KR20210074683A - 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스에 차등 발현하는 닭 유전자 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스에 차등 발현하는 닭 유전자 및 그의 용도에 관한 것으로, 고온 스트레스에 노출된 닭의 전사체 분석을 통하여 차등발현 유전자를 도출하고, 상기 차등발현 유전자들의 유전자 온톨로지 강화 분석 및 KEGG 경로 농축 분석과 유전자 동시 발현 네트워크 분석을 통해 발현 패턴 및 패턴별 기능 분류를 확인하였으며, 고온 스트레스에 대한 적응 반응 유전자에 관련된 주요 대사 경로 및 유전자 조절 형태를 확인하였다. 또한, 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스 노출에 따라 모든 비교군에서 공통적으로 발현량이 증가하는 유전자 1종을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 차등발현 유전자를 닭의 고온 스트레스 노출 여부 검출용 바이오마커로 활용함으로써, 닭의 최적 사육 조건을 확립하여 생산성 증대에 기여하고, 기후온난화에 대응하여 고온 적응성이 높은 닭 집단을 육성하는데 활용될 수 있다.

Description

닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스에 차등 발현하는 닭 유전자 및 그의 용도{Chicken gene differentially expressing high temperature stress in chicken breast muscle}

본 발명은 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스에 차등 발현하는 닭 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다.

닭은 고품질 단백질의 저렴한 공급원이며, 농촌 지역사회에 상당한 식품안전을 제공한다. 전문화된 특성 선택은 통제된 환경에서 상업용 육계 닭을 극한 환경에 민감하게 만들었다. 이는 열 스트레스와 같은 환경 조건을 경험하는 지역으로 양계 산업을 확장하는 데 상당한 장애를 야기한다. 항온성인 닭은 광범위한 주변 온도에 걸쳐 일정한 체온을 유지할 수 있지만, 지구 온난화와 기후 변화로 인한 더 높은 주변 온도는 동물의 생리적 및 기능에 상당한 영향을 미쳐 양계 산업에 상당한 경제적 손실을 가져온다.

고온 스트레스(HS; heat stress)는 주변 온도가 허용 범위를 초과하는 상태로 분류되어 조류들이 항상 일정한 체온을 유지하기가 어렵게 만든다. 그것은 육질 저하, 낮은 성장률, 체중의 감소, 계란 무게와 껍질의 두께 감소, 그리고 높은 사망률로 이어진다. 또한 체액 면역이 감소되어 조류가 질병에 취약해지기 때문에 심각한 면역 억제를 일으킨다. 고온 스트레스에 대한 조류의 반응은 유전학에 따라 달라진다. 상업적으로 빠르게 자라는 육계는 특히 고온 스트레스에 민감하지만, 열대 지역에서 자생하는 토종닭(IC) 품종은 다른 품종에 비해 고온 스트레스 내성이 더 높은 것으로 알려져 있다. 이는 고온 스트레스에 대한 유전적 저항성이 적응의 결과로 얻어질 수 있고, 유전될 수 있음을 시사한다.

증가하는 세계인구를 지원하기 위한 미래의 농업 확장은 극한 환경에 적응할 유전적 잠재력이 부족한 상업용 가축에 덜 적합한 기후 조건을 가진 지역에서 일어날 것이라고 예상되고 있다. 케냐와 같은 개발 도상국들의 마을에서는 토종닭(IC) 생산은 낮은 생산비용과 쓰레기 소각으로 살아남는 능력과 환경 기생충 문제에 대한 생존 능력 때문에 식량안보를 제공할 뿐만 아니라 소득보장도 제공한다. 케냐의 총 사육 닭 3천180만 마리 중 70%가 IC인 것으로 보고되었다. 케냐에는 건조, 반건조, 열대 및 온대 지역을 포함하여 7개의 상이한 농업-생태 지역이 있다. 이러한 농업-생태 지역에서 12종의 닭이 발견되고 있다. 이 닭들은 높은 유전적 다양성을 보이며 그들의 지역 환경에 잘 적응되어 있다. 닭은 자유 범위 시스템 하에서 광범위하게 사육되고, 이는 닭들이 극심한 기후 변화의 부정적인 영향에 노출됨을 의미한다. 여러 세대에 걸쳐 극심한 환경 조건에서도 살아남은 토종닭 생태형은 게놈 수준에서 내성을 보임에 따라 유전적 접근법을 통해 고온 스트레스의 영향을 완화하기 위해서 그러한 환경에서 진화한 닭을 분석하는 것이 필요하다. 케냐 토종 닭은 고온 적응 닭의 고온 스트레스에 대한 유전자 반응을 이해할 수 있는 기회를 제공한다. 고온 스트레스 적응 닭과 비적응 닭에 대한 이전의 연구로는 고온 스트레스에 의해 조절되는 생물학적 메커니즘을 밝히고, 열대 조건에 노출된 저지대 적응 닭과 고지대 적응 닭 사이의 차등 면역 반응을 확인한 것이 있으나(Park et al., 2018;te Pas et al., 2019), 열대 조건에 노출된 저지대 적응 닭과 고지대 적응 닭 사이의 차등 발현하는 유전자를 확인한 연구는 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스 노출 전후에 관찰되는 유전자 발현 차이 및 상호작용 연구를 통하여 닭의 고온 스트레스 노출에 따라 발현이 상이한 유전자 바이오마커 후보들을 발굴함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물 및 이를 이용한 닭의 가슴 근육 조직을 통해 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 고온 스트레스에 노출된 실험군의 닭과, 정상 대조군의 닭의 가슴근육 조직에서 각각 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 RNA를, 제1항의 조성물을 사용하여 RNA의 양을 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 RNA의 양을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 키트를 제공한다.

또한, 서열번호 1로 기재되는 유전자의 핵산 서열을 구성하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 마이크로어레이(microarray) 칩을 제공한다.

본 발명은 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스에 노출된 닭의 전사체 분석을 통하여 차등발현 유전자를 도출하고, 상기 차등발현 유전자들의 유전자 온톨로지 강화 분석 및 KEGG 경로 농축 분석과 유전자 동시 발현 네트워크 분석을 통해 발현 패턴 및 패턴별 기능 분류를 확인하였으며, 고온 스트레스에 대한 적응 반응 유전자에 관련된 주요 대사 경로 및 유전자 조절 형태를 확인하였다. 또한, 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스 노출에 따라 모든 비교군에서 공통적으로 발현량이 증가하는 유전자 1종을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 차등발현 유전자를 닭의 고온 스트레스 노출 여부 검출용 바이오마커로 활용함으로써, 닭의 최적 사육 조건을 확립하여 생산성 증대에 기여하고, 기후온난화에 대응하여 고온 적응성이 높은 닭 집단을 육성하는데 활용될 수 있다.

도 1은 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 실험 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 주성분 분석으로부터 얻은 고온 스트레스 처리 동안의 직장 온도 증가와 각 실험군의 관계를 나타낸 도이다.
(AHL: 급성 고지대 실험군, CHL: 만성 고지대 실험군, ALL: 급성 저지대 실험군, CLL: 만성 저지대 실험군)
도 3은 최대 변이가 에코 타입 간의 차이로 인한 것임을 보여주는 주요성분 분석(PCA) 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 고온 스트레스 처리 이후에 상향 조절 및 하향 조절된 차등발현 유전자의 수를 나타낸 결과(A), 급성 단계 처리에서 공통적이거나 고유한 차등발현 유전자 수를 나타낸 벤 다이어그램(B) 및 만성 단계 처리에서 공통적이거나 고유한 차등발현 유전자 수를 나타낸 벤 다이어그램(C)이다.
(H: 심장 조직, M: 가슴근육 조직, AHL: 급성 고지대 실험군, CHL: 만성 고지대 실험군, ALL: 급성 저지대 실험군, CLL: 만성 저지대 실험군)
도 5a 내지 d는 GO(gene ontology) 및 KEGG 경로 강화 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 가슴근육 및 심장 조직 차등발현 유전자(DEG)에 대해 통합된 유전자 공동 발현 네트워크 (GCN) 및 경로 강화 분석 결과를 나타낸 도이다. 노드는 유전자이고 가장자리는 상관 계수를 기반으로 하고, 부분 상관 관계가 있는 유전자 중 | r | ≥0.99 이상만 네트워크에 포함되었다. 노드 색은 유전자 발현이 가장 높은 조직 유형을 나타내고, 노드 경계는 유전자 발현이 가장 높은 단계를 나타낸다.
(A) 고지대 닭의 적어도 하나의 대조군에서 차등발현 유전자(DEG)의 정렬된 네트워크
(B) 고지대 GCN 네트워크의 모든 유전자가 풍부해진 KEGG 경로 네트워크.
(C) 저지대 닭의 적어도 하나의 대조군에서 차등발현 유전자(DEG)의 정렬된 네트워크
(D) 저지대 GCN 네트워크의 모든 유전자가 농축된 KEG 경로 네트워크.
도 7은 RNA-시퀀싱 분석에 사용된 모든 시료에 대해 HSPH1, OTUD1 및 PDK4의 qRN PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 모든 시료에서 일정한 발현을 나타내는 GADPH를 정규화 유전자로 사용하였다. RNA-시퀀싱 분석에서 확인된 Log2 폴드 변화는 막대로 나타내었고, qRT-PCR을 통한 폴드 변화는 라인 그래프로 나타내었다. RNA-시퀀싱 Log2 배수 변화 및 qRT-PCR 배수 변화의 산점도를 나타내고, 두 방법 사이의 상관 관계 (R²)를 확인하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물을 제공한다.

상기 유전자는 케냐 재래닭의 가슴근육 조직으로부터 유래된 것일 수 있고, 서열번호 1로 기재되는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 검출시약은 항체, 항체 단편, 앱타머, 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 항체 단편은 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등일 수 있다.

상기 단일클론항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이와 같은 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 수행되고 항체를 생산하는 세포는 표준적인 배양 방법으로 증식시킬 수 있다. 구체적으로, 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.

상기 다클론항체는 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.

상기 앱타머는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 분자로 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.

상기 프라이머는 본 발명의 서열번호로 기재되는 유전자에 상보적이며, 이를 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머라면 모두 사용할 수 있다.

상기 프로브는 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수개 내지 길게는 수백개의 염기에 해당하는 핵산 단편으로서, 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 비오틴, FITC, 로다민, DIG(digoxigenin) 등으로 표지되거나 방사선 동위원소 등으로 표지될 수 있다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 것일 수 있다.

상기 검출시약은 추가로 상기 검출시약에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다.

상기 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 검출시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

상기 고온 스트레스는 만성 또는 급성 중 어느 하나이다.

상기 닭은 저지대 또는 고지대 닭 중 어느 하나이다.

또한, 본 발명은 1) 고온 스트레스에 노출된 실험군의 닭과, 정상 대조군의 닭의 가슴근육 조직에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 RNA를, 상기 조성물을 사용하여 RNA의 양을 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 RNA의 양을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출 방법을 제공한다.

상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1로 기재되는 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함한다.

상기 단계 2)의 RNA 양 측정은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 구체적으로 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 또는 정량 실시간 RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR)로 수행될 수 있다.

상기 검출 방법에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 유전자의 발현량이 대조군에 비해 증가하는 경우 닭이 고온 스트레스에 노출된 것으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 키트를 제공한다.

상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1로 기재되는 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함한다.

상기 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 검출시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 유전자의 핵산 서열을 구성하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 마이크로어레이(microarray) 칩을 제공한다.

상기 유전자는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 상기 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작될 수 있다. 구체적으로, 상기 탐색된 유전자를 프로브로 이용하여 마이크로어레이 칩의 기판상에 고정화시킬 수 있다. 이때, 상기 고정은 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판에는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 활성기가 코팅될 수 있다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 고온 스트레스에 노출 시 변하는 닭 유래 유전자를 발굴하기 위하여, 고온 스트레스에 노출된 닭 가슴근육의 전사체 분석을 통하여 차등발현 유전자를 도출하고, 상기 차등발현 유전자들의 유전자 온톨로지 강화 분석 및 KEGG 경로 농축 분석과 유전자 동시 발현 네트워크 분석을 통해 발현 패턴 및 패턴별 기능 분류를 확인하였으며, 고온 스트레스에 대한 적응 반응 유전자에 관련된 주요 대사 경로 및 유전자 조절 형태를 확인하였다(도 1 내지 도 6 참조). 또한, 닭의 가슴근육 조직에서 고온 스트레스 노출에 따라 모든 비교군에서 공통적으로 발현량이 증가하는 유전자 1종을 확인하였다(도 7 참조).

따라서, 본 발명에 따른 상기 차등발현 유전자를 닭의 고온 스트레스 노출 여부 검출용 바이오마커로 활용함으로써, 닭의 최적 사육 조건을 확립하여 생산성 증대에 기여하고, 기후온난화에 대응하여 고온 적응성이 높은 닭 집단을 육성하는데 활용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 및 조직 적출

5월령인 암컷 닭 총 32마리(n=16마리)를 이용하였고, 케냐의 저지대 닭은 몸바사(4°1'0'S, 39°35'24'E)의 지역 농부들로부터 입수하였으며, 고지대 닭은 케냐의 농업 및 축산 연구기관인 나이바샤의 KALRO에서 얻었다. 실험의 개략도는 도 1에 나타내었다. 고온 스트레스 실험은 나이로비에 있는 케냐의 KOPIA센터에서 수행하였다. 고온 스트레스 노출군(n = 16)은 하루 8시간 동안 35℃의 고온에 노출되었고, 다른 모든 시기에는 28℃~ 30℃로 사육시켰다. 대조군(n = 16)은 전체 실험 기간 동안 24℃로 사육하였다. 5시간 동안 온도를 상승시킨 후, 급성군인 단기 고온 스트레스 노출군(n = 16, 지역당 4마리, 대조군 포함)을 희생시키고, 심장 조직과 가슴근육 조직을 채취하였다. 만성군인 장기 고온 스트레스 노출군(n = 16, 생태형당 4마리, 대조군 포함)은 3일간의 순환 고온 스트레스에 노출 시킨 후 희생시키고, 심장 조직과 가슴근육 조직을 채취하였다. 총 64개의 시료를 채취하여 RNAlater (Ambion, Texas, USA)에 보관하고 국립축산과학원(National Institute of Animal Science, South Korea)으로 운반하여 이후 사용하기 전까지 -80°C로 보관하였다.

<실험예 1> 고온 스트레스에 노출된 닭의 직장(rectum) 온도 증가 확인

닭의 고온 스트레스에 대한 물리적 변화로서, 직장 온도 변화를 측정하였다. 구체적으로, 대조군 및 고온 스트레스에 노출된 닭의 직장 온도를 치료 기간의 시작과 끝에 온도 프로브를 사용하여 측정하였다.

그 결과 도 2와 도 3에 나타난 바와 같이, 직장 온도의 최대 증가는 고온 스트레스에 노출된 급성 고지대군과 급성 저지대군으로 나타났다. 평균적으로 급성 고지대군과 급성 저지대군의 직장 온도는 각각 1.8℃와 1.6℃씩 증가했다. 대조군 그룹에서는 경미한 온도 변화만 관찰되었다. 즉, 급성 실험군 닭에서 직장 온도 변화가 상당히 높은 것으로 나타나 실험 기간이 끝났을 때 체온을 더 잘 조절할 수 있었던 만성 실험군 닭에 비해 급격한 온도 상승에 대응하여 체온을 유지하는데 어려움이 있음을 의미한다. 이는 순환 고온 스트레스에 대한 적응 때문인 것으로 생각된다. 직장 온도의 가장 높은 변화는 급성 실험군의 고지대 닭에서 나타났다. 이 닭들은 저지대 닭들에 비해 고온 스트레스에 덜 적응했다. 이를 통해, 고온 스트레스에 대한 고지대 닭의 반응은 저지대 닭의 반응보다 덜 강력함을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 고온 스트레스에 노출된 닭의 전사체(transcriptome) 분석을 통한 차등 발현 유전자 도출

상기 실시예 1에서 수득한 닭의 가슴근육 조직을 이용하여 닭의 고온 스트레스 노출에 따른 전사체 변화를 분석하고 차등발현되는 유전자를 도출하기 위해 하기 실험을 수행하였다.

2-1. RNA 분리 및 라이브러리 구축(library construction)

RNeasy 미니 키트(미국 Qiagen, USA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 상기 32개의 심장 조직과 32개의 가슴근육 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 순도와 농도는 NanoDrop ND-1000 UV-vis 분광광도계(NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA)로 측정하였다. RNA 무결성(integrity)은 RNA 나노 랩칩 키트(RNA Nano 6000 Assay 키트, Agilent, CA, USA)를 사용하여 바이오분석기(Bioanalyzer 2100 systems)에서 측정되었으며, 이때 RIN(RNA integrity number) 값은 8 이상인 시료만 사용하였다. 폴리-T 올리고가 부착된 마그네틱 비즈(poly-T oligo-attached magnetic beads, Invitrogen)를 이용하여 각 시료로부터 추출한 총 RNA 약 10 ㎍으로부터 폴리-A mRNA를 분리하였다. 상기 mRNA를 정제하고, 고온 조건에서 2가 양이온을 이용하여 작은 조각들로 절단하였다. 이후, mRNA 서열분석 시료 준비 키트(mRNA-Seq Sample Preparation Kit, Illumina, 미국)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 절단된 RNA 단편들을 역전사하여 최종 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA) 라이브러리를 제작하였다.

개별 라이브러리의 품질은 DNA Nano 1000 Assay kit를 사용하여 Bioanalyzer 2100 시스템에서 확인하였다.

그 결과, 저지대 및 고지대 케냐 닭 그룹의 심장 근육 및 가슴근육 조직으로부터 64개의 cDNA 라이브러리를 구축하였다.

2-2. 페어드 엔드 서열분석(Paired end sequencing analysis) 및 전사체 정렬

상기 cDNA 라이브러리를 이용하여 마크로젠(Macrogen, South Korea)을 통해 페어드 엔드 서열분석(Paired end sequencing analysis)을 수행하였다. 구체적으로, 페어드 엔드(PE) 서열분석은 단일 칩의 4 개 레인(레인 1, 4, 5 및 6의 각각 21, 12, 7, 24 개 샘플)에서 처리, 조직 및 영역에 의해 차단된 Illumina 기기(HiSeq 2500)를 이용하여 수행하였으며, 심장 조직에서 6억 4천 7백만, 가슴근육 조직에서 6억 5천만의 총 13억 3천만 페어드 엔드 리드가 생성되었고, 시료 당 평균 1.65 Gb의 서열 데이터에 해당하는 100 bp의 페어드 엔드(Paired-End) 리드 값이 생성되었다. 상기 페어드 엔드 리드를 FastQC 및 Trimmomatic을 이용하여 필터링하여, 다운스트림 분석에 총 시퀀싱된 판독치의 97.56%에 해당하는 12억 9천만 개의 리드가 사용되었다. 이 리드 결과는 심장 조직과 가슴근육 조직에 대해 각각 91.1% 및 85.12%의 평균 정렬률로 HISAT2 프로토콜에 따라 맵핑(mapping)하고, 닭 표준 유전체(reference genome)(Gallus gallus 5.0, Ensembl1)에 정렬(align)하였다.

2-3. 고온 스트레스에 노출된 닭의 차등발현 유전자 도출

고온 스트레스에 노출된 닭의 차등발현 유전자(DEG, differentially expressed genes)를 Cufflinks v 2.2.1를 이용하여 도출하였다. G /-GTF 플래그는 참조 전사 주석(reference transcript annotations)에 대해 정량화하는데 사용되었다. 개별 유전자의 발현은 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)수치로 계산하였다. 상기 FPKM 수치는 시료 간의 발현 프로파일을 비교하기 위하여 표준화하였다. 각 실험군 내 최소 2 개체에서 FPKM 수치가 0인 전사체 및 각 실험군 내에서 유의한 FDR(false discovery rate) 수치(q < 0.05)를 갖지 않는 전사체를 제외하였다. 이후, FPKM 수치를 log2 배수 변화(fold change)로 계산하여 log2 배수 변화 수치를 Cuffdiff를 이용한 차등발현 유전자(differentially expressed genes, DEGs) 분석에 이용하였다.

그 결과, 8 개의 차등발현 유전자(DEG) 세트가 생성되었다(고지대: 대조군-급성, 대조군-고온 스트레스, 고온 스트레스-급성, 고온 스트레스-만성; 저지대: 대조군-급성, 대조군-고온 스트레스, 고온 스트레스-급성, 고온 스트레스-만성). 도출된 차등발현 유전자의 전체 목록은 하기 표 1에 나타내었다.

Gene_Symbol	log2(fold_change)	p_value	q_value	significant
ZP1	-6.51106	5.00E-05	0.000237531	yes
TMEM220	-5.31275	5.00E-05	0.000237531	yes
OXCT1	-4.97827	0.00955	0.0279377	yes
ENSGALG00000001763	-4.93006	0.0078	0.0234516	yes
CATHL2	-4.69062	5.00E-05	0.000237531	yes
SNTN	-4.27187	0.00455	0.0146607	yes
MGST2	-4.1229	0.0003	0.00127108	yes
ENSGALG00000028268	-4.09032	5.00E-05	0.000237531	yes
XKR9	-4.03305	5.00E-05	0.000237531	yes
PDE8A	-3.82375	0.0063	0.0194841	yes
ENSGALG00000016601	-3.63755	0.0061	0.0189386	yes
MTURN	-3.39199	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000002939	-3.36882	0.00045	0.00184557	yes
ENSGALG00000026046	-3.3551	0.0131	0.0366686	yes
ATRAID	-3.34233	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000013101	-3.25188	0.00685	0.0209515	yes
MT4	-3.1675	5.00E-05	0.000237531	yes
irx2	-3.03244	0.0133	0.0371412	yes
THRSP	-2.99413	0.0001	0.000458034	yes
ACSM4	-2.98251	0.00605	0.0188057	yes
SYNDIG1	-2.90724	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000028964	-2.89701	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000026501	-2.86966	5.00E-05	0.000237531	yes
TTPAL	-2.73987	0.0042	0.0136709	yes
ENSGALG00000026913	-2.73868	5.00E-05	0.000237531	yes
SPRTN	-2.73578	0.0042	0.0136709	yes
ENSGALG00000000038	-2.72706	5.00E-05	0.000237531	yes
ADRB3	-2.65658	0.0106	0.0305835	yes
ENSGALG00000028359	-2.63732	5.00E-05	0.000237531	yes
INSC	-2.54396	5.00E-05	0.000237531	yes
GAL1	-2.45865	0.0042	0.0136709	yes
CATHL1	-2.44975	5.00E-05	0.000237531	yes
GTSF1	-2.43751	5.00E-05	0.000237531	yes
B3GAT2	-2.40803	0.00385	0.0126645	yes
ENSGALG00000028221	-2.38435	5.00E-05	0.000237531	yes
CTNNA2	-2.36466	0.0155	0.0423231	yes
MSC	-2.35824	0.0002	0.000875457	yes
ENSGALG00000013101	-2.26534	0.01695	0.0456138	yes
ENSGALG00000002431	-2.25851	0.00515	0.0163332	yes
ENSGALG00000026533	-2.23396	5.00E-05	0.000237531	yes
EIF2B5	-2.23313	0.00305	0.0103125	yes
SPP2	-2.2157	5.00E-05	0.000237531	yes
ogchi	-2.21519	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000028218	-2.20973	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000026742	-2.1969	0.00025	0.00107486	yes
ACBD7	-2.19656	5.00E-05	0.000237531	yes
LPP	-2.19438	5.00E-05	0.000237531	yes
TP53I3	-2.17163	5.00E-05	0.000237531	yes
CL2	-2.17035	0.00715	0.0217453	yes
HINTW	-2.15709	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000028302	-2.12883	5.00E-05	0.000237531	yes
MDGA2	-2.1211	5.00E-05	0.000237531	yes
KK34	-2.10952	5.00E-05	0.000237531	yes
NMB	-2.05968	0.00595	0.0185357	yes
ABRA	-2.05288	0.00575	0.0179894	yes
FAM198B	-2.05195	5.00E-05	0.000237531	yes
CAPRIN1	-2.0509	0.00485	0.0155013	yes
GAL4	-2.03723	0.0073	0.0221436	yes
MYF6	-2.01009	0.01035	0.0299596	yes
ENSGALG00000026666	-1.99875	5.00E-05	0.000237531	yes
GPR126	-1.96354	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000028402	-1.95415	5.00E-05	0.000237531	yes
CFC1B	-1.94916	0.0001	0.000458034	yes
C12ORF57	-1.9163	5.00E-05	0.000237531	yes
TBX5	-1.90886	0.00855	0.0253911	yes
CALB2	-1.90684	5.00E-05	0.000237531	yes
SPATA4	-1.88361	0.0001	0.000458034	yes
Blec1	-1.87814	5.00E-05	0.000237531	yes
MEST	-1.86591	0.00815	0.0243605	yes
ENSGALG00000021682	-1.85189	0.00445	0.0143793	yes
CD2	-1.84703	5.00E-05	0.000237531	yes
lasp-2	-1.82448	0.01395	0.0386882	yes
ENSGALG00000026540	-1.80564	0.01685	0.045391	yes
FKBP6	-1.80104	0.00385	0.0126645	yes
DBI	-1.78865	5.00E-05	0.000237531	yes
CHCHD10	-1.78176	5.00E-05	0.000237531	yes
BBOF1	-1.77171	0.00405	0.0132424	yes
ENSGALG00000021357	-1.76664	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000027676	-1.74941	0.00135	0.00499046	yes
STMN2	-1.7322	0.0002	0.000875457	yes
FGF12	-1.71781	5.00E-05	0.000237531	yes
INPP4A	-1.71291	0.01125	0.0321848	yes
ENSGALG00000028753	-1.7127	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000026441	-1.70632	5.00E-05	0.000237531	yes
SDCCAG3	-1.70351	5.00E-05	0.000237531	yes
S100A4	-1.70181	5.00E-05	0.000237531	yes
gga-mir-1646	-1.69749	0.0031	0.0104608	yes
KRT8	-1.69683	5.00E-05	0.000237531	yes
PPP1R1B	-1.68409	5.00E-05	0.000237531	yes
IGSF5	-1.68249	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000022832	-1.67687	0.00475	0.0152225	yes
ENSGALG00000024295	-1.65668	5.00E-05	0.000237531	yes
S100A13	-1.6548	5.00E-05	0.000237531	yes
Worthington	-1.62529	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000001734	-1.62371	5.00E-05	0.000237531	yes
NIPA1	-1.61968	0.0001	0.000458034	yes
ENSGALG00000007110	-1.6195	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000017013	-1.61194	5.00E-05	0.000237531	yes
FABP7	-1.60709	5.00E-05	0.000237531	yes
TANGO6	-1.60404	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000027621	-1.60165	5.00E-05	0.000237531	yes
gga-mir-223	-1.59147	0.00055	0.00221452	yes
PITX2	-1.58297	5.00E-05	0.000237531	yes
HNRPK	-1.57843	5.00E-05	0.000237531	yes
NME4	-1.56875	0.00765	0.0230586	yes
FAXDC2	-1.56713	0.01875	0.0496233	yes
PRSS57	-1.56353	0.0185	0.0490581	yes
RIPPLY2	-1.549	5.00E-05	0.000237531	yes
COL11A1	-1.54865	5.00E-05	0.000237531	yes
ACYP1	-1.54813	5.00E-05	0.000237531	yes
REM1	-1.5359	0.00285	0.00971333	yes
THRSPB	-1.52952	5.00E-05	0.000237531	yes
SMYD2	-1.5217	5.00E-05	0.000237531	yes
RFLB	-1.50752	0.00455	0.0146607	yes
NOV	-1.50717	5.00E-05	0.000237531	yes
NAAA	-1.50395	5.00E-05	0.000237531	yes
RPS28	-1.50389	5.00E-05	0.000237531	yes
TIGAR	-1.50134	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000007863	-1.50026	5.00E-05	0.000237531	yes
ApoD	-1.49938	0.0001	0.000458034	yes
gadd45	-1.49591	5.00E-05	0.000237531	yes
DCAF6	-1.49472	0.003	0.0101625	yes
ENSGALG00000011324	-1.49286	0.00985	0.0287005	yes
PCGF2	-1.49243	5.00E-05	0.000237531	yes
GPR126	-1.49094	5.00E-05	0.000237531	yes
VDAC2	-1.49066	0.00965	0.0281937	yes
PNKD	-1.48789	0.005	0.0159209	yes
ODF1	-1.48769	5.00E-05	0.000237531	yes
INHBA	-1.47653	5.00E-05	0.000237531	yes
IFT88	-1.47625	0.00305	0.0103125	yes
ELF3	-1.47592	5.00E-05	0.000237531	yes
PLPPR1	-1.47481	5.00E-05	0.000237531	yes
FAM3C	-1.47178	5.00E-05	0.000237531	yes
SMPD1	-1.47046	5.00E-05	0.000237531	yes
CREM	-1.44972	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000001620	-1.44706	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000021848	-1.44329	0.0004	0.00165674	yes
ENSGALG00000028226	-1.44137	0.0008	0.00311274	yes
ENSGALG00000022438	-1.42857	5.00E-05	0.000237531	yes
SNORA26	-1.42612	5.00E-05	0.000237531	yes
CNTF	-1.4224	5.00E-05	0.000237531	yes
SPC25	-1.42147	5.00E-05	0.000237531	yes
ACADL	-1.41695	5.00E-05	0.000237531	yes
NSUN6	-1.41281	0.00315	0.0106089	yes
LSM5	-1.40658	5.00E-05	0.000237531	yes
ATP8B3	-1.40059	5.00E-05	0.000237531	yes
ADAMTS10	-1.39733	0.00535	0.0168887	yes
ENSGALG00000027359	-1.39711	0.01655	0.0447191	yes
ENSGALG00000026338	-1.39136	0.0141	0.0390374	yes
HINT2	-1.3884	5.00E-05	0.000237531	yes
IFT43	-1.38749	0.013	0.0364298	yes
ENSGALG00000021451	-1.38517	0.0016	0.00580887	yes
SYPL2	-1.38455	5.00E-05	0.000237531	yes
PHYHIPL	-1.38401	5.00E-05	0.000237531	yes
AKR1D1	-1.38288	5.00E-05	0.000237531	yes
MED9	-1.38228	5.00E-05	0.000237531	yes
POLR2K	-1.3808	5.00E-05	0.000237531	yes
CERS6	-1.37764	5.00E-05	0.000237531	yes
LAMTOR2	-1.37586	0.0001	0.000458034	yes
SPCS1	-1.37452	0.00295	0.0100135	yes
PTRHD1	-1.37381	0.01185	0.0336526	yes
OCC-1	-1.36503	5.00E-05	0.000237531	yes
ASRGL1	-1.36491	0.00045	0.00184557	yes
FAM3B	-1.36491	0.0079	0.0237109	yes
ENSGALG00000010336	-1.36009	5.00E-05	0.000237531	yes
SNRPF	-1.35766	5.00E-05	0.000237531	yes
TNNC2	-1.35667	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000028767	-1.35268	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000003348	-1.35011	5.00E-05	0.000237531	yes
GRIA3	-1.3501	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000000017	-1.34984	5.00E-05	0.000237531	yes
TMA16	-1.34685	5.00E-05	0.000237531	yes
COMMD4	-1.34202	5.00E-05	0.000237531	yes
ACA64	-1.34054	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000004904	-1.33876	5.00E-05	0.000237531	yes
SH3PXD2A	-1.33811	0.0086	0.0255166	yes
DENR	-1.3371	5.00E-05	0.000237531	yes
HSCB	-1.32985	5.00E-05	0.000237531	yes
GPR39	-1.32686	5.00E-05	0.000237531	yes
JPH3	-1.32442	0.0068	0.0208217	yes
Rab27a	-1.31965	5.00E-05	0.000237531	yes
ENSGALG00000002595	-1.31944	5.00E-05	0.000237531	yes
KCNAB2	-1.31577	0.0003	0.00127108	yes
ENSGALG00000005956	-1.3093	5.00E-05	0.000237531	yes
NSMCE2	-1.30782	0.0045	0.0145197	yes
ENSGALG00000025963	-1.30543	0.001	0.00381276	yes
MYOC	-1.30169	5.00E-05	0.000237531	yes
MT1	-1.29966	5.00E-05	0.000237531	yes
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TIMM13	-1.28884	5.00E-05	0.000237531	yes
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급성 고온 스트레스는 각각 가슴근육 조직에서 351개와 322개, 심장 조직에서 384개와 184개의 차등발현 유전자(DEG)가 각각 저지대와 고지대에서 현저하게 다르게 표현되는 결과(FDR < 0.05)를 나타냈다(도 4 A). 두 가지 생태형 중에서 심장 조직과 가슴근육 조직 사이에 각각 48개의 차등발현 유전자와 30개의 차등발현 유전자가 겹쳤다(도 4 B). 10개의 차등발현 유전자는 저지대 닭의 두 조직 사이에 차이가 있었고, 8개의 차등발현 유전자는 고지대 닭의 두 조직 사이에 차이가 있었다(도 4 B). 2개의 차등발현 유전자(DEG)만이 4개의 대조군 모두에서 일관되게 나타났다. 이는 열충격단백질군 A(Hsp70) 멤버 8(HSPA8)과 열충격단백질군 B(Small)멤버 7(HSPB7)이었다. 저지대 닭의 경우 심장 조직과 가슴근육 조직 모두에서 급성 단계가 만성 단계보다 차등발현 유전자(DEG)가 2.2배에서 2.5배 더 많은 반면, 고지대 닭의 경우 가슴근육 조직의 급성 단계에서는 1.7배 더 많은 반면, 심장 조직의 두 단계 모두에서 유사한 수의 차등발현 유전자(DEG)가 나타났다. 이는 저지대 닭과 고지대 닭 사이의 심장 조직의 열 민감도 차이를 나타낸다. 저지대 닭에서 차등발현 유전자 수가 증가한 것을 통해 저지대 닭이 고지대 닭보다 고온 스트레스에 대한 반응이 훨씬 강하다는 것을 알 수 있다.

2-4. 도출된 고온 스트레스에 노출된 닭의 차등발현 유전자 분석

저지대 닭의 경우 심장 조직과 가슴근육 조직 모두에서 급성 단계가 만성 단계보다 차등발현 유전자(DEG)가 2.2배에서 2.5배 더 많은 반면, 고지대 닭의 경우 가슴근육 조직의 급성 단계에서는 1.7배 더 많은 반면, 심장 조직의 두 단계 모두에서 유사한 수의 차등발현 유전자(DEG)가 나타났다. 이는 저지대 닭과 고지대 닭 사이의 심장 조직의 열 민감도 차이를 나타낸다. 저지대 닭에서 차등발현 유전자 수가 증가한 것을 통해 저지대 닭이 고지대 닭보다 고온 스트레스에 대한 반응이 훨씬 강하다는 것을 알 수 있다. 급성 및 만성 단계에서 서로 다른 대조군 사이에 아주 적은 수의 유전자들이 중복되었다. 전체적으로 심장 조직에 있는 2개의 유전자(HSPA8과 HSPB7)와 가슴근육에 있는 2개의 유전자(HSPA8과 FABP4)가 겹쳤다. 이는 적응이 고온 스트레스에 대한 반응의 완전한 변화로 이어지는 것을 나타낸다. 모든 대조군에서 상향 조절되는 HSPA8 유전자는 분자 샤페론의 열충격 단백질(HSP) 70 계열 구성원으로, 새로 합성된 단백질의 정확한 접힘과 비가역 변성 단백질의 파괴에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. HSPA8은 고온 스트레스 하에서 닭에서 상향 조정되는 것으로 확인되었으며, 이는 훌륭한 바이오마커 역할을 할 수 있다. HSPB7은 작은 열 충격성 단백질(SHSP)계열에 속하며, 골격과 심근에서만 발현된다. HSPB7은 단백질 응집으로부터 세포를 보호하는 기능을 하며, 근육 완전성을 유지하는데 필요하다. 고온 스트레스는 변성된 단백질의 응집을 유발한다. HSPB7은 저지대 닭의 심장(급성 및 만성)과 가슴근육(급성)에서 상당히 상향 조정되는 반면 고지대 닭의 경우 그 효과는 반대(하향 규제)인 것으로 나타났다. 이는 저지대 닭들이 고지대 닭들보다 고온 스트레스 유도 단백질 응집의 효과를 더 잘 상쇄할 수 있다는 것을 나타낸다.

<실험예 3> 고온 스트레스에 노출된 닭의 차등발현 유전자들의 유전자 온톨로지 강화 분석 및 KEGG 경로 농축 분석

웹 기반 유전자 온톨로지 클러스터링 툴 DAVID (Huang et al., 2008)를 사용하여 기능적 주석 및 과잉 대표 분석을 수행하였다. 유전자는 생물학적 과정, 분자적 기능 및 KEGG 경로 용어로 주석이 달렸다. 중요한 용어 (KEGG의 경우 FDR <0.1, GO 용어의 경우 FDR <0.05)를 R (버전 3.4.1)에서 ggplot2 패키지로 도식화하였다.

차등발현 유전자들의 유전자 온톨로지 강화 분석 결과, 저지대 닭의 급성 단계에서 가장 중요한 용어(-log10 > 1)가 '식균작용의 양성 조절'이었고, 그 뒤를 '사이토카인 활성', ‘전사보조인자 활성’,'전압결합 나트륨 채널 활동'이 그 뒤를 이었으며, 가슴근육 조직의 유의미한 용어는 'ATP 결합', '탈 인산화', '활성 산소종 대사 과정', '키나아제 활성 조절', '시그널‘신호 변환’이었다. 고지대 급성 단계에서는 '지방산 결합' '금속 결합', '세포 주기의 조절', '세포사멸 과정 조절', '전사 보조인자 활성'이 가장 현저하게 강화된 반면, '지방산 결합', '단백질 접힘', '세포 사멸 과정 조절'은 심장 조직에서 가장 유의하게 강화된 GO 용어였다(도 5 A 및 C). 도 5 A 및 C는 여러 가지 생물학적 과정이 하나 이상의 상황에서 조절되었음을 나타낸다.

상향 조절된 차등발현 유전자(DEG)의 KEGG 경로 강화 분석 결과, 저지대 닭의 심장 근육에서 가장 강화된 경로(FDR < 0.05)는 "JakSTAT 신호 전달 경로", "PPAR 신호 전달 경로", "퓨린 대사", "신경 활성 리간드-수용체 상호 작용" 및 "p53 신호 전달" 인 반면, 가슴근육 조직에서 강화된 경로는 "세포 주기", "MAPK 신호 전달 경로", "암에서의 경로", "항원 처리 및 제시" 및 "p53 신호 전달 경로"인 것으로 나타났다. 고지대 닭의 심장 조직에서는 "PPAR 신호 전달 경로", "세포 접착 분자" 및 "p53 신호 전달 경로"가 강화된 반면, 가슴근육 조직에서는 "MAPK 신호 전달", "산화적 인산화", "PPAR 신호 전달 경로", "리보솜" 및 "퓨린 대사 "가 강화되었다(도 5 B).

하향 조절된 차등발현 유전자(DEG)의 KEGG 경로 강화 분석 결과, 저지대 닭의 심장 근육에서 "대사 경로"와 "초점 접착력(focal adhesion)"은 상당히 하향 조절된 반면, 가슴근육 조직에서는 "에스트로겐 신호 전달 경로", "HTLV-1 감염" 및 "FoxO 신호 전달 경로"가 하향 조절되었다. 고지대 닭의 심장 근육 조직에서 "암에서의 잘못된 전사의 조절" 및 "TGF- 베타 신호 전달 경로"는 상당히 하향 조절되는 반면, "대사 경로"는 가슴근육 조직에서 하향 조절되었다(도 5 D).

또한 고온 스트레스 반응의 단계별 차이를 관찰한 결과, DNA 손상 수리, 세포 주기 억제 및 세포 사멸의 시작에 필수적인 p53 경로는 급성 단계에서 심근과 가슴근육 모두에서 강화되었으며, 이는 급성 고온 스트레스가 세포 주기에 억제 효과를 가질 수 있음을 나타낸다. 에너지 대사에 필요한 PPAR 신호 경로와 산화 스트레스에 의한 염증 반응 조절은 4가지 대조군 중 3가지에서 만성 고온 스트레스 하에서 강화된 것으로 확인되었다. 열에 장기간 노출되면 닭에게 상당한 산화 스트레스 손상이 발생할 수 있다. 만성 고온 스트레스 그룹에서 PPAR 신호 전달의 강화는 고온 스트레스 유도 반응 산소 종(ROS) 축적 및 산화 스트레스를 나타낸다.

<실험예 4> 유전자 동시 발현 네트워크 분석 및 KEGG 경로 매핑

각각 고지대와 저지대의 심장 근육과 가슴근육 조직 급성 및 만성 단계에서 확인된 차등발현 유전자(DEG)를 통합하기 위하여 유전자 동시 발현 네트워크를 구축하였다. 구체적으로, 유전자 동시 발현 네트워크는 정보이론(PCIT) 알고리즘을 이용한 부분 상관 계수를 사용하여 구축하였다. 저지대 또는 고지대 닭 그룹에서 생성된 네 가지의 유전자 세트 중 적어도 하나의 차등발현 유전자(DEG)를 사용하여 두 개의 네트워크(저지대 특정 네트워크와 고지대 특정 네트워크)를 구축했다. 네트워크 구축에는 |r| ≥ 0.99의 부분적 상관관계가 있는 유전자만이 포함되었다. 네트워크는 CYTOSCAPE (버전 3.4.1)에서 시각화되었으며, NetworkAnalyzer 플러그인으로 분석하여 연결 정도에 따라 분류하였다. 그런 다음, 네트워크의 유전자는 ClueGO 플러그인을 사용하여 KEGG 경로(Ogata et al., 1999; Kanehisa and Goto, 2000)에 매핑하였다.

그 결과, 고지대 유전자 동시 발현 네트워크는 75개의 노드(genes)와 244개의 가장자리(연결)로 구성된다(도 6 A). 네트워크 내 유전자에 대한 KEGG 경로 강화 분석 결과 네트워크에 있는 77개의 유전자 중 28개로 구성된 4개의 경로가 강화된 것으로 나타났는데, 여기에는 'PPAR 신호 전달 경로', '소포체 내에서의 단백질 처리', 'MAPK 신호 전달 경로', 'p53 신호 전달 경로' 등이 포함되었다(도 6 B). 저지대 유전자 네트워크는 77개의 노드(genes)와 270개의 가장자리(연결)로 구성된다(도 6 C). 네트워크에서 75 개의 유전자 중 25 개를 포함하는 3 개의 KEGG 경로가 강화되었으며, 'p53 신호 전달', '스테로이드 생합성'및 'PPAR 신호 전달경로'가 포함되었다(도 6 D). 네트워크의 모든 유전자와 그 목록을 표 2에 나타내었다.

저지대 동시 발현 네트워크에서 최대 연결을 갖는 유전자는 사이클린-B2 (CCNB2), crumbs homolog 2(Crb2), carbohydrate sulfotransferease 9(CHST9), sestrin-1(SESN1) 및 nuclear receptor subfamily 4 group A member 3(NR4A3)을 포함한 반면 고지대 동시 발현 네트워크에서는 COMM domain containing 4 (COMMD4), tetratricopeptide repeat domain containing protein 32 (TTC32), H1 histone family member 0 (H1F0), acylphosphatase 1 (ACYP1) 및 ribosomal protein S28 (RPS28)이 가장 높은 정도(degree)를 나타냈다. 두 네트워크를 비교한 결과 이 중 PPAR 신호 경로(PLIN1, SCD, FABP4, FABP1 및 DBI), p53 신호 경로(CDK1, TP53I3, GADD45B, SESN1, GTSE1) 및 MAP Kinase 신호 경로(DUSP5 및 DUSP8)를 포함하는 30개의 유전자가 공유됨을 확인하였다.

Gene_Name	Max_expression level	Max_Time	Max_Tissue	Up/Down	Neighborhood Connectivity	Stress	Topological Coefficient
COMMD4	1.844113	Chronic	Heart	Down	6.95	10322	0.19857143
TTC32	1.66966	Chronic	Heart	Up	7.89473684	19330	0.18796992
H1F0	1.39519	Acute	Muscle	Up	8.72222222	10572	0.21273713
ACYP1	1.60023	Chronic	Heart	Up	8.55555556	18368	0.2037037
RPS28	1.78878	Acute	Muscle	Up	9.58823529	10516	0.20400501
PDK4	-4.63904	Acute	Muscle	Down	7.86666667	5182	0.23838384
FABP1	5.15697	Acute	Muscle	Up	6.5	1294	0.20967742
ATRAID	1.68693	Acute	Heart	Up	7.53846154	3902	0.25128205
SRGN	2.02632	Chronic	Heart	Up	9.46153846	6706	0.27828054
FABP4	-2.30848	Chronic	Heart	Down	4.66666667	16016	0.24537037
DACT2	-1.20745	Chronic	Muscle	Down	13.2	2406	0.28695652
FOS	1.65343	Acute	Muscle	Up	5.33333333	3424	0.28104575
MT4	2.03524	Acute	Muscle	Up	8.22222222	1290	0.35748792
HINTW	1.5004	Chronic	Heart	Up	5.5	2876	0.275
FGF10	2.41214	Acute	Muscle	Up	13.75	3316	0.3125
DBI	5.64419	Acute	Muscle	Up	10.5	4452	0.3
SEC61G	1.66905	Acute	Muscle	Up	13.75	3316	0.3125
C12ORF57	1.63656	Acute	Muscle	Up	13.75	3316	0.3125
AGO2	-5.97007	Acute	Muscle	Down	7	5878	0.41176471
COL12A1	1.70728	Acute	Muscle	Up	14.57142857	872	0.34693878
DUSP8	-5.41511	Acute	Muscle	Down	8.71428571	2340	0.31122449
FGF1	-3.22169	Acute	Muscle	Down	7.85714286	1718	0.37414966
JUN	1.96562	Chronic	Muscle	Up	4.42857143	24634	0.31632653
APOA1	-4.81277	Chronic	Muscle	Down	13.57142857	5352	0.35714286
FGF16	1.77388	Chronic	Muscle	Up	12.66666667	1104	0.44642857
SNCG1	2.26704	Acute	Muscle	Up	12.83333333	1080	0.44252874
ARID5A	-1.27522	Acute	Muscle	Down	11	1088	0.37931034
NR4A3	-2.40619	Chronic	Heart	Down	11	4398	0.37931034
MUC13	-1.64311	Chronic	Heart	Down	4.33333333	8984	0.39393939
REXO1	3.20713	Acute	Muscle	Up	9.4	370	0.39166667
FBXO32	-2.68972	Acute	Muscle	Down	10.2	702	0.36428571
FKBP51	-2.33353	Acute	Heart	Down	5.8	4312	0.34117647
SOCS6	-2.39991	Chronic	Heart	Down	4.4	334	0.48888889
SCD	2.52124	Acute	Heart	Up	4.4	334	0.48888889
RAD23	-1.71857	Acute	Muscle	Down	5.6	1246	0.4
HSPB1	-4.90665	Chronic	Heart	Down	6.2	3020	0.33333333
F13A1	-1.30195	Acute	Muscle	Down	5.6	1246	0.4
TTLL9	-1.08975	Chronic	Muscle	Down	14.2	1072	0.5
RFESD	-1.50371	Chronic	Muscle	Down	13.6	256	0.48571429
FGF12	-1.16108	Chronic	Muscle	Down	14.2	1072	0.5
DUSP5	1.41246	Chronic	Muscle	Up	14.2	1072	0.5
LPAR1	1.26501	Chronic	Heart	Up	11.2	13392	0.41481481
EMC4	1.888687	Chronic	Heart	Up	12	2162	0.46153846
AKR1D1	2.03935	Chronic	Heart	Up	14.8	3284	0.43529412
ADD2	1.10986	Chronic	Heart	Up	11.2	13392	0.41481481
HSPH1	1.76948	Acute	Muscle	Up	5	4506	0.45454545
ACTA1	-1.18763	Chronic	Heart	Down	4	12	0.57142857
IFI27L2	2.09088	Acute	Muscle	Up	9.5	2	0.41304348
HMGA1	-7.44066	Chronic	Heart	Down	7	250	0.4375
GTSE1	1.19916	Acute	Heart	Up	6.75	2590	0.39705882
HSPB7	1.24604	Acute	Muscle	Up	9.25	652	0.44047619
KLHL38	-1.45395	Acute	Muscle	Down	9.75	4	0.40625
ALDH1A1	-2.49196	Chronic	Heart	Down	11.25	2148	0.40178571
CDK1	2.69843	Acute	Muscle	Up	6.5	4	0.59090909
AMER3	-2.0903	Acute	Muscle	Down	6.5	4	0.59090909
CHAC1	-3.89573	Chronic	Muscle	Down	4.5	12	0.5
TP53I3	1.88879	Acute	Heart	Up	15	2	0.53571429
SESN1	-1.5478	Chronic	Heart	Down	17.25	3228	0.51515152
SMOC2	1.08237	Acute	Heart	Up	15.25	0	0.54464286
RBP7	-2.49326	Chronic	Heart	Down	17.25	3228	0.51515152
PPP1R1B	1.49567	Chronic	Heart	Up	17.25	3228	0.51515152
GADD45B	-1.0768955	Acute	Heart	Down	15.25	0	0.54464286
LRRC4	1.05418	Acute	Muscle	Up	5	2	0.71428571
HSPA8	1.446197	Acute	Muscle	Up	8	0	0.53333333
PLIN1	1.90105	Acute	Heart	Up	14.33333333	0	0.51190476
IGJ	3.41871	Acute	Heart	Up	12	0	0.57142857
FCGBP	3.82383	Acute	Heart	Up	12	0	0.57142857
RRAD	2.94517	Chronic	Muscle	Up	6.66666667	0	0.51282051
HINT2	1.86163	Acute	Muscle	Up	6.66666667	0	0.51282051
SMC2	-1.32163	Chronic	Muscle	Down	4.66666667	0	0.66666667
ACYP2	-1.63132	Chronic	Muscle	Down	4.66666667	0	0.66666667
OTUD1	-2.07061	Acute	Muscle	Down	4.66666667	0	0.77777778
GSTZ1	-2.01165	Chronic	Muscle	Down	5.33333333	0	0.76190476
ARRDC2	-2.19061	Acute	Muscle	Down	4.66666667	0	0.77777778
DGAT2	2.52472	Acute	Heart	Up	16.5	0	0.78571429

표 2는 고지대 닭(HL)과 저지대 닭(LL)에서의 유전자 네트워크를 그리는 데 사용되는 각 노드들의 모수 값으로 각 유전자의 최대 발현량(MAX_expression level), 최대 발현 시점(MAX_Time), 최대 발현 조직(MAX_Tissue), 방향성(Updown), 이웃하는 유전자간의 연결성(Neighborhood connectivity), 스트레스(노드를 지나는 최소 경로수) 및 형태적 계수(Topological Coefficient)를 나타낸 것이다.

서로 다른 대조군 하에서 생성된 차등발현 유전자(DEG)는 고온 스트레스에 대한 전반적인 반응을 확인하기 위해 저지대 및 고지대 유전자 상관 관계 네트워크(GCN)로 통합되었다. 그런 다음 GCN은 각 생태형에서 허브 유전자를 식별하기 위해 노드(genes) 사이의 연결을 나타내는 가장자리 수를 기준으로 정렬되었다. 저지대 GCN의 상위 5개 허브 유전자는 모두 세포 주기, 세포 신호 전달, 세포 분열 또는 DNA 수리 메커니즘을 모두 조절한다. 세포 분열의 중요한 조절 인자인 사이클린-B2(CCNB2)는 만성 단계에서 저지대 가슴근육에서 상당히 상향 조정되었다. CCNB2는 고온 스트레스 하에서 느리게 성장하는 일리노이 육계에 비해 빠르게 성장하는 ROSS 708 육계에서 상당히 하향 조절 되는 것으로 확인되었으며, ROSS 육계의 세포주기 활동 감소를 나타내는 것으로 제안되었다. Crums Homolog 2(Crb2)는 BRCT 단백질로서 DNA 손상 및 수리에 대한 세포 반응에 필수적인 세포 주기 체크포인트 매개체이다. crb2는 급성 및 만성 단계에서 가슴근육에서 상당히 상향 조정된 것으로 나타났다. carbohydrate sulfotransferease 9(CHST9)는 비 환원 말단 GalNAc 잔기의 4 번 위치로 황산염의 전달을 촉매하는 N- 아세틸 갈락토사민 4-0 황산 효소군의 구성원이며, 세포 신호 전달에 관여한다. CHST9의 발현은 가슴근육의 급성 단계에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 근육의 퇴화를 방지하여 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 수명을 연장시키는데 중요한 것으로 판명된 Sestrin-1(SESN1)은 ROS 간극에 필요하며 고온 스트레스에 대한 방어에 핵심적인 역할을 한다. SESN1의 발현은 급성기의 가슴근육에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A member 3 (NR4A3)는 핵 고아 수용체이며 Nur77 계열의 구성원이다. NR4A3은 세포 주기, 염증 및 DNA 수리에 중요한 여러 유전자를 활성화시킨다. NR4A3의 발현은 저지대 닭의 가슴근육에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. 네트워크상의 91개의 다른 유전자와 유의한 표현 상관관계를 가진 이들 핵심 허브 유전자의 차등발현은 저지대 닭이 고온 스트레스의 영향을 받았으며, 활성화, 세포 주기 체크포인트, 세포 주기 억제기, ROS 간극 및 DNA 손상과 수리 메커니즘을 통해 강하게 반응함을 나타낸다.

<실험예 5> 정량 실시간 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 이용한 검증(validation) 분석

상기 실험예 4에서 확인된 두 개의 동시 발현 네트워크 사이에서 중첩된 30개의 유전자 중 6개의 유전자인 OTUD1, HSPH1, PDK4, ATRAID, SRGN 및 MT4 유전자의 qRT-PCR로 검증하였다. 구체적으로, 각각의 분리된 RNA 1 μg을 RT-PCR (Invitrogen, CA, USA)을 위한 SuperScript Ⅲ^TM 첫 가닥 시스템을 사용하여 Oligo (dT)로 cDNA로 역전사하여 제조사의 설명서에 따라 최종 부피 20 ㎕로 만들었다. 생성된 cDNA를 qRT-PCR분석에 사용하기 전에 1:2로 희석하였다. PCR 반응은 dNTP가 포함된 5μl의 범용 마스터 믹스(Universal Master Mix)가 포함된 최종 부피 10 ㎕에서 수행하였다. MgCl₂, 반응 완충액, AmpliTaq Gold DNA 중합 효소, 90 nM 정방향 및 역방향 프라이머, 250 nM 형광 표지 TaqMan 프로브 및 최종적으로 2 ㎕의 cDNA를 첨가하였다. 그런 다음, 95 ℃에서 10 분간 초기 변성시킨 후 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 1 분간 40 사이클을 수행하여 ABI PRISM 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)에서 증폭하였으며, 모든 샘플은 3배로 증폭시켰다. 데이터는 서열 검출 소프트웨어(애플리케이션 Biosystems, CA, USA)로 분석하였다. qRT-PCR 분석을 사용한 모든 시약은 Life technologies (Carlsbad, CA, USA)에서 입수하였다. 표적 유전자의 C_T 값은 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 수치로 표준화하고, 2^-ΔΔCT 방법(Livak KJ et al. Methods 25:402-408, 2001)으로 정량하였다. RNA-Seq 결과의 qRT-PCR 검증에 사용되는 프라이머 목록은 표 3에 나타내었다.

유전자명	프라이머서열(5'→3')
HSPH1	forward: TGAATTGGAAACTCAGGACCAGATG (서열번호2)
	reverse: CCTCACTGTTCTCTTGCTGGTTATT (서열번호3)
SRGN	forward: GGCCGTGGTTCCAGCT (서열번호4)
	reverse: GCTCCTGGTACGTCTTCATCAG (서열번호5)
ATRAID	forward: GTTGGACCTCAGCAACTGTTC (서열번호6)
	reverse: CGTCAGGTCCAGCACGAC (서열번호7)
MT4	forward: CGGAGCTGCCGCAAGA(서열번호8)
	reverse: CCTTGGCACAGTTGTTGCA (서열번호9)
PDK4	forward: TGACTGGTCGCATCCCAAGTAAG (서열번호10)
	reverse: GGAAGAATTTGCCTGTTTGGAGG (서열번호11)
OTUD1	forward: GCTGTGTCCCTCTCCAAGATG (서열번호12)
	reverse: CACGCTTCTGTCCGTCTGT (서열번호13)
GAPDH	forward: GGAAGAATTTGCCTGTTTGGAGG (서열번호14)
	reverse:TCGTCAAGCTTGTTTCCTGGTATGA (서열번호15)

그 결과, RNA 시퀀싱과 qRT-PCR 사이에 유사한 발현 프로파일을 광범위하게 보였다. HSPH1(서열번호 1)의 경우 모든 실험군에서 발현이 증가하였으며, OTUD1와 PDK1의 경우, 급성 고온스트레스 실험군에서 저지대 및 고지대 닭 모두 발현이 감소하였으나, 만성 고온스트레스 실험군에서는 저지대 및 고지대 닭 모두 발현이 증가하는 것을 확인하였다. RNA 시퀀싱과 qRT-PCR log2 폴드 변화 결과 사이의 상관관계는 0.86이었다(도 7).

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Chicken gene differentially expressing high temperature stress in chicken breast muscle <130> 2019p-11-050 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallus gallus heat shock protein family H (Hsp110) member 1 (HSPH1) <400> 1 cgcccctgcg cacccatccg ccggcagtgg gaccggggcg gcggcggcgg cgccggcagc 60 gggttgggtg gggggtggtc tgttggtggc ggcggggcca tggcggtggt gggctttgat 120 ctgggtttcc agagctgcta catcgcagtg gcgcgggccg gcggcatcga gacggtggcc 180 aacgagttca gcgaccgctg caccccgtcc gtagtttcgt tcggctccaa aaacagagct 240 atcggcgtct cggcgaaaaa ccagcaaatt actcatgccc acaacacagt atctaacttc 300 aagaggttcc atggccgtgc atttaatgat ccgtttgttc agaaggaaaa ggaaaagttg 360 agttatgatt tggtccctat gaagaatggt ggagttggag tgaaggtcat gtacatggat 420 gaggagcaca tcttcagtgt ggaacagatt tcagcgatgt tgttgacaaa gttaaaggag 480 actgcagaga gtaacctgaa aaagccagta acagactgtg ttatttctgt tccatcgttt 540 ttcactgatg ctgaaaggag gtctgttctg gatgcagctc agattgttgg attaaactgt 600 cttagattaa tgaatgacat gacagctgtg gctctgaatt atgggattta taaacaagat 660 cttccagctc ctgaagagaa gccacgaata gtcgtatttg ttgatatggg gcattctgca 720 tttcaagtgt ctgcctgcgc gttcaacaag agtaaactaa aggtgctggg cacagcattt 780 gatcctttcc taggcggaag gaactttgat ggaaagttag tagactactt ttgtgcagaa 840 ataaaagcaa agtacaaact ggatccaaaa tcaaaagttc gagctcttct tcgtctgtat 900 caggagtgtg agaagctgaa gaaactaatg agttcaaaca gcacagacat tcccctaaac 960 attgagtgtt tcatgaatga cactgatgta tctggaaaaa tgaacaggtc ccagtttgaa 1020 gaactgtgtg ctgacctgct gcaaaggata gagatgcctc tgctttcgtt aatggaacaa 1080 acacaactga aggtggaaga tgtgactgct gtggagattg ttggaggagc aacccgcatt 1140 cctgctgtca aagaaaggat tgctaaattc tttggcaaag atgtcagtac aacactgaat 1200 gcagatgaag ccatagctag aggctgtgct ctacagtgtg caattctttc tccagctttt 1260 aaagtgagag aattctctgt gacagatgct acaccattcc caatctctct gttgtggaac 1320 acagaagcag aggacactga aggggttcat gaggtattca gcagaaatca tgcagcacct 1380 ttctccaaag ttcttacctt ctataggaag ggtccatttg agttagaagc tttttattct 1440 gatcctaatg gagtcccgta tccagagtca aaaattggta ggtatattat ccagaatgtg 1500 gcagctcaga aagatggaga gaagtctaaa gttaaagtga aagtccgtgt caatactcat 1560 ggcattttca gcgtgtccac tgcatccatg gtagaaccag ttaaaagtga agatagtgag 1620 gatgtcggtg ttgagactga attggaaact caggaccaga tgcctgctga aaattcaagt 1680 gataaaaata accagcaaga gaacagtgag gctggaacac agtcccaggt acaaactgat 1740 ggtcagcaaa cgtcacagtc tcccccttca tcagaacctc cctctgaaga aaacaaaatc 1800 ccagatgtca agaaaacaag tgaaaagaaa ggcgatcagc ctccagaagc taaaaaaccc 1860 aagataaaag tgaagaatgt ggaactgcct attgaagcta acttggtttg gcagttagga 1920 aaagatctcc tcaatatgta tattgaaaca gagggtaaga tgatcatgca agacaaactg 1980 gaaaaagaaa gaaatgatgc aaagaatgca gtggaagaat atgtgtatga gttcagggac 2040 aaattgtctg gaccatatga gaaatttgtt tgtgaaaagg atctgcaagg cttctctgca 2100 cttctaacag agacagaggg ctggctgtat gaagagggcg aggatgaagc taagcaggtg 2160 tatgtagaca aactagagga tttaaagaaa ttaggtactc caattgaaat gcgctatcaa 2220 gaagcagagg agcgaccaaa gctattagaa gaactgggac acaggctcca gtattacgct 2280 gcgatagctg gggaattcag gaataaagat gaaaaataca tccatattga tgaaatggaa 2340 atgatgaaag tagagaagtg tgtgagtgaa gtgatagagt ggatgaacaa tgctgtgagt 2400 gcccaggcta agaagagctt agatcaggat ccagctgtgc gttcctttga aattaaggca 2460 aagcttcaag agttgaacaa tgtctgtgag cccattgtga cacaaccaaa accaaaagtt 2520 gactctccta aggaagaaaa cccattaaat gaacagggcg attataaaac tgaagacatg 2580 ggagaagatg acaaaaattc agacatgcct caacaaaatg gtgaatgtca tccaggtgat 2640 caaaacactg ttaacatgga cttggactaa accactgcac ttgcagcaag ttatttcatc 2700 ccatgacaga agatattttt gctgtcatac atgatcacgg gattgggaat gcattgtttt 2760 gggaactatt tatatttttt cttaaaactt gtctggaata tgttgtgtta tgggaggaaa 2820 gaatagtagt agtgttggtc atgactatcc taaaaggaaa attgccttgg taactttcag 2880 attcctgtgg aattgtgagt tcatactaag cttctgtgca gtatttaacc atttgcatca 2940 ctaaagatga agagaagcac ttgttctgaa atatactgct ccttcaaaag gttgtatttg 3000 aaaccttcgt aggcatttgt agatgccaag gtagttttct ttcatctgga catctgattg 3060 ggtatgtcag taaaagccag tgtctgtccc gtttgtaagg actttgcaga ataaattttt 3120 ctgttctaag gtttttgatt attgcagtcc aaagcattta tcagataata agatgatgga 3180 atgtgttagt agcatgcaga aacgcttacg tttcgtctct tgctaaacaa tacatttttc 3240 atgtggggtg cttaaaatga aggaaatgct atttctgtta gtgttattgt gaagcctttt 3300 aatgggcttt aaaataaagt tcattttact ggtaaaaa 3338 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPH1 forward primer <400> 2 tgaattggaa actcaggacc agatg 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPH1 reverse primer <400> 3 cctcactgtt ctcttgctgg ttatt 25 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRGN forward primer <400> 4 ggccgtggtt ccagct 16 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRGN reverse primer <400> 5 gctcctggta cgtcttcatc ag 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATRAID forward primer <400> 6 gttggacctc agcaactgtt c 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATRAID reverse primer <400> 7 cgtcaggtcc agcacgac 18 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MT4 forward primer <400> 8 cggagctgcc gcaaga 16 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MT4 reverse primer <400> 9 ccttggcaca gttgttgca 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDK4 forward primer <400> 10 tgactggtcg catcccaagt aag 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDK4 reverse primer <400> 11 ggaagaattt gcctgtttgg agg 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTUD1 forward primer <400> 12 gctgtgtccc tctccaagat g 21 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTUD1 reverse primer <400> 13 cacgcttctg tccgtctgt 19 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 14 ggaagaattt gcctgtttgg agg 23 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 15 tcgtcaagct tgtttcctgg tatga 25

Claims (8)

1. 서열번호 1로 기재되는 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 고온 스트레스는 만성 또는 급성인 것을 특징으로 하는, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 닭은 저지대 또는 고지대 닭인 것을 특징으로 하는, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 검출시약이 항체, 항체 단편, 앱타머, 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 조성물.
   
5. 1) 고온 스트레스에 노출된 실험군의 닭과, 정상 대조군의 닭의 가슴근육 조직에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
   2) 단계 1)의 RNA를, 제1항 또는 제2항의 조성물을 사용하여 RNA의 양을 측정하는 단계; 및
   3) 단계 2)의 RNA의 양을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 유전자의 발현량이 대조군에 비하여 증가하는 경우 닭이 고온 스트레스에 노출된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출 방법.
   
7. 제1항의 조성물을 포함하는 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 키트.
   
8. 서열번호 1로 기재되는 유전자의 핵산 서열을 구성하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 닭의 고온 스트레스에 대한 노출 여부 검출용 마이크로어레이(microarray) 칩.
   
   
   

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