CN109917134A - 一种校准品稳定剂、测定c肽的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学检验技术领域，具体为一种校准品稳定剂、测定C肽检测试剂盒及检测方法。试剂盒包括校准品、试剂1、试剂2、试剂R3和试剂R4。该试剂盒利用吖啶酯标记抗C肽抗体、抗原、辣根过氧化物酶标记抗C肽抗体形成抗体‑抗原‑抗体复合物，无需洗涤过程，加入触发剂后立即连续检测一段时间，每次间隔0.02～0.05S，计算其峰面积，用已知浓度的C肽与计算出的峰面积作出剂量‑反应曲线，通过该曲线推算出待测样品的C肽含量。本发明提供的采用空间临近化学发光法检测C肽的试剂盒具有校准品稳定性强、试剂抗干扰能力强、准确度高、特异性好和线性范围宽的优点，结合仪器测量，适合各个层次的医疗和研究机构使用。

Description

一种校准品稳定剂、测定C肽的检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学检验技术领域，具体涉及一种校准品稳定 剂、测定C肽检测试剂盒及检测方法。

背景技术

C肽是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体 —胰岛素原。一个分子的胰岛素原在特殊的作用下，裂解成一个分子 的胰岛素和一个分子的C肽，因此在理论上C肽和胰岛素是等同分 泌的，血中游离的C肽生理功能尚不很清楚，但C肽不被肝脏破坏，半衰期较胰岛素明显为长，故测定C肽水平更能反应β细胞合成与 释放胰岛素功能。

对已经用胰岛素治疗的病人，体内产生的胰岛素抗体可干扰胰岛 素测定；同时现在采用的放免法测定胰岛素，也分辨不出是内生的还 是外源性胰岛素，给了解β细胞的功能带来困难，而C肽与胰岛素 之间有相当稳定的比例关系，且不受胰岛素抗体的干扰，注射的外源 性胰岛素又不含C肽，所以测定血中C肽水平，可以反应内生胰岛 素的水平，即可了解β细胞的功能。

检测C肽对糖尿病预防和治疗具有重要的临床意义：

(1)测定C肽，有助于糖尿病的临床分型，有助于了解患者的 胰岛功能。

(2)因为C肽不受胰岛素抗体干扰，对接受胰岛素治疗的患者， 可直接测定C肽浓度，以判定患者的胰岛β细胞功能。

(3)可鉴别低血糖的原因。若C肽超过正常，可认为是胰岛素 分泌过多所致，如C肽低于正常，则为其它原因所致。

(4)C肽测定有助于胰岛细胞瘤的诊断及判断胰岛素瘤手术效 果，胰岛素瘤血中C肽水平偏高，若手术后血中C肽水平仍高，说 明有残留的瘤组织，若随访中C肽水平不断上升，揭示肿瘤有复发 或转移的可能。

目前实验室检测C肽的方法比较多，常用方法有放射免疫分析 法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法 等。随着生物科技的发展，其检测方法也逐步由放射免疫学的检测方 法，逐渐向酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析法发展。放射性免 疫分析法由于试剂具有放射性，对操作者具有一定的危害，且操作复 杂，试剂有效期短等缺点，不推荐作为C肽临床诊断；酶联免疫分 析法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，线性范围有限， 无法持续监控C肽水平；化学发光免疫分析法是一种较为先进的免 疫学方法，具有高灵敏、高特异、快速、高通量等特点。现阶段化学 发光法已成为检测C肽水平的主流方法，并且由于自动化检测系统 的普及，极大地提升了实验的精密度。根据目前C肽的临床的应用 情况，市场应用前景较好的可靠方法为化学发光免疫分析法。

化学发光免疫分析法主要有微孔板式化学发光、微孔板式磁颗粒 化学发光、时间分辨荧光免疫分析法和光激化学发光法。

其中微孔板式磁颗粒化学发光法特征是，在微孔板上使用磁颗 粒，将亲和素～生物素侨联方法包被抗体，加入抗原和酶标抗体形成 抗体～抗原～酶标抗体复合物，将微孔板置于带有磁分离器的微孔板 洗板机上洗涤，加入化学发光底物反应，而后检测其发光强度(RLU)， C肽浓度与发光强度(RLU)成正相关。该方法具有检测范围宽，操 作简单等特点，但需要洗涤过程，会产生大量的废弃物，且反应时间 较长，不利于临床上大批量快速检测的需求。

光激化学发光法技术使用的是均相体系化学发光检测技术，参与 免疫反应的一个抗体上包被了感光珠，内含酞菁(鲁米诺类化学发光 物质)；另一个抗体上包被了发光珠，内含二甲基噻吩衍生物及Eu螯 合物。在目标抗原存在的情况下，可形成夹心免疫复合物，目标抗原 可使两个抗体上标记的感光珠和发光珠紧密的连接在一起，在680nm 激发光下，可完成鲁米诺氧途径化学发光过程。其缺点一：光激化学 发光需要抗体包被过程，在反应中虽然处于均相体系，但并非是完全 均相，而且发射强度依赖于各种环境因素，在不同的环境体系中，发 射强度和时间的曲线有较大的差别，所以必须严格控制外界的各种因素，如在感光珠附近200nm的范围内没有发光珠，单线态氧就会衰 变到基态氧进入下一个能量循环，这时就没有光信号产生；其二缺点 是光激化学发光的光信号强弱在一定程度上取决于样本量的大小，血 液中存在的干扰物质很多，而光激化学发光用的样本量一般都很高， 所以容易受干扰物质的干扰。

时间分辨荧光免疫测定是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系 元素标记抗原或抗体，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素螯合物 能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。但在合成理想的镧系元素螯合 物的工艺不稳定，实验重复性不好，信噪比低，灵敏度低。

目前的检测方法中，校准品是很重要的试剂。一般的抗原保存液 在常温中会发生缓慢的沉淀，导致抗原结构破坏，浓度下降。特别在 高于10℃以上的环境或溶液环境不佳的情况下，会导致抗原浓度急 剧下降，这种下降是不可逆的，从而使得校准检测失效，而一般的校 准品稳定剂只能确保校准品未开瓶之前于4℃甚至-20℃保存一年甚 至保存期更短，对于反复冻融和开瓶后置于常温条件下极不稳定。另 外校准品在使用和实际运输环节不可能完全保证在4℃的环境中进 行。因此抗原校准品稳定性也是影响现有检测方法的结果准确性的一 个重要因素。

发明内容

针对上述技术问题，有必要提供一种质量稳定，检测快速便捷， 灵敏度高，抗干扰能力强，特异性高的稳定剂、用于检测血液中C 肽的试剂盒及检测方法。本发明中的试剂盒具有校准品稳定性强、试 剂抗干扰能力强、准确度高、特异性好和线性范围宽等优点，结合仪 器测量，适合各个层次的医疗和研究机构使用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种校准品稳定剂，其组分包括：牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、 甘露醇、甘氨酸、明胶、乙二胺四乙酸二钠、酪蛋白、氯化镁和甘油； 其中牛血清白蛋白：海藻糖：蔗糖：甘露醇：甘氨酸：明胶：乙二胺 四乙酸二钠：酪蛋白：氯化镁的质量比为(4～6)：(2～4)：(1～3)：(0.8～ 1.2)：(1～3)：(0.8～1.2)：(1～3)：(2～4)：(0.8～1.2)优选重量比为5： 3：2：1：2：1：2：2：1。

进一步地，所述校准品稳定剂的制备方法为：将牛血清白蛋白、 海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、明胶、乙二胺四乙酸二钠、酪蛋白、 氯化镁加入适量去离子水中用玻璃棒慢慢混匀至完全溶解，过滤除 杂；在37℃放置10～12小时，得到混合液A；在混合液A中加入甘油，常温下用玻璃棒慢慢混匀30～40分钟，所述混合液A和甘油的 体积比为1：1。冻干后收集粉末，即得稳定剂。

进一步的，所述校准品稳定剂在校准品制备、保存中的应用。

一种测定C肽的检测试剂盒，包括校准品、试剂R1、试剂R2、 试剂R3、试剂R4；

所述校准品包含组分及终浓度为：

C肽抗原 0.2ng/mL～20ng/mL

缓冲液 5～100mmol/L

校准品稳定剂 0.01～1w/v％；

所述校准品稳定剂为前述的稳定剂或前述的制备方法制得的稳 定剂；

所述试剂R1的组分及终浓度为：

所述试剂R2的组分及终浓度为：

试剂R3的组分及终浓度为：

抗氧化剂 0.01～1w/v％

稳定剂3 0.01～1w/v％

所述试剂R4的组分及终浓度为：

触发剂 5～20mmol/L

稳定剂4 0.01～1w/v％

增强剂4 0.01～1w/v％

进一步地，所述试剂校准品中缓冲液的pH为6.5～8.5，其选自 磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液或HEPES缓冲液中的一种 或几种；优选pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述试剂R1、试剂R2中缓冲液pH为6.5～8.5，其 选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液或HEPES缓冲液中的 一种或几种；优选所述试剂R1、试剂R2中缓冲液pH为7.4的磷酸 盐缓冲液；所述试剂R1、试剂R2中缓冲液可以相同也可以不同。

进一步地，所述所述稳定剂1或稳定剂2分别为选自牛血清白蛋 白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种。

进一步地，所述所述稳定剂1或稳定剂2为牛血清白蛋白和甘露 醇；牛血清白蛋白和甘露醇重量比为1:5。

进一步地，所述增强剂1或增强剂2分别为选自PEG4000、 PEG6000、PEG8000或PEG20000的一种或几种。

进一步地，所述增强剂1或增强剂2为PEG20000。

进一步地，所述试剂R3中抗氧化剂选自抗坏血酸及其衍生物、 原花青素、维生素E的一种或几种。。

进一步地，所述试剂R3中所述抗氧化剂为抗坏血酸。

进一步地，所述试剂R3中稳定剂3选自牛血清白蛋白、海藻糖、 蔗糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R3中稳定剂3为牛血清白蛋白和蔗糖；牛 血清白蛋白和蔗糖重量比为1:1。

进一步地，所述试剂R4中所述触发剂选自过氧化氢、过氧化脲 等中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R4中所述触发剂为过氧化氢。

进一步地，所述试剂R4中稳定剂4选自牛血清白蛋白、海藻糖、 蔗糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R4中稳定剂4为牛血清白蛋白和海藻糖； 牛血清白蛋白和海藻糖重量比为1:1。

进一步地，所述试剂R4中增强剂4选自对羟基肉桂酸及其衍生 物的一种或几种。

进一步地，所述试剂R4中所述增强剂4为对羟基肉桂酸甲酯。

一种化学发光法测定C肽的方法，具体操作方法为：

(1)、分别获得样本和校准品的峰面积；

(2)、以校准品的C肽浓度作为X坐标，以峰面积作为Y坐标， 作出剂量-反应曲线，根据该曲线计算出样品中C肽的浓度。

进一步的，所述步骤(1)操作为：加入样本/校准品、试剂R1、 试剂R2于37℃孵育30min，加入试剂R3，混匀，加入发光底物R4， 立即连续检测1S内发光值RLU，每次间隔0.02～0.05S，计算得到峰 面积；

进一步的，所述步骤(1)中加入的样本/校准品、试剂R1、试 剂R2、试剂R3、试剂R4的体积比为样本/校准品：试剂R1：试剂 R2：试剂R3：试剂R4＝2：5～8：5～8：1：12～15；优选2:5:5:1:12。

本发明有益效果：

1)本发明提供了一种不同于现有技术的C肽检测试剂盒，其检 测原理为：吖啶酯标记C肽抗体、抗原、辣根过氧化物酶(HRP)标 记抗C肽抗体形成抗体-抗原-抗体复合物，无需洗涤过程，加入触发 剂后立即连续检测一段时间(通常是1～3S)，每次间隔0.02S～0.05S， 计算其峰面积；用已知浓度的C肽与计算出的峰面积作出剂量～反 应曲线，通过该曲线推算出待测样品的C肽含量。本发明提供了一 种检测血液中C肽含量的试剂盒，其为完全均相检测，更利于抗原 抗体的反应，因此检测非常快速，大大减少了反应时间，且能提高抗 体的利用率，降低试剂盒的成本，使得本发明具有更高的灵敏度、准 确度和更好的重复性。

辣根过氧化物酶氧化发光底物中的过氧化氢可产生自由基，自由 基随即氧化发光底物，由于自由基的半衰期非常短，只能在分子内中 扩散，难于在体系中扩散，故只有形成本发明的抗体-抗原-抗体复合 物才能反应反光。其与以往的化学发光法相比，本发明方法为空间邻 近化学发光法，属于完全均相检测，是最接近体内自然状态的反应， 具有简单快速的特点。

2)本发明在检测过程中无需进行包被处理，无需洗涤过程，大 大优化了工艺流程，对试剂盒的各性能均有较大的保障。因此，本试 剂盒具有检测范围宽，检测快速便捷、灵敏度高、特异性及重复性好 等特点，不需要大量的洗涤液，减少大量废弃物的排放，降低了废液 对操作人员、环境的伤害和处理废液的成本，更适合临床上使用。

3)使用试剂量少：本发明不需要很大的试剂量，降低试剂盒的 成本，在一定程度上提高了小样本检测小型化、芯片化和高通量的可 能性。

4)校准品在常温和37℃条件下保存时间更长，避免了反复冻融、 常温及高温条件下浓度下降的情况，可以有效的保证校准检测结果的 准确性和可重复性。很大程度上提高了实验室工作效率。

附图说明

图1为本发明试剂盒的标准曲线图，其中X轴表示校准品浓度， Y轴表示峰面积；

图2为本发明试验例一的相关性试验中实施例3试剂与Mercodia AB的小鼠C肽检测试剂盒的相关性对比图，其中X轴表示本发明实 施例3试剂盒测定的血清结果，Y轴表示的是Mercodia AB试剂盒测 定的血清结果。

图3为试验例三的线性试验结果，其中X轴表示C肽样本的实 测浓度，Y轴表示C肽样本的预测浓度。

图4为实验例五中本发明试剂盒的检测流程图。

图5为实验例五中Mercodia AB的C肽测定试剂盒(ELISA)的 检测流程图。

图6为实验例五中郑州安图生物工程股份有限公司的人C肽测 定试剂盒(化学发光法)的检测流程图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方 案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的 是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献 所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注 明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例1

1、校准品稳定剂的制备

将牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、明胶、乙二 胺四乙酸二钠、酪蛋白、氯化镁(按比例5：3：2：1：2：1：2：2： 1)加入去离子水中用玻璃棒混匀10分钟至完全溶解，过滤。在37℃ 放置11小时，得到混合也A。在混合液A中加入甘油，常温下用玻 璃棒混匀34分钟，所述混合液A和甘油的体积比为1：1.冻干后收 集粉末，即得校准品稳定剂。

2、校准品的制备

将校准品稳定剂加入含有防腐剂的磷酸盐缓冲液基质液中即可 得到试验组，每1L基质液中加入校准品稳定剂的量为10g。取未加入 校准品稳定剂的校准品基质液作为对照组。

用试验组和对照组相对应的基质液将C肽抗原稀释成相应浓度 的校准品，浓度分别为1ng/mL、10ng/mL，另加基质液0ng/mL。将 以上试验组和对照组配制的C肽校准品分别在-20℃、2～8℃、20℃、 37℃三个温度下放置60天后用Mercodia AB的小鼠C肽检测试剂盒测定各浓度校准品OD值、观察外观，以下是实验结果：

试剂组

对照组

以上试验结果，采用本发明提供的校准品稳定剂的校准品外观和 OD值基本在可接受范围，未出现异常情况。未采用本发明方法的校 准品稳定剂的校准品浓度随保存温度升高而下降越快，2～8℃保存试 剂组和对照组各校准品虽未出现异常，但对照组的空白孔OD值明显 升高，会影响试剂性能检测；20℃和37℃均有出现浑浊和沉淀现象。

实施例2、吖啶酯标记抗C肽抗体和辣根过氧化物酶标记抗C肽抗体的浓度选定标 准

采用方阵法将吖啶酯标记抗C肽抗体和辣根过氧化物酶标记抗 C肽抗体以不同稀释度进行配比，以最低信噪比大于5，最高信噪比 大于200为基准，优先选择成本最低的配比关系。

将吖啶酯标记抗C肽抗体以1/500、1/1000、1/2000、1/4000、 1/8000、1/16000的不同稀释度，与辣根过氧化物酶标记抗C肽抗体 1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000的不同稀释度进行 方阵法考察。两组比例交叉配比，最终选取最优的配比比例为Acridan 标记抗C肽抗体1/2000和辣根过氧化物酶标记抗C肽抗体1/8000。

实施例3、本发明测定C肽的检测试剂盒

校准品：pH为7.4

C肽抗原	10ng/mL
		磷酸盐缓冲液	30mmol/L
校准品稳定剂	1w/v％

试剂R1：pH为7.4

磷酸盐缓冲液	30mmol/L
		吖啶酯标记抗C肽抗体	5mg/L
BSA	0.01w/v％
		甘露醇	0.5w/v％
PEG20000	0.5w/v％

试剂R2：pH为7.4

试剂R3：

抗坏血酸	0.1w/v％
		牛血清白蛋白	0.5w/v％
蔗糖	0.5w/v％

试剂R4：

过氧化氢	10mmol/L
		牛血清白蛋白	0.5w/v％
海藻糖	0.5w/v％
		对羟基肉桂酸甲酯	0.1w/v％

按照上述配方制备得到试剂盒半成品，经过各性能验证合格后组 装成C肽检测试剂盒。

实施例4、检测方法

本发明实施例3所述的C肽检测试剂盒，多功能酶标仪LB942S 为例，其参数如表1。

分析方法：一步法，即加入10μL样本、25μL试剂R1、25μL试 剂R2于37℃孵育30min，加入5μL试剂R3，混匀，加入60μL发光 底物R4，立即连续检测1S内发光值RLU，每次间隔0.05S，通过仪 器计算得到峰面积。测定后以校准品的C肽浓度作为X坐标，以峰 面积作为Y坐标，作出剂量-反应曲线如图1所示，方程 Y＝100.0667X-0.3333，R²＝1。根据该剂量-反应曲线计算出样品中C 肽的浓度。

表1反应流程

试验例一、相关性试验

使用本发明试剂(具体配方同实施例3)和Mercodia AB的C肽 测定试剂盒，分别采用多功能酶标仪LB942S、科斯迈SMART1000 全自动发光仪对40份新鲜人血清按各自的参数同时进行测定，对测 定值进行相关性回归分析，测定结果见图2。

由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R²＝0.9998，回归方程 y＝0.9962x+0.0084。结果表明本试剂与已上市对比试剂测定病人血清 相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

试验例二、准确度和精密度试验

试剂：本发明试剂(具体配方同实施例3)、校准品、质控品。

仪器：多功能酶标仪LB942S。

操作步骤：使用校准品定标，各质控重复测定10次，计算测试 均值、SD、CV和相对偏差。

表2结果显示，本发明试剂检测各质控的相对偏差均小于1％， 准确度非常好。测定10次同个样本的CV值均小于3％，精密度较好。

表2测试结果(ng/mL)

试验例三、线性试验

采用本发明试剂(具体配方同实施例2)、校准品、高浓度C肽 样品、质控品。

仪器：多功能酶标仪LB942S。

操作步骤：以空白溶液作为稀释液，按比例稀释各浓度样本，各 样本重复测定3次。

表3结果表示，本发明试剂在0.2～20ng/mL范围内线性良好， 线性范围宽，如图3。

表3试验结果(ng/mL)

试验例四、抗干扰试验

取新鲜混合血清，分成5等份，然后将每等份再分成10等份， 按照下表4浓度加入不同的干扰物质，取本发明实施例2～4以及对 比例1～2试剂盒，分别测定血清中C肽的含量，测定结果如表5所 示。

相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物样本的测定 均值)/空无干扰物样本的测定均值×100％。

表4干扰物质浓度

表5检测结果

试验例五、本发明检测方法与现有方法反应流程对比

使用本发明试剂盒(具体配方同实施例3)和Mercodia AB的C 肽测定试剂盒(ELISA)、郑州安图生物工程股份有限公司的人C肽 检测试剂盒(化学发光法)，分别采用科斯迈SMART1000全自动发 光仪和多功能酶标仪LB942S对3份高中低浓度的质控血清(中国药 品生物制品检定所，规格：0.5mL，批号：1815-0312)按各自的参数 同时进行测定，结果见表6、表7、表8。

(1)本发明试剂盒检测：

组分：参见实施例3；检测仪器：科斯迈SMART1000；

检测流程参见图4。

(2)Mercodia AB的C肽测定试剂盒(ELISA)检测：

组分：包被板，校准品(1套)、分析缓冲液、酶结合物11x、酶 结合物缓冲液、洗液、显色液、终止液；

检测仪器：多功能酶标仪LB942S；

检测流程参见图5。

(3)郑州安图生物工程股份有限公司的人C肽测定试剂盒(化 学发光法)检测：

组分：包被板，校准品(1套)、酶结合物、发光底物A、发光 底物B、洗液、板贴、子母袋；

检测仪器：Lucy化学发光检测仪；

检测流程参见图6。

表6本发明试剂检测结果

表7 Mercodia AB检测结果

表8郑州安图生物检测结果

结果显示：检测同样3份高中低浓度质控血清，本发明试剂检测 时间为30分钟，Mercodia AB检测时间为135分钟，郑州安图生物 试剂检测时间为65分钟。且本发明试剂盒检测不需要洗涤过程，试 剂用量也比较少，检测结果相对偏差控制在±1％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具 体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指 出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前 提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种校准品稳定剂，其特征在于，组分包括：牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、明胶、乙二胺四乙酸二钠、酪蛋白和氯化镁；其中牛血清白蛋白：海藻糖：蔗糖：甘露醇：甘氨酸：明胶：乙二胺四乙酸二钠：酪蛋白：氯化镁的质量比为(4～6)：(2～4)：(1～3)：(0.8～1.2)：(1～3)：(0.8～1.2)：(1～3)：(2～4)：(0.8～1.2)。

2.一种校准品稳定剂的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)将牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、明胶、乙二胺四乙酸二钠、酪蛋白、氯化镁加入去离子水中混匀至完全溶解，过滤；在37℃放置10～12小时，得到混合液A；

(2)在混合液A中加入甘油，常温下搅拌30～40分钟，所述混合液A和甘油的体积比为1：1；冻干后收集粉末，即得标准品稳定剂。

3.一种测定C肽的检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4；

所述校准品包含组分及终浓度为：

C肽抗原 0.2ng/mL～20ng/mL、

缓冲液 5～100mmol/L、

校准品稳定剂 0.01～1w/v％；

所述校准品稳定剂为权利要求1所述的标准品稳定剂或权利要求2所述的制备方法制得的标准品稳定剂；

所述试剂R1的组分及终浓度为：

所述试剂R2的组分及终浓度为：

试剂R3的组分及终浓度为：

抗氧化剂 0.01～1w/v％、

稳定剂3 0.01～1w/v％；

所述试剂R4的组分及终浓度为：

触发剂 5～20mmol/L、

稳定剂4 0.01～1w/v％、

增强剂4 0.01～1w/v％。

4.根据权利要求3所述的测定C肽的试剂盒，其特征在于，所述试剂校准品、试剂R1或试剂R2中缓冲液分别为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或几种；所述缓冲液pH均为6.5～8.5。

5.根据权利要求3所述的测定C肽的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂1、稳定剂2、稳定剂3或稳定剂4分别为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的测定C肽的试剂盒，其特征在于，所述增强剂1或增强剂2分别选自PEG4000、PEG6000、PEG8000或PEG20000的一种或几种；所述试剂R4中增强剂4为对羟基肉桂酸及其衍生物的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的测定C肽的试剂盒，其特征在于，所述试剂R3中抗氧化剂选自抗坏血酸及其衍生物、原花青素、维生素E的一种或几种。

8.根据权利要求3所述的测定C肽的试剂盒，其特征在于，所述试剂R4中触发剂选自过氧化氢或过氧化脲中的一种或几种。

9.一种化学发光法测定C肽的方法，其特征在于，具体操作方法包括：

(1)、分别获得样本和校准品的峰面积；

(2)、以校准品的C肽浓度作为X坐标，以峰面积作为Y坐标，作出剂量-反应曲线，根据该曲线计算出样品中C肽的浓度。

10.根据权利要求12所述的化学发光法测定C肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)操作为：按样本/校准品：试剂R1：试剂R2：试剂R3：试剂R4＝2：5～8：5～8：1：12～15的比例加入试剂，孵育，再加入试剂R3，混匀，加入试剂R4，立即连续检测1S内发光值RLU，每次间隔0.02～0.05S，分别计算得到样本和校准品的峰面积。