CN113930435A - 一种放射配体法检测c肽抗体的试剂盒 - Google Patents

一种放射配体法检测c肽抗体的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种放射配体法检测C肽抗体的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1所示序列的质粒。本发明设计的抗原COVAL100C可有效携带放射性信号，经放射配体法检测可有效识别C肽抗体，批内批间CV均在有效范围内，该方法的建立有效填补了C肽抗体检测的空白。

Description

一种放射配体法检测C肽抗体的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种放射配体法检测C肽抗体的试剂盒。
背景技术
受体的放射配体结合分析(radioligand binding assay，RBA)在抗体检测中具有信号灵敏、线性范围广泛、成本低廉等优势。放射配体法已经可以实现有效检测多种自身抗体，包括锌转运体8(ZnT8)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶(IA2)、胰岛素(IAA)等，目前该方法也是全球糖尿病自身抗体检测的金标准。该方法在抗原制备的过程中有得天独厚的优势：1、将抗原中含S的蛋氨酸，替换成35S标记的放射性蛋氨酸，不改变原来抗原的任何空间结构，区别于其他的需要标记外源物质可能改变空间结构的检测方法；2、快速转录翻译抗原制备只需90min，时间短，成本低；3、抗原用量极低，90min制备的抗原可检测上千份样本。
但是，发明人在研究中发现，放射性抗原在制备的过程中需要满足一定的条件：1)抗原的序列中要包含一定量的蛋氨酸，但部分抗原内不含或者含有极少量的蛋氨酸，无法有效携带放射性信号，从而无法高效的产生放射性抗原。2)部分微小的抗原结构域，由于其自身过小，不仅难以携带信号，更难以常规生物合成以及快速转录翻译。以上均限制了缺少蛋氨酸的抗原或小微抗原在该方法中的应用。
C肽(C-Peptide)由胰岛β细胞分泌，胰岛素原在裂解过程中形成1个分子的胰岛素和1个分子的C肽。C肽由31个氨基酸组成，不仅分子量小且不含有蛋氨酸，这两点均限制了RBA在C肽抗体检测中应用，同时C肽抗体检测也是其他检测领域的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种放射配体法检测C肽抗体的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测C肽抗体的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1所示序列的质粒。
上述试剂盒在放射配体法检测C肽抗体中的应用。
进一步地，所述应用包括以下步骤：
步骤1，采用35S-蛋氨酸标记SEQ ID NO.1所示序列的质粒，经转录翻译获得放射性标记的抗原；
步骤2，采用步骤2得到的抗原对C肽抗体进行检测。
本发明设计的抗原COVAL100C可有效携带放射性信号，经放射配体法检测可有效识别C肽抗体，批内批间CV均在有效范围内，该方法的建立有效填补了C肽抗体检测的空白。
附图说明
图1为不同模拟样本量下RBA C肽检测的放射读数。
图2为健康人群RBA C肽抗体检测的结果。
图3为C肽抗体分别在T1DM、非T1DM及健康人群中的分布。
图4为RBA C肽抗体检测竞争性抑制实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
1、实验材料
(1)样本来源：阴性质控血清标本取自于无糖尿病家族史的健康志愿者。糖尿病患者血样459例，其中1型糖尿病(T1DM)血清194例，其它类型(非T1DM)265例，均来自临床诊断样本。健康人(Health)313例来自招募人群[年龄(26.8±7.3)岁；男143例，女170例]；糖耐量检测(OGTT)空腹及2h血糖正常,排除心、脑、肝、肾等慢性及内分泌疾病，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史。
(2)主要试剂及仪器：TNT SP6快速转录翻译试剂盒(Promega公司，货号L2080)；35S-蛋氨酸(5mCi，PerkinElmer，货号NEG709A)；蛋白A琼脂糖PA(GE公司，货号17-5280-02)；蛋白G琼脂糖PG(GE公司，货号17061805)；96孔PVDF平板(Corning公司，货号3504)；Microscint-20闪烁液(PerkinElmer公司，货号6013621))；TBST缓冲液(Tris-Base2.424g，NaCl8.70g,Tween-20 1.5mL，BSA 1.0g加蒸馏水定容至至1000mL，调pH至7.4)；βCounter液体闪烁计数仪(PerkinElmer)；蛋白纯化柱NAP Column(GE公司，货号17-0853-02)；Anti C-Peptide抗体(abcam公司，货号ab30477)。
2、实验方法
(1)OVAL100支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体如下：
GTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGA CAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCT。
(2)构建质粒COVAL100C
构建方案：按照哺乳蛋白表达体系进行密码子优化后(避开两个酶切位点)构建在载体上，包含kozak序列，XhoI、XbaI酶切位点，目的序列。方式如下：
XhoI(ctcgag)+kozak序列(gccacc)+ATG+目的序列+终止密码子+XbaI
质粒COVAL100C序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：
GAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGCCTAAACCCTCCACCCCGCCTGGTTCTTCAGGCGGTGGATCCGTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCTCCTAAACCCTCCACCCCGCCTGGTTCTTCAGGCGGTGGATCCGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAG。
(3)快速转录翻译质粒，获得放射性标记的抗原
35S-蛋氨酸和TNT SP6混合液解冻后置于冰上，依次加入40μLTNT混合液、1μL(1μg/μL)质粒和5μL35S-蛋氨酸，用4μL无核酸酶水补充至总反应体系为50μL，充分混匀后置于30℃水浴箱孵育90min，随后取出置于冰上准备过NAP-5柱。
取出1只NAP-5柱置于试管架上，将其上下盖子均打开，弃去平衡液后加入1mL的TBST缓冲液平衡NAP-5柱，洗脱3次。将反应混合物小心加在NAP-5柱填充物表面，再用100μL的缓冲液清洗反应管后仍将其加入NAP-5柱中，待红色液体缓慢下移至柱2/3后，加入500μL缓冲液，仔细观察柱下液滴的颜色变化，收集红色过柱液约500μL，从中取出2μL过柱抗原于闪烁管中与1mL闪烁液混匀，置96孔βCounter闪烁计数仪上计数其每分钟脉冲数(countsperminute，CPM)值。
(4)待测样本与抗原的结合与检测
每孔各加5μL样本血清或模拟样本，每个标本和质控血清均为双复孔，取适量标记抗原，用6mL TBST缓冲液稀释标记抗原至20000CPM/60μL，向其中每孔加60μL稀释后的标记抗原，每孔CPM值要求≥20000，标记抗原与血清混匀振荡1小时，4℃冰箱中过夜。孵育PVDF板，150μLTBST/孔，4℃冰箱中过夜。次日，倒去PVDF板中的液体，每孔中加50μL的蛋白A/G混合琼脂糖(62.5％的PA与20％的PG按4:1配制)，依次从96孔平板各孔中取出50μL混合液转移至96孔PVDF过滤板上，4℃冰箱中混匀1h沉淀抗原-抗体复合物后取出，真空泵抽吸去液体，先向PVDF过滤板各孔中加200μL TBST缓冲液洗涤沉淀物，真空泵抽吸去液体留取沉淀物，再加150μL缓冲液重复洗涤7次，置于烘箱烘干后每孔加入60μL闪烁液，置96孔βCounter计数仪上计数，每孔计数1min。
结果计算：
放射指数(Index)＝(标本血清CPM－阴性质控CPM)/(阳性质控CPM－阴性质控CPM)。
统计学处理：
所有数据均采用SPASS26软件进行统计，对所有计量资料符合正态分布的以用均数±标准差
Figure BDA0003265691430000042
表示，组间比较采用t检验、单因素方差分析、方差分析趋势性检验，组间率和构成比用χ2检验，当理论频数<5％时，使用Fisher精确概率检验。P<0.05为差异显著，具有统计学意义。
3、实验结果
(1)COVAL100C携带放射性信号捕获C肽抗体的有效性判断
转录翻译质粒COVAL100C，获得带有放射性信号的COVAL100C抗原，将购买的C肽抗体作为模拟样本，使用COVAL100C抗原进行捕获，根据上述实验方法，检测不同模拟样本量下的放射读数。
如图1所示，放射性读数随着模拟样本加样量的递减而递减，经过方差分析趋势性检验p<0.0001，趋势性极显著。由此可知该COVAL100C抗原可有效捕获C肽抗体，其携带的放射信号随着抗体含量的变化而变化。
后续实验中使用购买的抗体作为阳参，根据信噪比(S/N)>15(S/N：不同C肽抗体添加量的CPM值/阴参的CPM值)以及成本综合考虑，选用0.625μL抗体，CPM约9776作为阳参的加样量，如表1。
表1不同C肽抗体添加量下信噪比(S/N)
Figure BDA0003265691430000041
(2)RBA检测C肽抗体的正常人界值判定
取155例健康人血清进行RBAC肽抗体的测定，计算放射指数，取99％百分位点为界值。结果如图2所示，经计算阳性界值为0.03，阳性判断标准为≥0.03。
(3)RBA检测C肽抗体的批内批间差异
根据C肽抗体指数低、中、高在正常人和患者中选择3份血清在批内和批间各重复检测5次(n＝5)，批内和批间变异系数(coefficient of variance，CV)见表2。
表2 RBA C肽抗体检测的批内批间差异
Figure BDA0003265691430000051
结果显示RBA C肽抗体检测指数的批内CV为4.80％～8.39％，批间CV为7.11％～13.94％，阴阳性结果判断重复性100％。
(4)C肽抗体在不同人群中的分布
检测C肽抗体分别在T1DM、非T1DM及健康人群中的百分比，分别为2.58％(5/194)、3.40％(9/265)、2.38％(13/546)及0.63％(1/158)，如图3所示。
(5)C肽抗体阳性样本的竞争性抑制
抽取经C肽抗体阳性的样本21例进行竞争性抑制实验，在RBA C肽抗体检测中每孔加入2μg购买的C肽蛋白，进行竞争性抑制实验。
如图4所示，加入C肽蛋白后，抗体的放射指数下降至阴性范围。因此RBA C肽抗体检测可有效识别真实的C肽抗体。
本发明设计的抗原COVAL100C可有效携带放射性信号，经放射配体法检测可有效识别C肽抗体，批内批间CV均在有效范围内，该方法的建立有效填补了C肽抗体检测的空白。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 一种放射配体法检测C肽抗体的试剂盒
<130> 20210916
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggcagagg acctgcaggt ggggcaggtg gagctgggcg ggggccctgg tgcaggcagc 60
ctgcagccct tggccctgga ggggtccctg cagcctaaac cctccacccc gcctggttct 120
tcaggcggtg gatccgtgac tgagcaagaa agcaaacctg tgcagatgat gtaccagatt 180
ggtttattta gagtggcatc aatggcttct gagaaaatga agatcctgga gcttccattt 240
gccagtggga caatgagcat gttggtgctg ttgcctgatg aagtctcagg ccttgagcag 300
cttgagagta taatcaactt tgaaaaactg actgaatgga ccagttctaa tgttatggaa 360
gagaggaaga tcaaagtgta cttacctcgc atgaagatgg aggaaaaata caacctcaca 420
tctgtcttaa tggctcctaa accctccacc ccgcctggtt cttcaggcgg tggatccgag 480
gcagaggacc tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc aggcagcctg 540
cagcccttgg ccctggaggg gtccctgcag 570
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgactgagc aagaaagcaa acctgtgcag atgatgtacc agattggttt atttagagtg 60
gcatcaatgg cttctgagaa aatgaagatc ctggagcttc catttgccag tgggacaatg 120
agcatgttgg tgctgttgcc tgatgaagtc tcaggccttg agcagcttga gagtataatc 180
aactttgaaa aactgactga atggaccagt tctaatgtta tggaagagag gaagatcaaa 240
gtgtacttac ctcgcatgaa gatggaggaa aaatacaacc tcacatctgt cttaatggct 300

Claims (3)

1.一种检测C肽抗体的试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示序列的质粒。
2.权利要求1所述的试剂盒在放射配体法检测C肽抗体中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，采用35S-蛋氨酸标记SEQ ID NO.1所示序列的质粒，经转录翻译获得放射性标记的抗原；
步骤2，采用步骤2得到的抗原对C肽抗体进行检测。
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