CN111308079A - 一种提高胶体金免疫层析平台定量分析准确度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高胶体金免疫层析平台定量分析准确度的方法。具体地，本发明提供了一种标准曲线的建立方法，所述的标准曲线是用于通过基于胶体金的定量分析方法对待测样本中待测目标进行定量分析的标准曲线；且所述的制作方法包括步骤：(1)提供校准品稀释液；(2)用步骤(1)的校准品稀释液配置一系列校准品溶液；(3)通过基于胶体金的检测方法对步骤(2)得到的一系列校准品溶液进行检测并读取检测结果，从而获得一系列校准品溶液中的全部或部分的校准品溶液的检测值和背景值；(4)根据步骤(3)获得的检测值和背景值，计算校准品溶液的最终信号值；和(5)根据浓度以及相应的最终信号值绘制标准曲线。

Description

一种提高胶体金免疫层析平台定量分析准确度的方法
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种提高胶体金免疫层析平 台定量分析准确度的方法。
背景技术
免疫层析检测技术是八十年代发展起来的一种快速且易于使用的免疫分析技术。免疫层析检测技术的应用领域包括病原体、药物、激素和代谢物等在生物医学 上的检测，同时也被广泛用于植物检疫、兽医学、食品安全等领域。免疫层析试纸 主要由五部分组成：样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸收垫和PVC底板。
根据检测原理不同，免疫层析检测分为双抗体夹心法和竞争法免疫层析检测。
双抗体夹心法免疫层析的检测原理是：以预先包被T线和C线的硝酸纤维素 膜为固定层析膜，T线通常包被抗待测物抗体，C线通常包被抗IgG抗体。含待检 测物的样本滴加在样品垫上，通过与结合垫上的标记抗体结合，形成抗原-标记抗 体复合物，该复合物借助毛细作用，可在硝酸纤维素膜上泳动，与膜上的T线抗 体结合而被捕获，形成抗体-抗原-标记抗体三明治夹心结构，而未被结合的抗原- 标记复合物则被C线捕获。T线及C线处的标记抗体上所携带的标记物，可被检 测，其信号值与样本浓度水平呈正相关。
以免疫层析检测技术为基础，先后发展出了很多不同的免疫层析检测技术分 支，例如胶体金免疫层析检测技术和荧光免疫层析检测技术等。胶体金免疫层析检 测技术(Colloidal gold immuno-chromatography assay,GICA)是指以胶体金作为标记 物，1971年由Faulk W P和Taylor G M首次用来检测大肠埃希菌后，运用胶体金 免疫层析技术检测细菌得到了大范围的推广。胶体金免疫检测技术通常使用双抗体 夹心法，根据T线的灰度值判定样本浓度水平。胶体金免疫层析检测技术不仅操 作简便，检测特异性和稳定性好，而且不需要任何特殊的检测仪器，适合在紧急情 况的发病现场进行大规模样本的检测。然而，胶体金免疫层析技术检测灵敏度较低， 检测线性范围窄，只能定性或半定量检测，这是胶体金免疫层析法存在的缺陷。目 前，虽通过CMOS/CCD采集反射光信号并通过灰度值分析信号强弱，从而换算成 浓度值，实现了胶体金免疫层析的定量检测，但目前胶体金免疫层析平台的检测信 号易受样本情况的影响进而影响检测准确性。
综上所述，本领域迫切需要一种提高胶体金免疫层析平台检测临床准确度的方法，使得临床样本如血清、血浆、甚至全血检测在最大程度上削弱样本基质颜色的 干扰，使临床检测更准确。
发明内容
本发明的目的就是提供一种提高胶体金免疫层析平台检测临床准确度的 方法，使得临床样本如血清、血浆、甚至全血检测在最大程度上削弱样本基质 颜色的干扰，使临床检测更准确。
在本发明的第一方面，提供了一种标准曲线的建立方法，其中，
所述的标准曲线是用于通过基于胶体金的定量分析方法对待测样本中待测目 标进行定量分析的标准曲线；
且所述的建立方法包括步骤：
(1)提供校准品稀释液；
所述的校准品稀释液包括稀释溶剂和有色物质，且所述校准品稀释液中有色物质的用量由待测样本的背景值确定；
(2)用步骤(1)的校准品稀释液配置一系列校准品溶液；
其中，所述的一系列校准品溶液中的每种校准品溶液分别为含有不同浓度待测目标的校准品溶液，且该浓度是已知的；
(3)通过基于胶体金的检测方法对步骤(2)得到的一系列校准品溶液进行检测并读取检测结果，从而获得一系列校准品溶液中的全部或部分的校准品溶液的检测值 和背景值；
(4)根据步骤(3)获得的检测值和背景值，计算校准品溶液的最终信号值；和
(5)根据浓度以及相应的最终信号值绘制标准曲线。
在另一优选例中，所述背景值和所述检测值是匹配的。
在另一优选例中，所述背景值为N倍的背景均值，且N为检测值所对应的检 测线的条数，且N为正整数。
在另一优选例中，N＝1、2、3或4；较佳地，N＝1或2。
在另一优选例中，所述的标准曲线可以是实际的曲线和/或以函数表示的曲线。
在另一优选例中，所述的不同浓度是指选自下组的至少3个(较佳地，至少5 个；更佳地，至少7个；最佳地，至少10个)的浓度：80±8、60±6、40±4、30±3、 20±2、10±1、4±0.4、2±0.2、1±0.1、0.5±0.05、0.1±0.01、0ng/ml。
在另一优选例中，所述的一系列校准品溶液至少包括：含有0ng/ml待测目标 的校准品溶液。
在另一优选例中，所述的一系列校准品溶液包括含有选自下组中的至少3种 (较佳地，至少5种；更佳地，至少7种；最佳地，至少10种)浓度的待测目标的 校准品溶液：80±8、60±6、40±4、30±3、20±2、10±1、4±0.4、2±0.2、1±0.1、 0.5±0.05、0.1±0.01、0ng/ml。
在另一优选例中，所述的一系列校准品溶液包括：待测目标浓度分别为cd0、 cd1、cd2、….、cd(i-1)、cdi的校准品溶液；
其中，i为≥4的整数；
cd0＜cd1＜cd2＜…..＜cd(i-1)＜cdi；
在另一优选例中，cd0＝0ng/ml。
在另一优选例中，cd1、cd2、….、cd(i-1)和cdi为选自下组的浓度：80±8、60±6、 40±4、30±3、20±2、10±1、4±0.4、2±0.2、1±0.1、0.5±0.05、0.1±0.01ng/ml。
在另一优选例中，所述基于胶体金的检测方法是指胶体金免疫层析法。
在另一优选例中，步骤(3)中，通过胶体金免疫层析检测试剂盒对校准品溶 液中的目标物质进行检测。
在另一优选例中，所述胶体金免疫层析检测试剂盒为市售试剂盒或自行设 计或研发的试剂盒。
在另一优选例中，步骤(3)中，通过免疫分析仪读取检测结果。
在另一优选例中，所述待测样本的背景值通过下述方法获得：
通过基于胶体金的检测方法对待测样本中的待测目标进行检测，并读取检测结果，从而获得待测样本的背景值。
在另一优选例中，获取待测样本的背景值所用的基于胶体金的检测方法和/或 读取检测结果的方法与步骤(3)中所用的基于胶体金的检测方法和/或读取检测结果 的方法相同。
在另一优选例中，所述有色物质选自下组：橙黄G、胆红素、胆黄素；较佳 地，橙黄G。
在另一优选例中，所述待测样本为血液类样本。
在另一优选例中，所述待测样本选自：全血样本、血清样本、血浆样本，或其 组合。
在另一优选例中，所述待测样本含有或不含待测目标。
在另一优选例中，所述待测样本含有待测目标。
在另一优选例中，所述待测目标是能够通过胶体金方法检测的待测目标。
在另一优选例中，所述待测目标包括：蛋白、肽、肽前体、抗原和/或抗体。
在另一优选例中，所述待测目标为能够通过基于胶体金的方法被检测的标志 物。
在另一优选例中，所述待测目标为能够通过胶体金免疫层析检测平台进行检测的标志物。
在另一优选例中，所述待测目标包括：降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)， 或其组合。
在另一优选例中，所述稀释溶剂包括：基于磷酸缓冲体系的溶剂、基于Tris 缓冲体系的溶剂、基于碳酸缓冲体系的溶剂、基于柠檬酸缓冲体系的溶剂，或 其组合。
在另一优选例中，所述稀释溶剂为pH＝6.0～8.0的稀释溶剂。
在另一优选例中，步骤(1)中，在所述的校准品稀释液中，每单位量稀释溶剂 中有色物质的量为x，且x根据待测样本的背景(base)值y确定。
在另一优选例中，有色物质的量x与背景值y符合函数关系式y(x)。
在另一优选例中，所述单位量是指单位体积。
在另一优选例中，有色物质的量是以质量计的量或者是以有色物质母液的体积计的量。
在另一优选例中，所述有色物质的量是指有色物质的质量或者有色物质母液的体积。
在另一优选例中，所述有色物质母液为浓度已知的有色物质溶液(较佳地，浓 度已知的有色物质的水溶液)。
在另一优选例中，所述有色物质母液为浓度为0.005～0.02g/ml的有色物质水 溶液。
在另一优选例中，背景值y与有色物质的量x符合如公式1所示的函数关系式
y(x)＝ax+b (公式1)；
公式1中，x为单位量的稀释溶剂中有色物质的量，y为待测样本的背景值，a 和b为常数。
在另一优选例中，a和b为通过拟合确定的常数。
在另一优选例中，常数a和b是根据一系列空白稀释液中一一对应的单位量稀 释溶剂中有色物质的量x’和该空白稀释液的背景值y’进行拟合获得的(即根据多对 (较佳地2～5对)数据对(x’，y’)进行拟合获得)；其中，所述的空白稀释液包括稀释 溶剂和有色物质。
在另一优选例中，所述空白稀释液不包含待测目标。
在另一优选例中，所述空白稀释液主要由稀释溶剂和有色物质组成。
在另一优选例中，所述一系列空白稀释液中，每种空白稀释液中单位量稀释溶 剂中有色物质的量不同。
在另一优选例中，所述一系列空白稀释液中，每种空白稀释液中有色物质的浓 度不同。
在另一优选例中，空白稀释液的背景值通过步骤(3)的方法获得。
在另一优选例中，公式1中，
当x为每160体积的稀释溶剂中有色物质母液体积(与稀释溶剂的单位量的体 积单位相同)，且所述有色物质母液的浓度为0.01g/ml时；
a＝235.3且b＝945.75。
在另一优选例中，当x为每160体积的稀释溶剂中有色物质母液体积(与稀释 溶剂的单位量的体积单位相同)，且所述有色物质母液的浓度为0.01g/ml时；
背景值y与有色物质的量x符合如公式1-1所示的函数关系式，
y(x)＝235.3x+945.75 (公式1-1)；
其中，x和y的定义同公式1。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述校准品稀释液中，有色物质的量通过式1-1 或其等价函数计算；
y＝235.3x+945.75 (公式1-1)
式1-1中，x是指每160uL稀释溶剂所含有色物质浓度为0.01g/ml的有色物质 母液的体积(uL)；y是指待测样品的背景值。
在另一优选例中，步骤(4)中，所述的最终信号值是通过函数关系式：最终信 号值(检测值,背景值)计算的；
并且函数关系式：最终信号值(检测值,背景值)是根据建模用数据集中由一一 对应的背景值、浓度值和检测值组成的多组(较佳地，至少15组；更佳地，至少 28组)数据(即三维数据(背景值，浓度值，检测值))，并通过数学建模获得的；
其中，所述浓度值是指建模用校准品中目标物质的选定的浓度；
所述建模用校准品是用具有选定的理论背景值的校准品稀释液按选定的浓度 配制的建模用校准品；以及，
所述背景值和检测值是指用基于胶体金的检测方法对建模用校准品进行检测 所得的检测值和背景值。
在另一优选例中，所述建模用数据集包括：数据Dm1-1、数据Dm1-2、数据Dm2-1、 数据Dm2-2、…、和数据Dmj-k；
其中，j代表建模用数据集中不同选定的浓度(cm)的数量且j为≥3(较佳地，≥ 5；更佳地，≥7；最佳地≥10)的整数；k代表建模用数据集不同理论背景值(Bt)的 数量且j为≥3(较佳地，≥4；更佳地，≥5)的整数。
在另一优选例中，数据Dmj-k为三维数据Dmj-k(背景值Bmj-k，浓度值cmj，检测 值Tmj-k)。
在另一优选例中，所述建模用数据集包括j×k组数据。
在另一优选例中，所述理论背景值是指与校准品稀释液中有色物质的量对应的的背景值(该背景值对应于1条检测线)。
在另一优选例中，所述理论背景值是指与校准品稀释液中有色物质的量符合如前所述的有色物质的量x与背景值y的函数关系式y(x)。
在另一优选例中，所述数学建模是基于使由建模用数据集中与相同浓度值对应的不同背景值(或理论背景值)和不同检测值所得的最终信号值尽量相同的原则进 行的。
在另一优选例中，所述数学建模中所用的数学模型为：
检测值＝m+n(m)*背景值+e；且n(m)＝o+p*m；
其中，m代表最终信号值、o和p均为待数学建模确定的常数、e为误差系数。
在另一优选例中，建模用数据集包括基于多个(3～10个)不同的理论背景值的 获得的一一对应的背景值、浓度值和检测值。
在另一优选例中，根据所述理论背景值(如通过公式1或公式1-1)确定建模用 校准品所用的校准品稀释液中有色物质的量。
在另一优选例中，建模用数据集包括4～20个(较佳地，10～15个；更佳地， 11、12、13或14个)不同浓度值。
在另一优选例中，cm1、cm2、….、cm(i-1)和cmi为选自下组的浓度：80±8、60±6、 40±4、30±3、20±2、10±1、4±0.4、2±0.2、1±0.1、0.5±0.05、0.1±0.01和0ng/ml； 且至少cm1、cm2、….、cm(i-1)和cmi中的一个为0ng/ml；且cm1、cm2、….、cm(i-1)和cmi各不相同。
在另一优选例中，所述浓度值与所述一系列校准品溶液的待测目标的浓度相匹配。
在另一优选例中，所述目标物质的定义同待测目标。
在另一优选例中，所述目标物质与所述待测目标是相同或不同的，较佳地，是 相同的。
在另一优选例中，所述背景值与检测值所对应的检测线的数量相匹配。
在另一优选例中，当该检测值对应于N条检测线时，背景值为N倍的背景均 值，其中N为正整数(如N＝1、2、3、4或5)。
在另一优选例中，当待测目标为降钙素原(PCT)时，所述的最终信号值通过公 式2-1计算的；
Figure BDA0002389129730000071
在另一优选例中，公式2-1中，所述检测值是对应于两条检测线的检测值， 且所述的背景值是指2倍背景均值。
在本发明的第二方面中，提供了一种定量分析待测样本中待测目标含量的方 法，包括步骤：
(i)提供待测样本；
(ii)通过基于胶体金的检测方法对待测样本进行检测，并读取检测结果，从而 获得待测样本的检测值和背景值；
(iii)根据步骤(ii)获得的待测样本的检测值和背景值，计算待测样本的最终信号值；和
(iv)将步骤(iii)得到的待测样本的最终信号值代入标准曲线，回算得到待测样本中待测目标含量；
其中，所述标准曲线是通过如第一方面所述的方法制作的标准曲线。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述的基于胶体金的检测方法同第一方面所用 的基于胶体金的检测方法。
在另一优选例中，步骤(iii)中的计算待测样本的最检测信号值的方法同第一方面步骤(4)的计算校准品溶液的最终检测信号值的方法。
在本发明的第三方面中，提供了一种试剂盒，其包括：
(1)有色物质或有色物质母液；其中，所述有色物质母液为浓度已知的有色 物质溶液；
(2)稀释溶剂；和
(3)说明书，所述说明书上记载了如第一方面所述的建立标准曲线的方法。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括：(4)基于胶体金的定量分析方法的检 测试剂盒；较佳地，胶体金免疫层析检测试剂盒；更佳地，降钙素原(PCT)胶体 金免疫层析检测试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了160ul的PCT校准品稀释液液中添加橙黄G体积与检测背景值关 系图；其中纵坐标表示检测背景值(base)，横坐标表示在160ul的PCT校准品稀释 液液中添加的橙黄G体积量。
图2显示了有无加入橙黄G对PCT校准品检测信号的影响；其中纵坐标 表示原最终检测信号计算值(检测值-背景值)，横坐标表示PCT定标溶液的浓度 值。
图3显示了有无加入橙黄G对CRP校准品检测信号的影响；其中纵坐标 表示原最终检测信号计算值(检测值-背景值)，横坐标表示CRP定标溶液的浓度 值。
图4显示了采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线；
图5显示了临床样本测试比对结果；其中纵坐标是本发明实施例2所述检 测方法测定结果，横坐标是梅里埃PCT检测试剂盒测定结果。
图6显示了使用原最终检测信号计算值计算的全血样本测试比对结果；其 中纵坐标是本发明实施例4中所述检测方法并采用原公式计算结果，横坐标是 罗氏PCT检测试剂盒测定结果。
图7显示了使用新最终检测信号计算值计算的全血样本测试比对结果；其 中纵坐标是本发明实施例4中所述检测方法并采用新公式计算结果，横坐标是 罗氏PCT检测试剂盒测定结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入地研究。意外地发现在制作用于胶体金检测的标准 曲线时向所用的校准品稀释液中添加特定量的有色物质(尤其是橙黄G)既不会 对标准品的检测结果产生影响又显著提升对血液类样本(如血浆、血清和全血等) 甚至具有黄疸、溶血情况的血液类样本的基于胶体金的定量分析的准确度。基 于此，发明人完成了本发明。
术语
降钙素原(procalcitonin，PCT)是一种由116个氨基酸组成的糖蛋白，是降 钙素(calcitonin，CT)的前体肽。降钙素可被酶裂解为许多小的片断，最终形成 氨基降钙素原、成熟的降钙素和钙抑肽。降钙素原可以以游离形式存在于正常 人血清中，正常情况下，人体内血清PCT水平很低，大多低于0.l ng/ml；PCT 在细菌感染后2-3h，即可检测到轻度升高。随后PCT水平快速升高，6-12h后 到达顶峰，在48h内保持较高水平，2d后降到基线水平。PCT的半衰期为22-29 小时，在体内外稳定性好，不易被降解，且PCT检测不受大多数临床用药的影 响。PCT浓度和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降 低至正常水平，因而PCT可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。
如本文所用，“0ng/ml”是指不特意添加待测目标或目标物质配制校准品溶 液(或校准品)，但可能存在不影响检测的结果的或者无法检出量的待测目标或 目标物质。
如本文所用，“背景均值”是指，例如，不在检测线(T线)和质控线(C线)等 处获得的信号值。在本发明中，本领域技术人员能够根据待测样品的获得的胶 体金信号数据的实际情况选择背景均值的确定方法。例如，选择除对应于C线 和T线以外的最低信号值或多处的信号值的平均值，或选择例如，C线前或C 线与T线之间等处的最低信号值或多点的信号值的平均值作为背景均值。
如本文所用，当背景值和检测值“相匹配”或是“匹配的”是指，例如，所述 的检测值为对应于N条检测线时获得的检测值时，对应于该检测值的背景值(或 检测背景值)为相应倍数(N倍)的背景均值。即根据检测值所对应的检测线的数 量，“背景值”或“检测背景值”在数值上等于相应背景均值或者背景均值的倍数； 例如，当函数关系式(例如最终信号值(检测值,背景值)，如公式2或公式2-1)中 的变量即检测值是基于2条检测线所得的检测值时，背景值相应地变为2倍的 背景均值。
如本文所用，术语“等价函数”是指根据变量的单位的变化而应改变函数(或 函数关系式)中常数的值所得到的函数。虽然在本发明中，为了计算简便，采用 了以160uL稀释溶剂中加入有色物质母液(0.01g/ml)的体积(uL)计量方式并拟合 获得了函数关系式(如y(x))，但应当理解，在采用不同的计量方式的情况下， 对函数中常数进行换算是本领域技术人员无需付出创造性劳动的情况下能够 进行的。
如本文所用，术语“检测线”是指层析法检测试剂(条)中的检测线。
提高胶体金免疫层析平台定量分析准确度的方法
为了解决现有技术中对胶体金定量测试易受到样本干扰的问题，本发明提供了一种提高胶体金免疫层析平台定量分析准确度的方法。
典型地，本发明提供的方法在原有校准品稀释液中添加有色物质如橙黄G，绘 制不同橙黄G添加量与胶体金免疫层析试纸条检测背景值的关系曲线图(例如图1 所示的曲线)，利用橙黄G的不同添加量所得的不同检测背景下的校准品定标信号 值，根据不同背景-不同浓度-检测信号的数据集进行数学建模所得的最终信号计算 方式(例如，本发明实施例中所获得的
Figure BDA0002389129730000101
)。
此处所述的校准品稀释液可以是任意一种缓冲体系：包括磷酸缓冲体系、 Tris缓冲体系碳酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系等。
此处所述的稀释液添加物质，包括任何有色物质(例如，包括橙黄G、胆红素、 胆黄素等)。
进一步的，此处所述的有色物质的添加量是通过该有色物质添加量-胶体金免 疫层析试纸条检测背景值的关系曲线图(如图1所示)和临床样本检测背景值所决 定。具体的，首先配制某一有色物质的母液，在原有相同体积的不同份校准品稀释 液中添加不同体积量的有色物质母液，将不同颜色的校准品稀释液在胶体金免疫层 析试纸条上进行检测，得到不同的检测背景值，将有色物母液的添加体积量与检测 背景值数据绘制曲线，得到数学关系式。通过胶体金免疫层析试纸条检测临床样本 分析平均检测背景值，从而代入上述数学关系式得到相应有色物母液的添加体积 量。
进一步的，此处所述背景值取值方法包括在T/C线以外任一空白位置的任一 形式计算的背景检测信号值。
进一步的，此处所述数学关系式，包括任一形式的关系式，如一次函数、二次 函数等。
此处所述的利用橙黄G的不同添加量所得的不同检测背景下的PCT校准品定 标信号值，具体的，添加不同特定体积量的橙黄G得到不同颜色的校准品稀释液， 使用不同颜色的稀释液分别配制校准品定标溶液，依次在胶体金免疫层析试纸条上 检测，最终得到不同背景-不同浓度-检测值的关系数据集。
此处所述的根据数据集进行数学建模所得的最终信号计算方式，具体的，根据 不同背景-不同浓度-检测值的关系，建立数学模型，使检测值与不同背景值的组合 计算所得最终信号值在高低浓度值处受背景值的影响最小。
进一步的，此处所述最终信号值计算公式，包括任一形式的关系式，如一次函 数、二次函数等。
应当理解，在本文中，对于制作标准曲线的校准品的浓度梯度、不同浓度的数 量没有特别限制，本领域技术人员可根据实际的需要(如检测对象抗原/抗体的不 同)，实际样本中检测对象的可能或预估的含量等进行调整。
与现有技术相比，本发明的主要优点为：
1)校准品稀释液中添加有色物质，通过有色物质添加量-胶体金免疫层析试纸 条检测背景值的关系曲线图和临床样本检测平均背景值可精确调整校准品稀释液 的颜色及校准品检测背景值；
2)校准品稀释液颜色与临床样本基质颜色调整接近，可使校准品溶液更好地 模拟临床样本检测状态，因此使得胶体金免疫层析检测平台检测临床样本更准确。
3)调整校准品颜色是将校准品定标检测背景与临床样本平均检测背景保持一致，但临床上的样本基质颜色因人而异，各不相同，因此为了解决部分超出平均检 测背景值的样本(如黄疸、溶血)，通过添加有色物质体积量调整不同的校准品稀释 液颜色，得到不同背景-不同浓度-检测值的关系，根据该数据集优化最终检测信号 的算法来削弱背景值对最终检测信号的影响，进一步提高临床样本检测的准确度。
4)无需对现有的胶体金免疫层析试纸条的结构做出更改，无需改变原有光学 信号检测平台，仅在校准品稀释液中添加少量有色物质，并采用由此推导出的新的 最终信号计算公式，即可提高胶体金免疫层析平台检测临床样本的准确性，为临床 相关疾病的诊断提供更准确的依据。
5)本申请添加的有色物质不会与待测目标反应进而影响检测准确度。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数 是重量百分比和重量份数。
实施例1.PCT校准品稀释液中橙黄G添加量与检测背景关系
称取一定量的橙黄G粉末，充分溶解于三级水中配制成0.01g/ml的橙黄G母 液，用于后续校准稀释液的颜色调整。
取四份体积均为160ul的PCT校准品稀释液，分别加入0.5ul、1ul、1.5ul及 2ul的0.01g/ml的橙黄G母液，充分混匀。将这四份校准品稀释液分别使用降钙素 原(PCT)胶体金免疫层析检测试剂片进行检测，每份溶液检测两次重复，反应后在 全自动干式免疫分析仪上读取检测结果，记录各试剂片的检测背景值，如表1所示；
表1稀释液中添加不同量橙黄G的检测背景值
Figure BDA0002389129730000121
Figure BDA0002389129730000131
由不同橙黄G的添加量与检测背景值可绘制成曲线关系图，如图1所示，在 160ul的PCT校准品溶液中添加的橙黄G体积量越大，最终检测的背景值越高， 呈线性关系，数学公式为：y＝235.3x+945.75(公式1-1)，其中x是指橙黄G在160ul 的PCT校准品溶液中的添加量x(ul)、y是指背景值(base值)。
实施例2.根据临床样本检测背景平均值调整稀释液检测背景值
使用降钙素原(PCT)胶体金免疫层析检测试剂盒(降钙素原(PCT)测定试剂盒 (免疫层析法))对多例血清样本进行检测后，发现大部分正常血清样本的检测背景均 值在1200左右，因此若想得到相同检测背景值的校准品稀释液，代入上述数学关 系后可得160ul溶液中添加1.08ul，并由此比例关系配制更大体积的校准品稀释液。
分别使用无添加橙黄G的稀释液与添加了橙黄G的稀释液配制PCT定标溶液， 通过反应检测值进行对比，观察添加橙黄G后有无对校准品的检测带来影响。如 下表2与图2所示，加入橙黄G后并不会影响PCT的抗原抗体反应，其最终检测 值即简单的(检测值-背景值)略小于无加入橙黄G定标溶液的信号，这主要是由于 加入橙黄G后背景值上升，使得最终信号值稍微偏小所导致。为了进一步证明橙 黄G不会有干扰抗原抗体反应的影响，使用超敏C-反应蛋白(CRP)测定试剂盒与 CRP定标溶液再次进行验证，结果如表3和图3所示。综合以上PCT与CRP的 结果，说明在校准品稀释液中加入橙黄G不会对溶液中原检测对象的检测造成任 何影响，仅仅改变溶液检测的背景信号值，使校准品溶液颜色更接近临床样本基质 颜色。
表2比较有无加入橙黄G对PCT校准品检测值的影响
Figure BDA0002389129730000132
Figure BDA0002389129730000141
表3比较有无加入橙黄G对CRP校准品检测值的影响
Figure BDA0002389129730000142
为了更好的说明本发明的有益效果，收集30例血清样本，使用降钙素原 (PCT)胶体金免疫层析检测试剂盒进行检测，并选用梅里埃VIDAS降钙素原定 量测定试剂盒(酶联荧光分析)(注册号国食药监械(进)字2011第2403050号)进 行方法学比对。
具体步骤：
(1)按照在160ul稀释液中添加1.08ul橙黄G母液的比例关系，在50ml PCT 校准品稀释液中添加337.5ul的0.01g/ml的橙黄G母液，充分混匀；
(2)用上述步骤(1)得到的稀释液配制80、60、40、30、20、10、4、2、1、 0.5、0.1、0ng/ml的PCT校准品(PCT抗原(Hytest,货号8PC5))溶液；
(3)使用降钙素原(PCT)胶体金免疫层析检测试剂盒，将试剂片装载于全自 动干式免疫分析仪上，每份定标溶液置于仪器加样针处进行自动吸样，上样量为 60ul，反应15min后，读取检测值与背景值，计算差值作为最终的检测值，作标准 曲线；
(4)样本检测：与定标溶液相同的检测流程，通过最终检测值代入定标曲线 中回算样本PCT的浓度值；
(5)测定结果：采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线(X-Y)，如 图4所示，相关系数R2＝0.9998。将本发明稀释液配制的校准品的测定结果与梅 里埃VIDAS降钙素原定量测定试剂盒(酶联荧光分析)进行方法学比较，结果如图 5所示，斜率为1.0262，相关系数R2＝0.981，表明使用本发明稀释液配制的校准 品定标的临床测定结果与梅里埃测定结果一致性较高。
实施例3.利用添加不同体积量橙黄G建立PCT定标溶液不同背景-不同浓度 -检测值的数据集
上述实施例表明，添加橙黄G后可将校准品稀释液的检测背景值与临床样 本的平均背景值调整至一致。但临床上不同病人样本的基质颜色也各不相同， 而基质颜色对胶体金免疫层析检测的干扰又比较大，因此如何进一步消除不同 颜色背景对检测结果的影响是胶体金免疫层析检测较为关键的问题。因此本发 明人利用橙黄G能够调节不同颜色校准品稀释液的这一特点，模拟不同检测背 景对不同浓度最终检测值的实验，建立数据库，从而优化最终信号值的计算公 式，具体做法如下：
(1)设置1050、1150、1250、1350、1450、1550六种检测背景的校准品稀 释液，即分别按照在160ul稀释液中加入0.44、0.87、1.29、1.72、2.14、2.57ul橙 黄G母液的比例关系配制各校准品稀释液；
(2)使用上述步骤(1)得到的各稀释液分别配制80、60、40、30、20、10、4、 2、1、0.5、0.1、0ng/ml的PCT校准品(PCT抗原(Hytest,货号8PC5))溶液；
(3)使用降钙素原(PCT)胶体金免疫层析检测试剂盒与全自动干式免疫分析 仪，对上述步骤(2)所配的各定标溶液进行测试，每个浓度测试三次重复；
(4)记录各定标溶液中各浓度的检测值与背景值，如下表4所示，表4为不 同检测背景下各浓度的检测值与实际背景均值。如下表5所示，表5为使用现有最 终信号值的计算方法(即最终信号值＝检测值-检测背景值(原公式))所得的不同检测 背景下各浓度的最终信号值。(注：表中检测值为两条检测线检测值之和，公式中 的背景值是指2倍的单线背景值，例如目标背景1050，实际浓度0.1时背景均值为 1121，因此最终信号＝检测值(2369)-背景值(2*1121)＝127)。由表4和表5可知，不 同检测背景对低浓度的检测值影响较大。因此，若采用原有的信号计算方法，即最 终信号值＝检测值-背景值，会对高值的最终信号值带来较大的极差，即高浓度样本 受到背景值的影响较大。
(5)为了减少背景值对最终信号值的影响，根据上述步骤(4)所得到的不同 背景-不同浓度-检测值的数据集，进行数学建模(其中，所用数学模型为检测值 ＝m+n(m)*背景值+e，且n(m)＝o+p*m，其中，m代表最终信号值、o，p均为待确 定的常数、e为误差系数)，从而得到了如公式2-1所示的新最终信号值的算法，
Figure BDA0002389129730000161
(6)使用上述步骤(5)中所得的计算公式(公式2-1)，重新计算各浓度溶液在 不同检测背景下的最终信号值，如下表6所示，可见由本发明的新公式(公式2-1) 所得的最终信号值极差值明显减小。
表4不同检测背景下各浓度的检测值
Figure BDA0002389129730000162
表5使用原公式计算不同检测背景下各浓度的最终信号值
Figure BDA0002389129730000163
Figure BDA0002389129730000171
表6使用新公式计算不同检测背景下各浓度的最终信号值
浓度 0 0.1 0.5 1 2 4 10 20 30 40 60 80
1050: 161 192 281 381 674 1215 2293 3332 3895 4378 4923 5164
1150: 193 196 271 448 740 1365 2472 3742 4297 4554 5223 5558
1250: 176 218 264 425 777 1293 2346 3464 4147 4718 5008 5269
1350: 235 220 269 340 712 1242 2594 3665 4158 4571 5034 5543
1450: 171 227 285 380 631 1240 2280 3370 3880 4512 4977 5268
1550: 224 202 262 425 622 1155 2140 3430 4107 4537 5046 5389
极差 74 35 23 108 154 210 455 409 417 340 301 395
实施例4.使用新公式检测高背景值的临床样本
为了更好的说明本发明的有益效果，收集2例高值黄疸血清样本，选用梅 里埃VIDAS降钙素原定量测定试剂盒(酶联荧光分析)(注册号国食药监械(进) 字2011第2403050号)的检测值为正确靶值，来比较算法优化前后的检测准确 度。此外，收集26例全血临床样本，选用罗氏降钙素原检测试剂盒(电化学发 光法)(注册号国械注进20152401562)的检测值为正确靶值，来比较算法优化前 后的检测准确度。
具体做法如下：
(1)按照在160ul稀释液中添加1.08ul橙黄G母液的比例关系，在50ml PCT 校准品稀释液中添加337.5ul的0.01g/ml的橙黄G母液，充分混匀；
(2)用上述步骤(1)得到的稀释液配制80、60、40、30、20、10、4、2、1、 0.5、0.1、0ng/ml的PCT校准品(PCT抗原(Hytest,货号8PC5))溶液；
(3)使用降钙素原(PCT)胶体金免疫层析检测试剂盒，将试剂片装载于全自 动干式免疫分析仪上，每份定标溶液置于仪器加样针处进行自动吸样，上样量为 60ul，反应15min后，读取检测值与背景值，分别使用最终信号＝检测值-背景值与
Figure RE-GDA0002460649430000181
两种公式计算最终检测值，作标准曲线；
(4)样本检测：与定标溶液相同的检测流程，同样通过上述步骤(3)中两种 公式计算最终检测值，分别代入相对应的定标曲线中回算样本PCT的浓度值；
(5)测定结果：
(i)如下表7所示，使用原公式计算，由于较高的检测背景，会对黄疸的高值 样本带来检测偏小的影响，而使用新公式后，一定程度上消除了检测背景值的影响， 对检测准确度有明显的改善效果。
(ii)如下表8所示，使用原公式计算，由于较高的检测背景，会对全血的样本 带来检测偏小的影响，而使用新公式后，一定程度上消除了检测背景值的影响，对 检测准确度有明显的改善效果，图6显示的为使用原公式计算浓度值与罗氏降钙素 原检测试剂盒(电化学发光法)进行方法学比对结果，斜率为0.5754，相关系数 R2＝0.9808，整体检测偏低。图7显示的为使用新公式计算浓度值与罗氏降钙素 原检测试剂盒(电化学发光法)进行方法学比较结果，斜率为1.1974，相关系数 R2＝0.9849，一致性高。总之，使用新公式计算所得的高背景临床样本检测结果 准确度明显提高，可为胶体金免疫层析平台检测黄疸、溶血及全血样本提供更准确 的结果。
表7新旧公式对2例黄疸样本检测准确度的比较
Figure BDA0002389129730000183
其中，RD＝((检测结果-靶值)/靶值)*100％
表8新旧公式对26例全血样本检测准确度的比较
Figure BDA0002389129730000184
Figure BDA0002389129730000191
可见，本发明采用的新模型拟合所得的最终信号计算公式(即新公式)的的 准确度显著高于现有技术所用公式所得的最终信号。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种标准曲线的建立方法，其特征在于，
所述的标准曲线是用于通过基于胶体金的定量分析方法对待测样本中待测目标进行定量分析的标准曲线；
且所述的建立方法包括步骤：
(1)提供校准品稀释液；
所述的校准品稀释液由稀释溶剂和有色物质组成，且所述校准品稀释液中有色物质的量由待测样本的背景值确定；
(2)用步骤(1)的校准品稀释液配置一系列校准品溶液；
其中，所述的一系列校准品溶液中的每种校准品溶液分别为含有不同浓度待测目标的校准品溶液，且该浓度是已知的；
(3)通过基于胶体金的检测方法对步骤(2)得到的一系列校准品溶液进行检测并读取检测结果，从而获得一系列校准品溶液中的全部或部分的校准品溶液的检测值和背景值；
(4)根据步骤(3)获得的检测值和背景值，计算校准品溶液的最终信号值；和
(5)根据浓度以及相应的最终信号值绘制标准曲线。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有色物质选自下组：橙黄G、胆红素、胆黄素；较佳地，橙黄G。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样本选自：全血样本、血清样本、血浆样本，或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测目标包括：降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)，或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在所述的校准品稀释液中，每单位量稀释溶剂中有色物质的量为x，且x根据待测样本的背景值y确定。
6.如权利要求5所述的制作方法，其特征在于，背景值y与有色物质的量x符合如公式1所示的函数关系式
y(x)＝ax+b (公式1)；
公式1中，x为单位量的稀释溶剂中有色物质的量，y为待测样本的背景值，a和b为常数。
7.如权利要求1所述的制作方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的最终信号值是通过函数关系式：最终信号值(检测值,背景值)计算的；
并且函数关系式：最终信号值(检测值,背景值)是根据建模用数据集中由一一对应的背景值、浓度值和检测值组成的多组数据，并通过数学建模获得的；
其中，所述浓度值是指建模用校准品中目标物质的选定的浓度；
所述建模用校准品是用具有选定的理论背景值的校准品稀释液按选定的浓度配制的建模用校准品；以及，
所述背景值和检测值是指用基于胶体金的检测方法对建模用校准品进行检测所得的检测值和背景值。
8.如权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述的最终检测信号通过公式2-1计算的；
Figure FDA0002389129720000021
9.一种定量分析待测样本中待测目标含量的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供待测样本；
(ii)通过基于胶体金的检测方法对待测样本进行检测，并读取检测结果，从而获得待测样本的检测值和背景值；
(iii)根据步骤(ii)获得的待测样本的检测值和背景值，计算待测样本的最终检测信号值；和
(iv)将步骤(iii)得到的待测样本的最终检测信号值代入标准曲线，回算得到待测样本中待测目标含量；
其中，所述标准曲线是通过如权利要求1所述的方法制作的标准曲线。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括：
(1)有色物质或有色物质母液；其中，所述有色物质母液为浓度已知的有色物质溶液；
(2)稀释溶剂；和
(3)说明书，所述说明书上记载了如第一方面所述的建立标准曲线的方法。
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