CN101368966A - 一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒 - Google Patents

一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒 Download PDF

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CN101368966A CN 200810105418 CN200810105418A CN101368966A CN 101368966 A CN101368966 A CN 101368966A CN 200810105418 CN200810105418 CN 200810105418 CN 200810105418 A CN200810105418 A CN 200810105418A CN 101368966 A CN101368966 A CN 101368966A
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张倩云
应希堂
宋胜利
胡国茂
郑金来
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Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地提供了一种胃泌素释放肽前体(31－98)的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。本发明采用生物素－链霉亲和素系统包被抗体，提高了抗体包被的效率，同时也能提高灵敏度。本发明为小细胞肺癌的诊断提供了操作简便、检测结果灵敏、准确的化学发光试剂盒，可满足临床诊断的需要。

Description

一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种胃泌素释放肽前体(31-98)(proGRP(31-98))的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法，本发明方法采用一步免疫分析方法，以链亲合素-生物素系统包被proGRP(31-98)单克隆抗体。本发明试剂盒具有操作简便、性能可靠、灵敏、准确特点，为小细胞肺癌的早期诊断提供了可靠的检测方法。
背景技术
工业化社会里，肺癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的首位。主要原因是由于工业和交通发达地区，石油，煤等燃烧后产生的含有苯并芘致癌烃等可致肺癌的有害物质污染大气有关。另外吸烟为导致肺癌的主要个人因素，我国吸烟的情况非常严重，近3亿人口有吸烟习惯，青少年中吸烟者亦为数不少。长期吸烟可引致支气管粘膜上皮细胞增生，磷状上皮恶化生长，诱发鳞状上皮癌即肺癌或未分化小细胞癌。世界各国都加强了对肺癌的研究，然而肺癌的确切病因至今仍然没有完全了解。对肺癌的治疗仍需要早期诊断，早期治疗，从而提高癌症的治愈率。另外肺癌的治愈率也主要取决于肺癌的类型，肺癌有小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两种，两种肺癌需要不同的治疗手段，且预后效果不同，因此需要区别SCLC和NSCLC，从而采取不同的治疗手段，达到做好的治疗效果。其中SCLC在肺癌中的比例约为20-25％。
为了早期诊断、早期治疗小细胞肺癌，癌胚抗原、鳞状上皮细胞抗原、组织角蛋白三种肿瘤标志物广泛的用来作为特异的神经特异性抗原(NSE)的补充标志物。但由于这三种标志物特异性很低，并且与其它肿瘤有交叉，所以没有达到理想的早期诊断效果。另外由于NSE的灵敏度不高，需要两种标志物进行联合检测。
有报道指出胃泌素释放肽(GRP)在小细胞肺癌病人血液中有表达，且特异性很高。但是GRP在血液中含量低且不稳定，容易分解，从而给GRP的检测带来了极大的不方便。近年来，胃泌素释放肽前体(proGRP)得到深入研究，已证实其特异性、灵敏性均高于其他的肿瘤标志物，在小细胞肺癌的早期诊断中成为特异的肿瘤标志物。正是由于proGRP针对小细胞肺癌的诊断特异性不断得到证实，proGRP的特异抗体性能不断得到提高，proGRP单克隆抗体的成功制备为proGRP的免疫分析提供了可靠的原材料。proGRP有三个肽段：即1-27的信号肽段，该段在GRP的表达中不起作用；28-30封闭肽段，该段蛋白氨基化或者胰岛素化；另外就是31-98肽段，该肽段是对GRP表达的主要肽段。proGRP的31-98多肽片断在SCLC血液中含量升高最显著，大概是GRP含量的400多倍，因此，proGRP(31-98)多肽片断的检测就是本发明试剂盒的检测对象。
proGRP(31-98)的免疫分析多采用酶联免疫吸附(ELSIA)分析技术。ELISA技术由于其分析灵敏度不高，因而限制了其发展和使用。化学发光免疫分析法结合了免疫反应的高特异性和化学发光反应的高灵敏性，仪器简单，成本低廉，可达到10-18摩尔检测水平，且检测范围可达6个数量级，因而得到了越来越多的关注。链亲合素-生物素包被系统早已广泛应用在免疫分析医学领域。链亲合素包被固相载体，生物素化抗体，因此在链亲合素-生物素包被系统中，固相载体采用共价键结合生物素化的抗体，从而实现定向的共价键包被抗体，既有利于保持抗体的活性，又能充分暴露抗体的结合位点。与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大节省原材料的使用量，大大提高检测的灵敏度和准确性。
发明内容：
(一)需要解决的技术问题
本发明为了解决小细胞肺癌早期诊断的特异性问题，以化学发光免疫分析技术为技术平台，建立了proGRP(31-98)的免疫分析方法，并实现试剂盒的制备，满足临床检测的需要。本发明采用链亲合素-生物素系统包被抗体，节省抗体原料用量，延长包被固相的使用期限，从而为试剂盒的广泛推广应用提供了有利因素。
本发明的目的是提供一种定量测定proGRP(31-98)化学发光免疫分析试剂盒，并提供一种制备上述试剂盒的方法。
(二)技术方案
本发明所述检测proGRP(31-98)化学发光免疫分析方法及组装试剂盒中包括：proGRP(31-98)校准品；proGRP(31-98)单克隆抗体包被的微孔板；辣根过氧化物酶标记的proGRP单克隆抗体；发光底物液；浓缩洗涤液。
本发明所述试剂盒包括以下制备步骤：
a、选择合适的标准品稀释液；以选择的牛血清稀释液稀释proGRP(31-98)纯品，稀释浓度分别为0pg/ml、30pg/ml、150pg/ml、300pg/ml、600pg/ml、1200pg/ml；
b、proGRP(31-98)单克隆抗体微孔板：首先，在微孔板表面包被链亲合素，同时生物素化proGRP(31-98)单克隆抗体；进一步将生物素化proGRP抗体加入链亲合素包被微孔板中，形成proGRP(31-98)单克隆抗体包被微孔板；抗体包被的微孔板需要经过封闭，再干燥密封，置于4℃密封储存备用。
c、采用戊二醛偶联法制备辣根过氧化物酶标记的proGRP(31-98)单克隆抗体；选择Tris缓冲液做酶标记物稀释液，及确定酶标记物稀释浓度为1:10000；其中Tris缓冲液配制酶标记物稀释液如下：三羟甲基氨基甲烷12.1g/L，氯化钠8.8g/L，牛血清白蛋白10g/L，Proclin300生物防腐剂1.0ml/L，食品红0.1ml/L，盐酸调pH至7.5，纯化水定容。
d、配制化学发光底物液；本发明所述发光底物液包括A液与B液，其中A液包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；所述化学发光底物B液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％Tween20、0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6。使用时A液B液1:1混合使用。
e、配制浓缩洗涤液；本发明所述浓缩洗涤液稀释20倍使用。具体的配制如下：磷酸氢二钠58g/L，磷酸二氢钠2g/L，氯化钠160g/L，Tween-20 1ml/L，Proclin 300生物防腐剂1ml/L，去离子水定容，盐酸调pH至7.5使用时稀释20倍使用。
f、分装上述校准品、抗体包被微孔板、酶标记物、化学发光底物液、浓缩洗涤液，并组装为成品试剂盒。
本发明“胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒”一方面应用化学发光免疫分析技术实现灵敏地检测小细胞肺癌人体内的胃泌素释放肽前体含量，对于小细胞肺癌患者的早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值；另一方面结合使用链亲合素-生物素化包被系统，大大提高了胃泌素释放肽前体检测的线性范围、降低了包被抗体的用量、增强了包被固相的稳定性。总体来说，本发明试剂盒具有集实用性、先进性、经济性于一体等优点。
该“胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒”采用双抗体夹心免疫反应模式，即酶标记的抗体与载体上包被的抗体和被测样品的胃泌素释放肽前体结合形成双抗体夹心复合物。试剂盒各项指标均符合临床应用的要求。试剂盒在使用过程中，操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快速检测，使用成本低，更易推广应用，特别适合广大中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
附图说明
图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图
图2为实施例1所制备的试剂盒的健全试验曲线
图3为本发明同ELSIA试剂盒临床血样测值比对图
具体实施方式
实施例1 制备本发明的胃泌素释放肽前体(31-98)化学法光免疫分析测定试剂盒
一.标准品的配制
选择成牛血清为标准品基质液稀释proGRP(31-98)纯品，浓度分别为0pg/ml、30pg/ml、150pg/ml、300pg/ml、600pg/ml、1200pg/ml；
二.酶标记物的制备及酶稀释浓度的确定
1、改良的戊二醛交联法标记辣根过氧化物酶(HRP)，其步骤如下：
a、将12mgHRP溶于含5mgproGRP单克隆抗体的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中，缓慢搅拌下加入1％戊二醛溶液4mL，置室温3小时。
b、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
c、装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2的PBS，4℃透析过夜。
d、将透析产物移入试剂瓶加入1％BSA，再加入等量60％甘油，混匀，小量分装，-20℃保存。
2、酶标抗体浓度选定
试验证明，采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度范围为1:10000。
3、酶标记抗体稀释液的选择
采用棋盘试验确定的酶标记抗体的稀释液组成为：
 
试剂 分子式 终浓度 分子量 1000mL用量
三羟甲基氨基甲烷 C4H11NO3 0.10M 121.09 12.1g
盐酸 HCI 调pH至7.5
氯化钠 NaCl 150mM 58.44 8.8g
牛血清白蛋白 BSA 1.0％ 10g
生物防腐剂 Proclin300 0.1％ 1.0ml
食品红 0.005‰ 0.1ml
纯化水 H2O 加至1000mL
三.固相抗体的制备
a、链亲合素包被微孔板：pH9.6，0.05mol/L碳酸缓冲液稀释链霉亲和素到10mg/L，制成抗体包被液，然后取100μL/孔加入微孔板，4℃过夜，次日取出，洗涤3次。洗板液用0.05％吐温20，pH7.4 0.01mol/L PBS。再用牛血清封闭液37℃封闭30min；具体的牛血清封闭液配方如下：
 
试剂         分子式           终浓度     分子量     1000mL用量  
磷酸二氢钠   NaH2PO4·2H2O    1.28mM   156.01   0.2g      
磷酸氢二钠   Na2HPO4·12H2O   8.10mM   358.14   2.9g      
牛血清                        10％                  100ml       
生物防腐剂   Proclin300       0.1％                1.0ml      
纯化水       H2O                                    加至1000mL  
b、生物素化proGRP(31-98)抗体：用0.1M NaHCO3溶液将纯化的proGRP(31-98)单克隆抗体稀释为1mg/ml，将生物素酰一N羟基丁二酰亚胺酯用二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，在1ml抗体溶液中加入BNHS液20μl，混匀后置室温反应2小时，然后在4℃中对PBS透析2小时，滴定工作浓度后即可使用。
c、包被proGRP(31-98)单克隆抗体：将生物素化proGRP(31-98)抗体100μL/孔加入链亲合素化微孔板中，37℃温育3小时；
d、清洗、封闭：用pH值为7.4、含吐温一20和叠氮化钠防腐剂的磷酸盐洗涤缓冲液清洗3～5次，再用水解明胶封闭液封闭，干燥密封于4℃保存。封闭配方如下：
 
试剂           分子式           终浓度     分子量     1000mL用量    
磷酸二氢钠     NaH2PO4·2H2O   1.28mM   156.01   0.2g        
磷酸氢二钠     Na2HPO4·12H2O   8.10mM   358.14   2.9g        
水解明胶                        1.0％                10g           
生物防腐剂     Proclin300       0.1％                1.0ml        
纯化水         H2O                                    加至1000mL    
四、化学发光底物A液
鲁米诺        10mM     1.7716g
4-羟基联苯    0.3mM    0.051g
4-碘苯硼酸    0.05mM   0.012g
硼酸                   11.4g
硼砂                   4.9g
双蒸水        定溶     1000mL
pH                     8.0～10.0
五、化学发光底物B液
过氧化脲          3.5mM      0.329g
Tween20           0.1％       1ml
Na2HPO4·12H2O                 51.58g
NaH2PO4·2H2O                  8.74g
双蒸水            定溶        1000mL
pH                            7.0～7.6
使用时A液与B液等比例混合。
六、洗涤液缓冲液
Na2HPO4·12H2O                 58g
NaH2PO4·2H2O                  2g
NaCl                          160g
Tween-20                      1ml
Proclin300                    1ml
去离子水                      1000ml
调整pH至
Figure A200810105418D0009091858QIETU
，使用时稀释20倍使用。
七、成品试剂盒的组装
上述六个步骤所得产品分装、组合后即为试剂盒试剂组成。作为成品试剂盒，需要对所制备的试剂盒进行临床应用的考察。
实施例2 本发明的胃泌素释放肽前体化学法光免疫分析测定试剂盒使用方法
一.样品前处理
取人的空腹血清，2000-4000rpm离心10min，取上清液，无需其它特殊处理便可进行分析。
二.检测步骤
使用本试剂盒进行检测前，需先取出试剂盒内分装好的各组分：包被板、酶标记物、标准品室温静置，平衡到室温后使用；将恒温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。
使用本试剂盒的具体操作步骤如下：
1)取出试剂盒平衡到室温；
2)每孔加入25μL血清样品或系列标准品溶液，再加入标记物50μL，每次试验设空白1孔，然后除空白孔外，每孔加辣根过氧化物酶标记抗体溶液50μL；
3)37℃恒温温育45分钟；
4)取出微孔板，弃去溶液。用稀释20倍后的洗涤液洗板5次；
5)每孔加发光底物100μL，室温(22～28℃)静置5分钟；
6)用化学发光仪测相对发光值(RLU)，测量时间1秒/孔；
7)分别对校准品浓度和对应RLU取对数，在建立的双对数曲线上建立标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的proGRP(31-98)的浓度，计算检测结果；
8)打印检测结果报告。
本试剂盒的校准曲线见附图1，其中，I为发光强度，C为proGRP(31-98)浓度(单位为pg/mL)，相关系数R2＝0.9983，Y＝1.8549+1.3149X。
实施例3 本发明的试剂盒的方法学指标
按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下：
1.试剂盒灵敏度
灵敏度即可与零剂量点可区分开的浓度。同时测定10个零标准点，得RLU的平均值与标准偏差。计算RLU平均值与两倍标准偏差的差值，由内插法，从工作曲线中得出其对应浓度值。实验中测定的灵敏度为1.37pg/ml。
2.试剂盒精密度
将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验。以实施例1中所抽取的试剂盒测定三份高\中\低值样本110pg/mL和220pg/mL的proGRP样品各8次。计算测定浓度的变异系数。实施例1中的三批试剂盒的测定结果如表2、表3，表4所示，结果表明变异系数小于8.0％。
        表1.低值血清20pg/ml的变异系数
       表2.中值血清样本389pg/ml的变异系数
Figure A200810105418D0010091542QIETU
       表3.高值血清样本890pg/ml的变异系数
Figure A200810105418D0011091608QIETU
3.试剂盒准确度测定
在混合人血清中加入一定值1000pg/ml，537pg/ml，60pg/ml的proGRP(31-98)标准品，配成溶液，浓度分别为。再根据工作曲线，实际检测该溶液中proGRP含量.则样品的测定值减去血清本底值，再除以proGRP(31-98)标准浓度值，得到回收率。回收率如表2所示，三个样本的回收率分别为95％，93％，104％，即回收率在95-104％之间，符合临床应用的需要.
表4 血清样本回收率/方法准确度试验
 
人血清本底值pg/ml 标准浓度值pg/ml 实际检测值pg/ml 回收率％
108.5 1000 1057.6 95
24.5 537 542.8 96
3.74 60 69.58 110
4.健全性试验
用成牛血清稀释高值血清，检测稀释血清的proGRP含量值，一方面可以分析高值血清稀释后测值的可靠性，另一方面分析成牛血清作基质是否与人血清有交叉。如附图2所示是成牛血清以1:2，1:4，1:8，1:16稀释高值样品的测值曲线.由相关系数R＝0.9998表明稀释倍数与浓度呈良好的线性关系，牛血清缓冲液作基质不存在基质效应。
5.特异性实验
在血清样本中加入小细胞肝癌联合检测的肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞抗原(SCC)、组织角蛋白(CYFRA，TPA，TPS)，神经特异性抗原(NSE)，通过测值确定与proGRP(31-98)的交叉性。结果如下，可以看出，交叉反应率均在0.5-3％之间，符合临床要求。
经过上面所述大量实验，得出本发明试剂盒的方法学指标如下：
检测范围：0～1200pg/ml；
灵敏度：最小检出限为1.37pg/ml；
精密度：变异系数小于8.0％(n＝10)；
准确性：加标回收率在95～110％之间；
特异性：和CEA、SCC、CYFRA、TPA、TPS、NSE、常见小细胞肺癌肿瘤标志物的交叉反应率小于3％。
实施例4 本发明的试剂盒同ELSIA试剂盒临床血样测值比对
本发明试剂盒检测100份临床血清样品，其中正常血清15例，非小细胞肺癌15例，小细胞肺癌70例。测值及阴性、阳性检出结果如表5所示。
表5 本发明试剂盒对100例临床血清的测值与临床诊断对照
 
编号 诊断结果 测值pg/ml 编号 诊断结果 测值pg/ml 编号 诊断结果 测值pg/ml
1 正常 2.62 35 SCLC 1042.4 69 SCLC 115.59
2 正常 37.91 36 SCLC 1103.6 70 SCLC 387.45
3 正常 40.04 37 SCLC 974.20 71 SCLC 516.36
4 正常 4.46 38 SCLC 583.86 72 SCLC 965.09
5 正常 32.88 39 SCLC 437.46 73 SCLC 865.82
6 正常 20.34 40 SCLC 532.39 74 SCLC 146.04
7 正常 15.89 41 SCLC 675.17 75 SCLC 1075.9
8 正常 23.98 42 SCLC 188.94 76 SCLC 753.48
9 正常 7.18 43 SCLC 357.95 77 SCLC 910.86
10 正常 11.12 44 SCLC 447.35 78 SCLC 818.91
11 正常 19.37 45 SCLC 1190.3 79 SCLC 159.28
12 正常 54.61 46 SCLC 1032.0 80 SCLC 786.07
13 正常 8.84 47 SCLC 495.96 81 SCLC 25.97
14 正常 31.18 48 SCLC 149.06 82 SCLC 1021.6
 
15 正常 7.08 49 SCLC 205.16 83 SCLC 883.4
16 NSCLC 67.43 50 SCLC 106.48 84 SCLC 948.53
17 NSCLC 10.77 51 SCLC 675.34 85 SCLC 742.50
18 NSCLC 44.13 52 SCLC 379.48 86 SCLC 479.01
19 NSCLC 74.44 53 SCLC 720.08 87 SCLC 202.34
20 NSCLC 62.27 54 SCLC 27.01 88 SCLC 394.78
21 NSCLC 11.33 55 SCLC 111.03 89 SCLC 652.17
22 NSCLC 93.09 56 SCLC 407.72 90 SCLC 156.28
23 NSCLC 42.92 57 SCLC 247.11 91 SCLC 326.58
24 NSCLC 6.86 58 SCLC 118.34 92 SCLC 686.58
25 NSCLC 14.10 59 SCLC 441.09 93 SCLC 208.43
26 NSCLC 56.84 60 SCLC 379.59 94 SCLC 910.01
27 NSCLC 39.32 61 SCLC 207.31 95 SCLC 848.62
28 NSCLC 53.60 62 SCLC 399.61 96 SCLC 721.53
29 NSCLC 66.16 63 SCLC 474.77 97 SCLC 276.01
30 NSCLC 23.32 64 SCLC 432.32 98 SCLC 959.31
31 SCLC 119.18 65 SCLC 490.46 99 SCLC 249.77
32 SCLC 257.51 66 SCLC 364.43 100 SCLC 1222.3
33 SCLC 462.93 67 SCLC 473.87
34 SCLC 254.47 68 SCLC 200.81
用本发明的试剂盒和德国IBL公司ELSIA试剂盒对100份临床血清样品同时进行检测。其检测结果见附图3，以本发明方法测定的血样proGRP结果为横坐标，以ELSIA试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关系数r2＝0.9796。经统计学处理结果表明，本发明方法同ELSIA试剂盒临床血样测值相关性良好。
本发明为了满足小细胞肺癌早期诊断的需要，并区分非小细胞肺癌，解决了现行的小细胞肺癌早期诊断难题，即采用高灵敏的化学发光免疫分析方法结合链亲合素-生物素包被系统，提供了一种高灵敏、高特异、操作简便、价格适宜的定量检测proGRP(31-98)化学发光免疫试剂盒。本试剂盒不需要昂贵的检测仪器，便于临床推广，具有良好的市场价值。

Claims (10)

1.一种胃泌素释放肽前体(31-98)化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组分为：胃泌素释放肽前体(31-98)校准品、胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体包被的微孔板、辣根过氧化物酶标记的胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体、化学发光底物液、浓缩洗涤液。
2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，包被抗体与酶标记抗体均为单克隆抗体，只是针对proGRP的不同位点。
3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中A液/B液使用时需要1:1混合。
4.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、以胃泌素释放肽前体(31-98)纯品配制校准品；b、制备胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体包被的微孔板；c、制备辣根过氧化物酶标记的胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体；d、配制化学发光底物液；e、分装上述校准品、抗体包被微孔板、酶标记物、化学发光底物液和浓缩洗涤液，并组装为成品。
5.如权力要求4所述的方法，所述制备酶标记的胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体，其特征在于，以改良的戊二醛偶联法进行生物素标记抗体。
6.如权利要求4所述的方法，所述胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体包被的微孔板，其特征在于，采用生物素-链亲合素系统包被抗体。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；化学发光底物B液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％ Tween20、0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6。
8.如权利要求6所述的方法，所述采用生物素-链亲合素系统包被抗体，其特征在于，包括以下包被步骤：制备链亲合素包被的微孔板；以牛血清封闭液封闭链亲合素包被的微孔板；制备生物素化胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体；在链亲合素包被的微孔板中加入生物素化的胃泌素释放肽前体(31-98)单克隆抗体，制成抗体包被板；再以水解明胶封闭液封闭抗体包被板；除湿干燥后封袋，4℃保存备用。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述封闭链亲合素包被的微孔板的牛血清封闭液：体积分数10％牛血清、磷酸二氢钠0.2g/L、磷酸氢二钠2.9g/L、0.1％Proclin300生物防腐剂。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体包被板的水解明胶封闭液，1.0％水解明胶、NaH2PO4·2H2O 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O2.9g/L、0.1％Proclin300生物防腐剂1ml/L。
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