DE60125388T2

DE60125388T2 - Magnetisches in situ dilutionsverfahren

Info

Publication number: DE60125388T2
Application number: DE60125388T
Authority: DE
Inventors: C. Cynthia Newton BAMDAD
Original assignee: Minerva Biotechnologies Corp
Current assignee: Minerva Biotechnologies Corp
Priority date: 2000-10-03
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: AU2001296579B2; JP2004510982A; US20100124789A1; JP4223804B2; US20020086443A1; ATE349011T1; AU9657901A; WO2002029411A3; CA2424119A1; EP1381440A2; JP2004531688A; CA2423630C; DE60125388D1; WO2002029411A2; US7585682B2; US20020098526A1; WO2002028507A3; EP1381440B1; CA2423630A1; WO2002028507A2

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren, Tests und Bestandteile zum Nachweis und zur Analyse der Bindung zwischen biologischen und chemischen Spezies und kann speziell für die Arzneimittelforschung verwendet werden.
Auf bestimmten Gebieten der Chemie und Biologie ist die Bestimmung von Bindungswechselwirkungen zwischen Molekülen von höchster Bedeutung. Dies gilt besonders im Zusammenhang mit Studien betreffend die Physiologie. Eine große Anzahl von chemischen und biochemischen Wechselwirkungen, die mit physiologischen Prozessen oder mit der Wechselwirkung von Chemikalien mit physiologischen Prozessen verbunden sind, umfassen die Erkennung von einer molekularen Entität durch eine andere. Eine Klasse von derartigen Wechselwirkungen umfasst die physiologische Aktivität von Pharmazeutika (Arzneimitteln). Ein genaues Verständnis der Wechselwirkung von Arzneimitteln mit physiologischen Entitäten und die Konzeption von und/oder die Forschung an Arzneimitteln, die physiologisch miteinander wechselwirken können, ist, natürlich, für die Gesellschaft von enormem Interesse.
Arzneimittelforschung wird typischerweise durch das Screenen einer großen Anzahl von Kandidatenarzneimitteln hinsichtlich der Wechselwirkung mit physiologischen Zielen wie beispielsweise Ziel-Rezeptoren oder -Proteinen erleichtert. Bekannte Techniken zum Arzneimittelscreenen umfassen das individuelle Studium von Kandidatenarzneimitteln hinsichtlich ihres pharmazeutischen Potentials, oft parallel mit zehnen, hunderten oder tausenden von anderen Arzneimittelkandidaten. In einem typischen Verfahren werden tausende von Arzneimittelkandidaten (eine Bibliothek), von denen von einem jeden bekannt ist, dass er wenigstens ein gewisses Potential für eine Art von pharmazeutischer Verwendung aufweist, auf ihre Aktivität in Verbindung mit einem spezifischen physiologischen Zielmolekül parallel studiert. Während diese und andere Techniken zum Screenen von Arzneimitteln und Studieren anderer chemischer oder biologischer Bindungswechselwirkungen bekannt sind, sind einige zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Es besteht ein Bedarf für verbesserte, abgewandelte und in einigen Fällen schnellere Techniken zum Studium derartiger Wechselwirkungen.
Die vorliegende Erfindung stellt, allgemein, Techniken zum Separieren von wechselwirkenden Bestandteilen aus einer Mischung mutmaßlicher Bindungspartner, Bestimmen der Identität eines unbekannten Analyten, Bestimmen, welche von einer Anzahl von Spezies an eine bekannte Spezies bindet, Bestimmen, ob eine Spezies in einer Mischung existiert, die an eine andere Spezies bindet, und/oder eine Kombination dieser und anderer Techniken bereit.
In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung das magnetische Ziehen eines ersten Gegenstandes und eines ersten chemischen oder biologischen Mittels, das relativ zu dem ersten Gegenstand immobilisiert ist, an eine erste Stelle, und Ziehen eines zweiten Gegenstandes an eine zweite Stelle. Der erste oder zweite Gegenstand wird selektiv von seiner Stelle freigesetzt, während der andere an seiner Stelle zurückgehalten wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Entscheidung, ob der erste oder der zweite Gegenstand freigesetzt wird, auf der Grundlage gefällt werden, ob der erste oder zweite Artikel einen Bindungspartner oder Analyten eingefangen hat. Wiederholte Schritte aus magnetischem Ziehen und Freisetzen können zum Isolieren eines einzelnen Bindungspartners eines Analyten aus einer Reihe möglicher Bindungspartner führen.
Andere Vorteile, neue Merkmale und Ziele der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung offenkundig werden, wenn sie zusammen mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet wird, die Schemata sind und die nicht als maßstabsgetreu gezeichnet gelten sollen. Bei diesen Figuren ist ein jeder oder fast jeder Bestandteil, der in verschiedenen Figuren dargestellt ist, durch ein einzelnes Bezugszeichen wiedergegeben. Aus Gründen der Klarheit ist nicht jeder Bestandteil in jeder Figur markiert, und es ist auch nicht ein jeder Bestandteil einer jeden Ausführungsform der Erfindung gezeigt, wo eine Darstellung nicht erforderlich ist, um den Fachleuten auf dem Gebiet zu erlauben, die Erfindung zu verstehen.
1 veranschaulicht schematisch (ebenso wie die anderen Figuren) das Binden zwischen Kolloid-immobilisierten Proteinen und einem ersten, auf einer magnetischen Perle immobilisierten Arzneimittelkandidaten, aber nicht einem zweiten, auf einer magnetischen Perle immobilisierten Arzneimittelkandidaten;
2 veranschaulicht einen ersten Arzneimittelkandidaten, der relativ zu einer magnetischen Perle immobilisiert und an Kolloid-immobilisierte Proteine gebunden ist, und einen zweiten Arzneimittelkandidaten, der ebenfalls an magnetischen Perlen immobilisiert ist, aber nicht an Kolloid-immobilisierte Proteine gebunden ist, in einer Mischung in der Umgebung von magnetisch ausgerüsteten Elektroden;
3 veranschaulicht die magnetischen Perlen von 2 und daran immobilisierte Bestandteile, die zu Oberflächen von magnetisch ausgerüsteten Elektroden gezogen sind;
4 veranschaulicht die Anordnung von 3 nach selektiver Deaktivierung von mit einer Elektrode verbundenen magnetischen Kraft; und
5 veranschaulicht die Anordnung von 4 nach Deaktivierung von mit der verbleibenden Elektrode verbundenen magnetischen Kraft und Reaktivierung von mit beiden Elektroden verbundener magnetischer Kraft.
6 veranschaulicht eine Multiplex-Vorrichtung zum Anlegen und Freisetzen einer magnetischen Kraft an mehreren Stellen auf einer durchgehenden Oberfläche.
Die internationale Patentanmeldung mit der Nummer PCT/US00/01997, eingereicht am 25. Januar 2000 von Bamdad et al., mit dem Titel „Rapid and Sensitive Detection of Aberrant Protein Aggregation in Neurodegenerative Diseases" (veröffentlicht als WO 00/43791 am 27. Juli 2000), die internationale Patentanmeldung mit der Nummer PCT/US00/01504, eingereicht am 21. Januar 2000 von Bamdad et al., mit dem Titel „Interaction of Colloid-Immobilized Species with Species on Non-Colloidal Structures" (veröffentlicht als WO 00/34783 am 27. Juli 2000), die gemeinsam besessene, ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/602,778, eingereicht am 23.6.2000 von Bamdad et al., mit dem Titel „Interaction of Colloid-Immobilized Species with Species on Non-Colloidal Structures"; und die gemeinsam besessene, gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/631,818, eingereicht am 03.08.2000 durch Bamdad et al., mit dem Titel „Rapid and Sensitive Detection of Protein Aggregation" sind alle für die vorliegende Erfindung relevant.
Definitionen:
„Kleine Moleküle", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül mit weniger als 5 Kilodalton, typischerweise weniger als 1 Kilodalton. Wie hierin verwendet, schließt „kleines Molekül" Proteine aus.
Der Begriff „Kandidatenarzneimittel", wie hierin verwendet, bezeichnet eine jegliche medizinische Substanz, die bei Menschen, Tieren oder Pflanzen verwendet wird. In dieser Definition sind Verbindungsanaloga, natürlicherweise vorkommende, synthetische und rekombinante Pharmazeutika, Hormone, Antibiotika, Neurotransmitter etc. umfasst. Dies umfasst eine jegliche Substanz oder einen jeglichen Vorläufer (ob natürlich vorkommend, synthetisch oder rekombinant), der hinsichtlich der Verwendung als ein Arzneimittel für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, oder einer anderen Erkrankung, die durch aberrante Aggregation gekennzeichnet ist, oder deren Prävention evaluiert werden soll. Die Evaluierung erfolgt typischerweise durch die Aktivität in einem Test, wie beispielsweise den Screening-Tests der vorliegenden Erfindung.
Eine Vielzahl von Arten von Partikeln können im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise bedeutet „flüssigkeitssuspendierbares Partikel" ein Partikel, das veranlasst werden kann, durch sich selbst in Suspension in einer Flüssigkeit zu verbleiben, in der es für die Zwecke der Erfindung verwendet wird (typischerweise eine wässrige Lösung), oder in Lösung gehalten werden kann durch Anlegen eines magnetischen Feldes, eines elektromagnetischen Feldes, Bewegung wie beispielsweise Rühren, Schütteln, Vibrieren, Beschallen, Zentrifugieren, Vortexen oder dergleichen. Ein „magnetisch suspendierbares" Partikel ist ein solches, das in einer Flüssigkeit durch Anlegen eines magnetischen Feldes in Suspension gehalten werden kann. Ein elektromagnetisch suspendierbares Partikel ist ein solches, das in einer Flüssigkeit in Suspension gehalten werden kann durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldes (z. B. ein Partikel, das eine Ladung trägt, oder ein Partikel, das modifiziert ist, um eine Ladung zu tragen). Ein „selbst-suspendierbares Partikel" ist ein Partikel, dessen Größe und/oder Masse gering genug ist, so dass es in einer Flüssigkeit in Suspension verbleiben wird, in der es verwendet wird (typischerweise eine wässrige Lösung), ohne die Unterstützung von, beispielsweise, einem magnetischen Feld, für wenigstens 1 Stunde. Andere selbst-suspendierbare Partikel werden, ohne Unterstützung, für 5 Stunden, 1 Tag, 1 Woche oder sogar 1 Monat, gemäß der vorliegenden Erfindung, in Lösung bleiben.
„Proteine" und „Peptide" sind in der Technik gut bekannte Begriffe und sind in der Technik hinsichtlich der Anzahl von Aminosäuren, die sie jeweils umfassen, nicht präzise definiert. Wie hierin verwendet, wird diesen Begriffen ihre in der Technik übliche Bezeichnung beigemessen. Im Allgemeinen sind Peptide Aminosäuresequenzen mit einer Länge von weniger als etwa 100 Aminosäuren, können aber Sequenzen von bis zu 300 Aminosäuren umfassen. Proteine werden im Allgemeinen als Moleküle mit wenigstens 100 Aminosäuren verstanden.
Wie hierin verwendet bezeichnet eine „Metallbindungsmarkierung" eine Gruppe von Molekülen, die an ein Metall befestigt werden können, das durch ein Chelat koordinativ gebunden ist. Geeignete Gruppen derartiger Moleküle umfassen Aminosäuresequenzen, typischerweise von etwa 2 bis etwa 10 Aminosäureresten. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Histidine und Cysteine („Polyamino-Markierung"). Derartige Bindungsmarkierungen, wenn sie Histidine umfassen, können als „Poly-Histidin-System" oder „Histidin-Markierung" oder „HIS-Markierung" bezeichnet werden und können an entweder dem Amino- oder Carboxy-Terminus vorhanden sein oder an einer jeglichen exponierten Region eines Peptids oder Proteins oder einer Nukleinsäure. Ein Poly-Histidin-System aus sechs bis zehn Resten ist für die Erfindung bevorzugt. Das Poly-Histidin-System ist auch funktionell definiert als eine Anzahl von konsekutiven Histidin-Resten, die an ein interessierendes Protein hinzugefügt sind, was die Affinitätsreinigung des sich ergebenden Proteins an eine Metallchelatsäule erlaubt, oder die Identifizierung eines Protein-Terminus durch die Wechselwirkung mit einem weiteren Molekül (z. B. einem Antikörper, der mit der HIS-Markierung reagiert).
„Affinitätsmarkierung" wird seine übliche Bedeutung in der Technik beigemessen. Affinitätsmarkierungen umfassen, beispielsweise, Metallbindungs-Markierungen, GST (in GST/Glutathion-Bindungsclips) und Streptavidin (in Biotin/Streptavidin-Bindung). An verschiedenen Stellen hierin sind spezifische Affinitätsmarkierungen im Zusammenhang mit Bindungswechselwirkungen beschrieben. Es soll verstanden werden, dass die Erfindung in einer Ausführungsform, die eine Affinitätsmarkierung verwendet, eine Reihe von individuellen Ausführungsformen umfasst, die jeweils die Auswahl einer der hierin beschriebenen Affinitätsmarkierungen umfasst.
Wie hierin verwendet bezeichnet „Chelat, das ein Metall koordinativ bindet" oder Metall, das von einem Chelat koordinativ gebunden ist, ein Metall, das durch ein Chelat-bildendes Mittel koordinativ gebunden ist, das nicht alle verfügbaren Koordinationsstellen auf dem Metall ausfüllt, wodurch einige Koordinationsstellen für die Bindung vermittels einer Metall-bindenden Markierung verfügbar bleiben.
Wie hierin verwendet definiert „Metall-bindende Markierung/Metall/Chelat-Verbindung" eine Verbindung zwischen einer ersten und zweiten Spezies, bei der eine erste Spezies relativ zu einer Metall-bindenden Markierung immobilisiert ist; und eine zweite Spezies relativ zu einem Chelat immobilisiert ist, wo das Chelat ein Metall koordinativ bindet, an dem die Metall-bindende Markierung auch koordinativ gebunden ist. Das US-Patent 5,620,850 von Bamdad et al. beschreibt ähnliche Verbindungen.
„Signalentität" bedeuten eine Entität, die in der Lage ist, ihre Existenz in einer speziellen Probe oder an einer speziellen Stelle anzuzeigen. Signalentitäten der Erfindung können jene sein, die durch das unbewaffnete menschliche Auge identifizierbar sind, jene, die isoliert unsichtbar sein können, aber durch das unbewaffnete menschliche Auge nachweisbar sein können, wenn sie in ausreichender Menge vorliegen (z. B. Kolloidpartikel), Entitäten, die elektromagnetische Strahlung auf einem Niveau oder innerhalb eines Wellenlängenbereiches absorbieren oder emittieren, so dass sie leicht mit dem Auge (unbewaffnet oder mit einem Mikroskop, einschließlich eines Elektronenmikroskopes oder dergleichen) oder spektroskopisch nachgewiesen werden können, Entitäten, die elektronisch oder elektrochemisch nachgewiesen werden können, wie beispielsweise Redox-aktive Moleküle, die ein charakteristisches Oxidations/Reduktionsmuster nach Exposition gegenüber entsprechender Aktivierungsenergie („elektronische Signalentitäten") aufweisen, oder dergleichen. Beispiele umfassen Farbstoffe, Pigmente, elektroaktive Moleküle, wie beispielsweise Redox-aktive Moleküle, fluoreszierende Molekülbestandteile (einschließlich, per definitionem, phosphoreszierende Molekülbestandteile), hochregulierende Phosphore, chemilumineszierende Entitäten, elektrochemilumineszierende Entitäten oder Enzymgekoppelte Signalmolekülbestandteile, einschließlich Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase. „Vorläufer von Signalentitäten" sind Entitäten, die selbst keine Signalfähigkeiten aufweisen mögen, aber nach chemischer, elektrochemischer, elektrischer, magnetischer oder physikalischer Wechselwirkung mit einer weiteren Spezies Signalentitäten werden. Ein Beispiel umfasst einen Chromophor mit der Fähigkeit, Strahlung innerhalb einer speziellen, nachweisbaren Wellenlänge nur nach chemischer Interaktion mit einem weiteren Molekül zu emittieren. Vorläufer von Signalentitäten sind von Signalentitäten unterscheidbar, sind aber von der Definition von „Signalentitäten", wie hierin verwendet, umfasst. Wie hierin verwendet bedeutet „befestigt an oder ausgeführt, um befestigt zu werden" im Kontext einer Spezies relativ zu einer anderen Spezies oder zu einer Oberfläche eines Gegenstandes, dass die Spezies chemisch oder biochemisch mittels kovalenter Bindung, Bindung vermittels spezifischer biologischer Bindung (z. B. Biotin/Streptavidin), koordinativer Bindung wie beispielsweise Chelat/Metall-Bindung oder dergleichen, gebunden ist. Beispielsweise umfasst „befestigt" in diesem Kontext mehrere chemische Bindungen, mehrere chemische/biologische Bindungen etc., einschließlich, aber nicht beschränkt auf, eine Bindungsspezies wie beispielsweise ein Peptid, das auf einer Polystyrolperle synthetisiert ist, eine Bindungsspezies, die spezifisch biologisch an einen Antikörper gekoppelt ist, der an ein Protein gebunden ist wie beispielsweise Protein A, das kovalent an eine Perle gebunden ist, eine Bindungsspezies, die einen Teil (vermittels Gentechnologie) eines Moleküls wie beispielsweise GST oder eines Phagen ausbildet, das/der wiederum spezifisch biologisch an einen Bindungspartner gebunden ist, der kovalent an einer Oberfläche befestigt ist (z. B. Glutathion im Falle von GST), etc. Als weiteres Beispiel ist ein an ein Thiol kovalent gebundener Molekülbestandteil so ausgeführt, dass er kovalent an eine Goldoberfläche befestigt werden kann, da Thiol Gold kovalent bindet. In ähnlicher Weise ist eine Spezies, die eine Metallbindungsmarkierung trägt, ausgeführt, um an einer Oberfläche befestigt zu werden, die ein Molekül trägt, das kovalent an der Oberfläche gebunden ist (wie beispielsweise Thiol/Gold-Bindung), wobei das Molekül ein Chelat präsentiert, das ein Metall koordinativ bindet. Eine Spezies ist auch ausgeführt, um an eine Oberfläche befestigt zu werden, wenn eine Oberfläche eine spezielle Nukleotidsequenz trägt und die Spezies eine komplementäre Nukleotidsequenz umfasst.
„Kovalent befestigt" bedeutet befestigt durch nichts anderes als eine oder mehrere kovalente Bindungen. Beispielsweise ist eine Spezies, die, vermittels EDC/NHS-Chemie, kovalent an ein Carboxylat-präsentierendes Alkylthiol kovalent gekoppelt ist, das wiederum an einer Goldoberfläche befestigt ist, an diese Oberfläche kovalent gebunden.
„Spezifisch befestigt" oder „ausgeführt, um spezifisch befestigt zu werden" bedeutet, dass eine Spezies chemisch oder biochemisch mit einer Oberfläche verbunden ist, wie oben im Zusammenhang mit der Definition von „befestigt oder ausgeführt, um befestigt zu sein" beschrieben, aber ausschließlich einer jeglichen nicht-spezifischen Bindung.
„Nicht-spezifisches Binden", wie hierin verwendet, wird seine übliche Bedeutung auf dem Gebiet der Biochemie beigemessen.
„Kolloide", wie hierin verwendet, bezeichnet Nanopartikel, d. h. sehr kleine, selbst-suspendierbare oder Flüssigkeits-suspendierbare Partikel, einschließlich jener, die aus Materialien hergestellt sind, wie z. B., anorganische oder organische, polymere, keramische, Halbleiter-Metall- (z. B. Gold), nicht-metallische, kristalline, amorphe Materialien oder eine Kombination. Typischerweise weisen Kolloidpartikel, die gemäß der Erfindung verwendet werden, einen Querschnitt in eine jegliche Richtung von weniger als 250 nm auf, bevorzugtererweise einen Querschnitt von weniger als 100 nm in einer jeglichen Richtung und in den meisten Fällen einen Querschnitt von etwa 2 bis 30 nm auf. Eine Klasse von Kolloiden, die für die Anwendung bei der Erfindung geeignet ist, weist einen Querschnitt von 10 bis 30 nm auf, und eine weitere einen Querschnitt von etwa 2 bis 10 nm. Wie hierin verwendet umfasst dieser Begriff die üblicherweise auf dem Gebiet der Biochemie verwendeten Definition.
Ein „Molekülbestandteil, der ein Metall koordinativ binden kann", bedeutet, wie hierin verwendet, ein jegliches Molekül, das wenigstens zwei Koordinationsstellen auf einem Metallatom besetzen kann, wie beispielsweise eine Metallbindungsmarkierung oder ein Chelat.
Wie hierin verwendet ist ein Bestandteil, der „relativ zu immobilisiert" ist, entweder an dem anderen Bestandteil befestigt oder ist indirekt an dem anderem Bestandteil befestigt, beispielsweise durch Befestigen an einen dritten Bestandteil, an dem der andere Bestandteil ebenfalls befestigt ist, oder anders übergangsweise mit dem anderen Bestandteil verbunden ist. Beispielsweise ist eine Signalentität bezüglich einer Bindungsspezies immobilisiert, wenn die Signalentität an der Bindungsspezies befestigt ist, an einem Kolloidpartikel befestigt ist, an dem die Bindungsspezies befestigt ist, oder an ein Dendrimer oder Polymer befestigt ist, an dem die Bindungsspezies befestigt ist, etc.
„Verschiedene biologische Arten" bedeuten unterschiedliche Tiere, wie beispielsweise Maus und Hamster, Maus und Ziege etc.
Der Begriff „Probe" bezeichnet eine jegliche Zelle, Gewebe oder Flüssigkeit aus einer biologischen Quelle, eine „biologische Probe", oder irgendein anderes Medium, biologisch oder nicht-biologisch, das vorteilhafterweise gemäß der Erfindung evaluiert werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, eine biologische Probe, die von einem menschlichen Patienten stammt, eine Probe, die von einem Tier stammt, eine Probe, die von einem Lebensmittel für den menschlichen Verzehr stammt, eine Probe einschließlich Futter, die für den Verzehr durch Tiere konzipiert ist, wie beispielsweise Viehfutter, Milch, eine Organspendeprobe, eine Blutprobe für eine Blutkonserve, eine Probe von einem Wasserreservoir oder dergleichen. Ein Beispiel für eine Probe ist eine Probe, die von einem Menschen oder einem Tier stammt, an den/das das Kandidatenarzneimittel verabreicht worden ist, um die Wirksamkeit des Arzneimittels zu bestimmen.
Eine „Probe, von der vermutet, wird, dass sie" einen speziellen Bestandteil „enthält", bezeichnet eine Probe, deren Gehalt an dem Bestandteil unbekannt ist. Beispielsweise definiert eine Flüssigkeitsprobe von einem Menschen, von dem man vermutet, dass er eine Krankheit hat, wie beispielsweise eine neurodegenerative Erkrankung oder eine nicht-neurodegenerative Erkrankung, von dem man aber nicht weiß, dass er diese Erkrankung hat, eine Probe, von der man vermutet, dass sie eine Aggregat-bildende Spezies einer neurodegenerativen Erkrankung enthält. „Probe" in diesem Kontext umfasst natürlich auftretende Proben, wie beispielsweise physiologische Proben von Menschen oder anderen Tieren, Proben von Lebensmitteln, Viehfutter etc. ebenso wie „strukturell prädeterminierte Proben", die hierin so definiert sind, dass sie Proben bezeichnen, deren chemische oder biologische Sequenz oder Struktur eine prädeterminierte Struktur ist, die in einem Test verwendet wird, der so konzipiert ist, dass er testet, ob die Struktur mit einem speziellen Prozess wie beispielsweise einer neurodegenerativen Erkrankung verbunden ist. Beispielsweise umfasst eine „strukturell prädeterminierte Probe" ein Peptidsequenz, eine zufällige Peptidsequenz in einer Phage-Display-Bibliothek und dergleichen. Typische Proben, die von Menschen oder anderen Tieren stammen, umfassen Zellen, Blut, Urin, Augenflüssigkeit, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Flüssigkeit oder andere Proben von Mandeln, Lymphknoten, Nadelbiopsien, etc.
„Moleküldrähte" wie hierin verwendet, bezeichnet Drähte, die die Fähigkeit einer Flüssigkeit erhöhen, die auf eine SAM-beschichtete Elektrode trifft, elektrisch mit der Elektrode zu kommunizieren. Dies umfasst leitfähige Moleküle oder, wie oben erwähnt und detaillierter unten beispielhaft illustriert, Moleküle, die Defekte in dem SAM erzeugen können, was die Kommunikation mit der Elektrode erlaubt. Eine nichtbeschränkende Liste von zusätzlichen Moleküldrähten umfasst 2-Mercaptopyridin, 2-Mercaptobenzothiazol, Dithiothreitol, 1,2-Benzendithiol, 1,2-Benzendimethanthiol, Benzen-Ethanthiol und 2-Mercaptoethylether. Die Leitfähigkeit eines Monolayers kann auch erhöht werden durch das Hinzugeben von Molekülen, die die Leitfähigkeit in der Ebene der Elektrode fördern. Leitende SAMs können zusammengesetzt sein aus, sind aber nicht beschränkt auf: 1) Poly(ethinylphenyl)-Ketten, die mit einem Schwefel enden; 2) einem Alkylthiol, das mit einem Benzolring endet; 3) einem Alkylthiol, das mit einer DNA-Base endet; 4) einer jeglichen mit Schwefel endenden Spezies, die sich nur schwer zu einem Monolayer verpackt; 5) alle der obigen Moleküle mit oder ohne Alkylthiol-Abstandshaltermolekülen, die mit entweder Ethylenglycoleinheiten oder Methylgruppen enden, um nicht-spezifische Adsorption zu inhibieren. Thiole sind beschrieben infolge ihrer Affinität für Gold bei der leichten Ausbildung eines SAM. Andere Moleküle können Thiol ersetzen, wie in der Technik aus dem US-Patent 5,620,820 und andere Literaturstellen bekannt. Moleküldrähte erzeugen typischerweise, infolge ihres Volumens oder ihrer anderen Konformation Defekte in einem ansonsten vergleichsweise eng gepackten SAM, um zu verhindern, dass der SAM die Oberfläche gegen Fluide dicht versiegelt, gegenüber denen sie exponiert wird. Die Moleküldrähte verursachen eine Störung der dicht gepackten selbstassemblierten Struktur, wodurch Defekte definiert werden, die erlauben, dass Flüssigkeit, gegenüber der die Oberfläche exponiert ist, elektrisch mit der Oberfläche kommuniziert. In diesem Zusammenhang kommuniziert die Flüssigkeit elektrisch mit der Oberfläche, indem die Oberfläche kontaktiert wird oder nahe genug in die Nähe der Oberfläche gelangt, so dass eine elektronische Kommunikation durch Tunneln oder dergleichen erfolgen kann.
Der Begriff „biologisches Binden" bezeichnet die Wechselwirkung zwischen einem korrespondierenden Molekülpaar, das wechselseitig Affinität oder Bindungskapazität aufweist, typischerweise spezifische oder nicht-spezifische Bindung oder Wechselwirkung, einschließlich biochemische, physiologische und/oder pharmazeutische Wechselwirkungen. Biologisches Binden definiert eine Art von Wechselwirkung, die zwischen Paaren von Molekülen auftritt, einschließlich Proteinen, Nukleinsäuren, Glycoproteinen, Kohlenhydraten, Hormonen und dergleichen. Spezifische Beispiele umfassen Antikörper/Antigen, Antikörper/Hapten, Enzym/Substrat, Enzym/Inhibitor, Enzym/Profaktor, bindendes Protein/Substrat, Trägerprotein/Substrat, Lectin/Kohlenhydrat, Rezeptor/Hormon, Rezeptor/Effektor, komplementäre Stränge von Nukleinsäure, Protein/Nukleinsäure, Repressor/Induktor, Ligand/Zelloberflächenrezeptor, Virus/Ligand etc.
Der Begriff „Bindungspartner" bezeichnet ein Molekül, das eine Bindung mit einem speziellen Molekül eingehen kann. Biologische Bindungspartner sind Beispiele. Beispielsweise ist Protein A ein Bindungspartner des biologischen Moleküls IgG und umgekehrt.
Der Begriff „Bestimmen" bezeichnet eine quantitative oder qualitative Analyse einer Spezies vermittels, beispielsweise, Spektroskopie, Ellipsometrie, piezoelektrischer Messung, Immunotest, elektrochemischer Messung und dergleichen. „Bestimmen" bedeutet auch Nachweisen oder Quantifizieren der Wechselwirkung zwischen Spezies, z. B. Nachweisen von Bindung zwischen zwei Spezies.
Der Begriff „selbstassemblierter Monolayer" (SAM) bezeichnet eine vergleichsweise geordnete Anordnung von Molekülen, die spontan an eine Oberfläche chemisorbieren, in der die Moleküle in etwa parallel zueinander und im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche ausgerichtet sind. Ein jedes dieser Moleküle umfasst eine funktionelle Gruppe, die an die Oberfläche adhäriert, und einen Teil, der mit benachbarten Molekülen in dem Monolayer in Wechselwirkung tritt, um die vergleichsweise geordnete Anordnung auszubilden. Siehe Laibinis, P. E.; Hickman, J.; Wrighton, M. S.; Whitesides, G. M. Science 245, 845 (1989), Bain, C.; Evall, J.; Whitesides, G. M. J. Am. Chem. Soc. 111, 7155–7164 (1989), Bain, C.; Whitesides, G. M. J. Am. Chem. Soc. 111, 7164–7175 (1989).
Der Begriff "selbstassemblierter gemischter Monolayer" bezeichnet einen heterogenen selbstassemblierten Monolayer, der aus einer vergleichsweise geordneten Anordnung aus wenigstens zwei unterschiedlichen Molekülen hergestellt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Techniken, Kits und Gegenstände zur Bestimmung der Bindung zwischen chemischen oder biologischen Spezies bereit, insbesondere zum Bestimmen welche aus einer Serie von Spezies an eine spezielle Zielmolekülspezies binden und welche nicht. Techniken der Erfindung sind nützlich für die Bestimmung von im Wesentlichen einer jeglichen bindenden Wechselwirkung, typischerweise biologischer bindender Wechselwirkungen.
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung machen Gebrauch von selbstassemblierten Monolayern (SAMs) auf Oberflächen, wie beispielsweise Oberflächen von Kolloidpartikeln und Gegenständen, die beispielsweise Kolloidpartikeln mit Oberflächen, die mit SAMs beschichtet sind. In einem Satz bevorzugter Ausführungsformen bedecken SAMs, die vollständig aus synthetischen Molekülen ausgebildet sind, vollständig eine Oberfläche oder einen Bereich einer Oberfläche, z. B. bedecken vollständig die Oberfläche eines Kolloidpartikels. „Synthetisches Molekül" bedeutet, in diesem Kontext, ein Molekül, das nicht natürlicherweise vorkommt, sondern vielmehr ein solches, das unter der Kontrolle durch einen Menschen, durch von Menschen erzeugter Kontrolle oder von einem Menschen gesteuerter Kontrolle synthetisiert wird. „Vollständig bedecken" bedeutet in diesem Kontext, dass es keinen Bereich der Oberfläche oder der Region gibt, die direkt ein Protein, einen Antikörper oder eine andere Spezies kontaktiert, was die vollständige, direkte Abdeckung mit dem SAM verhindert. D. h. die Oberfläche oder der Bereich umfasst, über seine Gesamtheit, einen SAM, der vollständig aus nicht-natürlich auftretenden Molekülen (d. h. synthetischen Molekülen) besteht. Der SAM kann vollständig aus SAM-bildenden Spezies ausgebildet sein, die eng gepackte SAMs an den Oberflächen ausbilden, wobei diese Spezies in Verbindung mit Moleküldrähten oder anderen Spezies in der Lage sind, die elektronische Kommunikation durch den SAM zu fördern (einschließlich Fehler-fördernde Spezies, die in der Lage sind, in einem SAM teilzunehmen), anderen Spezies, die in der Lage sind, in einem SAM teilzunehmen, und eine jegliche Kombination davon. Bevorzugterweise umfassen alle Arten, die in dem SAM teilnehmen, eine Funktionalität, die, optional kovalent, an die Oberfläche bindet, wie beispielsweise ein Thiol, das an eine Goldoberfläche kovalent bindet. Ein selbstassemblierter Monolayer auf einer Oberfläche, gemäß der Erfindung, kann aus einer Mischung von Spezies zusammengesetzt sein (z. B. Thiol-Spezies, wenn Gold die Oberfläche ist), die im Wesentlichen eine jegliche chemische oder biochemische Funktionalität präsentieren (exponieren) kann. Beispielsweise können sie Triethylenglycol-endende Spezies (z. B. Triethylenglycol-endende Thiole) umfassen, um einer nicht-spezifischen Adsorption entgegenzutreten, und andere Arten (z. B. Thiole), die in einem Bindungspartner einer Affinitätsmarkierung enden, z. B. in einem Chelat enden, das ein Metall koordinativ binden kann, wie beispielsweise Nitrilotriessigsäure, die, wenn im Komplex mit Nickelatomen vorliegend, Histidin-markierte Bindungsspezies einfängt. Diese Anordnungen können für eine Vielzahl von Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. Als ein Beispiel kann ein selbstassemblierter Monolayer, unabhängig davon, ob er auf einer kolloidalen oder auf einer anderen Oberfläche ausgebildet ist, aus einer Mischung von Thiol-Spezies zusammengesetzt sein (wenn Gold die Oberfläche ist), was Triethylenglycol-endende Thiole umfasst, um nicht-spezifischer Adsorption zu widerstehen, und Thiole, die mit einem Bindungspartner einer Affinitätsmarkierung enden, z. B. mit einem Chelat enden, das ein Metall koordinativ binden kann, wie beispielsweise Nitrilotriessigsäure, das, wenn es im Komplex mit Nickelatomen vorliegt, Histidin-markierte Bindungsspezies einfangen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindungsspezies ein beta-Amyloidpeptid, das leicht selbst aggregieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur rigorosen Steuerung der Konzentration der Histidin-markierten Peptide, die auf einer Kolloidoberfläche präsentiert sind. Ohne diese rigorose Steuerung über die Peptiddichte auf einem jeden Kolloidpartikel würden co-immobilisierte Peptide leicht miteinander aggregieren, um mikrohydrophobe Domänen auszubilden, die Kolloid-Kolloid-Aggregation bei Abwesenheit von in der Probe vorhandenen Aggregat-bildenden Spezies katalysieren würden. Dies ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber bestehenden Kolloid-Agglutinationstest.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren liefern selbstassemblierte Monolayer auf Kolloiden, die der nicht-spezifischen Adsorption ohne Proteinblockierungsschritte widerstehen, wie beispielsweise Blockieren mit BSA. Die hierin beschriebenen Verfahren produzieren auch derivatisierte Kolloide, die in biologisch relevanten Fluiden stabil sind, und die kein Detergens (für Stabilität; Beibehalten der Kolloide in Suspension) erfordern, was mit Bindungsreaktionen interferiert. Dies erlaubt, dass empfindliche Bindungstests in Lösung durchgeführt werden. Dies beseitigt die Notwendigkeit, dass Bindungspartner an Adsorptionsoberflächen adheriert sein müssen, wie für bestehende Kolloidagglutinationstests üblich. Wie im Folgenden diskutiert, kann Detergens in vorteilhafter Weise für die SAM-Bildung auf Kolloiden verwendet werden. In diesem Falle kann und wird bevorzugterweise Detergens nach SAM-Ausbildung entfernt und ist nicht länger auf dem Kolloid, in dem SAM, oder sonst wo während Bindungswechselwirkungen oder einer anderen Verwendung der Kolloide vorhanden.
Ein Zielmolekül kann an einem ein elektrisches Signal abgebenden Kolloid befestigt sein und dann mit magnetischen Perlen inkubiert werden, von denen eine jede eine separate Wirkstoffkandidatenspezies präsentiert. Nach Inkubation können die magnetischen Perlen magnetisch an eine Sensorelektrode gezogen und, beispielsweise, durch ACV analysiert werden. Eine Wechselwirkung zwischen einem Arzneimittel auf einer magnetischen Perle und einem Zielmolekül auf einem ein elektronisches Signal abgebendes Kolloid macht den sich ergebenden Komplex sowohl rekrutierbar als auch nachweisbar. Die Komplexe werden magnetisch zu einer Elektrode gezogen und elektronisch analysiert. Verschiedene Techniken zum Herstellen von SAMs auf Kolloiden und Tests, die Perlen und Kolloidalpartikel verwenden, sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/US00/01997, eingereicht am 25. Januar 2000, mit dem Titel „Rapid and Sensitive Detection of Aberrant Protein Aggregation in Neurodegenrative Diseases" von Bamdad et al., offengelegt am 27. Juli 2000 als WO 00/43791, und in der internationalen Patentanmeldung PCT/US00/01504, eingereicht am 21. Januar 2000, mit dem Titel „Assays Involving Coloids and Non-coloidal Structures", von Bamdad et al., offengelegt am 27. Juli 2000 als WO 00/43783, beschrieben.
Arzneimittelbibliotheken aus kleinen Molekülen enthalten Millionen diskreter Verbindungen, was eine logistische Herausforderung darstellt. Die derzeitige Praxis besteht darin, Arzneimittelkandidaten zu vereinen, zu testen, die einzelnen Bestandteile von Pools zu analysieren, die positiv waren, und zu wiederholen, bis eine einzelne wechselwirkende Spezies identifiziert worden ist. Diese Praxis ist sehr zeitintensiv. Ein weitere Ansatz besteht darin, einen jeden Arzneimittelkandidaten mit einer einzigartigen Markierung zu versehen, die seine Identität codiert, und mit einer Fluoreszenzmarkierung. Zielmoleküle, die auf Polystyrolkügelchen immobilisiert sind, werden mit vereinigten Arzneimittelkandidaten inkubiert und dann abgespült. Die Polystyrolkügelchen, die einen Arzneimittelkandidaten eingefangen haben, fluoreszieren und können mikroskopisch voneinander getrennt werden. Die eingefangenen Arzneimittel werden dann decodiert, um das kleine Molekül zu identifizieren, das in Wechselwirkung getreten ist. Das Problem bei diesem Ansatz besteht darin, dass viele Markierungen, die zu den Arzneimittelkandidaten hinzufügt wurden, an den Wechselwirkungen teilnehmen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt.
Ein alternativer Ansatz besteht darin, Arzneimittel an oder befestigt an magnetischen Perlen zu synthetisieren. Die codierende Markierung wird dann an der Perle und nicht an dem Arzneimittelkandidaten befestigt. Pools aus Arzneimittel-präsentierenden magnetischen Perlen werden dann mit Kolloiden gemischt, die sowohl das Zielmolekül als auch eine elektronische Markierung (wie beispielsweise ein Ferrocen-Thiol, das in einen SAM auf dem Kolloid eingebaut ist) präsentieren. Die Lösung wird über einer Mikroelektrodenanordnung zurückgehalten. Ein magnetisches Feld kann getrennt an einer jeden Elektrodengrundplatte der Anordnung angelegt werden. Zuerst werden magnetische Felder an einer jeden Elektrode in der Anordnung angelegt, um die magnetischen Perlen anzuziehen. Die Anordnung wird dann elektronisch analysiert (ACV ist bevorzugt). Grundplatten, die ein Positiv registrieren, zeigen an, dass an dieser Adresse ein Arzneimittelkandidat auf einer magnetischen Perle ein Zielmolekül auf einem Signalkolloid eingefangen hat. Das magnetische Feld an räumlichen Adressen, die ein Positiv registrierten, blieb „eingeschaltet", während die anderen magnetischen Felder freigegeben werden, und ein Austrittsventil geöffnet wird, um magnetische Perlen wegzuwaschen, die Arzneimittelkandidaten tragen, die nicht wechselwirkten. Das Austrittsventil wird geschlossen und mehr Lösung hinzugegeben, um die Arzneimittelkandidaten in situ zu verdünnen. Das Verfahren wird mehrfach wiederholt, um zu gewährleisten, dass ein jedes Positiv von einer einzelnen magnetischen Perle stammt, die einen einzelnen Arzneimittelkandidaten trägt. Diese Positive werden gesammelt und analysiert, um die wechselwirkenden Arzneimittelkandidaten zu identifizieren. Perlen, die Arzneimittelkandidaten tragen, können codiert werden oder Arzneimittel können von den Perlen freigesetzt und zum Gegenstand von Analysetechniken gemacht werden, wie beispielsweise Massenspektrometrie, NMR, Sequenzieren und dergleichen.
Bezug nehmend nun auf die Figuren wird die Bestimmung von Bindungswechselwirkungen beschrieben werden. 1 veranschaulicht, schematisch, erste und zweite Gegenstände 20 bzw. 22. Die Gegenstände 20 und 22 können ein jeglicher Gegenstand sein, der eine chemische oder biologische Spezies für Bindungsstudien immobilisieren kann, und von einem Platz zu einem anderen vermittels eines magnetischen Feldes gezogen werden kann. Polymere magnetische Perlen, die in biochemischen Analysen typischerweise verwendet werden, sind bequem als Gegenstände 20 und 22 zu verwenden und die Gegenstände werden hierin im Folgenden als magnetische Perlen bezeichnet, wobei verstanden wird, dass andere Gegenstände verwendet werden können.
Die magnetische Perle 20 trägt ein erstes chemisches oder biologisches Agens 24 (D), das relativ zu der Perle immobilisiert ist, und die magnetische Perle 22 trägt in ähnlicher Weise ein immobilisiertes zweites chemisches oder biologisches Agens 26 (D').
In 1 sind auch Bindungspartner 28 (P) bereitgestellt, jeder immobilisiert relativ zu einer Signalentität 30. Wie dargestellt ist die Signalentität 30 ein Kolloidpartikel. In der dargestellten Ausführungsform weist der Bindungspartner 28 eine Bindungsaffinität für das erste chemische oder biologische Agens 24 auf, aber nicht für das zweite biologische oder chemische Agens 26. Entsprechend wird die Exposition aller Bestandteile, die in 1 dargestellt sind, miteinander, beispielsweise durch Mischen in einem typischen biochemischen Testflüssigkeitsmedium, zur Bindung von Bindungspartner 28 an dem ersten Agens 24 führen und entsprechend zur Immobilisierung von Perle 20 relativ zu der Signalentität 30. Die Signalentität 30 wird nicht relativ zur Perle 22 immobilisiert.
Sofern erwünscht, kann eine Vielzahl von Signalentitäten relativ zu Oberflächen von einer Vielzahl von Gegenständen immobilisiert sein, wie beispielsweise Kolloidpartikel. Signalentitäten wie beispielsweise Fluoreszenz-konjugierte Antikörper und andere fluoreszierende Fusionsproteine, einschließlich grün fluoreszierende Proteine, können leicht an Oberflächen von Goldkolloiden und anderen Oberflächen befestigt werden, die auch mutmaßliche Bindungspartner präsentieren, entweder durch Affinitätsmarkierung, EDC/NHS-Chemie oder durch Binden eines His-markierten Proteins A oder G, das auf NTA-SAM-beschichteten Kolloiden gemäß der Erfindung präsentiert ist. Signalentitäten wie beispielsweise fluoreszierende Molekülbestandteile, können auch auf einem Kolloid vermittels eines mit Biotin endenden Liganden co-immobilisiert werden, oder können vermittels einer Chelats/Metall/Metall-bindenden Markierungsverbindung befestigt sein. Ein fluoreszierender Molekülbestandteil kann auch befestigt werden, indem er an einem Antikörper angebracht wird und unter Verwendung einer Chelat/Metall/Metall-bindenden Markierung mit His-Protein G, um den Antikörper zu binden. Die Molekülbestandteile können dann direkt nachgewiesen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Signalentität elektroaktiv, insbesondere ein Redox-aktiver Komplex, der elektrochemisch durch, beispielsweise, Wechselstromvoltametrie (ACV) bestimmt werden kann.
Obwohl eine jede von einer Vielzahl von Bindungswechselwirkungen gemäß der Erfindung untersucht werden kann, umfasst eine bevorzugte Technik den Hochdurchsatznachweis von Wirkstoffkandidaten/Zielmolekül-Wechselwirkungen. Bei einer derartigen Anordnung sind das erste und zweite Agens 24 und 26 (D bzw. D') Arzneimittelkandidaten und der Bindungspartner 28 ist ein Zielprotein, das mit einem Arzneimittelkandidaten binden kann, aber nicht mit anderen Arzneimittelkandidaten binden darf. Dieser spezifische Test wird in den restlichen Figuren diskutiert werden, es wird aber verstanden, dass die Erfindung nicht auf Arzneimittelkandidaten/Zielmolekül-Wechselwirkungen beschränkt ist.
In einem typischen Arzneimittelscreeningtest kann eine sehr große Anzahl (von Tausenden bis Millionen) Arzneimittelkandidaten bereitgestellt werden, immobilisiert bezüglich magnetischer Perlen. Bevorzugterweise trägt eine jede magnetische Perle nur eine Art von immobilisiertem Arzneimittelkandidaten und es kann nur eine Perle pro Arzneimittelkandidaten bereitgestellt werden, oder viele Perlen pro Arzneimittelkandidaten. Ein Vorteil der Erfindung, wie vollständiger aus der unten folgenden Beschreibung verstanden werden wird, besteht darin, dass nur eine Perle für einen jeden Arzneimittelkandidaten bereitgestellt werden muss. Dies bedeutet, dass eine Vielzahl von Perlen in einem Test bereitgestellt werden kann, da eine jede Perle einen unterschiedlichen immobilisierten Arzneimittelkandidaten trägt.
In den Figuren ist die Signalentität 30 als ein Kolloidpartikel gezeigt und die Verwendung eines Kolloidpartikels als eine Signalentität, oder als eine Struktur, um bei der Immobilisierung einer anderen Signalentität (unten beschrieben) bezüglich eines Zielproteins 28 zu helfen, ist bevorzugt. Insbesondere sind Kolloidpartikel, die Goldoberflächen exponieren, wie beispielsweise Goldkolloidpartikel, besonders geeignet. Obwohl Kolloidpartikel im Zusammenhang mit Protein 28 im Folgenden diskutiert werden, wird verstanden, dass das Protein oder ein anderer Bindungspartner bezüglich einer Signalentität immobilisiert sein kann ohne die Verwendung eines Kolloidpartikels.
Die Immobilisierung der Arzneimittelkandidaten 24 und 26 auf den magnetischen Perlen 20 und 22 kann durch eine jegliche in der Technik bekannte Art durchgeführt werden. Derartige Techniken sind Routine. Arzneimittelkandidaten sollten an den Oberflächen der magnetischen Perlen in einer Konzentration präsentiert sein, die ausreichend ist, um ein adäquates Binden und eine adäquate Signalgebung zu erleichtern, was leicht durch die Fachleute auf dem Gebiet in Kenntnis der Erfordernisse der Tests der Erfindung maßgeschneidert werden kann.
Die Bindungspartner 28 können relativ zu den Kolloidpartikeln 30 vermittels Thiolbindung immobilisiert sein. D. h., dass der Bindungspartner 28 ein Thiol einbauen kann, oder chemisch oder anderweitig an einem Thiol immobilisiert sein kann, was an eine Goldoberfläche von Goldpartikeln 30 binden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Proteine 28 an die selbstassemblierenden Monolayer (SAMs) gebunden, die auf Oberflächen von kolloidalen Goldpartikeln 30 vermittels einer Metallbindungsmarkierung/Metall/Chelat-Verbindung ausgebildet sind. In einem solchen Fall kann eine Metallbindungsmarkierung an dem Bindungspartner 28 angebracht sein, und das Kolloid kann einen SAM tragen, der ein Chelat präsentiert, das ein Metall koordinativ bindet, an das die Bindungsmarkierung bindet. Andere Affinitätsmarkierungen können verwendet werden, um die Bindungspartner 28 an SAM-Spezies auf den Kolloidpartikeln anzubringen. In weiteren Ausführungsformen präsentieren SAMs auf Kolloidpartikeln Carboxylatgruppen, und Bindungspartner 28 inkorporieren oder sind immobilisiert relativ zu primären Aminen, die an die SAMs vermittels EDC-NHS-Chemie gebunden sind. Affinitätsmarkierung/Bindungspartnerbindung oder EDC-NHS-Chemie können verwendet werden, um im Wesentlichen eine jegliche Spezies an im Wesentlichen jede Oberfläche der Erfindung zu binden. Bevorzugterweise umfassen derartige SAMs eine ausreichende Exposition von Protein 28, um das Binden an Arzneimittelkandidat 24 zu erleichtern, wobei der Rest des selbstassemblierte Monolayers nicht-spezifische bindungsinhibierende Spezies umfasst, wie beispielsweise Polyethylenglycol-endende SAM-ausbildende Spezies. Die selektive Befestigung verschiedener Spezies an selbstassemblierte Monolayer-ausbildende Spezies, um selbstassemblierte Monolayer an Oberflächen auszubilden, die erwünschte chemische oder biochemische Funktionalitäten exprimieren, sind aus den oben angegebenen Literaturstellen und zusätzlichen Dokumenten bekannt, einschließlich US-Patent 5,512,131 und der internationalen Patentanmeldung WO 96/29629, die am 26. Juni 1996 veröffentlicht wurde. Eine Chemie zur Befestigung von Proteinen 28 an Kolloidpartikeln 38 ist auch in der parallel anhängigen, gemeinsam besessenen internationalen Patentanmeldung PCT/US00/01504 von Bamdad und Bamdad, die am 21. Januar 2000 eingereicht und als WO 00/34783 am 27. Juli 2000 veröffentlicht wurde, beschrieben.
In einer weiteren Technik können SAMs auf Kolloidpartikeln 30 ausgebildet sein, die Carboxy-endende Thiole inkorporieren. EDC-NHS-Kopplungschemie kann dann verwendet werden, um ein jegliches Molekül zu befestigen, das dem SAM ein primäres Amin präsentiert. Die meisten Proteine 28 werden primäre Amine enthalten und die Befestigung von primären Aminen an Molekülen für eine nachfolgende Befestigung an SAMs auf Kolloidpartikel 30 wird dadurch erleichtert. Eine typische EDC-NHS-Verknüpfung kann wie folgt ausgeführt werden.
Eine Dimethylformamid (DMF)-Lösung, die 20 bis 40 mikromolar NTA (Nitrilotriessigsäure) C11-Thiol, 540 bis 580 mikromolar COOH-C11-Thiol und +/– 40 mikromolar Ferrocenyl-C11-Thiol enthält, wird hergestellt. Kolloidpartikel werden in der Lösung inkubiert. Nach Inkubation wird die DMF-Lösung entfernt und die Kolloidpartikel in eine zweite DMF-Lösung eingeführt, die 400 mikromolar Polyethylenglycol-C11-Thiol enthält und hitzezyklisiert, wie oben beschrieben. 30 Mikroliter der Kolloide werden pelletiert und in 100 Mikroliter Phosphatpuffer resuspendiert. Zu der Pufferlösung werden 0,5 Mikromol N-Ethyl-N' (3-dimethylaminopropyl)carbodimid (EDC) und 0,1 Mikromol N-Hydroxysuccinimid plus ein Bindungspartner 28, der ein primäres Amin enthält, und der mit den Kolloiden verbunden werden soll, hinzugegeben. Die Kolloidlösung plus Bindungspartner wird für 10 Minuten inkubiert, während derer der Bindungspartner an die SAMs auf den Kolloiden befestigt wird. Entfernung der Lösung, gefolgt von Waschen und Resuspendieren folgte. Um eine Bindung von Bindungspartner an mehr als ein Kolloidpartikel zu vermeiden, kann das Volumen der Lösung, in dem die Reaktion erfolgt, in geeigneter Weise verdoppelt oder verdreifacht werden. Es kann gezeigt werden, dass der Bindungspartner bezüglich der Kolloide immobilisert werden kann durch Exposition gegenüber Agaroseperlen, die ein darauf immobilisiertes Ziel tragen, und Beobachten der Agglomeration.
In 2 sind die in 1 gezeigten Bestandteile nach Binden von Protein 28 an Arzneimittelkandidat 24 in einem Flüssigkeitsmedium suspendiert gezeigt. Die Bestandteile werden in der Umgebung einer ersten Stelle 40 und einer zweiten Stelle 42 suspendiert, zu der magnetischer Partikel 20 und 22 magnetisch gezogen werden können. Die Stellen 40 und 42 können prädeterminierte Bereiche einer Oberfläche eines einzelnen Gegenstandes sein, oder Oberflächen verschiedener Gegenstände. Ob die Stellen 40 und 42 von dem gleichen oder einem verschiedenen Gegenstand sind, ist im Zusammenhang mit der Erfindung nicht wichtig, solange die Stellen in dem Umfang getrennt und unterscheidbar sind, dass die Immobilisierung einer Signalentität an einer Stelle von den Immobilisierung an einer weiteren Stelle unterscheidbar ist (wie aus der unten folgenden Beschreibung offenkundig werden wird). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erste und zweite Stelle 40 und 42 Oberflächen einer ersten und zweiten Elektrode 44 bzw. 46, wobei ein Elektromagnet mit einer jeden Elektrode verbunden ist. Elektromagneten können so positioniert sein, dass sie die Perlen 20 und 22 in die Umgebung der ersten und zweiten Stelle 40 und 42 ziehen. Wie dargestellt sind die Elektromagneten 48 und 50 in Verbindung mit einer jeden Elektrode 44 bzw. 46 gezeigt und sind hinter den Elektroden bezüglich Bestandteilen des Tests angeordnet. Ein elektrischer Schaltkreis, der Elektroden adressiert, und die Elektromagneten sind konventionell, und sind nicht gezeigt.
Die magnetischen Perlen 20 und 22 werden magnetisch zu der ersten und zweiten Stelle 40 und 42 gezogen durch Aktivieren der Elektromagneten 48 und 50. Typischerweise werden die Perlen 20 und 22 in einem Flüssigmedium getragen, wie beispielsweise in einer wässrigen Lösung, gegenüber die Oberflächenbereiche 40 und 42 exponiert sind. 3 veranschaulicht die Perlen 20 und 22 und die Spezies, die relativ dazu immobilisiert sind, die an die Oberflächenstellen 40 und 42 gezogen sind. Die Perlen müssen in die der Nähe der Oberflächenstellen nur in dem Umfang gezogen werden, dass die Identifizierung von Signalentitäten, die bezüglich Perle 20 immobilisiert sind, identifiziert werden können. In einer Ausführungsform sind die Signalentitäten 30 durch das Auge identifizierbar. In dieser Ausführungsform können die Signalentitäten 30 Kolloidpartikel (die Aggregation nahe der Oberfläche der Perle 20 wird verursachen, dass die Perle eine blaue oder purpurne Farbe aufweist, die von anderen Perlen unterscheidbar ist), fluoreszierende Molekülbestandteile, fluoreszierende Partikel oder dergleichen sein. In einem derartigen Fall bedarf es der Elektroden 44 und 46 nicht; es ist nur erforderlich, dass die Perlen magnetisch an getrennte Stellen gezogen werden. Wenn dies erfolgt ist, wird die Oberflächenstelle 40 als eine solche identifiziert, die eine Signalentität 30 angezogen hat, und Stelle 42 wird identifiziert als eine solche, die keine Signalentität 30 angezogen hat.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Signalentität ein elektroaktives Molekül wie beispielsweise eine Redox-aktive Spezies, deren Gegenwart in der Nähe von Elektrode 44 und deren Abwesenheit in der Nähe von Elektrode 46 durch bekannte elektrochemische Techniken wie beispielsweise CV und ACV bestimmt werden kann. Derartige elektroaktive Moleküle sind typischerweise Metall-enthaltene Redox-aktive Moleküle, einschließlich Übergangsmetallkomplexe, d. h. Komplexe, die Metalle enthalten, die ausgewählt sind, aber nicht beschränkt sind auf, Cadmium, Kupfer, Kobalt, Palladium, Zink, Eisen, Ruthenium, Rhodium, Osmium, Rhenium, Platin, Scandium, Titan, Vanadium, Chrom, Mangan, Nickel, Molybdän, Technetium, Wolfram und hidium. Besonders bevorzugt sind Ruthenium, Osmium, Eisen, Platin und Palladium, wobei Ruthenium und Eisen besonders bevorzugt sind. Komplexe, die diese Metalle enthalten, werden die Metalle zusammen mit ihren Liganden enthalten, wie beispielsweise Isonikotinamid, Imidazol, Bipyridin, Terpyridin, Phenanthroline, Kohlenmonoxid, Isocyanid und Metallocen-Liganden, einschließlich substituierte Derivate der vorstehenden. Andere Liganden werden für die Fachleute auf dem Gebiet offenkundig sein. Ein besonders bevorzugter Metallkomplex der Erfindung ist ein Metallocen-Komplex, insbesondere Ferrocen, der ein Eisenatom und zwei Cyclopentadien-Liganden enthält, oder ein Derivat davon.
Die Signalentität (31, erstmalig in 3 dargestellt, aber optional in anderen Figuren vorhanden), die bezüglich Protein 28 immobilisiert ist, kann an einem üblichen Kolloidpartikel 30 befestigt sein, an dem das Protein 28 selbst befestigt ist. Dies kann erreicht werden durch Ausbildung eines gemischten SAM auf dem Kolloidpartikel 30, der Protein 28, die Signalentität (optional elektroaktiv wie beispielsweise Ferrocen) und, optional, nicht-SAM-bildende Spezies enthält, die das nicht-spezifische Binden inhibieren. Wo eine elektroaktive Signalentität 31 verwendet wird, kann seine Nähe, oder sein Fehlen, zu den Stellen 40 und 42 leicht durch Fachleute auf dem Gebiet bestimmt werden mit den Elektroden 44 und 46 unter Verwendung bekannter elektrochemischer Techniken wie beispielsweise CV oder ACV, wie erwähnt.
Unabhängig davon, welche Signaltechnik verwendet wird, wird, nachdem einmal bestimmt ist, dass eine Signalentität in der Nähe von Stelle 40, aber nicht in der Nähe von Stelle 42 vorhanden ist, der Elektromagnet 50 deaktiviert und Perlen, die nahe an die Stelle 42 gezogen worden sind, werden selektiv freigesetzt, wohingegen Perlen nahe an der Stelle 40 magnetisch vor Ort gehalten werden. Nach Freisetzen von Perlen von der Stelle 42 wird wenigstens die Stelle 42 und optional die Stellen 42 und 40 abgespült, um alle Perlen zu entfernen, die nicht magnetisch an der Stelle 40 zurückgehalten werden. Dann wird eine Flüssigkeit, die bevorzugterweise keine Perlen enthält, in die Umgebung der Oberflächenstellen 40 und 42 eingeführt, die Perlen 20 und 22 werden von der Oberflächenstelle 40 freigesetzt und in der Flüssigkeit suspendiert, und die Schritte des magnetischen Ziehens von Perlen an Oberflächenstellen, Bestimmen von Stellen, an denen Signalentitäten vorhanden sind, und Freisetzen von Perlen von Oberflächenstellen, wo Signalentitäten nicht vorhanden sind, wiederholt. Genauer werden nach dem Freisetzen von Perlen 20 und 22 von Oberflächenbereichen 40 die Elektromagneten 48 und 50 erneut aktiviert. Idealerweise werden dann die Perlen 20 und 22 zu unterschiedlichen Oberflächenstellen gezogen werden, was sie wirksam voneinander trennt (wie in 5 gezeigt; Wiederholung des Tests wird letztendlich zu einer derartigen Trennung führen). Wenn die Perle 20 zu der Oberflächenstelle 42 gezogen ist (identifiziert durch die Signalentität), dann kann der Elektromagnet 48 deaktiviert werden, was die Perle 22 freisetzt, die durch Abspülen entfernt wird, wobei nur die Perle 20 auf einer Oberflächenstelle immobilisiert bleibt. Der Arzneimittelkandidat 24 kann dann als einer identifiziert werden, der eine Bindungsaffinität für das Zielprotein 28 aufweist. Dies kann erreicht werden durch irgendeine von einer Vielzahl von bekannten Techniken. In einer Technik ist eine jede Perle mit einer einzigartigen Radiomarkierung markiert, die ausgelesen wird, um die chemische Vorgeschichte ihres befestigten Arzneimittelkandidaten zu enthüllen. Andere Markierungsschemata, die Nukleinsäure- oder Peptid-Markierung eines jeden synthetischen Schrittes umfassen, sind möglich. Ein weiterer Ansatz umfasst das Abspalten des Arzneimittelkandidaten 24 von der Perle 20 und seine Analyse unter Verwendung einer Technik wie beispielsweise Massenspektrometrie.
Wie in 1–5 dargestellt sind nur zwei Arten von Perlen (20 und 22) gezeigt, die nur zwei Arten von Kandidatenarzneimitteln tragen (D und D'). In einem tatsächlichen Test werden Hunderte, Tausende oder Millionen von Kügelchen verwendet, von denen eine jede ein einziges Arzneimittel trägt. Perlen, die Arzneimittelkandidaten tragen, sind leicht verfügbar oder von Fachleuten auf dem Gebiet herstellbar, beispielsweise unter Verwendung von kombinatorischer Synthese, Festphasensyntheseansätzen oder postsynthetischer Bindung von Perlen. In einer typischen großvolumigen Screeningtechnik kann es wünschenswert sein, z. B., zehn Millionen Arzneimittel (D, D', D'', ...) auf Wechselwirkung mit einem Bindungspartner zu screenen. Mit herkömmlicher Technologie würde dies typischerweise zehn Millionen Experimente bedeuten, oder paralleles Screenen (beispielsweise auf Mehrnapfplatten) von zehn Millionen Arzneimitteln, was ein zeitintensiver und arbeitsintensiver Prozess ist. Mit der vorliegenden Erfindung braucht jedoch nur eine viel kleinere Anzahl von Oberflächenstellen (40, 42, ...) verwendet zu werden als die Anzahl von zu screenenden Arzneimittelkandidaten. Die Größe der Oberflächenbereiche und ihre Anzahl ist so ausgewählt, dass viele Perlen (20, 22, ...), die viele Arzneimittelspezies präsentieren, an eine einzelne Oberflächenstelle gezogen werden. In einem typischen Test wird nur eine oder nur einige wenige dieser Perlen hinsichtlich Signalentitäten immobilisiert werden. Die Anzahl von Oberflächenstellen kann somit ausgewählt werden in Verbindung mit der Anzahl von Perlen und Arzneimittelkandidaten und der Anzahl von erwarteten positiven Bindungswechselwirkungen, so dass in dem ersten Schritt des Ziehens der Perlen an getrennte Oberflächenstellen wenigstens einige der Oberflächenstellen (im Allgemeinen viele oder die meisten der Oberflächenstellen) nicht die Anwesenheit einer Signalentität aufweisen werden. Wenn einmal bestimmte Stellen als Signalentitäten als nicht anziehend identifiziert worden sind, können alle Kugeln von diesen Stellen freigesetzt und weggewaschen werden und Perlen, die an Oberflächenstellen gehalten werden (Oberflächenstellen, die Signalentitäten aufweisen; nun eine viel kleinere Anzahl), können freigesetzt, erneut verteilt, erneut zu Oberflächenbereichen gezogen und der Test wiederholt werden, bis nur eine magnetische Perle, statistisch, an einer jeden Oberflächenstelle vorhanden ist. An diesem Punkt können Perlen, die Signalentitäten tragen, von allen anderen Perlen isoliert werden und die Identität der immobilisierten Arzneimittelkandidaten bestimmt werden.
Die Techniken der Erfindung erlauben eine Verringerung der Arbeit beim Screenen großer Zahlen möglicher Bindungswechselwirkungen. Beispielsweise kann das Screenen von zehn Millionen Arzneimittelkandidaten gegen ein einzelnes potentielles Bindungsprotein durchgeführt werden unter Verwendung von zehntausend Oberflächenstellen, oder viel weniger, beispielsweise nur eintausend Stellen, oder sogar einhundert Oberflächenstellen oder weniger. Natürlich kann eine Arzneimittelbibliothek alternativ gleichzeitig hinsichtlich Wechselwirkung mit einem Satz von Proteinen gescreent werden. In diesem Falle können Heteropartikel-Komplexe nachfolgend analysiert werden, um die Identität von nicht nur dem Arzneimittel, sondern auch von dem Protein zu bestimmen, an das es bindet.
Dieser Vorteil (effizientes Screenen) der Erfindung definiert einen Aspekt der Erfindung, der das Bereitstellen einer Vielzahl von Bindungspartnerkandidaten umfasst, wie beispielsweise Wirkstoffkandidaten, jeweils immobilisiert relativ zu getrennten Gegenständen, und das Studieren der Bindung von den Bindungspartnerkandidaten mit einem hinsichtlich einer Signalentität immobilisierten Ziel, in einem Verfahren, das verglichen mit der Anzahl von Bindungspartnerkandidaten ein Zehntel der Anzahl von Oberflächenstellen involviert, Bestimmen des spezifischen Bindens zwischen wenigstens einem Bindungspartnerkandidaten und dem Ziel.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung können magnetische Perlen modifiziert sein, um proteinartige Moleküle zu präsentieren, dann gemäß den Verfahren der Erfindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet werden, mit (einer) Targetspezies zu wechselwirken, die ebenfalls proteinartig sein kann, die an eine Population aus Goldkolloiden gebunden ist. Eine komplexe Probenmischung wie beispielsweise ein Zelllysat oder eine Probe aus natürlichen Produkten kann fraktioniert sein, dann können Fraktionen, die nur eine einzelne oder wenige distinkte Molekülspezies enthalten, an magnetische Perlen befestigt werden. Die Befestigung an magnetische Perlen kann durch nicht-spezifische Adsorption oder durch chemisches Koppeln an funktionalisierte Perlen erleichtert werden. Diese Perlen können oder können auch nicht aus Gold sein, das beschichtet ist, um die Ausbildung von SAMs auf ihren Oberflächen zu erleichtern. Unter Verwendung von Verfahren der Erfindung wird eine kleine Anzahl von Perlen identifiziert, die Spezies präsentieren, die mit Kolloid-immobilisierten Zielmolekülen wechselwirken. Wechselwirkende Spezies können dann desorbiert oder von den Partikeln abgespalten und unter Verwendung von standardbiochemischen Analysetechniken identifiziert werden, wie beispielsweise Massenspektroskopie (MS) oder Matrixlaser-Desorptionsionisation (MALDI) MS, oder Peptidsequenziertechniken. Proteine, die an magnetische Perlen befestigt worden sind vermittels Wechselwirkung mit einer Affinitätsmarkierung, können für die Analyse durch kompetitive Inhibition der Wechselwirkung mit der Affinitätsmarkierung freigesetzt werden. Beispielsweise fangen magnetische Perlen, die NTA-Ni-Molekülbestandteile tragen, selektiv Histidin-markierte Spezies. Die His-markierten Spezies können von der Perle freigesetzt werden durch kompetitives Inhibieren der Wechselwirkung mit hinzugegebenem Imidazol.
Alternativ kann eine kleine Anzahl distinkter Molekülspezies, aus komplexen Mischungen, an magnetische Perlen ohne Fraktionierung gebunden werden; eine geringe Anzahl von Molekülen kann auf einer jeden Perle präsentiert werden unter Verwendung von Kügelchen, die eine geringe Anzahl funktioneller Gruppen präsentieren oder unter Verwendung einer großen Anzahl von Kügelchen mit einer niedrigen Konzentration der komplexen Mischung.
Zusätzlich können molekularbiologische Techniken verwendet werden, um eine einzelne oder eine geringe Anzahl von distinkten Spezies auf Perlen zu präsentieren. Auf diesem Weg sind die in situ Techniken aus magnetischer Selektion und Verdünnung, wie sie hierin beschrieben sind, besonders hinsichtlich Proteomics-Studien anwendbar. Ein Satz magnetischer Perlen kann generiert werden, um die Genprodukte einer cDNA-Bibliothek zu präsentieren, dann hinsichtlich ihrer Wechselwirkung getestet werden, mit Zielmolekülen zu wechselwirken, die auf einer Population von Kolloiden immobilisiert sind, die auch Hilfssignalelemente tragen können. cDNA-Bibliotheken bestehen aus den Genomfragmenten, die spezifisch für Proteine kodieren. cDNA-Bibliotheken können leicht unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt werden und sind umfänglich aus interessierenden Zelllinien verfügbar. Um die Befestigung der Proteine an Perlen oder Kolloiden zu erleichtern, kann eine cDNA-Bibliothek, als ganzes oder separat, in einen Affinitäts-Markierungsexpressionsvektor eingeführt werden. Beispielsweise werden Affinitäts-Markierungsvektoren verwendet, um Histidin-markierte oder Glutathion-S-Transferase (GST)-markierte Proteine zu produzieren.
Zellen können dann mit den sich ergebenden Plasmid-DNAs transfiziert werden. Wie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt nehmen bakterielle Zellen im Allgemeinen ein einzelnes Plasmid auf; auf diesem Weg kann ein Pool aus cDNA-Plasmiden gleichzeitig in Zellen transfiziert, auf Agarose angezogen werden und eine jede Kolonie wird statistisch eine einzelne Spezies der transfizierten Plasmid-DNA enthalten. Kolonien werden aufgenommen und im Miniaturmaßstab gemäß Standardverfahren kultiviert.
Zellkulturen werden dann gemäß Standardtechniken angezogen und induziert, um die codierten Proteine zu exprimieren. Um das Verfahren zu beschleunigen, können Zellkulturen (von denen eine jede einen einzelnen Klon darstellt) miteinander vereinigt, angezogen und induziert werden, als ganzes, um die codierten Proteine zu exprimieren. Die vereinigten Proteine werden dann an eine einzelne Perle gebunden. Dies bedeutet, dass wenn mit Kolloiden getestet wird, die ein Zielmolekül präsentieren, eine Perle, die ein positives Signal erzeugte, gleichzeitig die Wechselwirkungsspezies ebenso wie irrelevante Spezies präsentiert. Deshalb kann, wenn vereinigte Transfektanten verwendet werden, das Prozedere wie folgt wiederholt werden, um zu bestimmen, welcher Bestandteil der an der Perle befestigten Mischung tatsächlich mit der Kolloid-immobilisierten Spezies wechselwirkte. Die Perle-Kolloid-Mischungen können Gegenstand von Standardanalysetechniken sein, wie beispielsweise Peptid-Mikrosequenzierung, um zu bestimmen, welcher Kulturpool an der speziellen Perle gebunden worden war. Die Identifizierung eines einzelnen Proteins aus der an der Perle gebundenen Mischung identifiziert den Pool, aus dem die Transfektante abgeleitet war. Aliquots der einzelnen Transfektanten werden zurückgehalten, so dass eine jede Transfektante getrennt angezogen und induziert werden kann, um Protein zu exprimieren, das dann separat an einen Satz von Perlen gebunden wird. Der Test wird dann wiederholt, um einzelne wechselwirkende Bestandteile zu identifizieren.
Die Proteinreinigung kann vereinfacht werden unter Verwendung von magnetischen Perlen, die Bindungspartner der Affinitätsmarkierung zeigen, die in das Protein eingeführt worden ist. Alternativ können exprimierte Proteine an magnetische Perlen vermittels Affinitätsmarkierungswechselwirkung aus einer rohen Mischung oder nach Standardreinigung gebunden werden.
Eine Beschreibung der Analyse von wechselwirkenden Spezies, wie beispielsweise Kolloid-Perlen-immobilisierten Spezies folgt.
Magnetische Perlen, die Spezies präsentieren, die mit Kolloid-immobilisierten Spezies wechselwirken, werden mit einer Kolloidschicht beschichtet infolge der Vervollständigung der Wechselwirkung zwischen den Spezies. Diese Perlen erzeugen ein elektronisches Signal. Nach dem in situ Prozess aus magnetischer Selektion und Verdünnung können magnetische Perlen zusammen mit ihren gebundenen Kolloiden Analysetechniken unterworfen werden, wie beispielsweise MS, MALDI-MS, Peptidsequenzierung (siehe auch Edmann-Mikrosequenzierung) und dergleichen, was auch enzymatische Spaltungsschritte umfassen kann, um die Identität der mutmaßlichen wechselwirkenden Spezies zu identifizieren. Immobilisierte Proteine können von den Perlen und Kolloiden für die Analyse durch eine Vielzahl von Verfahren entfernt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kompetitive Inhibition der Wechselwirkung zwischen Affinitätsmarkierung und Perle, enzymatischen Verdau, saure Elution und Laserdesorption. Beispielsweise können Proteine, die mit Histidin-Markierungen exprimiert werden, um die Befestigung an Oberflächen zu erleichtern, die Nitrilotriessigsäure/Nickel (NTA-Ni)-Gruppen präsentieren, durch Einführen von Imidazol freigegeben werden. Alternativ können Proteine von Trägern entfernt werden unter Verwendung von Trypsinspaltung. Moleküle können auch von Partikeln durch Laserionisationsdesorption entfernt werden und dann direkt in ein automatisiertes Analysesystem wie beispielsweise MS gegeben werden.
Ein Verfahren der Erfindung stellt massiv-parallele Analysen großer Anzahlen mutmaßlicher Wechselwirkungsspezies bereit. Ein derartiges System ist besonders nützlich für das Entschlüsseln des Proteinwechselwirkungsnetzwerkes von Genprodukten des gesamten menschlichen Genoms.
In diesem Fall werden cDNA-Bibliotheken in distinken Aliquots an getrennten Stellen bereitgestellt, wobei die DNA-Bibliotheken das gesamte Genom, eine Untergruppe oder eine Bibliothek von mit Erkrankung assoziierten Genen codieren. Ein jedes cDNA-Fragment wird separat in einen Proteinexpressionsvektor eingeführt. Um die Bindung des exprimierten Proteins an Perlen oder Kolloidpartikel zu erleichtern, können Affinitätsmarkierungsvektoren verwendet werden. Zellen werden separat mit der Plasmid-DNA transfiziert und die Proteinexpression induziert. An diesem Punkt werden Proteine, die eine Affinitätsmarkierung tragen, separat mit Perlen oder Kolloiden gemischt, die einen Bindungspartner für die Affinitätsmarkierung tragen. Auf diese Weise wird jedes Partikel eine einzige Proteinspezies präsentieren. Beispielsweise ist ein erster Satz von Proteinen, die Histidin-Markierungen tragen, an einen ersten Satz magnetischer Perlen gebunden, die Nitrilotriessigsäure (NTA)-Nickel-Molekülbestandteile tragen; NTA-Ni (II) bindet Histidinabschnitte. Ein zweiter Satz von Proteinen, die Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsmolekülteile tragen, wird an Goldkolloide befestigt, die Glutathion präsentieren, das der Bindungspartner von GST ist. Unterschiedliche Partikeltypen, d. h. Perlen versus Kolloiden, brauchen keine unterschiedlichen Affinitätsmarkierungen zu tragen. Ein jedes Partikel trägt jedoch eine Markierung, die das auf seiner Oberfläche gezeigte Protein in einzigartiger Weise identifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Markierung eine DNA-Sequenz und Goldkolloide zeigen auch einen elektroaktiven Signalmolekülanteil.
Gemäß den oben beschriebenen Verfahren der Erfindung werden magnetische Perlen, die einen ersten Proteinsatz tragen, mit Goldkolloiden gemischt, die einen zweiten Proteinsatz und einen elektroaktiven Signalmolekülbestandteil tragen. Die Lösung wird über eine Elektrodenanordnung gegeben. Unter einer jeden Grundplatte der Elektrodenanordnung befindet sich ein separat steuerbarer Elektromagnet. Man erlaubt, dass Proteine, die auf einem Kolloid gezeigt sind, mit Proteinen wechselwirken, die auf magnetischen Perlen gezeigt werden. Man erinnere sich, dass wenn ein Protein, das an ein elektronisches Signalkolloid gebunden ist, mit einem Protein auf einer magnetischen Perle wechselwirkt, der Komplex dann ein elektronisches Signal umwandeln wird, wenn er an die Elektrode angezogen wird. Magnetische Perlen alleine sind nicht in der Lage, dieses Signal bereitzustellen. Nach einer gewissen Inkubationszeitspanne werden alle Elektromagneten gleichzeitig angeschaltet. Elektromagneten, unter Grundplatten, die ein positives Signal registrieren, werden auf „ON" gehalten, während jene, die kein Signal erzeugten, freigegeben werden, um Perlen freizusetzen, die nicht mit einem Kolloid-immobilisierten Partner wechselwirkten. Eine Öffnung wird geöffnet und freigesetzte Perlen werden weggewaschen. Flüssigkeit wird in die Wechselwirkungskammer eingeführt, um die verbleibenden Perlen zu verdünnen und Elektromagneten unter den Grundplatten, die ein Positiv registrierten, werden freigegeben. Das Verfahren wird wiederholt, bis man sicher ist, dass statistisch nur eine mit Signalkolloiden versehene Perle übrig bleibt.
Eine jede magnetische Perle und ein jedes Kolloid kann einen DNA-Strang tragen, der die Identität des befestigten Proteins codiert. Zu diesem Zeitpunkt werden Stücke von einzelsträngiger, zusammengesetzte DNA zu der Wechselwirkungskammer hinzugegeben.
Ein jeder DNA-Strang besteht aus zwei Teilen: ein Ende ist komplementär zu einer DNA-Sequenz auf einer magnetischen Perle und das andere Ende ist komplementär zu einer Sequenz auf einem Kolloid. Alle möglichen Kombinationen von Sequenzen auf Perlen und Kolloiden sind dargestellt. Man erlaubt, dass die DNA frei mit den Perlen-Kolloid-Komplexen wechselwirkt. Nicht gebundene DNA wird aus der Wechselwirkungskammer ausgewaschen. DNA-Stränge, die gleichzeitig an eine komplementäre Sequenz auf einer magnetischen Perle und einer komplementären Sequenz auf einem Kolloid binden, stellen „Lösungen" des Problems dar, welche Proteine jeweils miteinander wechselwirken. Statt Peptid-Mikrosequenzierung durchzuführen, um die Identität der wechselwirkenden Paare zu enthüllen, eluiert man lediglich die gebundenen DNA-Lösungen und unterwirft sie einer DNA-Sequenzierung. Die Sequenz eines jeden DNA-Stranges wird das Komplement des DNA-Codes sein, das ein jedes Protein identifiziert.
Enzyme, die einzelsträngige DNA verdauen, können nach Hybridisierung zu der Lösung hinzugegeben und abgespült werden, um nicht gebundene Teile von DNA zu entfernen. Auf diesem Wege werden DNA-Stränge, die nur an ein Partikel gebunden sind, aber nicht an das andere, nicht als Lösungen ausgelesen. Enzyme mit 3'- und/oder 5'-Exonuklease-Aktivität, wie beispielsweise E. coli-DNA Pol I, die einzelsträngige DNA von den Enden her verdauen, sind bevorzugt, da sie keine DNA-Bruchstellen verdauen.
Die Länge von DNA, die erforderlich ist, um den Proteinsatz zu verschlüsseln, ist eine Funktion der Anzahl von distinkten Spezies in dem Satz. Auch ist die Länge der DNA-„Markierung" direkt proportional zur Anzahl von ungepaarten Basen, die erlaubt werden, ohne eine Hybridisierung zu beseitigen. Aus diesem Grund sind kurze DNA-Stränge bevorzugt. Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur und Salzkonzentration zusammen mit dem Hinzugeben von Chemikalien wie beispielsweise Formamid, können auch optimiert werden, um sicherzustellen, dass nur perfekt gepaarte DNA hybridisieren wird.
Alternativ können die Komplexe aus magnetischer Perle und Kolloid getrennt aus der Wechselwirkungskammer vor der Einführung von DNA-„Lösungs"-Strängen freigegeben werden, durch sequenzielle Freigabe der Elektromagneten unterhalb einer jeden Elektrodengrundplatte. Ein jeder wechselwirkender Komplex kann dann zu einer getrennten Stelle umgeleitet werden, wo alle möglichen DNA-Lösungen eingeführt werden. Um die sterische Interferenz bei der DNA-Hybridisierung zu verringern, können die wechselwirkenden Proteinpartner von den Partikeln dissoziiert und von der isolierten Stelle entfernt werden vor dem Einführen von DNA-Lösungs-Strängen. Man erlaubt, dass die DNA-Stränge gleichzeitig mit Perlen und Kolloiden in Abwesenheit von Protein-Protein-Wechselwirkungen hybridisieren. Nicht-wechselwirkende DNA-Spezies werden weggewaschen, beispielsweise durch Pelletieren der Partikel und Entfernen des Überstandes. Puffer, die für die Dissoziation von DNA-Hybriden geeignet sind, werden hinzugegeben, Partikel pelletiert und die im Überstand enthaltene DNA, die die Identität der wechselwirkenden Proteine codiert, wird dann sequenziert durch Standardsequenzierverfahren oder durch Hybridisierung an DNA-Array-Chips.
Um zu verhindern, dass Proteine auf magnetischen Perlen aneinander vor der Einführung von Proteinen auf Kolloiden aneinander binden, können magnetische Perlen hinzugegeben werden (in der Masse oder einzeln) und unmittelbar magnetisch zu der Elektrodenanordnung gezogen werden. Nach einer Inkubationsperiode werden Elektromagneten freigegeben und frei in Lösung, vor der ersten Runde aus Selektion und Verdünnung inkubiert.
Alternativ können Bestandteile, die an Perlen und Kolloide gebunden sind, Pools von Spezies sein.
Der Prozess aus magnetischer Selektion und Verdünnung, wie er oben beschrieben ist, wird die Analyse sicherlich vereinfachen und die Genauigkeit des Experimentes erhöhen. Er ist jedoch nicht insoweit absolut erforderlich, als dass das Hinzugeben der DNA-Hybrid-Lösungen alleine die Identität der wechselwirkenden Paare aufklären wird.
Der Signalmechanismus, der mit den Kolloiden verbunden ist, muss nicht elektronisch oder auf das Kolloid beschränkt sein. Beispielsweise kann die rote Farbe, die die Kolloide verleihen, wenn sie auf einer Oberfläche agglomerieren, als Indikator dafür dienen, dass eine Spezies auf einer Perle mit einer Spezies auf einem Kolloid in Wechselwirkung getreten ist. In diesem Falle braucht die Perle nicht magnetisch zu sein. Alternativ kann ein fluoreszierender Molekülbestandteil an den Kolloiden befestigt sein. Nach einer Inkubationsperiode können die Perlen (ob magnetisch oder nicht) konzentriert oder pelletriert werden, so dass die Lösung, die die nicht-interagierenden Kolloide enthält, entfernt werden kann. Fluoreszierende Perlen werden dann von nicht-wechselwirkenden Perlen getrennt und analysiert, um die Identität der wechselwirkenden Partner zu enthüllen.
Obwohl in der obigen Beschreibung „Proteine" aus einer cDNA-Bibliothek an die Perlen und Kolloide gebunden sind, antizipiert die Erfindung die Bindung einer großen Breite von mutmaßlichen wechselwirkenden Spezies an die Partikel. Diese Spezies können umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, chemische Verbindungen, Vorläufer von chemischen Verbindungen, reaktive Gruppen, Proteinkomplexe, Nukleinsäure-Proteinkomplexe, Sporen, Zellen, Nukleinsäuren, Peptide und Arzneimittelkandidaten. Diese Spezies können an die Kolloide und Perlen gebunden sein vermittels Affinitätsmarkierungswechselwirkung, nicht-spezifischer Bindung, spezifischer Bindung oder durch kovalentes chemisches Koppeln.
Zusätzlich muss die identifizierende Markierung, die an den magnetischen Perlen und Kolloiden befestigt ist, nicht auf einer Nukleinsäure basieren. Komplexe aus Perle und Kolloid können separat von der Elektrodengrundplatte freigegesetzt und zu getrennten Stellen abgelenkt werden, wo die Markierungen auf den Perlen entschlüsselt werden. Identifizierende Markierungen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Nukleinsäuremarkierungen, Radiofrequenzmarkierungen, fluoreszierende Markierungen, Fluoreszenz, die mit einem Partikel assoziiert ist, und chemische Markierungen.
Verschiedene Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um Wechselwirkungsmotive statt diskreter Bindungspartner zu identifizieren. Für diese spezielle Anwendung wird eine erste heterologe Population aus Proteinen an einen Satz magnetischer Perlen gebunden und eine zweite heterologe Population aus Proteinen an einen Satz von Kolloiden gebunden; ein jedes Partikel präsentiert eine einzelne Spezies. Nach dem hierin beschriebenen Selektions-Verdünnungs-Verfahren werden Perlen-Kolloid-Komplexe Pool-Sequenzierungstechniken unterworfen, um Wechselwirkungsmotive zu identifizieren. Einzelne Kolloid-tragende Perlen werden isoliert. Eine jede magnetische Perle präsentiert dadurch eine einzelne Spezies, die durch eine heterologe Population von Kolloid-tragenden Molekülen gebunden ist. Wechselwirkende Moleküle werden von ihren Partikelträgern freigegeben durch kompetetive Inhibition der Affinitätsmarkierungswechselwirkung. Wechselwirkende Komplexe werden einem allgemeinen enzymatischen Verdau unterzogen durch, beispielsweise, Trypsin; wechselwirkende Bereiche werden vor Verdau geschützt. Komplexe werden dann mit N-terminaler Peptidase verdaut, die vom N-Terminus zu dem Punkt hin verdaut, an dem der Wechselwirkungsbereich oder das Wechselwirkungsmotiv beginnt. Nach Verdau werden die wechselwirkenden Moleküle voneinander durch saure Elution freigesetzt. Die Mischung wird dann Pool-Sequenzierungstechniken unterzogen, was typischerweise ein Edman-Mikrosequenzieren mit sich bringt. Das Ergebnis der Pool-Sequenzierung besteht darin, dass wo immer ein Konsensmotiv existiert, die Identität dieser Aminosäuren klar ist, während andere Regionen als Rauschen erscheinen.
HPLC und ähnliche Techniken können verwendet werden, um wechselwirkende Spezies vor der Sequenzanalyse zu trennen.
Alternativ kann, nachdem mit Kolloid versehene Perlen isoliert worden sind, eine erste Kolloid-gebundene Spezies von ihren Trägern freigesetzt werden vermittels kompetitiver Inhibition der Wechselwirkung aus Affinitätsmarkierung und Kolloid, während man erlaubt, dass ein zweiter Satz von Proteinen an den Perlen gebunden bleibt. Dies kann entweder erreicht werden, indem man erlaubt, dass Proteine an die Perlen durch eine unterschiedliche Affinitätsmarkierungs-Wechselwirkung binden, oder durch kovalentes Koppeln von Spezies an die Perlen. Der enzymatische Verdau wird dann durchgeführt, während Proteinpaare an die Kugeln gebunden blieben. Diese Verfahrensweise verdaut bevorzugterweise das erste Protein, dass nicht direkt an die Perle gebunden ist, wohingegen die zweite an die Perle gebundene Spezies geschützt wird. Die Verdauungsprodukte können leicht entfernt werden, imdem die Perlen konzentriert werden, wodurch der Überstand verworfen wird. Die erste Spezies kann dann von ihrem Bindungspartner eluiert werden durch saure Elution oder ähnliche Techniken. Der Überstand, der die verdaute erste Spezies enthält, wird dann Pool-Sequenzierungstechniken unterworfen, um (ein) Konsensbindungsmotiv(e) zu erhellen. Die zweite Spezies kann von der Perle freigesetzt werden und wird einer Pool-Sequenzierung unterzogen. Alternativ kann die Verfahrensweise mit der ersten Spezies wiederholt werden oder eine Konsenssequenz von der ersten Spezies abgeleitet werden, die an die Perle gebunden ist, und die zweite Spezies, die an die Kolloide gebunden ist.
Verfahren der Erfindung können durchgeführt werden mit: einer einzelnen Spezies, die auf den Kolloiden präsentiert ist und vielen Spezies, die an die Perlen gebunden sind; vielen Spezies, die an die Kolloide gebunden sind, und vielen Spezies, die an die Perlen gebunden sind; oder vielen Spezies, die an Kolloide gebunden sind, und eine einzelne Spezies, die an die Perlen gebunden ist. Zusätzlich kann eine gemischte Population aus Partikeln, von denen ein jedes eine einzelne distinkte Spezies präsentiert, oder eine gemischte Population aus Partikeln verwendet werden, die gemischte Spezies präsentieren. In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden magnetische Perlen, die mit einer Schicht aus wechselwirkenden Kolloiden beschichtet sind, elektromagnetisch auf der Grundlage unterschiedlicher Massen ausgewählt. Alternativ können Kolloide modifiziert werden, so dass sie nicht nur einen mutmaßlichen Bindungspartner präsentieren, sondern auch einen Molekülanteil, der unterschiedliche elektromagnetische Eigenschaften verleihen wird, wenn er mit (einem) magnetischen Perle(n) komplexiert ist. Magnetische Perlen, die mit diesen Kolloiden versehen sind, können dann ausgewählt, getrennt und analysiert werden, um die Identität der Partikel-immobilisierten Wechselwirkungspartner zu enthüllen.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung braucht die Perle nicht magnetisch zu sein. Kolloid-Perlen-Komplexe können von nicht gebundenen Kolloiden durch Sedimentation, Zentrifugation oder durch physikalisches Entfernen von Perlen entfernt werden, die mit Kolloiden versehen werden, die Hilfssignalelemente präsentieren oder auch nicht.
In ähnlicher Weise brauchen die Partikel, die mutmaßliche Bindungspartner mit oder ohne Hilfssignalelemente präsentieren, nicht kolloidal zu sein. Beispielsweise können Moleküle direkt in Liposomen zusammen mit Signalmolekülbestandteilen eingebaut werden, wie beispielsweise Ferrocen-Derivaten, die an Lipide gekoppelt sind. Alternativ können Moleküle vermittels Affinitätsmarkierungswechselwirkung an Liposomen gebunden werden, die auch Bindungspartner für Affinitätsmarkierungen umfassen.
Verfahren der Erfindung können durchgeführt werden unter Verwendung einer heterologen Population von Kolloiden, die jeweils eine einzelne Spezies, oder Kolloiden, die die mehr als eine Spezies präsentieren. Spezies, die an Partikel gebunden sein können, wie hierin beschrieben, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Proteine, Domänen oder Fragmente von Proteinen, wie beispielsweise Kringle-Domänen, kleine Moleküle, natürliche Produkte und Arzneimittel.
Kolloide, die kein elektroaktives Signalelement präsentieren, oder die zusätzliche Signalelemente zeigen, können auch mit Aspekten dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können Kolloide derivatisiert werden, um elektroaktive ebenso wie fluoreszierende Molekülanteile zu präsentieren (einschließlich, per definitionem hierin, phosphoreszierende Molekülanteile). Ein jeder Satz von Kolloiden kann eine unterschiedliche Fluoreszenzfarbe präsentieren. FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs)-Analyse kann verwendet werden, um Hetero-Partikelkomplexe nach magnetischer Selektion, aber vor dem Identifizieren von Molekülspezies zu verwenden, die an eine jede Perle gebunden sind. Mit Kolloid versehene Perlen können auch durch elektromagnetische Verfahren getrennt werden. Zusätzlich können Kolloide, die kein Hilfssignalelement tragen, verwendet werden bei Aspekten der Erfindung. Diese Kolloid-versehenen Perlen können visuell identifiziert werden, da die Agglomeration von Goldkolloiden auf Partikeln diese rot färbt. Zusätzlich können Nanopartikel, die inhärent fluoreszieren, beispielsweise als eine Funktion ihrer Größe, ebenfalls verwendet werden, um die an der Oberfläche gebundenen Biomoleküle sowohl zu signalisieren als auch zu identifizieren.
Ein Attribut eines Aspektes der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, dass sie die MULTIPLEX-Identifizierung und Isolierung von interagierenden Spezies erlaubt. Diese Fähigkeit ist besonders nützlich auf dem Gebiet der Proteomics infolge der großen Anzahl von möglichen Wechselwirkungen zwischen den Genprodukten, die die Proteine sind. Mit der Anzahl von Genen im menschlichen Genom, die nun auf etwa 40.000 geschätzt wird, wird die Bestimmung von Wechselwirkungsnetzwerken durch sequentielles paarweise Testen minimal 8 × 10⁸ Experimente umfassen. Die Isolierung von wechselwirkenden Spezies, die an partikelähnlichen Trägern gebunden sind, vereinfacht die Analyse von wechselwirkenden Spezies, einschließlich der Identifizierung von wechselwirkenden Motiven. Zusätzlich erlaubt die Befestigung von mutmaßlichen Bindungspartnern an festen Trägern die Wiedergewinnung und erneute Verwendung von Partikeln, die Spezies präsentierten, die nicht wechselwirkten.
Beispiel 1
Massiv-parallele Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen: Aufklärung der Wechselwirkungskarte des menschlichen Proteoms
Die vorliegenden prophetischen Beispiele beschreiben, wie eine massiv-parallele Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durchgeführt wird, die besonders nützlich ist, wenn Proteine noch nicht charakterisiert sind. Hier wird dieses Verfahren verwendet, um die Protein-Wechselwirkungskarte des menschlichen Genoms aufzuklären. Eine Untergruppe von oder der gesamte Satz an Proteinen des Proteoms wird mit Affinitäts-Markierungen exprimiert, um die Befestigung des exprimierten Proteins an Sätze von Partikeln zu erleichtern. Partikel-immobilisierte Proteine werden miteinander vereinigt und man erlaubt, dass sie miteinander wechselwirken. Wechselwirkende Paare werden aus den vereinigten Mischungen durch einen reiterativen Prozess aus magnetischer Selektion und Verdünnung ausgewählt. Nach dem Verfahren aus Selektion und Verdünnung wird die Identität von wechselwirkenden Partnern bestimmt. Der Selektionsschritt verringert die Komplexität des Problems, indem die Notwendigkeit beseitigt wird, nicht-wechselwirkende Proteine zu analysieren.
Proteine und ihre codierenden DNA-Moleküle sind indirekt miteinander verbunden durch Co-Immobilisieren beider auf einem gemeinsamen Partikel oder Perle, wobei ein jedes Partikel (oder Perle) eine einzelne Proteinspezies und ihre codierende DNA zeigt. Das Verbinden des exprimierten Proteins mit seiner codierenden DNA befördert die Identifizierung eines jeden Satzes von wechselwirkenden Proteinen nach dem Verfahren aus Selektion und Verdünnung. Ein jedes Protein und seine codierende DNA wird auf zwei unterschiedlichen Arten von Partikeln immobilisiert: ein rekrutierbares Partikel und ein Signalpartikel. Die Größen der Partikel sind ebenfalls unterschiedlich, so dass kleinere Signalpartikel Satelliten um ein jedes größeres rekrutierbare Partikel bilden können. Bei diesem Beispiel wird ein jedes Protein und seine codierende DNA auf einer einzelnen magnetischen Perle mit 4–10 μm ebenso wie auf einer Vielzahl von Fluid-suspendierbaren Nanopartikeln immobilisiert, deren Durchmesser von 4–40 nm beträgt und die elektroaktive Signalentitäten tragen. Wenn eine erste Spezies auf einer magnetischen Perle biologisch mit einer zweiten Spezies auf einem Signalnanopartikel wechselwirkt, wird das rekrutierbare Partikel mit dem Signalpartikel „verbunden". Diese Heteropartikel-Komplexe werden dann magnetisch an eine Aufnahmeelektrode rekrutiert (siehe 6), wo sie ein Signal abgeben können wie beispielsweise ein elektronisches oder elektrochemisches Signal. Um die Multiplex-Analyse zu erleichtern, werden die Partikel magnetisch an eine Elektrodenanordnung angezogen, die eine Anzahl von einzeln adressierbaren Elektrodengrundplatten aufweist. Unterhalb einer jeden Elektrodengrundplatte befindet sich ein einzeln steuerbarer Elektromagnet, so dass das magnetische Feld oberhalb einer jeden Grundplatte selektiv ein- und ausgeschaltet werden kann. Magnetpartikel, die jedoch nicht mit Signalpartikeln verbunden sind, die kein Signal abgeben können, können auch an der gleichen Elektrodengrundplatte rekrutiert werden, die ein positives Signal abgibt. Diese nicht-signalgebenden magnetischen Perlen werden elektromagnetisch von der Grundplatte freigesetzt und aus dem Wechselwirkungsreservoir ausgewaschen. Signalgebende Nanopartikel, die nicht mit Spezies auf Magnetpartikeln wechselwirken, verbleiben in einer homogenen Suspension und geben kein Signal ab, sondern werden auch aus dem Wechselwirkungsreservoir ausgewaschen. Beide Spülfunktionen werden durchgeführt, indem die Magnetfelder unterhalb von Elektrodengrundplatten aufrecht erhalten werden, die ein positives Signal abgeben, um wechselwirkende Komplexe zurückzuhalten, während die magnetischen Felder unterhalb von Grundplatten, die kein positives Signal ergeben, auf null gestellt werden, um nicht-wechselwirkende magnetische Perlen freizusetzen. Eine Öffnung 150 (6) wird geöffnet und Flüssigkeit wird aus dem Wechselwirkungsreservoir ausgewaschen, wodurch nicht-wechselwirkende magnetische Perlen und nicht-wechselwirkende Nanopartikel weggetragen werden. Die Öffnung wird geschlossen, alle magnetischen Felder werden auf Null gestellt und mehr Puffer wird durch eine zweite Öffnung 160 zusammen mit mechanischem Rühren bereitgestellt, um die Partikel erneut zu suspendieren und erneut zu verteilen. Alle magnetischen Felder unterhalb der Elektrodengrundplatte werden wieder angeschaltet und das Verfahren aus Selektion und Verdünnung wird wiederholt, bis, statistisch, eine jede Grundplatte, die ein positives Signal abgibt, eine einzelne magnetische Perle enthält, die an eine Vielzahl von Signalnanopartikeln gebunden ist.
Um die Identität von wechselwirkenden Proteinen zu bestimmen, wird eine Anordnung von magnetischen Stiften, deren Größen zu der der Elektrodenanordnung passen, über die Elektrodenanordnung benachbart angeordnet und die Magnetfelder unterhalb der gesamten Elektrodenanordnung auf Null gefahren, so dass ein jeder magnetischer Stift einen einzelnen Heteropartikel-Komplex einfängt. Die beladene Stift-Anordnung wird in eine Platte mit mehreren Näpfen mit vergleichbaren Größen eingetaucht, wobei ein jeder Napf davon mit Lösung gefüllt ist, der DNA-Amplifikationsreagenzien enthält. Die entsprechenden codierenden DNA-Sequenzen (immobilisiert auf den Nanopartikeln und der Perle) werden durch PCR oder ähnliche Techniken amplifiziert und sequenziert, um die Identität eines jeden Satzes aus wechselwirkenden Proteinen zu enthüllen. Einzelne Aspekte des Experiments werden im Folgenden angegeben.
Herstellung von Proteinen
Eine DNA-Sequenz, die ein jedes Proteinelement des Proteoms codiert, wird in einen bakteriellen Proteinexpressionsvektor eingeführt. Der Expressionsvektor trägt eine Affinitätsmarkierung, (His)₆ in diesem Falle, Tandem Repeats von Gal4-Konsensussequenzen und zwei Sequenzen, die die Proteinidentifizierungssequenz flankieren, an die PCR-Primer binden können. Die Histidin-Markierung erleichtert die Befestigung des exprimierten Proteins an dem Partikel. Die Gal4-Konsensussequenz dient dazu, die codierende DNA an das Partikel vermittels der Wechselwirkung zwischen dem Erkennungsmotiv und einer Partikel-immobilisierten Hefe-DNA-Bindungsdomäne zu binden, die in diesem Falle ein GST-Gal4-Fusionsprotein ist. Die DNA-Bindungsdomäne von Gal4 (aa' 1–100) bindet an die Konsensussequenz CGGattAgAagcCgCCGAG und das GST bindet an einen Glutathion-Molekülbestandteil auf dem Partikel. Die Proteine werden separat exprimiert in einem zellfreien Translationssystem, um das Auftreten von irrelevanten Proteinen und Zelldebris zu verringern. Nach Proteinexpression enthält eine jede Expressionsmischung die codierende DNA und das exprimierte Protein. Eine jede Proteinexpressionsmischung wird in zwei Aliquots aufgeteilt. Eine einzelne magnetische Perle (mit einem Durchmesser von 4–10 μm) wird zu einem ersten Aliquot hinzugegeben und eine Menge NTA-Glutathion-SAM-beschichtete Nanopartikel werden zu einem zweiten Aliquot hinzugegeben. Die Partikel werden pelletiert und gewaschen, um Protein zu entfernen, das nicht Partikel-gebunden ist. Partikel und Perlen werden in Untergruppen von 1000 Spezies pro Pool miteinander vereint und einer magnetischen Selektion/Verdünnung und elektrochemischen Analyse unterzogen. Auf diese Art und Weise können nicht identifizierte Proteine an die gleiche Perle oder das gleiche Partikel gebunden sein, die/das die entsprechende codierende DNA bindet.
Herstellung von Nanopartikeln
Gold-Nanopartikel (Durchmesser = 4–25 nm) werden mit heterologen selbstassemblierten Monolayern (SAMs) derivatisiert, die präsentieren:

a) NTA (Nitrilotriessigsäure)-Ni⁺⁺, das Histidin-markierte Proteine fängt;
b) Glutathion, das Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine bindet,
c) Octamethylfenocen, das eine redoxaktiver Molekülanteil ist, der ein elektronisches oder elektrochemisches Signal abgeben kann;
d) Carboxylate, die Partikelaggregation verhindern;
e) Triethylenglycol, um nicht-spezifischer Adsorption zu wiederstehen. Im Grunde genommen kann eine jegliche biologische Spezies auf einem Kolloid immobilisiert werden.

Elektrochemische Analyse
Ein elektrochemisches Analysegerät von CH Instruments (Austin, TX) Modell 630 wird verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen auf magnetischen Perlen immobilisierten Spezies und Spezies, die auf Kolloiden immobilisiert sind, nachzuweisen, die auch redoxaktive Metalle tragen. Das Instrument ist so modifiziert, dass es einen Multiplex-Nachweis erleichtert. In diesem Falle sind die redoxaktiven Metalle Ferrocen-Derivate. Grundplatten der Elektrodenanordnung sind individuell ansteuerbar und dienen als Arbeitselektrode. In diesem Falle sind die Unterlagen Gold-beschichtet und derivatisiert mit leitfähigen selbst-assemblierten Monolayern. Eine Ag vs. Ag/Cl-Referenzelektrode wird mit einer Pt-Hilfselektrode verwendet. Elektroden werden abgetastet unter Verwendung von Wechselstromvoltametrie (ACV) mit einer Überspannung von 25 mV bei einer Frequenz von 10 Hz.
Konstruktion von einer Elektrodenanordnung, die zwischen einzeln adressierbaren Elektromagneten in Sandwich-Bauweise angeordnet ist
Elektrodenanordnungen 100 (6) mit 300–500 Elektrodengrundplatten 110 werden konstruiert, indem Gold über Ni⁺⁺ plattiert wird. Die Elektrodengrundplatten sind 50–500 μm auf Kante und sind in Sandwich-Bauweise zwischen Sätzen von einzeln adressierbaren Helmholtz-Elektromagneten 120 so angeordnet, dass ein Magnetfeldgradient erzeugt werden kann, um magnetische Perlen an der Grunsplattenoberfläche zu rekrutieren und dann zu halten (siehe 6). Die Richtung des Stroms wird umgekehrt, um das Magnetfeld auf Null zu stellen, wenn es erwünscht ist, die magnetischen Perlen von der Oberfläche freizugeben, um wegzuwaschen oder erneut zu verteilen. Um zu gewährleisten, dass das Wechselwirkungsreservoir termisch von den Elektromagnetanordnungen isoliert ist, so dass Hitze die Proteine in Lösung nicht denaturiert, wird eine Schicht aus Isoliermaterial 130 zwischen den Elektromagneten und dem Wechselwirkungsreservoir 140 angeordnet.
Berechnung von Proteinsätzen und der Elektrodengrundplattenanzahl
Um die Proteinwechselwirkungskarte des gesamten Proteoms zu erzeugen, muss man das Proteom in Untergruppen aufteilen, die dann hinsichtlich Wechselwirkung mit einer jeden anderen Untergruppe getestet werden. Unter der Annahme, dass es etwa 50.000 interessierende Proteine gibt, wird das Proteom in 50 Gruppen zu jeweils 1000 Proteine eingeteilt. Eine jede Gruppe aus 1000 Proteinen wird dann auf Wechselwirkung mit einer jeden anderen Gruppe von 1000 getestet, was zu einer 50×50 Matrix oder 2500 einzelnen Experimenten führt. Die Anzahl von Proteinen in einer jeden Untergruppe bestimmt die Anzahl von Elektrodengrundplatten in einer jeden Anordnung. Wenn man annimmt, dass ein jedes Protein einen einzigen Bindungspartner aufweist, dann hat ein jedes Protein eine 1/50-Chance, diesen Partner zu finden, wenn auf Wechselwirkung mit einer der 50 Untergruppen von Proteinen getestet wird. Ein jedes Protein weist jedoch im Durchschnitt wahrscheinlich 5 relevante Bindungspartner auf, was die Wahrscheinlichkeit, einen Bindungspartner innerhalb einer Untergruppe zu finden, auf 1/10 erhöht. Dies bedeutet, dass für 2000 Proteine in einem vereinigten Wechselwirkungsmix 200 ein positives Signal geben werden, was impliziert, dass die Elektrodenanordnung 300–500 Grundplatten aufweisen sollte. Signale auf niedrigem Niveau von nicht-spezifischen Bindungsereignissen sind minimal in Folge der kompetitiven Inhibition durch relevante Binder. Das Auftreten von falsch Positiven wird jedoch minimiert, wenn eine Signalschwelle eingestellt wird, wobei Signale unterhalb der Schwelle als negativ gezählt werden. Relative Affinitäten werden bestimmt durch Vergleich des Umfangs der Wechselwirkung einer ersten bindenden Spezies und einer zweiten bindenden Spezies mit einem dritten Zielmolekül, an das die erste und zweite binden.
Beispiel 2
Bestimmen der Bindungspartner eines einzelnen Zielproteins mit einem großen Pool von Kandidatenbindungspartnern
Dieses prophetische Beispiel beschreibt, wie Proteine aus einem großen Pool mutmaßlicher Bindungspartner identifiziert werden, die mit einem einzelnen Zielprotein wechselwirken.
Proteine aus dem großen Pool werden wie oben in Beispiel 1 hergestellt und nur auf Signalnanopartikel immobilisiert. Das Zielprotein wird auf einem Satz magnetischer Perlen immobilisiert. Da die Identität des Zielproteins bekannt ist, ist es nicht erforderlich, seine codierende DNA mit zu immobilisieren. Wechselwirkungspartner werden ausgewählt durch elektrochemische Analyse, wie oben beschrieben.
Beispiel 3
Auswahl von Wechselwirkungspartnern durch FACS-Analyse
Dieses Beispiel beschreibt, wie die Bindungspartner eines einzelnen Zielproteins identifiziert werden. Das Zielprotein wird auf einem Satz Perlen immobilisiert, die einen Durchmesser von 4–25 μm aufweisen. Mutmaßliche Bindungspartner, die wie oben beschrieben hergestellt oder aus einer cDNA-Bibliothek erzeugt werden können, werden zusammen mit ihrer codierenden DNA auf Nanopartikeln co-immobilisiert, die fluoreszierende Signalmolekülanteile tragen. Wenn ein Perlen-immobilisiertes Protein mit einer Spezies wechselwirkt, die auf Nanopartikel immobilisiert ist, wird die Perle mit fluoreszierenden Nanopartikeln versehen und kann durch FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs)-Analyse isoliert werden, woraufhin die gebundene DNA einer jeden wechselwirkenden Spezies sequenziert wird, um die Bindungspartner zu identifizieren.

Claims

Verfahren, umfassend: Magnetisches Ziehen eines ersten Gegenstandes und eines ersten chemischen oder biologischen Mittels, das relativ dazu immobilisiert ist, an eine erste Stelle und Ziehen eines zweiten Gegenstandes an eine zweite Stelle; selektive magnetische Freisetzung des ersten Gegenstandes aus der ersten Stelle durch selektive Deaktivierung der mit einer Elektrode assoziierten magnetischen Kraft oder magnetische Freisetzung des zweiten Gegenstandes aus der zweiten Stelle durch selektive Deaktivierung der mit einer Elektrode assoziierten magnetischen Kraft, während der zweite bzw. erste Gegenstand an seiner entsprechenden Stelle gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste chemische oder biologische Mittel einen Arzneimittelkandidaten darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste Mittel mit einem Bindungspartner davon verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Gegenstand einen magnetischen Gegenstand darstellt.
Verfahren nach Anspruch 4, worin jeweils die ersten und zweiten Gegenstände eine Magnetperle darstellen.
Verfahren nach Anspruch 3, umfassend das magnetische Ziehen des ersten Gegenstandes an die erste Stelle und das magnetische Ziehen des zweiten Gegenstandes an die zweite Stelle; und selektives magnetisches Freisetzen des zweiten Gegenstandes aus der zweiten Stelle durch selektive Deaktivierung der mit einer Elektrode assoziierten magnetischen Kraft, während der erste Gegenstand an der ersten Stelle gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die ersten und zweiten Stellen erste bzw. zweite prädeterminierte Bereiche einer Oberfläche darstellen.
Verfahren nach Anspruch 7, worin ein Elektromagnet mit jedem der ersten und zweiten prädeterminierten Oberflächenbereiche assoziiert ist, der dergestalt positioniert ist, um den ersten oder zweiten Gegenstand an den ersten bzw. zweiten prädeterminierten Oberflächenbereich zu ziehen.
Verfahren nach Anspruch 7, worin jeder der ersten und zweiten prädeterminierten Oberflächenbereiche eine Elektrode umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin jeder der prädeterminierten Oberflächenbereiche eine Elektrode umfasst, und ein Elektromagnet mit jedem der ersten und zweiten prädeterminierten Oberflächenbereiche assoziiert ist, der dergestalt positioniert ist, um den ersten oder zweiten Gegenstand an den ersten bzw. zweiten prädeterminierten Oberflächenbereich zu ziehen.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der erste Gegenstand an eine Signalentität immobilisiert ist, die relativ zum Bindungspartner immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der erste Gegenstand das erste daran befestigte Mittel trägt, ein Bindungspartner des ersten Mittels mit dem ersten Mittel verknüpft ist und die Signalentität relativ zum Bindungspartner immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der erste Gegenstand eine Magnetperle umfasst und ein Kolloidpartikel mit dem Bindungspartner verknüpft ist, und der zweite Gegenstand eine Magnetperle umfasst, die ein zweites chemisches oder biologisches Mittel immobilisiert daran trägt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Signalentität das Kolloidpartikel darstellt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Kolloidpartikel eine Hilfssignalentität einschließt, die relativ daran immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Signalentität ein an das Kolloidpartikel befestigtes Metallocen darstellt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin jeder der prädeterminierten Oberflächenbereiche eine Elektrode umfasst und ein Elektromagnet mit jedem der ersten und zweiten prädeterminierten Oberflächenbereiche assoziiert ist, der zum Ziehen des ersten oder zweiten Gegenstandes an den ersten bzw. zweiten prädeterminierten Oberflächenbereich positioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Metallocen Ferrocen darstellt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der erste Gegenstand eine Magnetperle umfasst, und ein Kolloidpartikel mit dem Verbindungspartner verknüpft ist und der zweite Gegenstand eine Magnetperle umfasst, die ein zweites chemisches oder biologisches Mittel immobilisiert daran trägt.
Verfahren nach Anspruch 18, worin jedes der ersten und zweiten Mittel ein Kandidatenarzneimittel darstellt.
Verfahren nach Anspruch 18, worin der Ziehschritt in Anwesenheit eines Kandidatenarzneimittels durchgeführt wird, und jedes der ersten und zweiten Mittel ein potenzielles Target des Kandidatenarzneimittels darstellt.
Verfahren nach Anspruch 3, umfassend die Bereitstellung einer Vielzahl von Magnetperlen, wobei jede ein chemisches oder biologisches Mittel relativ immobilisiert daran trägt; Exponieren der Perlen gegenüber einer Vielzahl von Kolloidpartikeln, wobei jedes einen potenziellen Bindungspartner der chemischen oder biologischen Mittel trägt; Zulassen, dass einige der Kolloidpartikel über die Interaktion chemischer oder biologischer Mittel/Bindungspartner an einige der Magnetperlen binden, während sie einige der Magnetperlen von einer Verknüpfung mit Kolloidpartikeln frei lassen; magnetisches Ziehen der Magnetperlen an eine Vielzahl prädeterminierter Stellen an einer Oberfläche; Bestimmen der ersten Oberflächenstellen, an die Kolloidpartikel gezogen wurden und zweite Oberflächenstellen, die im Wesentlichen frei von Kolloidpartikeln sind; und magnetische Freisetzung von Magnetperlen aus den zweiten Oberflächenstellen durch selektive Deaktivierung von mit einer Elektrode assoziierter magnetischer Kraft, während die Magnetperlen an den ersten Oberflächenstellen gehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 22, weiter umfassend die Entfernung von Magnetpartikeln, die aus der Umgebung der zweiten Oberflächenstellen freigesetzt werden; und ein- oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte des magnetischen Ziehens, Bestimmens und Freisetzens.
Verfahren nach Anspruch 22, weiter umfassend: Entfernen von Magnetpartikeln, die aus der Umgebung der ersten und zweiten Oberflächenstellen freigesetzt werden; Freisetzen von Magnetperlen aus den ersten Oberflächenstellen; und ein- oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte des magnetischen Ziehens, Bestimmens und Freisetzens.
Verfahren nach Anspruch 24, weiter umfassend, vor dem Wiederholungsschritt: Zufügen von Flüssigkeit zum Verdünnen von aus den ersten Oberflächenstellen freigesetzten Partikeln.
Verfahren nach Anspruch 23, umfassend den visuellen Nachweis der Anwesenheit von Kolloidpartikeln an Oberflächenstellen.
Verfahren nach Anspruch 23, umfassend den Nachweis der Anwesenheit von Kolloidpartikeln an Oberflächenstellen durch elektromagnetische Stimulation eines mit dem Kolloid verknüpften Metallocens.
Verfahren nach Anspruch 22, umfassend den Nachweis der Anwesenheit von Kolloidpartikeln an Oberflächenstellen durch elektromagnetische Stimulation eines mit dem Kolloid verknüpften Metallocens.
Verfahren nach Anspruch 24, weiter umfassend die Identifikation von mindestens einem ersten chemischen oder biologischen Mittel.