JP2004531688A - 流動の中断に基づく相互作用の電子検出および相互作用の検出 - Google Patents
流動の中断に基づく相互作用の電子検出および相互作用の検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004531688A JP2004531688A JP2002532328A JP2002532328A JP2004531688A JP 2004531688 A JP2004531688 A JP 2004531688A JP 2002532328 A JP2002532328 A JP 2002532328A JP 2002532328 A JP2002532328 A JP 2002532328A JP 2004531688 A JP2004531688 A JP 2004531688A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- porous member
- article
- channel
- substance
- fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/806—Electrical property or magnetic property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Abstract
多孔性部材は、微小流体系中にチャネルを一部または完全につなぐように、位置させることが可能である。当該多孔性部材は原位置で組立ておよび／または解体することも可能である。当該多孔性部材は、１つの場所で単一分子のみを含む連結により孔が分離され、非常に小さな孔サイズ部材で高レベルの開放区域を可能にするように、作ることが可能である。当該多孔性部材は、分子種により相互連結されたコロイド粒子で作りあげることも可能である。これらは、被検体を定性的におよび／または定量的に検出するために、または、チャネルをまず遮断し、次に開放すること、長時間被検体を濃縮することに続く、被検体の放出および下流での検出、などを含むさまざまな目的のために、指図に応じて作用物質を選択的に結合および／または放出するために、用いることも可能である。多孔性部材は多重チャネル系中のバルブを限定することが可能で、そして当該多孔性部材で作用物質の結合および放出を制御するとともに、これらのバルブを開放および閉鎖して、そして多重チャネル系中で流体流動を制御することも可能である。本発明の流体系は、異なる被検体が決定される複数の検知場所を含むことも可能である。本発明のシステムは、さまざまな作用物質について連続的に、総合的微量化学分析に対する柔軟性を提供する。
Description
【０００１】
関連出願
この仮出願でない出願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９条（ｅ）、タイトル３５に基づき、２０００年１０月３日付けの同時係属米国仮出願第６０／２３７４２７号および２００１年３月１日付けの米国仮出願第６０／２７２７２７号について利益を請求し、いずれの出願も参照によって本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
分野
本発明は、診断、治療、環境サンプリングおよび食品モニタリングに関係する、流れを中断させることに基づく新しい検出方法、および検出のための流動チャネルの複雑な回路を通る流れを向け直すために、チャネルを通る流れの中断を用いる方法に関する。本発明はまた、生物学的サンプルを含め、標的物質を含むと思われるサンプルを操作し、取扱う方法に関し、分子、生体分子、細胞および胞子などの標的材料を検出、分離および／または濃縮する。上記の検出および分離のための流路および流速を操作することを含む、多重プロセスおよび論理プロセスに、本発明を利用または適用することも可能である。また、常時監視システムにおける検出のために本発明を利用することが可能である。常時監視システムとしては、環境モニタリング、遠隔モニタリング、食品安全性、および移植可能なバイオセンサーを含むが、これに限定されるものではない。
【０００３】
背景
生物兵器を検出するために設計されたものを含め、治療診断に関するマイクロおよびナノ・スケールのバイオセンサー、ラボ・オン・ア・チップ・デバイス（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ ｄｅｖｉｃｅｓ）、および各種の小型化センサーを開発することに、今日、商業的に大きな関心が寄せられている。実際には、これらの応用のほぼすべては、一体化された試料調製を必要とする。試料調製には典型的に３つのプロセスが必要になる：１）デバイス内の微小流体チャネルを詰まらせ、検出感度を低下させる恐れがある屑（ｄｅｂｒｉｓ）を濾別すること；２）標的被検体を濃縮し、感度を高めること；および３）予測できる位置での下流検出のために標的を放出すること。チップスケールのデバイス中でこれらの試料調製方法を達成する技術は、現在のところ存在しない。慣用のフィルターや試料濃縮器は実用的でない。なぜなら、それらは膜のような材料によってできており、流体の流れに対し開かれている小さな有効径を通して試料を押し流すのに大きな圧力勾配を要するためである。標準的な試料調製フィルターは、代表的には、約０．２ミクロンのみかけの孔径を有するニトロセルロース膜である。こういったフィルターの１つにおける孔の断面積の和は、典型的には、当該フィルターの全断面積の僅か約０．３％である。これは、フィルターが存在している流動チャネルの有効直径は、フィルターが存在することにより大きく減少することを意味する。流動チャネルに試料を通すのに必要な圧力は、流動チャネルの直径の４乗に反比例する。したがって、流動チャネルの有効直径が小さくなることは、大きな圧力低下およびそれに伴う上流への圧力要求となるため、チップスケールのデバイスに組入れることは現状で不可能である。微小遠心分離器のようなベンチトップ装置上で容易に生成される大きな圧力低下は、マイクロデバイス内では簡単には生成されない。マイクロスケールバイオセンサーまたは他のマイクロスケールデバイス中のフィルターに試料流体を通過させるには、マイクロデバイスから分離されたマクロスケールのオフラインポンプが、現状では典型的に必要である。
【０００４】
チップスケールセンサーに標準的な試料調製部材を組み込むことに対する他の障害は、再使用可能性である。現在入手可能なフィルターは、典型的には一回限りの使用で、再使用ができない部材であり、チップスケールバイオセンサーへ組込んだ場合、これらの高価なデバイスを一回限りの使用で再使用不能にすることになる。加えて、そうした部材を組込むには、コネクターの使用が必要となるが、コネクターには、マイクロスケールの場合、漏れや破裂の問題がついてまわる。
【０００５】
開示の要約
生体材料のような標的物質をスクリーニングおよび測定することに関する上述の制約および問題の多くは、本発明システムで検討されている。
【０００６】
本開示は多孔性部材を記載し、この多孔性部材は好ましい実施態様において三次元ネットのようなナノ構造体（すなわち「ナノネット」）を含むことができ、この構造体は、ナノ粒子およびポリマー類を連結するもの（これは自己集合して、流動チャネルをつなぎ、ナノスケールフィルターを形成する）、濃縮器、および／または元の位置の（ｉｎ ｓｉｔｕ）検出器（チャネルを通る流れの中断されることを検出することにより標的物質または病原体が捕捉されたことを検出する）を含んでなる。本発明は、小型化センサー中で試料調製をいかに行うかという問題を検討する。本発明は、圧力低下の小さいフィルターおよびやはり再構成可能な濃縮器を提供することにより、小型化センサーの開発を困難にしているいくつかの重大な問題（以下に詳述する）を解決することが可能である。これらの方法は、移植可能なデバイスだけでなく、遠隔測定に使用されるリアルタイム連続モニタリングに特に適している。
【０００７】
本発明の観点として、誘導体化ナノ粒子およびバイオポリマー類の使用を記載し、これにより、多くの機能を有する、再使用可能／再生可能な三次元ナノ構造体が組立てられ、このナノ構造体は、マイクロまたはナノ・スケールの流動チャネル中に組立てることが可能で、新しいバイオセンサー、ナノフィルターおよびナノ濃縮器を創出する。
【０００８】
多孔性部材すなわちナノ構造体は、標的物質に対する認識リガンドを提示するように懸濁性ナノ粒子が誘導体化される場合には、バイオセンサーとして機能することも可能である。標的分子種の捕捉は、流動の中断により生じる下流圧、流動速度または他のパラメーターの変化を検出することにより、検出可能である。
【０００９】
本発明はナノフィルターを含む多孔性部材も記載し、この多孔性部材は相互連結用の粒子およびポリマー類（好ましくはバイオポリマー類）を含んでなり、これらは流動チャネル内のその位置に（ｉｎ ｓｉｔｕ）組立てられ、チャネルの不可欠の部分になる。いくつかの例として、例えばＤＮＡおよび金コロイドナノ粒子から構築されたナノフィルターは、０．５ミクロン未満、他の態様では０．２ミクロン未満、他の態様では１００ナノメートル（ｎｍ）未満、他の態様では５０ｎｍ未満、他の態様では１０ｎｍ未満、そして他の態様では５ｎｍ未満の公称相当孔径または平均細孔径を提供可能であり、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびいくつかの態様では９８％またはそれより多くの、流れに対して開かれた断面積を提供可能であり、典型的な標準膜フィルターでは０．３％である。有効流動チャネル径がこのように増加することにより、チャネルを通る流れを所定の速度に維持するのに必要な圧力が、少なくとも１６倍、他の態様では少なくとも２５０倍、他の態様では少なくとも６００倍、他の態様では少なくとも１０，０００倍、なお他の態様では少なくとも１００，０００倍の減少を生じ得る。その結果生じる極めて小さい必要圧力は、チップスケールポンプによって、または移植可能なデバイス中の拍動心臓によってさえも容易に生成可能である。粒子およびバイオポリマーを含むが、標的分子種と結合するリガンドを含まないナノ構造体が、チップスケールフィルターとしての使用するには好ましく、このようなフィルターは、流動チャネルの内部断面を横切って、原位置で（ｉｎ ｓｉｔｕ）解体し、再構成することが可能である。これらの構造体によって、標準的なフィルターが必要とする圧力より数桁も低い圧力で、所定の流体流動で、試料流体を濾過することが可能になる。細胞、胞子、細胞屑（ｄｅｂｒｉｓ）、または細菌の排除に対応するため、または他の濾過用途のために、相互連結性ポリマーストランドの長さを変更して、さまざまな有効公称「孔」径のナノフィルターを作出することも可能である。本発明で記載したナノフィルターは、ＤＮＡハイブリッド形成および／またはビオチン・ストレプトアビジン結合のような生体特異的相互作用を介して、誘導体化流動チャネルへ係留することも可能である。このように、ナノ構造体を再構築することを可能にする条件により、流動チャネルへナノフィルターを係留している生体相互作用を単に阻害することにより、ナノフィルターをその後の分析検定のために原位置で解体、再組立、および再構成することが可能である。
【００１０】
特定の標的分子種を捕捉し、濃縮し、次いで放出するためのナノスケール濃縮器を作出するように、いくつかの態様では、生体特異的プローブ／リガンドを有するように誘導体化されたコロイドを、上述のナノフィルター中へ取込むこともできる。なお別の態様では、このような誘導体化ナノネットを、標的検出のために使用することが可能である。ナノネット中に標的を捕捉したことによって、チャネルを通る流動が中断されることを検出することにより、流体試料中の標的被検体の存在を検出するための、ナノネットの形成およびこれらのナノネットの使用を、本発明はいくつかの態様で含む。ナノネットが標的被検体を捕捉し、チャネル中の流動を中断させた場合には、流動に開放されたそれらの有効断面積を変えることにより、こういった態様のナノネットはインシトゥセンサーまたはバイオセンサーとして機能し得る。流動の中断により生じる、流動チャネルにかかる流速、圧力低下および／または電気浸透力の変化を検出することによって、このような態様での標的分子種の存在を検出することができる。本発明よって流動チャネルを横切る圧力低下の変化を検出することにより標的分子種の検出は容易になるが、この標的分子種の検出は中断の程度に大きく影響され、これは、チャネル通じて所定の流速を維持するために必要な上流圧がチャネルの有効径の４乗に反比例するからである。この検出能力をより一層高めるために、流動チャネルのトポロジーを、溝形構造を有するように構築することも可能である。
【００１１】
出願人らは、以下の出願において、金コロイド上の生体特異的な自己集合単分子層（ＳＡＭｓ）の形成方法を、既に記載している：「神経変性疾患における異常タンパク質凝集の迅速かつ高感度検出」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年１月２５日付けで出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０１９９７（２０００年７月２７日にＷＯ００／４３７９１として公開）、「非コロイド構造体上の分子種とコロイド固定化分子種の相互作用」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年１月２１日付けで出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０１５０４（２０００年７月２７日にＷＯ００／４３７８３として公開）、「非コロイド構造体上の分子種とコロイド固定化分子種の相互作用」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年６月２３日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第０９／６０２７７８号、および「タンパク質凝集の迅速かつ高感度検出」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年８月３日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第０９／６３１８１８号（すべて、参照により本明細書に含まれるものとする）。これらの方法は、ナノ粒子上に、ＤＮＡ，タンパク質、ペプチド抗体、他のリガンド、またはこれらの組合わせを提示することを可能にする。１つの態様において、本発明は、標的となる病原体または被検体に対する抗体を提示するナノ粒子に連結されたポリマーから構築されたナノネットを提供する。このような態様では、ナノネットは、その被検体に特異的な濃縮器および／または検出器を含んでなる。
【００１２】
他の好ましい実施態様では、コンピューターシステムまたは他の制御システムの制御下で系内の流れの向きを変えることができるバルブを含む論理流動経路を形成するように、流動系を配置することが可能である。系内の実際の流動経路の配置を決定することは、１以上の検出部位でごく最近、どの標的が検出され、どれが検出されなかったかに依存して行うことが可能である。例えば、流動経路に沿った特定の位置での標的被検体の捕捉は、その流動経路に沿った流れを妨げることがあり、それを用いて、標的被検体の存在を検出し、論理的な仕方で系内の流動を向け直すことが可能であり、この論理的な方法により論理的な連続検出およびそれによる診断が達成可能になる。
【００１３】
本発明のさらなる理解のために、その他のおよびそのさらなる目的とともに、添付図面および詳細な説明に言及する。
【００１４】
１つの観点からは、本発明は一連の物品を提供する。１つの物品は、流動する流体を含むことができるチャネル、およびそのチャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材を含む。当該多孔性部材はコロイド粒子を含む。
【００１５】
もう１つのの態様では、本発明は、流動する流体を含むことができるチャネルと、そのチャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材で、当該多孔性部材が単一分子により分離された少なくとも２つの孔を含むものとを含む物品に関する。このことは、この２つの孔が全境界に渡って単一分子により分離されていることを、必ずしも意味しない。これは、その２つの孔を分離している構造体中の少なくとも１点において、単一分子がその２つの孔を分離しており、またその単一分子の分裂はその２つの孔が１つにすなるであろうことを、意味する。
【００１６】
もう１つの態様において、ある物品は、流動する流体を含むことができるチャネルと、そのチャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材を含み、この多孔性部材は、１ミクロン未満の平均細孔径および流れに対して開かれた面積を少なくとも５０％有する。少なくとも特定の百分率の「流れに対して開かれた面積」とは、多孔性部材によりつながれたチャネルの面積が、（１００−その百分率）％未満、遮断されていることを意味する。
【００１７】
もう１つの観点からは、本発明は、一連の方法を提供する。１つの方法は、多孔性部材に流体を通過させ、流体内の化学的、生物学的、または生化学的物質を多孔性部材に対し固定されたその物質の結合パートナーに結合できるようにすることを含む。この結合は、当該方法に従って決定される。
【００１８】
もう１つの態様において、本発明の方法は、流体流動チャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材に対し固定された化学的、生物学的、または生化学的物質の第１の結合パートナーを第２の結合パートナーと置換することを含む。この置換は、チャネルに対する多孔性部材を解体せずに行われる。
【００１９】
本発明のもう１つの方法は、多孔性部材に流体を通させること、および流体内の化学的、生物学的、または生化学的物質を、多孔性部材に対し固定された当該物質の結合パートナーと結合できるようにすることを含む。この化学的、生物学的、または生化学的物質は、次いで多孔性部材から放出される。
【００２０】
もう１つの態様において、ある方法は、第１の化学的、生物学的、または生化学的物質が、第１のコロイド粒子に対して固定されるようになることを可能にすることを含む。第２の化学的、生物学的、または生化学的物質は、第２のコロイド粒子に対して固定されるようになることが可能である。第１および第２の物質の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に少なくとも一部は基づき、第１のコロイド粒子は第１の流体チャネルに向けられ、そして第２のコロイド粒子は第２の流体チャネルへ向けられる。
【００２１】
本発明のもう１つの方法は、化学的、生物学的、または生化学的物質をコロイド粒子に対して固定化することを可能にすること、および当該物質の少なくとも１つの正体を決定することを含む。当該正体に少なくとも一部は基づいて、当該コロイド粒子は、第２の流体チャネルよりも第１の流体チャネルに向けられる。各チャネルは、進路指示ステップの前に当該コロイド粒子を受取ることが可能である。本発明のもう１つの方法は、化学的、生物学的、または生化学的物質をコロイド粒子に対して固定化することを可能にすること、第１の検出位置で当該物質の少なくとも１つの正体を決定すること、そして第２の検出場所で当該物質の少なくとも１つの正体を決定することを含む。
【００２２】
本発明のもう１つの方法は、初めにその物質を含む流体の流動経路（そこでは当該流体は複数の流動経路の選択肢を有する）を決定することにより、化学的、生物学的、または生化学的物質の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定することを含む。
【００２３】
本出願中の上記または他の場所に記載されている本発明の観点または態様の何れかに関連して、部材または方法ステップに関する以下の特徴は、これらの成分または方法ステップがこれらの観点または態様に含まれる範囲内で、適用可能である。チャネルが含まれる場合、チャネルは、約１０００ミクロン未満、または他の態様では約５００、３００、１００または５０ミクロン未満の断面寸法を有することが可能である。多孔性部材がチャネルをつなぐ場合、それはチャネルの一部をつないでもよく、チャネルを完全につないでもよい。多孔性部材がチャネルを部分的につなぐ場合、チャネル通って流れる流体のいくつかは、多孔性部材を通って流れるであろうが、別の流体は多孔性部材の脇を通過し、多孔性部材を通って流れないこともある。多孔性部材がチャネルを完全につなぐ場合、チャネル内を流れるすべての流体は多孔性部材を通過するにちがいなく、すなわち、その液体はチャネル内の多孔性部材をバイパスできない。
【００２４】
本発明の多孔性部材は、０．５ミクロン未満または、他の態様では、０．２ミクロン未満、１００ナノメートル未満、５０ナノメートル未満、１０ナノメートル未満、または５ナノメートル未満の平均細孔径を有することが可能である。
【００２５】
多孔性部材は、分子種と相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含んでもよい。分子種は、親和性標識／認識構成要素ペアを介してコロイド粒子にしっかりつながれてもよい。いくつかの態様では、少なくともいくつかのコロイド粒子は連結を介して他のコロイド粒子と相互連結されており、この連結においては、連結中の少なくとも一点で単一分子が含まれる。このことは、コロイド粒子間の連結はさまざまな場所で１つまたは複数の分子を含んでもよいが、少なくとも連結の一点では連結は単一分子のみであり、そしてその単一分子の破断によってコロイド粒子を分離することを、意味する。いくつかの態様では、チャネルを完全につなぐ多孔性部材の全体は、連結を介して他のコロイド粒子と相互連結されているコロイド粒子からできており、この連結のすべてが、少なくとも連結中の一点において単一分子を含む。コロイド粒子は、合成ポリマー、または天然にあるポリマー（ペプチドのような）および好ましくはオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーである分子を介して、相互連結されていてもよい。
【００２６】
本発明の多孔性部材は、さまざまな態様において、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の開放面積を有することが可能である。
【００２７】
チャネルは当業者に知られている本質的に任意のチャネルにより定義可能である。例えば、基質中に形成された溝によりチャネルを定義することも可能であり、またはチャネルは完全に閉鎖されてもよい。すなわちそれは、入口および出口を有する伸張された閉鎖構造であってもよい。
【００２８】
本発明のいくつかの方法は、化学的、生物学的、または生化学的物質と、その結合パートナーとの結合を決定することを含む。この結合は、いくつかの態様では定性的に、他の態様では定量的に決定可能である。本明細書で使用される「定性的に」および「定量的に」は、当該技術における普通の意味が与えられる。「定性的に」とは、１以上の物質が存在する（例えば、結合した）かどうかを決定することを意味する。「定量的に」とは、物質の量（例えば、結合した物質）を決定することを意味する。
【００２９】
１つの実施態様においては、流体が主流に沿って流れ、当該流体の全部ではなく一部が、主流から分析流へと向けられる。この分析流では、化学的、生物学的、または生化学的物質とその結合パートナーとの間の結合について、決定がなされる。この決定を使用することができ、主チャネル中の流体の流れに影響を与える。例えば、病原体を除去することが望ましい公共用給水において、多孔性部材上に固定された病原体の結合パートナーを提供することにより、当該病原体が存在するかどうかを決定するために、分析流を主水流から分岐し、連続的にモニターすることも可能である。もし病原体が存在し、病原体が多孔性部材に結合する場合、多孔性部材が部分的にまたは完全に遮断され、多孔性部材にかかる流体の差圧が変化する。これは、主要流体流を減少または停止するのに使われるシグナルとして、検出可能である。
【００３０】
いくつかの態様において、化学的、生物学的、または生化学的物質は、多孔性部材のところで結合することが可能で、そしてそれによって、多孔性部材のところに集められる。当該物質はしばらくして所望の箇所で解放され、そして下流で検出される。このようにして、多孔性部材が使用されて、物質を長時間集め、次いで当該物質を一度に（またはそれが集められる間の時間よりも少なくとも短い時間の間に）放出される。これによって、物質を長時間にわたり濃縮し、濃縮された物質を放出し、そしてそれを検出することにより、非常に低濃度の物質の非常に鋭敏な検出が可能になる。
【００３１】
本発明の他の長所、新規な特徴、および目的は、添付の図面（概略的であり、そして案分比例で描くようには意図されていない）をともに考慮すれば、以下の本発明の詳細な説明によって明らかになるだろう。図の中では、さまざまな図で図解されている同一の、または実質的に同様な各部分は、単一の数字または記号により表示されている。平明さを目的とするため、当業者が本発明を理解するのに図解が必要ない場合には、必ずしもすべての成分がすべての図で標号されているわけではなく、また本発明の各実施態様のすべての成分が必ずしも示されているわけではない。
【００３２】
詳細な説明
定義：
本明細書で用いられる「低分子」とは、５キロダルトン以下、より典型的には１キロダルトン以下の分子を意味する。本明細書で使われる場合、「低分子」はタンパク質を除外する。
【００３３】
本明細書で用いられる「候補薬剤」という用語は、ヒト、動物、または植物に使われる任意の医療用物質を指す。この定義には、化合物類似体、天然に存在する、合成の、および組換え体の、医薬品、ホルモン、抗微生物剤、神経伝達物質などが含まれる。これには、任意の物質または前駆体（天然に存在するか、合成されたか、または組換え体であるかを問わない）が含まれ、これらの物質または前駆体は、異常な凝集により特徴づけられる神経変性疾患または他の疾患の治療または予防のための薬剤としての使用が評価されるものである。評価は、典型的には、本発明のスクリーニング検査のような検査における活性を通じて行われる。
【００３４】
様々な種類の粒子が本発明において使用可能である。例えば、本発明の範囲内で利用される粒子として、以下のものの１以上を含んでもよい：本発明の目的のために使われる流体（典型的には水溶液）中においてそれ自身で懸濁状態を保つようにできる粒子、あるいは磁場、電磁場、撹拌（かき混ぜ、震盪、振動、超音波処理、遠心分離、渦動、または類似のもの）をかけることにより、溶液中において懸濁状態を維持可能な粒子を意味する「流体懸濁可能粒子」；磁場をかけることによって流体中に懸濁状態を維持することが可能な「磁気的に懸濁可能な」粒子；電磁場をかけることにより流体中に懸濁状態を維持することが可能な電磁気的に懸濁可能な粒子（例えば、電荷を有する粒子、または電荷を有するように修飾された粒子）；例えば磁場の援助なしに、少なくとも１時間、でそれが使われる流体（典型的には水溶液）中で懸濁状態のままであるほどに、サイズおよび／または質量が十分小さい粒子である「自己懸濁可能粒子」。他の自己懸濁可能粒子は、本発明に従って、援助なしに、５時間、１日、１週間、または１ヵ月間も、懸濁状態のままであろう。
【００３５】
「タンパク質」および「ペプチド」は、この技術分野においては周知の用語でり、そして各々が含むアミノ酸の数に関して技術分野では正確には定義されない。本明細書で使われる場合、これらの用語には、その技術分野における通常の意味が与えられる。一般的に、ペプチドは、長さ約１００のアミノ酸未満のアミノ酸配列であるが、３００アミノ酸までの配列を含んでもよい。タンパク質は、少なくとも１００アミノ酸の分子であると、一般には考えられている。
【００３６】
本明細書で用いられる「金属結合タグ（標識）」は、キレートにより配位されている金属につながられ得る分子の一群を指す。そのような分子の適当な群としては、アミノ酸配列があり、典型的には約２〜約１０のアミノ酸残基を含む。これらは、複数のヒスチジンおよび複数のシステイン（「ポリアミノ酸タグ」）を含むが、これに限定されるものではない。そうした結合タグは、それらがヒスチジンを含む場合、「ポリヒスチジン・トラクト（管）」または「ヒスチジンタグ」または「ＨＩＳ・タグ」と呼称されることがあり、そしてペプチドまたはタンパク質または核酸のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか、または任意の露出領域に存在してもよい。６〜１０残基のポリヒスチジントラクトが、本発明における使用には好ましい。また、当該ポリヒスチジントラクトは、関心のあるタンパク質に添加された多数の連続ヒスチジン残基であるとして機能的に定義され、それによって、金属キレートカラム上での当該生成タンパク質のアフィニティー精製、またはもう１つの分子（例えば、ＨＩＳ・タグと反応性の抗体）との相互作用によるタンパク質末端の同定が可能になる。以下における特定タイプの金属結合タグ（例えばヒスチジンタグ）の引例は、単に模範的なものであり、このようなタグとして、上記の金属結合タグのどれをも含んでよいが、それらは互換的なものであると理解すべきである。
【００３７】
「アフィニティータグ」には、技術分野における通常の意味が与えられる。アフィニティータグは、例えば、金属結合タグ、ＧＳＴ（ＧＳＴ／グルタチオン結合クリップにおけるＧＳＴ）、およびストレプトアビジン（ビオチン／ストレプトアビジン結合におけるストレプトアビジン）を含む。本明細書のさまざまな箇所で、特定のアフィニティータグが、相補的認識構成要素ペア（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｎｔｉｔｙ ｐａｉｒｓ）との結合相互作用との関連で、記載されている。アフィニティータグを用いるいかなる実施態様においても、本発明は、本明細書に記載のいかなるアフィニティータグから選択したものを含む一連の個々の態様を含むものと理解されるべきである。
【００３８】
本明細書で使われる「金属を配位するキレート」またはキレートにより配位された金属とは、キレート剤により配位された金属を指し、これは当該金属上の利用可能な配位部位のすべてが充たされておらず、金属結合タグによる結合のために利用可能ないくつかの配位部位を残されている。参照により本明細書に含まれるものとされるＢａｍｄａｄらの米国特許第５６２０８５０号は、典型的な金属結合タグ／キレート結合を記載している。
【００３９】
「シグナル伝達構成要素」とは、特定の試料中または特定の場所でその存在を示すことができる構成要素を指す。本発明のシグナル伝達構成要素は、ヒトの肉眼により同定可能であるもの、個別には目に見えないが、もし十分な量あればヒトの肉眼により検出可能と思われるもの（例えば、コロイド粒子）、可視的に（肉眼で、または電子顕微鏡または類似物を含む顕微鏡で）または分光法的に、容易に検出できるようなレベルまたは波長範囲内で電磁放射線を吸収または放出する構成要素、適切な活性化エネルギーに曝露すると特徴的な酸化／還元パターンを示すレドックス活性分子のような、電子的にまたは電気化学的に検出可能な構成要素（「電子シグナル伝達構成要素」）、またはこれに類するものであってもよい。例えば、染料、色素、レドックス活性分子のような電気活性分子、蛍光成分（定義によりリン光成分を含む）、上方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）リン光体、化学発光体、電気化学発光体、または西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素結合シグナル伝達成分を含む。「シグナル伝達構成要素の前駆体」とは、単独ではシグナル伝達能力をもたないが、もう１つの分子種との化学的、電気化学的、電気的、磁気的、または物理的相互作用により、シグナル伝達構成要素になり得る構成要素である。例えば、もう１つの分子と化学的相互作用するときだけ、特定の検出可能波長内の放射線を放出する能力を有する発色団が含まれる。シグナル伝達構成要素の前駆体は、本明細書で使われる場合、「シグナル伝達構成要素」と区別可能であるが、その定義内に含まれる。
【００４０】
もう１つの分子種に対して、またはある物品の表面に対してある分子種が「に固着される、または固着されるように適応される」または「に付着される、または付着されるように適応される」とは、本明細書で使われる場合、共有付着、特定の生体結合（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を介した付着、キレート／金属結合のような配位結合、または類似のものによって、分子種が化学的または生化学的に連結されることを意味する。例えば、この文脈における「固着される」または「付着される」とは、複数の化学的連結、複数の化学的／生物学的連結などを含み、ポリスチレンビーズの上に合成されたペプチドのような結合分子種、ビーズに共有的に付着するプロテインＡのようなタンパク質に結合する抗体に特異的に生体的に共役する結合分子種、ある表面に共有的に固着された結合パートナー（例えば、ＧＳＴの場合はグルタチオン）に今度は特異的に生体的に結合するＧＳＴまたはファージのような分子の一部を（遺伝子工学によって）形成する結合分子種などを含むが、これに限定されるものではない。もう１つの例として、チオールに共有的に結合された成分は、チオールが金に共有的に結合するため、金表面に取り入れられ固着する。同様に、金属結合タグを有する分子種は表面に取り入れられて固着されるが、その表面は、その表面分子も金属を配位するキレートを有しているような（チオール／金結合のような）表面に共有的に付着された分子を有する。ある表面が特定のヌクレオチド配列を有し、そしてある分子種が相補的ヌクレオチド配列を有するならば、分子種は表面に取り入れられ固着される。
【００４１】
「共有的に固着される」とは、１つ以上の共有結合そのものを介して固着されることを意味する。例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳの親和力を介して金表面に固着されている、カルボキシレートを示すアルキルチオールに共有的に共役されている分子種は、その表面に共有的に固着されている。
【００４２】
本明細書で用いられる「非特異的結合」とは、生化学分野での通常の意味が与えられる。
【００４３】
本明細書で用いられる「コロイド」とは、ナノ粒子（すなわち、非常に小さな自己懸濁性または流体懸濁性粒子）を意味し、例えば、無機または有機質、ポリマー性、セラミック、半導体性、金属性（例えば、金）、非金属性、結晶性、非晶質、またはこれらの組み合わせである材料からできているものが含まれる。本発明に従って使われるコロイド粒子は、典型的にはどの方向の断面も２５０ｎｍ未満、より典型的にはどの方向の断面も１００ｎｍ未満、そして大部分の場合約２〜３０ｎｍの断面である。本発明での使用に適しているコロイドの一群は、断面が１０〜３０ｎｍであり、そしてもう１つの一群は、断面が約２〜１０ｎｍである。本明細書で使われる場合、この用語は生化学の分野で普通に使われる定義を含む。
【００４４】
「試料」という用語は、生物学的ソースからの任意の細胞、組織、または体液（「生物学的試料」）、または生物学的または非生物学的な任意の媒体からの任意の細胞、組織、または体液を指し、これらは本発明に従って有利に評価され、人間の患者から得られる生体試料、動物から得られる試料、人間が消費するように設計された食物から得られる試料、家畜飼料のような動物食品用に設計された食物を含む試料、ミルク、臓器提供試料、血液供給用に予定された血液の試料、給水からの試料、またはこれらの類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。試料の１例として、薬剤の効力を決定するために候補薬剤に与えられるヒトまたは動物から得られる試料がある。
【００４５】
ある特定の成分を「含むと疑われる試料」とは、当該成分の含量が不明である試料を意味する。例えば、神経変性疾患または非神経変性疾患のような疾患を有すると疑われるが、当該疾患を有するとはわかっていないヒトからの体液試料は、神経変性疾患凝集体形成分子種を含むと疑われる試料と定義する。この文脈における「試料」とは、自然に生じる試料（例えば、ヒトまたは他の動物からの生理的試料、食物、家畜飼料などからの試料）、および「構造的に決定された試料」を含み、構造的に決定された試料とは、その化学的もしくは生物学的配列または構造が予め決定された構造であり、その構造が、神経変性疾患のような特定のプロセスと関連するかどうかを試験するための検査において用いられるものである試料を意味するように本明細書で定義される。例えば、「構造的に決定された試料」には、ペプチド配列、ファージディスプレイライブラリー中のランダムペプチド配列、およびその類似物が含まれる。ヒトまたは他の動物から採取された典型的な試料には、細胞、血液、尿、眼液、唾液、脳脊髄液、扁桃、リンパ節、針生検などからの体液または他の試料が含まれる。
【００４６】
本明細書で用いられる「分子ワイヤー」とは、ＳＡＭコート電極に遭遇する流体が当該電極と電気的に伝達する能力を高めるワイヤーを意味する。これは、導電性分子または、上述のおよび以下にさらに十分に例示するように、当該電極との伝達を可能にするＳＡＭ中にデフェクト（欠陥、傷）を起すこともあり得る分子を含む。分子ワイヤーのさらなる例示として、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトベンゾチアゾール、ジチオスレイトール、１，２−ベンゼンジチオール、１，２−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼンエタンチオール、および２−メルカプトエチルエーテルを含むが、これに限定されるものではない。単分子層の導電性は、電極平面の導電性を促進する分子の添加により高めることも可能である。導電性ＳＡＭｓは、１）硫黄が末端のポリ（エチニルフェニル）鎖；２）ベンゼン環が末端のアルキルチオール；３）ＤＮＡ塩基が末端のアルキルチオール；４）単分子層中へ充填されにくい任意の硫黄末端分子種；５）上記のすべてに、非特異的吸着を阻止するためのエチレングリコールユニットまたはメチル基のいずれかが末端のアルキルチオールスペーサー分子をプラスまたはマイナスしたものから構成されてもよいが、これに限定されるものではない。金に対する親和性のために、チオール類がＳＡＭの容易な形成において記載される。米国特許第５６２０８２０号および他の参考文献から当該技術分野で知られているように、他の分子をチオール類に代替することが可能である。分子ワイヤーは典型的には、それらのバルクまたは他の構造のために、ＳＡＭがさらされている流体に対する表面をＳＡＭが厳しく密閉することを防ぐために、比較的厳しく充填されたＳＡＭに傷をつくる。当該分子ワイヤーは、厳しく充填された自己集合構造体の破裂を生じ、それは、当該表面と電気的に通信するために、当該表面が流体にさらされることを可能にする傷となる。この状況において、当該流体は、トンネルの様にに孔をあけるか、類似のものによって、電子伝達が起こり得る表面に接触するか、当該表面に十分接近することにより、当該表面と電気的に伝達する。
【００４７】
「生物学的結合」という用語は、分子ペア間の相互作用を指し、この相互作用は相互の親和性または結合能力を示し、典型的には、生化学的、生理学的、および／または薬学的相互作用を含む、特異的または非特異的な結合または相互作用である。生物学的結合は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンおよびその類似物を含む分子のペア間に生じる相互作用の１類型である。具体例としては、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害物質、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、担体タンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸の相補鎖、タンパク質／核酸リプレッサー／インデューサー、リガンド／細胞表面受容体、ウリルス／リガンドなどが含まれる。
【００４８】
「結合パートナー」という用語は、特定の分子と結合することが可能な分子を指す。生物学的結合パートナーも、その一例である。例えば、プロテインＡは生体分子ＩｇＧの結合パートナーであり、そして逆も同じである。
【００４９】
「決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」と言う用語は、例えば、分光分析法、偏光解析法、圧電測定、イムノアッセイ、電気化学測定、および類似のものによる、ある分子種の定量的または定性的分析を指す。また、「決定すること」とは、分子種間の相互作用を検出することまたは定量すること、例えば、２つの分子種間の結合を検出することも意味する。
【００５０】
「自己集合単分子層」（ＳＡＭ）とは、表面上に自然に化学吸着された分子の比較的規則正しい集合であって、当該分子が相互にほぼ平行に、そして当該表面に概ね垂直に配向されているものを指す。当該分子の各々は、当該表面に接着する官能基、および当該単分子層中の隣接分子と相互作用する部分とを含み、比較的規則正しい配列を形成する。いずれも参照により本明細書に含められたものとされる、Ｌａｉｂｉｎｉｓ，Ｐ．Ｅ．；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｊ．；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５，８４５（１９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｅｖａｌｌ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１５５・７１６４（１９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１６４・７１７５（１９８９）を参照されたい。
【００５１】
「自己集合混合単分子層」という用語は、不均質な自己集合単分子層、すなわち、少なくとも２つの異なる分子の比較的規則正しい集合からできているものを指す。
【００５２】
「中断」または「中断する」という用語は、流動チャネルを通る流れに関して用いられる場合、流動チャネルを通る流れに対する抵抗の何らかの増加を指し、この抵抗の増加は、流体の流動に対して開かれた流動チャネルの断面積の分画の減少によるものであり、この減少は、例えば、流動チャネル内の少なくとも一部におけるナノ構造体またはナノネットの存在、またはその形状の変化により生じるものであって、これは、当該流動チャネルの有効直径を減少させるものである。
【００５３】
「有効直径」という用語は、上述の文脈でで用いられる場合、流体の流れに完全に開かれた断面を有し、そして、そこにおいて制限を有する流動チャネルの抵抗に本質的に等しい流体流動に対する抵抗、例えば、当該流動チャネルを通る流れの中断を起すナノネットを備える仮想の流動チャネルであって、そしてそこでの仮想の流動チャネルが、現実の制限流動チャネルのものと実質的に同様な全体的断面形を有する、前記仮想流動チャネルの断面直径を指す。
【００５４】
本発明の１つの側面において、三次元生体特異的マトリックスを、流動チャネルを横切って、粒子および相互連結ポリマー（例えば、天然および／または合成ポリマー）から自己集合させ、チップスケールデバイス中で試料調製、および／または標的被検体の濃縮および検出を実施するのに使用する。当該粒子は、好ましくは、ポリマーネットワークを形成するために、当該ポリマーにそれらの付着を容易にする成分を有する。もう１つの実施態様で、当該粒子は、例えば、標的物質に生物学的に結合することによって、当該標的物質を捕捉するプローブリガンドを有することも可能である。上記のように、形成された相互連結ポリマー／粒子ネットワークは、生じるナノ構造体を定め、それらの構造体は、超低圧力低下フィルター、標的被検体濃縮器、インシトゥ生体検出器として、あるいはさまざまな他の目的のために使用可能である。これらの構造体は、いくつかの態様では、論理的なまたは再構成可能なバルブとして作動するように、チャネル通る流れを阻止または遮断するためにも使用可能である。
【００５５】
図１は、機能化されたナノ粒子１０６へ付着しそして相互連結しているポリマー１０４のセグメントより成るナノ構造体を含む自己集合多孔性部材を、その中に含み、そしてその断面をつなぐ、流動チャネル１００を示す概略図である。当該ナノ構造体の末梢におけるいくつかのポリマー鎖、例えば、１０８は、末端終点、例えば、１１０を有し、それは、例えば、当該流動チャネルの表面１１２上の１つまたは１つより多い官能基との相互作用を経て、流動チャネル１００の内部１１２に付着している。図１に示すように、本発明のナノ構造体すなわちナノネットを含む前記多孔性部材の多くの特徴は、当該ナノ粒子が、当該連結の長さ沿いの少なくとも１点で、単一分子（例えば、単一バイオポリマーまたは合成ポリマー鎖）のみを含む、一連の個々の連結（例えば１０４）を経て互いに相互連結していることである。さらに、ナノ構造体すなわちナノネットを含む本発明的多孔性部材は、２つの隣接する孔、例えば、図１の孔１０３および１０５、を含むことも可能で、それらは、僅か単一分子、例えば、１０４、の幅で隔てられている。
【００５６】
１つの態様では、当該粒子はナノ粒子および／または自己懸濁性粒子であり、そして当該ポリマーはバイオポリマー（例えば、タンパク質またはペプチド、多糖、および／または核酸）であり、そして当該粒子およびバイオポリマー／流動チャネル表面を連結する当該付着は生物学的結合により仲介されている。ある好ましい態様では、当該ナノ粒子はコロイドで、そして当該バイオポリマーはＤＮＡである。特に好ましい態様では、自己集合単分子層（ＳＡＭｓ）で誘導化されている金コロイドは、当該コロイド上および当該流動チャネルの内部表面上に示された成分に対する結合パートナーを提示するＤＮＡの鎖により連結されている。コロイド上のそうした成分とＤＮＡ上の結合パートナーとの間の相互作用は、可逆的にもあるいは不可逆的にも設計可能である。結合の機構は、ＤＮＡ・ＤＮＡハイブリッド形成、他の生物学的結合、または化学的共役でもよい（図６および付随の説明でより詳細に下記で論考する）。可逆的結合機構は、当該ナノ構造体の再構成を可能にする。例えば、当該ナノ構造体を支持している相互作用を解放するために、ＤＮＡ・ＤＮＡ相互作用は、当該ＤＮＡを加熱水にさらすことにより分裂可能である。タンパク質・タンパク質生物学的結合を利用する態様の場合、そのような結合相互作用は、例えば、尿素または界面活性剤のような化学薬品の導入により、あるいはｐＨの変化を経て、解放可能である。適切な条件および分裂剤は、例えば、そこに固定化されているすべての物質を解放するように当該ナノ構造体の完全崩壊を可能にするために、例えば下流分析または検出のために、再構成および／または結合相互作用の解放を果すように、または、他の態様で、当該ナノ構造体を形成しているネットワークを解体せずに、当該ナノ構造体に固定化された第１結合パートナーを第２結合パートナーと置換するように、または被検体の下流決定のために、当該ナノ構造体を形成しているネットワークを解体せずに、当該ナノ構造体に固定化されている結合パートナーから当該被検体を解放するように、など、容易に選択可能である。
【００５７】
本発明のいくつかの実施態様は、コロイド粒子の表面のような、表面上の自己集合単分子層（ＳＡＭｓ）、およびＳＡＭｓでコートされた表面を有するコロイド粒子のような物品を、利用する。一組の好ましい態様では、合成分子で完全に形成されたＳＡＭｓは、ある表面またはある表面のある領域を完全に覆う、例えば、コロイド粒子の表面を完全に覆う。この関係での「合成分子」は、、天然には存在しない分子であって、むしろ、人工的に考えられまたは人工的に合成されたまたは人間による指令の制御の下に合成されたものを意味する。この関係での「完全に覆う」は、ＳＡＭによる完全で直接の被覆を妨げるタンパク質、抗体、または他の分子種と直接接触する表面または領域の部分がないことを意味する。すなわち、当該表面または領域は、その全体を横切って、天然に存在しない分子（すなわち、合成分子）から完全に構成されるＳＡＭを含む。当該ＳＡＭは、表面で最密充填ＳＡＭｓを形成するＳＡＭ形成分子種、当該ＳＡＭを通じて電子通信を促進できる分子ワイヤーまたは他の分子種（ＳＡＭに参加できる傷促進分子種を含め）と組合わせたこれらの分子種、ＳＡＭに参加できる他の分子種、およびこれらの任意の組合わせから完全に作られることも可能である。好ましくは、当該ＳＡＭに参加する分子種のすべては、金表面に共有的に結合するはずのチオールのような、当該表面に、選択的に共有的に結合する官能基を含む。ある表面上の自己集合単分子層は、本発明に従って、本質的に任意の化学的または生物学的官能基を提示（露出）可能な分子種（例えば、金が当該表面の場合、チオール分子種）の混合物から構成されてもよい。例えば、非特異的吸着に抵抗するためトリエチレングリコール末端分子種（例えば、トリエチレングリコール末端チオール類）、およびアフィニティータグの結合パートナーが末端の、例えば、ニッケル原子と複合した場合ヒスチジン標識結合分子種を捕捉するニトリロ三酢酸のように金属を配位できるキレートが末端の、他の分子種（例えば、チオール類）を含むことも可能である。これらの配置は、本発明のさまざまな実施態様に使用可能である。例として、コロイド上または別の表面上に形成されるかを問わず、自己集合単分子層は、非特異的吸着に抵抗するためトリエチレングリコール末端チオール類を含むチオール分子種（金が当該表面の場合）および例えば、ニッケル原子と複合した場合ヒスチジン標識結合分子種を捕捉するニトリロ三酢酸のように金属を配位できるキレートが末端の、アフィニティータグの結合パートナーが末端のチオール類との混合物で構成されてもよい。本発明は、いくつかの態様において、コロイド表面に提示された本質的に任意の化学的または生物学的分子種の濃度を厳密に制御するための、例えば、本発明に従ってさまざまな三次元ナノ構造体を形成するための、方法を提供する。
【００５８】
本発明の１つの側面で、三次元構造体は、流動チャネルにわたってインシトゥ（原位置で）形成される。本発明は、マイクロおよびナノ流動チャネルにわたって部分的に、そして好ましくは完全につなぐナノ構造体の形成に特によく適している（例えば、約１ｍｍを超えない、他の態様では約５００μｍを超えない、他の態様では約３００μｍを超えない、なお他の態様では約１００μｍを超えない、他の態様では約５０μｍを超えない、他の態様では２０μｍを超えない、他の態様では約１０μｍを超えない、他の態様では約５μｍを超えない、そしてなお他の態様では約１μｍを超えない、少なくとも１つの断面寸法を有するもの）。インシトゥ組立ては、一般的密封センサー内の流動チャネルの改造を可能にする。一般的ナノ構造体は、特定の標的物質または病原体の検出のためのような特定の使用に特異的にするために、流動チャネル内で組立て、次いでインシトゥ改造可能である。図２に図示するように、例えば、流動チャネル中のナノ構造体内でコロイド２０４を提示するＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）２０２にヒスチジン標識プロテインＡまたはＧ２００を付着させ、次いで特定の標的物質に結合パートナーを提示する抗体２０６を含む当該チャネルを通して試料を流すことにより、これは達成可能である。当該抗体は、次いでプロテインＡまたはＧ２００に結合し、かくして当該標的物質の捕捉に特異的なナノネットをつくることになる。
【００５９】
大部分の既成のセンサーは「専用の」検知能力を有する；すなわち、１つのセンサー技術は標的ＤＮＡを検出可能であるのに対し、もう１つは標的タンパク質を検出する、などである。本発明のいくつかの態様に従って提供される方法は、アレイフォーマットで並行にさまざまな異なる標的物質の同時検出を可能にする。これらの標的物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、全細胞などを含むことも可能である。インシトゥ組立てまたは改造は、流動チャネル内でナノネットの解体および再構成を可能にする。前成形コロイドおよび、標的物質に対する、抗体のような、認識エレメントの個別の在庫品を含むキットは、一般的センサーでの使用のために前包装可能で、それはそれらのセンサーを特定の検定用の特注品に容易に仕向けることになる。あるいは、前成形ＳＡＭコート粒子またはコロイドを、一般的密封センサー中に予め組立てられたナノネット中に懸濁することも可能である。標的被検体または病原体の識別子（例えば、結合パートナー）で、当該ナノネットをインシトゥで特注化するには、当該コロイドに結合するように修飾または形成も可能な所望のプローブリガンドであって、そのリガンドが、例えば、抗体であってもよい前記プローブリガンドを含む前包装溶液を、当該センサーに注入するだけでよい。
【００６０】
本発明に従い提供されるナノ構造体は、金または金コート基質、シリコン、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）または広く多様な他のポリマー性材料を、非限定的に、含む広く多様な材料から構築されたチャネル中に形成および／または付着させることも可能である。当該ナノ構造体は、直接的または間接的結合または共役を経て当該チャネル表面に付着させることも可能である。好ましい態様では、当該ナノ構造体は、当該ナノ構造体を含む前記ポリマーおよび／またはコロイドに付着された成分の結合パートナーを有するＳＡＭでコートされた基質へ付着する。
【００６１】
本発明のもう１つの側面では、ナノ構造体は、同じセンサー内で、複数の流動チャネルを横切って形成されてもよく、そして単一試料について並行してさまざまな検定を実施するために、異なる空間的場所に差動的に修飾されてもよい。被疑標的を複数のＤＮＡ，タンパク質および細胞決定基を同時に分析することにより同定する能力は、検出の精度および／または融通性を、例えば、桁違いに高めることもあり得る。好ましい態様では、マイクロセンサーまたは微小流体ネットワークの異なる流動チャネル中に位置するコロイドは、いくつかのマーカーを同時検出することにより特定標的の同定を可能にするために、特定のＤＮＡサイン、タンパク質識別子、および／または細胞または胞子特異的マーカーなどに対する結合パートナーで誘導体化される。あるいは、多重チャネルセンサーの各流動チャネルは、並行して複数の試料について同じ分析を実施するように、修飾することも可能である。
【００６２】
いくつかの態様では、当該ナノ構造体は、試料調製のために役立つフィルターとして機能することも可能で、そうしたナノ構造体は、バイオアッセイを妨害する恐れがある、過剰で無関係な生体物質および何らかの細胞残渣を排除可能である。当該フィルターの有効孔サイズは、（１）当該相互連結ポリマー鎖の長さ；および（２）当該粒子のサイズ、約２ｎｍないし約２００ｎｍ直径のサイズ範囲のものが一般に好ましい、：を変えることにより異なるサイズ範囲の残渣を排除するように調節することも可能である。
【００６３】
当該ナノ構造体はまた、当該構造体の粒子が、標的物質を含むと疑われる試料の標的物質に結合する結合パートナーを提示する場合、濃縮器として機能することも可能である。このようにして、検出デバイスの感度は、下流決定／検出のための適切な溶離剤または処理（例えば、化学溶離剤、ｐＨ変化、温度変化などに曝露）を経る、被検体の放出の前に、当該標的被検体を前濃縮することにより改善も可能である。本発明の本側面は、無関係なバックグラウンド材料から標的物質を分離するのにも使用可能である。標的物質を濃縮するために、当該ナノ構造体のコロイドまたは粒子は、標的物質または病原体に対する結合パートナーならびに相互連結ポリマーネットワーク（例えば、核酸ウェッブ）への結合を容易にするための成分を提供する抗体または他の物質で、誘導化することも可能である。いくつかの態様では、当該ナノ構造体による被検体の濃縮の程度は、当該ナノ構造体を通る流体流動を可能にし、そして当該被検体の下流決定を可能にするために、当該被検体を放出する前に、（以下に、より詳細に説明するように）当該ナノ構造体を含むチャネル沿いの流体流動が本質的に遮断されるようになる点まで進行することを可能にしてもよい。
【００６４】
図３は、生体特異的濃縮器として構成されたナノ構造体の概略図である。その図解態様では、流動チャネル２５０は、それによりナノネットを形成するポリマー鎖２５６を経て互いに相互連結されているコロイド２５４を含むナノ構造体２５２を、その中に含む。ナノ構造体２５２は、コロイド２５４に固着されたポリマー２５６と、導管２５０の内壁２５８に固着されたポリマー２６０との間の結合相互作用を経て、導管２５０の内壁につなぎ止められている。（複数の）コロイド２５４の少なくとも一部（例えばコロイド２６２）は、図解されているように、濃縮されるのが望まれる被検体、例えば、病原体２６６に対する結合パートナーを含む、そこに固着された抗体分子２６４をさらに含む。チャネル２５０を通る流れの通過に際して、抗体２６４に対して親和性を有する病原体２６６は、当該ナノ構造体に結合しそして固定化されるようになる傾向があり、一方当該流体流中に含まれる他の物質（例えば、２６８）は、当該ナノ構造体を自由に通過することが可能である。
【００６５】
前記記載のナノ構造体は、いくつかの態様では、インシトゥバイオセンサーとしても使用可能で、その１例を図４に図示し、そして以下に説明する。そのようなバイオセンサー３００は、次のように作動するように構成可能である：標的物質２６６がナノ構造体２５２中のコロイド２５４または粒子上の認識基（例えば、抗体２６４）に結合する場合、それらは捕捉され、そしてその有効開放断面積を変えることにより当該チャネルを通る流れを妨げる。次いで、当該ナノネット中の標的物質の捕捉は、当該チャネルを通る流動の中断から生じる、当該フィルターを横切る流速、圧力および／または電気浸透力の変化を検出することにより、検出可能である。例えば、示差圧力モニター３０２で、圧力降下の変化を検出することによる標的の検出は好ましい態様であるが、それは、チャネルを通る流れの所定速度を維持するために必要な圧力は、開放面積チャネルの有効直径の４乗に反比例し、本法を非常に感度の高いものにしているからである。
【００６６】
上記のナノセンサーは、好ましい態様において、極めて少ない電力消費で、流体培地の遠隔、リアルタイム、連続モニタリングを提供可能である。１つの例として、給水を、複数の標的汚染物質または病原体の存在について、連続的にモニターすることも可能である。粒子提示リガンドの標的との相互作用は、当該ナノネットを詰まらせ、そして流動を中断する傾向があり、それは、上述のように、高レベルの感度で検出可能である。当該センサーは、所望があれば、流速または圧力降下のいずれかの測定変化が、汚染された水の配水を停止させるためのストップ・フロー機構の誘発を生じるように、フィード・バックループへ電気的にまたは電子的に組込むことも可能である。
【００６７】
本発明の１つの側面は、一般的なナノ構造体を流動チャネル中に予め形成させ、それから、標的物質を認識するリガンドまたは結合パートナーを提示するために、後から特注するようなモジュラーシステムを提供する。当該認識リガンドは、標的物質に対して特異的な結合パートナーを含む、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよび／または合成分子など、を含んでもよい。
【００６８】
いくつかの態様では、当該ナノネットは、コロイドをＤＮＡの鎖と連結させる（例えば、図６に図解し、以下に説明するように）ことにより形成可能である。例えば、（１）当該ＤＮＡに付着するか、またはその中に含まれる基に結合する成分；（２）標的物質に結合する認識リガンド／結合パートナー；そして好ましくは、また、好ましくは、（３）当該コロイドを非特異的結合に対して抵抗性にする成分：を提示するＳＡＭｓでコロイドを誘導化することにより、これは達成可能である。例えば、ＤＮＡ、ニッケル（ＩＩ）をキレートするニトリロ三酢酸（ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ））およびエチレングリコール基を提示するＳＡＭｓで誘導化されたコロイドは、当該コロイド上に提示されたＤＮＡが、橋をかけているＤＮＡの鎖の末端断片に相補的な場合、三次元構造体へ自己集合可能である。当該ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）基は、当該標的物質を認識するヒスチジン標識タンパク質を捕らえ、そして当該タンパク質を当該標的物質への結合のために提示可能である。エチレングリコール頭部基は、当該コロイドが非特異的結合に抵抗するのを援助する。多数のヒスチジン標識または他の金属結合標識認識リガンドのいずれの１つでも、当該ナノネットの特異性を変えるために、当該コロイドに付着させることも恐らく可能だろう。認識リガンドは、当該ナノ構造体の集合の前または後に、当該コロイドに付着させることも可能である。ＤＮＡ、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）およびエチレングリコール基を提示するＳＡＭｓで誘導化されるコロイドを含み、特定の標的物質の結合パートナー（すなわち、「認識エレメント」）で流動チャネルを横切って予め形成されているナノネットを特注化するには、ヒスチジン標識認識エレメントを含む溶液を当該ナノ構造体を通して流すだけでよい。あるいは、抗体のＦｃ部分に結合するタンパク質Ｇのヒスチジン標識断片を、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）を有するコロイドに付着させてもよい。このようにして、多種多様の標的化物質を捕捉するために、本質的には任意の抗体を、当該ナノ構造体に容易に付着させることも可能である。
【００６９】
別の態様では、プローブリガンドを、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）・ヒスチジン・タグ結合以外の方法により当該コロイドまたは粒子に付着させることも可能である。例えば、アフィニティータグの他の結合パートナーを、アフィニティータグ標識認識エレメントを捕捉そして提示するために、当該コロイドに付着させることも可能である。例えば、グルタチオンを当該コロイドに付着させてもよく、それらはグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を結合可能である。好ましい態様では、当該グルタチオンはチオールに共有的に固着され、それは次いで、金コロイド上に形成される自己集合単分子層へ取込まれる。あるいは、認識エレメントは、コロイドまたは粒子に直接、共有的に固着されることも可能である。例えば、露出したカルボキシ基を有するコロイドは、当該認識エレメントを含むリガンド中の一級アミンにＥＤＣ／ＮＨＳ親和力を経て共役することも可能である。
【００７０】
当該コロイド上の基とのアフィニティータグ相互作用を経て当該コロイドに認識エレメントを付着させることの１つの利点は、その補足された標的が、次いで、下流検出のために、当該ナノネットから便利にも放出可能なことである。例えば、ある粒子上に固定化された、ヒスチジン標識認識エレメントに結合される捕捉標的物質は、当該ヒスチジンタグとＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）に対する結合で競合するイミダゾールの添加により、放出させることが可能である。当該放出に必要なイミダゾールの量は、当該表面に存在するＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）の量に依存し、したがって一定であり、それは、捕捉された標的物質の濃度に無関係である。逆に、もし当該標的物質が、粒子の表面に共有的に固着されている基により捕捉されるならば、その場合、当該標的を放出するのに必要な、ｐＨの変化および類似のもののような、条件は、捕捉された標的の量にに依存し、それは予めわからないことが多い。
【００７１】
粒子および連結ポリマーから成る三次元構造体は、上記のものとは別のさまざまな方法を用いて、流動チャネルを横切って構築可能である。例えば、図５Ａおよび５Ｂ（それらは、相互連結構造の自己集合前（図５Ａ）および後（図５Ｂ）のナノ構造体を含むさまざまな成分を図解する）に図解されているように、ナノ粒子・ＤＮＡナノ構造体３１０も、ストレプトアビジン３１６およびその末端でまたはその近くでビオチン（Ｂ）により修飾されているＤＮＡ３１８とともに、ビオチン３１４を有するナノ粒子３１２を混合することによって、自己集合可能である。ビオチン修飾ＤＮＡの長鎖は、ビオチニル化プライマーを用いる慣用のＰＣＲ技術によって、生成可能である。あるいは、ストレプトアビジンで修飾されたコロイドを、ビオチン修飾ＤＮＡへ直接付着するように結合させてもよい（不掲示）。このタイプのナノ構造体は、その表面にストレプトアビジンを有する流動チャネルに容易に付着させることが可能である。ストレプトアビジンは、チャネル表面に直接付着させても、当該表面上のビオチン基への結合を経て間接的に付着させても、いずれでもよい。上記の間接連結の１つの好ましい態様では、ビオチンを提示するＳＡＭｓは、金コートされたエッチング済みまたは機械仕上げチャネルの１つまたは１つより多い表面上に形成される。
【００７２】
図６に図解されるように、コロイド・ＤＮＡナノ構造体３５０も、ＤＮＡの長いリンカー鎖３５６の末端に相補的なＤＮＡの短鎖３５４でコロイド３５２を誘導体化することにより、形成可能である。コロイド表面に提示されたＤＮＡに相補的な合成ＤＮＡオリゴを経てコロイドを連結するのが簡単であるが、本発明に従って提供されるナノネットの構造エレメントを形成するためには、ＤＮＡのそうした合成片は好ましくない。ＤＮＡオリゴは典型的には、現在利用できる技術を用いて、最長約７０塩基対を超えて合成できない。そのような長さは僅か約２４ｎｍの渡り長に相当するに過ぎず、一方典型的なコロイドの直径は、例えば、約１０〜３０ｎｍのオーダーの可能性がある。そうした短い鎖は、本発明により提供されるナノネットについて好ましい開放面積の程度および有効孔サイズを提供するのに十分長くない。それ故、好ましい態様では、ＤＮＡのより長鎖３５６（数十ないし数百ないし数千の塩基対またはそれ以上）を、細菌プラスミドから酵素的に切出す。ＤＮＡのこれらの片は二本鎖であり、そのため、当該コロイド表面上に提示されたＤＮＡの短鎖３５４にハイブリッド形成するために、前記ヌクレオチドは利用できない。したがって、二本鎖ＤＮＡのこれらの片の、コロイドまたは粒子への付着を容易にするために、短いＤＮＡ「アダプター」３５８を、長い二本鎖ＤＮＡの各末端（例えば、３６０で）上に酵素的に連結する。これらのアダプターは、それらの長さの少なくとも一部にわたって相補的であるが、異なる長さを有する、２片の合成ＤＮＡ３６２，３６４から構築可能である。それらのアダプター３５８は酵素制限部位３６６で酵素的に切断可能で、３６６は当該アダプター中へ一端で操作されており、それは、適当な酵素で消化３６８後に、二本鎖ＤＮＡへ接続するためであり、その二本鎖ＤＮＡは、前記アダプター３５８とハイブリッド形成のために短い一本鎖長３７２を露出するように、一本鎖ＤＮＡの断片を切取るために、酵素によりその両末端３７０で同様に消化されている（プラスミドＤＮＡ中の制限酵素部位は、切除された鎖が均一の長さになるように、既知の技術を用いて容易に選択可能である）。アダプター３５８の別の末端３７４は、コロイド３５２へハイブリッド形成するための一本鎖「尾部」を提示する。このタイプの構造体は、表面固定化ＤＮＡオリゴヌクレオチド３７８へのＤＮＡハイブリッド形成を経て、流動チャネル３７６へ付着可能である。あるいは、当該流動チャネルは、コロイドの最初のセットまたはポリマー鎖の最初のセット上の結合パートナーを認識する基で誘導体化することも可能である。コロイドまたはポリマーのこの最初のセットは、それが当該チャネル表面を当該ナノ構造体へ接続し、一方、それに続く粒子およびポリマーは相互に連結するように、設計することも可能である。上述のＤＮＡ修飾技術は、当業者により十分理解される。
【００７３】
ナノ粒子ポリマーナノネットのインシトゥ構築については、２つの基本的戦略がある。１つは自発的自己集合であり、一方、もう１つは段階的自己集合である。例えば、前者の方法では、ＤＮＡ提示コロイドおよび相互連結ＤＮＡを、適切な比率で大量に混ぜ合わすと、その結果、流動チャネルをつなぐ本質的に完全な、空間的に局在化したナノネットの自発的形成が生じる。これに対して、後者の戦略は、コロイド次いでＤＮＡエレメント（またはその逆）の小部分を段階的に導入し、段階的な仕方で当該ナノネットを秩序正しい集合へ作りあげることにかかわる。
【００７４】
本発明の側面はまた、本発明により提供されるナノ構造体の三次元性質も利用する。分子生物学の当業者は、２つまたはそれ以上の抗体が、標的上の２つの異なるエピトープを認識することにより、標的物質に同時に結合できることを、了解する。異なる標的エピトープを認識する、２つまたはそれ以上の抗体の、離れたコロイド集団上への固定化は、当該ナノ構造体に、流動チャネルの長さに沿った架橋そして凝縮を起させる傾向があり、その際、標的物質または病原体は、流動を減少し、そしてついには、実際に遮断することもあり得る、密着した細網へ当該コロイドの凝集を誘導する。あるいは、または加えて、当該標的およびシグナル伝達構成要素に特異的な第２抗体を有する第２コロイド集団を、当該標的物質または病原体の捕捉後に導入し、インシトゥでまたは下流感知エレメントのいずれかで、当該シグナル伝達エレメントを経て、当該標的を検出できるようにすることも可能である。
【００７５】
基質、例えば流動チャネル表面を、さまざまな仕方で三次元粒子ポリマーナノ構造体の付着を可能にするように、修飾してもよい。好ましい方法では、流動チャネルの表面を金コートし、そしてその上に、当該３Ｄ構造体の付着を容易にするためのリガンドを提示するＳＡＭｓを形成させる。あるいは、非限定的にＰＶＣおよびＰＤＭＳを含む基質を、以下に説明する合成案に従って修飾し、そのようなリガンドに共有的に固着させるか、共役させてもよい。流動チャネルの長さおよび／または断面積の一部内にだけ当該ナノ構造体を空間的に制限するために、さまざまな技術を用いることが可能である。これらは、非限定的に、流動チャネル表面の一領域に反応物を含む溶液を制限する技術、当該全表面に反応物を導入するが、空間的に特別な領域のみを活性化する技術、および当該流動チャネルの空間的に特定の領域上に官能基または単分子層を化学的に加えるためのマイクロスタンピングテクノロジーを用いる技術、を含む。組立てられた三次元ナノ構造体は、当該構造を支えている結合相互作用を分裂させるために、例えば、熱、加熱溶液、ｐＨを変えた溶液、またはホルムアミドような化学溶液を、当該流動チャネルに導入することにより、インシトゥで解体することも可能である。
【００７６】
上述のように、流動チャネル基質は各種の合成ポリマー性材料で構成することも可能で、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリビニルアルコール、カルボキシル化ＰＶＣ、およびポリアリルアミンで、それらはいずれも、当該チャネルへの当該ナノ構造体の付着を容易にする、ＤＮＡ、ビオチン、またはタンパク質成分に容易に共役可能である。例えば、ＰＶＣ表面上へのＤＮＡ断片の付着は、図７Ａに示すスキーム１に図示されており、そして下記中に詳細に記載されている：相間移動触媒または溶媒を用いる懸濁中のポリ塩化ビニル上へのグラフティング（移植）、Ｎｋａｎｓａｈ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｇ．，；Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ中：Ｃａｒｒａｈｅｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．編，Ｐｌｅｎｕｍ，ニューヨーク、１９８３，ｐ．１０９；二元機能性チオール化合物によるＰＶＣ修飾、Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，Ｈ．，Ｍｉｊａｎｇｏｓ，Ｃ．；Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌ．３６，１９９６，１３；可変ポリ（塩化ビニル）ネットワークの合成、Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，Ｈ．，Ｈｉｄａｎｌｇｏ，Ｍ．，Ｍｉｊａｎｇｏｓ，Ｃ．；Ｍａｃｒｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１７，１９９６，１５；医学および関連適用のための耐移動性、血液和合性、可塑化ポリ塩化ビニル、Ｌａｋｓｈｍｉ，Ｓ．，Ｊａｙａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．；Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ ２２（３），１９９８，２２２。上記の戦略は、本および他基質への他の認識基の付着を容易にするように、容易に拡張可能である。ｐ−（ヒドロキシメチル）チオフェノールによる第二級塩化アルキル（１）の求核置換は、選択的に当該チオエーテル（２）を生じる。このプロセスは、溶液中および融成物中ですっきりとそして選択的に進行することが、証明されている（例えば、化学的に修飾されたポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）中のガラス転移温度に対する溶媒の効果、Ｌｏｐｅｚ，Ｄ．Ｍｉｊａｎｇｏｓ，Ｃ．，Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７２，１９９４，１５９を参照されたい）。当該ポリマー表面上のチオエーテル基の密度に直接関係する置換の程度は、実験条件に依存し、そして調節可能である。（２）の生成の条件下ではＰＶＣと反応しない、（２）中のベンジル型水酸基は、適切に保護されたＤＮＡオリゴマー（３）に付着させるのに、ここで使われる。いくつかの付着プロトコールが利用できる。例えば、（３）の５´−スルホン酸塩エステルの求核置換は、その共役産物（４）を与えるはずである（同様な置換反応の例については、亜硝酸陰イオンとの求核置換を経る３´−デオキシ−３´−ニトロチミジンの新しい合成、Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｊ．，Ｒａｇｏｕｚｅｏｓ，Ａ．，Ｒｉｄｅｏｕｔ，Ｊ．Ｌ．；Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．３２，１９９５，６９１；および、新規二環式［２，２，１］リボヌクレオシド類：２´−アミノ−および２´−チオ−ＬＮＡ単量体ヌクレオシド類の合成、Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，１９９８，６０７８を参照されたい）。別の戦略は、（５）のベンジル型スルホン酸塩エステルの、（６）におけるように、当該ＤＮＡ断片のアミンとの求核置換で、（７）を産生することに、かかわるものであろう。（６）のような化合物を調製するのに利用可能ないくつかの５´アミノモディファイヤーは、標準的ＤＮＡ合成技術による使用のために、商業的に入手可能である（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア、米国、から）。
【００７７】
当該ナノ構造体への結合のためのリガンドを当該表面の選択された空間場所に付着させ、一方、当該表面の残りの部分を非特異的結合に対して実質的に無傷に保つための、ポリマー表面調製の１つのプロセスは、図７Ｂ中に図示したスキーム２に模式的に表示する。上記のように、ポリマー表面（１）は、ｐ−（ヒドロキシメチル）チオフェノールで修飾し、（２）を生成させる。当該表面を広げ離した当該水酸基群を、２−ニトロベンジル（ＮＢＺ）のような感光性の保護基でここで保護し、（８）を得る（当該技術のより詳細な説明については、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク、１９９９；および、有機合成における光取外し保護基、Ｐｉｌｌａｉ，Ｖ．Ｎ．Ｒ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８０，１：を参照されたい）。当該ポリマー表面の小領域を、マスクを通して適切な波長の光（ｈν）で照射することにより、選択的に脱保護する；このプロセスは、表面（９）を生成する特定の区域でのみ前記表面水酸基を解放する（光指令の空間的にアドレス可能な化学合成に関する参考文献については：ガラス基質上でのＤＮＡアレイの光指令合成の効率、ＭｃＧａｌｌ，Ｇ．Ｈ．，Ｂａｒｏｎｅ，Ａ．Ｄ．，Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｍ．，Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｇｅｎｔａｌｅｎ，Ｅ．，Ｎｇｏ，Ｎ．，；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，１９９７，５０８１；および、光指令の空間的にアドレス可能な並発化学合成、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｒｅａｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｉｒｒｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｌｕ，Ａ．Ｔ．，Ｓｏｌａｓ，Ｄ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，１９９１，７６７を参照されたい）。それらの遊離水酸基は、（１０）を調製するために上記のようにＤＮＡ断片を付着させるのに、ここで使われる。最後に、当該表面の残りを脱保護し、そして得られる水酸基は、（１１）を形成させるためにエチレングリコールオリゴマーを付着させるのに、用いられる。
【００７８】
もう１つの好ましい態様では、流動チャネルは、当該チャネルに沿って多点検出場所を備えて、形成される。好ましい方法は、さまざまな標的に特異的なさまざまな認識エレメントを提示するシグナル伝達コロイドの数分子種と、当該試料とを混合することである。認識エレメントは、核酸、タンパク質、低分子、プリオン様ペプチド、抗体、または（例えば、フィブリル、プロトフィブリル、または定序ペプチド凝集体を含む）標的分子と相互作用する低分子であってもよい。試料プラグと呼ばれる、試料とコロイドの混合物は、被疑標的の１つに特異的な第２の認識エレメントも宿す、個別の空間的にアドレス可能な場所へ、流動チャネルを通して送られる。
【００７９】
例えば、多点検出場所流動チャネルシステムの最初の実施態様は、図８Ａに図示する。図示されるように、Ａｂ１〜１０と示された抗体を含む一連のプローブリガンドを、当該チャネル表面に直接それぞれを固定化するか、または単一チャネル４００に沿った個別の場所に固定化された離れたナノネット表面に含めてもよい。圧力センサーまたは流速検出器などのような検知エレメント４０２は、プローブリガンドを提示する各個別領域に隣接して位置する。標的物質を含むと疑われる試料を、ＡｂＡ〜Ｊと示される抗体をそれぞれ提示する一組のナノ粒子と混合する。本システムでは、Ａｂ１およびＡｂＡは第１の特定標的病原体上の異なるエピトープをそれぞれ認識し、Ａｂ２およびＡｂＢは第２の標的に対して同様であり、Ａｂ３およびＡｂＣは第３の標的に対して、などである。このようにして、特定チャネル４００を通る圧力低下プロファイルの分析は、指定場所で、さまざまな標的物質のどれが、当該チャネル中に、したがって当該試料中に、存在するかの同定を可能にする。あるいは、単一流動チャネルの長さに沿って位置するＡｂ１〜１０を提示する前記個別の領域の代わりに、Ａｂ１〜１０の各々は、図８Ｂに図示するように、別々の流動チャネル中に固定化し、ＡｂＡ〜Ｊと示される抗体をそれぞれ提示する一組のナノ粒子と混合した当該試料を、各チャネルに沿って流してもよい。各チャネルに沿った圧力または流速の分析は、さまざまな標的物質のどれが、当該試料中に存在するかの同定を可能にする。
【００８０】
あるいは、図９に示すように、上記の両組の抗体を遊離溶液中のナノ粒子上に提示することも可能である。図示された態様では、Ａｂ１〜１０を含むナノ粒子（わかり易いように、Ａｂ１〜３チャネルだけを図示してある）の各々は、流れが第１方向に進行する別々の流動チャネルに向けられる。試料のアリコットをＡｂｓＡ〜Ｊと別々に混合し、そして各々は、第１組のチャネルに直交する別々の流動チャネル（わかり易いように、ＡｂＡ〜Ｃチャネルだけを図示してある）に向けられる。このようにして、流れは、Ａｂ２／ＡｂＢおよびＡｂ３／ＡｂＣのチャネルの交差点で減じ、それは同時に、当該試料中の標的物質を認識し、そして架橋ナノ構造体を形成する。
【００８１】
もう１つの方法は、１つの標的に対して特異的な認識エレメントを宿す場所に当該試料を連続的に向け、そしてその標的の存否の検出に基づいて、当該試料を、論理アルゴリズムに基づく次の場所へ向け直してもよい。あるいは、当該試料は、すべての場所で同時に導入可能で、そして当該場所の問いただしは、決定点での検出結果に基づき、論理アルゴリズムに従って実施する。あるいは、当該分子種の存在は、論理アルゴリズムにより解釈する。当該標的物質の特定の側面、特徴またはエピトープの存在は、１つの場所で検出可能で、そしてこの検出に基づいて、当該試料プラグは次の場所へ向け直され、そこで当該標的物質の異なる側面、特徴またはエピトープが検出されることもある。このようにして、論理的診断薬試験を実施することも可能である。
【００８２】
論理的診断薬試験システムは、本発明に従って、さまざまな仕方で実行可能であるが、例えば、最初の試料プラグを、多くの標的に特異的な認識エレメントを有するシグナル伝達粒子とそれを混合する混合チャンバー中へ導入することも可能である。もう１つの好ましい態様では、当該システムの流動経路を通る流れを、標的物質の結合により中断することも可能である。そうした場合には、検出は圧力測定により行うことも可能で、そしていくつかの態様では、特定の流動経路への流動分岐は、そうしたチャネル中断により達成可能である。この方法は、当該流動の妨害を可能にするために、当該流動経路の一区画内に結合パートナーを固定化することを含んでもよい。当該流動の妨害は、当該障害物を横切るより高い圧力低下および／または流速の減少を生じる。いずれの場合も、当該変化を検出し、そして定量的および定性的決定を行うのに使用可能である。当該試料および粒子混合物は、個別の検知場所で局所認識エレメントを示す流動チャネルの迷路を通るように向けられる。これらの局所認識エレメントは、もしそのような標的物質が当該試料中にあれば、各組からの１つのエレメントが、その特定標的物質に同時に結合し、そしてそれ故、当該流動チャネルを中断するように、粒子固定化されている認識エレメントの当該組に相補的な組を形成するために、構成されてもよい。各検知場所での各測定の結果は、次の測定チャンバーヘ当該連結チャンバーを通る流れを向け直すために、本明細書ではマイクロバルブと呼ぶ、小流体バルブを活性化するのに、コントローラーにより利用されることも可能である。これらの測定結果次第では、当該流動を他のチャンバーなどへ向けてもよい。各チャンバーは単に便宜的な流動経路に過ぎず、当該検定そのものには関与しないことを、留意されたい；しかし各チャンバーは、例えば、圧力、流速などの測定処理能力を提供する。
【００８３】
特に好ましい実施態様では、図１０に図示するように、標的特異的ナノ粒子も選択的に含む当該試料は、流動チャネルの迷路４１０を通るそれ自身の経路へ向けることが可能である。当該試料中に存在する作用物質が、流動経路４１４に沿った個別のスポット４１２で、粒子（存在する場合には）上の認識エレメントおよび／または認識エレメント（類）へ同時に結合する場合には、当該チャネルネットワークのその部分を通る流れを遮断するためのバルブとして働く、ナノネット４１６が形成する。当該試料が当該流動チャネルネットワーク通ってたどった経路を、次いで分析し、当該試料中にどの標的物質類または標的物質の側面が存在したかを決定する。図１０に図示した上記の微小流動技術の論理的流動操作の例は、当該試料および、いくつかの標的分子に特異的なリガンドを提示する多くの生体特異的コロイドを含む、試料混合物を形成することにかかわる。次いで、当該試料混合物を、当該標的分子の１つに対して特異的でもある第２リガンドをそれぞれが宿す場所を通して連続的に流す。例えば、流動経路沿いの第１場所４１２は、「それはウイルス性か？」という質問をしてもよく（すなわち、ナノ構造体４１６は抗ウイルスリガンドを含む）、そこで、もしウイルスが存在し、そして試料／コロイドの結合が生じたとすると、詰まりまたはナノネットの形成および流動の遮断により、流れは第２場所へ向けられる；この場合、当該認識事象は活性化可能マイクロバルブとして働く。次の場所４１８、４１９は、「そのウイルスはインフルエンザに相同性を有するか？」または「それはエボラに相同性を有するか？」と尋ねてもよい。もしそうであれば、次に当該試料は、「何がその薬剤抵抗性か？」および類似の質問を尋ねる場所へ向けられる。図１０に図示する例では、当該試料プラグは、場所４１２で詰まったナノネットを形成して反応する（チャネル４１４を通る流れが無くなる＝「ウイルスあり」）。流れは次に、「ウイルスあり」チャネル４２０に沿って、分岐点４２２の方へ向けられる。当該試料は、場所４１９で抗エボラナノ構造体を詰まらせるが、抗インフルエンザナノ構造体を含む場所４１８を自由に通過し、それ故、当該試料はインフルエンザでなくエボラを含むことを示す。当該試料は、チャネル４２４に沿って分岐場所４２６へ流れ続け、それは抗エボラナノ構造体を含み、遮断されるようになり、それ故、チャネル４２６に沿ってエボラ薬剤スクリーンへ流れを向ける。次いで流れは、チャネル４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、および４３８へ進行するが、各チャネルは、エボラに対する親和性が検討される薬剤候補を提示するナノ構造体を含む。詰まるようになるチャネルは、エボラ標的に対する親和性を有する薬剤候補に相当し、その詰まりの程度が相互作用の程度／親和性に相関する。図示されているように、当該試料は、エボラ陽性／インフルエンザ陰性であり、そして薬剤候補４がエボラに対して親和性がある。
【００８４】
あるいは、当該試料の小部分を離れた検知場所へ配達し、一方、当該試料の主要部分を、ロボット試料配達アームの試料チャンバーに留めておいてもよい。その第１場所における標的物質の存否の検出に基づいて、当該ロボットアームは、（論理的アルゴリズムに基づいて）当該試料のその次のアリコットを第２検知場所へ配達するように指示されるようになる。このようにして、論理的診断および論理的検知を、最少のマイクロ流体工学で達成可能である。
【００８５】
流動の中断による検出は、食べ物、水、および／または飲料流体が処理されている工場におけるように、常時モニタリングが必要な情況では、特に有用なこともあり得る。そのような流動モニタリングの利点は、エネルギーがほとんどまたは全くいらないことである。当該プラントはそのプロセスそのものの一部として当該材料を流すので、当該流動の小部分を流出させること、または主要流に沿って測定場所を設置することは、当該試料を動かすための処理流動圧に追加のエネルギー入力をほとんどまたは全く課さないで済む。問題が見つかった時または場合には、自動バルブが活性化され、当該問題が修正されるまで、当該処理ラインを停止する。当該停止バルブのための活性化エネルギーも、当該プラントの処理流動圧から得ることも可能である。問題物質の検出は、流動検出によるか、または他の上記の方法の何れかによることも可能で、そこでの選択は、モニターされている当該プロセスの特定のパラメターおよび必要により決定される。そのような場合、安定で丈夫なリガンドが好ましい。流動中断が所望の検出図式である場合には、当該標的および当該リガンドは、効率的に流動を中断するために、強くそして長いポリマーを含む三次元構造体を作出するように設計することも可能である。あるいは、ある共通標的の異なる領域を同時に認識する２つのエレメントを有するポリマーを、効率的に流れを減らせる分子篩を形成するのに使ってもよい。好ましいリガンドは、相補性核酸、タンパク質またはペプチド、タンパク質複合体、または結合パートナーである抗体、低分子または合成認識エレメントを含む。
【００８６】
流動中断はまた、マイクロまたはナノ流体システム中の流動を意図的に遮断し、そして本質的に任意の「ナノバルブ」を交換するために、一般的に使用可能である。好ましい態様では、当該流動遮断機構は、当該システムが再使用可能なように、可逆的であるように設計してもよい。例えば、ＤＮＡオリゴは、ＤＮＡオリゴとのビーズ／粒子／コロイドをやはり宿す流動チャネルの内部の上に固定化してもよい。架橋オリゴは、既述のように、分子篩を形成するために、表面リガンドおよびビーズリガンドの両方に同時に結合してもよい。さらに、当該架橋オリゴの長さおよび配列は、特定分子量種用の分子フィルタートラップを形成するように、設計してもよい。少なくとも１つの結合パートナーを、流動チャネルに閉じ込めなければならないことは、明らかである。１つの態様では、当該リガンドは、光活性化化合物で当該チャネルの内側をコートすることにより、続いて、化学的に修飾したリガンドで当該チャネルを充たすことにより、当該流動チャネルの内部表面上に固定化することも可能である。チャネル壁を通してのレーザー照射は、特定のスペクトル光エネルルギーに曝される表面化合物とのみ当該リガンドを反応させ、空間的に限定された検出ゲートを作出する。当該チャネルは次いで洗浄され、当該結合リガンドで誘導体化されたチャネルの特定面積を残すことも可能である。当該リガンドはまた、流動チャネルを横切ってはめ合わされた膜またはマイクロスクリーン上に固定化されるか、または膜のマイクロスクリーン上のポリマー上に固定化されてもよい。当該リガンドはまた、膜またはスクリーンにより制限された、または、技術分野では知られている、Ｈ・フィルターのようなｐＨ勾配により流動チャネルの所定の断面上に保持された、ビーズ上に置かれることも可能である。このＨ・フィルターでは、ｐＨは、同じ場所での再循環のために当該ビーズを解離および回収するように、当該経路に沿って変化する。
【００８７】
次の実施例は、本発明の恩典を具体的に説明することを意図しているが、本発明の全範囲を例示するものではない。
【００８８】
【実施例】
実施例１． ビオチンおよびＮＴＡの両方を提示する金ナノ粒子上にＳＡＭｓを形成すること。
【００８９】
ＳＡＭプロトコール。 １．５ｍＬのＡｕｒｏ Ｄｙｅ Ｆｏｒｔｅ（金コロイド）をベンチトップマイクロフュージ（卓上型小型遠心分離機）上、１４ｋで１０分間ペレット化した。その上清を移し、そして保存した。当該コロイド含有ペレットを、界面活性剤溶液である保存用貯蔵緩衝液の１００μＬ中に再懸濁した。１０μＭビオチン・チオール，１０μＭ ＮＴＡ・チオール，および５８０μＭのカルボキシ終結Ｃ１１チオールを含む１００μｌのＤＭＦ溶液を、前記コロイド溶液に加え、そして２時間インキュベートし、それからペレット化した。次に、その上清を移し、そして捨てた。当該ペレットは次に、５０μｌの前記界面活性剤貯蔵緩衝液中に再懸濁した。１００μＬの４００μＭトリエチレングリコール終結チオール溶液を、前記再懸濁コロイドペレットに添加し、そして水浴中で次のように加熱サイクルした：５５℃で２分間；３７℃で２分間；５５℃で１分間；そして３７℃で２分間。当該溶液を室温に戻し、それから１４ｋで１０分間再びペレット化した。その上清を移し、そして当該ペレットを１００μｌ １０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁した。１％ＮｉＳＯ４を含む界面活性剤溶液の１００μＬを加え、その結果、ＮＴＡ金属キレートがＮｉ（ＩＩ）を複合体化し、そして次いで当該成分がヒスチジン標識分子種を容易に捕捉できるようにした。
【００９０】
実施例２． 相互連結ＤＮＡにより三次元ネットワーク中へ結合された金コロイドを含むナノ構造体を形成すること。
【００９１】
図５Ａおよび５Ｂは当該戦略を図解する図面である。
【００９２】
当業者にはよく知られているように、ビオチン成分で各末端を修飾される二本鎖ＤＮＡは、ビオチニル化プライマーを用いてＤＮＡ鋳型上でＰＣＲを実施することにより、作製可能である。異なる孔サイズを有するナノ構造体の形成を可能にするために、１ｋｂおよび２ｋｂの両ＤＮＡ断片を作製した。当該ＰＣＲ産物は、標準的技術を用いて、アガロースゲル上で精製した。
【００９３】
図１１は、ディジタル写真と、対応する実験を図解した下絵との合成物の複写写真である。本図は、ビオチン・ＳＡＭ・コートコロイドをストレプトアビジンおよびビオチニル化ＤＮＡとともにインキュベートしたときに、コロイド・ＤＮＡナノ構造体が形成されることを示す。コロイド・ＤＮＡナノ構造体の形成は、前記コロイドおよびＤＮＡ含有溶液の色調変化を検出することにより、検出される。均質な溶液中に分散されたとき、当該溶液が桃色になるのは、金コロイドの固有の性質である。しかし、当該コロイドを無理に近付けると、当該溶液は桃色から青色に変わるが、青色の程度はコロイド間の距離に依存する。
【００９４】
１０μｌの０．０２ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液を、１ｋｂビオチニル化ｄｓＤＮＡ（Ｃ），ビオチニル化ｄｓＤＮＡおよび過剰のビオチニル化一本鎖ＤＮＡプライマー類（Ｄ）、またはＤＮＡ（Ｂ）の代わりに緩衝液のいずれかとインキュベートし、そして２％ビオチンおよび２％ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）を提示したＳＡＭｓで誘導体化された金コロイドの３０μｌに、ウエル当り１００μｌの終容量にリン酸緩衝液中で添加した。対照ウエル（Ａ）は、１ｋｂビオチニル化ＤＮＡを含むが、ストレプトアビジンを含まない。上図に見られるように、ストレプトアビジンの不在下（Ａ）では、ビオチン・コロイドプラスＤＮＡは変色しない。ビオチン・コロイドプラスストレプトアビジン（Ｂ）は、１０分以内に赤色から青色に変色し、そして最終的に溶液は透明になる。ビオチニル化ＤＮＡの存在下で、ビオチン・コロイドプラスストレプトアビジンは、赤色から紫色に変色し、当該ＤＮＡのビオチニル化末端は、ストレプトアビジンの結合について当該コロイド上のビオチンと競合したことを示す。時間が経つと（１時間以上）、ビオチン・コロイドおよびストレプトアビジンの混合物は、完全に青色になり、当該凝集体は溶液から砕け、ウエル中の溶液を透明にした。ビオチン・コロイドプラスストレプトアビジンおよび１ｋｂＤＮＡは、いつまでも同じ色のままであり、当該コロイド・ストレプトアビジンネットワーク中へのビオチニル化ＤＮＡの取込みは、当該ネットワークが溶液中に懸濁したままになるように、当該コロイドを一定の距離に保つことを示した。ウエルＢとＣの内容物を移し、そしてペレット化し、そして当該ペレットを臭化エチジウムで染色した。ウエル（Ｃ）からのペレットは、当該ペレット中にＤＮＡを示し、当該ＤＮＡがネットワーク中へ取込まれていることが確認された。一本鎖ビオチニル化プライマー類（Ｄ）の存在下でのビオチン・コロイドプラスストレプトアビジンは、プライマー上の当該ビオチンが、ストレプトアビジンの結合について当該ビオチン・コロイドと競合したので、変色しなかった。当該プライマー類は一端でのみビオチニル化されているので、それらは、ビオチニル化１ｋｂＤＮＡがしたようには、コロイド・ＤＮＡ・ストレプトアビジンネットワークをつなぎ合わせるのには役立たず、そして当該ウエルは桃色のままであった。
【００９５】
実施例３． 再構成可能なナノ構造体。
【００９６】
ナノ粒子とｄｓＤＮＡの相互作用から形成される自己集合三次元構造体は、原位置で解体および再構成された。加熱した水の添加は、当該ＤＮＡ鎖を溶融または解離させた。各ＤＮＡ鎖は一端でのみビオチニル化されていたので、鎖溶融は当該ナノ構造体の解体を起した。図１２に図示した実験は、ナノ構造体が、当該溶液を加熱したときに、溶融することを示した。これらの結果は、ナノ粒子・ＤＮＡ構造体が、原位置で構成および再構成可能なことを示す。それらの結果はまた、形成するものが、実際にネットワークであって、解体し易いことはありえない非特異的な凝集体ではないことを証している。なお図１２について、左側で（１）は、ビオチニル化ｄｓＤＮＡ、ビオチン・ＳＡＭ・コート金コロイド、およびストレプトアビジンを含む溶液の写真のコピーである；（２）は、ビオチン・ＳＡＭ・コート金コロイド、およびストレプトアビジンを含むが、ビオチニル化ｄｓＤＮＡを含まない溶液の写真のコピーである；そして（３）は、ビオチニル化ｄｓＤＮＡ、ビオチン・ＳＡＭ・コート金コロイドを含むが、ストレプトアビジンを含まない溶液の写真のコピーである。それらの溶液は、次に２分間煮沸した。右側の対応するウエルに見られるように、２つの青色溶液の色は桃色に戻ったことから、当該ナノ構造体の溶融を示している。
【００９７】
実施例４． 自然に自己凝集するペプチドに連結された金コロイドを含むナノ構造体を形成すること。
【００９８】
図１３は、ナノ構造体が、凝集し易い分子種と誘導体化ナノ粒子とを混合することによっても、組立て可能なことを、図解している。ベータ・アミロイドペプチドは、自己凝集してフィブリルやプラークを形成することが知られているが、それらはアルツハイマー病の特徴である。ベータ・アミロイドペプチドは、インビトロ（試験管内で）自己凝集して病的なフィブリルを形成することも知られている。ヒスチジン標識ペプチドを捕捉するように、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）を提示した自己集合単分子層で誘導体化された金コロイド５００を、そのうちの一部５０４は当該コロイドへの付着を容易にするためにヒスチジンタグを有するた、ベータ・アミロイドペプチド５０２と混合した。図１４は、ヒスチジン標識ベータ・アミロイドペプチドを、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）所有ナノ粒子と混合した結果生じるペプチド・ナノ粒子ナノ構造体を示す、写真のコピーである。ナノ構造体形成が４０倍拡大で明瞭に見える（上図）が、ヒスチジン標識ランダム配列ペプチドは、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）ナノ粒子と混合した場合、ナノ構造体を産生しない（下図）。図１５は、ナノ粒子形成の程度が、金コロイド溶液の色調変化に相関することを示す、ディジタル画像の複写写真である。金コロイドの固有の光学的性質のために、粒子付着ベータ・アミロイドペプチド自己凝集体として、コロイド粒子がごく近くに引付けられ、そしてナノ構造体を形成するとき、桃色から青色へ、当該コロイド溶液の色調変化が起る。この図は、異なる薬剤候補が、９６ウエルプレートの各ウエル中のヒスチジン標識ベータ・アミロイドペプチドに加えられた、薬剤スクリーニング検定を示す。対照は最も左のカラム沿いにあり、上半分は薬剤を含まず、下半分はヒスチジン標識ランダム配列ペプチドを含む。色調変化の程度がナノ粒子形成の程度と相関することを例証するために、代表的なウエルの内容物を４０倍に拡大して示す。
【００９９】
実施例５． ナノスケールのフィルター、濃縮器、またはセンサーとして働く構造体を形成するために、金コート表面上の空間的に限定された領域につなぎ留められたナノ構造体。
【０１００】
マイクロ・またはナノ・スケールの流動チャネル中にこれらの機能性ナノ構造体を形成するには、同じような方法が使用可能である。
【０１０１】
不活性分子種のバックグラウンド中にビオチンの細い縞を表すパターン化ＳＡＭは、次のように金表面上に形成された。６００マイクロモルの総チオール濃度になる、２０％ビオチンチオールおよび８０％トリエチレングリコール末端型チオールを含むＤＭＦ溶液中に、ピペットの先端を浸し、そして金コート基質を横切って引張った（ドラッグした）が、これを本明細書ではチップと呼ぶ。当該チップ（複数）を室温で３０分間インキュベートし、それから、チップの全表面が覆われるように、４００μＭトリエチレングリコール末端型チオールの１ｍｌ溶液を含むシンチレーションバイアルに移した。次いで、当該チップ含有バイアルは、次のように、水浴中で加熱サイクルした：５５℃で２分間；３７℃で２分間；５５℃で１分間；そして３７℃で２分間。当該チップは室温へ冷却した。チップは、ＤＭＦ次いで水中ですすぎ、そしてアルゴンの気流下で乾燥した。上記のように調製した３０μＬビオチン・ＮＴＡ・ＳＡＭ・コートコロイド、１０μＬ０．０２ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液、および両端をビオチニル化された１０μＬの１ｋｂ ｄｓＤＮＡを含む溶液を、当該チップとともにインキュベートした。１５分間のインキュベーション期間の後、当該チップを水中ですすいだ。
【０１０２】
チップ表面上の細いビオチン提示縞に付着された、コロイド・ＤＮＡナノ構造体の形成は、当該チップの写真のコピーを示す図１６Ｂに、（金コロイドの赤色のために）濃い縞として容易に見ることができる。ナノ構造体形成の区域は、その表面上に金コロイドが凝集するので、黒ずんで見える。ビオチンに対して４つの結合部位を有するストレプトアビジンが、ビオチン提示コロイドおよびビオチン修飾ＤＮＡに同時に結合したときに、コロイド・ＤＮＡネットワークが形成された、それは図５Ａと５Ｂを参照されたい。同様に、ストレプトアビジンは、溶液中で遊離の状態で、当該ナノ構造体中の露出したビオチン成分および当該チップ表面上の露出したビオチン成分に、同時に結合した。当該ナノ構造体は、金コロイドの赤色のために、濃い縞として見える。対照：図１６Ａは、当該チップの全表面が均一に赤色（濃い）を呈するのを示す。均質のビオチン・ＳＡＭは、縞の中よりも、このチップの全表面にわたって形成された。図１６Ｃおよび１６Ｄに示すチップ上には赤い発色（濃い区域）はなく、当該コロイド・ＤＮＡナノ構造体はチップ表面に付着しなかったことを示す。。図１６Ｃおよび１６Ｄで使われたチップは、ＮＴＡ（Ｃ）およびトリエチレングリコール（Ｄ）のみを提示する均質なＳＡＭｓでコートされた。
【０１０３】
本発明はさまざまな実施態様について説明されたが、本発明は、本発明の精神内の広く多様なさらなるそして他の態様も可能なことは、言うまでもない。本明細書に記載のナノ構造体は、各種の検出デバイスに使用してもよい。最善の技術の決定は、検出される材料の特質、そしてその化学および標的および流速などに、依存する可能性もある。本来電子的である検出器も、記載のナノ構造体と適合可能である。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施態様が、本明細書に記載され、そして図解されたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施することおよび／または当該結果または利点を得ることについて、さまざまな他の手段および構造体を、容易に思い付くであろうし、そしてそうした変化または修飾の各々は、本発明の範疇内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメーター、寸法、材料、および構成などが、模範的であることを意味し、そして実際のパラメーター、寸法、材料、および構成などは、本発明の教示が使われる具体的な適用に依存するであろうことを、容易に了解するであろう。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの相当すものを、日常的な実験手段だけを用いて、認識し、あるいは確かめることができるであろう。したがって、前記の実施態様は例として提示されたに過ぎず、付随の請求事項およびそれに相当するものの範囲内において、本発明は、具体的に説明されたもの以外に、他の仕方で実行してもよいことは、言うまでもない。本発明は、本明細書に記載の各個別の特徴、システム、材料および／または方法に向けられる。加えて、２つまたはそれ以上のそうした特徴、システム、材料および／または方法の任意の組合せは、そうした特徴、システム、材料および／または方法が相互に矛盾しない限り、本発明の範疇内に含まれる。当該特許請求の範囲では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」，「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」，「ｃａｒｒｙｉｎｇ（〜を有する）」，「ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）」，「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（〜を含む）」および同様なもの、のような転換句または包含の句はすべて、開放的であると理解される、すなわち、「非限定的に含む」を意味するものとする。転換句または包含の句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（〜から成る）」および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（実質的に〜から成る）」だけは、それぞれ閉鎖的、または半閉鎖的なものと解釈するものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の実施態様の１つに従い、流動チャネル上の官能基との相互作用によって流動チャネルの内部につなぎ留られている、機能性化されたナノ粒子へ付着された相互連結ポリマーを含んでなる、自己集合ナノ構造体の概略図である。
【図２】
図２は、タンパク質Ｇの断片との相互作用（タンパク質Ｇは、ナノ粒子上にあるヒスチジンタグとＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）成分との間の相互作用を介して今度はナノ粒子に結合されている）によって、本発明の１つの実施態様に従って、ナノ構造体のナノ粒子に付着している抗体を示す概略図である。
【図３】
図３は、標的物質を認識するリガンドを有するように包埋ナノ粒子を誘導体化する場合、どのようにナノ構造体が生体特異的濃縮器として使用可能かを図示する概略図である。
【図４】
図４は、図３のナノ構造体中による標的物質の捕捉が、ナノ構造体にかかる流速の変化または圧力勾配の変化を検出することにより、どのように検知されるかを示す概略図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、抗体およびビオチンを有するナノ粒子が、どのようにストレプトアビジンおよびビオチニル化ｄｓＤＮＡと相互作用し、生体特異的であるナノ構造体を形成するかを示す、前後の概略図である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、抗体およびビオチンを有するナノ粒子が、どのようにストレプトアビジンおよびビオチニル化ｄｓＤＮＡと相互作用し、生体特異的であるナノ構造体を形成するかを示す、前後の概略図である。
【図６】
図６は、粒子・ポリマーネットワークの形成を容易にするために、ＤＮＡ誘導体化コロイドおよびアダプター配列で修飾されたＤＮＡからナノ構造体を構築するためのスキームを示す概略図である。
【図７Ａ】
図７Ａは、ポリ塩化ビニルなどの表面にＤＮＡを付着させるための合成スキームを示す概略図である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、流動チャネルの細い領域を横切るナノ構造体の付着のための空間的に仕切られた区域中で、表面を化学的に機能性にするための合成スキームを示す概略図である。
【図８Ａ】
図８Ａは、本発明の１つの実施態様に従う多重標的バイオセンサーの概略図である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、本発明のもう１つの実施態様に従う多重標的バイオセンサーの概略図である。
【図９】
図９は、本発明のさらにもう１つの実施態様に従う多重標的バイオセンサーの概略図である；
【図１０】
図１０は、本発明の１つの実施態様に従う論理処理に用いるための自動スイッチングバイオセンサーの概略図である。
【図１１】
図１１は、実験的試験ウエル（ｗｅｌｌｓ）のディジタル写真の複写写真を合わせたもの、および、ビオチン・ＳＡＭ・コートコロイドをストレプトアビジンおよびビオチニル化ＤＮＡとともにインキュベートしたときに、コロイド・ＤＮＡナノ構造体が形成されることを示す、対応する実験を図示する概略図である。
【図１２】
図１２は、熱の付加によりナノ粒子を接続するｄｓＤＮＡを溶融することにより、ナノ構造体が原位置で再構成可能なことを示す実験結果を提示する。
【図１３】
図１３は、凝集し易い分子種と誘導体化ナノ粒子とを混合することによってもナノ構造体が組立て可能なことを証明する概略図である。
【図１４】
図１４は、ヒスチジン標識ベータ・アミロイドペプチドをＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）含有ナノ粒子と混合した結果生じるペプチド・ナノ粒子ナノ構造体（上図）おおよびヒスチジン標識ランダム配列ペプチドをＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）ナノ粒子と混合した場合にナノ構造体を産生しないことを示すものである（下図）を示す４０倍拡大の写真のコピーである。
【図１５】
図１５は、ナノ粒子形成の程度が、金コロイド溶液の色調変化に相関することを示す、ディジタル画像の複写写真である。
【図１６】
図１６は、ナノ構造体をつなぎ留める成分を有するように誘導体化された金コート表面に、空間的に仕切られた仕方で、ナノ粒子・ＤＮＡナノ構造体が形成され、そして付着されることを示す一組のディジタル写真のコピーである。
関連出願
この仮出願でない出願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９条（ｅ）、タイトル３５に基づき、２０００年１０月３日付けの同時係属米国仮出願第６０／２３７４２７号および２００１年３月１日付けの米国仮出願第６０／２７２７２７号について利益を請求し、いずれの出願も参照によって本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
分野
本発明は、診断、治療、環境サンプリングおよび食品モニタリングに関係する、流れを中断させることに基づく新しい検出方法、および検出のための流動チャネルの複雑な回路を通る流れを向け直すために、チャネルを通る流れの中断を用いる方法に関する。本発明はまた、生物学的サンプルを含め、標的物質を含むと思われるサンプルを操作し、取扱う方法に関し、分子、生体分子、細胞および胞子などの標的材料を検出、分離および／または濃縮する。上記の検出および分離のための流路および流速を操作することを含む、多重プロセスおよび論理プロセスに、本発明を利用または適用することも可能である。また、常時監視システムにおける検出のために本発明を利用することが可能である。常時監視システムとしては、環境モニタリング、遠隔モニタリング、食品安全性、および移植可能なバイオセンサーを含むが、これに限定されるものではない。
【０００３】
背景
生物兵器を検出するために設計されたものを含め、治療診断に関するマイクロおよびナノ・スケールのバイオセンサー、ラボ・オン・ア・チップ・デバイス（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ ｄｅｖｉｃｅｓ）、および各種の小型化センサーを開発することに、今日、商業的に大きな関心が寄せられている。実際には、これらの応用のほぼすべては、一体化された試料調製を必要とする。試料調製には典型的に３つのプロセスが必要になる：１）デバイス内の微小流体チャネルを詰まらせ、検出感度を低下させる恐れがある屑（ｄｅｂｒｉｓ）を濾別すること；２）標的被検体を濃縮し、感度を高めること；および３）予測できる位置での下流検出のために標的を放出すること。チップスケールのデバイス中でこれらの試料調製方法を達成する技術は、現在のところ存在しない。慣用のフィルターや試料濃縮器は実用的でない。なぜなら、それらは膜のような材料によってできており、流体の流れに対し開かれている小さな有効径を通して試料を押し流すのに大きな圧力勾配を要するためである。標準的な試料調製フィルターは、代表的には、約０．２ミクロンのみかけの孔径を有するニトロセルロース膜である。こういったフィルターの１つにおける孔の断面積の和は、典型的には、当該フィルターの全断面積の僅か約０．３％である。これは、フィルターが存在している流動チャネルの有効直径は、フィルターが存在することにより大きく減少することを意味する。流動チャネルに試料を通すのに必要な圧力は、流動チャネルの直径の４乗に反比例する。したがって、流動チャネルの有効直径が小さくなることは、大きな圧力低下およびそれに伴う上流への圧力要求となるため、チップスケールのデバイスに組入れることは現状で不可能である。微小遠心分離器のようなベンチトップ装置上で容易に生成される大きな圧力低下は、マイクロデバイス内では簡単には生成されない。マイクロスケールバイオセンサーまたは他のマイクロスケールデバイス中のフィルターに試料流体を通過させるには、マイクロデバイスから分離されたマクロスケールのオフラインポンプが、現状では典型的に必要である。
【０００４】
チップスケールセンサーに標準的な試料調製部材を組み込むことに対する他の障害は、再使用可能性である。現在入手可能なフィルターは、典型的には一回限りの使用で、再使用ができない部材であり、チップスケールバイオセンサーへ組込んだ場合、これらの高価なデバイスを一回限りの使用で再使用不能にすることになる。加えて、そうした部材を組込むには、コネクターの使用が必要となるが、コネクターには、マイクロスケールの場合、漏れや破裂の問題がついてまわる。
【０００５】
開示の要約
生体材料のような標的物質をスクリーニングおよび測定することに関する上述の制約および問題の多くは、本発明システムで検討されている。
【０００６】
本開示は多孔性部材を記載し、この多孔性部材は好ましい実施態様において三次元ネットのようなナノ構造体（すなわち「ナノネット」）を含むことができ、この構造体は、ナノ粒子およびポリマー類を連結するもの（これは自己集合して、流動チャネルをつなぎ、ナノスケールフィルターを形成する）、濃縮器、および／または元の位置の（ｉｎ ｓｉｔｕ）検出器（チャネルを通る流れの中断されることを検出することにより標的物質または病原体が捕捉されたことを検出する）を含んでなる。本発明は、小型化センサー中で試料調製をいかに行うかという問題を検討する。本発明は、圧力低下の小さいフィルターおよびやはり再構成可能な濃縮器を提供することにより、小型化センサーの開発を困難にしているいくつかの重大な問題（以下に詳述する）を解決することが可能である。これらの方法は、移植可能なデバイスだけでなく、遠隔測定に使用されるリアルタイム連続モニタリングに特に適している。
【０００７】
本発明の観点として、誘導体化ナノ粒子およびバイオポリマー類の使用を記載し、これにより、多くの機能を有する、再使用可能／再生可能な三次元ナノ構造体が組立てられ、このナノ構造体は、マイクロまたはナノ・スケールの流動チャネル中に組立てることが可能で、新しいバイオセンサー、ナノフィルターおよびナノ濃縮器を創出する。
【０００８】
多孔性部材すなわちナノ構造体は、標的物質に対する認識リガンドを提示するように懸濁性ナノ粒子が誘導体化される場合には、バイオセンサーとして機能することも可能である。標的分子種の捕捉は、流動の中断により生じる下流圧、流動速度または他のパラメーターの変化を検出することにより、検出可能である。
【０００９】
本発明はナノフィルターを含む多孔性部材も記載し、この多孔性部材は相互連結用の粒子およびポリマー類（好ましくはバイオポリマー類）を含んでなり、これらは流動チャネル内のその位置に（ｉｎ ｓｉｔｕ）組立てられ、チャネルの不可欠の部分になる。いくつかの例として、例えばＤＮＡおよび金コロイドナノ粒子から構築されたナノフィルターは、０．５ミクロン未満、他の態様では０．２ミクロン未満、他の態様では１００ナノメートル（ｎｍ）未満、他の態様では５０ｎｍ未満、他の態様では１０ｎｍ未満、そして他の態様では５ｎｍ未満の公称相当孔径または平均細孔径を提供可能であり、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびいくつかの態様では９８％またはそれより多くの、流れに対して開かれた断面積を提供可能であり、典型的な標準膜フィルターでは０．３％である。有効流動チャネル径がこのように増加することにより、チャネルを通る流れを所定の速度に維持するのに必要な圧力が、少なくとも１６倍、他の態様では少なくとも２５０倍、他の態様では少なくとも６００倍、他の態様では少なくとも１０，０００倍、なお他の態様では少なくとも１００，０００倍の減少を生じ得る。その結果生じる極めて小さい必要圧力は、チップスケールポンプによって、または移植可能なデバイス中の拍動心臓によってさえも容易に生成可能である。粒子およびバイオポリマーを含むが、標的分子種と結合するリガンドを含まないナノ構造体が、チップスケールフィルターとしての使用するには好ましく、このようなフィルターは、流動チャネルの内部断面を横切って、原位置で（ｉｎ ｓｉｔｕ）解体し、再構成することが可能である。これらの構造体によって、標準的なフィルターが必要とする圧力より数桁も低い圧力で、所定の流体流動で、試料流体を濾過することが可能になる。細胞、胞子、細胞屑（ｄｅｂｒｉｓ）、または細菌の排除に対応するため、または他の濾過用途のために、相互連結性ポリマーストランドの長さを変更して、さまざまな有効公称「孔」径のナノフィルターを作出することも可能である。本発明で記載したナノフィルターは、ＤＮＡハイブリッド形成および／またはビオチン・ストレプトアビジン結合のような生体特異的相互作用を介して、誘導体化流動チャネルへ係留することも可能である。このように、ナノ構造体を再構築することを可能にする条件により、流動チャネルへナノフィルターを係留している生体相互作用を単に阻害することにより、ナノフィルターをその後の分析検定のために原位置で解体、再組立、および再構成することが可能である。
【００１０】
特定の標的分子種を捕捉し、濃縮し、次いで放出するためのナノスケール濃縮器を作出するように、いくつかの態様では、生体特異的プローブ／リガンドを有するように誘導体化されたコロイドを、上述のナノフィルター中へ取込むこともできる。なお別の態様では、このような誘導体化ナノネットを、標的検出のために使用することが可能である。ナノネット中に標的を捕捉したことによって、チャネルを通る流動が中断されることを検出することにより、流体試料中の標的被検体の存在を検出するための、ナノネットの形成およびこれらのナノネットの使用を、本発明はいくつかの態様で含む。ナノネットが標的被検体を捕捉し、チャネル中の流動を中断させた場合には、流動に開放されたそれらの有効断面積を変えることにより、こういった態様のナノネットはインシトゥセンサーまたはバイオセンサーとして機能し得る。流動の中断により生じる、流動チャネルにかかる流速、圧力低下および／または電気浸透力の変化を検出することによって、このような態様での標的分子種の存在を検出することができる。本発明よって流動チャネルを横切る圧力低下の変化を検出することにより標的分子種の検出は容易になるが、この標的分子種の検出は中断の程度に大きく影響され、これは、チャネル通じて所定の流速を維持するために必要な上流圧がチャネルの有効径の４乗に反比例するからである。この検出能力をより一層高めるために、流動チャネルのトポロジーを、溝形構造を有するように構築することも可能である。
【００１１】
出願人らは、以下の出願において、金コロイド上の生体特異的な自己集合単分子層（ＳＡＭｓ）の形成方法を、既に記載している：「神経変性疾患における異常タンパク質凝集の迅速かつ高感度検出」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年１月２５日付けで出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０１９９７（２０００年７月２７日にＷＯ００／４３７９１として公開）、「非コロイド構造体上の分子種とコロイド固定化分子種の相互作用」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年１月２１日付けで出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０１５０４（２０００年７月２７日にＷＯ００／４３７８３として公開）、「非コロイド構造体上の分子種とコロイド固定化分子種の相互作用」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年６月２３日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第０９／６０２７７８号、および「タンパク質凝集の迅速かつ高感度検出」の標題でＢａｍｄａｄらにより２０００年８月３日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第０９／６３１８１８号（すべて、参照により本明細書に含まれるものとする）。これらの方法は、ナノ粒子上に、ＤＮＡ，タンパク質、ペプチド抗体、他のリガンド、またはこれらの組合わせを提示することを可能にする。１つの態様において、本発明は、標的となる病原体または被検体に対する抗体を提示するナノ粒子に連結されたポリマーから構築されたナノネットを提供する。このような態様では、ナノネットは、その被検体に特異的な濃縮器および／または検出器を含んでなる。
【００１２】
他の好ましい実施態様では、コンピューターシステムまたは他の制御システムの制御下で系内の流れの向きを変えることができるバルブを含む論理流動経路を形成するように、流動系を配置することが可能である。系内の実際の流動経路の配置を決定することは、１以上の検出部位でごく最近、どの標的が検出され、どれが検出されなかったかに依存して行うことが可能である。例えば、流動経路に沿った特定の位置での標的被検体の捕捉は、その流動経路に沿った流れを妨げることがあり、それを用いて、標的被検体の存在を検出し、論理的な仕方で系内の流動を向け直すことが可能であり、この論理的な方法により論理的な連続検出およびそれによる診断が達成可能になる。
【００１３】
本発明のさらなる理解のために、その他のおよびそのさらなる目的とともに、添付図面および詳細な説明に言及する。
【００１４】
１つの観点からは、本発明は一連の物品を提供する。１つの物品は、流動する流体を含むことができるチャネル、およびそのチャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材を含む。当該多孔性部材はコロイド粒子を含む。
【００１５】
もう１つのの態様では、本発明は、流動する流体を含むことができるチャネルと、そのチャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材で、当該多孔性部材が単一分子により分離された少なくとも２つの孔を含むものとを含む物品に関する。このことは、この２つの孔が全境界に渡って単一分子により分離されていることを、必ずしも意味しない。これは、その２つの孔を分離している構造体中の少なくとも１点において、単一分子がその２つの孔を分離しており、またその単一分子の分裂はその２つの孔が１つにすなるであろうことを、意味する。
【００１６】
もう１つの態様において、ある物品は、流動する流体を含むことができるチャネルと、そのチャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材を含み、この多孔性部材は、１ミクロン未満の平均細孔径および流れに対して開かれた面積を少なくとも５０％有する。少なくとも特定の百分率の「流れに対して開かれた面積」とは、多孔性部材によりつながれたチャネルの面積が、（１００−その百分率）％未満、遮断されていることを意味する。
【００１７】
もう１つの観点からは、本発明は、一連の方法を提供する。１つの方法は、多孔性部材に流体を通過させ、流体内の化学的、生物学的、または生化学的物質を多孔性部材に対し固定されたその物質の結合パートナーに結合できるようにすることを含む。この結合は、当該方法に従って決定される。
【００１８】
もう１つの態様において、本発明の方法は、流体流動チャネルを少なくとも一部はつなぐ多孔性部材に対し固定された化学的、生物学的、または生化学的物質の第１の結合パートナーを第２の結合パートナーと置換することを含む。この置換は、チャネルに対する多孔性部材を解体せずに行われる。
【００１９】
本発明のもう１つの方法は、多孔性部材に流体を通させること、および流体内の化学的、生物学的、または生化学的物質を、多孔性部材に対し固定された当該物質の結合パートナーと結合できるようにすることを含む。この化学的、生物学的、または生化学的物質は、次いで多孔性部材から放出される。
【００２０】
もう１つの態様において、ある方法は、第１の化学的、生物学的、または生化学的物質が、第１のコロイド粒子に対して固定されるようになることを可能にすることを含む。第２の化学的、生物学的、または生化学的物質は、第２のコロイド粒子に対して固定されるようになることが可能である。第１および第２の物質の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に少なくとも一部は基づき、第１のコロイド粒子は第１の流体チャネルに向けられ、そして第２のコロイド粒子は第２の流体チャネルへ向けられる。
【００２１】
本発明のもう１つの方法は、化学的、生物学的、または生化学的物質をコロイド粒子に対して固定化することを可能にすること、および当該物質の少なくとも１つの正体を決定することを含む。当該正体に少なくとも一部は基づいて、当該コロイド粒子は、第２の流体チャネルよりも第１の流体チャネルに向けられる。各チャネルは、進路指示ステップの前に当該コロイド粒子を受取ることが可能である。本発明のもう１つの方法は、化学的、生物学的、または生化学的物質をコロイド粒子に対して固定化することを可能にすること、第１の検出位置で当該物質の少なくとも１つの正体を決定すること、そして第２の検出場所で当該物質の少なくとも１つの正体を決定することを含む。
【００２２】
本発明のもう１つの方法は、初めにその物質を含む流体の流動経路（そこでは当該流体は複数の流動経路の選択肢を有する）を決定することにより、化学的、生物学的、または生化学的物質の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定することを含む。
【００２３】
本出願中の上記または他の場所に記載されている本発明の観点または態様の何れかに関連して、部材または方法ステップに関する以下の特徴は、これらの成分または方法ステップがこれらの観点または態様に含まれる範囲内で、適用可能である。チャネルが含まれる場合、チャネルは、約１０００ミクロン未満、または他の態様では約５００、３００、１００または５０ミクロン未満の断面寸法を有することが可能である。多孔性部材がチャネルをつなぐ場合、それはチャネルの一部をつないでもよく、チャネルを完全につないでもよい。多孔性部材がチャネルを部分的につなぐ場合、チャネル通って流れる流体のいくつかは、多孔性部材を通って流れるであろうが、別の流体は多孔性部材の脇を通過し、多孔性部材を通って流れないこともある。多孔性部材がチャネルを完全につなぐ場合、チャネル内を流れるすべての流体は多孔性部材を通過するにちがいなく、すなわち、その液体はチャネル内の多孔性部材をバイパスできない。
【００２４】
本発明の多孔性部材は、０．５ミクロン未満または、他の態様では、０．２ミクロン未満、１００ナノメートル未満、５０ナノメートル未満、１０ナノメートル未満、または５ナノメートル未満の平均細孔径を有することが可能である。
【００２５】
多孔性部材は、分子種と相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含んでもよい。分子種は、親和性標識／認識構成要素ペアを介してコロイド粒子にしっかりつながれてもよい。いくつかの態様では、少なくともいくつかのコロイド粒子は連結を介して他のコロイド粒子と相互連結されており、この連結においては、連結中の少なくとも一点で単一分子が含まれる。このことは、コロイド粒子間の連結はさまざまな場所で１つまたは複数の分子を含んでもよいが、少なくとも連結の一点では連結は単一分子のみであり、そしてその単一分子の破断によってコロイド粒子を分離することを、意味する。いくつかの態様では、チャネルを完全につなぐ多孔性部材の全体は、連結を介して他のコロイド粒子と相互連結されているコロイド粒子からできており、この連結のすべてが、少なくとも連結中の一点において単一分子を含む。コロイド粒子は、合成ポリマー、または天然にあるポリマー（ペプチドのような）および好ましくはオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーである分子を介して、相互連結されていてもよい。
【００２６】
本発明の多孔性部材は、さまざまな態様において、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の開放面積を有することが可能である。
【００２７】
チャネルは当業者に知られている本質的に任意のチャネルにより定義可能である。例えば、基質中に形成された溝によりチャネルを定義することも可能であり、またはチャネルは完全に閉鎖されてもよい。すなわちそれは、入口および出口を有する伸張された閉鎖構造であってもよい。
【００２８】
本発明のいくつかの方法は、化学的、生物学的、または生化学的物質と、その結合パートナーとの結合を決定することを含む。この結合は、いくつかの態様では定性的に、他の態様では定量的に決定可能である。本明細書で使用される「定性的に」および「定量的に」は、当該技術における普通の意味が与えられる。「定性的に」とは、１以上の物質が存在する（例えば、結合した）かどうかを決定することを意味する。「定量的に」とは、物質の量（例えば、結合した物質）を決定することを意味する。
【００２９】
１つの実施態様においては、流体が主流に沿って流れ、当該流体の全部ではなく一部が、主流から分析流へと向けられる。この分析流では、化学的、生物学的、または生化学的物質とその結合パートナーとの間の結合について、決定がなされる。この決定を使用することができ、主チャネル中の流体の流れに影響を与える。例えば、病原体を除去することが望ましい公共用給水において、多孔性部材上に固定された病原体の結合パートナーを提供することにより、当該病原体が存在するかどうかを決定するために、分析流を主水流から分岐し、連続的にモニターすることも可能である。もし病原体が存在し、病原体が多孔性部材に結合する場合、多孔性部材が部分的にまたは完全に遮断され、多孔性部材にかかる流体の差圧が変化する。これは、主要流体流を減少または停止するのに使われるシグナルとして、検出可能である。
【００３０】
いくつかの態様において、化学的、生物学的、または生化学的物質は、多孔性部材のところで結合することが可能で、そしてそれによって、多孔性部材のところに集められる。当該物質はしばらくして所望の箇所で解放され、そして下流で検出される。このようにして、多孔性部材が使用されて、物質を長時間集め、次いで当該物質を一度に（またはそれが集められる間の時間よりも少なくとも短い時間の間に）放出される。これによって、物質を長時間にわたり濃縮し、濃縮された物質を放出し、そしてそれを検出することにより、非常に低濃度の物質の非常に鋭敏な検出が可能になる。
【００３１】
本発明の他の長所、新規な特徴、および目的は、添付の図面（概略的であり、そして案分比例で描くようには意図されていない）をともに考慮すれば、以下の本発明の詳細な説明によって明らかになるだろう。図の中では、さまざまな図で図解されている同一の、または実質的に同様な各部分は、単一の数字または記号により表示されている。平明さを目的とするため、当業者が本発明を理解するのに図解が必要ない場合には、必ずしもすべての成分がすべての図で標号されているわけではなく、また本発明の各実施態様のすべての成分が必ずしも示されているわけではない。
【００３２】
詳細な説明
定義：
本明細書で用いられる「低分子」とは、５キロダルトン以下、より典型的には１キロダルトン以下の分子を意味する。本明細書で使われる場合、「低分子」はタンパク質を除外する。
【００３３】
本明細書で用いられる「候補薬剤」という用語は、ヒト、動物、または植物に使われる任意の医療用物質を指す。この定義には、化合物類似体、天然に存在する、合成の、および組換え体の、医薬品、ホルモン、抗微生物剤、神経伝達物質などが含まれる。これには、任意の物質または前駆体（天然に存在するか、合成されたか、または組換え体であるかを問わない）が含まれ、これらの物質または前駆体は、異常な凝集により特徴づけられる神経変性疾患または他の疾患の治療または予防のための薬剤としての使用が評価されるものである。評価は、典型的には、本発明のスクリーニング検査のような検査における活性を通じて行われる。
【００３４】
様々な種類の粒子が本発明において使用可能である。例えば、本発明の範囲内で利用される粒子として、以下のものの１以上を含んでもよい：本発明の目的のために使われる流体（典型的には水溶液）中においてそれ自身で懸濁状態を保つようにできる粒子、あるいは磁場、電磁場、撹拌（かき混ぜ、震盪、振動、超音波処理、遠心分離、渦動、または類似のもの）をかけることにより、溶液中において懸濁状態を維持可能な粒子を意味する「流体懸濁可能粒子」；磁場をかけることによって流体中に懸濁状態を維持することが可能な「磁気的に懸濁可能な」粒子；電磁場をかけることにより流体中に懸濁状態を維持することが可能な電磁気的に懸濁可能な粒子（例えば、電荷を有する粒子、または電荷を有するように修飾された粒子）；例えば磁場の援助なしに、少なくとも１時間、でそれが使われる流体（典型的には水溶液）中で懸濁状態のままであるほどに、サイズおよび／または質量が十分小さい粒子である「自己懸濁可能粒子」。他の自己懸濁可能粒子は、本発明に従って、援助なしに、５時間、１日、１週間、または１ヵ月間も、懸濁状態のままであろう。
【００３５】
「タンパク質」および「ペプチド」は、この技術分野においては周知の用語でり、そして各々が含むアミノ酸の数に関して技術分野では正確には定義されない。本明細書で使われる場合、これらの用語には、その技術分野における通常の意味が与えられる。一般的に、ペプチドは、長さ約１００のアミノ酸未満のアミノ酸配列であるが、３００アミノ酸までの配列を含んでもよい。タンパク質は、少なくとも１００アミノ酸の分子であると、一般には考えられている。
【００３６】
本明細書で用いられる「金属結合タグ（標識）」は、キレートにより配位されている金属につながられ得る分子の一群を指す。そのような分子の適当な群としては、アミノ酸配列があり、典型的には約２〜約１０のアミノ酸残基を含む。これらは、複数のヒスチジンおよび複数のシステイン（「ポリアミノ酸タグ」）を含むが、これに限定されるものではない。そうした結合タグは、それらがヒスチジンを含む場合、「ポリヒスチジン・トラクト（管）」または「ヒスチジンタグ」または「ＨＩＳ・タグ」と呼称されることがあり、そしてペプチドまたはタンパク質または核酸のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか、または任意の露出領域に存在してもよい。６〜１０残基のポリヒスチジントラクトが、本発明における使用には好ましい。また、当該ポリヒスチジントラクトは、関心のあるタンパク質に添加された多数の連続ヒスチジン残基であるとして機能的に定義され、それによって、金属キレートカラム上での当該生成タンパク質のアフィニティー精製、またはもう１つの分子（例えば、ＨＩＳ・タグと反応性の抗体）との相互作用によるタンパク質末端の同定が可能になる。以下における特定タイプの金属結合タグ（例えばヒスチジンタグ）の引例は、単に模範的なものであり、このようなタグとして、上記の金属結合タグのどれをも含んでよいが、それらは互換的なものであると理解すべきである。
【００３７】
「アフィニティータグ」には、技術分野における通常の意味が与えられる。アフィニティータグは、例えば、金属結合タグ、ＧＳＴ（ＧＳＴ／グルタチオン結合クリップにおけるＧＳＴ）、およびストレプトアビジン（ビオチン／ストレプトアビジン結合におけるストレプトアビジン）を含む。本明細書のさまざまな箇所で、特定のアフィニティータグが、相補的認識構成要素ペア（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｎｔｉｔｙ ｐａｉｒｓ）との結合相互作用との関連で、記載されている。アフィニティータグを用いるいかなる実施態様においても、本発明は、本明細書に記載のいかなるアフィニティータグから選択したものを含む一連の個々の態様を含むものと理解されるべきである。
【００３８】
本明細書で使われる「金属を配位するキレート」またはキレートにより配位された金属とは、キレート剤により配位された金属を指し、これは当該金属上の利用可能な配位部位のすべてが充たされておらず、金属結合タグによる結合のために利用可能ないくつかの配位部位を残されている。参照により本明細書に含まれるものとされるＢａｍｄａｄらの米国特許第５６２０８５０号は、典型的な金属結合タグ／キレート結合を記載している。
【００３９】
「シグナル伝達構成要素」とは、特定の試料中または特定の場所でその存在を示すことができる構成要素を指す。本発明のシグナル伝達構成要素は、ヒトの肉眼により同定可能であるもの、個別には目に見えないが、もし十分な量あればヒトの肉眼により検出可能と思われるもの（例えば、コロイド粒子）、可視的に（肉眼で、または電子顕微鏡または類似物を含む顕微鏡で）または分光法的に、容易に検出できるようなレベルまたは波長範囲内で電磁放射線を吸収または放出する構成要素、適切な活性化エネルギーに曝露すると特徴的な酸化／還元パターンを示すレドックス活性分子のような、電子的にまたは電気化学的に検出可能な構成要素（「電子シグナル伝達構成要素」）、またはこれに類するものであってもよい。例えば、染料、色素、レドックス活性分子のような電気活性分子、蛍光成分（定義によりリン光成分を含む）、上方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）リン光体、化学発光体、電気化学発光体、または西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素結合シグナル伝達成分を含む。「シグナル伝達構成要素の前駆体」とは、単独ではシグナル伝達能力をもたないが、もう１つの分子種との化学的、電気化学的、電気的、磁気的、または物理的相互作用により、シグナル伝達構成要素になり得る構成要素である。例えば、もう１つの分子と化学的相互作用するときだけ、特定の検出可能波長内の放射線を放出する能力を有する発色団が含まれる。シグナル伝達構成要素の前駆体は、本明細書で使われる場合、「シグナル伝達構成要素」と区別可能であるが、その定義内に含まれる。
【００４０】
もう１つの分子種に対して、またはある物品の表面に対してある分子種が「に固着される、または固着されるように適応される」または「に付着される、または付着されるように適応される」とは、本明細書で使われる場合、共有付着、特定の生体結合（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を介した付着、キレート／金属結合のような配位結合、または類似のものによって、分子種が化学的または生化学的に連結されることを意味する。例えば、この文脈における「固着される」または「付着される」とは、複数の化学的連結、複数の化学的／生物学的連結などを含み、ポリスチレンビーズの上に合成されたペプチドのような結合分子種、ビーズに共有的に付着するプロテインＡのようなタンパク質に結合する抗体に特異的に生体的に共役する結合分子種、ある表面に共有的に固着された結合パートナー（例えば、ＧＳＴの場合はグルタチオン）に今度は特異的に生体的に結合するＧＳＴまたはファージのような分子の一部を（遺伝子工学によって）形成する結合分子種などを含むが、これに限定されるものではない。もう１つの例として、チオールに共有的に結合された成分は、チオールが金に共有的に結合するため、金表面に取り入れられ固着する。同様に、金属結合タグを有する分子種は表面に取り入れられて固着されるが、その表面は、その表面分子も金属を配位するキレートを有しているような（チオール／金結合のような）表面に共有的に付着された分子を有する。ある表面が特定のヌクレオチド配列を有し、そしてある分子種が相補的ヌクレオチド配列を有するならば、分子種は表面に取り入れられ固着される。
【００４１】
「共有的に固着される」とは、１つ以上の共有結合そのものを介して固着されることを意味する。例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳの親和力を介して金表面に固着されている、カルボキシレートを示すアルキルチオールに共有的に共役されている分子種は、その表面に共有的に固着されている。
【００４２】
本明細書で用いられる「非特異的結合」とは、生化学分野での通常の意味が与えられる。
【００４３】
本明細書で用いられる「コロイド」とは、ナノ粒子（すなわち、非常に小さな自己懸濁性または流体懸濁性粒子）を意味し、例えば、無機または有機質、ポリマー性、セラミック、半導体性、金属性（例えば、金）、非金属性、結晶性、非晶質、またはこれらの組み合わせである材料からできているものが含まれる。本発明に従って使われるコロイド粒子は、典型的にはどの方向の断面も２５０ｎｍ未満、より典型的にはどの方向の断面も１００ｎｍ未満、そして大部分の場合約２〜３０ｎｍの断面である。本発明での使用に適しているコロイドの一群は、断面が１０〜３０ｎｍであり、そしてもう１つの一群は、断面が約２〜１０ｎｍである。本明細書で使われる場合、この用語は生化学の分野で普通に使われる定義を含む。
【００４４】
「試料」という用語は、生物学的ソースからの任意の細胞、組織、または体液（「生物学的試料」）、または生物学的または非生物学的な任意の媒体からの任意の細胞、組織、または体液を指し、これらは本発明に従って有利に評価され、人間の患者から得られる生体試料、動物から得られる試料、人間が消費するように設計された食物から得られる試料、家畜飼料のような動物食品用に設計された食物を含む試料、ミルク、臓器提供試料、血液供給用に予定された血液の試料、給水からの試料、またはこれらの類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。試料の１例として、薬剤の効力を決定するために候補薬剤に与えられるヒトまたは動物から得られる試料がある。
【００４５】
ある特定の成分を「含むと疑われる試料」とは、当該成分の含量が不明である試料を意味する。例えば、神経変性疾患または非神経変性疾患のような疾患を有すると疑われるが、当該疾患を有するとはわかっていないヒトからの体液試料は、神経変性疾患凝集体形成分子種を含むと疑われる試料と定義する。この文脈における「試料」とは、自然に生じる試料（例えば、ヒトまたは他の動物からの生理的試料、食物、家畜飼料などからの試料）、および「構造的に決定された試料」を含み、構造的に決定された試料とは、その化学的もしくは生物学的配列または構造が予め決定された構造であり、その構造が、神経変性疾患のような特定のプロセスと関連するかどうかを試験するための検査において用いられるものである試料を意味するように本明細書で定義される。例えば、「構造的に決定された試料」には、ペプチド配列、ファージディスプレイライブラリー中のランダムペプチド配列、およびその類似物が含まれる。ヒトまたは他の動物から採取された典型的な試料には、細胞、血液、尿、眼液、唾液、脳脊髄液、扁桃、リンパ節、針生検などからの体液または他の試料が含まれる。
【００４６】
本明細書で用いられる「分子ワイヤー」とは、ＳＡＭコート電極に遭遇する流体が当該電極と電気的に伝達する能力を高めるワイヤーを意味する。これは、導電性分子または、上述のおよび以下にさらに十分に例示するように、当該電極との伝達を可能にするＳＡＭ中にデフェクト（欠陥、傷）を起すこともあり得る分子を含む。分子ワイヤーのさらなる例示として、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトベンゾチアゾール、ジチオスレイトール、１，２−ベンゼンジチオール、１，２−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼンエタンチオール、および２−メルカプトエチルエーテルを含むが、これに限定されるものではない。単分子層の導電性は、電極平面の導電性を促進する分子の添加により高めることも可能である。導電性ＳＡＭｓは、１）硫黄が末端のポリ（エチニルフェニル）鎖；２）ベンゼン環が末端のアルキルチオール；３）ＤＮＡ塩基が末端のアルキルチオール；４）単分子層中へ充填されにくい任意の硫黄末端分子種；５）上記のすべてに、非特異的吸着を阻止するためのエチレングリコールユニットまたはメチル基のいずれかが末端のアルキルチオールスペーサー分子をプラスまたはマイナスしたものから構成されてもよいが、これに限定されるものではない。金に対する親和性のために、チオール類がＳＡＭの容易な形成において記載される。米国特許第５６２０８２０号および他の参考文献から当該技術分野で知られているように、他の分子をチオール類に代替することが可能である。分子ワイヤーは典型的には、それらのバルクまたは他の構造のために、ＳＡＭがさらされている流体に対する表面をＳＡＭが厳しく密閉することを防ぐために、比較的厳しく充填されたＳＡＭに傷をつくる。当該分子ワイヤーは、厳しく充填された自己集合構造体の破裂を生じ、それは、当該表面と電気的に通信するために、当該表面が流体にさらされることを可能にする傷となる。この状況において、当該流体は、トンネルの様にに孔をあけるか、類似のものによって、電子伝達が起こり得る表面に接触するか、当該表面に十分接近することにより、当該表面と電気的に伝達する。
【００４７】
「生物学的結合」という用語は、分子ペア間の相互作用を指し、この相互作用は相互の親和性または結合能力を示し、典型的には、生化学的、生理学的、および／または薬学的相互作用を含む、特異的または非特異的な結合または相互作用である。生物学的結合は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンおよびその類似物を含む分子のペア間に生じる相互作用の１類型である。具体例としては、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害物質、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、担体タンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸の相補鎖、タンパク質／核酸リプレッサー／インデューサー、リガンド／細胞表面受容体、ウリルス／リガンドなどが含まれる。
【００４８】
「結合パートナー」という用語は、特定の分子と結合することが可能な分子を指す。生物学的結合パートナーも、その一例である。例えば、プロテインＡは生体分子ＩｇＧの結合パートナーであり、そして逆も同じである。
【００４９】
「決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」と言う用語は、例えば、分光分析法、偏光解析法、圧電測定、イムノアッセイ、電気化学測定、および類似のものによる、ある分子種の定量的または定性的分析を指す。また、「決定すること」とは、分子種間の相互作用を検出することまたは定量すること、例えば、２つの分子種間の結合を検出することも意味する。
【００５０】
「自己集合単分子層」（ＳＡＭ）とは、表面上に自然に化学吸着された分子の比較的規則正しい集合であって、当該分子が相互にほぼ平行に、そして当該表面に概ね垂直に配向されているものを指す。当該分子の各々は、当該表面に接着する官能基、および当該単分子層中の隣接分子と相互作用する部分とを含み、比較的規則正しい配列を形成する。いずれも参照により本明細書に含められたものとされる、Ｌａｉｂｉｎｉｓ，Ｐ．Ｅ．；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｊ．；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５，８４５（１９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｅｖａｌｌ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１５５・７１６４（１９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１６４・７１７５（１９８９）を参照されたい。
【００５１】
「自己集合混合単分子層」という用語は、不均質な自己集合単分子層、すなわち、少なくとも２つの異なる分子の比較的規則正しい集合からできているものを指す。
【００５２】
「中断」または「中断する」という用語は、流動チャネルを通る流れに関して用いられる場合、流動チャネルを通る流れに対する抵抗の何らかの増加を指し、この抵抗の増加は、流体の流動に対して開かれた流動チャネルの断面積の分画の減少によるものであり、この減少は、例えば、流動チャネル内の少なくとも一部におけるナノ構造体またはナノネットの存在、またはその形状の変化により生じるものであって、これは、当該流動チャネルの有効直径を減少させるものである。
【００５３】
「有効直径」という用語は、上述の文脈でで用いられる場合、流体の流れに完全に開かれた断面を有し、そして、そこにおいて制限を有する流動チャネルの抵抗に本質的に等しい流体流動に対する抵抗、例えば、当該流動チャネルを通る流れの中断を起すナノネットを備える仮想の流動チャネルであって、そしてそこでの仮想の流動チャネルが、現実の制限流動チャネルのものと実質的に同様な全体的断面形を有する、前記仮想流動チャネルの断面直径を指す。
【００５４】
本発明の１つの側面において、三次元生体特異的マトリックスを、流動チャネルを横切って、粒子および相互連結ポリマー（例えば、天然および／または合成ポリマー）から自己集合させ、チップスケールデバイス中で試料調製、および／または標的被検体の濃縮および検出を実施するのに使用する。当該粒子は、好ましくは、ポリマーネットワークを形成するために、当該ポリマーにそれらの付着を容易にする成分を有する。もう１つの実施態様で、当該粒子は、例えば、標的物質に生物学的に結合することによって、当該標的物質を捕捉するプローブリガンドを有することも可能である。上記のように、形成された相互連結ポリマー／粒子ネットワークは、生じるナノ構造体を定め、それらの構造体は、超低圧力低下フィルター、標的被検体濃縮器、インシトゥ生体検出器として、あるいはさまざまな他の目的のために使用可能である。これらの構造体は、いくつかの態様では、論理的なまたは再構成可能なバルブとして作動するように、チャネル通る流れを阻止または遮断するためにも使用可能である。
【００５５】
図１は、機能化されたナノ粒子１０６へ付着しそして相互連結しているポリマー１０４のセグメントより成るナノ構造体を含む自己集合多孔性部材を、その中に含み、そしてその断面をつなぐ、流動チャネル１００を示す概略図である。当該ナノ構造体の末梢におけるいくつかのポリマー鎖、例えば、１０８は、末端終点、例えば、１１０を有し、それは、例えば、当該流動チャネルの表面１１２上の１つまたは１つより多い官能基との相互作用を経て、流動チャネル１００の内部１１２に付着している。図１に示すように、本発明のナノ構造体すなわちナノネットを含む前記多孔性部材の多くの特徴は、当該ナノ粒子が、当該連結の長さ沿いの少なくとも１点で、単一分子（例えば、単一バイオポリマーまたは合成ポリマー鎖）のみを含む、一連の個々の連結（例えば１０４）を経て互いに相互連結していることである。さらに、ナノ構造体すなわちナノネットを含む本発明的多孔性部材は、２つの隣接する孔、例えば、図１の孔１０３および１０５、を含むことも可能で、それらは、僅か単一分子、例えば、１０４、の幅で隔てられている。
【００５６】
１つの態様では、当該粒子はナノ粒子および／または自己懸濁性粒子であり、そして当該ポリマーはバイオポリマー（例えば、タンパク質またはペプチド、多糖、および／または核酸）であり、そして当該粒子およびバイオポリマー／流動チャネル表面を連結する当該付着は生物学的結合により仲介されている。ある好ましい態様では、当該ナノ粒子はコロイドで、そして当該バイオポリマーはＤＮＡである。特に好ましい態様では、自己集合単分子層（ＳＡＭｓ）で誘導化されている金コロイドは、当該コロイド上および当該流動チャネルの内部表面上に示された成分に対する結合パートナーを提示するＤＮＡの鎖により連結されている。コロイド上のそうした成分とＤＮＡ上の結合パートナーとの間の相互作用は、可逆的にもあるいは不可逆的にも設計可能である。結合の機構は、ＤＮＡ・ＤＮＡハイブリッド形成、他の生物学的結合、または化学的共役でもよい（図６および付随の説明でより詳細に下記で論考する）。可逆的結合機構は、当該ナノ構造体の再構成を可能にする。例えば、当該ナノ構造体を支持している相互作用を解放するために、ＤＮＡ・ＤＮＡ相互作用は、当該ＤＮＡを加熱水にさらすことにより分裂可能である。タンパク質・タンパク質生物学的結合を利用する態様の場合、そのような結合相互作用は、例えば、尿素または界面活性剤のような化学薬品の導入により、あるいはｐＨの変化を経て、解放可能である。適切な条件および分裂剤は、例えば、そこに固定化されているすべての物質を解放するように当該ナノ構造体の完全崩壊を可能にするために、例えば下流分析または検出のために、再構成および／または結合相互作用の解放を果すように、または、他の態様で、当該ナノ構造体を形成しているネットワークを解体せずに、当該ナノ構造体に固定化された第１結合パートナーを第２結合パートナーと置換するように、または被検体の下流決定のために、当該ナノ構造体を形成しているネットワークを解体せずに、当該ナノ構造体に固定化されている結合パートナーから当該被検体を解放するように、など、容易に選択可能である。
【００５７】
本発明のいくつかの実施態様は、コロイド粒子の表面のような、表面上の自己集合単分子層（ＳＡＭｓ）、およびＳＡＭｓでコートされた表面を有するコロイド粒子のような物品を、利用する。一組の好ましい態様では、合成分子で完全に形成されたＳＡＭｓは、ある表面またはある表面のある領域を完全に覆う、例えば、コロイド粒子の表面を完全に覆う。この関係での「合成分子」は、、天然には存在しない分子であって、むしろ、人工的に考えられまたは人工的に合成されたまたは人間による指令の制御の下に合成されたものを意味する。この関係での「完全に覆う」は、ＳＡＭによる完全で直接の被覆を妨げるタンパク質、抗体、または他の分子種と直接接触する表面または領域の部分がないことを意味する。すなわち、当該表面または領域は、その全体を横切って、天然に存在しない分子（すなわち、合成分子）から完全に構成されるＳＡＭを含む。当該ＳＡＭは、表面で最密充填ＳＡＭｓを形成するＳＡＭ形成分子種、当該ＳＡＭを通じて電子通信を促進できる分子ワイヤーまたは他の分子種（ＳＡＭに参加できる傷促進分子種を含め）と組合わせたこれらの分子種、ＳＡＭに参加できる他の分子種、およびこれらの任意の組合わせから完全に作られることも可能である。好ましくは、当該ＳＡＭに参加する分子種のすべては、金表面に共有的に結合するはずのチオールのような、当該表面に、選択的に共有的に結合する官能基を含む。ある表面上の自己集合単分子層は、本発明に従って、本質的に任意の化学的または生物学的官能基を提示（露出）可能な分子種（例えば、金が当該表面の場合、チオール分子種）の混合物から構成されてもよい。例えば、非特異的吸着に抵抗するためトリエチレングリコール末端分子種（例えば、トリエチレングリコール末端チオール類）、およびアフィニティータグの結合パートナーが末端の、例えば、ニッケル原子と複合した場合ヒスチジン標識結合分子種を捕捉するニトリロ三酢酸のように金属を配位できるキレートが末端の、他の分子種（例えば、チオール類）を含むことも可能である。これらの配置は、本発明のさまざまな実施態様に使用可能である。例として、コロイド上または別の表面上に形成されるかを問わず、自己集合単分子層は、非特異的吸着に抵抗するためトリエチレングリコール末端チオール類を含むチオール分子種（金が当該表面の場合）および例えば、ニッケル原子と複合した場合ヒスチジン標識結合分子種を捕捉するニトリロ三酢酸のように金属を配位できるキレートが末端の、アフィニティータグの結合パートナーが末端のチオール類との混合物で構成されてもよい。本発明は、いくつかの態様において、コロイド表面に提示された本質的に任意の化学的または生物学的分子種の濃度を厳密に制御するための、例えば、本発明に従ってさまざまな三次元ナノ構造体を形成するための、方法を提供する。
【００５８】
本発明の１つの側面で、三次元構造体は、流動チャネルにわたってインシトゥ（原位置で）形成される。本発明は、マイクロおよびナノ流動チャネルにわたって部分的に、そして好ましくは完全につなぐナノ構造体の形成に特によく適している（例えば、約１ｍｍを超えない、他の態様では約５００μｍを超えない、他の態様では約３００μｍを超えない、なお他の態様では約１００μｍを超えない、他の態様では約５０μｍを超えない、他の態様では２０μｍを超えない、他の態様では約１０μｍを超えない、他の態様では約５μｍを超えない、そしてなお他の態様では約１μｍを超えない、少なくとも１つの断面寸法を有するもの）。インシトゥ組立ては、一般的密封センサー内の流動チャネルの改造を可能にする。一般的ナノ構造体は、特定の標的物質または病原体の検出のためのような特定の使用に特異的にするために、流動チャネル内で組立て、次いでインシトゥ改造可能である。図２に図示するように、例えば、流動チャネル中のナノ構造体内でコロイド２０４を提示するＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）２０２にヒスチジン標識プロテインＡまたはＧ２００を付着させ、次いで特定の標的物質に結合パートナーを提示する抗体２０６を含む当該チャネルを通して試料を流すことにより、これは達成可能である。当該抗体は、次いでプロテインＡまたはＧ２００に結合し、かくして当該標的物質の捕捉に特異的なナノネットをつくることになる。
【００５９】
大部分の既成のセンサーは「専用の」検知能力を有する；すなわち、１つのセンサー技術は標的ＤＮＡを検出可能であるのに対し、もう１つは標的タンパク質を検出する、などである。本発明のいくつかの態様に従って提供される方法は、アレイフォーマットで並行にさまざまな異なる標的物質の同時検出を可能にする。これらの標的物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、全細胞などを含むことも可能である。インシトゥ組立てまたは改造は、流動チャネル内でナノネットの解体および再構成を可能にする。前成形コロイドおよび、標的物質に対する、抗体のような、認識エレメントの個別の在庫品を含むキットは、一般的センサーでの使用のために前包装可能で、それはそれらのセンサーを特定の検定用の特注品に容易に仕向けることになる。あるいは、前成形ＳＡＭコート粒子またはコロイドを、一般的密封センサー中に予め組立てられたナノネット中に懸濁することも可能である。標的被検体または病原体の識別子（例えば、結合パートナー）で、当該ナノネットをインシトゥで特注化するには、当該コロイドに結合するように修飾または形成も可能な所望のプローブリガンドであって、そのリガンドが、例えば、抗体であってもよい前記プローブリガンドを含む前包装溶液を、当該センサーに注入するだけでよい。
【００６０】
本発明に従い提供されるナノ構造体は、金または金コート基質、シリコン、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）または広く多様な他のポリマー性材料を、非限定的に、含む広く多様な材料から構築されたチャネル中に形成および／または付着させることも可能である。当該ナノ構造体は、直接的または間接的結合または共役を経て当該チャネル表面に付着させることも可能である。好ましい態様では、当該ナノ構造体は、当該ナノ構造体を含む前記ポリマーおよび／またはコロイドに付着された成分の結合パートナーを有するＳＡＭでコートされた基質へ付着する。
【００６１】
本発明のもう１つの側面では、ナノ構造体は、同じセンサー内で、複数の流動チャネルを横切って形成されてもよく、そして単一試料について並行してさまざまな検定を実施するために、異なる空間的場所に差動的に修飾されてもよい。被疑標的を複数のＤＮＡ，タンパク質および細胞決定基を同時に分析することにより同定する能力は、検出の精度および／または融通性を、例えば、桁違いに高めることもあり得る。好ましい態様では、マイクロセンサーまたは微小流体ネットワークの異なる流動チャネル中に位置するコロイドは、いくつかのマーカーを同時検出することにより特定標的の同定を可能にするために、特定のＤＮＡサイン、タンパク質識別子、および／または細胞または胞子特異的マーカーなどに対する結合パートナーで誘導体化される。あるいは、多重チャネルセンサーの各流動チャネルは、並行して複数の試料について同じ分析を実施するように、修飾することも可能である。
【００６２】
いくつかの態様では、当該ナノ構造体は、試料調製のために役立つフィルターとして機能することも可能で、そうしたナノ構造体は、バイオアッセイを妨害する恐れがある、過剰で無関係な生体物質および何らかの細胞残渣を排除可能である。当該フィルターの有効孔サイズは、（１）当該相互連結ポリマー鎖の長さ；および（２）当該粒子のサイズ、約２ｎｍないし約２００ｎｍ直径のサイズ範囲のものが一般に好ましい、：を変えることにより異なるサイズ範囲の残渣を排除するように調節することも可能である。
【００６３】
当該ナノ構造体はまた、当該構造体の粒子が、標的物質を含むと疑われる試料の標的物質に結合する結合パートナーを提示する場合、濃縮器として機能することも可能である。このようにして、検出デバイスの感度は、下流決定／検出のための適切な溶離剤または処理（例えば、化学溶離剤、ｐＨ変化、温度変化などに曝露）を経る、被検体の放出の前に、当該標的被検体を前濃縮することにより改善も可能である。本発明の本側面は、無関係なバックグラウンド材料から標的物質を分離するのにも使用可能である。標的物質を濃縮するために、当該ナノ構造体のコロイドまたは粒子は、標的物質または病原体に対する結合パートナーならびに相互連結ポリマーネットワーク（例えば、核酸ウェッブ）への結合を容易にするための成分を提供する抗体または他の物質で、誘導化することも可能である。いくつかの態様では、当該ナノ構造体による被検体の濃縮の程度は、当該ナノ構造体を通る流体流動を可能にし、そして当該被検体の下流決定を可能にするために、当該被検体を放出する前に、（以下に、より詳細に説明するように）当該ナノ構造体を含むチャネル沿いの流体流動が本質的に遮断されるようになる点まで進行することを可能にしてもよい。
【００６４】
図３は、生体特異的濃縮器として構成されたナノ構造体の概略図である。その図解態様では、流動チャネル２５０は、それによりナノネットを形成するポリマー鎖２５６を経て互いに相互連結されているコロイド２５４を含むナノ構造体２５２を、その中に含む。ナノ構造体２５２は、コロイド２５４に固着されたポリマー２５６と、導管２５０の内壁２５８に固着されたポリマー２６０との間の結合相互作用を経て、導管２５０の内壁につなぎ止められている。（複数の）コロイド２５４の少なくとも一部（例えばコロイド２６２）は、図解されているように、濃縮されるのが望まれる被検体、例えば、病原体２６６に対する結合パートナーを含む、そこに固着された抗体分子２６４をさらに含む。チャネル２５０を通る流れの通過に際して、抗体２６４に対して親和性を有する病原体２６６は、当該ナノ構造体に結合しそして固定化されるようになる傾向があり、一方当該流体流中に含まれる他の物質（例えば、２６８）は、当該ナノ構造体を自由に通過することが可能である。
【００６５】
前記記載のナノ構造体は、いくつかの態様では、インシトゥバイオセンサーとしても使用可能で、その１例を図４に図示し、そして以下に説明する。そのようなバイオセンサー３００は、次のように作動するように構成可能である：標的物質２６６がナノ構造体２５２中のコロイド２５４または粒子上の認識基（例えば、抗体２６４）に結合する場合、それらは捕捉され、そしてその有効開放断面積を変えることにより当該チャネルを通る流れを妨げる。次いで、当該ナノネット中の標的物質の捕捉は、当該チャネルを通る流動の中断から生じる、当該フィルターを横切る流速、圧力および／または電気浸透力の変化を検出することにより、検出可能である。例えば、示差圧力モニター３０２で、圧力降下の変化を検出することによる標的の検出は好ましい態様であるが、それは、チャネルを通る流れの所定速度を維持するために必要な圧力は、開放面積チャネルの有効直径の４乗に反比例し、本法を非常に感度の高いものにしているからである。
【００６６】
上記のナノセンサーは、好ましい態様において、極めて少ない電力消費で、流体培地の遠隔、リアルタイム、連続モニタリングを提供可能である。１つの例として、給水を、複数の標的汚染物質または病原体の存在について、連続的にモニターすることも可能である。粒子提示リガンドの標的との相互作用は、当該ナノネットを詰まらせ、そして流動を中断する傾向があり、それは、上述のように、高レベルの感度で検出可能である。当該センサーは、所望があれば、流速または圧力降下のいずれかの測定変化が、汚染された水の配水を停止させるためのストップ・フロー機構の誘発を生じるように、フィード・バックループへ電気的にまたは電子的に組込むことも可能である。
【００６７】
本発明の１つの側面は、一般的なナノ構造体を流動チャネル中に予め形成させ、それから、標的物質を認識するリガンドまたは結合パートナーを提示するために、後から特注するようなモジュラーシステムを提供する。当該認識リガンドは、標的物質に対して特異的な結合パートナーを含む、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよび／または合成分子など、を含んでもよい。
【００６８】
いくつかの態様では、当該ナノネットは、コロイドをＤＮＡの鎖と連結させる（例えば、図６に図解し、以下に説明するように）ことにより形成可能である。例えば、（１）当該ＤＮＡに付着するか、またはその中に含まれる基に結合する成分；（２）標的物質に結合する認識リガンド／結合パートナー；そして好ましくは、また、好ましくは、（３）当該コロイドを非特異的結合に対して抵抗性にする成分：を提示するＳＡＭｓでコロイドを誘導化することにより、これは達成可能である。例えば、ＤＮＡ、ニッケル（ＩＩ）をキレートするニトリロ三酢酸（ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ））およびエチレングリコール基を提示するＳＡＭｓで誘導化されたコロイドは、当該コロイド上に提示されたＤＮＡが、橋をかけているＤＮＡの鎖の末端断片に相補的な場合、三次元構造体へ自己集合可能である。当該ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）基は、当該標的物質を認識するヒスチジン標識タンパク質を捕らえ、そして当該タンパク質を当該標的物質への結合のために提示可能である。エチレングリコール頭部基は、当該コロイドが非特異的結合に抵抗するのを援助する。多数のヒスチジン標識または他の金属結合標識認識リガンドのいずれの１つでも、当該ナノネットの特異性を変えるために、当該コロイドに付着させることも恐らく可能だろう。認識リガンドは、当該ナノ構造体の集合の前または後に、当該コロイドに付着させることも可能である。ＤＮＡ、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）およびエチレングリコール基を提示するＳＡＭｓで誘導化されるコロイドを含み、特定の標的物質の結合パートナー（すなわち、「認識エレメント」）で流動チャネルを横切って予め形成されているナノネットを特注化するには、ヒスチジン標識認識エレメントを含む溶液を当該ナノ構造体を通して流すだけでよい。あるいは、抗体のＦｃ部分に結合するタンパク質Ｇのヒスチジン標識断片を、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）を有するコロイドに付着させてもよい。このようにして、多種多様の標的化物質を捕捉するために、本質的には任意の抗体を、当該ナノ構造体に容易に付着させることも可能である。
【００６９】
別の態様では、プローブリガンドを、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）・ヒスチジン・タグ結合以外の方法により当該コロイドまたは粒子に付着させることも可能である。例えば、アフィニティータグの他の結合パートナーを、アフィニティータグ標識認識エレメントを捕捉そして提示するために、当該コロイドに付着させることも可能である。例えば、グルタチオンを当該コロイドに付着させてもよく、それらはグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を結合可能である。好ましい態様では、当該グルタチオンはチオールに共有的に固着され、それは次いで、金コロイド上に形成される自己集合単分子層へ取込まれる。あるいは、認識エレメントは、コロイドまたは粒子に直接、共有的に固着されることも可能である。例えば、露出したカルボキシ基を有するコロイドは、当該認識エレメントを含むリガンド中の一級アミンにＥＤＣ／ＮＨＳ親和力を経て共役することも可能である。
【００７０】
当該コロイド上の基とのアフィニティータグ相互作用を経て当該コロイドに認識エレメントを付着させることの１つの利点は、その補足された標的が、次いで、下流検出のために、当該ナノネットから便利にも放出可能なことである。例えば、ある粒子上に固定化された、ヒスチジン標識認識エレメントに結合される捕捉標的物質は、当該ヒスチジンタグとＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）に対する結合で競合するイミダゾールの添加により、放出させることが可能である。当該放出に必要なイミダゾールの量は、当該表面に存在するＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）の量に依存し、したがって一定であり、それは、捕捉された標的物質の濃度に無関係である。逆に、もし当該標的物質が、粒子の表面に共有的に固着されている基により捕捉されるならば、その場合、当該標的を放出するのに必要な、ｐＨの変化および類似のもののような、条件は、捕捉された標的の量にに依存し、それは予めわからないことが多い。
【００７１】
粒子および連結ポリマーから成る三次元構造体は、上記のものとは別のさまざまな方法を用いて、流動チャネルを横切って構築可能である。例えば、図５Ａおよび５Ｂ（それらは、相互連結構造の自己集合前（図５Ａ）および後（図５Ｂ）のナノ構造体を含むさまざまな成分を図解する）に図解されているように、ナノ粒子・ＤＮＡナノ構造体３１０も、ストレプトアビジン３１６およびその末端でまたはその近くでビオチン（Ｂ）により修飾されているＤＮＡ３１８とともに、ビオチン３１４を有するナノ粒子３１２を混合することによって、自己集合可能である。ビオチン修飾ＤＮＡの長鎖は、ビオチニル化プライマーを用いる慣用のＰＣＲ技術によって、生成可能である。あるいは、ストレプトアビジンで修飾されたコロイドを、ビオチン修飾ＤＮＡへ直接付着するように結合させてもよい（不掲示）。このタイプのナノ構造体は、その表面にストレプトアビジンを有する流動チャネルに容易に付着させることが可能である。ストレプトアビジンは、チャネル表面に直接付着させても、当該表面上のビオチン基への結合を経て間接的に付着させても、いずれでもよい。上記の間接連結の１つの好ましい態様では、ビオチンを提示するＳＡＭｓは、金コートされたエッチング済みまたは機械仕上げチャネルの１つまたは１つより多い表面上に形成される。
【００７２】
図６に図解されるように、コロイド・ＤＮＡナノ構造体３５０も、ＤＮＡの長いリンカー鎖３５６の末端に相補的なＤＮＡの短鎖３５４でコロイド３５２を誘導体化することにより、形成可能である。コロイド表面に提示されたＤＮＡに相補的な合成ＤＮＡオリゴを経てコロイドを連結するのが簡単であるが、本発明に従って提供されるナノネットの構造エレメントを形成するためには、ＤＮＡのそうした合成片は好ましくない。ＤＮＡオリゴは典型的には、現在利用できる技術を用いて、最長約７０塩基対を超えて合成できない。そのような長さは僅か約２４ｎｍの渡り長に相当するに過ぎず、一方典型的なコロイドの直径は、例えば、約１０〜３０ｎｍのオーダーの可能性がある。そうした短い鎖は、本発明により提供されるナノネットについて好ましい開放面積の程度および有効孔サイズを提供するのに十分長くない。それ故、好ましい態様では、ＤＮＡのより長鎖３５６（数十ないし数百ないし数千の塩基対またはそれ以上）を、細菌プラスミドから酵素的に切出す。ＤＮＡのこれらの片は二本鎖であり、そのため、当該コロイド表面上に提示されたＤＮＡの短鎖３５４にハイブリッド形成するために、前記ヌクレオチドは利用できない。したがって、二本鎖ＤＮＡのこれらの片の、コロイドまたは粒子への付着を容易にするために、短いＤＮＡ「アダプター」３５８を、長い二本鎖ＤＮＡの各末端（例えば、３６０で）上に酵素的に連結する。これらのアダプターは、それらの長さの少なくとも一部にわたって相補的であるが、異なる長さを有する、２片の合成ＤＮＡ３６２，３６４から構築可能である。それらのアダプター３５８は酵素制限部位３６６で酵素的に切断可能で、３６６は当該アダプター中へ一端で操作されており、それは、適当な酵素で消化３６８後に、二本鎖ＤＮＡへ接続するためであり、その二本鎖ＤＮＡは、前記アダプター３５８とハイブリッド形成のために短い一本鎖長３７２を露出するように、一本鎖ＤＮＡの断片を切取るために、酵素によりその両末端３７０で同様に消化されている（プラスミドＤＮＡ中の制限酵素部位は、切除された鎖が均一の長さになるように、既知の技術を用いて容易に選択可能である）。アダプター３５８の別の末端３７４は、コロイド３５２へハイブリッド形成するための一本鎖「尾部」を提示する。このタイプの構造体は、表面固定化ＤＮＡオリゴヌクレオチド３７８へのＤＮＡハイブリッド形成を経て、流動チャネル３７６へ付着可能である。あるいは、当該流動チャネルは、コロイドの最初のセットまたはポリマー鎖の最初のセット上の結合パートナーを認識する基で誘導体化することも可能である。コロイドまたはポリマーのこの最初のセットは、それが当該チャネル表面を当該ナノ構造体へ接続し、一方、それに続く粒子およびポリマーは相互に連結するように、設計することも可能である。上述のＤＮＡ修飾技術は、当業者により十分理解される。
【００７３】
ナノ粒子ポリマーナノネットのインシトゥ構築については、２つの基本的戦略がある。１つは自発的自己集合であり、一方、もう１つは段階的自己集合である。例えば、前者の方法では、ＤＮＡ提示コロイドおよび相互連結ＤＮＡを、適切な比率で大量に混ぜ合わすと、その結果、流動チャネルをつなぐ本質的に完全な、空間的に局在化したナノネットの自発的形成が生じる。これに対して、後者の戦略は、コロイド次いでＤＮＡエレメント（またはその逆）の小部分を段階的に導入し、段階的な仕方で当該ナノネットを秩序正しい集合へ作りあげることにかかわる。
【００７４】
本発明の側面はまた、本発明により提供されるナノ構造体の三次元性質も利用する。分子生物学の当業者は、２つまたはそれ以上の抗体が、標的上の２つの異なるエピトープを認識することにより、標的物質に同時に結合できることを、了解する。異なる標的エピトープを認識する、２つまたはそれ以上の抗体の、離れたコロイド集団上への固定化は、当該ナノ構造体に、流動チャネルの長さに沿った架橋そして凝縮を起させる傾向があり、その際、標的物質または病原体は、流動を減少し、そしてついには、実際に遮断することもあり得る、密着した細網へ当該コロイドの凝集を誘導する。あるいは、または加えて、当該標的およびシグナル伝達構成要素に特異的な第２抗体を有する第２コロイド集団を、当該標的物質または病原体の捕捉後に導入し、インシトゥでまたは下流感知エレメントのいずれかで、当該シグナル伝達エレメントを経て、当該標的を検出できるようにすることも可能である。
【００７５】
基質、例えば流動チャネル表面を、さまざまな仕方で三次元粒子ポリマーナノ構造体の付着を可能にするように、修飾してもよい。好ましい方法では、流動チャネルの表面を金コートし、そしてその上に、当該３Ｄ構造体の付着を容易にするためのリガンドを提示するＳＡＭｓを形成させる。あるいは、非限定的にＰＶＣおよびＰＤＭＳを含む基質を、以下に説明する合成案に従って修飾し、そのようなリガンドに共有的に固着させるか、共役させてもよい。流動チャネルの長さおよび／または断面積の一部内にだけ当該ナノ構造体を空間的に制限するために、さまざまな技術を用いることが可能である。これらは、非限定的に、流動チャネル表面の一領域に反応物を含む溶液を制限する技術、当該全表面に反応物を導入するが、空間的に特別な領域のみを活性化する技術、および当該流動チャネルの空間的に特定の領域上に官能基または単分子層を化学的に加えるためのマイクロスタンピングテクノロジーを用いる技術、を含む。組立てられた三次元ナノ構造体は、当該構造を支えている結合相互作用を分裂させるために、例えば、熱、加熱溶液、ｐＨを変えた溶液、またはホルムアミドような化学溶液を、当該流動チャネルに導入することにより、インシトゥで解体することも可能である。
【００７６】
上述のように、流動チャネル基質は各種の合成ポリマー性材料で構成することも可能で、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリビニルアルコール、カルボキシル化ＰＶＣ、およびポリアリルアミンで、それらはいずれも、当該チャネルへの当該ナノ構造体の付着を容易にする、ＤＮＡ、ビオチン、またはタンパク質成分に容易に共役可能である。例えば、ＰＶＣ表面上へのＤＮＡ断片の付着は、図７Ａに示すスキーム１に図示されており、そして下記中に詳細に記載されている：相間移動触媒または溶媒を用いる懸濁中のポリ塩化ビニル上へのグラフティング（移植）、Ｎｋａｎｓａｈ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｇ．，；Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ中：Ｃａｒｒａｈｅｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．編，Ｐｌｅｎｕｍ，ニューヨーク、１９８３，ｐ．１０９；二元機能性チオール化合物によるＰＶＣ修飾、Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，Ｈ．，Ｍｉｊａｎｇｏｓ，Ｃ．；Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌ．３６，１９９６，１３；可変ポリ（塩化ビニル）ネットワークの合成、Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，Ｈ．，Ｈｉｄａｎｌｇｏ，Ｍ．，Ｍｉｊａｎｇｏｓ，Ｃ．；Ｍａｃｒｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１７，１９９６，１５；医学および関連適用のための耐移動性、血液和合性、可塑化ポリ塩化ビニル、Ｌａｋｓｈｍｉ，Ｓ．，Ｊａｙａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．；Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ ２２（３），１９９８，２２２。上記の戦略は、本および他基質への他の認識基の付着を容易にするように、容易に拡張可能である。ｐ−（ヒドロキシメチル）チオフェノールによる第二級塩化アルキル（１）の求核置換は、選択的に当該チオエーテル（２）を生じる。このプロセスは、溶液中および融成物中ですっきりとそして選択的に進行することが、証明されている（例えば、化学的に修飾されたポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）中のガラス転移温度に対する溶媒の効果、Ｌｏｐｅｚ，Ｄ．Ｍｉｊａｎｇｏｓ，Ｃ．，Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７２，１９９４，１５９を参照されたい）。当該ポリマー表面上のチオエーテル基の密度に直接関係する置換の程度は、実験条件に依存し、そして調節可能である。（２）の生成の条件下ではＰＶＣと反応しない、（２）中のベンジル型水酸基は、適切に保護されたＤＮＡオリゴマー（３）に付着させるのに、ここで使われる。いくつかの付着プロトコールが利用できる。例えば、（３）の５´−スルホン酸塩エステルの求核置換は、その共役産物（４）を与えるはずである（同様な置換反応の例については、亜硝酸陰イオンとの求核置換を経る３´−デオキシ−３´−ニトロチミジンの新しい合成、Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｊ．，Ｒａｇｏｕｚｅｏｓ，Ａ．，Ｒｉｄｅｏｕｔ，Ｊ．Ｌ．；Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．３２，１９９５，６９１；および、新規二環式［２，２，１］リボヌクレオシド類：２´−アミノ−および２´−チオ−ＬＮＡ単量体ヌクレオシド類の合成、Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，１９９８，６０７８を参照されたい）。別の戦略は、（５）のベンジル型スルホン酸塩エステルの、（６）におけるように、当該ＤＮＡ断片のアミンとの求核置換で、（７）を産生することに、かかわるものであろう。（６）のような化合物を調製するのに利用可能ないくつかの５´アミノモディファイヤーは、標準的ＤＮＡ合成技術による使用のために、商業的に入手可能である（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア、米国、から）。
【００７７】
当該ナノ構造体への結合のためのリガンドを当該表面の選択された空間場所に付着させ、一方、当該表面の残りの部分を非特異的結合に対して実質的に無傷に保つための、ポリマー表面調製の１つのプロセスは、図７Ｂ中に図示したスキーム２に模式的に表示する。上記のように、ポリマー表面（１）は、ｐ−（ヒドロキシメチル）チオフェノールで修飾し、（２）を生成させる。当該表面を広げ離した当該水酸基群を、２−ニトロベンジル（ＮＢＺ）のような感光性の保護基でここで保護し、（８）を得る（当該技術のより詳細な説明については、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク、１９９９；および、有機合成における光取外し保護基、Ｐｉｌｌａｉ，Ｖ．Ｎ．Ｒ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８０，１：を参照されたい）。当該ポリマー表面の小領域を、マスクを通して適切な波長の光（ｈν）で照射することにより、選択的に脱保護する；このプロセスは、表面（９）を生成する特定の区域でのみ前記表面水酸基を解放する（光指令の空間的にアドレス可能な化学合成に関する参考文献については：ガラス基質上でのＤＮＡアレイの光指令合成の効率、ＭｃＧａｌｌ，Ｇ．Ｈ．，Ｂａｒｏｎｅ，Ａ．Ｄ．，Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｍ．，Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｇｅｎｔａｌｅｎ，Ｅ．，Ｎｇｏ，Ｎ．，；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，１９９７，５０８１；および、光指令の空間的にアドレス可能な並発化学合成、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｒｅａｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｉｒｒｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｌｕ，Ａ．Ｔ．，Ｓｏｌａｓ，Ｄ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，１９９１，７６７を参照されたい）。それらの遊離水酸基は、（１０）を調製するために上記のようにＤＮＡ断片を付着させるのに、ここで使われる。最後に、当該表面の残りを脱保護し、そして得られる水酸基は、（１１）を形成させるためにエチレングリコールオリゴマーを付着させるのに、用いられる。
【００７８】
もう１つの好ましい態様では、流動チャネルは、当該チャネルに沿って多点検出場所を備えて、形成される。好ましい方法は、さまざまな標的に特異的なさまざまな認識エレメントを提示するシグナル伝達コロイドの数分子種と、当該試料とを混合することである。認識エレメントは、核酸、タンパク質、低分子、プリオン様ペプチド、抗体、または（例えば、フィブリル、プロトフィブリル、または定序ペプチド凝集体を含む）標的分子と相互作用する低分子であってもよい。試料プラグと呼ばれる、試料とコロイドの混合物は、被疑標的の１つに特異的な第２の認識エレメントも宿す、個別の空間的にアドレス可能な場所へ、流動チャネルを通して送られる。
【００７９】
例えば、多点検出場所流動チャネルシステムの最初の実施態様は、図８Ａに図示する。図示されるように、Ａｂ１〜１０と示された抗体を含む一連のプローブリガンドを、当該チャネル表面に直接それぞれを固定化するか、または単一チャネル４００に沿った個別の場所に固定化された離れたナノネット表面に含めてもよい。圧力センサーまたは流速検出器などのような検知エレメント４０２は、プローブリガンドを提示する各個別領域に隣接して位置する。標的物質を含むと疑われる試料を、ＡｂＡ〜Ｊと示される抗体をそれぞれ提示する一組のナノ粒子と混合する。本システムでは、Ａｂ１およびＡｂＡは第１の特定標的病原体上の異なるエピトープをそれぞれ認識し、Ａｂ２およびＡｂＢは第２の標的に対して同様であり、Ａｂ３およびＡｂＣは第３の標的に対して、などである。このようにして、特定チャネル４００を通る圧力低下プロファイルの分析は、指定場所で、さまざまな標的物質のどれが、当該チャネル中に、したがって当該試料中に、存在するかの同定を可能にする。あるいは、単一流動チャネルの長さに沿って位置するＡｂ１〜１０を提示する前記個別の領域の代わりに、Ａｂ１〜１０の各々は、図８Ｂに図示するように、別々の流動チャネル中に固定化し、ＡｂＡ〜Ｊと示される抗体をそれぞれ提示する一組のナノ粒子と混合した当該試料を、各チャネルに沿って流してもよい。各チャネルに沿った圧力または流速の分析は、さまざまな標的物質のどれが、当該試料中に存在するかの同定を可能にする。
【００８０】
あるいは、図９に示すように、上記の両組の抗体を遊離溶液中のナノ粒子上に提示することも可能である。図示された態様では、Ａｂ１〜１０を含むナノ粒子（わかり易いように、Ａｂ１〜３チャネルだけを図示してある）の各々は、流れが第１方向に進行する別々の流動チャネルに向けられる。試料のアリコットをＡｂｓＡ〜Ｊと別々に混合し、そして各々は、第１組のチャネルに直交する別々の流動チャネル（わかり易いように、ＡｂＡ〜Ｃチャネルだけを図示してある）に向けられる。このようにして、流れは、Ａｂ２／ＡｂＢおよびＡｂ３／ＡｂＣのチャネルの交差点で減じ、それは同時に、当該試料中の標的物質を認識し、そして架橋ナノ構造体を形成する。
【００８１】
もう１つの方法は、１つの標的に対して特異的な認識エレメントを宿す場所に当該試料を連続的に向け、そしてその標的の存否の検出に基づいて、当該試料を、論理アルゴリズムに基づく次の場所へ向け直してもよい。あるいは、当該試料は、すべての場所で同時に導入可能で、そして当該場所の問いただしは、決定点での検出結果に基づき、論理アルゴリズムに従って実施する。あるいは、当該分子種の存在は、論理アルゴリズムにより解釈する。当該標的物質の特定の側面、特徴またはエピトープの存在は、１つの場所で検出可能で、そしてこの検出に基づいて、当該試料プラグは次の場所へ向け直され、そこで当該標的物質の異なる側面、特徴またはエピトープが検出されることもある。このようにして、論理的診断薬試験を実施することも可能である。
【００８２】
論理的診断薬試験システムは、本発明に従って、さまざまな仕方で実行可能であるが、例えば、最初の試料プラグを、多くの標的に特異的な認識エレメントを有するシグナル伝達粒子とそれを混合する混合チャンバー中へ導入することも可能である。もう１つの好ましい態様では、当該システムの流動経路を通る流れを、標的物質の結合により中断することも可能である。そうした場合には、検出は圧力測定により行うことも可能で、そしていくつかの態様では、特定の流動経路への流動分岐は、そうしたチャネル中断により達成可能である。この方法は、当該流動の妨害を可能にするために、当該流動経路の一区画内に結合パートナーを固定化することを含んでもよい。当該流動の妨害は、当該障害物を横切るより高い圧力低下および／または流速の減少を生じる。いずれの場合も、当該変化を検出し、そして定量的および定性的決定を行うのに使用可能である。当該試料および粒子混合物は、個別の検知場所で局所認識エレメントを示す流動チャネルの迷路を通るように向けられる。これらの局所認識エレメントは、もしそのような標的物質が当該試料中にあれば、各組からの１つのエレメントが、その特定標的物質に同時に結合し、そしてそれ故、当該流動チャネルを中断するように、粒子固定化されている認識エレメントの当該組に相補的な組を形成するために、構成されてもよい。各検知場所での各測定の結果は、次の測定チャンバーヘ当該連結チャンバーを通る流れを向け直すために、本明細書ではマイクロバルブと呼ぶ、小流体バルブを活性化するのに、コントローラーにより利用されることも可能である。これらの測定結果次第では、当該流動を他のチャンバーなどへ向けてもよい。各チャンバーは単に便宜的な流動経路に過ぎず、当該検定そのものには関与しないことを、留意されたい；しかし各チャンバーは、例えば、圧力、流速などの測定処理能力を提供する。
【００８３】
特に好ましい実施態様では、図１０に図示するように、標的特異的ナノ粒子も選択的に含む当該試料は、流動チャネルの迷路４１０を通るそれ自身の経路へ向けることが可能である。当該試料中に存在する作用物質が、流動経路４１４に沿った個別のスポット４１２で、粒子（存在する場合には）上の認識エレメントおよび／または認識エレメント（類）へ同時に結合する場合には、当該チャネルネットワークのその部分を通る流れを遮断するためのバルブとして働く、ナノネット４１６が形成する。当該試料が当該流動チャネルネットワーク通ってたどった経路を、次いで分析し、当該試料中にどの標的物質類または標的物質の側面が存在したかを決定する。図１０に図示した上記の微小流動技術の論理的流動操作の例は、当該試料および、いくつかの標的分子に特異的なリガンドを提示する多くの生体特異的コロイドを含む、試料混合物を形成することにかかわる。次いで、当該試料混合物を、当該標的分子の１つに対して特異的でもある第２リガンドをそれぞれが宿す場所を通して連続的に流す。例えば、流動経路沿いの第１場所４１２は、「それはウイルス性か？」という質問をしてもよく（すなわち、ナノ構造体４１６は抗ウイルスリガンドを含む）、そこで、もしウイルスが存在し、そして試料／コロイドの結合が生じたとすると、詰まりまたはナノネットの形成および流動の遮断により、流れは第２場所へ向けられる；この場合、当該認識事象は活性化可能マイクロバルブとして働く。次の場所４１８、４１９は、「そのウイルスはインフルエンザに相同性を有するか？」または「それはエボラに相同性を有するか？」と尋ねてもよい。もしそうであれば、次に当該試料は、「何がその薬剤抵抗性か？」および類似の質問を尋ねる場所へ向けられる。図１０に図示する例では、当該試料プラグは、場所４１２で詰まったナノネットを形成して反応する（チャネル４１４を通る流れが無くなる＝「ウイルスあり」）。流れは次に、「ウイルスあり」チャネル４２０に沿って、分岐点４２２の方へ向けられる。当該試料は、場所４１９で抗エボラナノ構造体を詰まらせるが、抗インフルエンザナノ構造体を含む場所４１８を自由に通過し、それ故、当該試料はインフルエンザでなくエボラを含むことを示す。当該試料は、チャネル４２４に沿って分岐場所４２６へ流れ続け、それは抗エボラナノ構造体を含み、遮断されるようになり、それ故、チャネル４２６に沿ってエボラ薬剤スクリーンへ流れを向ける。次いで流れは、チャネル４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、および４３８へ進行するが、各チャネルは、エボラに対する親和性が検討される薬剤候補を提示するナノ構造体を含む。詰まるようになるチャネルは、エボラ標的に対する親和性を有する薬剤候補に相当し、その詰まりの程度が相互作用の程度／親和性に相関する。図示されているように、当該試料は、エボラ陽性／インフルエンザ陰性であり、そして薬剤候補４がエボラに対して親和性がある。
【００８４】
あるいは、当該試料の小部分を離れた検知場所へ配達し、一方、当該試料の主要部分を、ロボット試料配達アームの試料チャンバーに留めておいてもよい。その第１場所における標的物質の存否の検出に基づいて、当該ロボットアームは、（論理的アルゴリズムに基づいて）当該試料のその次のアリコットを第２検知場所へ配達するように指示されるようになる。このようにして、論理的診断および論理的検知を、最少のマイクロ流体工学で達成可能である。
【００８５】
流動の中断による検出は、食べ物、水、および／または飲料流体が処理されている工場におけるように、常時モニタリングが必要な情況では、特に有用なこともあり得る。そのような流動モニタリングの利点は、エネルギーがほとんどまたは全くいらないことである。当該プラントはそのプロセスそのものの一部として当該材料を流すので、当該流動の小部分を流出させること、または主要流に沿って測定場所を設置することは、当該試料を動かすための処理流動圧に追加のエネルギー入力をほとんどまたは全く課さないで済む。問題が見つかった時または場合には、自動バルブが活性化され、当該問題が修正されるまで、当該処理ラインを停止する。当該停止バルブのための活性化エネルギーも、当該プラントの処理流動圧から得ることも可能である。問題物質の検出は、流動検出によるか、または他の上記の方法の何れかによることも可能で、そこでの選択は、モニターされている当該プロセスの特定のパラメターおよび必要により決定される。そのような場合、安定で丈夫なリガンドが好ましい。流動中断が所望の検出図式である場合には、当該標的および当該リガンドは、効率的に流動を中断するために、強くそして長いポリマーを含む三次元構造体を作出するように設計することも可能である。あるいは、ある共通標的の異なる領域を同時に認識する２つのエレメントを有するポリマーを、効率的に流れを減らせる分子篩を形成するのに使ってもよい。好ましいリガンドは、相補性核酸、タンパク質またはペプチド、タンパク質複合体、または結合パートナーである抗体、低分子または合成認識エレメントを含む。
【００８６】
流動中断はまた、マイクロまたはナノ流体システム中の流動を意図的に遮断し、そして本質的に任意の「ナノバルブ」を交換するために、一般的に使用可能である。好ましい態様では、当該流動遮断機構は、当該システムが再使用可能なように、可逆的であるように設計してもよい。例えば、ＤＮＡオリゴは、ＤＮＡオリゴとのビーズ／粒子／コロイドをやはり宿す流動チャネルの内部の上に固定化してもよい。架橋オリゴは、既述のように、分子篩を形成するために、表面リガンドおよびビーズリガンドの両方に同時に結合してもよい。さらに、当該架橋オリゴの長さおよび配列は、特定分子量種用の分子フィルタートラップを形成するように、設計してもよい。少なくとも１つの結合パートナーを、流動チャネルに閉じ込めなければならないことは、明らかである。１つの態様では、当該リガンドは、光活性化化合物で当該チャネルの内側をコートすることにより、続いて、化学的に修飾したリガンドで当該チャネルを充たすことにより、当該流動チャネルの内部表面上に固定化することも可能である。チャネル壁を通してのレーザー照射は、特定のスペクトル光エネルルギーに曝される表面化合物とのみ当該リガンドを反応させ、空間的に限定された検出ゲートを作出する。当該チャネルは次いで洗浄され、当該結合リガンドで誘導体化されたチャネルの特定面積を残すことも可能である。当該リガンドはまた、流動チャネルを横切ってはめ合わされた膜またはマイクロスクリーン上に固定化されるか、または膜のマイクロスクリーン上のポリマー上に固定化されてもよい。当該リガンドはまた、膜またはスクリーンにより制限された、または、技術分野では知られている、Ｈ・フィルターのようなｐＨ勾配により流動チャネルの所定の断面上に保持された、ビーズ上に置かれることも可能である。このＨ・フィルターでは、ｐＨは、同じ場所での再循環のために当該ビーズを解離および回収するように、当該経路に沿って変化する。
【００８７】
次の実施例は、本発明の恩典を具体的に説明することを意図しているが、本発明の全範囲を例示するものではない。
【００８８】
【実施例】
実施例１． ビオチンおよびＮＴＡの両方を提示する金ナノ粒子上にＳＡＭｓを形成すること。
【００８９】
ＳＡＭプロトコール。 １．５ｍＬのＡｕｒｏ Ｄｙｅ Ｆｏｒｔｅ（金コロイド）をベンチトップマイクロフュージ（卓上型小型遠心分離機）上、１４ｋで１０分間ペレット化した。その上清を移し、そして保存した。当該コロイド含有ペレットを、界面活性剤溶液である保存用貯蔵緩衝液の１００μＬ中に再懸濁した。１０μＭビオチン・チオール，１０μＭ ＮＴＡ・チオール，および５８０μＭのカルボキシ終結Ｃ１１チオールを含む１００μｌのＤＭＦ溶液を、前記コロイド溶液に加え、そして２時間インキュベートし、それからペレット化した。次に、その上清を移し、そして捨てた。当該ペレットは次に、５０μｌの前記界面活性剤貯蔵緩衝液中に再懸濁した。１００μＬの４００μＭトリエチレングリコール終結チオール溶液を、前記再懸濁コロイドペレットに添加し、そして水浴中で次のように加熱サイクルした：５５℃で２分間；３７℃で２分間；５５℃で１分間；そして３７℃で２分間。当該溶液を室温に戻し、それから１４ｋで１０分間再びペレット化した。その上清を移し、そして当該ペレットを１００μｌ １０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁した。１％ＮｉＳＯ４を含む界面活性剤溶液の１００μＬを加え、その結果、ＮＴＡ金属キレートがＮｉ（ＩＩ）を複合体化し、そして次いで当該成分がヒスチジン標識分子種を容易に捕捉できるようにした。
【００９０】
実施例２． 相互連結ＤＮＡにより三次元ネットワーク中へ結合された金コロイドを含むナノ構造体を形成すること。
【００９１】
図５Ａおよび５Ｂは当該戦略を図解する図面である。
【００９２】
当業者にはよく知られているように、ビオチン成分で各末端を修飾される二本鎖ＤＮＡは、ビオチニル化プライマーを用いてＤＮＡ鋳型上でＰＣＲを実施することにより、作製可能である。異なる孔サイズを有するナノ構造体の形成を可能にするために、１ｋｂおよび２ｋｂの両ＤＮＡ断片を作製した。当該ＰＣＲ産物は、標準的技術を用いて、アガロースゲル上で精製した。
【００９３】
図１１は、ディジタル写真と、対応する実験を図解した下絵との合成物の複写写真である。本図は、ビオチン・ＳＡＭ・コートコロイドをストレプトアビジンおよびビオチニル化ＤＮＡとともにインキュベートしたときに、コロイド・ＤＮＡナノ構造体が形成されることを示す。コロイド・ＤＮＡナノ構造体の形成は、前記コロイドおよびＤＮＡ含有溶液の色調変化を検出することにより、検出される。均質な溶液中に分散されたとき、当該溶液が桃色になるのは、金コロイドの固有の性質である。しかし、当該コロイドを無理に近付けると、当該溶液は桃色から青色に変わるが、青色の程度はコロイド間の距離に依存する。
【００９４】
１０μｌの０．０２ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液を、１ｋｂビオチニル化ｄｓＤＮＡ（Ｃ），ビオチニル化ｄｓＤＮＡおよび過剰のビオチニル化一本鎖ＤＮＡプライマー類（Ｄ）、またはＤＮＡ（Ｂ）の代わりに緩衝液のいずれかとインキュベートし、そして２％ビオチンおよび２％ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）を提示したＳＡＭｓで誘導体化された金コロイドの３０μｌに、ウエル当り１００μｌの終容量にリン酸緩衝液中で添加した。対照ウエル（Ａ）は、１ｋｂビオチニル化ＤＮＡを含むが、ストレプトアビジンを含まない。上図に見られるように、ストレプトアビジンの不在下（Ａ）では、ビオチン・コロイドプラスＤＮＡは変色しない。ビオチン・コロイドプラスストレプトアビジン（Ｂ）は、１０分以内に赤色から青色に変色し、そして最終的に溶液は透明になる。ビオチニル化ＤＮＡの存在下で、ビオチン・コロイドプラスストレプトアビジンは、赤色から紫色に変色し、当該ＤＮＡのビオチニル化末端は、ストレプトアビジンの結合について当該コロイド上のビオチンと競合したことを示す。時間が経つと（１時間以上）、ビオチン・コロイドおよびストレプトアビジンの混合物は、完全に青色になり、当該凝集体は溶液から砕け、ウエル中の溶液を透明にした。ビオチン・コロイドプラスストレプトアビジンおよび１ｋｂＤＮＡは、いつまでも同じ色のままであり、当該コロイド・ストレプトアビジンネットワーク中へのビオチニル化ＤＮＡの取込みは、当該ネットワークが溶液中に懸濁したままになるように、当該コロイドを一定の距離に保つことを示した。ウエルＢとＣの内容物を移し、そしてペレット化し、そして当該ペレットを臭化エチジウムで染色した。ウエル（Ｃ）からのペレットは、当該ペレット中にＤＮＡを示し、当該ＤＮＡがネットワーク中へ取込まれていることが確認された。一本鎖ビオチニル化プライマー類（Ｄ）の存在下でのビオチン・コロイドプラスストレプトアビジンは、プライマー上の当該ビオチンが、ストレプトアビジンの結合について当該ビオチン・コロイドと競合したので、変色しなかった。当該プライマー類は一端でのみビオチニル化されているので、それらは、ビオチニル化１ｋｂＤＮＡがしたようには、コロイド・ＤＮＡ・ストレプトアビジンネットワークをつなぎ合わせるのには役立たず、そして当該ウエルは桃色のままであった。
【００９５】
実施例３． 再構成可能なナノ構造体。
【００９６】
ナノ粒子とｄｓＤＮＡの相互作用から形成される自己集合三次元構造体は、原位置で解体および再構成された。加熱した水の添加は、当該ＤＮＡ鎖を溶融または解離させた。各ＤＮＡ鎖は一端でのみビオチニル化されていたので、鎖溶融は当該ナノ構造体の解体を起した。図１２に図示した実験は、ナノ構造体が、当該溶液を加熱したときに、溶融することを示した。これらの結果は、ナノ粒子・ＤＮＡ構造体が、原位置で構成および再構成可能なことを示す。それらの結果はまた、形成するものが、実際にネットワークであって、解体し易いことはありえない非特異的な凝集体ではないことを証している。なお図１２について、左側で（１）は、ビオチニル化ｄｓＤＮＡ、ビオチン・ＳＡＭ・コート金コロイド、およびストレプトアビジンを含む溶液の写真のコピーである；（２）は、ビオチン・ＳＡＭ・コート金コロイド、およびストレプトアビジンを含むが、ビオチニル化ｄｓＤＮＡを含まない溶液の写真のコピーである；そして（３）は、ビオチニル化ｄｓＤＮＡ、ビオチン・ＳＡＭ・コート金コロイドを含むが、ストレプトアビジンを含まない溶液の写真のコピーである。それらの溶液は、次に２分間煮沸した。右側の対応するウエルに見られるように、２つの青色溶液の色は桃色に戻ったことから、当該ナノ構造体の溶融を示している。
【００９７】
実施例４． 自然に自己凝集するペプチドに連結された金コロイドを含むナノ構造体を形成すること。
【００９８】
図１３は、ナノ構造体が、凝集し易い分子種と誘導体化ナノ粒子とを混合することによっても、組立て可能なことを、図解している。ベータ・アミロイドペプチドは、自己凝集してフィブリルやプラークを形成することが知られているが、それらはアルツハイマー病の特徴である。ベータ・アミロイドペプチドは、インビトロ（試験管内で）自己凝集して病的なフィブリルを形成することも知られている。ヒスチジン標識ペプチドを捕捉するように、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）を提示した自己集合単分子層で誘導体化された金コロイド５００を、そのうちの一部５０４は当該コロイドへの付着を容易にするためにヒスチジンタグを有するた、ベータ・アミロイドペプチド５０２と混合した。図１４は、ヒスチジン標識ベータ・アミロイドペプチドを、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）所有ナノ粒子と混合した結果生じるペプチド・ナノ粒子ナノ構造体を示す、写真のコピーである。ナノ構造体形成が４０倍拡大で明瞭に見える（上図）が、ヒスチジン標識ランダム配列ペプチドは、ＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）ナノ粒子と混合した場合、ナノ構造体を産生しない（下図）。図１５は、ナノ粒子形成の程度が、金コロイド溶液の色調変化に相関することを示す、ディジタル画像の複写写真である。金コロイドの固有の光学的性質のために、粒子付着ベータ・アミロイドペプチド自己凝集体として、コロイド粒子がごく近くに引付けられ、そしてナノ構造体を形成するとき、桃色から青色へ、当該コロイド溶液の色調変化が起る。この図は、異なる薬剤候補が、９６ウエルプレートの各ウエル中のヒスチジン標識ベータ・アミロイドペプチドに加えられた、薬剤スクリーニング検定を示す。対照は最も左のカラム沿いにあり、上半分は薬剤を含まず、下半分はヒスチジン標識ランダム配列ペプチドを含む。色調変化の程度がナノ粒子形成の程度と相関することを例証するために、代表的なウエルの内容物を４０倍に拡大して示す。
【００９９】
実施例５． ナノスケールのフィルター、濃縮器、またはセンサーとして働く構造体を形成するために、金コート表面上の空間的に限定された領域につなぎ留められたナノ構造体。
【０１００】
マイクロ・またはナノ・スケールの流動チャネル中にこれらの機能性ナノ構造体を形成するには、同じような方法が使用可能である。
【０１０１】
不活性分子種のバックグラウンド中にビオチンの細い縞を表すパターン化ＳＡＭは、次のように金表面上に形成された。６００マイクロモルの総チオール濃度になる、２０％ビオチンチオールおよび８０％トリエチレングリコール末端型チオールを含むＤＭＦ溶液中に、ピペットの先端を浸し、そして金コート基質を横切って引張った（ドラッグした）が、これを本明細書ではチップと呼ぶ。当該チップ（複数）を室温で３０分間インキュベートし、それから、チップの全表面が覆われるように、４００μＭトリエチレングリコール末端型チオールの１ｍｌ溶液を含むシンチレーションバイアルに移した。次いで、当該チップ含有バイアルは、次のように、水浴中で加熱サイクルした：５５℃で２分間；３７℃で２分間；５５℃で１分間；そして３７℃で２分間。当該チップは室温へ冷却した。チップは、ＤＭＦ次いで水中ですすぎ、そしてアルゴンの気流下で乾燥した。上記のように調製した３０μＬビオチン・ＮＴＡ・ＳＡＭ・コートコロイド、１０μＬ０．０２ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液、および両端をビオチニル化された１０μＬの１ｋｂ ｄｓＤＮＡを含む溶液を、当該チップとともにインキュベートした。１５分間のインキュベーション期間の後、当該チップを水中ですすいだ。
【０１０２】
チップ表面上の細いビオチン提示縞に付着された、コロイド・ＤＮＡナノ構造体の形成は、当該チップの写真のコピーを示す図１６Ｂに、（金コロイドの赤色のために）濃い縞として容易に見ることができる。ナノ構造体形成の区域は、その表面上に金コロイドが凝集するので、黒ずんで見える。ビオチンに対して４つの結合部位を有するストレプトアビジンが、ビオチン提示コロイドおよびビオチン修飾ＤＮＡに同時に結合したときに、コロイド・ＤＮＡネットワークが形成された、それは図５Ａと５Ｂを参照されたい。同様に、ストレプトアビジンは、溶液中で遊離の状態で、当該ナノ構造体中の露出したビオチン成分および当該チップ表面上の露出したビオチン成分に、同時に結合した。当該ナノ構造体は、金コロイドの赤色のために、濃い縞として見える。対照：図１６Ａは、当該チップの全表面が均一に赤色（濃い）を呈するのを示す。均質のビオチン・ＳＡＭは、縞の中よりも、このチップの全表面にわたって形成された。図１６Ｃおよび１６Ｄに示すチップ上には赤い発色（濃い区域）はなく、当該コロイド・ＤＮＡナノ構造体はチップ表面に付着しなかったことを示す。。図１６Ｃおよび１６Ｄで使われたチップは、ＮＴＡ（Ｃ）およびトリエチレングリコール（Ｄ）のみを提示する均質なＳＡＭｓでコートされた。
【０１０３】
本発明はさまざまな実施態様について説明されたが、本発明は、本発明の精神内の広く多様なさらなるそして他の態様も可能なことは、言うまでもない。本明細書に記載のナノ構造体は、各種の検出デバイスに使用してもよい。最善の技術の決定は、検出される材料の特質、そしてその化学および標的および流速などに、依存する可能性もある。本来電子的である検出器も、記載のナノ構造体と適合可能である。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施態様が、本明細書に記載され、そして図解されたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施することおよび／または当該結果または利点を得ることについて、さまざまな他の手段および構造体を、容易に思い付くであろうし、そしてそうした変化または修飾の各々は、本発明の範疇内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメーター、寸法、材料、および構成などが、模範的であることを意味し、そして実際のパラメーター、寸法、材料、および構成などは、本発明の教示が使われる具体的な適用に依存するであろうことを、容易に了解するであろう。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの相当すものを、日常的な実験手段だけを用いて、認識し、あるいは確かめることができるであろう。したがって、前記の実施態様は例として提示されたに過ぎず、付随の請求事項およびそれに相当するものの範囲内において、本発明は、具体的に説明されたもの以外に、他の仕方で実行してもよいことは、言うまでもない。本発明は、本明細書に記載の各個別の特徴、システム、材料および／または方法に向けられる。加えて、２つまたはそれ以上のそうした特徴、システム、材料および／または方法の任意の組合せは、そうした特徴、システム、材料および／または方法が相互に矛盾しない限り、本発明の範疇内に含まれる。当該特許請求の範囲では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」，「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」，「ｃａｒｒｙｉｎｇ（〜を有する）」，「ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）」，「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（〜を含む）」および同様なもの、のような転換句または包含の句はすべて、開放的であると理解される、すなわち、「非限定的に含む」を意味するものとする。転換句または包含の句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（〜から成る）」および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（実質的に〜から成る）」だけは、それぞれ閉鎖的、または半閉鎖的なものと解釈するものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の実施態様の１つに従い、流動チャネル上の官能基との相互作用によって流動チャネルの内部につなぎ留られている、機能性化されたナノ粒子へ付着された相互連結ポリマーを含んでなる、自己集合ナノ構造体の概略図である。
【図２】
図２は、タンパク質Ｇの断片との相互作用（タンパク質Ｇは、ナノ粒子上にあるヒスチジンタグとＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）成分との間の相互作用を介して今度はナノ粒子に結合されている）によって、本発明の１つの実施態様に従って、ナノ構造体のナノ粒子に付着している抗体を示す概略図である。
【図３】
図３は、標的物質を認識するリガンドを有するように包埋ナノ粒子を誘導体化する場合、どのようにナノ構造体が生体特異的濃縮器として使用可能かを図示する概略図である。
【図４】
図４は、図３のナノ構造体中による標的物質の捕捉が、ナノ構造体にかかる流速の変化または圧力勾配の変化を検出することにより、どのように検知されるかを示す概略図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、抗体およびビオチンを有するナノ粒子が、どのようにストレプトアビジンおよびビオチニル化ｄｓＤＮＡと相互作用し、生体特異的であるナノ構造体を形成するかを示す、前後の概略図である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、抗体およびビオチンを有するナノ粒子が、どのようにストレプトアビジンおよびビオチニル化ｄｓＤＮＡと相互作用し、生体特異的であるナノ構造体を形成するかを示す、前後の概略図である。
【図６】
図６は、粒子・ポリマーネットワークの形成を容易にするために、ＤＮＡ誘導体化コロイドおよびアダプター配列で修飾されたＤＮＡからナノ構造体を構築するためのスキームを示す概略図である。
【図７Ａ】
図７Ａは、ポリ塩化ビニルなどの表面にＤＮＡを付着させるための合成スキームを示す概略図である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、流動チャネルの細い領域を横切るナノ構造体の付着のための空間的に仕切られた区域中で、表面を化学的に機能性にするための合成スキームを示す概略図である。
【図８Ａ】
図８Ａは、本発明の１つの実施態様に従う多重標的バイオセンサーの概略図である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、本発明のもう１つの実施態様に従う多重標的バイオセンサーの概略図である。
【図９】
図９は、本発明のさらにもう１つの実施態様に従う多重標的バイオセンサーの概略図である；
【図１０】
図１０は、本発明の１つの実施態様に従う論理処理に用いるための自動スイッチングバイオセンサーの概略図である。
【図１１】
図１１は、実験的試験ウエル（ｗｅｌｌｓ）のディジタル写真の複写写真を合わせたもの、および、ビオチン・ＳＡＭ・コートコロイドをストレプトアビジンおよびビオチニル化ＤＮＡとともにインキュベートしたときに、コロイド・ＤＮＡナノ構造体が形成されることを示す、対応する実験を図示する概略図である。
【図１２】
図１２は、熱の付加によりナノ粒子を接続するｄｓＤＮＡを溶融することにより、ナノ構造体が原位置で再構成可能なことを示す実験結果を提示する。
【図１３】
図１３は、凝集し易い分子種と誘導体化ナノ粒子とを混合することによってもナノ構造体が組立て可能なことを証明する概略図である。
【図１４】
図１４は、ヒスチジン標識ベータ・アミロイドペプチドをＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）含有ナノ粒子と混合した結果生じるペプチド・ナノ粒子ナノ構造体（上図）おおよびヒスチジン標識ランダム配列ペプチドをＮＴＡ・Ｎｉ（ＩＩ）ナノ粒子と混合した場合にナノ構造体を産生しないことを示すものである（下図）を示す４０倍拡大の写真のコピーである。
【図１５】
図１５は、ナノ粒子形成の程度が、金コロイド溶液の色調変化に相関することを示す、ディジタル画像の複写写真である。
【図１６】
図１６は、ナノ構造体をつなぎ留める成分を有するように誘導体化された金コート表面に、空間的に仕切られた仕方で、ナノ粒子・ＤＮＡナノ構造体が形成され、そして付着されることを示す一組のディジタル写真のコピーである。
Claims (80)
- 流動する流体を含むことができるチャネル（ｃｈａｎｎｅｌ）；および
当該チャネルを少なくとも一部つなぎ、コロイド粒子を含む多孔性部材：
を含む物品。 - チャネルが約５００ミクロンより小さい断面寸法を有する、請求項１におけるような物品。
- チャネルが約３００ミクロンより小さい断面寸法を有する、請求項１におけるような物品。
- チャネルが約１００ミクロンより小さい断面寸法を有する、請求項１におけるような物品。
- チャネルが約５０ミクロンより小さい断面寸法を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材がチャネルを完全につなぎ、チャネル内を流れるいかなる流体も多孔性部材を通過しなければならない、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が０．５ミクロンより小さい平均細孔径を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が０．２ミクロンより小さい平均細孔径を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が１００ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が５０ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が１０ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が５ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項１におけるような物品。
- 多孔性部材が、分子種で相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含む、請求項１におけるような物品。
- アフィニティータグ／認識構成要素ペアを介してコロイド粒子につながれる分子種を含む、請求項１３におけるような方法。
- 連結（各連結は、連結中の少なくとも一点で単一分子を含む）を介して他のコロイド粒子と相互連結された少なくともいくつかのコロイド粒子を含む、請求項１３におけるような物品。
- オリゴヌクレオチドを介して相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含む、請求項１３におけるような物品。
- 多孔性部材が少なくとも７０％の開放面積（ｏｐｅｎ ａｒｅａ）を有する、請求項１における物品。
- 多孔性部材が少なくとも８０％の開放面積を有する、請求項１における物品。
- 多孔性部材が少なくとも９０％の開放面積を有する、請求項１における物品。
- 多孔性部材が少なくとも９５％の開放面積を有する、請求項１における物品。
- 多孔性部材が少なくとも９８％の開放面積を有する、請求項１における物品。
- チャネルが、表面に形成された溝を含んでなる、請求項１におけるような物品。
- チャネルが、入口および出口を有する伸張した閉鎖型の構造である、請求項１におけるような物品。
- チャネルが５００ミクロンより小さい断面寸法を有し、かつ多孔性部材が、チャネルを完全につなぎ、分子種で相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含み、少なくとも７０％の開放面積および０．５ミクロンより小さい平均細孔径を有する、請求項２３におけるような物品。
- 多孔性部材が、少なくとも９５％の開放面積および１０ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項２４におけるような物品。
- 流動する流体を含むことができるチャネル；および
該チャネルを少なくとも一部つなぎ、単一分子により分離された少なくとも２つの孔を含む多孔性部材：
を含む物品。 - チャネルが、入口および出口を有する伸張した閉鎖型の構造である、請求項２６におけるような物品。
- チャネルが５００ミクロンより小さい断面寸法を有する、請求項２６におけるような物品。
- 多孔性部材がチャネルを完全につなぎ、そのため当該チャネルを流れる流体が多孔性部材を通過しなければならない、請求項２７におけるような物品。
- 多孔性部材が、０．５ミクロンより小さい平均細孔径および少なくとも７０％の開放面積を有する、請求項２６におけるような物品。
- 多孔性部材が、１０ナノメートルより小さい平均細孔径および少なくとも９５％の開放面積を有する、請求項２６におけるような物品。
- 単一分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６におけるような物品。
- 単一分子がポリマーを含む、請求項２６におけるような物品。
- ポリマーが合成ポリマーである、請求項３３におけるような物品。
- 多孔性部材が、分子種で相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含む、請求項２６におけるような物品。
- 流動する流体を含むことができるチャネル；および
該チャネルを少なくとも一部つなぎ、１ミクロンより小さい平均細孔径を有し、流れに対し開放された面積を少なくとも５０％有する多孔性部材：
を含む物品。 - 多孔性部材が０．５ミクロンより小さい平均細孔径を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が０．２ミクロンより小さい平均細孔径を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が１００ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が５０ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が１０ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が５ナノメートルより小さい平均細孔径を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が少なくとも７０％の開放面積を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が少なくとも８０％の開放面積を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が少なくとも９０％の開放面積を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が少なくとも９５％の開放面積を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が少なくとも９８％の開放面積を有する、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材が１０ナノメートルより小さい平均細孔径および少なくとも９５％の開放面積を有する、請求項３６におけるような物品。
- チャネルが、入口および出口を有する伸張した閉鎖型のチャネルを含み、かつ多孔性部材がチャネルを完全につなぎ、そのため当該チャネルを流れる流体が多孔性部材を通過しなければならない、請求項３６におけるような物品。
- 多孔性部材がコロイド粒子を含む、請求項４９におけるような物品。
- 多孔性部材が、分子種で相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含む、請求項４９におけるような物品。
- 多孔性部材が、他のコロイド粒子と相互連結されたコロイド粒子を含むネットワークを含み、このコロイド粒子の少なくともいくつかが他のコロイド粒子に単一分子を含む連結を介して連結されている、請求項４９におけるような物品。
- 多孔性部材を通って流体を通過させること；
前記流体内の化学的、生物学的、または生化学的物質を、多孔性部材に固定された前記物質の結合パートナーと結合できるようにすること；
前記結合を決定すること：
を含む方法。 - 多孔性部材にかかる圧力の差圧の変化を決定することにより結合を決定することを含む、請求項５３におけるような方法。
- 結合を定性的に決定することを含む、請求項５３におけるような方法。
- 結合を定量的に決定することを含む、請求項５３におけるような方法。
- 多孔性部材が、流体が通過するチャネルをつなぐ、分子種と相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含む、請求項５３におけるような方法。
- チャネルが、入口および出口を有する伸張した閉鎖型のチャネルであり、かつ多孔性部材が当該チャネルを完全につなぎ、そのため当該チャネルを通って流れる流体が当該多孔性部材を通過しなければならない、請求項５７におけるような方法。
- 多孔性部材が分子種で相互連結されたコロイド粒子のネットワークを含む、請求項５８におけるような方法。
- 分子種がオリゴヌクレオチドを含む、請求項５９におけるような方法。
- 分子種がポリマーを含む、請求項５９におけるような方法。
- ポリマーが合成ポリマーから成る、請求項６１におけるような方法。
- 多孔性部材がコロイド粒子を含むネットワークを含み、前記コロイド粒子の少なくともいくつかが単一分子を含む連結を介して他のコロイド粒子と連結される、請求項５９におけるような方法。
- 流体が、流体の主流から分けられた流体の分析流であり、決定工程に応じて流体の主流を制御することをさらに含む、請求項５３におけるような方法。
- 前記物質が、流体の主流から望ましくは分けられた物質であり、決定工程に応じて流体の主流を減少させることをさらに含む、請求項６４におけるような方法。
- 流体が水である、請求項６５におけるような方法。
- 流体が流動するチャネルを少なくとも一部つなぐ多孔性部材に固定された、化学的、生物学的、または生化学的物質の第１の結合パートナーを、チャネルに関する多孔性部材を解体することなく、第２の結合パートナーと置換することを含む方法。
- 多孔性媒体を通して流体を通過させること；
流体内の化学的、生物学的、または生化学的物質が、多孔性部材に固定された当該物質の結合パートナーと結合できるようにすること；および
当該化学的、生物学的、または生化学的物質を多孔性部材から放出させること：を含む方法。 - 多孔性部材より下流で、化学的、生物学的、または生化学的物質を決定することをさらに含む、請求項６８におけるような方法。
- 第１の期間に多孔性部材における物質を濃縮すること、第１の期間より短い第２の期間に当該多孔性部材で濃縮された物質を放出することおよびその物質を決定すること含む、請求項６８におけるような方法。
- 多孔性部材を通る流体の流れを実質的に遮断するのに必要な程度に、前記物質が結合パートナーに結合することを可能にすること、次いで当該物質を多孔性部材から解放させ、それによって流体が多孔性部材を通って流れることを可能にすることを含む、請求項６８におけるような方法。
- 前記物質を多孔性部材から化学的に解放させることを含む、請求項７１におけるような方法。
- 前記物質を多孔性部材から熱的に解放させることを含む、請求項７１におけるような方法。
- 第１の化学的、生物学的、または生化学的物質が第１のコロイド粒子に対して固定されることを可能にすること、および第２の化学的、生物学的、または生化学的物質が第２のコロイド粒子に対して固定されることを可能にすること；
第１および第２の物質の正体に少なくとも一部は基づいて、第１のコロイド粒子を第１の流動チャネルに向け、および第２のコロイド粒子を第２のチャネルに向けること：
を含む方法。 - 化学的、生物学的、または生化学的物質がコロイド粒子に対して固定されることを可能にすること；
前記物質の少なくとも１つの正体を決定すること；
前記正体に少なくとも一部は基づいて、前記コロイド粒子を第２の流体チャネルではなく第１の流体チャネルに向けることであって、各チャネルが前記指向工程の前にコロイド粒子を受けることができるもの：
を含む方法。 - 複数の物質が複数のコロイド粒子に固定されることを可能にすることであって前記物質が相互に異なるもの、第１の場所で少なくとも１つの物質の少なくとも１つの正体を決定すること、次いで前記コロイド粒子の少なくともいくつかを第２の場所へ移動させ、そしてその第２の場所で少なくとも１つの異なる物質の少なくとも１つの正体を決定することを含む、請求項７５におけるような方法。
- 化学的、生物学的、または生化学的物質がコロイド粒子に固定されることを可能にすること；
第１の検出場所で前記物質の少なくとも１つの正体を決定すること；および
第２の検出場所で前記物質の少なくとも１つの正体を決定すること：
を含む方法。 - 流体流動経路に沿って第１の場所で物質の第１の正体を決定すること、流動経路に沿って前記コロイド粒子を含む流体を第２の検出場所へ移動し、そしてその第２の場所で前記物質の第２の正体を決定することを含む、請求項７７におけるような方法。
- 前記物質を当初含む流体の流動経路を決定することにより、化学的、生物学的、または生化学的物質の正体を決定することであって、前記流体が複数の流動経路の選択肢を有するもの：
を含む方法。 - 流動経路に沿って前記物質が結合パートナーに結合することを可能にし、それによって当該流体の流動経路を変えることを含む、請求項７９におけるような方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23742700P | 2000-10-03 | 2000-10-03 | |
| US27272701P | 2001-03-01 | 2001-03-01 | |
| PCT/US2001/030992 WO2002028507A2 (en) | 2000-10-03 | 2001-10-03 | Electronic detection of interaction based on the interruption of flow |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004531688A true JP2004531688A (ja) | 2004-10-14 |
| JP4585170B2 JP4585170B2 (ja) | 2010-11-24 |
Family
ID=26930658
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002532934A Expired - Lifetime JP4223804B2 (ja) | 2000-10-03 | 2001-10-03 | 磁力でのＩｎＳｉｔｕ希釈法 |
| JP2002532328A Expired - Lifetime JP4585170B2 (ja) | 2000-10-03 | 2001-10-03 | 流動の中断に基づく相互作用の電子検出および相互作用の検出 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002532934A Expired - Lifetime JP4223804B2 (ja) | 2000-10-03 | 2001-10-03 | 磁力でのＩｎＳｉｔｕ希釈法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7615340B2 (ja) |
| EP (2) | EP1325332B1 (ja) |
| JP (2) | JP4223804B2 (ja) |
| AT (1) | ATE349011T1 (ja) |
| AU (3) | AU2001296579B2 (ja) |
| CA (2) | CA2424119A1 (ja) |
| DE (1) | DE60125388T2 (ja) |
| WO (2) | WO2002029411A2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005335054A (ja) * | 2004-04-27 | 2005-12-08 | Japan Science & Technology Agency | 金属ナノワイヤー及びその製造方法 |
| JP2007057518A (ja) * | 2005-07-27 | 2007-03-08 | Mitsubishi Chemicals Corp | 生体物質構造体及び生体物質構造体の製造方法、並びに、生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及び、センサーチップ |
| JP2007101520A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-04-19 | Mitsubishi Chemicals Corp | 生体物質複合体、並びに、生体物質複合体担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置及びセンサーチップ |
| US9297800B2 (en) | 2004-09-14 | 2016-03-29 | Mitsubishi Chemical Corporation | Biomaterial construct, its producing method, biomaterial support, target material purifying method, affinity chromatography container, separation chip, analyzing method and analyzing separator for target material, biomaterial complex, and its support, sensor chip, solid support with biomaterial fixed thereon |
| WO2021117204A1 (ja) * | 2019-12-12 | 2021-06-17 | 株式会社島津製作所 | クロマトグラフシステム |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050148101A1 (en) * | 1999-01-23 | 2005-07-07 | Bamdad Cynthia C. | Interaction of colloid-immobilized species with species on non-colloidal structures |
| US20040146918A1 (en) * | 2000-02-18 | 2004-07-29 | Weiner Michael L. | Hybrid nucleic acid assembly |
| AU2001253597A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Minerva Biotechnologies Corporation | Treatment of neurodegenerative disease |
| AU2001282785A1 (en) * | 2000-08-23 | 2002-03-04 | Imego Ab | A sample collecting arrangement and a method |
| US20020048821A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-04-25 | David Storek | Sample preparing arrangement and a method relating to such an arrangement |
| US7998746B2 (en) * | 2000-08-24 | 2011-08-16 | Robert Otillar | Systems and methods for localizing and analyzing samples on a bio-sensor chip |
| AU2001296579B2 (en) | 2000-10-03 | 2006-08-31 | Minerva Biotechnologies Corporation | Magnetic in situ dilution |
| DE60138130D1 (de) * | 2000-11-01 | 2009-05-07 | Minerva Biotechnologies Corp | Proteomanalyse verfahren zum drogen vergleich |
| WO2002039999A2 (en) * | 2000-11-15 | 2002-05-23 | Minerva Biotechnologies Corporation | Use of suramine, l-histidine, quisqualic acid or d-cycloserine for angiogenesis inhibition |
| US20020164611A1 (en) * | 2000-11-15 | 2002-11-07 | Bamdad R. Shoshana | Oligonucleotide identifiers |
| KR20030031911A (ko) * | 2001-04-19 | 2003-04-23 | 싸이퍼젠 바이오시스템즈, 인코포레이티드 | 질량 분석법과 친화성 태그를 이용한 생물분자 특성화 |
| US7723123B1 (en) * | 2001-06-05 | 2010-05-25 | Caliper Life Sciences, Inc. | Western blot by incorporating an affinity purification zone |
| US7218527B1 (en) * | 2001-08-17 | 2007-05-15 | Alien Technology Corporation | Apparatuses and methods for forming smart labels |
| US20050118647A1 (en) * | 2001-12-31 | 2005-06-02 | Yung-Chiang Chung | Microfluidic mixer apparatus and microfluidic reactor apparatus for microfluidic processing |
| EP1469311B1 (en) * | 2002-01-29 | 2007-08-08 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Biosensor, magnetic molecule measurement method, and measurement object measuring method |
| JP2004037338A (ja) * | 2002-07-05 | 2004-02-05 | Yokogawa Electric Corp | 磁気ビーズを用いて生体高分子を基板へ固定する方法およびその方法を用いた生体高分子測定装置 |
| JP3783677B2 (ja) * | 2002-10-29 | 2006-06-07 | 株式会社日立製作所 | 生体物質精製方法および生体物質精製用キットおよび生体物質分析システム |
| DE50310049D1 (de) * | 2002-12-23 | 2008-08-07 | Febit Biotech Gmbh | Einbau von hapten-gruppen bei der herstellung von trägern für die analytbestimmung |
| US7887754B2 (en) * | 2003-02-07 | 2011-02-15 | Waters Technologies Corporation | Polymeric solid supports for chromatography nanocolumns |
| DE112004000244T5 (de) * | 2003-02-10 | 2006-02-09 | Waters Investments Ltd., New Castle | Siloxan-immobilisierte partikuläre stationäre Phasen für chromatographische Auftrennungen und Extraktionen |
| TW200500290A (en) * | 2003-02-10 | 2005-01-01 | Reveo Inc | Micro-nozzle, nano-nozzle, manufacturing methods therefor, applications therefor |
| WO2005011867A2 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Handylab, Inc. | Processing particle-containing samples |
| US20050112586A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-05-26 | Roland Janzen | Method and composition for stabilizing liquid reagents |
| US8852862B2 (en) | 2004-05-03 | 2014-10-07 | Handylab, Inc. | Method for processing polynucleotide-containing samples |
| US20060105320A1 (en) * | 2004-05-20 | 2006-05-18 | The Whitehead Institute For Biomedical Research | Electrical conductors and devices from prion-like proteins |
| JP2008507269A (ja) * | 2004-07-20 | 2008-03-13 | シージーケー カンパニー リミテッド | 物質の相互作用探索システム |
| US20060019259A1 (en) * | 2004-07-22 | 2006-01-26 | Joyce Timothy H | Characterization of biopolymers by resonance tunneling and fluorescence quenching |
| US7981696B2 (en) * | 2005-02-18 | 2011-07-19 | The United States of America, as represented by the Secretary of Commerce, The National Institute of Standards and Technology | Microfluidic platform of arrayed switchable spin-valve elements for high-throughput sorting and manipulation of magnetic particles and biomolecules |
| US20070127164A1 (en) * | 2005-11-21 | 2007-06-07 | Physical Logic Ag | Nanoscale Sensor |
| WO2007106580A2 (en) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Micronics, Inc. | Rapid magnetic flow assays |
| US8883490B2 (en) | 2006-03-24 | 2014-11-11 | Handylab, Inc. | Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system |
| US10900066B2 (en) | 2006-03-24 | 2021-01-26 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
| DK2001990T3 (en) | 2006-03-24 | 2016-10-03 | Handylab Inc | Integrated microfluidic sample processing system and method for its use |
| US11806718B2 (en) | 2006-03-24 | 2023-11-07 | Handylab, Inc. | Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system |
| US7998708B2 (en) | 2006-03-24 | 2011-08-16 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
| US8288162B2 (en) * | 2006-03-28 | 2012-10-16 | Inanovate, Inc. | Nano-particle biochip substrates |
| US8323694B2 (en) * | 2007-05-09 | 2012-12-04 | Nanoprobes, Inc. | Gold nanoparticles for selective IR heating |
| US8287820B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-10-16 | Handylab, Inc. | Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system |
| US9186677B2 (en) | 2007-07-13 | 2015-11-17 | Handylab, Inc. | Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples |
| US8182763B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-05-22 | Handylab, Inc. | Rack for sample tubes and reagent holders |
| EP3222733B1 (en) | 2007-07-13 | 2021-04-07 | Handylab, Inc. | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
| US8105783B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-01-31 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge |
| US20090136948A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-28 | Jongyoon Han | Nanoconfinement- based devices and methods of use thereof |
| JP2009178159A (ja) * | 2007-11-05 | 2009-08-13 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板 |
| DE102007061513A1 (de) | 2007-12-20 | 2009-06-25 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Dotierkapseln, diese enthaltende Verbundsysteme sowie deren Verwendung |
| DK2338052T3 (da) * | 2008-10-16 | 2020-02-17 | Koninklijke Philips Nv | Fremgangsmåde og anordning til bestemmelse af mængden af magnetisk-mærkede målkomponenter |
| CN102483410A (zh) * | 2009-03-25 | 2012-05-30 | 莱泽尔诊断公司 | 用于分析流体变量的装置和方法 |
| US20110123452A1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-05-26 | Nanoprobes, Inc. | Metal oligomers and polymers and their use in biology and medicine |
| JP5791634B2 (ja) | 2010-01-29 | 2015-10-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | サンプル−回答型のマイクロ流体カートリッジ |
| FI20115175A0 (fi) * | 2011-02-23 | 2011-02-23 | Helsinki Thermo Fisher Scient Oy | Partikkelien prosessointi |
| US9500506B2 (en) * | 2011-03-21 | 2016-11-22 | Watersign Ltd | Method and system for stamping and marking fluid in a pipe network for smart monitoring systems |
| EP2694965B1 (en) | 2011-04-05 | 2017-01-18 | Purdue Research Foundation | Micro-fluidic system using micro-apertures for high throughput detection of entities |
| CN106148512B (zh) | 2011-04-15 | 2020-07-10 | 贝克顿·迪金森公司 | 扫描实时微流体热循环仪和用于同步的热循环和扫描光学检测的方法 |
| WO2012170998A1 (en) * | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Cornell University | Immobilized protein system for rapid and enhanced multiplexed diagnostics |
| EP2773892B1 (en) | 2011-11-04 | 2020-10-07 | Handylab, Inc. | Polynucleotide sample preparation device |
| CA2880101A1 (en) | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Ohmx Corporation | Electronic measurements of monolayers following homogeneous reactions of their components |
| WO2014018899A1 (en) * | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Ohmx Corporation | Electric measurement of monolayers following pro-cleave detection of presence and activity of enzymes and other target analytes |
| US9314948B2 (en) * | 2012-11-02 | 2016-04-19 | Palo Alto Research Center Incorporated | Systems and methods for employing magnetic assistance in precision wire placement when producing overmolded products |
| WO2014100725A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Micronics, Inc. | Portable fluorescence detection system and microassay cartridge |
| CN107824233B (zh) | 2012-12-21 | 2020-06-30 | 珀金埃尔默健康科学有限公司 | 用于微流体用途的低弹性膜 |
| EP2935908B1 (en) | 2012-12-21 | 2019-08-14 | PerkinElmer Health Sciences, Inc. | Fluidic circuits and related manufacturing methods |
| US20160007893A1 (en) * | 2013-02-06 | 2016-01-14 | Loxbridge Research Llp | Systems and methods for early disease detection and real-time disease monitoring |
| EP3372647B1 (en) | 2013-02-12 | 2019-10-30 | ETH Zurich | Hybrid nanocomposite materials of amyloid fibrils and gold |
| AU2014262726B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-09-19 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
| JP6472788B2 (ja) | 2013-05-07 | 2019-02-20 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 粘土鉱物およびアルカリ性溶液を使用して核酸含有試料を調製するための方法 |
| US10386377B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-08-20 | Micronics, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
| US9488600B2 (en) * | 2014-07-28 | 2016-11-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Radio-frequency nanopore sensor |
| CA2959073A1 (en) * | 2014-09-23 | 2016-03-31 | Tearlab Research, Inc. | Systems and methods for integration of microfluidic tear collection and lateral flow analysis of analytes of interest |
| US10670595B2 (en) * | 2015-05-26 | 2020-06-02 | Oncogenesis, Inc. | System, method and kit for detection of analytes by production of electrochemical species |
| US20200018769A1 (en) * | 2017-03-31 | 2020-01-16 | Samdi Tech, Inc. | Articles and methods involving detection of binding |
| EP3656468A1 (en) | 2018-11-23 | 2020-05-27 | ETH Zurich | Fluoride removal process |
| US20210325386A1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-10-21 | University Of Rochester | Microfluidic Devices and Methods for Rapid Detection of Pathogens and Other Analytes |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4596660A (en) * | 1982-07-23 | 1986-06-24 | Amf Inc. | Fibrous media containing millimicron-sized particulates |
| JPH06501419A (ja) * | 1990-10-15 | 1994-02-17 | ソーン テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 電気泳動およびクロマトグラフィー用のモザイクマイクロカラム、スラブおよび分離媒体 |
| JPH06509424A (ja) * | 1992-05-21 | 1994-10-20 | バイオサイト・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 膜を有さず試薬の移動を制御する診断用装置および器具 |
| JPH06511193A (ja) * | 1991-10-11 | 1994-12-15 | ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチュアリング・カンパニー | 分離および精製用の粒子充填不織繊維状物品 |
| JPH07506430A (ja) * | 1992-05-01 | 1995-07-13 | トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア | 微細加工した検出構造体 |
| WO1998043739A2 (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-08 | Biosite Diagnostics Incorporated | Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes |
| WO1999061888A2 (en) * | 1998-05-22 | 1999-12-02 | California Institute Of Technology | Microfabricated cell sorter |
Family Cites Families (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7807532A (nl) * | 1978-07-13 | 1980-01-15 | Akzo Nv | Metaal-immunotest. |
| GB8328520D0 (en) | 1983-10-25 | 1983-11-23 | Serono Diagnostics Ltd | Methods of assay |
| CA1224003A (en) * | 1984-04-24 | 1987-07-14 | Robert S. Molday | Colloidal sized metal-polysaccharide particles |
| GB8417301D0 (en) * | 1984-07-06 | 1984-08-08 | Serono Diagnostics Ltd | Assay |
| US4791069A (en) | 1984-09-21 | 1988-12-13 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Methods for attaching ligands or anti-ligands to a solid phase |
| US4888248A (en) * | 1986-07-01 | 1989-12-19 | Hidefumi Hirai | Colloidal metal dispersion, and a colloidal metal complex |
| US4879220A (en) * | 1986-11-18 | 1989-11-07 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Crosslinking receptor-specific probes for electron microscopy |
| US5120643A (en) | 1987-07-13 | 1992-06-09 | Abbott Laboratories | Process for immunochromatography with colloidal particles |
| US4853335A (en) * | 1987-09-28 | 1989-08-01 | Olsen Duane A | Colloidal gold particle concentration immunoassay |
| US4859612A (en) * | 1987-10-07 | 1989-08-22 | Hygeia Sciences, Inc. | Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite |
| ES2067018T3 (es) * | 1988-12-28 | 1995-03-16 | Stefan Miltenyi | Procedimiento y materiales para la separacion en alto gradiente magnetico de materiales biologicos. |
| KR910007824B1 (ko) * | 1989-10-25 | 1991-10-02 | 한국과학기술원 | 포도당과 과당측정용 바이오센서의 제조방법 |
| US5169754A (en) | 1990-10-31 | 1992-12-08 | Coulter Corporation | Biodegradable particle coatings having a protein covalently immobilized by means of a crosslinking agent and processes for making same |
| US5147841A (en) * | 1990-11-23 | 1992-09-15 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Method for the preparation of metal colloids in inverse micelles and product preferred by the method |
| US5294369A (en) * | 1990-12-05 | 1994-03-15 | Akzo N.V. | Ligand gold bonding |
| JPH0792459B2 (ja) * | 1991-06-18 | 1995-10-09 | オリンパス光学工業株式会社 | 免疫学的試験方法 |
| US5248772A (en) * | 1992-01-29 | 1993-09-28 | Coulter Corporation | Formation of colloidal metal dispersions using aminodextrans as reductants and protective agents |
| US6001556A (en) * | 1992-11-13 | 1999-12-14 | The Regents Of The University Of California | Polymeric assay film for direct colorimetric detection |
| TW239881B (ja) * | 1992-12-22 | 1995-02-01 | Sienna Biotech Inc | |
| US5512131A (en) | 1993-10-04 | 1996-04-30 | President And Fellows Of Harvard College | Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles |
| US5620850A (en) * | 1994-09-26 | 1997-04-15 | President And Fellows Of Harvard College | Molecular recognition at surfaces derivatized with self-assembled monolayers |
| WO1996029629A2 (en) | 1995-03-01 | 1996-09-26 | President And Fellows Of Harvard College | Microcontact printing on surfaces and derivative articles |
| CN1114831C (zh) * | 1995-03-20 | 2003-07-16 | 准确系统科学株式会社 | 利用吸移管装置处理液体的方法以及用于该法的仪器 |
| US6342389B1 (en) * | 1995-04-10 | 2002-01-29 | Roger S. Cubicciotti | Modified phycobilisomes and uses therefore |
| US5679519A (en) * | 1995-05-09 | 1997-10-21 | Oprandy; John J. | Multi-label complex for enhanced sensitivity in electrochemiluminescence assay |
| US6319670B1 (en) * | 1995-05-09 | 2001-11-20 | Meso Scale Technology Llp | Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles |
| US5620820A (en) | 1995-10-12 | 1997-04-15 | Xerox Corporation | Four color toner set |
| US6586193B2 (en) * | 1996-04-25 | 2003-07-01 | Genicon Sciences Corporation | Analyte assay using particulate labels |
| US6342349B1 (en) | 1996-07-08 | 2002-01-29 | Burstein Technologies, Inc. | Optical disk-based assay devices and methods |
| AU4043497A (en) | 1996-07-29 | 1998-02-20 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US20020172953A1 (en) | 1996-07-29 | 2002-11-21 | Mirkin Chad A. | Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field |
| US6361944B1 (en) * | 1996-07-29 | 2002-03-26 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US6582921B2 (en) | 1996-07-29 | 2003-06-24 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof |
| WO1998020162A2 (en) | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Clinical Micro Sensors | Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids |
| US5981297A (en) * | 1997-02-05 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Biosensor using magnetically-detected label |
| US6100045A (en) * | 1997-02-10 | 2000-08-08 | Dsm N.V. | Detection of analytes using electrochemistry |
| JPH10259519A (ja) * | 1997-03-17 | 1998-09-29 | Tokuyama Corp | 微多孔性ポリオレフィン繊維及びその製造方法 |
| US6001231A (en) * | 1997-07-15 | 1999-12-14 | Caliper Technologies Corp. | Methods and systems for monitoring and controlling fluid flow rates in microfluidic systems |
| GB9715101D0 (en) * | 1997-07-18 | 1997-09-24 | Environmental Sensors Ltd | The production of microstructures for analysis of fluids |
| US6974669B2 (en) | 2000-03-28 | 2005-12-13 | Nanosphere, Inc. | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles |
| US6057435A (en) * | 1997-09-19 | 2000-05-02 | Genentech, Inc. | Tie ligand homologues |
| US6180084B1 (en) * | 1998-08-25 | 2001-01-30 | The Burnham Institute | NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same |
| WO1999018438A1 (en) * | 1997-10-02 | 1999-04-15 | Aclara Biosciences, Inc. | Capillary assays involving separation of free and bound species |
| DE19802576B4 (de) | 1998-01-23 | 2004-10-28 | Xerion Pharmaceuticals Ag | Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung von Proteinen und ihren Bindungspartnern |
| EP1051517A2 (en) | 1998-01-27 | 2000-11-15 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Amplification of nucleic acids with electronic detection |
| IL123210A0 (en) * | 1998-02-06 | 1998-09-24 | Gombinsky Moshe | A device and system for the collection of magnetic particles |
| FI102906B1 (fi) * | 1998-02-23 | 1999-03-15 | Bio Nobile Oy | Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi |
| JP3944996B2 (ja) * | 1998-03-05 | 2007-07-18 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａプローブアレー |
| CA2323514A1 (en) | 1998-04-01 | 1999-10-07 | Yale University | Method for selectively modulating the interactions between survivin and tubulin |
| US6188812B1 (en) * | 1998-09-01 | 2001-02-13 | Hung Pin Kao | Method and apparatus for enhanced evanescent fluorescence and color filtering using a high refractive index thin film coating |
| WO2000024941A1 (en) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Detection of target analytes using particles and electrodes |
| WO2000043791A2 (en) | 1999-01-25 | 2000-07-27 | Minerva Biotechnologies Corporation | Rapid and sensitive detection of aberrant protein aggregation in neurodegenerative diseases |
| EP1147416B1 (en) | 1999-01-23 | 2013-05-29 | Minerva Biotechnologies Corporation | Assays involving colloids and non-colloidal structures |
| WO2002001230A2 (en) | 2000-06-23 | 2002-01-03 | Minerva Biotechnologies Corporation | Rapid and sensitive detection of protein aggregation |
| CN1185492C (zh) | 1999-03-15 | 2005-01-19 | 清华大学 | 可单点选通式微电磁单元阵列芯片、电磁生物芯片及应用 |
| CA2366123A1 (en) | 1999-04-15 | 2000-10-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarrays of polypeptides |
| CA2369868A1 (en) | 1999-04-15 | 2000-10-26 | The University Of Virginia Patent Foundation | Proteome mining |
| DE19918486B4 (de) | 1999-04-23 | 2005-09-08 | Reichert, Karl-Heinz, Prof. Dr.rer.nat. | Reaktivmembran, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung der Reaktivmembran |
| US6258263B1 (en) * | 1999-09-17 | 2001-07-10 | The University Of Cincinnati | Liquid chromatograph on a chip |
| US6355591B1 (en) * | 2000-01-03 | 2002-03-12 | Indian Oil Corporation Limited | Process for the preparation of fluid catalytic cracking catalyst additive composition |
| JP2003523185A (ja) * | 2000-01-13 | 2003-08-05 | イムニベスト・コーポレイション | 強磁性流体に基づくアレイ |
| US6681616B2 (en) * | 2000-02-23 | 2004-01-27 | Caliper Technologies Corp. | Microfluidic viscometer |
| AU2001253597A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Minerva Biotechnologies Corporation | Treatment of neurodegenerative disease |
| EP1283844A1 (en) | 2000-05-26 | 2003-02-19 | Minerva Biotechnologies Corporation | Metallocenes as signal-transducer for detection of chemical or biological events |
| AU7014001A (en) | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Minerva Biotechnologies Corp | Interaction of colloid-immobilized species with species on non-colloidal structures |
| AU2001270078A1 (en) | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Minerva Biotechnologies Corporation | Tandem signaling assay |
| AU2001296579B2 (en) | 2000-10-03 | 2006-08-31 | Minerva Biotechnologies Corporation | Magnetic in situ dilution |
| DE60138130D1 (de) | 2000-11-01 | 2009-05-07 | Minerva Biotechnologies Corp | Proteomanalyse verfahren zum drogen vergleich |
| US20020164611A1 (en) | 2000-11-15 | 2002-11-07 | Bamdad R. Shoshana | Oligonucleotide identifiers |
| WO2002039999A2 (en) | 2000-11-15 | 2002-05-23 | Minerva Biotechnologies Corporation | Use of suramine, l-histidine, quisqualic acid or d-cycloserine for angiogenesis inhibition |
| EP1354196B1 (en) | 2000-11-27 | 2010-09-15 | Minerva Biotechnologies Corporation | Diagnostics, drug screening and treatment for cancer |
| US6649419B1 (en) * | 2000-11-28 | 2003-11-18 | Large Scale Proteomics Corp. | Method and apparatus for protein manipulation |
| WO2002076248A2 (en) | 2001-03-22 | 2002-10-03 | Minerva Biotechnologies Corporation | Customized therapeutics and in situ diagnostics |
| EP1432825A4 (en) | 2001-08-31 | 2005-02-09 | Minerva Biotechnologies Corp | PARTICLES MODIFIED BY AFFINITY MARKER |
-
2001
- 2001-10-03 AU AU2001296579A patent/AU2001296579B2/en not_active Ceased
- 2001-10-03 WO PCT/US2001/031061 patent/WO2002029411A2/en active IP Right Grant
- 2001-10-03 EP EP01977463A patent/EP1325332B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 US US09/971,056 patent/US7615340B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 CA CA002424119A patent/CA2424119A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-03 JP JP2002532934A patent/JP4223804B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 DE DE60125388T patent/DE60125388T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 AU AU2002216614A patent/AU2002216614A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-03 AU AU9657901A patent/AU9657901A/xx active Pending
- 2001-10-03 CA CA2423630A patent/CA2423630C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 EP EP01986272A patent/EP1381440B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 WO PCT/US2001/030992 patent/WO2002028507A2/en active Application Filing
- 2001-10-03 AT AT01977463T patent/ATE349011T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 JP JP2002532328A patent/JP4585170B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 US US09/971,099 patent/US7585682B2/en active Active
-
2009
- 2009-11-05 US US12/613,420 patent/US20100124789A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4596660A (en) * | 1982-07-23 | 1986-06-24 | Amf Inc. | Fibrous media containing millimicron-sized particulates |
| JPH06501419A (ja) * | 1990-10-15 | 1994-02-17 | ソーン テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 電気泳動およびクロマトグラフィー用のモザイクマイクロカラム、スラブおよび分離媒体 |
| JPH06511193A (ja) * | 1991-10-11 | 1994-12-15 | ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチュアリング・カンパニー | 分離および精製用の粒子充填不織繊維状物品 |
| JPH07506430A (ja) * | 1992-05-01 | 1995-07-13 | トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア | 微細加工した検出構造体 |
| JPH06509424A (ja) * | 1992-05-21 | 1994-10-20 | バイオサイト・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 膜を有さず試薬の移動を制御する診断用装置および器具 |
| WO1998043739A2 (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-08 | Biosite Diagnostics Incorporated | Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes |
| WO1999061888A2 (en) * | 1998-05-22 | 1999-12-02 | California Institute Of Technology | Microfabricated cell sorter |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005335054A (ja) * | 2004-04-27 | 2005-12-08 | Japan Science & Technology Agency | 金属ナノワイヤー及びその製造方法 |
| US9297800B2 (en) | 2004-09-14 | 2016-03-29 | Mitsubishi Chemical Corporation | Biomaterial construct, its producing method, biomaterial support, target material purifying method, affinity chromatography container, separation chip, analyzing method and analyzing separator for target material, biomaterial complex, and its support, sensor chip, solid support with biomaterial fixed thereon |
| JP2007057518A (ja) * | 2005-07-27 | 2007-03-08 | Mitsubishi Chemicals Corp | 生体物質構造体及び生体物質構造体の製造方法、並びに、生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及び、センサーチップ |
| JP2007101520A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-04-19 | Mitsubishi Chemicals Corp | 生体物質複合体、並びに、生体物質複合体担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置及びセンサーチップ |
| WO2021117204A1 (ja) * | 2019-12-12 | 2021-06-17 | 株式会社島津製作所 | クロマトグラフシステム |
| CN114829925A (zh) * | 2019-12-12 | 2022-07-29 | 株式会社岛津制作所 | 色谱系统 |
| JP7310922B2 (ja) | 2019-12-12 | 2023-07-19 | 株式会社島津製作所 | クロマトグラフシステム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020086443A1 (en) | 2002-07-04 |
| JP2004510982A (ja) | 2004-04-08 |
| WO2002029411A3 (en) | 2002-08-22 |
| EP1381440B1 (en) | 2013-01-30 |
| CA2423630A1 (en) | 2002-04-11 |
| WO2002028507A3 (en) | 2003-10-23 |
| JP4585170B2 (ja) | 2010-11-24 |
| EP1381440A2 (en) | 2004-01-21 |
| US7615340B2 (en) | 2009-11-10 |
| ATE349011T1 (de) | 2007-01-15 |
| WO2002028507A2 (en) | 2002-04-11 |
| DE60125388D1 (de) | 2007-02-01 |
| US20020098526A1 (en) | 2002-07-25 |
| US7585682B2 (en) | 2009-09-08 |
| EP1325332B1 (en) | 2006-12-20 |
| AU2001296579B2 (en) | 2006-08-31 |
| EP1325332A2 (en) | 2003-07-09 |
| WO2002029411A2 (en) | 2002-04-11 |
| AU2002216614A1 (en) | 2002-04-15 |
| JP4223804B2 (ja) | 2009-02-12 |
| US20100124789A1 (en) | 2010-05-20 |
| AU9657901A (en) | 2002-04-15 |
| CA2424119A1 (en) | 2002-04-11 |
| CA2423630C (en) | 2011-12-06 |
| DE60125388T2 (de) | 2007-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4585170B2 (ja) | 流動の中断に基づく相互作用の電子検出および相互作用の検出 | |
| JP4516273B2 (ja) | オリゴヌクレオチド識別子 | |
| US7625764B2 (en) | Stimuli-responsive polymer devices | |
| AU2003247788B2 (en) | Nanoparticle polyanion conjugates and methods of use thereof in detecting analytes | |
| US7442339B2 (en) | Microfluidic apparatus, Raman spectroscopy systems, and methods for performing molecular reactions | |
| US8614056B2 (en) | Microfluidic method for measurement or detection involving cells or biomolecules | |
| AU2001296579A1 (en) | Magnetic in situ dilution | |
| EP3291916B1 (en) | Particle based immunoassay with alternating current electrokinetics | |
| JP2008154493A (ja) | 分離精製方法とマイクロ流体回路 | |
| JP7454030B2 (ja) | 標的分子をナノポアに送達するシステム及び方法 | |
| EP2042861B1 (en) | Method for evaluating analyte | |
| WO2005062982A2 (en) | Signal amplification methods for analyte detection | |
| US7456028B2 (en) | Electrochemical method for detecting water born pathogens | |
| JP4335526B2 (ja) | コロイド構造体および非コロイド構造体による結合スピーシーズの検出 | |
| CN107589254A (zh) | 一种免疫脂质体复合物纳米粒子生物芯片的制造方法及应用 | |
| JP7369017B2 (ja) | コロイド粒子を用いた被検物質検出増感法 | |
| AU2002248159A1 (en) | Oligonucleotide identifiers | |
| AU4017101A (en) | High-throughput screening assay systems in microscale fluidic devices |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041004 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071210 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080307 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080314 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080610 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090311 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090610 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090617 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090911 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100119 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100519 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100520 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100614 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100708 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100709 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100805 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100903 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4585170 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130910 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130910 Year of fee payment: 3 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130910 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |