WO2012022285A2

WO2012022285A2 - Verfahren zum nachweis von l-pk-tumormarkern im stuhl zur erkennung von lebererkrankungen

Info

Publication number: WO2012022285A2
Application number: PCT/DE2011/001412
Authority: WO
Inventors: Hans Scheefers; Ursula Scheefers-Borchel
Original assignee: Schebo Biotech Ag
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2012-02-23
Also published as: DE102010025545A1; WO2012022285A3

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung ist ein Verfahren zur Bestimmung des Biomarkers L-PK im Stuhl zum Nachweis einer Lebererkrankung, insbesondere eines Tumors.

Description

Verfahren zum Nachweis von L-PK-Tumormarkern im Stuhl zur Erkennung von Lebererkrankungen

Beschreibung Die Erfindung betrifft Verfahren zur Durchführung von Diagnosen von Lebererkrankungen oder deren Vorläuferund/oder Begleiterscheinungen, Leberläsionen, chronische Lebererkrankungen, einschließlich Tumoren der Leber, wobei eine qualitative, quantitative Bestimmung mittels eines geeigneten Biomarkers (Isoenzym L der Pyruvatkinase , L-PK, EC.2.7.1.40) erfolgt. Ferner betrifft die Erfindung die chemische Bestimmung von L-PK, deren Kombination mit anderen zum Stand der Technik gehörenden Biomarkern und deren Verrechnung mittels geeigneter Algorithmen,

insbesondere zur in-vitro Diagnostik.

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Testverfahren, Antikörper, Schnelltest, Testkit, Herstellungsverfahren eines monoklonalen, besonders bindungsfähigen anti-L-PK- Antikörpers.

Eine qualitative, quantitative Bestimmung des

Pyruvatkinase- Isoenzyms Typ L (L-PK) ist mit Hilfe von Antikörpern in Körperflüssigkeiten, im Blut, Plasma, Stuhl sowie Gewebekultur möglich. Die entsprechenden Antiseren werden erhalten, wenn man gereinigtes Pyruvatkinase- Isoenzym L (L-PK) bzw. Teils ücke desselben als Immunogen verwendet. Bevorzugt sind Antiseren mit monoklonalen

Antikörpern. Diese Antikörper lassen sich sowohl in ELISA- Testsystemen als auch in anderen immunologischen

Testsystemen (quantitativ oder qualitativ) bestimmen. Ein Testkit hierzu enthält mindestens einen L-PK

bindungsfähigen Rezeptor, der mit keinem anderen

Pyruvatkinase-Isoenzym kreuzreagiert, sowie gegebenenfalls weitere für die Durchführung des Immunoassays notwendige Reagenzien. Der Test dient der Diagnose diverser

Erkrankungen (insbesondere Lebererkrankungen) , bei denen das Isoenzym L-PK aus Zellen, insbesondere Hepatozyten durch z.B. Apoptose in Körperflüssigkeiten z.B. Blut freigesetzt wird.

Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung In Deutschland leiden etwa 5 Millionen Menschen an

Lebererkrankungen. Viele Lebererkrankungen werden erst spät erkannt. Tückisch an Lebererkrankungen ist, dass die Leber kein Schmerzempfinden hat und keine Warnzeichen aussendet. Mögliche Beschwerden sind eher unspezifisch. So bleibt es häufig bei der Einstufung als

Alltagsbeschwerden, wie z.B. „Stress" oder „chronische Erschöpfung". Folgende Symptome können einen ersten

Hinweis auf eine Erkrankung der Leber oder Galle liefern: - Ständige Müdigkeit

Konzent ationsstö ungen

- Druckgefühl im Oberbauch

Juckreiz

lehmfarbener Stuhl und bierbrauner Urin

- Appetitverlust

Ekel gegen bestimmte Speisen, v.a. Fleisch GewichtsVeränderungen

Übelkeit und Erbrechen

Blähbauch

Nasenbluten und Blutergüsse

- Gelbfärbung der Haut oder Augen

häufige Muskel- und Gelenkschmerzen

- Verminderung der Körperbehaarung um Brust- oder

Bauchbereich bei Männern An erster Stelle sind die Fettlebererkrankungen zu nennen, oft vergesellschaftet mit Übergewicht, Typ- 2 -Diabetes und übermäßigem Alkoholgenuss . Zur zweiten großen Gruppe gehören die chronische Virushepatitis B und C, die

zusammen mehr als eine Million Menschen in Deutschland betreffen. Nur 20 bis 25 Prozent der Infizierten wissen etwas von ihrer Virusinfektion. Bei den Fettlebererkrankungen ist die Dunkelziffer mindestens ebenso hoch. Hinzu kommen seltenere Lebererkrankungen wie Eisen- und Kupferstoffwechselerkrankung, Autoimmunhepatitis , primär biliäre Zirrhose oder medikamentös bedingte Leberschäden. Nichtalkoholische Fettlebererkrankungen {non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD) umfassen ein Spektrum von Lebererkrankungen, das von gutartigen Steatosen bis zur nichtalkoholischen Steatohepatitis reicht (NASH) .

Alle gängigen Leberparameter, wie z.B. die Bestimmung der Transaminasen, der Alanin-Aminotransferease, der Aspartat- Aminotransferase usw. , zur Diagnose verschiedener

Lebererkrankungen sind unspezifisch für Lebererkrankungen (nicht leber- spezifisch) . So kommen die Transaminasen in sämtlichen Muskeln vor. Relevanter Stand der Technik ergibt sich ferner aus:

WO 02/103035, WO 2001/021826 sowie Domingo et al., Journal of Histochemistry and Cytochemistry 40(1992), 665-673. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass erhöhte L-PK- Konzentrationen in Probandenstuhlproben signifikant auf eine Lebererkrankung hinweisen.

Mit geeigneten immunchemischen Methoden und Testverfahren zur Bestimmung des Biomarkers L-PK (Pyruvatkinase der Leber) ist es erfindungsgemäß möglich, spezifisch

Lebererkrankungen zu erkennen. Weiterhin erlaubt die

Erfindung ein Monitoring der Lebererkrankungen und eine Therapieerfolgskontrolle . Es war nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur . quantitativen und/oder qualitativen

spezifischen Bestimmung von L-PK zur Verfügung zu stellen, das insbesondere den Nachweis sehr geringer Mengen an L-PK im Stuhl ermöglicht, das sehr genau und einfach

durchzuführen ist und das insbesondere den spezifischen Nachweis der L-PK ermöglicht, ohne dass ebenfalls

vorhandene andere Pyruvatkinase-Isoenzyme und andere im Blut, Plasma, Körperflüssigkeiten, Stuhl oder Gewebe des menschlichen Organismus vorhandenen Proteine den Nachweis stören.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung von

polyklonalen und monoklonalen L-PK- spezifischen

Antikörpern, die spezifisch bindefähig mit der L-PK und deren Teilstücke sind. Vorzugsweise ein besonders

bindungsfähiger Antikörper für L-PK. Die Erfindung betrifft auch solche Teilstücke,

(Polypeptide, Proteine) , die eine Sequenzidentität oder Homologie von 20% und mehr, vorzugsweise von 80% und mehr, besonders bevorzugt von 90-95% und mehr (z.B. 98%, 99% oder 99,5%) mit der Aminosäuresequenz der L-PK aufweisen. Ebenfalls mit eingeschlossen sind solche analogen

Aminosäure -Sequenzen, die aufgrund des Austausches von einer oder mehreren Aminosäuren (n) in diesen Sequenzen dennoch die gewünschte Funktion eines Biomarkers zur

Diagnose von Lebererkrankungen/ Krebs gewährleisten.

Antiseren, die die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper enthalten, werden erhalten, indem man das Immunogen L-PK oder Fragmente desselben in den Organismus von

Versuchstieren einbringt.

Versuchstiere wie z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe oder Pferde werden in bekannter Weise immunisiert und so Antiseren mit polyklonalen Antikörpern erhalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden in entsprechender Weise monoklonale Antikörper nach der Methode von G.

Köhler und C. Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)

erhalten. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein

Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch mit L-PK bindefähig ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Mäuse oder Ratten mit L-PK immunisiert, B-Lymphozyten aus der Milz der

immunisierten Tiere mit Myelomzellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kloniert, die Hybridomazellen, die L-PK bindungsfähige Antikörper sezernieren, isoliert kloniert und züchtet und den durch sie gebildeten

monoklonalen Antikörper gewinnt.

Besonders bevorzugt für die Fusion wird eine Zelllinie verwendet, die selbst kein Immunglobulin produziert.

Die erfindungsgemäß erhältlichen monoklonalen Antikörper reagieren nicht mit anderen Pyruvatkinase- Isoenzymen ode mit anderen Substanzen, sondern sind für L-PK spezifisch

Im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren werden vorzugsweise folgende Schritte durchgeführt:

(a) Man bringt die Stuhlprobe {z.B. menschliche, tierische) mit mindestens zwei verschiedenen

Rezeptoren in Kontakt, von denen der erste Rezeptor Rl in fester Phase vorliegt und mit L-PK bindefähig ist, und der zweite Rezeptor R2 in flüssiger Phase vorliegt, und ebenfalls mit L-PK bindefähig ist, wobei Rezeptor R2 eine Markierung trägt oder die

Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt ;

<b)) man trennt die feste von der flüssigen Phase;

(c )) man bestimmt die Markierung oder das

detektierbare Molekül in der festen Phase nach an sich bekannten Methoden und quantifiziert

entsprechend die Menge an in der Probe vorhandener

L-PK, wobei man erfindungsgemäß als mindestens einen der Rezeptoren Rl oder R2 einen Antikörper

verwendet, der spezifisch mit L-PK bindefähig ist und zwischen anderen Pyruvatkinase -Isoenzymen diskriminiert, d.h. keines der anderen PK- Isoenzyme bindet. Obwohl es selbstverständlich auch möglich ist, zwei

Antikörper zu verwenden, welche beide spezifisch mit L-PK nach obiger Definition bindefähig sind, reicht es für den zweiten der Rezeptoren Rl oder R2 in der Regel aus, einen nicht so spezifischen Antikörper zu verwenden. In dem Fall, in dem als Rezeptor Rl bereits ein spezifisch nur mit L-PK bindefähiger Antikörper verwendet wurde, liegt nach Abtrennung der flüssigen Phase nur die L-PK an diesen Rezeptor gebunden vor. Der Nachweisrezeptor R2 muss daher lediglich mit L-PK bindefähig sein, muss aber nicht unbedingt eine Diskriminierung zwischen PK- Isoenzymen erlauben.

In dem Fall, in dem als Rezeptor Rl ein weniger

spezifischer Antikörper eingesetzt wird, wird ein Rezeptor R2 verwendet, der spezifisch nur mit der L-PK bindefähig ist, sodass ein detektierbares Signal nur bei

Vorhandensein von L-PK entsteht. Wie oben bereits erwähnt, können jedoch auch zwei

spezifisch nur mit L-PK bindefähige Antikörper eingesetzt werden, um womöglich eine noch höhere Spezifität zu erreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man als Rezeptor Rl einen spezifisch mit L-PK bindefähigen und zwischen anderen Pyruvatkinase- Isoenzymen diskriminierenden Antikörper.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verwendet man als Rezeptor R2 einen Antikörper, der selbst eine Markierung trägt. Damit ist ein direkter Nachweis noch schneller möglich als in dem Fall, wo ein detektierbares Molekül an Rezeptor R2 gebunden ist. Eine weitere

bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein

Verfahren, bei dem man als Rezeptor R2 einen

enzymgebundenen Antikörper verwendet und das Verfahren als Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) oder IFA ausführt .

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich z.B. ein Testkit immunochromatographischer assays zur Diagnose z.B. eines Leberschadens, der mindestens einen Rezeptor für L-PK enthält, der mit keinem anderen

Pyruvatkinase- Isoenzym kreuzreagiert, sowie gegebenenfalls weitere für die Durchführung eines Assays notwendige

Reagenzien.

Das Testkit ist insbesondere für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgestaltet. Deshalb enthält das Testkit vorzugsweise einen zweiten Rezeptor R2 , der eine Markierung trägt oder die Bindung an ein

detektierbares Molekül vermittelt.

Vorzugsweise wird ein an L-PK spezifisch bindender

Antikörper mittels bekannten Verfahren an eine Festphase immobilisiert. Diese Festphase ist in einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ebenfalls Bestandteil des Testkits. Die zu untersuchende Probe wird dann mit dem vorzugsweise gelösten Protein in Kontakt gebracht und in einem geeigneten Puffersystem mittels der Antikörper an die Festphase gebunden. Nach Waschen des so erhaltenen immobilisierten Antikörper-L-PK-Komplexes wird dann ein weiterer markierter, z.B. mit Biotin versehener zweiter Antikörper zugesetzt, der an ein anderes Epitop des L-PK bindet. Dann wird die Markierung bestimmt, z.B. mit Hilfe von Streptavidin-Peroxidase . Die Menge an gebundenem

Marker ist direkt proportional der Menge an L-PK in der Probe. Zweckmäßigerweise enthält der Testkit

Referenzmaterial bekannten Gehalts an L-PK zur

quantitativen Bestimmung. Selbstverständlich können auch alle anderen Arten von immunologischen Nachweisverfahren, welche mit Hilfe von Antikörpern durchgeführt werden, erfindungsgemäß

eingesetzt werden. Gerade auch für die tatsächliche

Formulierung als Testkit sind dem Fachmann viele

Alternativen bekannt, die allesamt prinzipiell für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind. So kann auch beispielsweise ein Schnelltest in Form eines Teststreifens (z.B. lateral flow,

immunochromatographisches Testverfahren) konzipiert werden, auf dem in unterschiedlichen Zonen des

Teststreifens die benötigten Antikörper entweder in löslicher Form oder festphasenfixiert (z.B. an Nitrocellulose, Gold, Silber, Latex, Polymerpartikel,

magnetische Partikel, unterschiedlich gefärbte, ungefärbte Partikel gebunden) angeordnet sind. Die Probe bzw. der

Flüssigkeitsanteil der Probe oder ein Extrakt können dann den Teststreifen durchwandern und an der Detektionsstelle ein Signal liefern, wenn L-PK in der Probe vorhanden ist. Die genaue Anordnung der einzelnen Komponenten auf dem Teststreifen und in der Flüssigkeit ist abhängig vom angewandten immunologischen Verfahren und vom Fachmann leicht realisierbar.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Rezeptor" bzw. "Antikörper" auch solche Teile oder

Fragmente von Rezeptoren bzw. Antikörpern (z.B. gold- oder silberkonjugierte Antikörper) umfassen, welche die

notwendige Bindung an L-PK noch vermitteln. Es ist hierbei auch möglich, anstelle eines einzelnen Antikörpers ein Konjugat aus zwei Antikörpern einzusetzen. Beispielsweise kann man sich vorstellen, als Rezeptor R2 einen mit L-PK bindefähigen Antikörper zu verwenden und den Nachweis über einen weiteren markierten Antikörper zu führen, welcher gerichtet ist gegen den Fe -Teil des Rezeptors R2 und eine Markierung trägt oder wiederum an ein detektierbares

Molekül gekoppelt ist. Diese Konjugatbildung z.B. aus zwei Antikörpern soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfasst sein, wenn R2 so definiert ist, dass er die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt. Analoges gilt für die Bindung des Rezeptors Rl an die feste Phase. Auch diese Bindung kann über festphasen-gekoppelte

Antikörper erfolgen, an welche der Fe -Teil des Rezeptors Rl bindet. Viele weitere Ausgestaltungen der Erfindung z.B. durch Aptamere sind denkbar und für den Fachmann ohne Weiteres durchführbar. Diese Ausgestaltungen sind daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfasst, solange sie den Nachweis der L-PK ermöglichen. Bevorzugt ist der lösliche Rezeptor R2 ein markierter Antikörper.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, simultan Mehrfach- Analytbestimmungen durchzuführen, z.B. multiplex (fest oder flüssig Assays (Flow-Assays) , Arrays, Microarrays (kompetitiv, nicht-kompetitiv) , Assays {ELISA etc.) oder Biosensoren zu bestimmen, wie z.B. elektrische

(Impedanz) elektrochemische, amperometrische Sensoren, potentiometrische , ionenselektive potentiometrische oder photometrische Sensoren oder auch solche mittels

Halbleiterelektroden wie Feldeffekttransistoren (FET) , chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET) ,

suspended-gate-Feldeffekttransistoren {SGFET) oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige

Biosensoren sind zusammenfassend in E.A.H. Hall und G. Hummel in "Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von ionensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind unter anderem von F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der Immunsensorik" , Labor 2000, S. 70-96 (1993) beschrieben. Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und

Oberflächenwellenelementen, welche als Mikrowaagen

verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper {der sog. Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobilisiert und nach Bindung mit der zu analysierenden L-PK eine Änderung der Schwingungsf equenz des Quarzes gemessen. Derartige Sensoren sind beispielsweise von A. Leidl et al . in "Proceedings of the Second International Symposium on Minaturized Total Analyses Systems μTAS" , Basel 1996 , beschrieben. Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von C. Köslinger et al . , Fresenius J. Anal. Chem (1994), 349: 349-354, beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen.

Signifikante Verbesserungen der Immunoassays hinsichtlich Sensitivität, Testkinetik und weiteren Punkten wie dynamic ränge and format flexibility können durch Anwendung der Lumineszenz, z.B. Chemilumineszens , Elektrochemi- lumineszenz erreicht werden. Elektrochemilumineszenz ist der Vorgang, durch den Licht erzeugt wird, wenn eine geringe Spannung an eine Elektrode angelegt wird, wodurch eine cyclische Redox-Reaktion in einem Ruthenium Metall Ion getriggert wird {Bruno, G. (1997) Rec.Rp pp . 175-179; Williams R. (1996), Amer. Biotech., p. 26) .

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörper sind, wie oben beschrieben auf an sich bekannte Weise erhältlich. Vorzugsweise wird zuerst L-PK, z.B. aus Leber isoliert (durch Anwendung der Chromatographie an DEAE Sephadex A-50 und anschließender Affinitätschromatogrophie an blauer Sepharose CL 6B) , wie in der Literatur beschrieben. Danach wird ein Versuchstier mit der so erhaltenen L-PK bzw. mit Bruchstücken davon, welche die entsprechenden Epitope aufweisen, immunisiert und die gebildeten Antikörper isoliert. Derartige Bruchstücke, welche zur Immunisierung verwendet werden, können z.B. aus einer Protease-Verdauung der gereinigten L-PK stammen oder aus synthetischen

Teilpeptiden derselben bestehen. Die Herstellung solcher Teilpeptide ist dem Fachmann an sich bekannt. Es werden dabei aus der Sequenz z.B. mit Hilfe von Computerprogrammen Sequenzen ausgewählt, welche

entsprechende Epitope enthalten können.

Diese Sequenzen werden dann auf ihre Verwendbarkeit zur Herstellung L-PK spezifischer Antikörper getestet.

Vorzugsweise werden nach der Methode von Köhler, Milstein (Nature 256, 455-497 (1975) erhältliche L-PK spezifische monoklonale Antikörper verwendet.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert :

Beispiel 1

Immunoassay (ELISA)

Eine ELISA- Platte wird mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet, der nur L-PK bindungsfähig ist. L-PK aus EDTA-Plasmaproben und aus Standards bindet an diesen

Antikörper und wird dadurch an die Platte gebunden. Ein zweiter monoklonaler Antikörper, der biotinyliert ist, bindet im nächsten Inkubationsschritt an L-PK. Nachfolgend wird ein Konjugat von POD (Peroxydase und Streptavidin an die Biotineinheit des Antikörpers gebunden. Die Peroxydase oxidiert ABTS 2 , 2¹ -Azino-bis- (3-ethyl-benzothiazolin-6- sulfonsäure) diammoniumsalz ) unter Ausbildung einer dunklen grünen Farbe. Schließlich wird die Konzentration von oxidiertem ABTS photometrisch bestimmt. Beispiel 2

Immunographischer Assay, Immunoassay als Teststreifen, DIP-Test oder im Lateral -Flow-Format Das im Testkit enthaltene Testsystem besteht aus einem getrockneten Nitrocellulosestreifen, welcher durch linienförmiges Aufbringen eines monoklonalen Antikörpers, der für L-PK bindungsfähig ist, speziell zum Zweck der Analytik produziert wurde.

Wenige Tropfen einer aus Stuhl gewonnenen Probenflüssigkeit, die L-PK enthalten kann, werden an einem Ende des Nitrocellulosestreifens aufgetropft. Die

Flüssigkeit breitet sich aus und wandert u.a. aufgrund von Kapillarkräften zum anderen Ende des Streifens. Ist L-PK in der Probenflüssigkeit enthalten, wird diese von den an die Nitrocellulose aufgebrachten Antikörpern gebunden und dadurch linienförmig lokal fixiert . Zusätzlich in der Lösung befindliche Goldpartikel, die mit einem zweiten L-PK spezifischen Antikörper

beschichtet und deshalb L-PK bindungsfähig sind, können an die linienf rmig lokal fixierte L-PK binden und erzeugen hierdurch für den Betrachter eine sichtbare, rötlich-braune Anfärbung der weißen Nitrocellulose. Durch diese Anfärbung ist ein spezifischer Nachweis der L-PK möglich . Beispiel 3

Mehrfach-Bestimmung mittels anderer Technologien

(Plattformen) Extraktion, Probenvorbereitung Grundsätzlich ist die Bestimmung des Markers (der

Marker), evtl. nach Extraktion bzw. nach

Probenvorbereitung auch mit anderen kommerziell

erhältlichen immunchemischen TestSystemen,

Nachweisverfahren mittels unterschiedlicher Technologien aus einem Probenbehältnis möglich (siehe Beschreibung) .

Beispiel 4

Algorithmen

In einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist es auch möglich, die Biomarker in entsprechender

Kombinatorik unter Zuhilfenahme geeigneter mathematischer Algorithmen mit den Messergebnissen, vorzugsweise auch aus einem Probenbehältnis, auszuwerten. Vorzugsweise z.

B. unter Verwendung der patentierten Auswertungsverfahren der Firma Definiens AG in München (Gründer

Nobelpreisträger G. Binnig) .

Beispiel 5

Massenspektrometrie

Es ist auch möglich, die Biomarker mittels einer

massenspektrometrischen Methode bspw. mittels MALDI-TOF, SIMS, DESI oder Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry (REIMS) nach fachüblicher Durchführung zu bestimmen. Vorzugsweise unter Verwendung von Daten- Analysen-Methoden mit geeigneten, ausgewählten

mathematischen Algorithmen.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zum selektiven, qualitativen oder/und quantitativen Nachweis des Pyruvatkinase- Isoenzyms vom Typ L-PK, welches als Biomarker dient, in menschlichem oder tierischem Stuhl zum Nachweis eines pathologischen Geschehens der Leber, dadurch gekennzeichnet, dass man die L-PK mit Hilfe mindestens eines Rezeptors, der mit keinem anderen Pyruvatkinase-Isoenzym kreuzreagiert, nach dem Prinzip eines Immunoassays bestimmt, wobei der Rezeptor auch ein Aptamer sein kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Stuhlprobe mit mindestens zwei verschiedenen Rezeptoren in Kontakt bringt, von denen der erste Rezeptor Rl in fester Phase vorliegt und mit L-PK bindefähig ist und der zweite Rezeptor R2 in flüssiger Phase vorliegt und ebenfalls mit L-PK bindefähig ist und wobei Rezeptor R2 eine

Markierung trägt oder die Bindung an ein

detektierbares Molekül vermittelt, b) die feste von der flüssigen Phase trennt, oder die Messung mittels physikalisch unterscheidbarer Partikel mit so genannten „ Flow-Messverfahren" durchführt , die Markierung oder das detektierbare Moleküls in der festen Phase bestimmt und entsprechend die Menge an in der Probe vorhandener L-PK quantifiziert, wobei man als mindestens einen der Rezeptoren Rl oder R2 einen Antikörper verwendet, der spezifisch mit L-PK bindefähig ist und für andere PK- Isoenzyme nicht bindefähig ist, d.h. zwischen anderen

Pyruvatkinase- Isoenzymen diskriminiert .

Verfahren nach Anspruch 2,

dadurch gekennzeichnet, dass man den spezifisch mit L-PK bindefähigen und zwischen anderen

Pyruvatkinase- Isoenzymen diskriminierenden

Antikörper als Rezeptor Rl oder R2 einsetzt.

Verfahren nach einem der vorhergehenden

Ansprüche,

dadurch gekenr.zeich.net, dass man einen

Antikörper als Rezeptor R2 verwendet, der eine Markierung trägt .

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

dadurch gekennzeichnet,

dass man einen Enzym-gebundenen Antikörper als Rezeptor R2 oder Rl verwendet und das Verfahren als immunochemisch durchführt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,

dass man immunographische und/oder Bead-Assays (z.B. magnetisch oder nicht-magnetisch) oder Assays im Säulenformat unter Verwendung von poly- oder monoklonalen Antikörpern, die z.B. an Gold, Silber, Latex-, Partikeln {magnetisch, nicht-magnetisch, oder unterschiedlich

gefärbt) , Nitrozellulose usw. gebunden sind oder ungebunden in so genannten „Flow- Messverfahren" , verwendet.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,

dass die Biomarkerkonzentration mittels Arrays, Biosensoren, unter Verwendung unterschiedlicher chemischer und/oder physikalischer

Detektionsmethoden und unter Zuhilfenahme ausgewählter mathematischer Algorithmen, auch in Kombinatorik mit anderen

1ebererkrankungsspezif ischen Biomarkern

bestimmt und ausgewertet wird.

Testki (s) enthaltend Reagenzien und Hilfsmittel für die Durchführung der erfindungsgemäßen

Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7.

Verfahren zum Nachweis einer Lebererkrankung, insbesondere eines Lebertumors, dadurch

gekennzeichnet, dass L-PK (Pyruvatkinase der Leber) im Stuhl eines Menschen gemessen wird.

10. Verfahren zum Nachweis einer Lebererkrankung, gemäß Anspruch 1, mittels Anwendung eines

Bestimmungsverfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-7.