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Die Erfindung betrifft Verfahren zur Durchführung von Diagnosen von Lebererkrankungen oder deren Vorläufer- und/oder Begleiterscheinungen, Leberläsionen, chronische Lebererkrankungen, einschließlich Tumoren der Leber, wobei eine qualitative, quantitative Bestimmung mittels eines geeigneten Biomarkers (Isoenzym L der Pyruvatkinase, L-PK, EC.2.7.1.40) erfolgt. Ferner betrifft die Erfindung die chemische Bestimmung von L-PK, deren Kombination mit anderen zum Stand der Technik gehörenden Biomarkern und deren Verrechnung mittels geeigneter Algorithmen, insbesondere zur in-vitro Diagnostik.
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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Testverfahren, Antikörper, Schnelltest, Testkit, Herstellungsverfahren eines monoklonalen, besonders bindungsfähigen anti-L-PK-Antikörpers. Eine qualitative, quantitative Bestimmung des Pyruvatkinase-Isoenzyms Typ L (L-PK) ist mit Hilfe von Antikörpern in Körperflüssigkeiten, im Blut, Plasma, Stuhl sowie Gewebekultur möglich. Die entsprechenden Antiseren werden erhalten, wenn man gereinigtes Pyruvatkinase-Isoenzym L (L-PK) bzw. Teilstücke desselben als Immunogen verwendet. Bevorzugt sind Antiseren mit monoklonalen Antikörpern. Diese Antikörper lassen sich sowohl in ELISA-Testsystemen als auch in anderen immunologischen Testsystemen (quantitativ oder qualitativ) bestimmen. Ein Testkit hierzu enthält mindestens einen L-PK bindungsfähigen Rezeptor, der mit keinem anderen Pyruvatkinase-Isoenzym kreuzreagiert, sowie gegebenenfalls weitere für die Durchführung des Immunoassays notwendige Reagenzien. Der Test dient der Diagnose diverser Erkrankungen (insbesondere Lebererkrankungen), bei denen das Isoenzym L-PK aus Zellen, insbesondere Hepatozyten durch z. B. Apoptose in Körperflüssigkeiten z. B. Blut freigesetzt wird.
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Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
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In Deutschland leiden etwa 5 Millionen Menschen an Lebererkrankungen. Viele Lebererkrankungen werden erst spät erkannt. Tückisch an Lebererkrankungen ist, dass die Leber kein Schmerzempfinden hat und keine Warnzeichen aussendet. Mögliche Beschwerden sind eher unspezifisch. So bleibt es häufig bei der Einstufung als Alltagsbeschwerden, wie z. B. „Stress” oder „chronische Erschöpfung”. Folgende Symptome können einen ersten Hinweis auf eine Erkrankung der Leber oder Galle liefern:
- – Ständige Müdigkeit
- – Konzentrationsstörungen
- – Druckgefühl im Oberbauch
- – Juckreiz
- – lehmfarbener Stuhl und bierbrauner Urin
- – Appetitverlust
- – Ekel gegen bestimmte Speisen, v. a. Fleisch
- – Gewichtsveränderungen
- – Übelkeit und Erbrechen
- – Blähbauch
- – Nasenbluten und Blutergüsse
- – Gelbfärbung der Haut oder Augen
- – häufige Muskel- und Gelenkschmerzen
- – Verminderung der Körperbehaarung um Brust- oder Bauchbereich bei Männern
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An erster Stelle sind die Fettlebererkrankungen zu nennen, oft vergesellschaftet mit Übergewicht, Typ-2-Diabetes und übermäßigem Alkoholgenuss. Zur zweiten großen Gruppe gehören die chronische Virushepatitis B und C, die zusammen mehr als eine Million Menschen in Deutschland betreffen. Nur 20 bis 25 Prozent der Infizierten wissen etwas von ihrer Virusinfektion. Bei den Fettlebererkrankungen ist die Dunkelziffer mindestens ebenso hoch. Hinzu kommen seltenere Lebererkrankungen wie Eisen- und Kupferstoffwechselerkrankung, Autoimmunhepatitis, primär biliäre Zirrhose oder medikamentös bedingte Leberschäden. Nichtalkoholische Fettlebererkrankungen (non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD) umfassen ein Spektrum von Lebererkrankungen, das von gutartigen Steatosen bis zur nichtalkoholischen Steatohepatitis reicht (NASH).
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Alle gängigen Leberparameter, wie z. B. die Bestimmung der Transaminasen, der Alanin-Aminotransferease, der Aspartat-Aminotransferase usw., zur Diagnose verschiedener Lebererkrankungen sind unspezifisch für Lebererkrankungen (nicht leber-spezifisch). So kommen die Transaminasen in sämtlichen Muskeln vor.
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Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass erhöhte L-PK-Konzentrationen in Probandenproben signifikant auf eine Lebererkrankung hinweisen. Mit geeigneten immunchemischen Methoden und Testverfahren zur Bestimmung des Biomarkers L-PK (Pyruvatkinase der Leber) ist es erfindungsgemäß möglich, spezifisch Lebererkrankungen zu erkennen. Weiterhin erlaubt die Erfindung ein Monitoring der Lebererkrankungen und eine Therapieerfolgskontrolle.
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Es war nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen spezifischen Bestimmung von L-PK zur Verfügung zu stellen, das insbesondere den Nachweis sehr geringer Mengen an L-PK in Körperflüssigkeiten und Stuhl ermöglicht, das sehr genau und einfach durchzuführen ist und das insbesondere den spezifischen Nachweis der L-PK ermöglicht, ohne dass ebenfalls vorhandene andere Pyruvatkinase-Isoenzyme und andere im Blut, Plasma, Körperflüssigkeiten, Stuhl oder Gewebe des menschlichen Organismus vorhandenen Proteine den Nachweis stören.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung von polyklonalen und monoklonalen L-PK-spezifischen Antikörpern, die spezifisch bindefähig mit der L-PK und deren Teilstücke sind. Vorzugsweise ein besonders bindungsfähiger Antikörper für L-PK.
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Die Erfindung betrifft auch solche Teilstücke, (Polypeptide, Proteine), die eine Sequenzidentität oder Homologie von 20% und mehr, vorzugsweise von 80% und mehr, besonders bevorzugt von 90–95% und mehr (z. B. 98%, 99% oder 99,5%) mit der Aminosäuresequenz der L-PK aufweisen. Ebenfalls mit eingeschlossen sind solche analogen Aminosäure-Sequenzen, die aufgrund des Austausches von einer oder mehreren Aminosäuren(n) in diesen Sequenzen dennoch die gewünschte Funktion eines Biomarkers zur Diagnose von Lebererkrankungen/Krebs gewährleisten.
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Antiseren, die die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper enthalten, werden erhalten, indem man das Immunogen L-PK oder Fragmente desselben in den Organismus von Versuchstieren einbringt.
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Versuchstiere wie z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe oder Pferde werden in bekannter Weise immunisiert und so Antiseren mit polyklonalen Antikörpern erhalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden in entsprechender Weise monoklonale Antikörper nach der Methode von G. Köhler und C. Milstein, Nature 256, 495–497 (1975) erhalten.
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Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch mit L-PK bindefähig ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Mäuse oder Ratten mit L-PK immunisiert, B-Lymphozyten aus der Milz der immunisierten Tiere mit Myelomzellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kloniert, die Hybridomazellen, die L-PK bindungsfähige Antikörper sezernieren, isoliert, kloniert und züchtet und den durch sie gebildeten monoklonalen Antikörper gewinnt. Besonders bevorzugt für die Fusion wird eine Zelllinie verwendet, die selbst kein Immunglobulin produziert.
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Die erfindungsgemäß erhältlichen monoklonalen Antikörper reagieren nicht mit anderen Pyruvatkinase-Isoenzymen oder mit anderen Substanzen, sondern sind für L-PK spezifisch.
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Im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren werden vorzugsweise folgende Schritte durchgeführt:
- (a) Man bringt die Probe (z. B. menschliche, tierische) mit mindestens zwei verschiedenen Rezeptoren in Kontakt, von denen der erste Rezeptor R1 in fester Phase vorliegt und mit L-PK bindefähig ist, und der zweite Rezeptor R2 in flüssiger Phase vorliegt, und ebenfalls mit L-PK bindefähig ist, wobei Rezeptor R2 eine Markierung trägt oder die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt;
- (b) man trennt die feste von der flüssigen Phase;
- (c) man bestimmt die Markierung oder das detektierbare Molekül in der festen Phase nach an sich bekannten Methoden und quantifiziert entsprechend die Menge an in der Probe vorhandener L-PK, wobei man erfindungsgemäß als mindestens einen der Rezeptoren R1 oder R2 einen Antikörper verwendet, der spezifisch mit L-PK bindefähig ist und zwischen anderen Pyruvatkinase-Isoenzymen diskriminiert, d. h. keines der anderen PK-Isoenzyme bindet.
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Obwohl es selbstverständlich auch möglich ist, zwei Antikörper zu verwenden, welche beide spezifisch mit L-PK nach obiger Definition bindefähig sind, reicht es für den zweiten der Rezeptoren R1 oder R2 in der Regel aus, einen nicht so spezifischen Antikörper zu verwenden. In dem Fall, in dem als Rezeptor R1 bereits ein spezifisch nur mit L-PK bindefähiger Antikörpei verwendet wurde, liegt nach Abtrennung der flüssigen Phase nur die L-PK an diesen Rezeptor gebunden vor. Der Nachweisrezeptor R2 muss daher lediglich mit L-PK bindefähig sein, muss aber nicht unbedingt eine Diskriminierung zwischen PK-Isoenzymen erlauben.
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In dem Fall, in dem als Rezpetor R1 ein weniger spezifischer Antikörper eingesetzt wird, wird ein Rezeptor R2 verwendet, der spezifisch nur mit der L-PK bindefähig ist, sodass ein detektierbares Signal nur bei Vorhandensein von L-PK entsteht.
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Wie oben bereits erwähnt, können jedoch auch zwei spezifisch nur mit L-PK bindefähige Antikörper eingesetzt werden, um womöglich eine noch höhere Spezifität zu erreichen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man als Rezeptor R1 einen spezifisch mit L-PK bindefähigen und zwischen anderen Pyruvatkinase-Isoenzymen diskriminierenden Antikörper.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verwendet man als Rezeptor R2 einen Antikörper, der selbst eine Markierung trägt. Damit ist ein direkter Nachweis noch schneller möglich als in dem Fall, wo ein detektierbares Molekül an Rezeptor R2 gebunden ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, bei dem man als Rezeptor R2 einen enzymgebundenen Antikörper verwendet und das Verfahren als Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) oder IFA ausführt.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich z. B. ein Testkit immunochromatographischer assays zur Diagnose z. B. eines Leberschadens, der mindestens einen Rezeptor für L-PK enthält, der mit keinem anderen Pyruvatkinase-Isoenzym kreuzreagiert, sowie gegebenenfalls weitere für die Durchführung eines Assays notwendige Reagenzien.
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Das Testkit ist insbesondere für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgestaltet. Deshalb enthält das Testkit vorzugsweise einen zweiten Rezeptor R2, der eine Markierung trägt oder die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt.
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Vorzugsweise wird ein an L-PK spezifisch bindender Antikörper mittels bekannten Verfahren an eine Festphase immobilisiert. Diese Festphase ist in einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ebenfalls Bestandteil des Testkits. Die zu untersuchende Probe wird dann mit dem vorzugsweise gelösten Protein in Kontakt gebracht und in einem geeigneten Puffersystem mittels der Antikörper an die Festphase gebunden. Nach Waschen des so erhaltenen immobilisierten Antikörper-L-PK-Komplexes wird dann ein weiterer markierter, z. B. mit Biotin versehener zweiter Antikörper zugesetzt, der an ein anderes Epitop des L-PK bindet. Dann wird die Markierung bestimmt, z. B. mit Hilfe von Streptavidin-Peroxidase. Die Menge an gebundenem Marker ist direkt proportional der Menge an L-PK in der Probe. Zweckmäßigerweise enthält der Testkit Referenzmaterial bekannten Gehalts an L-PK zur quantitativen Bestimmung.
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Selbstverständlich können auch alle anderen Arten von immunologischen Nachweisverfahren, welche mit Hilfe von Antikörpern durchgeführt werden, erfindungsgemäß eingesetzt werden. Gerade auch für die tatsächliche Formulierung als Testkit sind dem Fachmann viele Alternativen bekannt, die allesamt prinzipiell für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind. So kann auch beispielsweise ein Schnelltest in Form eines Teststreifens (z. B. lateral flow, immunochromatographisches Testverfahren) konzipiert werden, auf dem in unterschiedlichen Zonen des Teststreifens die benötigten Antikörper entweder in löslicher Form oder festphasenfixiert (z. B. an Nitrocellulose, Gold, Silber, Latex, Polymerpartikel, magnetische Partikel, unterschiedlich gefärbte, ungefärbte Partikel gebunden) angeordnet sind. Die Probe bzw. der Flüssigkeitsanteil der Probe oder ein Extrakt können dann den Teststreifen durchwandern und an der Detektionsstelle ein Signal liefern, wenn L-PK in der Probe vorhanden ist.
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Die genaue Anordnung der einzelnen Komponenten auf dem Teststreifen und in der Flüssigkeit ist abhängig vom angewandten immunologischen Verfahren und vom Fachmann leicht realisierbar.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck ”Rezeptor” bzw. ”Antikörper” auch solche Teile oder Fragmente von Rezeptoren bzw. Antikörpern (z. B. gold- oder silberkonjugierte Antikörper) umfassen, welche die notwendige Bindung an L-PK noch vermitteln. Es ist hierbei auch möglich, anstelle eines einzelnen Antikörpers ein Konjugat aus zwei Antikörpern einzusetzen. Beispielsweise kann man sich vorstellen, als Rezeptor R2 einen mit L-PK bindefähigen Antikörper zu verwenden und den Nachweis über einen weiteren markierten Antikörper zu führen, welcher gerichtet ist gegen den Fc-Teil des Rezeptors R2 und eine Markierung trägt oder wiederum an ein detektierbares Molekül gekoppelt ist. Diese Konjugatbildung z. B. aus zwei Antikörpern soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfasst sein, wenn R2 so definiert ist, dass er die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt. Analoges gilt für die Bindung des Rezeptors R1 an die feste Phase. Auch diese Bindung kann über festphasen-gekoppelte Antikörper erfolgen, an welche der Fc-Teil des Rezeptors R1 bindet.
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Viele weitere Ausgestaltungen der Erfindung z. B. durch Aptamere sind denkbar und für den Fachmann ohne Weiteres durchführbar. Diese Ausgestaltungen sind daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfasst, solange sie den Nachweis der L-PK ermöglichen.
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Bevorzugt ist der lösliche Rezeptor R2 ein markierter Antikörper.
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Erfindungsgemäß ist es auch möglich, simultan Mehrfach-Analytbestimmungen durchzuführen, z. B. multiplex (fest oder flüssig Assays (Flow-Assays), Arrays, Microarrays (kompetitiv, nicht-kompetitiv), Assays (ELISA etc.) oder Biosensoren zu bestimmen, wie z. B. elektrische (Impedanz)elektrochemische, amperometrische Sensoren, potentiometrische, ionenselektive potentiometrische oder photometrische Sensoren oder auch solche mittels Halbleiterelektroden wie Feldeffekttransistoren (FET), chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET), suspended-gate-Feldeffekttransistoren (SGFET) oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige Biosensoren sind zusammenfassend in
E. A. H. Hall und G. Hummel in "Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von ionensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind unter anderem von
F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der Immunsensorik", Labor 2000, S. 70–96 (1993) beschrieben. Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächenwellenelementen, welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sog. Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobilisiert und nach Bindung mit der zu analysierenden L-PK eine Änderung der Schwingungsfrequenz des Quarzes gemessen. Derartige Sensoren sind beispielsweise von
A. Leidl et al. in "Proceedings of the Second International Symposium an Minaturized Total Analyses Systems μTAS", Basel 1996, beschrieben. Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von
C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem (1994), 349: 349–354, beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen. Signifikante Verbesserungen der Immunoassays hinsichtlich Sensitivität, Testkinetik und weiteren Punkten wie dynamic range and format flexibility können durch Anwendung der Lumineszenz, z. B. Chemilumineszens, Elektrochemilumineszenz erreicht werden. Elektrochemilumineszenz ist der Vorgang, durch den Licht erzeugt wird, wenn eine geringe Spannung an eine Elektrode angelegt wird, wodurch eine cyclische Redox-Reaktion in einem Ruthenium Metall Ion getriggert wird (
Bruno, G. (1997) Rec. Rp pp. 175–179; Williams R. (1996), Amer. Biotech., p. 26).
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Die erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörper sind, wie oben beschrieben auf an sich bekannte Weise erhältlich. Vorzugsweise wird zuerst L-PK, z. B. aus Leber isoliert (durch Anwendung der Chromatographie an DEAE Sephadex A-50 und anschließender Affinitätschromatogrophie an blauer Sepharose CL 6B), wie in der Literatur beschrieben. Danach wird ein Versuchstier mit der so erhaltenen L-PK bzw. mit Bruchstücken davon, welche die entsprechenden Epitope aufweisen, immunisiert und die gebildeten Antikörper isoliert. Derartige Bruchstücke, welche zur Immunisierung verwendet werden, können z. B. aus einer Protease-Verdauung der gereinigten L-PK stammen oder aus synthetischen Teilpeptiden derselben bestehen. Die Herstellung solcher Teilpeptide ist dem Fachmann an sich bekannt. Es werden dabei aus der Sequenz z. B. mit Hilfe von Computerprogrammen Sequenzen ausgewählt, welche entsprechende Epitope enthalten können.
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Diese Sequenzen werden dann auf ihre Verwendbarkeit zur Herstellung L-PK spezifischer Antikörper getestet.
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Vorzugsweise werden nach der Methode von Köhler, Milstein (Nature 256, 455–497 (1975) erhältliche L-PK spezifische monoklonale Antikörper verwendet.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
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Beispiel 1
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Immunoassay (ELISA)
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Eine ELISA-Platte wird mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet, der nur L-PK bindungsfähig ist. L-PK aus EDTA-Plasmaproben und aus Standards bindet an diesen Antikörper und wird dadurch an die Platte gebunden. Ein zweiter monoklonaler Antikörper, der biotinyliert ist, bindet im nächsten Inkubationsschritt an L-PK. Nachfolgend wird ein Konjugat von POD (Peroxidase und Streptavidin an die Biotineinheit des Antikörpers gebunden. Die Peroxidase oxidiert ABTS 2,2'-Azino-bis-(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonsäure)diammoniumsalz) unter Ausbildung einer dunklen grünen Farbe. Schließlich wird die Konzentration von oxidiertem ABTS photometrisch bestimmt.
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Beispiel 2
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Immunographischer Assay, Immunoassay als Teststreifen, DIP-Test oder im Lateral-Flow-Format
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Das im Testkit enthaltene Testsystem besteht aus einem getrockneten Nitrocellulosestreifen, welcher durch linienförmiges Aufbringen eines monoklonalen Antikörpers, der für L-PK bindungsfähig ist, speziell zum Zweck der Analytik produziert wurde.
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Wenige Tropfen der Probenflüssigkeit, die L-PK enthalten kann, werden an einem Ende des Nitrocellulosestreifens aufgetropft. Die Flüssigkeit breitet sich aus und wandert u. a. aufgrund von Kapillarkräften zum anderen Ende des Streifens. Ist L-PK in der Probenflüssigkeit enthalten, wird diese von den an die Nitrocellulose aufgebrachten Antikörpern gebunden und dadurch linienförmig lokal fixiert.
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Zusätzlich in der Lösung befindliche Goldpartikel, die mit einem zweiten L-PK spezifischen Antikörper beschichtet und deshalb L-PK bindungsfähig sind, können an die linienförmig lokal fixierte L-PK binden und erzeugen hierdurch für den Betrachter eine sichtbare, rötlich-braune Anfärbung der weißen Nitrocellulose. Durch diese Anfärbung ist ein spezifischer Nachweis der L-PK möglich.
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Beispiel 3
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Mehrfach-Bestimmung mittels anderer Technologien (Plattformen) Extraktion, Probenvorbereitung
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Grundsätzlich ist die Bestimmung des Markers (der Marker), evtl. nach Extraktion bzw. nach Probenvorbereitung auch mit anderen kommerziell erhältlichen immunchemischen Testsystemen, Nachweisverfahren mittels unterschiedlicher Technologien aus einem Probenbehältnis möglich (siehe Beschreibung).
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Beispiel 4
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Algorithmen
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In einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist es auch möglich, die Biomarker in entsprechender Kombinatorik unter Zuhilfenahme geeigneter mathematischer Algorithmen mit den Messergebnissen, vorzugsweise auch aus einem Probenbehältnis, auszuwerten. Vorzugsweise z. B. unter Verwendung der patentierten Auswertungsverfahren der Firma Definiens AG in München (Gründer Nobelpreisträger G. Binnig).
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Beispiel 5
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Massenspektrometrie
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Es ist auch möglich, die Biomarker mittels einer massenspektrometrischen Methode bspw. mittels MALDI-TOF, SIMS, DESI oder Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry (REIMS) nach fachüblicher Durchführung zu bestimmen. Vorzugsweise unter Verwendung von Daten-Analysen-Methoden mit geeigneten, ausgewählten mathematischen Algorithmen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- G. Köhler und C. Milstein, Nature 256, 495–497 (1975) [0011]
- E. A. H. Hall und G. Hummel in ”Biosensoren”, Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 [0028]
- F. Aberl und H. Wolf in ”Aktuelle Trends in der Immunsensorik”, Labor 2000, S. 70–96 (1993) [0028]
- A. Leidl et al. in ”Proceedings of the Second International Symposium an Minaturized Total Analyses Systems μTAS”, Basel 1996 [0028]
- C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem (1994), 349: 349–354 [0028]
- Bruno, G. (1997) Rec. Rp pp. 175–179; Williams R. (1996), Amer. Biotech., p. 26 [0028]
- Köhler, Milstein (Nature 256, 455–497 (1975) [0031]