WO2002099431A2 - Verwendung von cytosolischer nadp-abhängiger isocitrat-dehydrogenase in körperflüssigkeiten und stuhl zum nachweis einer malignen erkrankung sowie ein testkit hierzu - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a detection of malignant processes or diseases in humans or animals and a test kit for performing the detection according to the invention. It also relates to the use of the test kit to determine the extent and degree of the disease and to determine a promising treatment regimen, in particular with chemotherapeutic agents.
- Tumor markers are macromolecules or antigens that occur in blood, serum or other body fluids, and their change in concentration is related to the development and growth of an individual's malignant tumors.
- An ideal tumor marker should have the following properties: high specificity, i.e. not detectable in benign diseases and healthy people; high sensitivity, i.e. he can in a high
- Percentage of tumor patients are detected; - good correlation with the tumor stages or the
- Tumor mass it should provide information about the metabolism of the tumor; its concentration should correlate well with tumor malignancy; Relationship to forecast; reliable predictive values.
- test principles are not very specific, since they can be disturbed by a large number of influencing factors (false positive / false negative, e.g. due to non-compliance with urgently necessary dietary requirements on the part of the patient and from a number of medicinal products, as well as through excessive vitamin C administration ( e.g. in vegetables, fruit juices etc.) (Thomas, L., Labor und Diagnose, 5th edition, 1998).
- a positive test for occult blood in the stool must be clarified until the source of the bleeding is located or the cause of the bleeding has been found. In any case, the clinical finding justifies a prompt further diagnostics to be carried out, for example by endoscopy, sonography, X-ray.
- endoscopy, sonography, X-ray the presence of blood in the stool is not always due to a tumorous event and the other way around, the lack of blood in the stool does not mean that there is no tumor in the intestine.
- Isocitrate dehydrogenase is an enzyme of the glutaminolysis metabolism and occurs in humans and animals in the form of two different isoenzymes, namely as cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase (EC 1.1.1.42) and as mitochondrial NAD-dependent isocitrate dehydrogenase (EC 1.1.1.41).
- cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase EC 1.1.1.42
- mitochondrial NAD-dependent isocitrate dehydrogenase EC 1.1.1.41
- An overexpression of the NADP-dependent has already been found in histochemical studies on tumor tissues such as breast cancer
- the tumor tissue had to be opened histologically, i.e. the cell structure of the tissue and the individual cells had to be destroyed so that the substances enclosed in the cell were released and made accessible for analysis.
- Tumor tissues themselves are detectable, but are not suitable as tumor markers.
- the present invention aims to continue
- Another object of the invention is to provide an easy-to-carry out specific method or a test with which a neoplastic process in the gastrointestinal tract can be carried out particularly early and
- the aim of the invention is in particular to detect a malignant process or tumor with respect to the problem of the so-called adenoma-carcinoma sequence in polyps (polyposis coli) before the submucosa.
- .5 has infiltrated and has infiltrated neighboring tissue.
- cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase or parts thereof is determined qualitatively and / or quantitatively in a stool and / or body fluid sample $ 0.
- the content of cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase in body fluids and / or in $ 5 excrement, e.g. B. can be determined in the stool of tumor patients, the content of the degree of malignancy in the gastrointestinal tract. It is usually directly proportional to this.
- the cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase remains quantitatively detectable even in the case of intensely homogenized, longer-stored samples, for example when sending samples. This also applies if the sample has been extracted beforehand. A clear reaction can be obtained even if the body fluid samples or stool are very diluted. It was surprisingly found here that the detection takes place selectively even without prior extraction in the sample. However, the sample is preferably extracted. Such an extraction is carried out in particular with detergents such as CHAPS.
- Suitable body fluids with which the method according to the invention can be carried out include, for example, plasma, serum, cerebrospinal fluid, ejaculate, saliva, sputum and / or urine.
- the method according to the invention is particularly preferred using plasma and / or serum and
- the marker enzyme according to the invention can be detected in the urine, but not in the serum, this shows that there is a malignant process in the bladder or kidney. So if it is detectable both in the urine and in the serum, then the tumor has already infiltrated neighboring tissue that is in contact with the bloodstream and the lymphatic system or has infiltrated into it. The same is true in the case of bronchial and lung cancer Sputum to and in the ejaculate on malignant processes of the prostate and testicle. This also applies to the cerebrospinal fluid. If only the marker in fluid is found here, this means that tissue in contact with the cerebrospinal fluid is affected, but not adjacent tissue.
- the detection according to the invention and the associated test system provide a further general tumor marker which can be used to detect generally malignant neoplastic tumorous events in a living body without having to take tissue samples from the body to be examined in a surgical manner.
- neoplastic processes or tumors can be recorded, such as, for example, esophageal, stomach and / or colon cancer, in particular colon tumors, breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer and
- Cervical carcinoma liver carcinoma, prostate and / or testicular cancer, kidney and / or bladder cancer, lung and / or bronchial carcinoma, in particular small-cell bronchial carcinoma and tumors of the nervous tissue, in particular brain tumors.
- the detection according to the invention is combined with further tumor tests. According to the invention, it is preferred to use a method to detect the NADP-dependent isocitrate dehydrogenase
- a further detection of malignancy that is to be carried out together with the method according to the invention is the detection of malate decarboxylase (EC1.1.1.40), specifically as described above in body fluids and in Chair.
- malate decarboxylase EC1.1.1.40
- the method according to the invention is particularly selective, it has been found that when the method is combined with one or both of the previously described proofs, the probability of false positive and false negative results is significantly reduced. In this way, the reliability of the detection according to the invention can be further increased.
- Chemotherapy is accessible. This is particularly true if this is carried out together with the malate decarboxylase and / or the tumor M2 pyruvate kinase. It has been found that when the tumor markers mentioned above, namely tumor M2 pyruvate kinase, NADP-dependent isocitrate dehydrogenase and malate decarboxylase are present in the tumor cell, a detoxification of certain chemotherapeutic agents or cytostatics, such as cis-platinum, with other chemotherapeutic agents such as mitomycin being enhanced in their effect. It is thus possible with the detection 5 according to the invention to also select a corresponding chemotherapeutic agent with which the tumor can be combated without valuable time being lost due to lengthy trial and error in vivo until it is recognized whether a tumor is responding to the treatment.
- the detection according to the invention is preferably carried out immunologically.
- the marker enzyme is bound by means of a receptor, which is immobilized on a solid phase, and preferably after
- .0 can be demonstrated quantitatively or qualitatively. Detection using other biosensors is also possible. Further detection is possible using mass spectroscopy, in particular using MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption / ionization flight time
- the invention thus also relates to a device or a test kit for carrying out the detection according to the invention.
- Such a test kit usually comprises at least one first receptor immobilized on a solid phase, which selectively binds the marker enzyme to be detected or the tumor marker. It also preferably includes
- the & 5 at least one biosensor, which indicates the binding of the marker enzyme to be detected to the receptor.
- the first receptor bound to the solid phase any agent binding the marker enzyme or tumor marker to be used is used.
- the receptor is particularly preferably an antibody.
- receptor or “antibody” is also intended to include those parts or fragments of receptors or antibodies which still mediate the necessary binding to cytosolic isocitrate dehydrogenase. It is also possible to use a single antibody instead
- the antibodies used according to the invention preferably react selectively with the tumor marker to be detected and discriminate against other, also similar isoenzymes. In particular, they show no cross-reactions with other substances found in the samples.
- the biosensor is a further receptor which has a detectable detection marker and which reacts with the tumor marker or marker enzyme bound to the solid phase. It is preferably an antibody. Detection markers of this type are known per se and are generally used in so-called immunassays, in particular in ELISA or other sandwich assays. These are in particular second antibodies which are bindable with the tumor marker enzyme such as isocitrate dehydrogenase, the detection being carried out via a further labeled third, in particular soluble antibody which is directed against the Fc part of the second soluble receptor and which bears a detectable label or again is coupled to a detectable molecule.
- This Conjugate formation from two antibodies is intended to be included in the context of the present invention. The same applies to the binding of the receptor to the solid phase. This binding can also be carried out via solid-phase-coupled antibodies to which the Fc part of the receptor binds.
- One of the two receptors preferably mediates the binding to a solid phase, so that a separation of the liquid phase containing the body fluid sample or stool and the solid phase is made possible, on which the cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase by means of the receptor (first receptor ) is bound.
- this solid phase is also part of the test kit.
- the sample to be examined is then brought into contact with the preferably dissolved protein and bound to the solid phase by means of the receptor in a suitable buffer system.
- another detectable labeled receptor (second receptor), e.g.
- the test kit expediently contains reference material of known content of cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase for quantitative determination.
- the analyte concentration can in principle also be determined using biosensors, e.g. amperometric sensors, potentiometric, ion-selective potentiometric or photometric sensors, or also by means of semiconductor electrodes, such as field effect transistors (FET), chemosensitive field effect transistors (CHEMFET), suspended gate field effect transistors (SGFET) or ion sensitive field effect transistors.
- biosensors e.g. amperometric sensors, potentiometric, ion-selective potentiometric or photometric sensors, or also by means of semiconductor electrodes, such as field effect transistors (FET), chemosensitive field effect transistors (CHEMFET), suspended gate field effect transistors (SGFET) or ion sensitive field effect transistors.
- FET field effect transistors
- CHEMFET chemosensitive field effect transistors
- SGFET suspended gate field effect transistors
- biosensors are summarized in E.A. H. Hall and G. Hummel in “Biosensors”, Springer Verlag Heidelberg, Germany, 1995. Further
- ISFET ion-sensitive field effect transistors
- optical detectors include by F. Aberl and H. Wolf in “Current Trends in Immune Sensing", Labor 2000, pp. 70-96 (1993).
- the method according to the invention is also suitable for
- Electrochemiluminescence is the process in which light generation occurs when a low voltage is applied to an electrode that triggers a cyclic redox reaction of a ruthenium metal ion (Bruno, G. (1997) Rec. Rp pp. 175-179; Williams R. (1996) Amer. Biotech., P. 26).
- Antibodies which can be used according to the invention can, according to
- Methods known in the art can be produced. Methods for producing specific monoclonal antibodies are well known to those skilled in the art.
- the antigen in the present case the cytosolic isocitrate dehydrogenase or the malate decarbxylase or parts thereof, is used in a customarily purified form to produce antibodies.
- the method described for the first time by Köhler and Milstein can be used for this purpose, modifications and further developments of these methods being known to the person skilled in the art. Production is not critical as long as specific antibodies are obtained, which can be determined by selection. The selection takes place for antibodies which specifically bind the cytosolic isocitrate dehydrogenase or parts thereof, but not one of the other isoenzymes of the isocitrate dehydrogenase.
- the antibodies used in the detection or test according to the invention can be obtained using methods known per se.
- the cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase for example from colon tumors, human liver and breast tumors, isolated.
- the purification of the isoenzyme consists of the following
- Steps An ammonium sulfate precipitation, QAE Sephadex A-50, 2 '5' -ADP-Sepharose 4B and a Sephacryl-S300 chromatography as described by Oluyinka O. Irukera (dissertation at the Justus Liebig University in G funnelen , July 1998), in analogy to other NADH-dependent enzymes (such as malate decarboxylase).
- the purified fraction gave a band after SDS gel electrophoresis.
- a test animal is then immunized with the cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase obtained in this way or with fragments thereof which have the corresponding epitopes, and the antibodies formed are isolated.
- fragments used for immunization can e.g. originate from a protease digestion of the purified cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase or consist of synthetic partial peptides thereof. The preparation of such partial peptides is known per se to the person skilled in the art. From the total sequence, e.g. with the aid of computer programs, partial sequences are selected which contain corresponding epitopes. These sequences are then tested for their usability for the production of specific antibodies.
- Monoclonal antibodies are preferably produced by the method of Koehler, Milstein (Nature 256, 495-497 (1975).
- BALB / c mice are immunized with isolated isocitrate dehydrogenase, for example, and the spleen cells of these animals are immunized with a myeloma cell line, for example PA I
- the antibodies secreted in the ascites are tested for their specificity, for example in the ELISA or RIA (radio immunoassay) and isolated.
- the antibodies thus obtained usually belong to the IgGl class.
- the second receptor is preferably a soluble, labeled antibody or a soluble antibody which is bound to an enzyme, which in turn can be determined via a detection reaction.
- the test kit is designed in such a way that it is suitable for a sandwich, ELISA, quartz crystal, microbalance or
- Electrochemiluminescence test contains necessary reagents and / or devices.
- the test kit preferably comprises an extractant for the sample to be examined, such as CHAPS.
- an extractant for the sample to be examined such as CHAPS.
- it preferably contains a reference standard for comparison or calibration of the test results.
- the test according to the invention also includes an evaluation scale for determining or calibrating the size, the extent and / or the degree of the tumor or the malignant process.
- the test contains a calibration or scale and / or table for determining and defining a therapy scheme with suitable, promising chemotherapeutic agents such as, for example, B. Cytostatics.
- the table, scale or curve is designed so that the respective therapeutic agent to be used results directly from it.
- test kit is designed as an array in which the isocitrate dehydrogenase, the malate decarboxylase and the tumor M2 pyruvate kinase can be detected side by side or also one after the other.
- the test kit is in the form of a test strip in which the sample liquid passes through different areas in which the first and second receptors are in soluble form. It is preferred that the test kit is in the form of a test strip which has an application zone for the sample and has further sections which are designed such that a liquid sample applied in the sample application area travels to a detection zone in which the test result is read can be.
- the different areas must support the migration of the sample, for example by capillary action.
- the application zone is followed by an area in which a soluble labeled antibody is present which corresponds to the second receptor.
- the first receptor is preferably already in immobilized form.
- the first receptor can also be present both in a zone before and in a zone after the region and can be present there in soluble form.
- a solid phase must then be present on the test kit, in which the first receptor binds to the solid phase and thereby a complex of the first receptor, isocitrate dehydrogenase and second receptor with the label or the detectable molecules is bound to the solid phase ,
- the presence of the cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase can then again be determined via the label, this label being able to be designed such that it can be recognized without further addition of substances, such as a gold label or a fluorescent label, or else can be designed such that the addition of further reagents enables the determination.
- an enzyme substrate can be applied to the test strip in a second step, or in one separate area of the test strip, through which the sample liquid including the second receptor passes.
- the test strip is arranged such that a filter is arranged between the application zone and the further areas of the test strip, which retains insoluble constituents of the sample.
- a liquid-absorbing medium can be applied behind the detection area, which can absorb essentially the entire amount of liquid of the applied sample.
- the soluble second receptor is preferably a labeled antibody.
- An approximately 12 ml disposable tube and a microbiological inoculation loop (e.g. Sarstedt) are balanced to 0 using a sensitive digital laboratory balance.
- the stool is then weighed in with the inoculation loop by pricking the stool sample with the eyelet and the amount of stool remaining at the tip (approx. 100 mg) into the Disposable tube.
- a toothpick can also be used instead of the inoculation loop.
- the volumes of the extraction buffer to be added are varied according to the weighed stool sample mass (e.g. 100 mg stool + 10 ml buffer or 75 mg stool + 7.5 ml buffer). Final concentration: 10 mg stool / ml extraction buffer.
- the stool sample suspension is mixed vigorously at room temperature with a test tube shaker (e.g. VORTEX).
- the chairs must be well homogenized.
- CHAPS 3- [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 10 mM (Sigma) to the phosphate-buffered extraction buffer.
- An ELISA plate is coated with a monoclonal antibody that only recognizes the cytosolic isocitrate dehydrogenase.
- the monoclonal antibody that only recognizes the cytosolic isocitrate dehydrogenase.
- Antibody was produced by means of purified cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase according to the method known from Köhler and Milstein and screened for selectivity.
- the cytosolic NADP-dependent isocitriate dehydrogenase from dilute stool samples and from standards binds to the antibody and is thus immobilized on the plate.
- a second monoclonal antibody, which is biotinylated, binds to the in the next incubation step cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase.
- a conjugate of POD (peroxidase) and streptavidin then binds to the biotin unit.
- the peroxidase oxidizes ABTS (2,2-azino-bis- (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) to form a dark green color.
- concentration of oxidized ABTS is then determined photometrically in a manner known per se.
- a patient's serum which was obtained in the usual way, is tested with the same ELISA plate.
- the sample was diluted 1:10 in a series of dilutions and the diluted samples were examined for their detection limit, showing a high sensitivity of the test according to the invention.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis einer malignen Erkrankung in Menschen oder Tieren sowie einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens und schliesslich die Verwendung des Testkits zum selektiven Nachweis von cytosolischer NADP-abhängiger Isocitrat-Dehydrogenase in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten sowie in Stuhl und zur Bestimmung des Ausmasses der malignen Erkrankung sowie zur Bestimmung eines Behandlungsschemas.
Description
Beschreibung
Verwendung von cytosolischer NADP-<abhεtngiger Isocitrat- Dehydrogenase in Körperflüssigkeiten und Stuhl zum Nachweis einer malignen Erkrankung sowie ein Testkit hierzu
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Nachweis von malignen Vorgängen bzw. Erkrankungen in Menschen oder Tieren sowie einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweises. Sie betrifft auch die Verwendung des Testkits zur Bestimmung des Ausmaßes und Grades der Erkrankung und zur Bestimmung eines erfolgversprechenden Behandlungsschemas insbesonders mit Chemotherapeutika .
Tumormarker sind in Blut, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten auftretende Makromoleküle oder Antigene, deren Konzentrationsänderung in Beziehung mit der Entstehung und dem Wachstum von malignen Tumoren eines Individuums stehen.
Ein idealer Tumormarker sollte folgende Eigenschaften aufweisen: hohe Spezifität, d.h. bei benignen Erkrankungen und gesunden Personen nicht nachweisbar sein; hohe Sensitivität , d.h. er kann in einem hohen
Prozentsatz der Tumorpatienten nachgewiesen werden; - gute Korrelation mit den Tumorstadien bzw. der
Tumormasse; er sollte Auskunft über den Stoffwechsel des Tumors geben; seine Konzentration sollte gut mit der Tumormalignitat korrelieren;
Beziehung zur Prognose; verlässliche Vorhersagewerte.
Die Kriterien der 100 %igen Spezifität und der 100 %igen Sensitivität werden bis heute von keinem der bekannten Tumormarker erfüllt.
Bei der Diagnose von malignen bzw. neoplastischen Zuständen wie Krebs ist es wünschenswert, möglichst frühzeitig ein tumoröses Geschehen im Körper nachweisen zu können, und zwar insbesondere schon in einer Wachstumsphase, in welcher der Tumor noch keinen Kontakt mit dem Gefäßsystem des Körpers aufgenommen hat (in der "Polyp-cancer-sequence" , zeitlich vor der Infiltration der Submukosa) .
So ist es z. B. üblich, zur Diagnose von malignen Vorgängen im Gastrointestinaltrakt, besonders im Hinblick auf die sogenannte Adenom-Carcinom-Sequenz bei Polypen (Polyposis coli) , occultes Blut im Stuhl nachzuweisen. Hierzu werden sowohl nicht-immunologische Tests (z.B. Pseudoperoxidase-Aktivität, Porphyrin-Nachweis) als auch immunologische Tests verwendet.
Beide Testprinzipien sind jedoch nicht sehr spezifisch, da sie durch eine Vielzahl von Einflussgrößen gestört werden können (falsch positiv/falsch negativ, z.B. durch Nichteinhalten dringend notwendiger Diätvorschriften von Seiten des Patienten und von einer Reihe von Arzneimitteln sowie durch überhöhte Vitamin-C-Gabe (z.B. in Gemüse, Fruchtsäften etc.) (Thomas, L. , Labor und Diagnose, 5. Auflage, 1998) .
Ein positiver Test auf occultes Blut im Stuhl muss so lange abgeklärt werden, bis die Blutungsquelle lokalisiert ist bzw. die Ursache der Blutung gefunden wurde. Der klinische Befund rechtfertigt in jedem Fall eine zügig
durchzuführende weitere Diagnostik, z.B. durch Endoskopie, Sonographie, Röntgen. Das Vorliegen von Blut im Stuhl ist aber nicht immer auf ein tumoröses Geschehen zurückzuführen und andersherum bedeutet das Fehlen von Blut im Stuhl auch nicht sicher, dass kein Tumor im Darm vorhanden ist .
Isocitrat-Dehydrogenase ist ein Enzym des Glutaminolyse- Metabolismus und kommt bei Mensch und Tier in Form zweier verschiedener Isoenzyme vor, und zwar als cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.42) und als mitochondriale NAD-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.41). Es wurde bereits bei histochemischen Untersuchungen an Tumorgeweben wie Brustkrebs eine Überexpression der NADP-abhängigen
Isocitrat-Dehydrogenase gefunden (Hilf et al . , Cancer (1976), 38: 695-700; Elias, Cell. Mol. Biol . (1985), 31: 281-298; Marzatico et al . , J. Neurosurg. Sei. (1986), 30: 129-132; Lane and King, J. Steroid Biochem. (1989), 33: 853-858; Eigenbrodt et al . , in : Biochemical and Molecular Aspects of Selected Cancers (1994) (Pretlow T.G. and Pretlow T.P. eds . ) Academic Press New York, 2: 311-385. Mazurek et al . , Anticancer Research, 20:5151-5154 (2000).
Um diese Untersuchungen durchzuführen, musste jeweils das Tumorgewebe histologisch aufgeschlossen werden, d.h. der Zellverband des Gewebes und die einzelnen Zellen mussten zerstört werden, damit die in der Zelle eingeschlossenen • Substanzen freigesetzt und einer Analyse zugänglich wurden.
Obwohl aus den zuvor genannten Untersuchungen seit langem bekannt war, dass in manchen Tumorgeweben verschiedene Enzyme wie beispielsweise die NAD -abhängige Isocitrat- Dehydrogenase in deutlich erhöhten Konzentrationen auftritt, konnte diese bislang nicht als Tumormarker genutzt werden, da ihr Nachweis nur an chirurgisch
entnommenem Tumorgewebe möglich war wobei das Tumorgewebe bzw. die Tumorzellen zusätzlich zerstört, d.h. homogenisiert werden mussten, um die enzymatische Aktivität dieser Enzyme zu bestimmen. Derartige im 5 Zeilinneren vorliegende Substanzen, die nur im
Tumorgewebe selbst nachweisbar sind, eignen sich jedoch nicht als Tumormarker.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, den weiterhin
10 bestehenden Bedarf an einem spezifischen, leicht durchzuführenden Nachweis auf einen malignen Vorgang zu befriedigen, und zwar insbesonders derart, daß ein neoplastisches Geschehen besonders frühzeitig und zweifelsfrei nachgewiesen werden kann.
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Die Erfindung hat weiterhin zum Ziel, ein, leicht durchzuführendes spezifisches Verfahren bzw. einen Test bereitzustellen, mit dem ein neoplastischer Vorgang im Gastrointestinaltrakt besonders frühzeitig und
10 zweifelsfrei nachgewiesen werden kann. Dabei hat die Erfindung inbesonders zum Ziel, im Hinblick auf die Problematik der sogenannten Adenom-Carcinom-Sequenz bei Polypen (Polyposis coli) einen malignen Vorgang bzw. Tumor bereits dann nachzuwiesen, ehe dieser die Submukosa .
.5 infiltriert hat und in Nachbargewebe eingewuchert ist.
Dieses Ziel wird dadurch erreicht, daß die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase oder Teilstücke davon in einer Stuhl- und/oder Körperflüssigkeitsprobe $0 qualitativ oder/und quantitativ bestimmt wird.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, daß sich der Gehalt an cytosolischer NADP-abhängiger Isocitrat-Dehydrogenase in Körperflüssigkeiten und/oder in $5 Exkrementen, z. B. im Stuhl von Tumorpatienten bestimmen lässt, wobei der Gehalt dem Grad des malignen Geschehens
im Gastrointestinaltrakt entspricht . Üblicherweise ist er hierzu direkt proportional .
Dies ist umso überraschender, weil umfangreiche Untersuchungen mit anderen spezifischen Proteinen im Stuhl und in Körperflüssigkeiten keine Hinweise auf ihre mögliche Verwendung als Tumormarker gaben.
Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, daß sowohl die Struktur als auch die physiko-chemischen Eigenschaften der cytosolischen NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase infolge der erheblichen proteolytischen Aktivität und den physiologischen Gegebenheiten im Gastrointestinaltrakt (z. B. pH-Wert, sauer im Magen, alkalisch im Darm) sowie in Körperflüssigkeiten offensichtlich nicht nachhaltig beeinträchtigt werden. Dies gilt insbesonders auch für den immunologischen Nachweis der cytosolischen NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt und gezeigt werden, dass sich trotz der zuvor beschriebenen Proteindenaturierung und Proteinverdauung ein spezifischer qualitativer und insbesonders sogar quantitativer Nachweis von cytosolischer NADP-abhängiger Isocitrat-Dehydrogenase in Körperflüssigkeiten und/oder im Stuhl von Tumorpatienten führen lässt.
Überraschenderweise wurde dabei auch festgestellt, dass die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase quantitativ auch bei intensiv homogenisierten, länger gelagerten Proben wie zum Beispiel beim Probenversand nachweisbar bleibt. Dies gilt auch dann, wenn die Probe zuvor extrahiert wurde . Auch bei starker Verdünnung der Körperflüssigkeitsproben oder von Stuhl kann eine deutliche Reaktion erhalten werden. Hierbei wurde überraschenderweise festgestellt, dass der Nachweis auch ohne vorherige Extraktion in der Probe selektiv erfolgt.
Vorzugsweise wird die Probe jedoch extrahiert. Eine derartige Extraktion wird insbesonders mit Detergenzien wie besipielsweise CHAPS durchgeführt.
Geeignete Körperflüssigkeiten, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, umfassen beispielsweise Plasma, Serum, cerebrospinales Fluid, Ejakulat, Speichel, Sputum und/oder Urin. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von Plasma und/oder Serum sowie von
Exkrementen, insbesonders Stuhlproben durchgeführt.
Es wurde erfindungsgemäß auch gefunden, daß durch den Nachweis der Isocitrat-Dehydrogenase im Stuhl ein maligner Vorgang bereits sehr frühzeitig nachgewiesen werden kann, und zwar bereits dann, wenn der Tumor die Mucosa noch nicht durchwachsen hat. Ist nämlich der erfindungsgemäße Nachweis des Tumormarkerenzyms lediglich im Stuhl möglich und nicht im Serum, so hat in diesem Fall der Tumor die Mucosa des Gastrointestinaltraktes noch nicht durchwachsen. In einem derartigen Stadium sind die Heilungschancen besonders gut. Ist dagegen der erfindungsgemäße Nachweis des Markerenzymes sowohl im Stuhl als auch im Serum möglich, dann zeigt dies an, daß der Tumor bereits die Mucosa durchwachsen hat und benachbartes mit dem Blut und/oder Lymphsystem in Kontakt stehendes Gewebe infiltriert hat .
Dies trifft auch für andere Organe zu. Läßt sich beispielsweise im Urin das erfindungsgemäße Markerenzym nachweisen, nicht jedoch im Serum, so zeigt dies, daß ein maligner Vorgang in Blase oder Niere vorliegt. Ist es also sowohl im Urin als auch im Serum nachweisbar, dann hat auch hier der Tumor bereits benachbartes, mit der Blutbahn und dem Lymphsystem in Kontakt stehendes Gewebe infiltriert bzw. ist in dieses eingewuchert. Das gleiche trifft im Falle des Bronchial- und Lungenkrebses auf das
Sputum zu sowie beim Ejakulat auf maligne Vorgänge der Prostata und des Hodens. Dies gilt auch für das cerebrospinale Fluid. Wird hier lediglich der Marker in Fluid aufgefunden, dann bedeutet dies, daß mit dem cerebrospinalen Fluid in Kontakt stehendes Gewebe, nicht jedoch benachbartes Gewebe betroffen ist.
Durch den erfindungsgemäßen Nachweis sowie das dazugehörige Testsystem wird ein weiterer genereller Tumormarker bereitgestellt, mit dem allgemein maligne neoplastische tumoröse Ereignisse in einem lebenden Körper nachgewiesen werden können ohne daß dabei dem zu untersuchenden Körper Gewebeproben auf chirurgische Art und Weise entnommen werden müssen.
Mit dem erfindungsgemäßen Nachweis lassen sich im wesentlichen sämtliche neoplastischen Vorgänge bzw. Tumore erfassen, wie beispielsweise Speiseröhren-, Magen- und/oder Darmkrebs, insbesondere Dickdarmtumore, das Mammakarzinom, Ovarialkarzinom, Gebärmutter- und
Gebärmutterhalskarzinom, Leberkarzinom, Prostata- und/oder Hodenkrebs, Nieren- und/oder Blasenkrebs, Lungen- und/oder Bronchialkarzinom, insbesondere das kleinzellige Bronchialkarzinom und Tumoren des Nervengewebes, insbesondere Gehirntumore .
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der erfindungsgemäße Nachweis mit weiteren Tumortests kombiniert. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, den Nachweis der NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase mit einem
Test auf die Tumor M2-Pyruvatkinase zu ergänzen, wie er beispielsweise in der WO 90/05917 beschrieben ist.
Ein weiterer zusammen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführender Nachweis auf ein malignes Geschehen ist der Nachweis der Malatdecarboxylase (E.C.1.1.1.40) und zwar wie zuvor beschrieben in Körperflüssigkeiten und in
Stuhl . Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren besonders selektiv ist, wurde gefunden, daß bei einer Kombination des Verfahrens mit einem oder beiden der zuvor geschilderten Nachweise die Wahrscheinlichkeit von falsch positiven sowie falsch negativen Ergebnissen deutlich verringert wird. Auf diese Weise kann die Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Nachweises weiter erhöht werden. Prinzipiell ist es erfindungsgemäß auch möglich, die Malatdecarboxylase zum Nachweis eines Tumors allein durchzuführen, d. h. auch ohne den Nachweis der NADP- abhängigen Isocitratdehydrogenase .
Darüber hinaus hat es sich gezeigt, daß das sich durch den Nachweis von allen drei zuvor genannten Tumormarkern, nämlich der NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase, der Malatdecarboxylase sowie der Tumor M2-Pyruvatkinase auch das Ausmaß und der Grad des malignen, neoplastischen Vorganges feststellen läßt. Es hat sich nämlich gezeigt, daß bei Vorliegen von mindestens zwei, vor allem aber von allen drei verschiedenen Tumormarkern es üblicherweise bereits zu Absiedelungen, d. h. Metastasen des Primärtumors gekommen ist . Läßt sich dagegen nur eines dieser Markerenzyme nachweisen, so liegt üblicherweise meist nur ein Primärtumor vor. Dies wird neben dem qualitativen Nachweis der drei Marker durch einen quantitativen Nachweis noch weiter vervollständigt.
Darüber hinaus hat es sich gezeigt, daß es möglich ist, mittels dem erfindungsgemäßen Nachweis des Tumormarkers festzustellen, inwieweit der Tumor einer bestimmten
Chemotherapie zugänglich ist . Dies trifft insbesondere dann zu, wenn dieser zusammen mit der Malatdecarboxylase und/oder der Tumor M2-Pyruvatkinase durchgeführt wird. Es wurde nämlich gefunden, daß beim Vorliegen der zuvor genannten Tumormarker, nämlich Tumor M2-Pyruvatkinase, NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase sowie der Malatdecarboxylase in der Tumorzelle eine Entgiftung von
bestimmten Chemotherapeutika bzw. Cytostatika erfolgt, wie beispielsweise cis-Platin, wobei andere Chemotherapeutika wie beispielsweise Mitomycin in ihrer Wirkung verstärkt werden. Damit ist es mit dem erfindungsgemäßen Nachweis 5 möglich, auch ein entsprechendes Chemotherapeutikum auszuwählen, mit welchem der Tumor bekämpft werden kann, ohne daß durch langwieriges Ausprobieren in vivo wertvolle Zeit verloren geht, bis erkannt wird, ob ein Tumor auf die Behandlung anspricht .
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Der erfindungsgemäße Nachweis wird vorzugsweise immunologisch durchgeführt . Dabei wird das Markerenzym mittels einem Rezeptor, der an einer festen Phase immobilisiert ist, gebunden und vorzugsweise nach
15 Entfernung anderer Bestandteile der zu untersuchenden Probe in der immobilisierten festphasengebundenen Form nachgewiesen. Dies kann beispielsweise mittels einem zweiten Rezeptor geschehen, der an das Markerenzym bindet und der selbst oder mittels eines weiteren Reagenzes
.0 quantitativ oder qualitativ nachweisbar ist. Auch die Detektion mittels anderen Biosensoren ist möglich. Ein weiterer Nachweis ist mittels der Massenspektroskopie möglich, insbesondere mittels MALDI-TOF (Matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisationsflugzeit-
.5 Massenspektroskopie) .
Die Erfindung betrifft somit auch eine Vorrichtung bzw. einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweises.
,0
Ein solcher Testkit umfaßt üblicherweise mindestens einen an einer festen Phase immobilisierten ersten Rezeptor, der das nachzuweisende Markerenzym bzw. den Tumormarker selektiv bindet . Des weiteren umfaßt er vorzugsweise
&5 mindestens einen Biosensor, welcher die Bindung des nachzuweisenden Markerenzymes an den Rezeptor anzeigt.
Als ein an der festen Phase gebundener erster Rezeptor dient jedes das nachzuweisende Markerenzym bzw. Tumormarker bindende Mittel. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, einen Rezeptor zu verwenden, welcher das Markerenzym mehr oder weniger selektiv bindet, wie z. B. in der Zellmembran vorliegende Bindungs- und Rezeptorproteine. Besonders bevorzugt ist der Rezeptor jedoch ein Antikörper.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Rezeptor" bzw. "Antikörper" auch solche Teile oder Fragmente von Rezeptoren bzw. Antikörpern umfassen, welche die notwendige Bindung an cytosolische Isocitrat- Dehydrogenase noch vermitteln. Es ist hierbei auch möglich, anstelle eines einzelnen Antikörpers ein
Konjugat, beispielsweise aus zwei Antikörpern einzusetzen. Die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper reagieren vorzugsweise selektiv mit dem nachzuweisenden Tumormarker und diskriminieren andere, auch ähnliche Isoenzyme. Insbesonders zeigen sie keinerlei Kreuzreaktionen mit anderen in den Proben vorkommenden Substanzen.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform ist der Biosensor ein weiterer Rezeptor, der einen nachweisbaren Detektionsmarker aufweist, und der mit dem an der festen Phase gebundenen Tumormarker bzw. Markerenzym reagiert. Vorzugsweise ist er ein Antikörper. Derartige Detektionsmarker sind an sich bekannt und werden allgemein in sogenannten Immunassays, insbesondere in ELISA oder anderen Sandwichassays verwendet. Dies sind inbesonders mit dem Tumormarkerenzym wie der Isocitrat- Dehydrogenase bindefähige zweite Antikörper, wobei der Nachweis über einen weiteren markierten dritten, insbesondere löslichen Antikörper geführt wird, der gegen den Fc-Teil des zweiten löslichen Rezeptors gerichtet ist und der eine detektierbare Markierung trägt oder wiederum an ein detektierbares Molekül gekoppelt ist. Diese
Konjugatbildung aus zwei Antikörpern soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfasst sein. Analoges gilt für die Bindung des Rezeptors an die feste Phase. Auch diese Bindung kann über Festphasen-gekoppelte Antikörper erfolgen, an welche der Fc-Teil des Rezeptors bindet.
Einer der beiden Rezeptoren vermittelt vorzugsweise die Bindung an eine feste Phase, sodass eine Trennung von flüssiger Phase, enthaltend die Körperflüssigkeitsprobe bzw. Stuhl, und der festen Phase ermöglicht wird, an der die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase mittels dem Rezeptor (erster Rezeptor) gebunden ist. Diese Festphase ist in einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ebenfalls Bestandteil des Testkits. Die zu untersuchende Probe wird dann mit dem vorzugsweise gelösten Protein in Kontakt gebracht und in einem geeigneten Puffersystem mittels dem Rezeptor an die Festphase gebunden. Nach Waschen des so erhaltenen immobilisierten Rezeptor-cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase-Komplexes wird ein weiterer detektierbarer markierter Rezeptor (zweiter Rezeptor) , z.B. mit Biotin versehener zweiter Antikörper zugesetzt, der an ein anderes Epitop der cytosolischen NADP- abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase bindet. Dann wird die Markierung bestimmt, z.B. mit Hilfe von Streptavidin- Peroxidase. Die Menge an gebundenem Marker ist direkt proportional der Menge an cytosolischer NADP-abhängiger Isocitrat-Dehydrogenase in der Probe. Zweckmäßigerweise enthält der Testkit Referenzmaterial bekannten Gehalts an cytosolischer NADP-abhängiger Isocitrat-Dehydrogenase zur quantitativen Bestimmung.
Neben der bevorzugten Ausgestaltung als Festphasen- Sandwich-Assay sind allerdings auch andere Nachweismethoden und Immunoassays geeignet, mit deren Hilfe die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat- Dehydrogenase spezifisch nachgewiesen werden kann, sowie
Testkits, welche die dafür notwendigen Reagenzien enthalten, insbesondere den bzw. die spezifisch bindefähigen Antikörper.
Neben der Bestimmung der jeweiligen Tumormarkerenzyme, insbesonders der cytosolischen NADP-abhängigen Isocitrat- Dehydrogenase mittels Immunoassay und insbesondere ELISA oder anderen Sandwich-Assays kann die Analytkonzentration prinzipiell auch mittels Biosensoren bestimmt werden, wie z.B. amperometrische Sensoren, potentiometrische, ionenselektive potentiometrische oder fotometrische Sensoren, oder auch mittels Halbleiterelektroden, wie Feldeffekttransistoren (FET) , chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET) , suspendedgate- Feldeffekt-Transistoren (SGFET) oder ionensensitive Feldeffekttransistoren.
Biosensoren sind beispielsweise zusammenfassend in E.A. H. Hall und G. Hummel in "Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere
Entwicklungen von ionen-sensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind u.a. von F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der Immunsensorik" , Labor 2000, S. 70-96 (1993) beschrieben. Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die
Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächenwellenelementen, welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sog. Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobilisiert und nach Bindung mit der zu analysierenden cytosolischen NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase gemessen. Derartige Sensoren sind beispielsweise von A. Leidl et al . In "Proceedings of the Second International Symposium on Minaturized Total Analyses Systems μTAS", Basel 1996, beschrieben. Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von C. Köslinger et al . , Fresenius J. Anal. Chem (1994),
349: 349-354, beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen.
Signifikante Verbesserungen der Nachweismöglichkeiten durch Immunoassays können hinsichtlich Sensitivität,
Dynamik, Assaykinetik und Formatflexibilität auch durch die Verwendung von Elektrochemilumineszenz erreicht werden. Die Elektrochemilumineszenz ist der Vorgang, bei dem eine Lichterzeugung dann auftritt, wenn eine niedrige Spannung an eine Elektrode angelegt wird, welche eine cyclische Redoxreaktion eines Rutheniummetallion triggert (Bruno, G. (1997) Rec. Rp S. 175-179; Williams R. (1996), Amer. Biotech., p. 26).
Erfindungsgemäß einsetzbare Antikörper können gemäß im
Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gut bekannt. Beispielsweise wird hierzu das Antigen, im vorliegenden Fall also die cytosolische Isocitrat-Dehydrogenase bzw. die Malatdecarbxylase oder Teilstücke davon in auf übliche Weise gereinigter Form zur Erzeugung von Antikörpern verwendet. Prinzipiell kann hierzu das Verfahren, welches erstmals von Köhler und Milstein beschrieben wurde, angewandt werden, wobei dem Fachmann auch Abwandlungen und Weiterentwicklungen dieser Verfahren bekannt sind. Die Herstellung ist solange nicht kritisch, wie spezifische Antikörper erhalten werden, was durch Selektion festgestellt werden kann. Die Selektion erfolgt auf Antikörper, welche spezifisch die cytosolische Isocitrat- Dehydrogenase oder Teilstücke derselben, jedoch nicht eines der anderen Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase binden.
Die im erfindungsgemäßen Nachweis bzw. Test verwendeten Antikörper sind mit Hilfe von an sich bekannten Methoden erhältlich. Hierbei wird zuerst die cytosolische NADP-
abhängige Isocitrat-Dehydrogenase, z.B. aus Dickdarmtumoren, menschlicher Leber und Brusttumoren, isoliert .
Die Reinigung des Isoenzyms besteht aus folgenden
Schritten: Einer Ammonium-sulfatfällung, QAE Sephadex A- 50-, 2 '5 ' -ADP-Sepharose 4B- und einer Sephacryl-S300- Chromatographie, wie bei Oluyinka O. Irukera beschrieben (Dissertation an der Justus-Liebig-Universität in Gießen, Juli 1998) , in Analogie zu andereb NADH-abhängigen Enzymen (wie z.B. Malat-Decarboxylase) . Die gereinigte Fraktion ergab nach SDS-Gel-Elektrophorese eine Bande.
Danach wird ein Versuchstier mit der so erhaltenen cytosolischen NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase bzw. mit Bruckstucken derselben, welche die entsprechenden Epitope aufweisen, immunisiert und die gebildeten Antikörper isoliert. Derartige Bruchstücke, welche zur Immunisierung verwendet werden, können z.B. aus einer Protease-Verdauung der gereinigten cytosolischen NADP- abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase stammen oder aus synthetischen Teilpeptiden derselben bestehen. Die Herstellung solcher Teilpeptide ist dem Fachmann an sich bekannt. Es können dabei aus der Gesamtsequenz z.B. mit Hilfe von Computerprogrammen Teilsequenzen ausgewählt werden, welche entsprechende Epitope enthalten. Diese Sequenzen werden dann auf ihre Verwendbarkeit zur Herstellung spezifischer Antikörper getestet.
Vorzugsweise werden dabei monoklonale Antikörper nach der Methode von Köhler, Milstein (Nature 256, 495-497 (1975) erzeugt. Dabei werden beispielsweise BALB/c-Mäuse mit isolierter Isocitrat-Dehydrogenase immunisiert und die Milzzellen dieser Tiere mit einer Myelomazellinie, beispielsweise PA I, fusioniert. Die in den Ascites sezernierten Antikörper werden, beispielsweise im ELISA oder RIA (Radio Immunoassay) , auf ihre Spezifität getestet
und isoliert. Üblicherweise gehören die so erhaltenen Antikörper zur Klasse IgGl .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der zweite Rezeptor bevorzugt ein löslicher, markierter Antikörper oder ein löslicher Antikörper, der an ein Enzym gebunden ist, welches wiederum über eine Nachweisreaktion bestimmbar ist. Es ist besonders bevorzugt, dass der Testkit so ausgestaltet ist, dass er weitere für einen Sandwich-, ELISA-, Schwingquarz-, Mikrowaage- oder
Elektrochemolumineszenztest notwendige Reagenzien oder/und Vorrichtungen enthält.
Der Testkit umfaßt vorzugsweise ein Extraktionsmittel für die zu untersuchende Probe wie beispielsweise CHAPS. Darüber hinaus enthält er vorzugsweise einen Referenzstandard zum Vergleich bzw. zur Kalibrierung der Testergebnisse. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfaßt der erfindungsgemäße Test auch eine Bewertungsskala zur Festlegung bzw. zur Kalibrierung der Größe, des Umfanges und/oder des Grades des Tumors bzw. des malignen Vorganges. Schließlich enthält der Test in einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform eine Kalibrierung bzw. Skala und/oder Tabelle zur Bestimmung und Festlegung eines TherapieSchemas mit geeigneten, erfolgversprechenden Chemotherapeutika wie z. B. Zytostatika. Dabei ist die Tabelle, Skala bzw. Kurve so ausgestaltet, daß sich daraus direkt das jeweilige anzuwendende Therapeutikum ergibt . In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausfuhrungsform ist der Testkit als Array ausgestaltet, in welchem sich die Isocitratdehydrogenase, die Malatdecarboxylase und die Tumor M2-Pyruvatkinase neben- oder auch nacheinander detektieren läßt.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Sandwich- bzw. ELISA-Immunoassays ist es im Rahmen
der vorliegenden Erfindung wiederum bevorzugt, dass der Testkit in Form eines Teststreifens ausgebildet ist, in dem die Probenflüssigkeit verschiedene Bereiche durchläuft, in denen sich die ersten und zweiten Rezeptoren in löslicher Form befinden. Dabei ist es bevorzugt, dass der Testkit in Form eines Teststreifens ausgebildet ist, der eine Auftragzone für die Probe aufweist und weitere Abschnitte aufweist, welche so ausgebildet sind, dass eine im Probenauftragbereich aufgetragene flüssige Probe bis zu einer Detektionszone durchwandert, in der das Testergebnis abgelesen werden kann. Die verschiedenen Bereiche müssen also z.B. durch Kapillarwirkung die Wanderung der Probe unterstützen.
Dabei ist es wiederum bevorzugt, dass auf die Auftragzone ein Bereich folgt, in dem ein löslicher markierter Antikörper vorhanden ist, der dem zweiten Rezeptor entspricht. In einer darauf folgenden Detektionszone liegt der erste Rezeptor vorzugsweise bereits in immobilisierter Form vor. Allerdings kann auch der erste Rezeptor sowohl in einer Zone vor als auch in einer Zone nach dem Bereich vorliegen und dort in löslicher Form vorhanden sein. Es muss dann eine feste Phase auf dem Testkit vorhanden sein, in welcher der erste Rezeptor an die feste Phase bindet und dadurch ein Komplex aus erstem Rezeptor, Isocitrat- Dehydrogenase und zweitem Rezeptor mit der Markierung bzw. den detektierbaren Molekülen, an die Festphase gebunden wird. Die Anwesenheit der cytosolischen NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase kann dann wiederum über die Markierung festgestellt werden, wobei diese Markierung so ausgestaltet sein kann, dass sie ohne weitere Zugaben von Substanzen erkennbar ist, wie z.B. eine Goldmarkierung oder eine Fluores'zenzmarkierung, oder aber auch so ausgestaltet sein kann, dass eine Zugabe weiterer Reagenzien die Bestimmung ermöglicht. Beispielsweise kann ein Enzymsubstrat in einem zweiten Schritt auf den Teststreifen aufgegeben werden, oder aber in einem
separaten Bereich des TestStreifens anwesend sein, den die Probenflüssigkeit einschließlich dem zweiten Rezeptor durchwandert .
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist der Teststreifen so angeordnet, dass zwischen der Auftragzone und den weiteren Bereichen des Teststreifens ein Filter angeordnet ist, der unlösliche Bestandteile der Probe zurückhält.
Um eine zügige Durchwanderung des Teststreifens zu gewährleisten, kann hinter den Detektionsbereich ein flüssigkeitsaufsaugendes Medium aufgebracht sein, welches im Wesentlichen die gesamte Flüssigkeitsmenge der aufgetragenen Probe aufsaugen kann.
Die- Anwesenheit eines solchen flüssigkeitsaufsaugenden Mediums verstärkt die Kapillarkräfte, welche die Durchwanderung des Teststreifens durch die Probenflüssigkeit vorantreiben.
Bevorzugt ist der lösliche zweite Rezeptor ein markierter Antikörper.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert .
Beispiel 1
Einwiegen der Stuhlproben
Ein etwa 12 ml umfassendes Einwegröhrchen und eine mikrobiologische ImpfÖse (z,B. Sarstedt) werden mit einer empfindlichen digitalen Laborwaage auf 0 austariert. Anschließend wird mit der Impföse der Stuhl eingewogen, indem man mit der Öse in die Stuhlprobe sticht und die an der Spitze verbleibende Stuhlmenge (etwa 100 mg) in das
Einwegröhrchen einbringt. An Stelle der ImpfÖse kann auch ein Zahnstocher benutzt werden.
Entsprechend der gewogenen Stuhlprobenmasse werden die Volumina des zuzugebenden Extraktionspuffers variiert (z.B. 100 mg Stuhl + 10 ml Puffer oder 75 mg Stuhl + 7,5 ml Puffer) . End-konzentration: 10 mg Stuhl/ml Extraktionspuffer.
Beispiel 2 Homogenisation und Extraktion der Stuhlproben
Die Stuhlprobensuspension wird bei Raumtemperatur mehrfach kräftig mit einem Reagenzglas-Schüttelgerät (z.B. VORTEX) gemixt. Die Stühle müssen gut homogenisiert sein. Um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten, ist es wichtig, dem phosphatgepufferten Extraktionspuffer das Detergens CHAPS (3- [ (3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- propansulfonat, 10 mM (Sigma) beizumischen.
Beispiel 3 a) Stuhl
Es wird eine ELISA-Platte mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet, der nur die cytosolische Isocitrat-Dehydrogenase erkennt. Der monoklonale
Antikörper wurde mittels gereinigter cytosolischer NADP-abhängiger Isocitratdehydrogenase nach dem von Köhler und Milstein bekannten Verfahren hergestellt und auf Selektivität gescreent . Dabei bindet die cytosolische NADP-abhängige Isocitriat-Dehydrogenase aus verdünnten Stuhlproben und aus Standards an den Antikörper und wird so an der Platte immobilisiert . Ein zweiter monoklonaler Antikörper, der biotinyliert ist, bindet im nächsten Inkubationsschritt an die
cytosolische NADP-abhängige Isocitrat- Dehydrogenase. Danach bindet ein Konjugat von POD (Peroxidase) und Streptavidin an die Biotineinheit . Die Peroxidase oxidiert ABTS (2,2- Azino-bis- (3-ethylbenzo-thiazolin-6-sulfonsäure) diammoniumsalz) unter Ausbildung einer dunklen grünen Färbung. Die Konzentration von oxidiertem ABTS wird dann auf an sich bekannte Weise fotometrisch bestimmt .
b) Serum
Wie in a) beschrieben wird ein Serum eines Patienten, das auf übliche Weise gewonnen wurde, mit der gleichen ELISA- Platte getestet . Dabei wurde die Probe in einer Verdünnungsreihe jeweils 1:10 verdünnt und die verdünnten Proben auf ihre Nachweisgrenze hin untersucht, wobei sich eine hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Tests zeigt .
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Claims
1. Verfahren zum Nachweis eines malignen tumorösen Zustandes mittels einem Markerenzym, dadurch gekennzeichnet, dass als Markerenzym cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase [E.C. 1.1.1.42] und/oder Teilstücke davon in einer Körperflüssigkeit und/oder Stuhl qualitativ und/oder quantitativ bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Körperflüssigkeitsprobe Plasma, Serum, cerebrospinales Fluid, Ejakulat, Speichel, Sputum oder/und Urin verwendet wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung mittels eines Rezeptors durchgeführt wird, der die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase oder Teilstücke derselben spezifisch erkennt und andere Isocitrat-Dehydrogenase-Isoenzyme oder Teile derselben diskriminiert.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
die Probe mit einem Rezeptor in Kontakt gebracht wird, der an einer festen Phase gebunden ist, wobei der Rezeptor die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase oder die Teilstücke bindet,
die Probe nach der Bindung der Dehydrogenase an den Rezeptor abgetrennt und die gebundene Dehydrogenase detektiert wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Rezeptor polyklonale Antikörper und/oder monoklonale Antikörper verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebundene Markerenzym mittels einem zweiten löslichen markierten Rezeptor, der die cytosolische NADP- abhängige Isocitrat-Dehydrogenase oder gebundene Teilstücke der selben spezifisch erkennt, einen Schwingquarz, Mikrowaage, oder einen Elektrolumineszenztest durchfuhrt .
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des Markerenzyms mittels Massenspektroskopie durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als weiteres Markerenzym Tumor M2 Pyruvat-Dehydrogenase [E.C.
2.7.1.40] und/oder der cytosolischen NADP-abhängigen Malatdecarboxylase [E.C.1.1.1.40] bestimmt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man damit den Grad und die Intensität des malignen Zustandes bestimmt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Festlegung eines therapeutischen Behandlungsschemas durchgeführt wird.
11. Testkit zum Nachweis eines malignen Zustandes nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens einen cytosolischen NADP- abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase spezifisch bindenden ersten Rezeptor umfasst, der andere Enzyme und Isoenzyme diskriminiert.
12. Testkit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass er einen weiteren Rezeptor umfaßt, der ebenfalls an die cytosolische NADP-abhängige Isocitrat- Dehydrogenase bindet und der einen detektierbaren Marker aufweist und/oder die Bindung an einen detektierbaren Marker vermittelt.
13. Testkit nach Anspruch 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor ein monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper ist und/oder spezifisch bindefähige Antikörperteile umfaßt.
14. Testkit nach einem der Ansprüche 11 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, dass der erste Rezeptor an eine feste Phase gekoppelt vorliegt.
15. Testkit nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass er weitere für einen Sandwich-, ELISA-, Schwingquarz-, Mikrowaage- oder
Elektrochemolumineszenztest notwendige Reagenzien oder/und Vorrichtungen enthält .
16. Testkit nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er in Form eines Teststreifens ausgebildet ist, der eine Auftragzone für die Probe sowie weitere Abschnitte in einer Anordnung aufweist,
in der eine im Probeauftragbereich aufgetragene Flüssigkeit enthaltende Probe bis zu einer Detektionszone durchwandert, in der das Testergebnis abgelesbar ist.
17. Verwendung eines Testkits nach einem der Ansprüche 11 bis 16 zum qualitativen oder/und quantitativen selektiven Nachweis von cytosolischer NADP-abhängiger Isocitrat-Dehydrogenase in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, und/oder Exkrementen, zur Bestimmung des Ausmaßes und Grades einer malignen Erkrankung, und/oder Bestimmung eines therapeutischen Behandlungsschemas .
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5952177A (en) * | 1997-12-03 | 1999-09-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human cytosolic isocitrate dehydrogenase |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MAZUREK, S. E TAL: "Tumor M2-PK and glutaminolytic enzymes in the metabolic shift of tumor cells" ANTICANCER RESEARCH, Nr. 20, 2000, Seiten 5151-5154, XP009000350 in der Anmeldung erwähnt * |
| MAZUREK, S. ET AL: "Energy metabolism in the involuting mamary gland" IN VIVO , Bd. 13, Nr. 6, November 1999 (1999-11), Seiten 467-477, XP009000352 Athens, greece * |
| MENACHE, R. ET AL: "Enzymes and isoenzymes in different body tissue and fluids in bening and malignant gynecological tumors" ISRAEL JOURNAL OF MEDICAL SCIENCES, Bd. 13, Nr. 8, August 1977 (1977-08), Seiten 848-851, XP009000353 * |
| SHARMA, A. ET AL: "Isocitric dehydrogenase of the cerebrospinal fluid in brain tumours and meningitis" INDIAN JOURNAL OF MEDICAL RESEARCH, Bd. 72, Nr. 3, 1980, Seiten 458-460, XP009000351 * |
Also Published As
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