KR20180133180A - 성숙 췌장 베타 세포 바이오마커 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 성숙 췌장 베타 세포의 바이오마커 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 Prmt1 유전자를 넉아웃한 형질전환 동물은 제2형 당뇨병의 모델로 이용될 수 있어 제2형 당뇨병의 발병기전 연구 및 당뇨병 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 Prmt1 유전자/단백질을 이용한 성숙 췌장 베타 세포 구별용 조성물은 성숙한 췌장과 미성숙한 췌장 또는 역분화가 진행된 췌장의 베타 세포를 구별할 수 있고, 이를 이용하여 췌장 베타 세포의 분화 역분화 예방용, 분화 촉진용, 또는 역분화된 췌장 베타 세포의 재분화 촉진용 물질을 스크리닝할 수 있으며, 여기서 스크리닝된 후보물질은 제2형 당뇨병의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 성숙 췌장 베타 세포의 바이오마커 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
췌장의 랑게르한스 섬(islet of Langerhans)은 다섯 가지의 내분비 세포 유형(α, β, δ, PP 및 ε 세포)을 포함하는 복잡한 미세기관이다. 이러한 랑게르한스 섬의 65-80%를 차지하는 베타 세포는 혈당을 낮추는 인슐린 호르몬을 합성하고 저장 및 분비하는 기능을 하는 세포로서, 혈당이 높아지면 저장된 인슐린을 분비하고 동시에 추가적으로 인슐린을 생산한다.
제2형 당뇨를 포함한 인슐린 의존성 당뇨의 발병기전에는 다수의 복잡한 요인들이 작용하지만 상기 췌장 베타 세포의 손상, 또는 역분화를 동반하는 기능 상실 또는 기능 저하에 의해 발병하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 인슐린 의존성 당뇨병 치료의 일차적인 목적은 손상된 췌장 베타세포를 재생하거나 역분화(dedifferentiation)된 췌장 베타세포를 재생(재분화, redifferentiation)시키는 것이다.
인슐린 의존성 당뇨의 새로운 치료법이나 신약은 이를 평가하는데 적합한 어세이 포맷과 새로운 마커 단백질을 필요로 한다. 따라서 당-의존적 인슐린 분비를 특징으로 하는 성숙 췌장 베타세포의 상태를 명확하게 연결지을 수 있는 새로운 마커 단백질에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제10-136382호는 제2형 당뇨병의 조기 검출을 위한 마커단백질로 올팍토메딘4(OLFM4) 폴리펩타이드를 개시한다.
대한민국 특허공개공보 제10-2016-0114949호는 제2형 당뇨병의 진단을 위한 마커로서 펠리노-1 단백질을 개시한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 인슐린 의존성 당뇨를 조기 진단하거나 새로운 당뇨병 치료제를 평가하는데 적합한 마커 단백질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 Prmt1 유전자를 췌장 베타세포 특이적으로 넉아웃한 마우스에서 췌장 베타 세포의 역분화가 진행되는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 Prmt1 유전자가 넉아웃된 형질전환 동물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Prmt1 유전자 또는 단백질을 이용한 성숙 췌장 베타 세포 구별용 조성물, 및 이를 포함하는 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장의 성숙 베타 세포를 미성숙 베타 세포로부터 구별하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장 베타세포의 역분화 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장 베타세포의 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장 베타세포의 재분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Prmt1(Protein arginine methyltransferase 1) 유전자가 넉아웃된 Prmt1 넉아웃 형질전환동물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Prmt1 넉아웃 형질전환동물은 마우스 인 것이 바람직하나, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 랫트, 토끼 등을 포함하는 모든 동물이 이에 해당할 수 있다.
상기 형질전환 동물은 인위적으로 외부의 유전자를 삽입하거나 또는 유전자를 제거하여 의도하는 유전형질을 발현시킨 동물을 말하며, 생명체에서의 특정 유전자의 역할을 파악하는 기초연구에 유용하게 쓰일 수 있다. 즉, 그 기능이 의심되는 유전자를 삽입 또는 결실시키고, 그 영향이 어떻게 나타나는지를 관찰하여 상기 유전자가 매개하는 생리적 기능을 유추할 수 있다. 뿐만 아니라, 형질전환 동물은 사람 질병의 모델로서 사용할 수 있고, 질병의 원인이나 질병의 진행과정 등을 파악하거나 잠재적 치료약품의 효과나 부작용을 알아보는데 매우 유용하다. 현재 치매, 암, 심장병, 유전병 등의 질병에 걸린 형질전환 마우스, 제브라피쉬 등이 개발되고 있다.
본 발명의 상기 Prmt1(Protein arginine methyltransferase 1)는 아르기닌 메틸화(arginine methylation)을 일으키는 대표적인 효소로서, Prmt1은 히스톤 단백질 중 H4의 3번째 아르기닌을 비대칭적으로 메틸화시키고, 이는 추후 연속적으로 일어나는 라이신 잔기의 아세틸화를 통해 유전자 발현을 촉진할 수 있음이 알려져 있다. 한편, PRMT1은 히스톤 이외에도 여러 단백질을 아르기닌 메틸화 시킨다는 것이 알려지고 있으며, 포유류 세포의 90%의 메틸아르기닌이 Prmt1의 활성에 의한 것으로 알려져 있다(Tao Lu et al. Cell Cycle. 2014).
하기 본원 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, Prmt1은 이전 연구에서 생리학적 기능이 밝혀진 간세포(hepatocyte)에서의 발현량을 1로 놓고 비교해 보았을 때 췌도(islet)에서 10배 이상 높은 발현량을 나타내어 알려지지는 않았으나 췌장에서의 다양한 생리적 기능을 수행하리라는 것을 예측할 수 있다 (도 1).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Prmt1 넉아웃 형질전환동물은 마우스이다. 상기 Prmt1 넉아웃 마우스는 구체적으로 Prmt1 fl/fl x RIP2-Cre +/- 마우스이다. 본 발명에서 상기 Prmt1 fl/fl x RIP2-Cre +/- 마우스는 Prmt1 Floxed (fl/fl) 마우스를 RIP2-Cre 마우스와 교배시켜 생산된다.
또한, 상기 Prmt1 넉아웃 마우스는 췌장의 베타 세포에 특이적으로 넉아웃 된 것을 특징으로 한다(Prmt1 βKO). 본 발명의 실시예에서 확인된 바와 같이 상기 Prmt1 넉아웃 마우스(Prmt1 fl/fl x RIP2-Cre +/-)는 베타세포에 특이적으로 Prmt1 유전자가 넉아웃된다(도 3).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 Prmt1 넉아웃 마우스는 Prmt1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스(Prmt1 βiKO)이다. 상기 Prmt1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스는 Prmt1 floxed (fl/fl) 마우스를 Pdx1-CreEP 마우스와 교배시켜 생산되며, 타목시펜의 투여시 Prmt1의 넉아웃이 이루어져 타겟 유전자의 넉아웃 시점을 조절할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 Prmt1 넉아웃 마우스(Prmt1 βKO)는 대조군 마우스(Prmt1 fl/fl)에 비하여 당부하에 대한 혈당조절능력이 감소하여 내당능이 낮게 나타나며(도 4), 포도당부하 인슐린 분비능 측정을 위한 인 비보(in vivo) 및 엑스-비보(ex-vivo) 실험에서 대조군 마우스(Prmt1 fl/fl)에 비하여 인슐린 분비능이 낮게 나타남을 확인할 수 있다(도 5).
따라서, 상기 결과 및 후술할 내용을 근거로 본 발명의 Prmt1 넉아웃 형질전환 동물은 인슐린 의존성 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병에 대한 질환동물모델로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Prmt1 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 프라이머, 또는 프로브를 포함하는 성숙 췌장 베타 세포구별용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 Prmt1 mRNA에 상보적이고 Prmt1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, Prmt1 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 Prmt1에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에서는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 성숙한 췌장의 베타 세포인지 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프로브"는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 Prmt1 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 혈뇨 환자의 방광 종양의 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 표적 분자, 예를 들어 검출 또는 정량하고자 하는 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있도록, 검출 또는 정량하고자 하는 표적 서열의 영역과 동일하거나, 그에 상보적이거나, 그의 상동체이거나, 또는 그와 상동성인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 본 발명에서 이해되는 바와 같이, 프라이머는 그 자체로 프로브로서 기능할 수 있다. 본 발명에서 이해되는 "프로브"는 다수의 시판 qPCR 방법에서 통상적인 바와 같이 예를 들어 프라이머 쌍과 내부-표지 프로브의 조합을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 Prmt1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 이의 항체 결합 단편, 또는 앱타머를 포함하는 성숙 췌장 베타 세포구별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 Prmt1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 성숙 췌장 베타 세포를 구별하는 데 이용될 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
또한 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 성숙 췌장 베타 세포구별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다. 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 Prmt1 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 췌장의 성숙 베타 세포를 미성숙 베타 세포, 또는 역분화된 베타 세포로부터 구별하는 방법을 제공한다:
(a) 동물로부터 분리된 췌장 베타 세포에서 Prmt1 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 Prmt1 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 성숙 췌장 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계.
상기 성숙 췌장 베타 세포를 구별하는 방법을 단계별로 설명한다.
단계 (a): 췌장 베타 세포 분리 및 Prmt1 발현 수준의 측정
먼저 인간을 포함하는 동물로부터 췌장의 베타 세포를 분리한다. 이어서, 상기 분리된 췌장의 베타 세포 내의 Prmt1 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정한다.
상기 Prmt1 유전자의 발현 정도를 측정하는 수단은 검출 또는 증폭하는 올리고뉴클레오티드 프로브, 어레이-기반 방법, PCR-기반 방법, 서열분석-기반 방법에 기초하여 발현 수준을 측정하는 수단 또는 발현 수준을 측정하는 여타 적합한 수단을 포함할 수 있다.
단계 (b): 측정된 Prmt1 발현 수준을 성숙 췌장 베타 세포의 Prmt1 발현 수준과 비교
구체적으로, 상기 단계 (b)는 췌장 베타 세포 시료 내 Prmt1의 발현 수준을 측정하여 정상적인 성숙 췌장의 베타 세포에서 발현되는 Prmt1의 발현 수준과 비교하여 정상 범주의 Prmt1의 발현 수준에 해당되는 경우에 성숙 췌장 베타 세포로 판정한다. 한편, 췌장 베타 세포 시료 내의 Prmt1 발현 수준이 상기 정상 범주의 성숙 췌장 베타 세포의 Prmt1 발현 수준보다 낮게 나타나는 경우에는 미성숙 베타 세포 또는 역분화된 베타 세포로 판정하며, 미성숙인지, 역분화인지 여부는 시료를 수득한 개체의 연령, 성별과 건강상태, 주증(Chief complaint) 및 다른 검사 결과 등을 참작하여 판정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 췌장 베타세포의 역분화(dedifferentiation) 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 역분화가 진행된 성숙 베타 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계,
상기 후보물질과의 접촉 후 상기 Prmt1의 발현 수준이 후보물질의 접촉 전과 비교하여 증가되는 경우 췌장 베타세포의 역분화 예방용 물질로 판정한다.
상기 췌장 베타 세포의 역분화 예방용 물질의 스크리닝 방법을 단계별로 설명한다.
단계 (a): 후보물질의 접촉
먼저, 역분화가 진행된 성숙 베타 세포와 후보물질(candidate substance)을 접촉시킨다.
상기 성숙 베타 세포의 역분화 진행 여부는 본 발명의 Prmt1을 포함하는 베타 세포의 특징(beta cell identity)을 식별하는 당업계에 알려진 다양한 바이오마커를 검출함으로써 확인할 수 있으며, 예를 들면 인슐린 및 글루카곤이 동일한 세포에서 생산되는 것을 확인하거나, 성숙 베타 세포 마커인 Nkx6.1와 Glut2의 발현 감소, 세포의 다능성 마커인 Ngn3(neurogenin-3)의 발현 증가 및 전 내분비 마커(pre-endocrine marker)인 Sox9의 발현 증가를 검출함으로써 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 분석하고자 하는 후보물질은 다양한 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 후보물질은 화학물질, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 후보물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)일 수 있다. 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(영국), Comgenex(미국), Brandon Associates(미국), Microsource(미국) 및 Sigma-Aldrich(미국)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(미국) 및 MycoSearch(미국)에서 상업적으로 구입가능하다. 단백질, 펩타이드 등의 후보물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
단계 (b): Prmt1 유전자의 발현 수준 측정
다음으로 상기 췌장 베타 세포의 Prmt1의 발현 정도를 분석한다.
상기 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 유전자 발현 정도는 mRNA 레벨을 측정함으로써 분석할 수 있고, 구체적으로 RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
다음, 상기 Prmt1 유전자가 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군과 비교하여 발현이 증가되는 경우에는 상기 후보물질을 췌장 베타세포의 역분화 예방용 물질로 판정한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 베타 세포 특이적으로 Prmt1 유전자를 넉아웃한 마우스에서는 베타 세포의 역분화가 진행되었다. 따라서 Prmt1 유전자는 췌도 베타 세포의 기능 유지에 필수적인 유전자임을 확인할 수 있고, 상기 후보물질과의 접촉으로 췌장 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현이 증가되는 경우에는 베타 세포의 역분화 예방용 물질로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 미성숙 췌장 베타세포의 분화(differentiation) 촉진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
미성숙 췌장 베타 전구세포와 후보물질을 접촉시키는 단계;
상기 미성숙 췌장 베타 전구세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 후보물질과의 접촉 후 상기 Prmt1의 발현 수준이 후보물질의 접촉 전과 비교하여 증가되는 경우 미성숙 췌장 베타세포의 분화 촉진용 물질로 판정한다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 역분화된 췌장 베타세포의 재분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
역분화가 진행된 성숙 베타 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계;
상기 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 후보물질과의 접촉 후 Prmt1의 발현 수준이 후보물질의 접촉 전과 비교하여 증가되는 경우 역분화된 췌장 베타세포의 재분화 촉진용 물질로 판정한다.
상기 췌장 베타세포의 분화 촉진용 및 재분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법은 각각 미성숙 췌장 베타 세포와 역분화가 진행된 성숙 베타 세포에 후보물질을 접촉시키는 것을 제외하고는 상술한 역분화 예방용 물질의 스크리닝 방법과 동일하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 Prmt1 유전자를 넉아웃한 형질전환 동물은 제2형 당뇨병의 모델로 이용될 수 있어 제2형 당뇨병의 발병기전 연구 및 당뇨병 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 Prmt1 유전자/단백질을 이용한 성숙 췌장 베타 세포 구별용 조성물은 성숙한 췌장과 미성숙한 췌장 또는 역분화가 진행된 췌장의 베타 세포를 구별할 수 있고, 이를 이용하여 췌장 베타 세포의 분화 역분화 예방용, 분화 촉진용, 또는 역분화된 췌장 베타 세포의 재분화 촉진용 물질을 스크리닝할 수 있으며, 여기서 스크리닝된 후보물질은 제2형 당뇨병의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스에서 장기에 따른 Prmt1 유전자의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 2는 인간의 췌도에서 Prmt1 단백질 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 3은 Prmt1 넉아웃 마우스에서 Prmt1 유전자의 넉아웃 여부를 확인하기 위하여 췌도에서 Prmt1 단백질 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 4는 Prmt1 넉아웃 마우스의 내당능 장애를 확인하기 위하여 포도당 투여 후 시간에 따른 혈당을 측정하여 나타낸 도이다.
도 5는 Prmt1 넉아웃 마우스의 인슐린 분비능을 확인하기 위하여 포도당 투여 후 시간에 따른 혈중 인슐린 농도를 측정하여 나타낸 도이다.
도 6a 내지 도 6c는 선천적 Prmt1 넉아웃이 아닌, 발달과정 이후의 Prmt1 넉아웃에 따른 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 타목시펜을 투여해 Prmt1 넉아웃을 유도한 마우스(Prmt1 iβKO)를 이용한 실험방법 개요 및 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Prmt1 넉아웃 마우스의 당부하에 대한 미토콘드리아의 기능을 확인하기 위하여 포도당 주입 후 시간에 따른 췌도 세포의 산소 소비율을 나타낸 도이다.
도 8은 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 글루카곤 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 9는 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 성숙 베타 세포 마커인 Nkx6.1과 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 10은 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 다능성 마커인 Ngn3과 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 11은 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 성숙 베타 세포 마커인 Glut2와 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 12는 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 전내분비(pre-endocrine) 마커인 Sox9 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 2는 인간의 췌도에서 Prmt1 단백질 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 3은 Prmt1 넉아웃 마우스에서 Prmt1 유전자의 넉아웃 여부를 확인하기 위하여 췌도에서 Prmt1 단백질 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 4는 Prmt1 넉아웃 마우스의 내당능 장애를 확인하기 위하여 포도당 투여 후 시간에 따른 혈당을 측정하여 나타낸 도이다.
도 5는 Prmt1 넉아웃 마우스의 인슐린 분비능을 확인하기 위하여 포도당 투여 후 시간에 따른 혈중 인슐린 농도를 측정하여 나타낸 도이다.
도 6a 내지 도 6c는 선천적 Prmt1 넉아웃이 아닌, 발달과정 이후의 Prmt1 넉아웃에 따른 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 타목시펜을 투여해 Prmt1 넉아웃을 유도한 마우스(Prmt1 iβKO)를 이용한 실험방법 개요 및 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Prmt1 넉아웃 마우스의 당부하에 대한 미토콘드리아의 기능을 확인하기 위하여 포도당 주입 후 시간에 따른 췌도 세포의 산소 소비율을 나타낸 도이다.
도 8은 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 글루카곤 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 9는 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 성숙 베타 세포 마커인 Nkx6.1과 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 10은 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 다능성 마커인 Ngn3과 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 11은 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 성숙 베타 세포 마커인 Glut2와 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
도 12는 고지방 식이 Prmt1 넉아웃 마우스의 베타 세포에서 역분화 진행 여부를 확인하기 위하여 전내분비(pre-endocrine) 마커인 Sox9 및 인슐린의 발현을 면역염색으로 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1: 마우스에서 장기에 따른
Prmt1
유전자의 발현 정도 확인
12주령 된 C57BL/6J 마우스로부터 간(Liver), 뇌(Brain), 갈색지방(Brown adipose tissue), 피하지방(Subcutaneous fat), 췌도(Islet)를 각각 분리한 후 Trizol 시약 (Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 중 1 μg을 Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem)를 이용하여 cDNA로 합성하고 Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem)를 이용하여 Real-time PCR을 시행하였다. Prmt1 유전자의 발현량은 Beta-actin을 내부 대조군으로 이용하여 표준화하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, Prmt1 유전자는 간세포의 발현 비율을 1로 보았을 때, 췌도(islet)에서 10배 이상 높은 발현 정도를 나타냄을 확인하였다.
실시예
2: 인간의
췌도에서
Prmt1
단백질 및 인슐린의 발현 비교
68세 췌장암 환자의 췌장 조직을 10% formalin (Sigma)으로 상온에서 12시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩 한 후 4 μm 두께로 슬라이드 글라스에 마운팅 하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화 시킨 후, 95℃의 10 mM 구연산 나트륨 버퍼; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간 동안 블로킹 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다: anti-Insulin (Guinea pig, 1:1000; Dako), anti-Prmt1 (Rabbit, 1:1000; Abcam). PBS로 10분간 워싱한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence 마운팅 medium (Dako)로 마운팅 하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 인슐린을 발현하는 베타 세포와 Prmt1을 발현하는 세포가 동일함을 확인할 수 있다.
실시예
3:
Prmt1
βKO
마우스의 제작
Prmt1 floxed (fl/fl) 마우스를 RIP2-Cre 마우스와 교배시켜 Prmt1 fl/fl x RIP2-Cre +/- (Prmt1 βKO) 마우스를 생산하였다. PRMT1이 베타세포 특이적으로 넉아웃 되었는지를 확인하기 위하여, 3주령의 대조군(Prmt1 fl/fl)과 Prmt1 βKO 마우스의 췌장을 적출하여 Prmt1, Insulin, Glucagon을 형광 염색하였다. 마우스의 췌장을 적출한 후 10% formalin (sigma)으로 상온에서 4시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩한 후 4 μm 두께로 슬라이드글라스에 마운팅 하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화시킨 후, 95℃ 의 10 mM 구연산 나트륨 버퍼; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간 동안 블로킹을 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다: anti-Insulin(Guinea pig, 1:1000; Dako), anti-Prmt1(Rabbit, 1:1000; Abcam), anti-Glucagon(Mouse, 1:1000; Sigma). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), Cy5-conjugated goat anti-mouse IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence 마운팅 medium (Dako)로 마운팅하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Prmt1 βKO 마우스에서는 인슐린을 분비하는 베타세포에 특이적으로 Prmt1 유전자가 넉아웃 된 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4:
Prmt1
βKO
마우스의
내당능 장애
유무의 확인
상기 실시예 3에서 제작한 Prmt1 βKO 마우스에의 내당능 장애(Glucose intolerance) 유무를 확인하기 위하여, 8주령, 12주령의 대조군(Prmt1 fl/fl)과 Prmt1 βKO 마우스에서 내당능 검사를 시행하였다. 먼저, 마우스를 16시간 동안 금식 시킨 후, 복강에 2g/kg 체중의 양으로 포도당 용액을 주사하였다. 주사 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 시점에 혈당계측기로 마우스 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Prmt1 βKO 마우스는 대조군인 Prmt1 fl/fl 마우스와 비교하여 내당능이 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
5:
Prmt1
βKO
마우스의 in
vivo
및 ex
vivo
포도당 부하 인슐린
분비능시험
(GSIS)
Prmt1 βKO 마우스의 인슐린 분비능을 측정하기 위하여 in-vivo와 ex-vivo에서 포도당부하 인슐린 분비능 (Glucose stimulated insulin secretion; GSIS) 검사를 시행하였다.
In-vivo GSIS 실험을 위하여 마우스를 16시간 동안 금식시킨 후, 2g/kg 체중의 양으로 포도당 용액을 복강에 주사하였다. 주사 직전(0 min)과 주사 15분 후 시점에 헤파린 튜브를 이용하여 마우스의 눈확부분(retro-orbital area)에서 채혈을 한 후, 혈액을 4℃/12,000 rpm/10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 인슐린 ELISA kit (ALPCO)을 이용하여 분리한 혈청에서 인슐린 농도(ng/ml)를 측정하였다.
Ex-vivo GSIS 실험을 위하여 마우스에서 췌도를 분리(isolation)한 후 RPMI 1640 (10% FBS) 배지에 넣고, 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 16시간 동안 안정화시켰다. 안정화가 끝난 췌도를 5 mM 포도당 농도의 Krebs-Ringer HEPES(KRH) 버퍼에 옮긴 후, 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 다음 췌도를 2.8 mM 포도당 농도의 Krebs-Ringer HEPES(KRH) 버퍼에 옮긴 후, 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음 췌도를 두 그룹으로 10개씩 나누어 한 그룹에는 2.8 mM 포도당 농도의 KRH 버퍼 1 ml를, 다른 한 그룹에는 20 mM 포도당 농도의 KRH 버퍼 1 ml을 넣고 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 15분간 반응시켰다. 분비된 인슐린이 함유된 KRB 버퍼는 반응 직후 -80℃에 보관하였다. 췌도 내 인슐린을 추출하기 위해 반응이 끝난 췌도는 hand-picking하여 0.5 ml의 acid-ethanol(1.5mL HCl in 100ml of 70% ethanol)에 넣고 Bioruptor sonicator로 30초간 sonication시킨 후 -80℃에 보관하였다. 인슐린 ELISA kit (ALPCO)을 이용하여 KRB 버퍼 내의 분비된 인슐린과 acid-ethanol 내의 췌도 내 인슐린 농도를 측정하였고, 인슐린 분비능(insulin release)은 췌도 내 인슐린(islet insulin content)에 대한 분비된 인슐린(secreted insulin)의 %(percentage)로 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Prmt1 βKO 마우스의 인슐린 분비능은 대조군인 대조군(Prmt1 fl/fl) 마우스의 인슐린 분비능보다 낮게 나타남을 확인하였다.
실시예
6:
Prmt1
βiKO
마우스에서
DEG
(differentially Expressed Gene) 확인
발달과정 이후에서 Prmt1 유전자를 넉아웃시킨 경우에 나타나는 유전자의 발현 정도를 확인하고자 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저 Prmt1 floxed (fl/fl) 마우스를 대조군으로 하고, Prmt1 floxed (fl/fl) 마우스를 Pdx1-CreER 마우스와 교배시켜 Prmt1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- (Prmt1 βiKO)마우스를 생산하여 실험군으로 사용하였다. 다음으로 성체 베타세포에서 PRMT1 단백질을 제거하기 위해 6주령부터 8주령까지 2주 동안 총 5회, 75 mg/kg(체중)의 용량으로 타목시펜(tamoxifen, sigma)을 마우스 복강에 주사하였다. 이와 같은 방법으로 타목시펜을 2주간 투여한 대조군 마우스(Prmt1 fl/fl, n=3)와 Prmt1 βiKO 마우스(n=3)의 췌도를 RNA-시퀀싱 분석에 사용하였다. 상기 실험방법 개요 및 DEG 실험결과는 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.
도 6b에 나타낸 바와 같이 실험군에서는 대조군에 비하여 Pdx1, Nkx6.1, MafA, Ucn3과 같은 베타 세포 마커 유전자들의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 도 6c에 나타낸 바와 같이 특히 산화적 인산화나, 전자 전달계 관련 유전자의 발현이 감소되어 미토콘드리아 기능 감소를 예측할 수 있었다.
실시예
7:
Prmt1
βKO
마우스
췌도의
당부하에 대한 미토콘드리아의 기능 확인
Prmt1 βKO 마우스 췌도의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위하여 12주령의 대조군(Prmt1 fl/fl)과 Prmt1 βKO 마우스에서 췌도를 분리한 후 RPMI 1640 (10% FBS) 배지에 넣고, 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 16시간 동안 안정화시켰다. 안정화시킨 췌도를 검정 배지(Seahorse Bioscience)로 워싱한 다음 그룹당 50개씩 hand-picking하여 XF-24 췌도 배양 마이크로 플레이트에 분배하였다. 그 다음 췌도를 10 mM 피루베이트(pyruvate)와 2 mM 글루타민(glutamine)이 함유된 37℃ 검정 배지에서 1시간 동안 반응시켰다. 20 mM 포도당은 세포의 산소 소비율(OCR: oxygen consumption rate)을 자극하기 위해 주입하였으며, 5 mM의 올리고마이신(oligomycin)은 ATP 합성효소(ATP synthase)를 억제하기 위해 주입하였다. 미토콘드리아의 호흡 억제제인 CCCP(Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)는 전자전달계의 capacity를 측정하기 위하여 1 μM 농도로 주입하였다. 미토콘드리아 복합체 1 억제제(Mitochondrial complex 1 inhibitor)인 로테논(rotenone)은 전자전달계 반응을 종결시키기 위해 5 μM 농도로 주입하였다. 췌도의 산소 소비율(oxygen consumption rate)은 Seahorse XF-24 analyzer (Seahorse Bioscience)로 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, Prmt1 βKO 마우스 췌도의 산소 소비율이 대조군(Prmt1 fl/fl) 마우스의 췌도에 비하여 낮은 것으로 나타나 미토콘드리아의 산화적 기능이 감소함을 실험적으로 확인할 수 있었다.
실시예
8: 고지방
식이한
Prmt1
βKO
마우스의
췌도
베타세포
역분화
확인(인슐린 및 글루카곤 염색)
고지방식이(High-fat diet; HFD)를 8주령부터 24주령까지 총 16주간 먹인 24주령의 Prmt1 βKO 마우스의 췌장을 적출하여 Insulin, Glucagon을 형광 염색하였다. 마우스의 췌장을 적출한 후 10% 포르말린 (sigma)으로 상온에서 4시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩 한 후 4 μm 두께로 슬라이드글라스에 마운팅 하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화시킨 후, 95 의 10 mM 구연산 나트륨 버퍼; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간 동안 블로킹을 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4 에서 16시간동안 반응시켰다: 항-인슐린 (Guinea pig, 1:1000; Dako), 항-글루카곤(Mouse, 1:1000; Sigma). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-mouse IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence 마운팅 medium (Dako)로 마운팅하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이를 먹여 인슐린의 분비를 유도한 Prmt1 βKO 마우스의 췌도에서는 인슐린과 글루카곤이 동시에 분비되고 있음을 확인할 수 있었다. 인슐린과 글루카곤이 베타세포에서 동시에 생산된다는 것은 베타세포의 특성이 유지되지 못하고 소실되는 역분화(dedifferentiation)의 특징이다. 따라서, Prmt1 βKO 마우스에서는 췌도 내 베타세포의 역분화가 유도됨을 확인할 수 있다.
실시예
9: 고지방
식이한
Prmt1
βKO
마우스의
췌도
베타세포
역분화
확인(인슐린 및 성숙 베타 세포
마커인
Nkx6
.1 염색)
고지방식이(High-fat diet; HFD)를 8주령부터 24주령까지 총 16주간 먹인 24주령의 Prmt1 βKO 마우스의 췌장을 적출하여 Insulin, Nkx6.1을 형광 염색하였다. 마우스의 췌장을 적출한 후 10% 포르말린(sigma)으로 상온에서 4시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩한 후 4 μm 두께로 슬라이드글라스에 마운팅하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화시킨 후, 95℃의 10mM sodium citrate buffer; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간동안 블로킹을 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4에서 16시간동안 반응시켰다: anti-Insulin(Guinea pig, 1:1000; Dako), anti-Nkx6.1(Mouse, 1:1000; DSHB). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-mouse IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence 마운팅 medium (Dako)로 마운팅하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군의 췌도 베타세포에서는 Nkx6.1이 핵내에서 강하게 발현되는데 반하여, 실험군인 Prmt1 βKO 마우스의 췌도 베타세포에서는 Nkx6.1의 핵내 염색성이 약하게 나타났으며 오히려 세포질에서 많이 발현되었음을 확인할 수 있다. 이 현상은 사람 당뇨환자의 역분화된 베타세포에서도 관찰되는 특징 중 하나이다.
실시예
10: 고지방
식이한
Prmt1
βKO
마우스의
췌도
베타세포
역분화
확인(인슐린 및
다능성
마커인
Ngn3
염색)
고지방식이(High-fat diet; HFD)를 8주령부터 24주령까지 총 16주간 먹인 24주령의 Prmt1 βKO 마우스의 췌장을 적출하여 Insulin, Neurogenin-3을 형광 염색하였다. 마우스의 췌장을 적출한 후 10% 포르말린 (sigma)으로 상온에서 4시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩 한 후 4 μm 두께로 슬라이드글라스에 마운팅하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화시킨 후, 95℃ 의 10 mM sodium citrate buffer; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간동안 블로킹을 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4℃ 에서 16시간동안 반응시켰다: anti-Insulin(Guinea pig, 1:1000; Dako), anti-Neurogenin-3(Mouse, 1:1000; DSHB). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-mouse IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence 마운팅 medium (Dako)로 마운팅하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군의 췌도 베타세포에서는 Ngn3가 전혀 발현되지 않은 반면, 실험군인 Prmt1 βKO 마우스의 췌도 베타세포에서는 인슐린의 발현이 매우 약하게 나타났으며, Ngn3의 핵내 염색성을 가지는 베타세포들이 다수 나타남을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 베타세포에서 인슐린의 발현이 감소하고 다능성 마커인 뉴로제닌-3의 발현이 강하게 나타나는 결과로부터 과 글루카곤이 베타세포에서 동시에 생산된다는 것은 베타세포의 특성이 유지되지 못하고 소실되는 역분화(dedifferentiation)의 특징이다. 따라서, Prmt1 βKO 마우스에서는 췌도 내 베타세포의 역분화가 유도됨을 확인할 수 있다.
실시예
11: 고지방
식이한
Prmt1
βiKO
마우스의
췌도
베타세포
역분화
확인(인슐린 및 성숙 베타세포
마커인
Glut2
염색)
22주령부터 24주령까지 2주동안 총 5회, 75mg/kg(체중)의 농도로 타목시펜(tamoxifen, sigma)을 복강에 주사하고, 고지방식이(High-fat diet; HFD)를 24주령부터 32주령까지 총 8주간 먹인 32주령의 대조군(Prmt1 fl/fl)과 Prmt1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- (Prmt1 βiKO) 마우스의 췌장을 적출하여 Insulin, Glut-2를 형광 염색하였다. 먼저 마우스의 췌장을 적출한 후 10% formalin (sigma)으로 상온에서 4시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩한 후 4 μm 두께로 슬라이드글라스에 마운팅하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화시킨 후, 95℃의 10mM sodium citrate buffer; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간동안 blocking을 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4에서 16시간동안 반응시켰다: anti-Insulin(Guinea pig, 1:1000; Dako), anti-Glut2 (Rabbit, 1:500; Millipore). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence mounting medium (Dako)로 마운팅하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스의 성숙 췌도 베타세포에서는 인슐린 및 Glut2의 발현이 확연하게 나타났으나, Prmt1 βiKO 마우스의 성숙 췌도 베타세포에서는 인슐린 및 Glut2의 발현이 감소하였음을 확인 할 수 있었다. 따라서, Prmt1 βiKO 마우스에서는 췌도 내 베타세포의 역분화가 유도됨을 확인할 수 있다.
실시예
12: 고지방
식이한
Prmt1
βiKO
마우스의
췌도
베타세포
역분화
확인(인슐린 및 전 내분비(pre-endocrine)
마커인
Sox9
염색)
22주령부터 24주령까지 2주동안 총 5회, 75mg/kg(체중)의 농도로 타목시펜(tamoxifen, sigma)을 복강에 주사하고, 고지방식이(High-fat diet; HFD)를 24주령부터 32주령까지 총 8주간 먹인 32주령의 대조군(Prmt1 fl/fl)과 Prmt1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- (Prmt1 βiKO)마우스의 췌장을 적출하여 Insulin, Sox-9을 형광 염색하였다. 마우스의 췌장을 적출한 후 10% formalin (sigma)으로 상온에서 4시간 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 automatic tissue processor (Leica)를 이용하여 파라핀에 임베딩한 후 4 μm 두께로 슬라이드 glass에 마운팅하였다. 면역형광염색을 위해 조직슬라이드를 탈파라핀화-수화시킨 후, 95의 10mM sodium citrate buffer; pH 6.0에서 30분간 반응시켰다. 4% goat serum (in PBS)으로 상온에서 1시간동안 blocking을 한 후, 다음과 같은 일차 항체를 이용하여 4에서 16시간 동안 반응시켰다: anti-Insulin(Guinea pig, 1:1000; Dako), anti-Sox9 (Rabbit, 1:1000; Millipore). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 다음과 같은 형광 이차 항체를 이용하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다: fluorescein isothiocyanate conjugated goat anti-guinea pig IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). PBS에서 10분간 워싱을 한 후, 4',6-diamidino-2-phenylindole (1:2000; Invitrogen)으로 상온에서 5분간 반응시킨 후 fluorescence 마운팅 medium (Dako)로 마운팅하였다. 이미지는 컨포컬 형광현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스의 성숙 췌도 베타세포에서는 전 내분비 마커인 Sox9의 발현이 확인되지 않았으나, 실험군인 Prmt1 βiKO 마우스의 성숙 췌도 베타세포에서는 전 내분비 마커인 Sox9의 발현이 나타났음을 확인 할 수 있었다. 상기 결과로부터 Prmt1 βKO 마우스에서는 췌도 내 베타세포의 역분화가 유도됨을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Biomarker For Mature Pancreatic Beta Cell And Methods Of Using
The Same
<130> PN170066
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1325
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prmt1 gene nucleotide sequence
<400> 1
ggggctgggc tgaggaccct ctggtaaaag gcggtccccg gtcgagccgg ggggagaaaa 60
gagagagggg ggggtctcgg aggccggagg actcgggtga agatggcggc agccgaggcc 120
gcgaactgca tcatggaggt ttcctgtggc caagcagaaa gtagtgagaa gcccaacgct 180
gaggacatga catccaaaga ctactacttt gactcctatg cccactttgg catccacgag 240
gagatgctga aggatgaggt gcgcaccctc acataccgca actccatgtt tcacaatcgg 300
catctcttca aagacaaggt ggtgctggat gtgggctcag gcactggcat cctctgcatg 360
tttgctgcca aggcgggggc ccgcaaggtt attgggattg agtgttccag tatctccgat 420
tatgctgtga agattgtcaa agccaacaag ttagaccatg tggtgaccat catcaagggc 480
aaggtggagg aggtggagct gcccgtggag aaggtggaca tcatcatcag cgagtggatg 540
ggttactgcc tcttctacga gtccatgctc aacaccgtgc tgcacgctcg ggacaagtgg 600
ctggcacccg atggcctcat cttcccagac cgggccacct tgtatgtgac agccattgag 660
gaccgacaat ataaagacta caagatccac tggtgggaga acgtgtatgg ctttgatatg 720
tcctgcatta aagacgtggc catcaaggag cccctggtgg acgtggtgga cccaaagcag 780
ctggtcacca atgcctgcct cataaaggag gtggacatct acacagtcaa ggtggaggac 840
ctgaccttca cctccccctt ctgcctgcaa gtgaagagga acgactacgt gcacgcgctg 900
gtggcttact tcaacatcga gttcacccga tgccacaaga ggaccggctt ctccaccagt 960
cctgagtccc cgtacacaca ctggaagcag actgtgttct acatggagga ctacctaaca 1020
gtgaagactg gcgaggagat ctttggcacc attggaatga ggcccaatgc caaaaacaat 1080
cgtgacttgg actttaccat cgacctggac ttcaagggtc agctgtgtga gctctcttgt 1140
tccaccgact accggatgcg ctgaggaggt gccaggctgg ccctcctgca gaagggggct 1200
cggggggatg ggcttggggg atgggggggt acatcgtgac tgtgtttttc ataacttatg 1260
tttttatatg gttgcgttta tgccaataaa tcctcagctg accatgccaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaa 1325
<210> 2
<211> 353
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prmt1 protein amino acid sequence
<400> 2
Met Ala Ala Ala Glu Ala Ala Asn Cys Ile Met Glu Val Ser Cys Gly
1 5 10 15
Gln Ala Glu Ser Ser Glu Lys Pro Asn Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys
20 25 30
Asp Tyr Tyr Phe Asp Ser Tyr Ala His Phe Gly Ile His Glu Glu Met
35 40 45
Leu Lys Asp Glu Val Arg Thr Leu Thr Tyr Arg Asn Ser Met Phe His
50 55 60
Asn Arg His Leu Phe Lys Asp Lys Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly
65 70 75 80
Thr Gly Ile Leu Cys Met Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val
85 90 95
Ile Gly Ile Glu Cys Ser Ser Ile Ser Asp Tyr Ala Val Lys Ile Val
100 105 110
Lys Ala Asn Lys Leu Asp His Val Val Thr Ile Ile Lys Gly Lys Val
115 120 125
Glu Glu Val Glu Leu Pro Val Glu Lys Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu
130 135 140
Trp Met Gly Tyr Cys Leu Phe Tyr Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Leu
145 150 155 160
His Ala Arg Asp Lys Trp Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Phe Pro Asp
165 170 175
Arg Ala Thr Leu Tyr Val Thr Ala Ile Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp
180 185 190
Tyr Lys Ile His Trp Trp Glu Asn Val Tyr Gly Phe Asp Met Ser Cys
195 200 205
Ile Lys Asp Val Ala Ile Lys Glu Pro Leu Val Asp Val Val Asp Pro
210 215 220
Lys Gln Leu Val Thr Asn Ala Cys Leu Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr
225 230 235 240
Thr Val Lys Val Glu Asp Leu Thr Phe Thr Ser Pro Phe Cys Leu Gln
245 250 255
Val Lys Arg Asn Asp Tyr Val His Ala Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile
260 265 270
Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Arg Thr Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Pro Tyr Thr His Trp Lys Gln Thr Val Phe Tyr Met Glu Asp Tyr
290 295 300
Leu Thr Val Lys Thr Gly Glu Glu Ile Phe Gly Thr Ile Gly Met Arg
305 310 315 320
Pro Asn Ala Lys Asn Asn Arg Asp Leu Asp Phe Thr Ile Asp Leu Asp
325 330 335
Phe Lys Gly Gln Leu Cys Glu Leu Ser Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met
340 345 350
Arg
Claims (11)
- Prmt1 유전자가 넉아웃된 Prmt1 넉아웃(knockout) 형질전환동물
- 제 1 항에 있어서, 상기 Prmt1 넉아웃 형질전환동물은 췌도 베타 세포에 특이적으로 Prmt1을 넉아웃시킨 마우스인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
- 제 2 항에 있어서 상기 형질전환동물은 Prmt1 fl/fl x RIP2-Cre +/- 마우스(Prmt1 βKO mouse) 또는 Prmt1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스(Prmt1 βiKO mouse)인 것을 특징으로 하는 형질전환동물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환동물은 제2형 당뇨병 모델로 사용되는 것을 특징으로 하는 형질전환동물.
- Prmt1 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 프라이머, 또는 프로브를 포함하는 성숙 췌장 베타 세포구별용 조성물.
- Prmt1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 이의 항체 결합 단편, 또는 앱타머를 포함하는 성숙 췌장 베타 세포구별용 조성물.
- 제 5 항 또는 제 6 항의 조성물을 포함하는 성숙 췌장 베타 세포구별용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 췌장의 성숙 베타 세포를 미성숙 베타 세포로부터 구별하는 방법:
(a) 동물로부터 분리된 췌장 베타 세포에서 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 Prmt1 유전자의 발현 수준을 성숙 췌장 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계.
- 다음 단계를 포함하는 췌장 베타세포의 역분화(dedifferentiation) 예방용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 역분화가 진행된 성숙 베타 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계,
상기 후보물질과의 접촉 후 상기 Prmt1의 발현 수준이 후보물질의 접촉 전과 비교하여 증가되는 경우 췌장 베타세포의 역분화 예방용 물질로 판정한다.
- 다음 단계를 포함하는 미성숙 췌장 베타세포의 분화(differentiation) 촉진용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 미성숙 췌장 베타 전구세포와 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 미성숙 췌장 베타 전구세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계,
상기 후보물질과의 접촉 후 상기 Prmt1의 발현 수준이 후보물질의 접촉 전과 비교하여 증가되는 경우 미성숙 췌장 베타세포의 분화 촉진용 물질로 판정한다.
- 다음 단계를 포함하는 역분화된 췌장 베타세포의 재분화(redifferentiation) 촉진용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 역분화가 진행된 성숙 베타 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 베타 세포의 Prmt1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계,
상기 후보물질과의 접촉 후 Prmt1의 발현 수준이 후보물질의 접촉 전과 비교하여 증가되는 경우 역분화된 췌장 베타세포의 재분화 촉진용 물질로 판정한다.
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| MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Vol. 29, No. 11, pp. 2982-2996(2009년 6월)* * |
| Nature Communication, 9:4824(2018) * |
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| 웹진 분자세포생물학뉴스레터, 연구실탐방 ‘고려대학교 생명과학부 대사질환연구실’, pp.1-6(2015년 3월)* * |
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