電極アレイのパッドは、個々にアドレスで位置付けることができ、そして作動電極として働く。この場合には、そのパッドは金で被覆され、そして電導性自己集成単層で誘導化される。Ag vs.Ag/Cl参照電極が、Pt補助剤と共に使用される。電極は、10Hzの周波数で25mVの過電圧を有する交流ボルタンメトリ−(Alternating Current Voltammetry(ACV))を使用して走査される。
個々にアドレスで位置付けることができる電磁石の間に挟まれた電極アレイのデザイン
300〜500の電極パッド110を有する電極アレイ100(図6)が、Ni++上を金でめっきすることによって構築される。諸電極パッドは、横に立てて50〜500ミクロンであって、磁性ビーズをリクルートし次いでパッド表面に保持する為に磁場勾配が発生されることができるように、個々にアドレスで位置付けることができる数組のHelmholtz電磁石120の間に挟みこまれる(図6)。その電流の方向は、洗い去る為かまたは再配分する為にその表面から磁性ビーズを放すことが望ましい時には、磁場をゼロにするよう反転される。熱が溶液中のタンパク質を変性させないよう、相互作用槽を電磁石アレイから熱的に確実に隔離する為、断熱材130の層が、電磁石と相互作用槽140との間に据えられる。
タンパク質の組及び電極パッドの数の計算
プロテオーム全体のタンパク質相互作用マップを作成する為、プロテオームを複数のサブセットに分ける必要があり、次いで、それらサブセットは、いずれの他のサブセットとも相互作用について試験される。興味の対象である約50,000のタンパク質があると仮定すると、プロテオームは各々1000タンパク質の50組に分けられる。次いで、1000タンパク質の各々のグループが、1000からなるいずれの他のグループとも相互作用について試験され、結果的に50×50マトリックス、即ち2500の別々の実験が生じる。各々のサブセットにおけるタンパク質の数は、各々のアレイ中の電極パッドの数を決定する。各々のタンパク質が単一の結合パートナーを有すると仮定すると、50サブセットのタンパク質の1サブセットとの相互作用を試験された時には、各々のタンパク質は、そのパートナーを見出す1/50の機会を有することになる。しかしながら、各々のタンパク質は、大抵平均して5つの関連ある結合パートナーを有するので、サブセット内では結合パートナーを見つける確率は1/10に向上する。これは、1つのプールされた相互作用混合物中の2000のタンパク質について、200が陽性信号を送達するということを意味し、それは、電極アレイが300〜500のパッドを有すべきであることを示唆する。非特異的結合の発生からの低レベル信号は、関連ある結合性物質による競合的阻害の故に極微である。しかしながら、それを下回る信号が陰性として数えられる信号のしきい値がセットされる時には偽陽性信号の発生は最小限度になる。相対的親和性は、第1結合種及び第2結合種の、その第1種及び第2種が結合する第3標的タンパク質との相互作用の度合いを比較することによって確認される。
実施例2
結合パートナー候補の大きなプールで単一の標的タンパク質の結合パートナーを確認する
この予言的な実施例は、推定上の結合パートナーの大きなプールから、単一の標的タンパク質と相互作用するタンパク質をどのように同定するかを説明する。その大きなプールからのタンパク質が、上で実施例1において記載された通りにに調製され、そして信号発信ナノ粒子上にだけ不動化される。その標的タンパク質は、1組の磁性ビーズ上に不動化される。標的タンパク質の同一性がわかっているので、そのコーディングDNAを同時不動化させる必要はない。相互作用パートナーが、上に記載された電気化学的分析によって選択される。
実施例3
FACS分析による相互作用タンパク質パートナーの選択
この実施例は、単一の標的タンパク質の結合パートナーをどのように同定するかを説明する。その標的タンパク質は、直径が4〜25ミクロンである1組のビーズ上に不動化される。推定上の結合パートナーは、上に記載された通りに調製されることも、cDNAライブラリーから生成されることもでき、それらのコーディングDNAと一緒に蛍光信号発信部分を有するナノ粒子上に同時不動化される。ビーズ不動化タンパク質がナノ粒子上に不動化された種と相互作用すると、そのビーズに蛍光性ナノ粒子が付くことになり、FACS(蛍光活性化セルソート)分析によって分離されることができ、その後に各々の相互作用種の付着DNAが配列決定されて、結合パートナーが同定される。
【0083】
当業者は、本明細書に列挙された全てのパラメータが例示的であることが意図されていること、及び、実際のパラメータが本発明の方法及び装置がそれについて使用される具体的な適用に依存することを容易に理解するだろう。それ故に、前述の態様は実施例としてだけ表され、本発明は、添付された請求項及びその均等物の範囲内で、具体的に記載された方法とは別の方法で行われうるものと理解されるべきである。請求項において、“包含する”、“担持する”、“有する”等の語は、それらを包含する“含んでなる”としての意味を有するが、それに限られない。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、コロイド不動化タンパク質と第1磁性ビーズ不動化薬物候補の間の結合であって第2磁性ビーズ不動化薬物候補との間ではない結合を概略的(残りの図でもそうする)に示したものである。
【図2】 図2は、磁力物を備え付けられた電極近傍における混合物の、磁性ビーズに関して不動化されかつコロイド不動化タンパク質に結合した第1薬物候補、及びやはり磁性ビーズに不動化されているがコロイド不動化タンパク質とは結合していない第2薬物候補を示す。
【図3】 図3は、図2の磁性ビーズと、それに不動化され磁力物を備え付けられた電極の表面に引き寄せられた成分を示す。
【図4】 図4は、一方の電極に関連した磁力の選択的脱活性化後における、図3の配置を示す。
【図5】 図5は、残った電極に関連した磁力の脱活性化と双方の電極に関連した磁力の再活性化後の図4の配置を示す。
【図6】 図6は、連続表面上の複数の場で磁力を適用しそして放つ為の多重装置を示す。
Claims (26)
- 第1物品及びそれに関して不動化された第1の化学的または生物学的物質を第1場へ磁力で引きよせ、かつ、第2物品を第2場へ磁力で引き寄せ、そして、
該第1物品を該第1場で保持しながら、電極に関連して磁力を選択的に脱活性化することによって該第2物品を該第2場から選択的に磁力的に放すこと、
を含んでなる方法であって、
該第1の物質がその結合パートナーに連結されており、
該第1及び第2場が、ある表面の予め決められたそれぞれの第1及び第2区域である、上記方法。 - 請求項1記載の方法であって、該第1化学的または生物学的物質が薬物候補である方法。
- 請求項1記載の方法であって、該第1物品が磁性物品である方法。
- 請求項3記載の方法であって、該第1及び第2物品の各々が磁性ビーズである方法。
- 請求項1記載の方法であって、電磁石が、該第1及び第2の予め決められた表面区域の各々に付けられ、該第1または第2物品をそれぞれ該第1または第2の予め決められた表面区域に引き寄せるように位置付けされた方法。
- 請求項1記載の方法であって、該第1及び第2の予め決められた表面区域の各々が電極を含んでなる方法。
- 請求項6記載の方法であって、該予め決められた表面区域の各々が電極を含んでなり、そして電磁石が該第1及び第2の予め決められた表面区域の各々に付けられ、該第1または第2物品をそれぞれ該第1または第2の予め決められた表面区域へ引き寄せるよう位置付けされた方法。
- 請求項1記載の方法であって、該第1物品が、該結合パートナーに関して不動化された信号発信体に不動化された方法。
- 請求項8記載の方法であって、該第1物品がそれに固定された該第1物質を担持し、該第1物質の結合パートナーが該第1物質に連結されており、そして該信号発信体が該結合パートナーに関して不動化されている方法。
- 請求項9記載の方法であって、該第1物品が磁性ビーズを含んでなり、コロイド粒子が該結合パートナーに連結されており、そして該第2物品が、それに不動化された第2化学的または生物学的物質を担持する磁性ビーズを含んでなる方法。
- 請求項10記載の方法であって、該信号発信体が該コロイド粒子である方法。
- 請求項10記載の方法であって、該コロイド粒子がそれに関して不動化された補助的な信号発信体を含む方法。
- 請求項12記載の方法であって、該信号発信体が該コロイド粒子に固定されたメタロセンである方法。
- 請求項13記載の方法であって、該予め決められた表面区域の各々が電極を含んでなり、そして電磁石が該第1及び第2の予め決められた表面区域の各々に付けられ、該第1または第2物品をそれぞれ該第1または第2の予め決められた表面区域に引き寄せるように位置付けされた方法。
- 請求項13記載の方法であって、該メタロセンがフェロセンである方法。
- 請求項13記載の方法であって、該第1物品が磁性ビーズを含んでなり、コロイド粒子が該結合パートナーに連結されており、そして、該第2物品が、それに不動化された第2化学的または生物学的物質を担持する磁性ビーズを含んでなる方法。
- 請求項15記載の方法であって、該第1及び第2物質の各々が薬物候補である方法。
- 請求項15記載の方法であって、該引き寄せ工程が薬物候補の存在下で行われ、そして該第1及び該第2物質の各々が該薬物候補の潜在的標的である方法。
- 請求項1記載の方法であって、
複数の磁性ビーズであって各々がそれに関して不動化された化学的または生物学的物質を担持する磁性ビーズを提供し;
該ビーズを、複数のコロイド粒子であって各々が該化学的または生物学的物質の潜在的結合パートナーを担持しているコロイド粒子に曝露し;
該コロイド粒子のいくつかが化学的または生物学的物質/結合パートナー相互作用を介して該磁性ビーズのいくつかに結合するようにしながら、該磁性ビーズのいくつかはコロイド粒子へ連結させないでおき;
該磁性ビーズを、ある表面の予め決められた複数の場へ磁力で引き寄せ;
コロイド粒子が引き寄せられた第1表面場及び実質的にコロイド粒子を含まない第2表面場を確認し;そして
磁性ビーズを該第1表面場において保持しながら、電極に関連して磁力を選択的に脱活性化することによって磁性ビーズを該第2表面場から磁力的に放すこと
を含んでなる方法。 - 請求項19記載の方法であって、さらに
該第2表面場の近傍から放たれた磁性粒子を除去し;そして
磁力での引き寄せ、確認、及び引き放しの該段階を1またはそれを超える回数繰り返すこと
を含んでなる方法。 - 請求項19記載の方法であって、さらに
該第1及び第2表面場の近傍から放された磁性粒子を除去し;
磁性ビーズを該第1表面場から放し;そして
磁力で引きよせ、確認し、そして磁力的に引き放す該段階を1またはそれを超える回数繰り返すこと;
を含んでなる方法。 - 請求項21記載の方法であって、該繰り返し段階に先立って:
該第1表面場から放出された粒子を希釈する為の流体を加えること
をさらに含んでなる方法。 - 請求項20記載の方法であって、表面場におけるコロイド粒子の存在を視覚で検出することを含んでなる方法。
- 請求項20記載の方法であって、該コロイドに連結されたメタロセンを電磁的に刺激することによって表面場におけるコロイド粒子の存在を検出することを含んでなる方法。
- 請求項19記載の方法であって、該コロイドに連結したメタロセンを電磁力で刺激することによって表面場におけるコロイド粒子の存在を検出することを含んでなる方法。
- 請求項21記載の方法であって、少なくとも1の第1化学的または生物学的物質を同定することをさらに含んでなる方法。
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