CN108226524A

CN108226524A - 一种基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒、制备及使用方法

Info

Publication number: CN108226524A
Application number: CN201711272565.5A
Authority: CN
Inventors: 徐林
Original assignee: Nanjing Tianzong Yikang Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Tianzong Yikang Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的cTnT诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的cTnT诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作快速、特异性好、精密度好、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于心肌损伤的监测，可以提高急性心肌损伤诊断的准确率，具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒、制备及使用方法

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内cTnT的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

肌钙蛋白T(TnT)分子量为37KD，是原肌球蛋白结合亚基。有三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白T(sTnT)包括快骨骼肌型和慢骨骼肌型，此外还有心肌型。心肌肌钙蛋白T(cTnT) 的大部分是以C-T-I的复合物形式存在于细丝上，6％-8％以游离的形式存在于心肌细胞浆中。因cTnT与骨骼肌TnT的基因编码不同，骨骼肌中无cTnT的表达。cTnT相对于两种骨骼肌亚型有40％的不同源性。cTnT分子稳定、亲水、特异性抗原决定簇的反应性好。

患有各种冠状动脉疾患的病人必然会发生心肌细胞损伤。有些病人的临床表现可能不完全符合WHO关于急性心肌梗死(AMI)诊断标准(不稳定心绞痛就是其中之一)，但却伴有某些心肌损伤标志物(如cTnT等)升高，从而导致细胞内的组成成分渗漏入外周血循环。这使得心肌细胞损伤标志物的检测成为可能。cTnT和cTnI在AMI后(3-6小时)血中浓度很快升高，和CK-MB(3-8小时)相当或稍早，它们测定的特异性和灵敏度明显高于CK-MB。cTn具有相当的诊断窗口期(cTnI 7-9天，cTnT更长)。cTn对急性胸痛病人(无论有无骨骼肌损伤)的诊断均优于CK-MB。研究表明：在对AMI的诊断方面cTnI和cTnT无显著差异，都能鉴别出CK-MB 所不能检测出的心肌损伤。相对cTnT而言，cTnI显示出较低的初始灵敏性和较高的特异性。就上升的相对值来说，cTnT比cTnI高；在不稳定心绞痛病人中cTnT上升的频度比cTnI高。在AMI后30天死亡率的预报方面，cTnT优于cTnI。无论是不稳定心绞痛还是无Q波的心肌梗死，最初24小时的cTnT最具预后价值。对不稳定冠状动脉疾患病人的随访发现，cTnT 和运动试验两项都正常者，死亡或AMI的仅1％；若异常，死亡或AMI可达50％。

常用的cTnT检测方法有胶体金免疫层析法、电化学发光法和磁微粒化学发光法。虽然胶体金免疫层析法检测速度快，但检测结果准确度越来越不能满足要求。电化学发光法提高了检测的灵敏度和准确度，但和磁微粒化学发光法一样都属于非均相反应，操作过程需要清洗，降低了试剂的精密度。

为解决上述问题，如果能利用cTnT的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对心肌损伤诊断的cTnT快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作快速、灵敏度高、检测快速、精密度高等优点；将其应用于急性心肌损伤的监测，可以提高急性心肌损伤诊断的准确率，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测cTnT的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术cTnT检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗cTnT抗体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗cTnT抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗cTnT抗体为针对cTnT不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗cTnT抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗cTnT抗体的质量比为1∶1-10。

在上述方案中，所述抗cTnT抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗cTnT抗体的质量比为1∶1-10。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒。其主要组成包括：

1)抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗cTnT抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(cTnT)，5-抗cTnT抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。

图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

抗cTnT抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN 为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗cTnT抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例2

抗cTnT抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗cTnT抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

8)4℃放置2h。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，25ng/ml的cTnT标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

回收率试验：用已知量cTnT标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算cTnT的回收率。检测结果如下：

样本编号	加入cTnT浓度(ng/ml)	测量cTnT的浓度(ng/ml)	回收率(％)
				1	1	0.96	96.0
2	5	5.2	104.0
				3	10	9.7	97.0
4	20	19.4	97.0

3.精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。

4.分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.01ng/ml。

5.抗干扰性

检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测血清标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到cTnT 阳性血清标本中，使血清标本中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到cTnT阳性血清标本中，使血清标本中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、 1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到cTnT阳性血清标本中，使血清标本中胆红素的含量分别为25μg/ml、50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的cTnT阳性血清标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在94.1％-104.3％之间。表明基于双分子荧光互补技术的cTnT试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6.相关性

如图3所示，与罗氏公司cTnT试剂盒的相关性为：y＝1.014x+0.011，R²＝0.999。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：

1)试剂盒主要组成：抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段；

2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗cTnT抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

2.一种基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)抗cTnT抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；

2)抗cTnT抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。

3.根据权利要求1所述的抗cTnT抗体为针对cTnT不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗cTnT抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与cTnT抗体的质量比为1∶1-10。

6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的cTnT检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗cTnT抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与cTnT抗体的质量比为1∶1-10。

7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。