JP5567577B2 - 磁気標識された標的成分の量を決定するための方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、磁性粒子が、標的成分の試料量に依存する速度論で接触面に特異的に結合することができる、試料中の標的成分の量を決定するための方法に関する。さらに、これはかかる方法を実行するためのセンサ装置と、関連コンピュータプログラムに関する。

ＵＳ６９９１９３８Ｂ１は、試料中の標的物質の表面への結合が継続的に観察され、試料中の該標的物質の量に関連付けられる方法を開示する。しかしながらこのアプローチの問題は、測定が通常、標的物質の特異的に結合していない部位による影響を受けるということである。

この背景に基づき、本発明の目的は、試料中の標的成分の量を確実に決定するための手段を提供することである。

この目的は、請求項１に記載の方法、請求項１３に記載のセンサ装置、請求項１４に記載のコンピュータプログラム、及び請求項１５に記載の使用法によって実現される。好適な実施形態は従属請求項に開示される。

本発明にかかる方法は、試料中の標的成分の量の決定に役立ち、ここで磁性粒子は、試料で満たされる試料室の接触面に特異的に結合することができ、該結合は標的成分の試料量に依存する速度論で起こる。探求される標的成分の量は、以下では簡潔に"試料量"と呼ばれる。これは典型的には濃度として測定され、例えば体積当たりの質量又は体積当たりの粒子の数として測定される。"標的成分"は、例えば生体分子、複合体、細胞画分又は細胞などの生物学的物質を有することができる。

"磁性粒子"という語は、磁化粒子又は磁化可能粒子（分子、複合体、ナノ粒子、マイクロ粒子など）、例えば超常磁性ビーズをあらわすものとする。磁性粒子はしばしば関心のある標的成分に対する標識として使用され、それらに化学的に結合する。

"試料室"は典型的には、空の空洞、又は試料物質を吸収し得るゲルのようなある物質で満たされる空洞である。これは開放空洞、閉鎖空洞、又は流体接続チャネルによって他の空洞に接続される空洞であってもよい。試料室の壁の一部は、磁性粒子が特異的に結合することができる"接触面"である。そのために接触面は通常、磁性粒子（対応する抗原を有する）が特異的に結合することができる結合部位（例えば抗体）で覆われる。

該方法は以下のステップを有する。
ａ）非結合磁性粒子が接触面から離されるように、接触面において磁性粒子に磁力がはたらく、少なくとも２つの"洗浄ステップ"。この運動はしばしば接触面から垂直に離れる方に向けられるが、これはまた、横成分又は表面への（少なくとも中間の）接近さえ有し得る。適切な磁力は具体的には、表面から離れる方に向けられる非ゼロ勾配で接触面において磁場を発生させることによって実行されることができる。随意に磁力は、結合しているが特異的に結合していない、例えば特異的結合部位とのハイブリダイゼーションを介してではなくより弱い力だけを介して結合している磁性粒子も、接触面から除去するために十分な大きさであり得る。洗浄ステップの少なくとも２つの実行は、洗浄に相当し得る、磁性粒子の除去が全く起こらない（非ゼロ）時間間隔によって分離される。
ｂ）関連する洗浄ステップ中に接触面における磁性粒子の総量が測定される、少なくとも２つの"測定ステップ"（これらの各々は前述の洗浄ステップのもう一方に関連する）。"磁性粒子の総量"とは、特異的結合磁性粒子、並びに非特異的結合粒子及び非結合粒子を有することに留意すべきである。さらに、測定の持続期間は洗浄ステップの持続期間と無関係である。従って洗浄ステップ"中"の測定は通常、洗浄ステップの間隔における任意の時点での即時測定を意味し、この間隔は定義により、磁性粒子の能動的除去が終わった後の瞬間も有するものとする。
磁性粒子の量は磁気的に、すなわちそれらの磁性の検出を介して、又は任意の他の適切な方法を介して、例えば磁性粒子に結合した蛍光標識の検出を介して、測定され得ることがさらに留意されるべきである。
ｃ）測定ステップの測定結果を用いて、標的成分の所望の試料量が推定される、"推定ステップ"。

上記方法は、接触面への磁性粒子の結合の進行中の過程中に実行されることができる、接触面における測定から、試料中の標的成分の量（"試料量"）を決定することを可能にするという利点を持つ。これは、非結合磁性粒子の磁気洗浄が使用されるという事実によるものであり、これは試料の交換なく正確な測定をもたらす。該方法は、定常状態に（おそらく非常にゆっくり）達するまで待つ必要がないので速い。さらに該方法は、定常状態における接触面での結合の飽和につながる、従って定常状態において確実に決定されることができない、標的成分の高い試料量の決定を可能にすることによって、ダイナミックレンジの増加をもたらす。この力学的上限（ｕｐｐｅｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｍｉｔ）の拡張はより大きな磁性粒子の使用を可能にし、そしてこれは低い感度限界を向上させる。

磁性粒子は好適には、洗浄ステップａ）の前及び／又は後に、例えば適切な配向の傾斜磁場によって発生する磁気引力によって接触面に引き付けられる。このようにして接触面への磁性粒子の結合が加速されることができる。磁気引力の強度は、非定常過程中になされる測定ステップｂ）の結果に影響を及ぼすので、わかっているか、及び／又は厳密に制御されるべきである。

測定ステップｂ）における接触面での磁性粒子の総量の測定は、好適には、可能な限り多くの非結合磁性粒子が接触面から除去されることを保証するために、関連する洗浄ステップａ）の終わりになされる。

洗浄ステップａ)は複数回繰り返され得、洗浄ステップの実行は、非結合磁性粒子の除去が全く起こらない（非ゼロ）時間間隔によって分離される。典型的には、接触面への粒子の磁気的誘引のために中間時間間隔が使用される。"洗浄ステップａ）"に関する上記及び以下の全ての所見及び変更は、このステップの全繰り返しにも当てはまることに留意すべきである。

本発明の前述の実施形態において洗浄ステップａ）は複数回実行されるが、関連する測定ステップｂ）は２回だけ、すなわち複数の洗浄ステップのうちの２つの単一回に対して実行され得る。しかしながら好適には、測定ステップｂ）は洗浄ステップａ）の全実行に対して実行される。"測定ステップｂ）"に関する上記及び以下の全ての所見及び変更は、このステップの全繰り返しにも当てはまることに留意すべきである。

該方法によって得られる少なくとも２つの測定結果は、好適には異なる測定ステップｂ）において得られる複数の測定結果に基づいて推定ステップｃ）を行うことによって活用される。これは例えば、単一測定の各々から標的成分の試料量の値を推定し、そしてこれらの値の適切な統計的平均を計算することによってなされることができる。別のアプローチでは、異なる測定ステップにおいて得られる複数の測定結果は、測定結果の変化に基づいて試料量の推定を行うために使用されることができる。従って例えば測定結果の変化率（勾配）を計算することが可能であり、これは結合過程の速度論に関連し、従って探求される標的成分の試料量に対する信頼できる指標でもある。

標的成分の試料量の推定は、あるいはステップｂ）で得られる単一の測定結果に基づいてもよく、これは多くの状況において上記量を決定する簡単で迅速な方法である。

実際には、（ｉ）測定結果の変化（すなわち速度論）又は（ｉｉ）単一の測定結果に基づいて標的成分の試料量の推定を行う、上記代替的変形例は、標的成分の異なる試料量に対してその最高精度を実現することがわかっている。標的成分の予測される試料量に対する値が与えられるとき、これは該方法の最適な変形例を自動的に選択するために、すなわち複数の測定結果の変化、又は単一の測定結果、又は両アプローチの組み合わせに基づいて推定を行うために、利用されることができる。結合磁性粒子の量が標的成分の試料量とともに増加するアッセイにおいて（例えばサンドイッチアッセイにおいて）、第一の変形例は通常、予測される試料量の高い値に好まれ、第二の変形例は低い値に好まれる。逆のルールは、標的成分の低い試料量が結合磁性粒子の高い量に対応する、例えば阻害アッセイに当てはまり、逆もまた同様である。一般的に、速い結合及び／又は多くの結合磁性粒子を伴うアッセイの場合、速度論ベースの測定が好ましく、一方遅い結合及び／又は少しの結合磁性粒子を伴うアッセイの場合、単一測定が有利に使用されると言える。

前述の標的成分の予測される試料量は前もって、例えば検査されるべき試料についての利用可能な追加情報を介して与えられ得る。しかしながら好適には、標的成分の予測される試料量は進行中のアッセイ中に得られる最初の測定結果に基づいて推定される。従って該方法は自己適応的にされることができ、標的成分の全く未知の量の試料を扱う最適手順を自動的に選択する。

本発明の別の実施形態によれば、残りの洗浄ステップと測定ステップのタイミング（すなわち開始、終了）は、既に実行された洗浄ステップと測定ステップの測定結果に基づいて決定される。最初の測定結果が標的成分の高い試料量を示す場合、例えば速度論の決定のための最適測定ステップをスケジュールすることが可能であり、標的成分の低い試料量を示す場合は、"終点測定"のための単一測定ステップを最適にスケジュールすることが可能である。

磁気洗浄ステップａ）は、接触面に特異的に結合していないおよそ全ての（すなわち８０％より多い、好適には９０％より多い）磁性粒子が、このステップの終わりに接触面から除去されるようになり得る。これは、例えば十分に高く、十分長く続く適切な磁力を加えることによって実現されることができる。そして洗浄ステップの終わりの測定は、実質的に特異的結合磁性粒子の量のみを含む。

あるいは、洗浄ステップａ）は、特異的に結合していない磁性粒子の画分のみがこのステップ中に接触面から除去されるようになり得る。こうした部分洗浄は、完全洗浄が時間がかかり過ぎる場合、特に測定結果の変化を決定することを可能にする、複数の洗浄ステップが実行されなければならない場合、好まれ得る。

標的成分の支配的な試料量及び磁性粒子の結合性質に応じて、接触面における利用可能な結合の飽和に、多かれ少なかれ迅速に達し得る。洗浄ステップ及び関連測定ステップのタイミングは、好適にはこの事実を考慮して、測定がなされるのが早過ぎたり（十分な磁性粒子が接触面に結合していないとき）、又は遅過ぎたり（接触面において既に飽和に達しているとき）するのを回避する。これは例えば、表面飽和に達するために必要な予測される総時間の
ｉ）所与の下位割合（ｌｏｗｅｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）の後、及び／又は
ｉｉ）所与の上位割合（ｕｐｐｅｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）の前
に少なくとも1つの洗浄ステップと関連測定ステップが実行される場合に実現されることができる。下位割合は例えば表面飽和に達するまでの総時間の約２０％、上位割合は約８０％に対応し得る。特定の試料において表面飽和に達するのに予測される総時間に対して利用可能な推定がない場合、全体的に有効な境界値がとられることができる。従って最終測定ステップ（"終点測定"）のタイミングは、通常は測定される必要がある標的成分の最低量に依存し、一方それより前の"中点測定"は、測定される必要がある標的成分の最高量を決定することができるようなタイミングである。

推定ステップｃ）は、接触面への磁性粒子の結合が、標的成分の試料量に依存する物理／化学法則によって支配されるという事実を利用する。従って中間洗浄ステップ中に得られる測定結果は、標的成分の試料量に再現性よく関連し、これは測定から標的成分の試料量を推測することを可能にする。測定結果と、推定に必要な試料量との数学的関係は、理論的考察から得られ得る。しかしながら好適にはこの関係は、標的成分の異なる既知の試料量を持つ検査試料で実行される較正手順から決定される。このようにして得られる較正データは、推定ステップの根拠として使用されることができる。これらは例えばルックアップテーブルとして、又は近似パラメータを持つ数式として与えられることができる。

本発明はさらに、以下の構成要素を有するセンサ装置に関する。
ａ）標的成分と磁性粒子を有する試料が中に設けられることができる試料室であって、該試料室は磁性粒子が特異的に結合することができる接触面を持つ。
ｂ）非結合磁性粒子が接触面から離されるように、接触面において磁性粒子に磁力をはたらかせるための磁気マニピュレータ。磁気マニピュレータは例えば接触面において傾斜磁場を発生させる電磁石によって実現され得る。
ｃ）接触面における磁性粒子の総量を測定するためのセンサユニット。センサユニットは例えば光学、磁気、機械、音響、熱、及び／又は電気センサユニットであり得る。磁気センサユニットは具体的にはコイル、ホールセンサ、平面ホールセンサ、フラックスゲートセンサ、ＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉素子）、磁気共鳴センサ、ｍａｇｎｅｔｏ‐ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅセンサ、又は、ＷＯ２００５／０１０５４３Ａ１若しくはＷＯ２００５／０１０５４２Ａ２に記載の種類の磁気抵抗センサ、特にＧＭＲ（巨大磁気抵抗）、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗）、若しくはＡＭＲ（異方性磁気抵抗）を有し得る。光学センサユニットは具体的には、検出面における粒子によるフラストレーテッド全反射から生じる出力光線における変動を検出するように構成され得る。他の光学、機械、音響、及び熱センサのコンセプトはＷＯ９３／２２６７８に記載され、これは参照により本文に組み込まれる。
ｄ）上記種類の方法で標的成分の試料量を決定するために磁気マニピュレータとセンサユニットに接続される制御ユニット。これは制御ユニットが以下のように構成されることを意味する。
（ｉ）少なくとも２つの洗浄ステップを実行する（磁気マニピュレータに、非結合磁性粒子を接触面から除去するために磁性粒子に磁力をはたらかせるようにすることによって）
（ｉｉ）少なくとも２つの関連する測定ステップを実行する（センサユニットに、洗浄ステップ中に接触面における磁性粒子の総量を測定させることによって）
（ｉｉｉ）前述の測定結果を用いて標的成分の試料量を推定する。制御ユニットは専用電子機器、関連ソフトウェアを持つデジタルデータ処理ハードウェア、又は両者の混合によって実現され得る。

センサ装置は、上記種類の方法を実行するために必要な構成要素を有する。従って、その装置の詳細、利点及び改良についてのさらなる情報のために前記説明が参照される。

上記方法は、典型的には計算装置、例えば前述のセンサ装置の制御ユニット内のマイクロプロセッサ又はＦＰＧＡを用いて実現される。従って、本発明は、計算装置上で実行されるときに本発明にかかる方法のいずれかの機能を提供するコンピュータプログラムをさらに含む。

さらに、本発明はデータキャリア、例えばフロッピーディスク、ハードディスク、ＥＰＲＯＭ、又はコンパクトディスク（ＣＤ‐ＲＯＭ）を含み、これは機械可読形式でコンピュータ製品を記憶し、データキャリア上に記憶されるプログラムが計算装置上で実行されるときに本発明の方法の少なくとも１つを実行する。データキャリアは具体的には、前段落で述べられた計算装置のプログラムを記憶するのに適し得る。

現在、かかるソフトウェアはダウンロードのためにインターネット又は企業イントラネットで提供されることが多く、従って本発明は、ローカル又はワイドエリアネットワークを介して本発明にかかるコンピュータ製品を送信することも含む。

本発明はさらに、分子診断、生物試料分析、又は化学試料分析、食品分析、及び／又は法医学的分析のための上記マイクロ電子デバイスの使用に関する。分子診断は例えば標的分子に直接又は間接的に結合した磁性粒子を用いて達成され得る。

本発明のこれらの及び他の態様は以下に記載の実施形態から明らかであり、それらを参照して解明される。これらの実施形態は添付の図面の助けを借りて例として説明される。

本発明にかかる方法の逐次段階を示す。 本発明にかかる方法の逐次段階を示す。 本発明にかかる方法の逐次段階を示す。 本発明にかかる方法の逐次段階を示す。 本発明にかかる方法の逐次段階を示す。 標的成分の異なる量を持つ２つの試料例に対する測定信号の経時的な経過を示す。 ３つの磁気洗浄ステップとともに測定信号の経時的な経過の別の例を示す。 図７の洗浄ステップ中の測定値と、標的成分の関連する試料量との関係をあらわす決定された用量反応曲線を例示的に図示する。 中点ベース測定と勾配ベース測定に関連する異なるダイナミックレンジを図示する。

図面中の類似する参照数字は同じ又は同様の構成要素をあらわす。

多くの生物学的アッセイにおいては、大きなダイナミックレンジ（すなわち確実に決定されることができる標的成分濃度の範囲）が望ましい。以下の実施例は磁性（ナノ）粒子に基づくアッセイのダイナミックレンジがいかにして拡張されることができるかの解決法を説明する。

磁性粒子又はビーズは、高速で、高感度で、簡便な分子診断を実現するために例えば生物学的標的成分（原子、イオン、生体分子、細胞、ウィルス、又は細胞若しくはウィルスの画分、組織抽出物など）に対する標識として使用されることができる。多くのバイオセンサ装置において、磁性粒子は標的成分の存在／不在下でセンサ装置の接触面に結合し、表面に結合した磁性粒子の量は溶液中の標的成分の濃度に依存する。

センサ装置は、高感度に、かつ大きなリニアダイナミックレンジにわたって、すなわち信号が濃度に比例する大きな濃度範囲にわたって、測定することができることが望ましい。しかしながら、ダイナミックレンジは限られることがしばしば観察される。１００ｎｍより大きい磁性粒子の場合、リニアレンジは例えば通常は約１‐２桁に限られる。表面検出技術に対するダイナミックレンジは、
検出されることができる磁性粒子（標識）の最低密度
表面に取り付けることができる磁性粒子（標識）の最高密度（表面上の標識の多層は信号の線形増加をもたらさないと仮定する）
によって限られる。

大きな磁性粒子を用いることは、検出されることができる粒子の最低密度を減少させるので、有利である。しかしながら、従って最高粒子密度もまた、粒子のサイズによる立体障害のために減少する。

一例として、心臓トロポニンの検査は、１ｐＭのオーダーで極めて高感度の測定を必要とし、これは大きな（直径３００‐５００ｎｍ）磁性粒子の使用を示唆する。これは、信号が高濃度で飽和するので、低い（２オーダー）ダイナミックレンジを犠牲にする。しかしながら臨床要件を満たすためには、濃度において少なくとも３０年間測定することができる必要がある。

高濃度においてダイナミックレンジを拡張する１つの方法は、元の試料の様々な希釈で複数の測定を実行することである。別の方法はインキュベーション時間を変えるために異なる時間において試料を導入することである（ＷＯ／２００６／０９２０３６参照）。しかしながらこれらの方法は面倒でエラーを起こしやすく、複数の処理ステップを要する。

留意されるべき別の問題は、測定がしばしば、結合磁性粒子の濃度に比例しない部分、例えばセンサ面への粒子の非特異的結合又は表面の上のバルク流体に由来する信号も含むということである。

上記問題に対処するために、終点測定の感度を速度論的測定の拡張されたダイナミックレンジと組み合わせる、速度論的測定と終点測定の組み合わせが本明細書で提案される。これは複数の洗浄ステップを利用するアッセイ法によって達成されることができる。この方法は以下でより詳細に記載される。

センサ装置において、洗浄ステップは、センサ領域の上の標的成分（被分析物）を含む試料流体を、標的成分を含まない別の流体と（マイクロ）流体的に交換することによって実行されることができる。これは複雑で達成が困難である可能性がある。さらに、速度論的測定を行うことを可能にする反応を再開するために試料流体を再導入することは不可能であることが多い。

磁性粒子を使用するアッセイの独自の特徴は、磁気洗浄ステップを実行する能力である。センサ面に近い（従って信号を生じる）が結合していない磁性粒子は、粒子を表面から離す磁石を用いることによって簡単に除去されることができる。加えて、磁力を調整することによって、特異的結合はそのままにしながら、弱い非特異的結合によって結合している粒子もまた除去されることができる。かかる磁気洗浄ステップは非常に高速で１秒以内に完了することができる。さらに、試料室／センサ領域から試料液体を除去する必要がない。洗浄ステップ後、特異的結合粒子によって生成される信号が測定されることができ、反応は簡単に再開されることができる。このようにして、特異的結合粒子の量が単一アッセイにおいて何度も決定されることができる。

図１乃至５は磁気センサ装置１００の上記コンセプトを図示する。磁気センサ装置１００は試料室１を有し、その中に標的成分と磁性粒子２を有する液体試料が設けられることができる。試料室１は底部において接触面４によって囲まれ、これは磁性粒子２が特異的に結合することができる結合部位３を持つ。接触面４は、基板、例えばマイクロ電子回路が埋め込まれるシリコン基板、又は光学測定の場合はガラス基板の表面であり得る。一般的に、磁性粒子２は、人が実際に関心を持つある標的成分に対する標識として使用される。簡単にするため、以下では磁性粒子２は同時に関心のある標的成分であるものとする。一部のアッセイにおいて、例えば標的分子に事前に結合しなかったために接触面４に結合することができない磁性粒子があることに留意すべきである。以下で決定されるものは、結合することができる試料中の磁性粒子の量のみである。

試料室１の下及び上に、誘引磁石１１と反発磁石１２がそれぞれ配置される。誘引磁石１１が駆動されるとき、これは磁性粒子２を接触面４に引き付ける傾斜磁場Ｂを発生させる。

接触面４の下の磁気センサユニット１０は接触面における磁性粒子２の量を検出する。この検出は任意の適切な手段によって、例えば光学的に又は磁気的に達成され得る。制御ユニット１３がセンサユニット１０と磁石１１，１２に接続され、それらの活動を制御し、センサ信号ｓを読み取る。センサ信号ｓの典型的な時間的経過は、制御ユニット１３のボックス上のダイアグラムにあらわされる。

図１は、ちょうど試料室１を試料で満たすことによって磁性粒子２が試料室１の中に入れられた状況を示す。粒子２は駆動された誘引磁石１１によって接触面４に引き付けられる。磁性粒子２がまだ接触面４にないので、対応するセンサ信号ｓは低い値を持つ。

図２において、最初の磁性粒子２が接触面４に達している。センサ信号ｓはそれに応じて増加する。

図３において、誘引磁石１１はオフにされており、代わりに反発磁石１２がオンにされている。これは磁性粒子２を接触面４から引き離す傾斜磁場を発生させる。従って洗浄ステップが実現され、ここで非特異的結合磁性粒子２は接触面４から除去される。結果として、センサ信号ｓは特異的結合磁性粒子の量に対応する値に達するまで降下する。測定ステップにおいて、制御ユニット１３はセンサ１０によってもたらされる対応する測定値をサンプリングして記憶することができる。

図４において、洗浄ステップは終了し、磁性粒子を接触面４に引き付けるために誘引磁石１１が再度駆動されている。接触面における磁性粒子２の到着により、センサ信号ｓはそれに応じて増加する。

図５は磁気洗浄及び測定ステップ（図３）、及び中間誘引ステップ（図４）の複数の繰り返し後の状況を示す。洗浄中のセンサ信号ｓは、最終的に定常状態レベルに近づくまで周期的に振動するように増加した。洗浄ステップの終わりに得られる測定結果の１つ又はいくつかから、試料室１内の磁性粒子の試料量が推定されることができる。これを行う異なる方法が以下でより詳細に説明される。

第一の実施形態において、磁性粒子で標識される標的成分の接触面４への効率的な結合をもたらすために向けられる誘引作動は、場合によりセンサ信号ｓの個別の読み出しステップと相まって、１つ以上の磁気洗浄ステップによって中断される。図６は、それぞれゼロ（灰色の曲線"０ｐＭ"）及び１００ｐＭ（実線の黒い曲線"１００ｐＭ"）の標的成分の濃度に対するセンサ信号ｓを持つ対応するダイアグラムを示す。本明細書において信号ｓは、０％が磁性粒子のない接触面に対応するように定義される。

標的成分がないとき、標的分子に結合していない磁性粒子は接触面に結合することができないので、導入される洗浄ステップ中にセンサ信号は０に戻る。１００ｐＭの標的成分の存在下では、洗浄ステップ中に信号の時間依存変化が観察されることができる。洗浄ステップ中、多くの非結合及び非特異的結合粒子が除去されることがダイアグラムから明らかである。標的成分のないときであっても、接触面は非結合ビーズによってすぐに飽和するが、これは洗浄ステップ中に除去される。

各洗浄ステップにおいて、"中点測定"がなされ、標的成分の（既知の）試料量に関連付けられることができる。このように、用量反応曲線（標的成分濃度ｖｓ．信号）がこれらの"中点測定"の各々に対してプロットされることができる。

図７及び図８はこれを例示的な標的成分トロポニンについてより詳細に示す。図７は、５００ｐＭトロポニンを有する試料、並びに３つの洗浄及び測定ステップＷ１，Ｗ２，及びＷ３に対する測定曲線を描く。図８は２つの中点測定Ｗ１，Ｗ２及び終点測定Ｗ３に対する複数のかかる測定から得られる対応する用量反応曲線を示す（"中点測定"という語は、磁性粒子のさらなる結合が後に続く洗浄ステップ中の測定をあらわし、一方"終点測定"はアッセイの最終測定であることに留意すべきである）。

信号の遅い展開をもたらす標的成分濃度の場合、後期の中点測定が使用されることができる。接触面４が（洗浄ステップ中に）すぐに飽和する標的成分濃度の場合、早期の中点測定が使用されることができる。これはアッセイのずっと広いダイナミックレンジをもたらす。

第一の実施形態に類似する第二の実施形態においては、表面結合中に複数の洗浄ステップが導入される。しかしながら、特定のセンサ反応に対する単一の中点及び／又は終点測定を用いる代わりに、時間に対する洗浄ステップ後の信号変化の勾配が、速度論、従って試料中に存在する標的成分の量に対する測定として使用されることができる。この方法は上記の中点／終点測定と容易に組み合わされることができる。信号がアッセイの終わりに飽和する標的成分濃度の場合、アッセイの速度論／勾配が使用されることができ、一方センサが飽和しない濃度の場合、終点測定が使用されることができ、高感度測定及びアッセイの広いダイナミックレンジの両方を可能にする。

上述の実施形態は組み合わされることができることに留意すべきである。図９はこの点において、１つのアッセイ内で速度論（すなわち勾配ｄｓ／ｄｔ）及び終点信号（ｓ）の両方が、標的成分トロポニンの異なる濃度Ｃを持つ検査試料に対する２つの個別の測定として使用された実施例を示す。容易に観察されることができるように、終点測定（ひし形で左軸上に示される）は低い方の濃度Ｃの範囲を直線的にカバーし、一方勾配ベースの測定（四角で右軸上に示される）は高い方の濃度の範囲をカバーする。従って各測定タイプのダイナミックレンジは全く異なり、アッセイ全体のダイナミックレンジを向上させる。これは速度論的測定と終点測定との組み合わせに限定されず、１つ以上の速度論的測定と１つ以上の中点測定と終点測定の任意の組み合わせが原則として可能である。

機器の最終読み出しのためにどの測定を使用するかの区別（特定の信号又は勾配は、試料中に存在する標的成分の未知の量に変換されなければならない）は、制御ユニット１３において実行するソフトウェアによって自動的に行われることができる。例えば図９における実験の場合、終点測定が特定値を超える信号をもたらす場合、速度論的測定が使用されることができる。あるいは逆もまた同様に、勾配が特定値を下回る場合、終点測定が使用されることができる。かかる選択は好適には未知の試料のアッセイの開始中に"オンライン"でなされることができる。例えば、最初の速度論的測定又は中点測定が高いトロポニン値を示す場合、アッセイは５分ではなく１分で完了し得る。

磁性粒子を作動させるための電磁石コイルの使用は、磁性粒子の操作に対する優れた制御をもたらす。磁性粒子が表面に結合することができる速度、従って信号が展開する速度は、磁気コイルが操作されるやり方によって制御されることができる。言い換えれば、結合速度は個々のアッセイの特定のニーズに適応されることができる。これは作動によってアッセイのダイナミックレンジが調整されることができることを意味する。これは終点、中点、及び速度論的測定に当てはまる。さらに、１つのアッセイ内で異なるタイプの測定に対して異なる作動プロトコルを用いることによって、測定タイプの各々のダイナミックレンジが（半）独立的に調整されることができる。例えば、２つの測定タイプのダイナミックレンジは、それらが（わずかに）重なり、アッセイの大きな全体のダイナミックレンジをもたらすように調整されることができる。

本発明は特定の実施形態を参照して上記に記載されたが、様々な変更及び拡張が可能である。例えば、
‐センサユニットは、粒子の任意の特性に基づいて、センサ面上又は付近の磁性粒子の存在を検出する任意の適切なセンサであることができ、例えばこれは磁気的方法、光学的方法（例えばイメージング、蛍光、化学発光、吸収、散乱、エバネセント場技術、表面プラズモン共鳴、ラマンなど）、音波検出（例えば表面音響波、バルク超音波、カンチレバー、水晶振動子など）、電気的検出（例えば伝導、インピーダンス、電流測定、酸化還元サイクル）、それらの組み合わせなどを介して検出することができる。
‐磁気センサユニットは例えば、コイル、磁気抵抗センサ、ｍａｇｎｅｔｏ‐ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅセンサ、ホールセンサ、平面ホールセンサ、フラックスゲートセンサ、ＳＱＵＩＤ、磁気共鳴センサなどであることができる。
‐分子標的はしばしば、例えば細胞、ウィルス、又は細胞若しくはウィルスの画分、組織抽出物など、大きな部分の濃度及び／又は存在を決定する。
‐分子アッセイに加えて、例えば細胞、ウィルス、又は細胞若しくはウィルスの画分、組織抽出物など、大きな部分もまた本発明にかかるセンサ装置で検出されることができる。
‐検出はセンサ面に対するセンサ素子のスキャニングの有無にかかわらず起こり得る。
‐標識としてはたらく粒子は検出法によって直接検出されることができる。その上、粒子は検出前にさらに処理されることができる。さらなる処理の一例は、検出を容易にするために、物質が加えられるか、又は標識の（生）化学的若しくは物理的特性が調整されることである。
‐該装置及び方法は、複数の生化学アッセイタイプ、例えば結合／非結合アッセイ、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、置換アッセイ、酵素アッセイなどで使用されることができる。これは、大規模多重化が容易に可能であり、基板上にインクジェットプリントを介して異なるオリゴがスポットされることができるので、ＤＮＡ検出に特に適している。
‐該装置及び方法は、センサ多重化（すなわち異なるセンサ及びセンサ面の併用）、標識多重化（すなわち異なるタイプの標識の併用）及びチャンバ多重化（すなわち異なる反応チャンバの併用）に適している。
‐該装置及び方法は、少ない試料量に対する高速で、ロバストで、簡便なポイントオブケアバイオセンサとして使用されることができる。反応チャンバは、１つ以上の場発生手段と１つ以上の検出手段を含む、小型リーダとともに使用されるべき使い捨て用品であることができる。また本発明の装置、方法及びシステムは、自動ハイスループット検査において使用されることができる。この場合反応チャンバは例えばウェルプレート又はキュベットであり、自動機器に収まる。
‐ナノ粒子とは、３ｎｍ乃至５０００ｎｍ、好適には１０ｎｍ乃至３０００ｎｍ、より好適には５０ｎｍ乃至１０００ｎｍの範囲の少なくとも１つの寸法を持つ粒子を意味する。

最後に、本願において"有する"という語は他の要素又はステップを除外せず、"ａ"又は"ａｎ"は複数を除外せず、単一のプロセッサ又は他のユニットが複数の手段の機能を満たしてもよいことが指摘される。本発明はありとあらゆる新規の特性及びありとあらゆる特性の組み合わせに存在する。さらに、請求項における参照符号はその範囲を限定するものと解釈されてはならない。

Claims (12)

1. 試料中の標的成分の量を決定するための方法であって、磁性粒子は、前記標的成分の試料量に依存する速度論で、前記試料で満たされる試料室の接触面に特異的に結合し、該方法は、
   ａ）特異的結合磁性粒子が前記接触面に残り、非結合磁性粒子が前記接触面から離されるように、前記磁性粒子に磁力がはたらく、少なくとも２つの"洗浄ステップ"と、
   ｂ）前記接触面における磁性粒子の総量が洗浄ステップａ）中に測定される、少なくとも２つの関連する"測定ステップ"と、
   ｃ）前記標的成分の試料量が、前記測定ステップｂ）の測定結果を用いて推定される、"推定ステップ"とを有し、
   前記推定ステップｃ）が、前記測定ステップｂ）の単一の測定結果及び／又は複数の測定結果の変化に基づいて実行されるかが、前記標的成分の予測される試料量に従って自動的に決定される、
   方法。
2. 前記磁性粒子が、前記洗浄ステップの前及び／又は後に磁気引力によって前記接触面に引き付けられる、請求項１に記載の方法。
3. 前記測定ステップが前記洗浄ステップの終わりに実行される、請求項１に記載の方法。
4. 前記標的成分の予測される試料量が少なくとも１つの早期測定結果に基づいて推定される、請求項１に記載の方法。
5. 残りの洗浄及び測定ステップのタイミングが、既に実行された洗浄及び測定ステップの測定結果に基づいて決定される、請求項１に記載の方法。
6. 特異的に結合していないおよそ全ての磁性粒子が洗浄ステップ中に前記接触面から除去される、請求項１に記載の方法。
7. 特異的に結合していない前記磁性粒子のごく一部が洗浄ステップ中に前記接触面から除去される、請求項１に記載の方法。
8. 少なくとも１つの洗浄ステップ及び対応する測定ステップが、結合の飽和に達するために必要な予測される総時間の所与の下位割合の後、及び／又は所与の上位割合の前に実行される、請求項１に記載の方法。
9. 前記推定ステップが検査試料を用いて得られる較正データに基づく、請求項１に記載の方法。
10. センサ装置であって、
    ａ）標的成分と磁性粒子を有する試料が中に設けられることができる試料室であって、前記試料室は、前記標的成分の試料量に依存する速度論で前記磁性粒子が特異的に結合することができる接触面を持つ、試料室と、
    ｂ）特異的結合磁性粒子が前記接触面に残り、非結合磁性粒子が前記接触面から離されるように、前記接触面において前記磁性粒子に磁力をはたらかせるための磁気マニピュレータと、
    ｃ）前記接触面における磁性粒子の総量を測定するためのセンサユニットと、
    ｄ）請求項１に記載の方法で前記標的成分の試料量を決定するために前記磁気マニピュレータと前記センサユニットに接続される制御ユニットとを有する、センサ装置。
11. 請求項１に記載の方法を実行することを可能にするためのコンピュータプログラム。
12. 分子診断、生物試料分析、又は化学試料分析のための請求項１０に記載のセンサ装置の使用。

Images