DE602004004775T2 - Verfahren zur Diagnose von Leberfibrose. - Google Patents
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Description
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Hepatologie und Leberfibrose. Insbesondere betrifft sie eine Gruppe von serologischen Markern, die zur Diagnose von Leberfibrose, speziell zur Diagnose von durch chronische HCV-Infektion verursachter Leberfibrose, herangezogen werden können. Diese Marker können zur Überwachung der therapeutischen Behandlung von Leberfibrose eingesetzt werden.
- Hintergrund der Erfindung
- Fibrotische Lebererkrankungen stellen weltweit die achthäufigste Todesursache dar, die jährlich 1,3 Millionen Leben fordert (Murray und Lopez, 1997, Lancet 349, 1269-1276). Die zellulären Mechanismen der Fibrose sind komplexer Natur. Infolge einer Leberschädigung, beispielsweise hervorgerufen durch chronische Hepatitis C-Virus (HCV)-Infektion, Hepatitis B-Virus (HBV)-Infektion, alkoholische Lebererkrankung oder Fettlebererkrankung, medikamenteninduzierte Lebererkrankung oder primäre biliäre Zirrhose, werden die normalerweise im Ruhezustand befindlichen Lebersternzellen zu proliferierenden Myofibroblasten aktiviert. Diese Zellen erzeugen extrazelluläre Matrixproteine und setzen Gewebeinhibitoren von Metallproteinasen frei, die an für den Narbenabbau verantwortliche Metallproteinasen binden und diese inaktivieren. Dies kann infolge erhöhter Produktion von Gewebe und Proteinen wie Kollagen sowie verminderten Abbaus dieser Verbindungen zu verstärkter Fibrose und Narbenbildung führen, wodurch die Leberfunktion beeinträchtigt wird (McHutchinson 2004, CME Newsletter Tx Reporter Gastroenterology, 2-4).
- Bei der Leberfibrose handelt es sich um einen reversiblen Prozess mit Anhäufung extrazellulärer Matrix, bei der Leberzirrhose allerdings um einen irreversiblen Prozess, der durch das Parenchym vollständig unter Knötchenbildung umgebende dicke Matrixbänder geprägt ist. Unbehandelt kann Leberfibrose zu Leberzirrhose führen, eventell zu Krebs. Aus diesen Gründen ist die zeitgerechte und präzise Diagnosestellung von Leberfibrose für die wirksame medizinische Behandlung wesentlich.
- Derzeit gilt die Leberbiopsie noch immer als der Goldstandard zur Beurteilung von Fibrose und Entzündung. Empfohlen wird die Durchführung einer Leberbiopsie zwecks Feststellung des Schweregrades bzw. des Stadiums der Erkrankung, Bestätigung der Diagnose sowie Erhebung eines Befundes als Vergleichsgrundlage für die Erfassung der Besserung bzw. des Fortschreitens der Erkrankung, Hilfestellung bei der Prognosestellung und bei der Entscheidung über die Notwendigkeit einer Behandlung (McHutchinson, s.o.; eine Übersicht findet sich in Gebo et al, 2002 Hepatology 36, 161-172).
- Es existiert eine Reihe histologischer Systeme zur semiquantitativen Bewertung der Ausprägung der Leberfibrose und -entzündung bei Patienten mit chronischer Hepatitis C. Das METAVIR-System wird am häufigsten zur Einstufung verwendet (Bedossa et al., 1994, Hepatology, 20, 15-20). Leberfibrose wird im METAVIR-Scoring-System in 5 Stadien von F0 bis F4 eingeteilt. F0 steht für keine Fibrose, F1 für leichte Fibrose (portale Fibrose ohne Septen). Die mäßige bis schwere Fibrose wird in F2 bis F4 eingeteilt (F: wenige Septen, F3: zahlreiche Septen ohne Zirrhose), Stadium F4 entspricht dem Endstadium der Zirrhose. Ab Stadium F ≥ 2 wird die Fibrose als klinisch signifikant erachtet.
- Allerdings birgt die Anwendung der Leberbiopsie zur Diagnose und zum Staging von Fibrose einige Nachteile. Bei der Leberfibrose können Entnahmefehler auftreten, so dass die geringe Probenmenge eventuell nicht den tatsächlichen Zustand der gesamten Leber widerspiegelt. Sie ist an sich kein präziser Marker für den stetig fortschreitenden Abbauprozess. Weiterhin interpretieren Pathologen histologische Proben häufig unterschiedlich, wobei eine Variabilität sowohl zwischen den Gutachtern untereinander als auch hinsichtlich des einzelnen Gutachters bei 10 bis 20% der Biopsien auftritt (Cadranel et al. 2000, Hepatology 32, 477-481).
- Die Durchführung einer Leberbiopsie stellt für den Patienten einen invasiven und schmerzhaften Eingriff dar, der zudem auch mit einem Blutungsrisiko und anderen Komplikationen nach Probenentnahme verbunden ist. Der Eingriff ist auch ferner teils wegen der erwarteten Komplikationen und darauf folgendem Krankenhausaufenthalt des Patienten kostspielig.
- Leberfibrose stellt die Hauptkomplikation einer chronischen HCV-Infektion dar, die zur Entwicklung von Zirrhose und dekompensierter Lebererkrankung führt. Die gezielte Untersuchung von Entwicklung und Progression der Fibrose ist daher für die effektive Versorgung dieser Patienten wesentlich. Die Beurteilung fortschreitender Fibrose ist am besten mit nichtinvasiven Tests, die zur Abgrenzung von Zwischenstadien der Fibrose in der Lage sind, durchzuführen. Zwar wurden bisher verschiedene Einzelmarker sowie Algorithmen für ganze Markergruppen veröffentlicht, jedoch steht derzeit kein aussagekräftiger einzelner Biomarker oder ein Biomarker- Score zur Verfügung, der eine zuverlässige Prognose für die Fibrose zulässt (diagnostische Präzision DP >80%). Im Rahmen der National Institutes of Health Consensus Development Konferenz im Jahre 2002 wird dringend dazu aufgerufen, weiter im Bereich der Entwicklung nichtinvasiver dynamischer Messgrößen für Leberfibrose zu forschen. Insbesondere sollten Untersuchungen von Leberbiopsie-Alternativen ausreichend Einzelheiten zu den Biopsieverfahren liefern (Durchschnittsgröße von Biopsieproben; histologisch hinreichend charakterisierte Qualifikatorengruppe), um die Leser von der Angemessenheit eines Referenzstandards zu überzeugen. Die Leberbiopsie hängt sehr von optimierten Durchführungskriterien ab und kann aufgrund der Variabilität zwischen Gutachtern bzw. wegen zu geringer Probengröße (< 10 mm) zur inkorrekten Klassifizierung der histologischen Stadien führen.
- Es wurde weitreichend nach biochemischen bzw. serologischen Markern, die die fibrotischen Prozesse bei der Lebererkrankung widerspiegeln und als Ersatz für die Leberbiopsie dienen können, gesucht. In den letzten Jahren wurden einige nichtinvasive oder minimal invasive biochemische und serologische Marker zur Unterstützung der Diagnosestellung von Lebererkrankungen untersucht. Insbesondere wurden Kombinationen von Markern zur Einteilung der Patienten nach Stadium bzw. Ausprägung der Fibrose eingesetzt.
-
US 6,631,330 offenbart die Verwendung einer Kombination aus mindestens 4 biochemischen Markern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-2-Makroglobulin, Aspartataminotransferase, γ-Glutamyltranspeptidase, γ-Globulin, Gesamtbilirubin, Albumin, α1-Globulin, α2-Globulin, Haptoglobin, β-Globulin, apoA1, IL-10, TGF-β1, apoA2 und ApoB. Die von 4 dieser Marker erhobenen Werte werden zur Ermittlung des Vorliegens von Leberfibrose mathematisch kombiniert. Anhand dieser Markergruppe lässt sich eine diagnostische Präzision von etwa 80 Prozent erzielen. - Die internationale Patentanmeldung WO 2003/073822 beschreibt ein Verfahren zur Diagnostizierung des Vorliegens bzw. des Schweregrades von Leberfibrose bei einem Patienten. Dabei findet die Kombination von mindestens 3 Markern, bei denen es sich um α-2-Makroglobulin, Hyaluronsäure und Gewebeinhibitor von Metallproteinase 1 (TIMP-1) handelt, Einsatz. Anhand dieses Verfahrens lässt sich eine diagnostische Präzision von etwa 80 Prozent (McHutchinson, 2004, s.o.) erzielen.
- Es besteht Bedarf an der Entwicklung eines nichtinvasiven oder minimal invasiven Verfahrens, um bei der Feststellung von Leberfibrose eine höhere diagnostische Präzision zu erreichen und mit größerer Sicherheit als im bisher bekannten Stand der Technik verschiedene Fibrose-Stadien klassifizieren und voneinander unterscheiden zu können, so dass eine Überwachung des Fortschreitens der Fibrose und des Ansprechens auf die Therapie möglich wird. Ferner sollte sich ein derartiges Verfahren für Reihenuntersuchungen mittels Analyseautomaten eignen.
- Beschreibung der Erfindung
- Das Problem wird durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung gelöst. Dieses Verfahren zum Nachweis des Vorliegens und/oder des Schweregrads einer Lebererkrankung bei einem Patienten, besteht darin, dass
- a) in einer von einem Patienten gewonnenen Probe TIMP-1 (Gewebeinhibitor von Metallproteinase I) gemessen wird
- b) in dieser Probe A2M (α-2-Makroglobulin) gemessen wird
- c) in dieser Probe PLT (Thrombozytenzahl) gemessen wird
- d) in dieser Probe PI (Prothrombinindex) gemessen wird
- e) in dieser Probe fakultativ mindestens ein zusätzlicher Parameter ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Harnstoff und GGT (γ-Glutamyltranspeptidase) gemessen oder bestimmt wird
- f) in dieser Probe fakultativ mindestens ein zusätzlicher biochemischer oder klinischer Parameter gemessen wird
- g) auf Grundlage des Vorhandenseins von/der Messwerte für TIMP-1, A2M, PLT, PI und des gemäß Schritt e) und f) gemessenen Parameters das Vorliegen und/oder der Schweregrad einer Lebererkrankung diagnostiziert wird.
- Die vorliegende Erfindung gestattet eine zuverlässige Differenzierung zwischen Fibrose Stadium F0/F1 und Stadien F2/F3/F4. Zudem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine therapeutische Überwachung zur Kontrolle der medizinischen Behandlung von Lebererkrankungen.
- Zwischen dem Verfahren der vorliegenden Erfindung und den hinreichend charakterisierten Metavir-Stadien für Leberfibrose besteht eine enge Korrelation. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber Verfahren aus dem Stand der Technik besteht in der Verwendung einer Qualifikatorengruppe zur Minimierung der Fehlerhäufigkeit bei der Klassifizierung pathologischer Beobachtungen und bei statistischen Modellen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst ein mit dem anhand einiger Verfahren bestimmten Schweregrad der Fibrose eng korrelierendes nichtinvasives Verfahren: Bei diesen Verfahren handelt es sich um Leberbiopsie und weitere Verfahren wie die Erhebung des Fibroseareals.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf einer statistisch relevanten Probenkohorte von Patienten mit hinreichend charakterisierter Leberfibrose, die das gesamte Spektrum der Metavir-Stadien abdeckt, und auf Proben von Personen ohne histologisch befundete Leberfibrose (Metavir-Score: 0). Der Metavir-Score ist das erste Kriterium bei der Auswahl der Proben. Dieser Referenzwert wird durch Doppelbestimmung und optimiert durch Verwendung von Proben einer Größe von mehr als 15 mm bestätigt.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine zuverlässige Prognose der Fibrose mit einer diagnostischen Präzision (DP) von mindestens 85%, bevorzugt mindestens 87%. Da selbst der Referenzstandard – was die fakultative inkorrekte Klassifizierung von Fibrose-Stadien betrifft – nicht den Goldstandard bei der Leberfibrose darstellt und ferner dem Patienten Schmerzen bereitet und ihn einem Gesundheitsrisiko aussetzt, repräsentiert das erfindungsgemäße Verfahren eine Alternative zur Biopsie.
- Das Verfahren erlaubt die Untersuchung von Entwicklung und Progression der Fibrose und stellt eine effektive Versorgung von Patienten mit chronischer HCV bereit. Im Vergleich zur Biopsie kann die Krankheitsüberwachung bei Patienten mit chronischer HCV innerhalb eines kurzen Zeitraums durchgeführt werden. Mit dem Verfahren lässt sich der Erfolg der antifibrotischen Therapie mitverfolgen.
- Mit dem Verfahren können auch Entwicklung und Progression von Fibrose bei Patienten mit chronischer Leberschädigung untersucht werden. Dabei handelt es sich um eine relativ häufige Erkrankung, die zwar mit geringfügigen Symptomen, langfristig jedoch mit einem erheblichen Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko einhergeht, und pathologisch durch fortschreitende Lebernekrose und Entzündungen an der Leber charakterisiert ist, häufig begleitet von Fibrose. HCV stellt die häufigste Form von chronischer Leberschädigung dar. Das Verfahren kann auf weitere Formen chronischer Leberschädigung angewendet werden: alkoholische Steatohepatitis (ASH), alkoholische Fettleber (AFLD), nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) oder nichtalkoholische Fettleber (NAFLD). Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Überwachung des Schweregrads von NASH und NAFLD eingesetzt werden. Sie können zur Diagnose von Leberfibrose bei einer Person mit Virushepatitis wie Hepatitis A-, B-, C- oder D-Virus oder Humanimmundefizienz-Virus (HIV), chronisch persistierender oder chronisch aktiver Hepatitis, autoimmuner Lebererkrankung wie autoimmuner Hepatitis oder medikamenteninduzierter Lebererkrankung; primärer biliärer Zirrhose, primärer sklerosierender Cholangitis, biliärer Atresie, von medizinischer Behandlung herrührender Lebererkrankung oder angeborener Lebererkrankung verwendet werden. Die Erfindung kann zur Überwachung der Behandlung mit einem potentiell leberpathologischen Arzneimittel eingesetzt werden.
- Entsprechend der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den bevorzugten Parameterkombinationen um TIMP-1, A2M, PLT, PI (auch mit SNIFF 4c – der französischen Abkürzung für nichtinvasiver Score für Leberfibrose – bezeichnet) mit einer diagnostischen Präzision von 84%; TIMP-1, A2M, PLT, PI, Harnstoff (SNIFF 5a) mit einer diagnostischen Präzision von 84%; und TIMP-1, A2M, PLT, PI, Harnstoff, GGT (SNIFF 6b) mit einer diagnostischen Präzision von 87,4%. Diese bevorzugten Kombinationen finden sich ebenfalls in Tabelle 3.
- Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind die spezifischen Termini und Ausdrücke wie folgt zu verstehen:
Diagnostische Präzision (DP) bezeichnet die Präzision des Tests an sich. Konkret den Prozentsatz aller Tests, die eindeutig positiv oder eindeutig negativ sind. Die Testergebnisse sind umso verlässicher, je höher die diagnostische Präzision liegt. DP errechnet sich aus der Summe der eindeutig positiven und eindeutig negativen Ergebnisse dividiert durch die Gesamtzahl der Probenergebnisse und unterliegt dem Einfluss der Prävalenz von Fibrose in der analysierten Population. - Der Cut-off-Wert stellt die mathematisch errechnete Konzentration eines einzelnen Biomarkers oder einer Kombination mehrerer Biomarker zur Unterscheidung zwischen Vorliegen und Nichtvorliegen einer Erkrankung dar. Im Sinne der Erfindung liegt der Cut-off-Wert bei einem Score von 0,5. Ein Wert von größer gleich 0,5 (≥ 0,5) weist darauf hin, dass in Abgrenzung zu keiner oder leichter Fibrose (Metavir-Stadien F0 bzw. F1) oder klinisch signifikanter Fibrose (CSF, Metavir-Stadien F2, F3, F4) nunmehr Metavir-Stadium F2 erreicht worden ist.
- Positiver prädiktiver Wert (PPV) bezeichnet den Prozentsatz an positiven Tests, die eindeutig positiv sind.
- Negativer prädiktiver Wert (NPV) bezeichnet den Prozentsatz an negativen Tests, die eindeutig negativ sind.
- Score steht für die mathematische Kombination mehrerer mit Fibrose in Zusammenhang stehender Biomarker. Der hier verwendete Score steht insbesondere für den Bereich 0 (minimale Fibrose) bis 1 (CSF: klinisch signifikante Fibrose).
- AUROC steht für Fläche unter der Receiver-Operator-Characteristics (ROC)-Kurve. Bei diesen Kurven wird die Sensitivität gegen den Reziprokwert der Spezifität aufgetragen. Eine Fläche unter der ROC-Kurve von 1,00 würde für den Idealfall von 100 Prozent Sensititivät und 100 Prozent Spezifität stehen. Je größer die Steigung zu Beginn der Kurve, umso besser die Relation zwischen Sensitivität und Spezifität eines Tests.
- Sensitivität bezeichnet die Wahrscheinlichkeit eines positiven Testergebnisses bei einem Patienten, bei dem eine Erkrankung, ein Risikofaktor oder ein anderer Krankheitszustand vorliegt.
- Spezifität bezeichnet die Wahrscheinlichkeit eines negativen Testergebnisses bei einem Patienten, bei dem die Erkrankung nicht vorliegt.
- Bei TIMP-1 (Gewebeinhibitor von Metallproteinase I) handelt es sich um ein aus 184 Aminosäuren bestehendes Sialoglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 28,5 kDa (siehe z.B. Murphy et al. Biochem J. 1981, 195, 167-170), das Metallproteinasen wie interstitielle Kollagenase MMP-1 oder Stromelysin oder Gelatinase B inhibiert. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff TIMP-1 ein Protein mit signifikanter struktureller Homologie zu Human-TIMP-1, die die proteolytische Aktivität von Metallproteinasen inhibiert. Human-TIMP-1 kann durch Verwendung spezifisch die Epitope von TIMP-1 erkennender Antikörper nachgewiesen werden. TIMP-1 kann auch durch Nachweis verwandter Nukleinsäuren wie der entsprechenden mRNA festgestellt werden.
- Bei A2M (α-2-Makroglobulin) handelt es sich um ein konserviertes Protein, das in großen Mengen im Plasma vorliegend als Protease-bindendes Protein zur Eliminierung aktiver Proteasen aus Gewebeflüssigkeiten dient. Die Wirkung von A2M besteht nicht in der Inaktivierung der katalytischen Aktivität einer Protease, sondern in der physischen Ummantelung der Zielprotease durch Einhüllen derselben. Eine vom A2M umhüllte Protease wird somit sterisch an der Abspaltung ihrer Substratproteine gehindert. Im Sinne der Erfindung kann A2M durch ein spezifische Antikörper einsetzendes immunologisches Assay entsprechend dem Fachmann bekannten Testformaten nachgewiesen werden. A2M kann auch durch Nachweis verwandter Nukleinsäuren wie der entsprechenden mRNA festgestellt werden.
- PLT (Thrombozytenzahl) steht für die Anzahl der Blutplättchen (Thrombozyten) und wird durch Zählen derselben in einem handelsüblichen Zellzähler erhoben.
- PI (Prothrombinindex) dient zum Nachweis von Interferenzen im Koagulationssystem und kann durch Versetzen der Plasmaprobe mit Thromboplastin und Messen der Zeit bis zur Gerinnung in Sekunden (Quick-Zeit) erhoben werden. Dieser Wert wird mit einem International Normalized Ratio in Korrelation gesetzt, der über einen Korrekturfaktor zur Berücksichtigung der Sensitivität des eingesetzten Thromboplastins umfasst.
- Erfindungsgemäß können zusätzliche biochemische oder klinische Parameter bestimmt werden. Bei den zusätzlichen biochemischen Parametern kann es sich um alle direkt oder indirekt mit dem Metabolismus oder der Struktur der Leber im Zusammenhang stehende Parameter handeln, wie beispielsweise Ferritin, Hyaluronat, AST (Aspartataminotransferase), MMP-2 (Matrixmetallproteinase-2), ALT (Alaninaminotransferase), PIIINP (N-ständiges Propeptid des Typ-III-Prokollagens), Bilirubin, Haptoglobin, ApoA1. Weiterhin können Hepcidin oder Adiponectin bestimmt werden.
- Bei Hepcidin handelt es sich um ein von der Leber synthetisiertes Eiweiß, das ursprünglich als zirkulierendes antimikrobielles Peptid identifiziert wurde. Es stellt ein wichtiges Verbindungsglied zwischen den Eisenreserven im Körper und der Eisenaufnahme in den Darmzellen dar. Adiponectin wird von den Fettzellen sezerniert und zirkuliert zur Beeinflussung der Stoffwechselfunktion in relativ hohen systemischen Konzentrationen. Reduzierte Adiponectinspiegel im Serum weisen auf ein erhöhtes Erkrankungsrisiko hin, beispielsweise schwere Ausprägung von nichtalkoholischer Fettleber (NAFLD) oder nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH).
- Als zusätzliche klinische Parameter können Alter, Geschlecht, Gewicht, Ernährungsgewohnheiten des Patienten erhoben werden.
- Die Bestimmung von Harnstoff, GGT (Gammaglutamyltransferase), Ferritin, Hyaluronat, AST (Aspartataminotransferase) und ALT (Alaninaminotransferase), Ferritin, MMP-2, PIIINP, Bilirubin, Haptoglobin, ApoA1, Hepcidin und Adiponectin erfolgt mittels handelsüblicher Testkits unter Anwendung von dem Fachmann bekannten immunologischen oder photometrischen Verfahren. Gegebenenfalls können zur Bestimmung eines Parameters auch Hybridisierungsverfahren zum Nachweis von für einen Analyten oder Parameter spezifischen Nukleinsäuren (beispielsweise die entsprechende mRNA) eingesetzt werden.
- Die Erfindung bedient sich der Bestimmung von mehreren Parametern. Daher erfolgt der Nachweis jener erfindungsgemäßer biochemischer und serologischer Parameter, die anhand von Festphasen-Testsystemen durchgeführt werden können, bevorzugt an wie in US 2003/0017616 und WO 99/67643 beschriebenen miniaturisierten Array-basierenden Testsystemen. Diese verfügen über mehrere räumlich definierte Testfelder, die jeweils zum Nachweis eines einzelnen spezifischen Analyten oder Parameters eingesetzt werden können. Dies ermöglicht den Nachweis mehrerer Analyten in einem einzigen Testlauf.
- Der Begriff definierte Testfelder auf Festphase bedeutet, dass die Testfelder definierte Festphasenbereiche umfassen, die bevorzugt von anderen Testfeldern durch inerte Bereiche räumlich getrennt sind. Der Durchmesser dieser definierten Testfelder beträgt vorzugsweise 10 μm bis 1 cm und besonders bevorzugt 10 μm bis 5 mm. Ganz besonders bevorzugt sind miniaturisierte Testfelder mit einem Durchmesser von 10 μm bis 2 mm. Festphasen mit mehreren Testfeldern sind bevorzugt und werden auch als Array-Systeme bezeichnet. Derartige Array-Systeme werden beispielsweise in Ekins und Chu (Clin. Chem. 37, 1995, 1955-1967) und in den US-Patentschriften Nr. 5,432,099, 5,516,635 und 5,126,276 beschrieben. Wie bereits erwähnt, liegt der Vorteil von Array-Systemen darin, dass Bestimmungen auf mehrere Analyten und Kontrollen gleichzeitig an einer Probe durchgeführt werden können.
- Durch die Verwendung von Kontrollfeldern zum Nachweis von Proben mit nichtspezfischen Bindungs- bzw. Interferenzreaktionen kann die Verlässlichkeit der Resultate insbesondere bei miniaturisierten Array-Testsystem erheblich verbessert werden.
- Bei der vorliegenden Erfindung könnte der Nachweis von TIMP-1 und A2M und eventuell zusätzlichen anderen biochemischen Parametern, die sich für Festphasenbasierende Nachweisverfahren eignen, beispielsweise durch Einsatz eines derartigen Array-basierenden Testsystems gleichzeitig erfolgen.
- Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Festphase um einen beliebigen gängigen Träger für Nachweisverfahren, vorzugsweise um einen nichtporösen Träger, z.B. einen Träger mit einer Plastik-, Glas-, Metall- oder Metalloxidoberfläche. Poröse Träger wie Teststreifen sind ebenfalls geeignet. Auf diesem Träger befinden sich räumlich voneinander abgegrenzte Bereiche (Testfelder). Auf diese werden immobilisierte Festphasen-Rezeptoren aufgebracht. Die Immobilisierung der Festphasen-Rezeptoren erfolgt nach bekannten Methoden, z.B. durch direkte adsorptive Bindung, kovalente Kupplung oder Kupplung über hochaffine Bindungspaare, z.B. Streptavidin (oder Avidin)/Biotin, Antigen/Antikörper oder Zucker/Lectin. Das Vorliegen bzw. die Menge des Analyten in einer Probe kann aus der spezifischen Bindung von Komponenten aus dem Nachweismedium bestimmt werden, z.B. des zu bestimmenden Analyten oder eines zum Festphasen-Rezeptor analogen Analyten.
- Der Nachweis von Parametern unter Verwendung von Festphasen-Arrays kann natürlich auch mittels konventionellen, nicht miniaturisierten Systemen wie Mikrotiterplatten, Röhrchen oder Beads erfolgen.
- Der Nachweis des Analyten und gegebenenfalls der Nachweis von Interferenzreaktionen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in bekannter Weise durch Verwendung geeigneter Markergruppen, z.B. Fluoreszenzmarkergruppen, bewerkstelligt. Alternativ dazu ist es bei geeigneten Festphasen möglich, auch die Interaktion von Komponenten des Nachweismediums mit den Test- und fakultativ den Kontrollfeldern durch Bestimmung der Schichtdicke des entsprechenden Feldes, beispielsweise durch Plasmonresonanzspektroskopie, nachzuweisen.
- Bei Array-Systemen zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Analyten aus einer Probe wird bevorzugt eine universelle Markergruppe eingesetzt, die den gleichzeitigen Nachweis mehrerer unterschiedlicher Analyten auf verschiedenen Testfeldern ermöglicht. Ein Beispiel für derartige universelle Markergruppen sind Markergruppen, die einen spezifisch mit einem auf einem Testreagens befindlichen komplementären Rezeptor interagierenden Rezeptor tragen, beispielsweise einen löslichen Rezeptor für einen zu bestimmenden Analyten oder für ein Analytenanalogon (wie etwa Antikörper/Antigen oder Streptavidin/Biotin etc.).
- Der Begriff Probe bezeichnet eine biologische Probe, die (vermutlich) mindestens einen der erfindungsgemäßen Marker enthält. Als Probe kann beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Synovialflüssigkeit oder Lebergewebe verwendet werden. Flüssige Proben können erforderlichenfalls vor der Analyse verdünnt werden.
- Zum Erhalt eines bei der Diagnose einer Krankheit unterstützenden Ergebnisses werden dem Fachmann bekannte mathematische Algorithmen verwendet. Die erhobenen Daten werden kombiniert und mittels statistischer Verfahren wie logistischer binärer Regression, unter Erhalt eines Scores, evaluiert.
-
1 zeigt an 120 Patienten mit HCV-Infektion gemessene Rohdaten. -
2 zeigt die Verteilung eines der bevorzugten Scores (SNIFF 6b) und einer im Stand der Technik eingesetzten Kombination mittels Fibrotest in Abhängigkeit vom Metavir F-Stadium. Es ist ersichtlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Fibrotest-Verfahren Patienten weniger häufig unkorrekterweise den Metavir-Stadien F3 und F4 zuordnet. Insbesondere klassifiziert der SNIFF 6b-Score nur eine einzige Probe im Stadium F3 fälschlicherweise als negativ (Score unterschreitet den Wert 0,5), während dies beim Fibrotest bei mehreren Proben geschieht. - Im Einzelnen umfasst der Fibrotest-Score die Kombination von A2M, Haptoglobin, ApoA1, Bilirubin, GGT, Alter und Geschlecht eines Patienten. Diese sieben Parameter im Fibrotest erreichen eine DP von etwa 80%, im Vergleich zu dem Sniff 6b-Score mit einer DP von über 87% (siehe auch Tabelle 3).
-
3 zeigt die ROC-Kurven für klinisch signifikante Fibrose-Gruppen entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren (SNIFF 6b) im Vergleich zum Verfahren aus derUS 6,631,330 (Fibrotest 7). Die ROC-Kurve für die Erfindung ergibt eine größere Steigung und einen höheren AUROC-Wert als das Verfahren aus dem Stand der Technik: AUROC 0,920 ± 0,036 (SNIFF 6b) gegenüber 0,857 ± 0,026 (Fibrotest 7). - Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel eingehender erläutert:
- Beispiel
- Unter Verwendung von handelsüblichen Testkits wurden alle Tests entsprechend den Anweisungen der nachstehend angeführten Hersteller durchgeführt. Tabelle 1
-
1 zeigt an Proben von 120 an HCV-Infektion leidenden Patienten bestimmte Rohdaten. Die Daten wurden unter Verwendung der zuvor angeführten Testkits erhoben. - Tabelle 2 listet Werte zur diagnostischen Präzision (DP) und AUROC. Es wird ersichtlich, dass für jeden einzelnen Marker die DP unter 80% liegt. Tabelle 2
- Tabelle 3 zeigt einen Vergleich von FP/AUROC mittels Verfahren aus dem Stand der Technik. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellten sich hinsichtlich der diagnostischen Präzision bei klinisch signifikanter Fibrose mittels binärer logistischer Regression im Vergleich zu den Verfahren aus
US 6,631,330 und WO2003/073822 als überlegen heraus. Tabelle 3
- n var steht für die Anzahl der untersuchten Variablen oder Parameter, n Pt für die Anzahl der untersuchten Patienten.
Claims (3)
- Verfahren zum Nachweis des Vorliegens und/oder des Schweregrads einer Lebererkrankung bei einem Patienten, in dem h) in einer von einem Patienten gewonnenen Probe TIMP-1 (Gewebeinhibitor von Metallproteinase I) gemessen wird i) in dieser Probe A2M (α-2-Makroglobulin) gemessen wird j) in dieser Probe PLT (Thrombozytenzahl) gemessen wird k) in dieser Probe PI (Prothrombinindex) gemessen wird l) in dieser Probe fakultativ mindestens ein zusätzlicher biochemischer oder klinischer Parameter ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Harnstoff und GGT (γ-Glutamyltranspeptidase) gemessen oder bestimmt wird m) in dieser Probe fakultativ mindestens ein zusätzlicher biochemischer oder klinischer Parameter gemessen wird n) auf Grundlage des Vorhandenseins von/der Messwerte für TIMP-1, A2M, PLT, PI und des gemäß Schritt e) und f) gemessenen Parameters das Vorliegen und/oder der Schweregrad einer Lebererkrankung diagnostiziert wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, das zur Überwachung der therapeutischen Behandlung von Leberfibrose eingesetzt wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, das zum Staging von Leberfibrose eingesetzt wird.
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