CN108267593A - 一种基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒、制备及使用方法。所述试剂盒包括:抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段;本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的cTnI诊断试剂盒的制备方法,该方法包括:抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备;最后还公开了该试剂盒的使用方法;本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点,便于临床检测使用,其应用于急性心肌梗死的诊断,可以提高急性心肌梗死检测的准确率,具有极大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内cTnI的含量,属于疾病诊断检测领域。
背景技术
心血管疾病是威胁人类生命健康的第一重大疾病。根据世界卫生组织最新统计,全球每年有1670万人死于各类心脑血管疾病,这一数字占所有疾病死亡的29.2%,其中有一半以上死于急性心肌梗死。在我国,近10年来,我国急性心肌梗死的发病率明显上升,已接近国际平均水平。冠心病发病率占总人口的6%左右,实际的冠心病患者人数达780万人。而且由于缺乏冠心病的防治常识,很多患者就诊时已到晚期,以急性心肌梗死(AMI)为首发症状。
心肌肌钙蛋白(cTnI)灵敏度高、特异性强、发病后持续时间长,几乎完全具有心肌组织特异性并具有高度敏感性,因此是评价心肌坏死的首选标志物。即使心肌组织发生微小区域的坏死也能检查到cTn的升高。cTn的升高对于诊断急性心肌梗死至关重要。目前cTn主要用于心肌缺血损伤的临床诊断、危险性估计和预后判断,此外还可用于MI后临床溶栓治疗效果判定;心肌缺血损伤面积的估计、临床诊断心肌炎、心肌创伤(心脏手术)、围手术期心脏并发症、严重脓毒血症或脓毒血症导致的左心衰竭、充血性心功能不全,以及某些治疗药物的临床疗效观察等。因此,如何快速、特异性、高灵敏度的检测体内肌钙蛋白的水平对于心肌梗死患者的诊断和治疗具有重要的意义,具有广泛的临床应用前景和市场潜力。
目前cTnI检测方法主要有层析免疫法、酶联免疫吸附试验和磁微粒化学发光法。层析免疫法实验快速,但该方法灵敏度低、无法动态监测cTnI含量的变化。酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低,并且反应时间较长。磁微粒化学发光法具有操作简单,检测速度快等特点,但是该方法是非均相反应,需要清洗,降低了检测的精密度。
为解决上述问题,利用双分子荧光互补技术,以cTnI的抗体构建技术平台,研发出一种简便、直观、灵敏高、准确性好的cTnI检测试剂。将其应用于急性心肌梗死的监测,可提高检测的准确率,具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明提供一种可用于定量检测cTnI的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现:
一种制备基于双分子荧光互补技术cTnI检测试剂盒的方法,包括如下步骤:
1)抗cTnI抗体偶联荧光蛋白N端片段;
2)抗cTnI抗体偶联荧光蛋白C端片段;
在上述技术方案中,所述抗cTnI抗体为针对cTnI不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
在上述方案中,所述抗cTnI抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中,荧光蛋白N端片段与抗cTnI抗体的质量比为1∶1-10。
在上述方案中,所述抗cTnI抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中,荧光蛋白C端片段与抗cTnI抗体的质量比为1∶1-10。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒。其主要组成包括:
1)抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段;
2)抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段,混合反应5-60分钟;
2)激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒原理示意图,其中, 1-抗cTnI抗体,2-连接剂,3-荧光蛋白N端片段,4-待测物(cTnI),5-抗cTnI抗体,6-荧光蛋白C端片段,7-连接剂。
图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
抗cTnI抗体偶联荧光蛋白N端片段,以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例,具体实施过程为:
1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中,用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25%的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗cTnI抗体,用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体,将活化的YFPN蛋白和抗体混合。
6)4℃,反应过夜。
7)封闭:加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液,室温封闭2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物,用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物,使用前稀释至所需浓度。
实施例2
抗cTnI抗体偶联荧光蛋白C端片段,以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC 为例,具体实施过程为:
1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中,用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25%的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗cTnI抗体,用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体,将活化的YFPC蛋白和抗体混合。
6)4℃,反应过夜。
7)封闭:加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液,室温封闭2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物,用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物,使用前稀释至所需浓度。
实施例3
试剂盒主要组成:
1)抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段;
2)抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
实施例4
试剂盒使用方法,包括如下步骤:
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段,混合反应5-60分钟;
2)激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价:
1.线性
配制浓度为0ng/ml,0.05ng/ml,0.2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,25ng/ml,50ng/ml的cTnI标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段,加入50μl抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段,37℃温育10分钟。温育后,激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
以荧光信号值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
回收率试验:用已知量cTnI标准品加入到正常人的血清标本中,测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较,计算cTnI的回收率。检测结果如下:
样本编号 | 加入cTnI浓度(ng/ml) | 测量cTnI的浓度(ng/ml) | 回收率(%) |
1 | 0.10 | 0.10 | 100 |
2 | 1 | 1.03 | 103 |
3 | 5 | 5.13 | 102.6 |
4 | 25 | 24.6 | 98.4 |
3.精密度
选取3份不同浓度的标本,分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果,计算平均偏差CV值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为:是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点,计算其平均值(X)和标准差(SD),以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.01ng/ml。
5.抗干扰性
检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到cTnI阳性血清标本中,使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到cTnI阳性血清标本中,使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到cTnI阳性血清标本中,使血清中胆红素的含量分别为25μg/ml、 50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的cTnI阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率,回收率在98.7%-101.6%之间。表明基于双分子荧光互补技术的 cTnI试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示,与雅培cTnI试剂盒的相关性为:y=1.031x-0.056,R2=0.999。
本发明与现有方法和产品相比,具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低,对检测仪器要求低的优点。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒、制备及使用方法,其特征在于:
1)试剂盒主要组成:抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段;
2)使用方法:在试剂盒的反应孔中加入样本、抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnI抗体偶联的荧光蛋白C端片段,混合反应5-60分钟;
3)检测方法:激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
2.一种基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)抗cTnI抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备;
2)抗cTnI抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。
3.根据权利要求1所述的抗cTnI抗体为针对cTnI不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的荧光蛋白,包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒制备的方法,其特征在于,所述的抗cTnI抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中,荧光蛋白N端片段与抗cTnI抗体的质量比为1∶1-10。
6.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的cTnI检测试剂盒制备的方法,其特征在于,所述的抗cTnI抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中,荧光蛋白C端片段与抗cTnI抗体的质量比为1∶1-10。
7.根据权利要求1所述的反应孔,包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。
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