Die
Proteine vom Typ PAT gehören
zu der Familie SLC36 (SLC : solute carrier) entsprechend dem Human
Genom Organisation (HUGO) Nomenklaturkomitee und umfassen unter
anderem auch protonengekoppelte und somit protonenabhängige Aminosäuretransporter
(PAT : proton coupled amino acid transporter). Es handelt sich dabei
im Transmembranproteine. In Säugern
wurden bisher zwei protonenabhängige
Aminosäuretransporter
nachgewiesen, die mit PAT1 und PAT2 bezeichnet werden. Es gehören noch
zwei weitere orphane Transporter zur Familie SLC36, die mit PAT3
und PAT4 bezeichnet werden.
PAT1
ist hauptsächlich
in der Plasmamembran von Enterozyten und in lysosomalen Membranen von
Neuronen zu finden, aber auch in Niere, Lunge und Leber nachweisbar.
PAT2
wurde hauptsächlich
in Herz und Lunge nachgewiesen, aber auch in Neuronen, die den N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor
Subtyp NR1 exprimieren.
Generell
hat PAT1 ein breiteres Substratspektrum als PAT2, dafür zeigt
PAT2 die höhere Affinität. Physiologisch
sind PAT1 und PAT2 für
die Aufnahme von kleinen neutralen Aminosäuren aus dem Darm, Primärharn bzw.
Blut verantwortlich. Darüber
hinaus ist möglicherweise
der neuronal-exprimierte PAT2 zusammen mit GlyT1 und GlyT2 für die Regulation
der Glycin-Konzentration verantwortlich, die modulierend die glycinerge
und glutamaterge neuronale Signalübertragung beeinflusst. Darüber hinaus
gibt es experimentelle Hinweise, dass PAT1 und PAT2 auch kurzkettige
Fettsäuren
in einem elektroneutralen Prozess transportieren.
Die
Lokalisation von PAT1 in Lysosomen von Neuronen deutet daraufhin,
dass PAT1 möglicherweise
für den
Export von kleinen neutralen Aminosäuren nach lysosomaler Proteolyse
verantwortlich ist.
Die
treibende Kraft für
den Transport sind der Protonengradient und im Falle des elektrogenen Aminosäuretransportes
auch das Membranpotential über
die Membran.
Hinsichtlich
der Struktur der PAT-Familie geht man je nach Hydropathieanalyse
davon aus, dass PAT1 und PAT2 aus 9 bzw. 11 Transmembrandomänen aufgebaut
sind. Die Tatsache, dass in Neuronen PAT1 lysosomal und PAT2 endosomal
sowie im ER exprimiert ist, könnte
darauf hindeuten, dass sie für
die neuronale Aktivität
von großer
Bedeutung sind und für
den ZNS-Bereich zukünftige
Targets darstellen.
Wahrscheinlich
ist ein Gendefekt bei PAT1 verantwortlich für die erblich bedingte Iminoglycinurie,
bei der der Transport von Prolin, Hydroxyprolin und Glycin in Darm
und Niere nicht funktioniert.
In
Bezug auf die Pharmakologie von PAT1 ist bemerkenswert, dass PAT1
therapeutisch relevante Prolinderivate sowie D-Serin und D-Cycloserin transportiert,
die bei Krebs und Gemütskrankheiten
eingesetzt werden. PAT1 ist daher bei oraler Medikamentengabe ein
Kandidat für
die Absorption von pharmazeutisch wirksamen Substanzen.
Gegebenenfalls
ist das PAT1-Protein in einen übergeordneten
Wirkortkomplex integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer PAT1-Einheiten
oder -Proteinmoleküle
zu einem Oligomer sein. Es können aber
auch andere, z.B. enzymatische Komponenten vorhanden sein, die in
Kooperation mit dem PAT1-Protein vorliegen. Diese können auch
räumlich beabstandet
vorliegen.
Es
sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen
bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ
und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.
Auch
ist es wünschenswert,
vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren,
z.B. am PAT1-Protein, an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen,
um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder
zu untersuchen.
Übliche Experimente
am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner
aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die
damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.
Folglich
wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine
isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe
auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren
selbst möglich
ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere
biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in
isolierter Art und Weise einer Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum
Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen
oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitäten ausnutzen
und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig,
dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfälligkeit
zukommen.
Oft
sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.
Es
sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel
die sogenannten Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp-Technik, bei welchen
zum Beispiel Zellen isoliert einer elektro physiologischen Untersuchung
zugänglich
sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen
Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die
Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder
dergleichen vermittelt werden, gemessen.
Trotz
der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekannten elektrophysiologischen Methoden
dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen
Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit
für einen
schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet
sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden
Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter
Signalanteile aufweisen. Darüber
hinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.
So
wurden Bindungs- bzw. Aufnahmestudien von radioaktiv markierten
Substraten an Caco2-Zellen oder PAT1 exprimierende Zellen oder Oozyten sowie
Patchclampmessungen und Zweielektrodenvoltageclampmessungen durchgeführt, die
aber die oben beschriebenen Unzulänglichkeiten aufweisen.
Die
Untersuchung der Wirkung von Substanzen bei radioaktiven Bindungs-
und Aufnahmeassays lässt
in der Regel keine Unterscheidung zu, ob ein Wirkstoff nur bindet
oder auch transportiert wird, dafür müssten alle Wirkstoffe radioaktiv
markiert sein.
Radioaktive
Messungen bedürfen
speziell ausgebildeten Personals sowie notwendiger Sicherheitseinrichtungen.
Beide Methoden können
nur offline durchgeführt
werden und erfordern Vermittler in Form von Färbereagenzien oder radioaktiv
markierten Substraten. Bestimmt wird nicht die unmittelbare Enzymaktivität, sondern
die Änderung
einer Substratkonzentration nach dem Abschluss des Transportes.
Sie erfassen die Transportaktivität im Laufe von Minuten.
Die
Untersuchung von Substanzen mit Hilfe der Patch/Voltageclamptechnik
enthält
die gleichen Informationen wie mit der hier beschriebenen Erfindung.
Allerdings bieten die Patch-Messungen
bzw. Zweielektrodenvoltageclampmessungen nur einen sehr geringen
Durchsatz und man benötigt
erfahrenes Personal für
die Durchführung.
Zudem sind für die
Patch-/Voltageclampmethode eine Zellkultureinheit oder die Haltung
entsprechender Tiere, z.B. von Fröschen (Xenopus laevis), von
denen entsprechende Zellen entnommen werden, nötig.
Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-PAT1-Protein-Assay zu
schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art
und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massenbetrieb,
unter vertretbaren Kosten möglich
ist.
Der
Erfindung liegt ferner die Aufgabe zu Grunde, die Wechselwirkung
von Substanzen mit PAT1 zu untersuchen. Wird z.B. eine Substanz
von PAT1 transportiert, kann dies ein Indiz für eine hohe orale Absorptionsrate
und damit für
eine hohe Bioverfügbarkeit
dieser Substanz sein. Die Bioverfügbarkeit von pharmazeutisch
wirksamen Substanzen ist ein entscheidendes Merkmal für deren
klinische Anwendung und damit kommerziellen Einsatz.
Gelöst werden
diese und weitere Aufgaben, die sich aus dem eingangs diskutierten
Stand der Technik ergeben, bei einem Verfahren zum Identifizieren
eines Wirkstoffkomplexes erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs
1. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind Gegenstand der jeweiligen abhängigen Unteransprüche.
Weiterhin
sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Testkit zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
gemäß Anspruch
18, ein Screeningverfahren gemäß Anspruch
15, sowie Verwendungen des Verfahrens und des Testkits gemäß den Ansprüchen 20
bzw. 21.
Im
Transportzyklus von PAT1 werden Protonen zusammen mit Aminosäuremolekülen über die Membran
verschoben.
Der
Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grunde, diese aminosäureabhängige Ladungsverschiebung
direkt, z.B. durch Anbindung von Enzympräparationen auf einer geeigneten
Oberfläche, die
z.B. in ein Durchflusssystem integriert ist und/oder bei der ein
Substratkonzentrationssprung durchgeführt werden kann, als elektrischen
Stromfluss, als elektrische Potentialänderung und/oder deren zeitlichem
Verlauf zu messen und den Einfluss verschiedener Substanzen oder
Wirksubstanzen auf die Messgröße Stromfluss,
als elektrische Potentialänderung
und/oder deren zeitlichem Verlauf zu untersuchen.
Im
Sinne der Erfindung ist dabei auch eine mögliche Untersuchung einer möglichen
Protonenabhängigkeit,
also eine Abhängigkeit
von der Protonenkonzentration, z.B. auch im Rahmen eines Protonenkonzentrations-
oder pH-Wert-Sprungs, mitumfasst.
Es
ist ferner eine alternative oder zusätzliche Idee, die substratabhängige, aminosäureabhängige und/oder
aminosäureanalogabhängige Ladungsverschiebung – also den
Protonen- oder allgemeiner einen Ionentransport – in der Messgröße Stromfluss, als
elektrische Potentialänderung
und/oder in deren zeitlichem Verlauf zu untersuchen.
Die
Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren eines
Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft und/oder
das Transportverhalten eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ
eines PAT1-Proteins oder eines Teils davon enthält, modifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren weist
folgende Schritte auf:
- (a) Bereitstellen einer
Mehrzahl Primärträger, welche
den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-PAT1 Protein umfassen, insbesondere
in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
- (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder
im Oberflächenbereich
eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode
in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger bevorzugt gegenüber dem
Messmedium und gegenüber
den Primärträgern mittels
des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder
wird,
- (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
- (d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen
des potenziellen Wirkstoff komplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder
Teilen davon, und
- (e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses
des potenziellen Wirkstoff komplexes oder eines Teils davon auf
enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils
davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des oder am Wirkortkomplex
oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen
Aktion über
die Biosensorelektrode als Sekundärträger,
dadurch gekennzeichnet,
dass in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder
mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
- (f) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein Ruhemedium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen
Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e),
- (g) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein zweites nicht-aktivierendes Medium und gegebenenfalls Detektieren
einer elektrischen Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei im zweiten oder nichtaktivierenden
Medium, insbesondere ein Nicht-Substrat von PAT1 vorgesehen ist,
- (h) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer
elektrischen Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende
Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch
zusätzlich
ein Substrat und/oder Cosubstrat des Typ-PAT1-Proteins enthält und/oder eine gegenüber dem
nichtaktivierenden Medium variierte Konzentration eines Substrats
und/oder Cosubstrats, insbesondere anstelle eines gegebenenfalls
im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium vorhandenen Nicht-Substrats.
Die
erfindungsgemäßen Schritte
(f), (g), (h) werden – gegebenenfalls
mit Wiederholungen – bevorzugt
in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.
Im
Sinne der Erfindung können
in der Abfolge der Schritte (d), (e) und/oder (f), (g), (h) und
deren Wiederholungen auch so genannte Substratkonzentrationssprünge und
Cosubstratkonzentrationssprünge,
insbesondere in der H+-Konzentration, durchgeführt werden,
wobei insbesondere immer bei einer ersten oder Startkonzentration – die auch
null sein kann – begonnen
und bei einer zweiten oder Endkonzentration – die auch null sein kann – geendet
wird.
Im
Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzymatische
Eigenschaft" des Typ-PAT1-Proteins
gleichzeitig auch immer das Transportverhalten, z.B. in Bezug auf
den durch diese Proteine vermittelten Aminosäure-, Aminosäureanaloga-,
Protonen- und/oder
Ionentransport, und nimmt damit auch immer Bezug auf den eingangs diskutierten
Einfluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe.
Dies bedeutet, dass, wo immer von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften
des Proteins die Rede ist, auch Untersuchungen erfindungsgemäß mit umfasst
sind, die zeigen sollen, ob ein bestimmter Stoff vom Typ-PAT1-Protein
transportiert wird.
Soll überprüft werden,
ob ein potentieller Wirkstoff das Typ-PAT1-Protein aktiviert/inhibiert, kann
der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.
Soll überprüft werden,
ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle
Wirkstoff im aktivierenden Medium vorhanden sein, nicht jedoch im
Ruhemedium bzw. im nichtaktivierenden Medium.
Bevorzugt
wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer
eines PAT1-Proteins verwendet.
Ferner
ist es vorgesehen, dass ein Wirkort komplex oder ein Teil davon
verwendet wird, welcher auf einem Typ-PAT1-Protein basiert, die
aus einem Gewebe eines Säugetiers
stammt, z.B. aus dem Darm, aus neuronalem Gewebe oder dem ZNS, der Niere,
Lunge oder der Leber, oder hieraus abgeleitet ist.
Insbesondere
stammt das Typ-PAT1-Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt
kloniert vor.
In
vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex – enthaltend
das Typ-PAT1-Protein – aus
dem Organismus Ratte, Schwein, Maus, Kaninchen oder Mensch stammt oder
aus diesen genetisch abgeleitet wird.
Erfindungsgemäß werden
wässrige
Messlösungen
und insbesondere wässrige
Elektrolytlösungen
als Messlösung
oder Messmedium verwendet, die als Ruhemedium, nicht aktivierende
sowie aktivierende Lösungen
oder Medien bezeichnet werden.
Alle
verwendeten Messlösungen
enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH-Wert stabilisierendes Mittel
bevorzugt ausgewählt
aus der Liste: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES u.a., wie sie z.B. in „Buffers,
Calbiochem" veröffentlicht
sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbüchern der
Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Erfindungsgemäß sollen
diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6- 8, bevorzugt etwa
im Bereich von pH 6 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten
pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Substrat (Wirkstoffkomplex)
abhängen
und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.
Erfindungsgemäß ist es
möglich,
die Verfahrensschritte (c) und/oder (d), gegebenenfalls auch (f) bis
(h) mittels
- – Zumischen oder Injizieren
des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,
- – Austauschen
oder Zumischen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder
- – chemisches
oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder
eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer
Vorstufe davon
durchzuführen.
Das
bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon
direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein
zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann. Besonders
einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach
das jeweilige Messmedium ausgetauscht wird, beispielsweise in kontinuierlicher Art
und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst
durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren
im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von
Strahlung erfolgen.
Der
qualitative Einfluss und/oder der quantitative Einfluss des potenziellen
Wirkstoffes oder Wirkstoff komplexes wird erfindungsgemäß durch Detektieren
einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex
oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ-PAT1-Protein
vermittelt wird.
Insbesondere
wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff
bestimmt, und durch Vergleichen beider Messreihen wird untersucht,
ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen
Eigenschaften des Typ-PAT1-Proteins.
Wie
in der WO02/074983 beschrieben werden die Primärträger mit den Wirkortkomplexen
an einem Sekundärträger, nämlich der
Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich
in Kontakt gebracht und dort insbesondere angelagert.
Bei
der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundärträger bestehen
vielfältige
Möglichkeiten.
Es
wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als
Sekundärträger verwendet wird,
bei welcher ein elektrisch leitfähiger
und festkörperartiger
Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird,
welcher gegenüber
dem Messmedium und gegenüber
den Primärträgern elektrisch
und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs
in Form einer festkörperunterstützten Membran,
welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer
organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils
zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen
organischen Verbindung.
Bei
einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet
wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen
wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht
darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
Im
Hinblick auf die Primärträger, welche
den Wirkortkomplex und insbesondere die Typ-PAT1-Proteine im Bereich
ihrer Membran enthalten sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten,
wobei der jeweiligen Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen
werden kann.
Zum
Beispiel bietet es sich gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
an, dass als Primärträger jeweils
eine eukaryontische Zelle, eine prokaryontische Zelle, insbesondere
ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile
hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon
in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in
gereinigter und/oder modifizierter Form, verwendet wird.
Es
ist auch möglich,
dass als Primärträger jeweils
ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird.
Die Membranfragmente können
sich auch planar anlagern, d.h. als nicht sphärische Struktur.
Besonders
vorteilhaft gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn die
Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und
daran angelagerten Primärträgern in
einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder
angeströmt
wird. Auf diese Art und Weise lässt
sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung
im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht
realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen
eines Fließsystems vorteilhaft
auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung die
erfindungsgemäßen Versuchsbedingungen
einstellen. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettiervorrichtung
kann das erfindungsgemäße Verfahren
vorteilhaft durchgeführt werden.
Besonders ökonomisch
und für
eine statistische Auswertung zugänglich
gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren
dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird,
insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums,
ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.
Wichtig
ist bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren das Vergleichen
der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex
mit einer Situation, bei welcher der potenziel le Wirkstoffkomplex
nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den
Wechsel zwischen nicht-aktivierendem zu aktivierendem Medium in
Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoff komplexes
und Vergleich der erhaltenen Messwerte.
Potentielle
zu testende Wirkstoffe können insbesondere
unter anderem sein monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale
Antikörper und
Peptide. Es können
jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, dass sie
eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese
Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht.
Substanzen,
die als Testsubstanzen in dem erfindungsgemäßen Testsystem untersucht werden können, können niedermolekulare
Verbindungen sein. Erfindungsgemäß können den
niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosäureanaloga,
Steroide, Nukleoside, Nukleotide.
Insbesondere
können
als Testsubstanzen Aminosäuren
oder Aminosäureanaloga
verwendet werden.
Es
kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Ruhemedium, im nichtaktivierenden
als auch im aktivierenden Medium zugesetzt oder dort freigesetzt
werden.
Auch
ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder
der sie tragenden Primärträger mit
dem Wirkstoffkomplex denkbar.
Des
Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (g)
ein Waschschritt durchgeführt
wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den
Primärträgern in
ein viertes oder Waschmedium, welches bevorzugt mit dem nicht aktivierenden
Medium identisch ist, und/oder in ein oder in das Ruhemedium.
Ferner
ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (h) bei einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
Es
ist bevorzugt, wenn der Schritt (f) vor Beginn der eigentlichen
Messreihe, d.h. bevor zum erstenmal die Schritte (g) und (h) durchgeführt werden, für mindestens
5 Minuten, bevorzugt für
mindestens 10 Minuten, besonders bevorzugt für mindestens 15 Minuten, noch
mehr bevorzugt für
mindestens 20 Minuten und insbesondere bevorzugt für mindestens
30 Minuten durchgeführt
wird. Die Schritte (g) und (h) werden erfindungsgemäß für mindestens
0,2 s, höchstens
jedoch 5 s und bevorzugt für
etwa 1 bis 2 s durchgeführt.
Nach der erstmaligen Durchführung der
Schritte (g) und (h) wird Schritt (f) für mindestens 1 s bis höchstens
120 s durchgeführt,
bevorzugt für mindestens
30 s bis 90 s.
Die
Prozesse des Spülens,
Waschens und/oder Ruhens in den jeweiligen Medien können auch
für oder
mit deutlich kürzeren
Zeitspannen erfolgen.
Die
Medien, also das Ruhemedium, das nicht aktivierende Medium und das
aktivierende Medium, weisen Kaliumionen in Konzentrationen im Bereich
von etwa 10 mmol/l bis etwa 300 mmol/l auf, bevorzugt im Bereich
von etwa 100 mmol/l.
Des
Weiteren enthält
das aktivierende Medium ein Substrat des PAT1-Proteins, bevorzugt
Glycin. Weitere mögliche
Substrate sind andere Aminosäuren,
Aminosäureanaloga
oder andere Substanzen, die von PAT1 transportiert werden oder werden können.
Die
Konzentration kann je nach Anwendung schwanken. Bei Kompetetionsuntersuchungen
kann Glycin im Bereich von etwa einem oder einigen hundert μmol/l bis
zu einigen zehn mmol/l eingesetzt werden, z.B. im Bereich von etwa
5 mmol/l bis etwa 50 mmol/l. Bei Wirkstofftestungen auf Aktivierung und/oder
Inhibierung des TYP-PAT1-Proteins kann auch eine Konzentration im
Bereich darüber
sinnvoll sein, z.B. im Bereich von etwa 1 mmol/l bis etwa 100 mmol/l.
Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird alternativ oder zusätzlich
als nicht ak tivierendes Medium ein Medium verwendet mit 100 mmol/l
KCl, 2 mmol/l MgCl2, 30 mmol/l MES pH 6/KOH
und Valin im Bereich von etwa 2 mmol/l bis etwa 80 mmol/l.
Ferner
wird alternativ oder zusätzlich
bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
als aktivierendes Medium ein Medium verwendet mit 100 mmol/l KCl,
2 mmol/l MgCl2, 30 mmol/l MES pH 6/KOH und
Glycin im Bereich von etwa 2 mmol/l bis etwa 80 mmol/l.
Dabei
sind auch immer Verfahrensweisen möglich, bei denen das eigentliche
Substrat im Hintergrund, z.B. in konstanter Konzentration, vorliegt und
ein die Konzentration eines Cosubstrats und/oder die Protonenkonzentration – durch
einen pH-Sprung – ändernder
Konzentrationssprung durchgeführt
wird.
Des
Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes. Dieser Testkit weist
auf:
- – mindestens
einen Primärträger mit
dem Typ-PAT1-Protein,
- – einen
Messbereich,
- – gegebenenfalls
ein erstes oder Ruhemedium, ein zweites oder nicht-aktivierendes
Medium sowie ein drittes oder aktivierendes Medium.
Erfindungsgemäß wird auch
ein Screeningverfahren nach Anspruch 19 zum Identifizieren geschaffen,
und zwar zum Identifizieren:
- – eines
unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder
Derivats davon,
- – des
Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoff komplexes,
Teils und/oder Derivats davon,
- – des
Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils
und/oder Derivats davon,
- – der
Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats davon,
- – der
Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils
und/oder Derivats davon.
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden
von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren
oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes,
welcher ein Typ-PAT1-Protein enthält, und von Wirkstoffkomplexen,
die ein Substrat für
PAT1 darstellen.
Des
Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit
erfindungsgemäß verwendet
zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren
oder Modulatoren eines einen Typ eines PAT1-Proteins enthaltenden
Wirkortkomplexes und/oder von Wirkstoffkomplexen, die ein Substrat für PAT1 darstellen.
Auf
der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehenden
und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten
weiter erläutert:
Es
ist ein z. B. wässriges
Messmedium vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet
werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primärträgern und gegenüber den
biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend elektrisch isoliert.
Der
Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese
kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich
ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.
Eine
besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt
sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberfläche des
Trägers
abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei
um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die
Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine
Schichtstärke
von etwa 10 bis 200 nm.
Das
Typ-PAT1-Protein kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder
in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch
geänderter
Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften
getestet und pharmakologisch untersucht werden. Andererseits bieten
sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Veränderungen
an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der
pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.
Besonders
vorteilhaft ist es, dass Primärträger eines
jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen
werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage
und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich
auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen
und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträger.
Das
Nämliche
gilt auch für
die in dem Primärträger vorgesehenen
Wirkortkomplexe und das Typ-PAT1-Protein. Hier sind Wirkortkomplexe
und Typ-PAT1-Protein eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen
Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen,
physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen
Eigenschaften. Zusätzlich
sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick
auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit
in Bezug auf den jeweiligen Primärträger in etwa einheitlich
sein.
Wie
bereits ausgeführt,
liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von
Substanzen auf die Funktion von Typ-PAT1-Proteinen einer Untersuchung
zugänglich
zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins
modulieren, sind als potentielle Wirkstoffe von gewerblichem Interesse.
Auch
wären Substrate
des Proteins, die von diesem transportiert werden, wichtige neue
Moleküle.
Das
erfindungsgemäße Vorgehen
bietet folgende Vorteile:
Die Messung der Enzymaktivität gemäß dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen
Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine
Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist
sensitiv gegenüber
allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel
inhibiert, können
mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden.
Substrate müssen
nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort
des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.
Darüber hinaus
ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik die Signalqualität besser,
und zwar im Sinne eines besseren Signal-Rauschverhältnisses.
BEISPIEL 1 Vorbereitung
des Sensorchips
Die
Goldoberfläche
eines zu Grunde liegenden Sensorchips wurde durch Einlegen in eine
1 mmol/l Octadecylmercaptanlösung
in Alkohol mercaptanisiert oder hydrophobisiert, also hydrophob gemacht,
mit 2-Propanol oder Ethanol (absolut) oder Wasser gespült und getrocknet.
Sie wurde dann mit Diphytanoylphosphatidylcholin (in Decan) bedeckt und
mit einem Anlagerungspufferpuffer (100 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2, 30 mmol/l Mes, pH 6/KOH) überschichtet.
BEISPIEL 2 Herstellung
proteinhaltiger Membranfragmentesuspension
Die
Membranfragmente wurden nach folgendem Protokoll präpariert:
Pro 1 g Zellpellet 1 ml Sucrosepuffer aus 0,25 mol/l Sucrose, 5
mmol/l Tris, pH 7,5, ca. 2 mmol/l DTT, PMSF (50 μl PMSF als gesättigte ethanolische
Lösung
auf 100 ml Puffer), Complete (Fa. Roche, eine Tablette pro 50 ml
Puffer). Zellen aufbrechen bis homogene Masse entstanden ist, 10
min/680 g/4°C;
10 min/6100 g/4°C; Überstand
1 h/100.000 g/4°C
zentrifugieren; Pellet in 5 mmol/l Tris pH 7,5 aufnehmen, so dass
sehr trübe
Mischung entsteht; mit Zugabe von 70% Sucrose (in 5 mmol/l Tris) auf
51,3 Sucrose einstellen, Zentrifugenröhrchen mit 44,4%, 30,7% und
8,6% Sucrose in 5 mmol/l Tris pH 7,5 überschichten; 1 h 40 min/100.0000/4°C im Ausschwenkrotor
zentrifugieren; Banden mit Pasteurpipette abnehmen und pelletieren
in Anlagerungspuffer (siehe oben); 30 min/150.0000/4°C; Pellets
in Anlagerungspuffer aufnehmen. Alternativ zum Sucrosegradienten
wurde auch ein Percollgradient eingesetzt. Denkbar ist auch eine
Zweiphasentrennung
BEISPIEL 3 Herstellung
der PAT1-Sensorchips
10 μl bis 50 μl der Membranfragmentesuspension
mit einer Proteinkonzentration von ca. 0,1-1,0 mg/ml wurden auf
einen vorbehandelten Sensorchip mit einer runden Goldelektrode (IonGate
Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) mit z.B. etwa 3 mm Durchmesser
aufgetragen und bei 2 Stunden oder über Nacht im Kühlschrank
bei weniger als etwa 8°C
inkubiert.
BEISPIEL 4 Aktivitätsmessung
an PAT1-exprimierenden Membranfragmenten
Die
Durchflusszelle mit integriertem proteinbeladenem Sensorchip wurde
mit nicht aktivierender Lösung
mit 100 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2, 30 mmol/l
MES pH 6/KOH, 40 mmol/l bis 80 mmol/l Valin gespült. Mittels elektromechanischem
3/2-Wegeventil wurde anschließend
auf aktivierende Lösung
mit 100 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2, 30 mmol/l
MES pH 6/KOH, 2,5 mmol/l bis 80 mmol/l Glycin umgestellt.
Im
Transportzyklus von PAT1 werden durch Cotransport von Protonen und
Glycin netto positive elektrische Ladungen über die Membran und auf die Elektrode
des Biosensors zu verschoben, was zu einem positiven Stromsignal
führt: 1.
BEISPIEL 5 Aktivitätsmessung
mit Leucin statt Glycin
Die
Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurden in nicht
aktivierender und aktivierender Lösung 50 mmol/l Valin bzw. 50
mmol/l Leucin (statt Glycin) verwendet. Da Leucin von PAT1 nicht
transportiert wird, findet auch kein Cotransport von Protonen statt
und es kann kein Ladestrom gemessen werden: 2.
BEISPIEL 6 Aktivitätsmessung
an Kontrollmembranen
Die
Kontrollmessungen wurden wie bei den PAT1-exprimierenden Membranen
durchgeführt, aber
an Membranen, die in Bezug auf die PAT1-Bedingungen keine für den Test
relevante Menge und/oder Aktivität
an PAT1 enthielten bzw. zeigten. Z.B. kann ein derartiges Kontrollexperiment
an Membranen oder Membranfragmenten durchgeführt werden, die ein anderes
Protein als PAT1 überexprimieren,
z.B. NCX. Durch spezifische Aktivitätsmessung in Bezug auf dieses
anderen Protein kann zunächst die
Anlagerung der Membranen oder Membranfragmente nachgewiesen werden.
Dann können
die für PAT1
spezifischen Tests zur Kontrolle durchgeführt werden.
Dabei
ergaben sich keine Signale beim Wechsel von nicht aktivierendem
Medium mit 100 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2,
30 mmol/l MES pH 6/KOH, 80 mmol/l Valin auf aktivierendes Medium
mit 100 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2, 30 mmol/l
MES pH 6/KOH, 80 mmol/l Glycin anstelle von Valin.
1 zeigt
in Form eines Graphen den gemäß einer
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t)
als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PAT1-Protein
hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht.
2 zeigt
in Form eines Graphen den gemäß einer
anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t)
als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PAT1-Protein hervorgerufenen
Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht, und zwar
bei einem Kontrollexperiment, bei welchem zwischenzeitlich Glycin
durch Leucin ersetzt wird.
3 zeigt
in Form eines Graphen den gemäß einer
anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit einer Biosensorelektrode normierten gemessenen maximalen elektrischen Strom
I(t) als Funktion des eingestellten pH-Werts.
1 zeigt
in Form eines Graphen den gemäß einer
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t)
als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PAT1-Protein
hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht.
Dabei
bezeichnet die Abszisse die Zeit t, wobei t = 0 denjenigen Zeitpunkt
t angibt, bei welchem das Medium effektiv, also für PAT1 wirksam
von einem nicht aktivierendem zu einem aktivierendem gewechselt
wird. D.h., ab t=0 ist das Substrat, hier Glycin, welches vor t=0
fehlte, effektiv, also für
PAT1 wirksam im Messmedium vorhanden. Dadurch wird der elektrische
Strom I(t), dargestellt durch die Ordinate als Strom transportierter
Ionen als Funktion der Zeit t manifest, welcher auf der Ordinate
aufgezeichnet ist. Die Ordinate bezeichnet also den gemessenen elektrischen
Strom I(t), als Funktion der Zeit t, welcher über die Biosensorelektrode
gemessen wird.
Dargestellt
sind in 1 vier Messspuren A, B, C und
D, die mit unterschiedlichen Messbedingungen in Bezug auf die Substratkonzentration
an Glycin korrespondieren.
Spur
A der 1 zeigt eine Messung, bei welcher die PAT1-Proteineinheiten
durch Glycinzugabe von 80 mmol/l zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert
wird, und zwar in Anwesenheit von 100 mmol/l K bei pH = 6. Unter
Glycintransport werden mittels des PAT1-Proteins Protonen über die
Primärträger, z.B. über Membranfragmente
oder Vesikel, auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt.
Im Transportzyklus von PAT1 wird dabei netto positive elektrische
Ladung über
die Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal führt. Dies
ist am gemessenen positiven elektrischen Strom I(t) erkennbar.
Spur
B in 1 zeigt eine Messung, bei welcher – unter
sonst gleichen Bedingungen wie bei der Spur A – die Konzentration des bei
t0 = 0 zugegebenen Glycins statt 80 mmol/l nur 20 mmol/l betrug. Deutlich
erkennbar ist die Absenkung des Maximums des gemessenen elektrischen
Stroms I(t).
In
den Spuren C und D der 1 ist die zugegebene Glycinkonzentration
auf 10 mmol/l bzw. auf 2,5 mmol/l eingestellt.
1 zeigt
somit die Relevanz der Anwesenheit von Glycin für die Transportaktivität der PAT1-Einheiten
2 zeigt
ebenfalls in Form eines Graphen den gemäß einer anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t)
als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PAT1-Protein
hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht,
und zwar bei einem Kontrollexperiment, bei welchem zwischenzeitlich
Glycin durch Leucin ersetzt wird.
Spur
A der 2 entspricht hinsichtlich der Messbedingungen
etwa der Spur A aus 1 und zeigt also eine Messung,
bei welcher die PAT1-Proteineinheiten durch Glycinzugabe von 40
mmol/l zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert werden, und zwar in Anwesenheit
von 100 mmol/l K bei pH = 6. Unter Glycintransport werden mittels
des PAT1-Proteins wieder Protonen über die Primärträger, z.B. über Membranfragmente
oder Vesikel, auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt.
Im Transportzyklus von PAT1 wird dabei wieder netto positive elektrische Ladung über die
Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal führt. Dies
ist am gemessenen positiven elektrischen Strom I(t) erkennbar.
Spur
B der 2 zeigt eine Messung, bei welcher statt 40 mmol/l
Glycin in der nicht aktivierenden Messlösung nun 50 mmol/l Valin und
50 mmol/l Leucin in der aktivierenden Messlösung vorliegen. Trotz des Vorhandenseins
von Protonen bei pH = 6 bei t0 = 0 ist kein über das Rauschen hinausgehendes
Signal messbar. Dadurch ist gezeigt, dass der gemessene elektrische
Strom I(t) aus der Spur A den Transportstrom repräsentiert.
Aus Messungen mit anderen Methoden ist bekannt, dass PAT1 Leucin nicht
transportiert.
3 zeigt
die pH-Abhängigkeit
des normierten maximalen Stroms als elektrische Aktion von PAT1,
und zwar normiert auf das Maximum, das bei pH = 6 vorliegt, wobei
die weiteren Bedingungen 100 mmol/l K+ und
80 mmol/l Valin-Glycin waren.
Grundsätzliche
Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen
Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die
einfache Handhabbarkeit und geringer Störanfälligkeit. In der Verwendung
der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen
Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit,
eine geringe Störanfälligkeit
sowie insbesondere ein gegenüber
herkömmlichen
Verfahren maßgeblich
gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren
kostengünstig
ausgearbeitet und durchgeführt
werden können.
Darüber hinaus
ist im Gegensatz zu anderen Techniken die Signalqualität besser,
und zwar im Sinne eines besseren Signal-Rauschverhältnisses.