CN115927605A - Pla2g12b作为糖尿病肾病生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疾病检测技术领域，具体涉及PLA2G12B作为糖尿病肾病生物标志物及其应用。本发明通过在临床标本、动物模型以及体外实验三个层面上发现PLA2G12B在糖尿病肾脏损伤中表达增加，且其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关，发现PLA2G12B具有作为糖尿病肾损伤的生物标志物的潜力；进一步通过验证该指标在糖尿病肾病患者中的诊断效能，表明其可以用于糖尿病患者肾脏损伤的早期诊断，具有较高的灵敏度、特异度和正确率，因此具有良好的临床应用价值和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于疾病检测技术领域，具体涉及PLA2G12B作为糖尿病肾病生物标志物及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
糖尿病肾病（DN）等发病率逐年升高，导致了患者死亡率升高、住院周期延长和医疗费用增加。目前的诊断工具对糖尿病肾脏损伤的早期诊断灵敏度较低。寻找一个早期、可靠、重复性好、经济和精确的肾损伤生物学标志物是一项重要的研究课题。近年来，许多血清和尿液蛋白质作为可能的糖尿病肾病早期标志物被广泛研究，但由于往往敏感性和特异性很差,并不能对糖尿病早期肾损伤进行有效的筛查及诊断。
磷脂酶A2（phospholipaseA2, PLA2）是一类能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶，是介导花生四烯酸代谢及多种细胞活性物质产生的关键分子。分泌型的磷脂酶A2亚家族（sPLA2）是磷脂酶A2中最大一个亚家族，是一类能够在磷脂二位酰基位点选择性水解酯键的酶，与糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、心血管疾病等代谢及炎症相关疾病有重要的关系，迄今为止在体内共发现了11种分泌型磷脂酶A2的亚型。XIIB组磷脂酶A2（PLA2G12B）是磷脂酶A2的一个亚型，与同家族的其他成员不同，PLA2G12B在其活性位点由碱性的组氨酸突变为亮氨酸，可能导致其磷脂酶活性丧失。文献报道，PLA2G12B是调节极低密度脂蛋白(VLDL)分泌的重要分子，PLA2G12B敲除小鼠发生严重的低血脂症，而肝脏中有大量的脂质积累。发明人发现，针对其在糖尿病肾病中的作用尚未有研究报道。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供PLA2G12B作为糖尿病肾病生物标志物及其应用。本发明通过研究发现，PLA2G12B在糖尿病肾脏损伤中表达增加，且其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关，发现PLA2G12B具有作为糖尿病肾损伤的生物标志物的潜力。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明的第一个方面，提供检测PLA2G12B表达的物质在制备糖尿病肾病检测产品中的应用；其中，所述糖尿病肾病检测产品为用于糖尿病肾病的筛查、诊断或辅助诊断、监测和预后评估的产品。
具体的，本发明通过研究发现，PLA2G12B在糖尿病肾病中表达增加，且其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关。同时，通过验证该指标在糖尿病肾病患者中的诊断效能，表明其可以用于糖尿病患者肾脏损伤的早期诊断，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过在临床标本、动物模型以及体外实验三个层面上发现PLA2G12B在糖尿病肾脏损伤中表达增加，且其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关，发现PLA2G12B具有作为糖尿病肾损伤的生物标志物的潜力；进一步通过验证该指标在糖尿病肾病患者中的诊断效能，表明其可以用于糖尿病患者肾脏损伤的早期诊断，具有较高的灵敏度、特异度和正确率，因此具有良好的临床应用价值和社会效益。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例中糖尿病肾病（DN）患者血清中PLA2G12B的表达情况。其中，a为DN组与对照组（糖尿病无肾脏并发症患者）血清中PLA2G12B表达水平比较图，*表示与糖尿病无肾脏并发症患者（对照组）相比，P<0.05。b为糖尿病肾病患者血清中PLA2G12B的表达水平与24h尿蛋白之间的关系图。c为糖尿病肾病患者血清中PLA2G12B的表达水平与血肌酐之间的关系图。d为糖尿病肾病患者血清中PLA2G12B的表达水平与肾小球滤过率（eGFR）之间的关系图。
图2是本发明实施例中糖尿病肾病（DN）患者肾脏病理切片中PLA2G12B的表达情况。其中，a为糖尿病肾病患者与正常对照组免疫组化结果图。b为ImageJ统计糖尿病肾病患者与正常对照组病理切片中PLA2G12B在肾小球的表达水平，*表示与正常肾脏组织相比，P<0.05。c为糖尿病肾病患者病理切片中PLA2G12B的表达含量与血肌酐之间的关系图。d为糖尿病肾病患者病理切片中PLA2G12B的表达含量与肾小球滤过率之间的关系图。
图3是本发明实施例中不同浓度高糖（15、30 mmol/L D-葡萄糖）处理足细胞后基于RT-qPCR获得的PLA2G12BmRNA表达情况图。*表示与正常对照组相比，P<0.05。
图4是本发明实施例中不同浓度高糖（15、30 mmol/L D-葡萄糖）处理足细胞后基于Western Blot获得的PAL2G12B蛋白的表达情况图。*表示与正常对照组相比，P<0.05。
图5是本发明实施例中不同浓度糖基化终末期产物（AGEs，25、50、100 mmol/L）处理足细胞后基于Western Blot获得的PAL2G12B蛋白的表达情况图。*表示与正常对照组相比，P<0.05。
图6是本发明实施例中不同浓度棕榈酸（PA，100、200、400 μmol/L）处理足细胞后基于RT-qPCR获得的PLA2G12BmRNA表达情况图。*表示与正常对照组相比，P<0.05。
图7是本发明实施例中不同浓度棕榈酸（PA，100、200、400 μmol/L）处理足细胞后基于Western Blot获得的PAL2G12B蛋白的表达情况图。*表示与正常对照组相比，P<0.05。
图8是本发明实施例中使用高糖（D-葡萄糖30 mmol/L）、AGEs（100 mmol/L）、PA（400 μmol/L）分别刺激足细胞，基于细胞荧光染色获得的PLA2G12B的表达水平图，其中，DAPI用于标记足细胞细胞核。
图9是本发明实施例中血清检测标志物PLA2G12B在糖尿病肾病患者中的诊断效能ROC曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供检测PLA2G12B表达的物质在制备糖尿病肾病检测产品中的应用。其中，所述糖尿病肾病检测产品为用于糖尿病肾病的筛查、诊断或辅助诊断、监测和预后评估的产品。
其中，针对糖尿病肾病的诊断或辅助诊断具体为早期诊断或早期辅助诊断。
本发明通过试验验证，PLA2G12B在糖尿病肾病患者中表达增加，其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关；且高糖、糖基化终末期产物及棕榈酸均可诱导足细胞中PLA2G12B的蛋白及mRNA水平升高，且存在剂量依赖性。上述结果表明PLA2G12B在糖尿病肾病表达显著增加，且其水平变化与糖尿病肾病的病程进展密切相关。因此其可用于糖尿病肾病的筛查、（辅助）诊断、检测和预后评估。
所述检测PLA2G12B表达的物质可以是采用诸如ELISA、免疫荧光等检测待测样本中PLA2G12B蛋白表达情况的物质；
或者，所述检测PLA2G12B表达的物质还可以是采用诸如RT-PCR、RNAscope原位杂交等检测待测样本中PLA2G12B编码基因的表达水平的物质。
所述待测样本为人源样本，更具体的，所述待测样本为人血液样品，具体为人血清。
所述糖尿病肾病检测产品可以是检测试剂盒、检测装置或设备等，在此不做具体限定；上述产品可用于糖尿病肾病的筛查、（早期）诊断或（早期）辅助诊断、监测和预后评估。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
本实施例通过在临床标本、动物模型及体外实验三个层面上发现PLA2G12B在糖尿病肾脏损伤中表达增加，且其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关，发现PLA2G12B具有作为糖尿病肾损伤的生物标志物的潜力。
a)获取临床标本：从住院患者中获得总合计37例患者血清样本，其中糖尿病无肾脏并发症患者血清18例，DN患者血清19例。肾活检标本取自山东大学医学院病理科，其中包括4个肾脏组织正常的对照样本和6个DN患者的样本。
b)临床标本检测：
进行酶联免疫吸附试验(ELISA)以评估血清PLA2G12B蛋白的浓度，ELISA试剂盒购自ShareBio有限公司，严格按照制造商的指导原则进行操作。将患者血清样本在稀释缓冲液中稀释100倍，将稀释后血清样本以100μL/孔加入到96孔微量滴定板中，进行PLA2G12B蛋白浓度分析，通过测量450nm处的吸光度来确定信号，采用独立样本t检验比较组间变量差异。
收集DN患者的肾脏穿刺活检标本。采用免疫组化、免疫荧光染色及RNAscope原位杂交等技术检测相关基因在足细胞中的表达变化，采用免疫荧光双标结合激光共聚焦技术确定PLA2G12B在足细胞的亚细胞定位。
c)体外模拟DN条件下PLA2G12B的表达情况
体外培养人肾小球足细胞（HPC），采用不同的刺激条件模拟DN，包括：高糖（HG）、糖基化终末期产物（AGEs）及棕榈酸（PA）处理足细胞。
从糖尿病肾病患者血清结果来看，如图1的a中ELISA所示，DN患者（n=19）与糖尿病无肾脏并发症患者血清（n=18）相比，血清中PLA2G12B表达显著增加。而图1中b则表明糖尿病肾病患者血清中PLA2G12B的含量与尿蛋白呈正相关（Spearman r=0.7439，P<0.001）。图1中的c则显示糖尿病肾病患者血清中PLA2G12B的含量与血肌酐呈正相关（Spearman r=0.5483，P<0.01）。图1中的d则表明糖尿病肾病患者血清中PLA2G12B的含量与肾小球滤过率（eGFR）呈负相关（Spearman r=-0.6486，P<0.001）。
从糖尿病肾病（DN）患者肾脏病理切片结果来看，如图2中a中的免疫组化结果所示，PLA2G12B在糖尿病肾病患者的病理切片中表达升高。图2中的b则显示了基于ImageJ统计患者病理切片中PLA2G12B在肾小球的表达水平，表明与正常对照组相比，糖尿病肾病患者PLA2G12B表达水平升高。图2中的c则表明糖尿病肾病患者病理切片中PLA2G12B的表达含量与血肌酐呈正相关（Spearman r=0.6423，P<0.005）。图2中的d表明糖尿病肾病患者病理切片中PLA2G12B的表达含量与肾小球滤过率呈负相关（Spearman r=-0.6896，P<0.005）。
综上，由上述分析可知，PLA2G12B在糖尿病肾病患者中表达增加，其表达水平与血肌酐和尿蛋白呈正相关，与估算的肾小球滤过率呈负相关；而从体外模拟DN条件下PLA2G12B的表达情况来看，如图3-8所示，其中图3为使用不同浓度高糖（15、30 mmol/L D-葡萄糖）处理足细胞，RT-qPCR实验结果显示，PAL2G12BmRNA的表达水平随刺激浓度的升高而逐渐升高（n=6）。图4为使用不同浓度高糖（15、30 mmol/L D-葡萄糖）处理足细胞，Western Blot实验结果显示，PAL2G12B蛋白的表达水平随刺激浓度的升高而逐渐升高（n=6）。图5为不同浓度糖基化终末期产物（AGEs，25、50、100 mmol/L）处理足细胞，WesternBlot实验结果显示，PAL2G12B蛋白的表达水平随刺激浓度的升高而逐渐升高（n =6）。图6为不同浓度棕榈酸（PA，100、200、400 μmol/L）处理足细胞，RT-qPCR实验结果显示，PAL2G12BmRNA的表达水平随刺激浓度的升高而逐渐升高（n=6）。图7为不同浓度棕榈酸（PA，100、200、400 μmol/L）处理足细胞，Western Blot实验结果显示，PAL2G12B蛋白的表达水平随刺激浓度的升高而逐渐升高（n=6）。图8为PLA2G12B细胞荧光实验结果，使用D-葡萄糖（30mmol/L）、AGEs（100 mmol/L）、PA（400 μmol/L）分别刺激足细胞，PLA2G12B的表达水平在足细胞中升高明显（n=6）。
上述结果从基因和蛋白水平证明，高糖、糖基化终末期产物及棕榈酸均可诱导足细胞中PLA2G12B的蛋白及mRNA水平升高，且存在剂量依赖性。而高糖、糖基化终末期产物及棕榈酸均是引起糖尿病肾病足细胞损伤的主要物质基础，在糖尿病肾病的发病机制和发生发展过程中起到重要作用。因此上述结果进一步验证了PLA2G12B在糖尿病肾病表达显著增加，其水平变化与糖尿病肾病的进展密切相关。因此PLA2G12B具有作为糖尿病肾病的生物标志物的潜力，也因此其可以用于糖尿病肾病的筛查、诊断、监测和预后。
最后，使用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线）进一步验证血清PLA2G12B在糖尿病肾病患者中的诊断效能。其自变量（检验项目）为连续性变量（在本实施例中即血清中PLA2G12B的表达水平），因变量为二分类变量（在本实施例中具体为18例糖尿病无肾脏并发症患者和19例糖尿病肾病患者），以真阳性率（敏感度，Sensitivity）为纵坐标，假阳性率（1-特异度，1-Specificity）为横坐标基于SPSS进行绘制，即得到如图9所示的ROC曲线，其ROC曲线下面积（AUC）为0.982，敏感性100.0％，特异性94.4％，准确率97.3％，本发明结果显示，血清PLA2G12B可以用于糖尿病肾病患者的早期诊断，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。这就为进一步的临床研究提供了重要依据，为糖尿病肾病的诊治方案提供了新思路。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (8)
1.检测PLA2G12B表达的物质在制备糖尿病肾病检测产品中的应用；所述糖尿病肾病检测产品为用于对糖尿病肾病的筛查、诊断或辅助诊断、监测和预后评估的产品。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，对糖尿病肾病的诊断或辅助诊断为早期诊断或早期辅助诊断。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测PLA2G12B表达的物质包括采用ELISA、免疫荧光检测待测样本中PLA2G12B蛋白表达情况的物质。
4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测PLA2G12B表达的物质包括采用RT-PCR、RNAscope检测待测样本中PLA2G12B编码基因的表达水平的物质。
5.如权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述待测样本为人源样本。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述人源样本为人血液样本。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述人血液样本为人血清。
8.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述糖尿病肾病检测产品为检测试剂盒。
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| WO2010040571A2 (en) * | 2008-10-10 | 2010-04-15 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases |
| CN109765380A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-17 | 郑州大学第一附属医院 | 一种检测早期糖尿病肾病的标记物及应用方法 |
| CN110960535A (zh) * | 2018-09-30 | 2020-04-07 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 18β-甘草次酸在制备脂代谢异常相关疾病药物中的应用 |
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